KR101966755B1 - 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 또는 항산화용 조성물 - Google Patents
동백나무 유래 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 또는 항산화용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 미백용도 또는 항산화용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 제주에서 자생하는 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 우수한 티로시나아제 활성 억제와 항산화 활성을 가지는바, 상기 추출물을 포함하는 미백 또는 항산화용 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 건강기능성식품을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 또는 항산화용 화장료 조성물, 식품 조성물 및 건강기능성식품에 관한 것이다.
겨우살이과 식물은 잎과 줄기에 엽록소가 있어 광합성을 하는 반기생성 식물로, 기주식물의 지상부인 줄기 등에 기생하는 식물로써 한랭지역을 제외한 전 세계의 열대와 온대지역의 약 40속 1,500여종이 분포하고 있다.
피부는 표피, 진피, 피하조직으로 이루어져 있으며 멜라닌 세포는 표피에 존재한다. 타이로시나아제는 타이로신을 산화시켜 멜라닌 형성에 관계하는 효소이다. 자외선에 피부가 노출될 때 타이로시나아제가 멜라닌의 합성을 증가시켜 자외선을 물리적으로 차단하고 피부 보호막의 역할을 한다. 멜라닌이 합성되는 경로는 티로시나아제가 활성화되어 티로신으로부터 도파 및 도파퀴논을 형성시키고, 멜라닌 세포의 멜라노좀에서 멜라닌 중합체가 형성되게 된다. 형성된 멜라닌은 표피의 각질화 과정에 의해 피부 표면에 도달하게 된다.
타이로시나아제는 항산화제에 의해 활성을 방해받는다. 따라서 타이로시나아제의 활성이 저해되면 멜라닌 색소 형성 작용이 억제됨으로써 미백효과를 보이게 된다.
항산화제는 활성 산소와 반응함으로써 활성 산소에 의한 생체 손상을 억제하거나 최소화하는 것으로, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA, Butylated hydroxyanisole), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT, Butylated hydroxytoluene), 프로필 갈레이트(PG, Propyl galate), 터셔리부틸 하이드로퀴논(TBHQ, Teritiarybutyl hydroquinine) 등의 합성 항산화제와 엽록소, 녹차 추출물, 프로롤리스 등의 천연물 유래 항산화제로 구분될 수 있는데, 합성 항산화제의 경우 발암 및 심혈관 계열에 부작용을 유발하는 것으로 알려지면서 천연물로부터 유래하는 보다 안전하고 뛰어난 효과를 가지는 항산화제에 관한 연구가 활발하게 수행되고 있다.
따라서, 인간에게 독성을 나타내지 않으면서 효과적인 피부 미백 및 항산화 효과를 달성할 수 있는 새로운 성분에 관한 연구가 필요한 실정이다.
이에 본 발명에서는 천연 미백 및 항산화제 개발의 소재로서 제주 동백나무 유래 겨우살이를 이용한 미백용 또는 항산화용 화장료 조성물, 식품용 조성물, 건강기능식품을 개발하고자 하였다.
본 발명의 목적은 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는, 식품 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공하기 위한 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
한 구체예에서, 상기 조성물은 티로시나아제 활성을 억제하는 것인, 피부 미백용 화장료 조성물일 수 있다.
한 구체예에서, 상기 조성물은 피부 항산화용인 화장료 조성물일 수 있다.
한 구체예에서, 상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알코올 추출물인 화장료 조성물일 수 있다.
한 구체예에서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 팩, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것인, 화장료 조성물일 수 있다.
또한 본 발명은 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는, 식품 조성물을 제공한다.
한 구체예에 있어서, 상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알코올 추출물인 식품 조성물일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 식품 조성물을 포함하는 피부 미백용 건강기능성식품을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 식품 조성물을 포함하는 피부 항산화용 건강기능성식품을 제공한다.
본 발명은 제주 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 티로시나아제 활성 억제와 항산화 활성을 이용하여 미백 또는 항산화용 화장료 조성물, 식품 조성물, 건강기능성식품을 제공할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이를 채취하는 과정을 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 추출하기 위한 공정도이다.
도 3은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 총 페놀함량을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 아스코르브산 함량을 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 카로티노이드 함량을 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 클로로필 a 및 b의 함량을 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 DPPH 소거능 측정 그래프이다.
도 9는 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 SOD 소거능 활성 측정 그래프이다.
도 10은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 NO 소거능 활성 측정 그래프이다.
도 11은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 금속봉쇄력 측정 그래프이다.
도 12는 본 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 환원력 측정 그래프이다.
도 13은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 티로시나아제 억제 활성을 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 추출하기 위한 공정도이다.
도 3은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 총 페놀함량을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 아스코르브산 함량을 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 카로티노이드 함량을 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 클로로필 a 및 b의 함량을 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 DPPH 소거능 측정 그래프이다.
도 9는 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 SOD 소거능 활성 측정 그래프이다.
도 10은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 NO 소거능 활성 측정 그래프이다.
도 11은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 금속봉쇄력 측정 그래프이다.
도 12는 본 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 환원력 측정 그래프이다.
도 13은 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 티로시나아제 억제 활성을 측정한 그래프이다.
본 발명은 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 포함하는 화장료 조성물, 식품 조성물, 건강기능식품에 관한 것으로, 이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하나, 이들이 발명의 내용을 제한하는 것은 아니다.
겨우살이과 식물은 잎과 줄기에 엽록소가 있어 광합성을 하는 반기생성 식물로, 기주식물의 지상부인 줄기 등에 기생하는 식물로써 한랭지역을 제외한 전 세계의 열대와 온대지역의 약 40속 1,500여종이 분포하고 있다.
본 발명에서 사용한 겨우살이(Korthalsella japonica)는 제주에서 자생하는 동백나무를 숙주로 하여 기생하여 생장한 겨우살이이나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기와 같은 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 피부 미백용 또는 피부 항산화용일 수 있다.
상기 미백이란 멜라닌 등의 색소 과다로 인하여 명도가 감소된 피부의 명도를 증가시키거나 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 방법, 상기 방법으로 형성된 명도가 증가된 피부 등을 포괄하여 의미할 수 있다.
멜라닌은 피부, 머리카락, 눈동자 등 생물체에 널리 분포되어 있는 색소 성분으로 인체 표피층의 멜라닌 세포(melanocyte) 내의 멜라노좀(melanosome)에서 합성되는데, 티로시나아제(tyrosinase) 효소에 의해 티로신(tyrosine)을 시발 물질로 하여 DOPA(3,4-dihydroxy-phenylalanine) 또는 DOPA 퀴논으로 변환되는 산화 및 중합 반응으로 생합성 된다. 생합성된 멜라닌은 자외선과 같은 피부자극에 대해 저항력을 높여주지만, 과도한 멜라닌 합성은 기미, 주근깨, 검버섯과 같은 색소 침착을 일으키기 때문에 티로시나아제 활성 측정은 피부 미백효과를 나타내는 하나의 중요한 지표로 받아들여지고 있다.
한편, 피부에 색소가 침착되는 과정에는 티로시나아제(tyrosinase)라는 효소가 작용하며, 이어서 일련의 산화과정을 통해 멜라닌 중합체가 과량으로 생성되어 피부에 축적되는 것으로 알려져 있다. 티로시나아제 는 아미노산의 일종인 타이로신(tyrosine)을 멜라닌 중합체 생성의 중간물질인 도파(DOPA, 3,4-dihydroxy phenylalanine), 도파퀴논(DOPA-quinone)으로 전환시키는 멜라닌 생성과정에서 가장 중요한 효소이다.
따라서, 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 상기 티로시나아제의 발현을 억제하거나 발현된 효소의 활성을 억제하여 멜라닌 생성을 조절할 수 있다.
상기 항산화(antioxidation)는 체내에서 일어나는 여러 산화작용을 방지하는 것을 말하며, 생체막이나 지단백질로서 존재하는 지질은 체내에서 발생하는 자유 라디칼(free radical)의 공격을 받아 여러 종류의 과산화물을 형성하는데, 과산화물들과 분해산물 등은 반응성이 높아 주변의 생체분자들의 구조와 기능을 변환시켜 노화 현상 및 여러 가지 만성질환을 초래한다. 생체 내에는 이러한 자유 라디칼(free radical)을 중화시키고 몸을 보호할 수 있는 여러 항산화 방어기구가 있다. 인간의 질병 및 노화는 체내 대사과정 중 발생하는 O2(superoxide), NO(nitric oxide), NO2(nitrogen dioxide), OH(hydroxyl), ROO(proxyl), RO(alkoxyl), HO2(hydroperoxyl) 라디칼(radical) 등의 산화반응에 기인하며 생체 내에서는 이런 유해한 라디칼인 유리기로부터 생체를 방어하기 위한 수단으로써 항산화 효소인 슈퍼옥시드 디스무타제(SOD, superoxide dismutase)는 슈퍼옥시드 라디칼(superoxide radical)을 환원시켜 H2O2로 전환시키며 이때 생성된 H2O2등은 카탈라제(CAT; catalase), 글루타치온 퍼옥시다제(GSH-px; glutathione-peroxidase) 등의 항산화 효소나 비타민 E, 글루타치온 등의 항산화 물질이 존재하여 유리기를 제거함으로써 생체를 산화적 손상으로부터 보호한다(Ishinaga M, et al., daily intake of fatty acids, sterols, and phospholipids by Japanese women and serum cholesterol, J. Nutr. Sci. Vitaminol, 40, pp.557-567, 1994).
그러나 이러한 항산화 방어계가 유리기 생성을 조절할 수 없을 정도로 저하될 때 조직의 산화적 스트레스와 손상이 촉진되며 체내에서 생성된 과잉의 유리기와 지질 과산화물은 단백질의 산화, DNA 손상과 같은 산화적 스트레스에 의한 상해를 증가시킨다.
이에 본 발명자들은 산화적 스트레스를 억제하여 항산화 활성을 가지는 천연 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 동백나무 유래 겨우살이 추출물이 항산화능이 우수함을 확인하였으며, 이를 통해 항산화제로서의 가능성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 상기 산화적 스트레스를 억제하여 항산화 효과를 나타낼 수 있다.
또한 멜라닌 색소 억제를 달성할 수 있는 항산화 작용 역시 피부 미백 효과를 나타내는 중요한 지표가 될 수 있다.
상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 이들의 혼합용매(예를 들어, 함수알코올, 함수글리세린, 함수에틸렌글리콜, 함수프로필렌글리콜, 함수 부틸렌글리콜)중에서 선택된 것일 수 있고, 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알코올에서 선택된 용매로 추출되는 것 일 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물이 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알코올 추출물인, 화장료 조성물을 제공한다.
상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 티로시나아제를 억제하는 활성이 뛰어나 미백효과가 우수할 수 있다.
상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 산화적 스트레스를 조절하는 항산화 효과가 우수할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 항산화용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 하기의 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
(a) 동백나무 유래 겨우살이를 세척 후 건조하는 단계;
(b) 상기 건조한 겨우살이를 동결건조하여 분말화하여 겨우살이 분말을 수득하는 단계;
(c) 상기 겨우살이 분말에 열수 또는 유기용매를 겨우살이 분말의 3 내지 7배 (w/v) 로 첨가하여 추출하는 단계;
(d) 상기 추출물을 원심분리하고 여과한 다음 감압농축하는 단계; 및
(e) 상기 농축물을 동결건조 하는 단계.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 (a)의 겨우살이는 제주도에서 자생하는 동백나무에서 채취한 겨우살이를 사용할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 (b)에서 겨우살이를 분말화 할 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니나 동결건조하여 분말화하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 (c)의 추출용매는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것일 수 있으며, 상기 유기용매로는 C1 내지 C4 저급 알코올을 이용하는 것일 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 (c)의 열수 또는 유기용매는 겨우살이 분말의 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것, 2 내지 9배 또는 3 내지 7배일 수 있으나 이 역시 제한되지 않는다.
상기 단계 (c)의 추출방법으로 물을 사용할 경우, 이에 제한되는 것은 아니나 열수일 수 있으며, 열수를 첨가하여 추출하는 경우, 100 내지 150℃의 온도에서 멸균하는 것을 더 포함하는 것일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 (c)의 추출방법으로 유기용매를 사용할 경우, 이에 제한되는 것은 아니나 에탄올 또는 메탄올일 수 있으며, 상기 유기용매를 첨가하여 추출하는 경우, 100 내지 200 rpm, 20 내지 30℃ 로 60 내지 80 시간 동안 추출한 것을 더 포함하는 것일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 상기 (d) 단계의 추출물은 1000 내지 2000 rpm에서 10 내지 20분 동안 원심분리하고, 0.4 내지 0.5 μm 의 필터로 여과하여 부유성분을 제거한 것일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 팩, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 사용하여 통상의 화장료 제조방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 화장료 조성물 분애에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 특히 화장수, 로션, 크림, 에센스 형태로 제조되는 것일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 화장료 조성물의 총 액상 중량에 대하여 0.1 중량% ~ 10 중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있고, 또한 화장료 조성물의 총 건조중량에 대하여 0.001 ~ 5 중량% 또는 0.01 ~ 3 중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있다.
또한 본 발명은 동백나무 유래 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 피부 미백용 또는 항산화용 식품 조성물일 수 있다.
상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 피부에 침착된 멜라닌 색소의 색을 엷게 하는데 도움을 주는 기능을 가질 수 있으며, 피부에 멜라닌 색소가 과다 침착되는 것을 방지하여 피부 색소 침착 질환의 발생을 억제함으로써 피부의 미백에 도움을 주는 기능을 가질 수 있다. 이와 같은 미백은 티로시나아제 활성을 억제함으로서 달성될 수 있다.
상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 피부에서 발생하는 산화적 스트레스에 대한 항산화능을 가질 수 있다.
상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 이들의 혼합용매 중에서 선택된 것일 수 있고, 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알코올에서 선택된 용매로 추출될 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물이 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알코올 추출물인 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 동백나무 유래 겨우살이 추출물 이외에도 미백 또는 항산화 활성에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로써 함유할 수 있다.
본 발명에서 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등;및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 식품 조성물을 포함하는 피부 미백용 건강기능식품 또는 항산화용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서 용어 "건강기능 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 원료 조성물 중 1 ~ 10 중량%, 바람직하게는 5 ~ 10 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 전체 식품 100 중량%에 대하여 1 내지 15 중량% 포함되도록 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제 또는 음료로 제조되는 경우에는 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
이상 본 명세서에 기재된 수치 값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
재료 준비
1-1. 동백나무 유래 겨우살이 채집
제주도 서귀포시 소재 동백수목원 카멜리아 힐에 소재한 동백나무 재래종 한 그루를 지정하여, 이 동일한 숙주식물에서 기생하는 겨우살이를 봄(5월), 여름(8월), 가을(11월), 겨울(2월) 시기별로 채집하여 사용하였다. 본 실험에 사용한 동백나무 유래 겨우살이의 채집 과정은 도 1에 도시한 바와 같다.
1-2. 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 제조
상기 시기별로 채취한 동백나무 유래 겨우살이는 증류수로 세척 및 건조 후 동결건조(PVTFI 10A, (주)일신랩, 한국)하여 분쇄하고, 분말상태(powder)의 시료는 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하여 다음 실험에 사용하였다.
상기 분말상태의 각 시료에 각각 열수, 70% 에탄올(ethanol, EtOH), 100% 메탄올(methanol, MeOH)을 추출 용매로 건물 중량의 5배 추출용매량 (g/mL, W/V)으로 첨가하여 유효성분 추출하기 위한 실험을 다음과 같이 수행하였다.
70% 에탄올과 100% 메탄올은 shaking incubator를 이용하여 150 rpm, 25℃의 조건으로 72 시간동안 추출하여 제조하였다. 열수의 경우 121℃ autoclave법을 이용하여 1 시간 동안 추출하여 제조하였다.
상기 수득한 70% 에탄올, 100% 메탄올 에탄올, 열수 겨우살이 추출물은 1500 rpm에서 15 분간 원심분리 시키고 0.45 μm의 여과필터를 이용하여 부유성분을 제거하였으며, 감압농축(Buchi rotavapor R-200, New castle, DE, US)을 통해 얻어낸 고형성분을 다시 동결건조 하여 다음 실험에 사용하기 전까지 보관하였고, 실험 시에는 dimethyl sulfoxide(DMSO) 혹은 phosphate-buffered saline(PBS)을 이용하여 stock solution을 만든 다음 적정 농도로 희석하여 사용하였다(도 2).
따라서, 본 발명에서 추출된 추출물의 종류는 총 12개이며 다음과 같다.
1) 5월 동백나무 유래 겨우살이 추출물 3종
- 70% 에탄올, 100% 메탄올 에탄올, 열수 추출물
2) 8월 동백나무 유래 겨우살이 추출물 3종
- 70% 에탄올, 100% 메탄올 에탄올, 열수 추출물
3) 11월 동백나무 유래 겨우살이 추출물 3종
- 70% 에탄올, 100% 메탄올 에탄올, 열수 추출물
4) 2월 동백나무 유래 겨우살이 추출물 3종
- 70% 에탄올, 100% 메탄올 에탄올, 열수 추출물
수확시기별 동백나무 유래 겨우살이의 생리활성 탐색을 위해 3가지 용매(100% MeOH, 70% EtOH 및 열수)를 이용하여 유효성분을 추출하고 농축한 다음 동결건조한 후 획득한 고형분의 수율은 다음과 같다. 수확시기별 수율은 100% MeOH (4.2-7.1%)보다 70% EtOH (7.2-11.3%)이 높은 것으로 나타났다. 8월 열수 추출물이 18.5%로 가장 높은 수율을 나타내었으며, 11월 겨우살이 시료에서 가장 낮은 비율(4%)로 고형분이 추출되는 것으로 나타났다.
<실시예 2>
동백나무 유래 겨우살이의 폴리페놀류 성분 분석
2-1. 동백나무 유래 겨우살이 총 폴리페놀 함량 측정
폴리페놀 화합물은 flavonoids, anthocyanins, tannins, catechins, isoflavones, lignans, resveratrols 등을 총칭하며, 식물계에 널리 분포되어있는 phytochemical로 특히 과일 및 엽채류에 다량 함유되어 있다. 폴리페놀에 존재하는 다수의 히드록실기(-OH)와 페놀 고리에 의한 공명구조는 여러 화합물과 쉽게 결합하는 특성을 가지고 있어 지질 산화, 활성 산소 제거 등에 기여하여 항산화 및 항암, 항염 등의 약리 효과가 뛰어나다. 이에 동백나무 유래 겨우살이의 유효성분을 총 폴리페놀, 플라보노이드, 비타민 C, 카로티노이드, 클로로필 a, b 수준에서 정량하였다.
상기 실시예 1에서 준비한 동백나무 유래 겨우살이 추출물 각각의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis의 방법을 변형하여 측정하였다. 시기별로 채집한 겨우살이 고형 추출물에 DMSO 또는 PBS를 첨가하여 제조한 겨우살이 농축물에 50% Folin-Ciocalteu 시약, 95% EtOH와 DW를 가하였고, 5 분 후 5% sodium carbonate 용액을 첨가한 후 혼합하고 1 시간동안 차광하여 발색시킨 다음 microplate reader (Spectra MR, Dynex, VA, US)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하고 gallic acid 표준용액을 사용하여 구한 검량선에 의해 정량하여 측정하였다.
동백나무 유래 겨우살이에 함유된 폴리페놀의 함량을 측정한 결과 70% EtOH의 총 폴리페놀 함량이 8월, 11월에서 각각 37,082 mg gallic acid equivalence (GAE)/100 g, 83,708 mg GAE/100 g으로 유의적으로 높았으며, 100% MeOH의 총 폴리페놀 함량이 22,359-64,485 mg GAE/100 g, 열수가 7,635-37,628 mg GAE/100 g의 범위로 나타남을 확인하였다(도 3). 시기적으로 8월 수확물에 비해 11월 수확물의 함량이 약 2.3-4.9 배 가량 증가한 것으로 관찰하였다.
2-2. 동백나무 유래 겨우살이 총 플라보노이드 함량 측정
플라보노이드는 폴리페놀에 속하는 성분으로 C6-C3-C6를 기본골격으로 하며 노란색 내지는 담황색을 나타내는 페놀계 화합물의 총칭으로, 채소류와 식물의 잎, 꽃, 과실, 줄기 및 뿌리 등 거의 모든 부위에 함유되어 있을 뿐만 아니라 곡물, 과실류 등 자연계 도처에 풍부하게 함유되어 있다. 플라보노이드는 폴리페놀과 마찬가지로 활성 산소종을 효과적으로 제거하여 항산화능이 높다고 알려져 있으며 다양한 생리활성에 작용하는 것으로 보고되어 본 연구에서도 동백나무 유래 겨우살이의 플라보노이드 함량을 계측하였다.
상기 실시예 1에서 수득한 동백나무 유래 겨우살이 고형 추출물에 DMSO 또는 PBS를 첨가하여 제조한 겨우살이 농축물 시료 30 μL 당 5% sodium nitrite 용액 및 DW를 가하고 6 분 뒤 10% aluminium chloride 용액을 첨가한 후 다시 6 분간 실온에서 incubation 하였다. 4% NaOH 용액을 첨가한 후 DW로 총 용량을 맞추고 잘 혼합한 다음 15 분간 실온에서 반응시켰다. 반응시간이 종료된 후 microplate reader를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하고 rutin 표준용액을 사용하여 구한 검량선에 의해 정량하여 측정하였다.
동백나무 유래 겨우살이의 수확시기별 추출물의 플라보노이드 함량은 도 4와 같이 8월, 11월 에서는 70% EtOH에서 20,109-23,988 mg rutin equivalence (RE)/100 g으로 100% MeOH보다 약 1.2배 이상 많은 함유량을 나타내었으며, 2, 5월 에서는 반대로 100% MeOH에서 16,237-20,283 mg RE/100 g으로 70% EtOH보다 약 1.3배 이상 많은 함유량을 나타내었다. 또한, 8월과 11월의 열수 추출물에서는 3,298-4,806 mg RE/100 g으로 가장 낮은 함량을 보였다. 열수 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량이 현저히 낮게 측정되는 원인은 다수의 기존 연구 보고와 같이 고온의 열수 추출 과정이 유효성분을 파괴하여 야기되는 것으로 분석되었다. 통계프로그램을 사용하여 동백나무 유래 겨우살이의 수확시기별 각 추출물들 사이의 유의성을 살펴본 결과 8월과 11월의 100% MeOH, 70% EtOH, 열수 추출물은 통계적으로 유의성을 지녔고, 2월, 5월의 100% MeOH, 70% EtOH 추출물 또한 통계적으로 유의성을 나타내었다.
2-3. 동백나무 유래 겨우살이 L-ascorbic acid 함량 측정
비타민 C (L-ascorbic acid)는 유리 라디칼을 소거하는 물질로 강력한 항산화 효능을 띄는 대표적인 천연 항산화 물질이다. 비타민 C의 안전성은 전 세계적으로 인정받고 있어 다양한 향장품 소재 및 기능성 원료로 각광받고 있다. 이에 비타민 C 함량 측정을 통해 동백나무 유래 겨우살이 소재화 가능성을 평가하고자 하였다.
동백나무 유래 겨우살이의 ascorbic acid 함량은 hydrazine 비색법을 기반으로 측정하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 시기별 겨우살이 고형분을 준비하여 15 mg/mL의 농도로 1% metaphosphoric acid 용액에서 150 rpm, 25℃에서 차광하여 72 시간동안 추출하였다.
추출 시료는 불순물을 제거하기 위해 0.45 μm 여과필터와 원심분리를 진행하였다. 준비된 겨우살이 시료 25 μL 당 2,6-dichloroindophenol 225 μL를 첨가하여 515 nm에서 흡광도를 측정하고 ascorbic acid 표준용액을 사용하여 구한 검량선에 의해 정량하였다.
동백나무 유래 겨우살이의 비타민 C 함량을 hydrazine 비색법에 의거하여 측정한 결과는 도 5와 같다. 건조중량 100 g 당 비타민 C의 농도는 8월 수확물에서 100% MeOH이 1,385 mg ascorbic acid (AA)/100 g, 70% EtOH이 960 mg AA/100 g으로 100% MeOH 추출물이 높은 함량을 가지고 있는 것을 볼 수 있으며, 열수 추출물에서는 271 mg AA/100 g으로 가장 낮은 함량을 나타내었다. 또한, 11월 수확물에서 100% MeOH과 70% EtOH, 열수 추출물이 각각 1,007, 707, 217 mg AA/100 g으로 8월과 같은 경향을 나타내었다. 반면, 2월 수확물의 경우 100% MeOH이 543 mg AA/100 g, 70% EtOH이 1,258 mg AA/100 g으로 8월, 11월 수확물의 결과와는 반대로 70% EtOH에서 높은 함량을 나타내었고, 5월 수확물도 2월 수확물의 경향과 마찬가지로 70% EtOH에서 1,396 mg AA/100 g으로 100% MeOH보다 높은 함량을 나타내었다. 수확시기별 비타민 C 함량을 전체적으로 살펴본 결과 100% MeOH 추출물은 8월, 70% EtOH 추출물은 5월에 비슷한 수치의 높은 함유량을 보였으며, 이러한 결과는 상록나무의 특성상 1년 내내 잎이 지지 않기 때문에 비타민 C 함량이 유기용매에서 전체적으로 비슷한 함량을 나타나는 것으로 예상된다.
2-4. 동백나무 유래 겨우살이 총 카로티노이드 및 클로로필 함량 측정
카로티노이드는 β-이오논 핵을 갖는 식물의 주요 색소체 중 하나로 생체 내에서 레티놀로 전환되어 프로비타민 A로 작용할 뿐만 아니라β-카로틴을 중심으로 항산화 활성을 띈다. 최근 들어 카로티노이드는 단순히 색소로서의 의미에서 탈피하여 기능성 성분으로서의 가치를 주목받고 있기에 본 발명의 겨우살이 추출물의 총 카로티노이드 함량을 측정하였다.
상기 실시예 1에서 수득한 동백나무 유래 겨우살이 고형 추출물에 시료 1 mg 당 1 mL의 DMSO 또는 PBS를 첨가하여 차광 상태로 150 rpm, 25℃로 72 시간동안 추출하였다. 그 다음 추출 시료는 불순물을 제거하기 위해 0.45 μm 여과필터와 원심분리를 진행하였다. 불순물이 제거된 겨우살이 추출물은 microplate reader에 의해 470, 653, 666 nm에서 흡광도를 측정하여 총 카로티노이드 및 클로로필 함량을 다음 공식에 의해 산출하였다.
Total carotenoid contents (mg/L) =
(1000 × A470) - (2.86 × chlorophyll a) - (129.2 × chlorophyll b/245)
Chlorophyll a (mg/L) = (15.65 × A666) - (7.34 × A653)
Chlorophyll b (mg/L) = (27.05 × A653) - (11.21 × A666)
도 6에 나타낸 바와 같이 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 카로티노이드 함량은 추출 용매 및 수확시기에 따라 현격한 차이를 나타내었으며, 추출물 중에서 100% MeOH이 70% EtOH과 열수에 비해 높은 함량을 나타내었다. 우선적으로 8월 수확물을 살펴보면 100% MeOH이 27,476 mg/100 g으로 70% EtOH (11,693 mg/100 g)과 열수 (6,589 mg/100 g)보다 약 2-4배가량의 높은 수치의 함량을 보였으며, 11월 수확물에서 또한 100% MeOH (15,468 mg/100 g)에서 가장 높은 함량으로 70% EtOH (8,646 mg/100 g)과 열수 (6,279 mg/100 g)보다 약 2-3배가량 높은 함량을 나타내어 8월과 유사한 경향성을 띄었다. 2월 수확물에서는 100% MeOH이 49,175 mg/100 g으로 수확시기 중에서 가장 높은 함량을 나타내었으며, 70% EtOH (16,167 mg/100 g)과 통계적으로 유의성을 나타내었다. 5월 수확물에서 또한 앞서 나타난 2월 수확물과 같은 경향을 나타내었으며, 100% MeOH (44,339 mg/100 g)과 70% EtOH (17,065 mg/100 g)에서 통계적으로 유의성을 나타내었다. 특히 2월 수확물에서 다른 계절 수확물 보다 2-4배 높은 카로티노이드 함량을 보였는데 이는 카로티노이드가 노랑, 오렌지, 분홍의 색소를 함유함으로서 겨우살이가 겨울에 특히 누런 초록빛을 띄기 때문으로 사료된다.
클로로필 a, b는 천연 녹색 색소의 일종으로 감광체로 작용하여 지질 광산화를 촉진하는 것으로 알려져 있으나, 차광된 상태에서는 유리 라디칼을 소거하는 항산화제로 알려져 있다. 이에 동백나무 유래 겨우살이의 항산화능을 확인하기 위해 클로로필 a, b 수준을 조사하였다.
동백나무 유래 겨우살이의 수확시기별 클로로필 a, b 수준을 조사한 결과 모두 100% MeOH에서 유의적으로 높게 측정되었으며, 8월을 기준으로 수확시기가 지남에 따라 감소됨을 확인하였다. 70% EtOH에서 클로로필 a, b 의 평균값이 약 172 mg/100 g, 324 mg/100 g으로 확인되었으며, 100% MeOH의 클로로필 a, b 의 평균값은 약 1908 mg/100 g, 800 mg/100 g으로 70% EtOH과 반대되는 결과를 나타내었다(도 7). 흥미롭게도 상기 연구 결과와 달리 클로로필 함량은 70% EtOH보다 열수에서 통계적으로 높게 나타나는데 이는 열처리에 따라 단백질과 약한 결합 상태로 존재하던 클로로필이 용매 상으로 유리되어 발생한 것으로 판단된다.
2-5. 동백나무 유래 겨우살이의 DPPH 라디칼 소거능 측정
동백나무 유래 겨우살이의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하기 위해, 상기 실시예 1에서 수득한 동백나무 유래 겨우살이 고형 추출물에 DMSO 또는 PBS를 첨가하여 제조한 겨우살이 농축물 시료를 여러 농도로 희석하여 준비한 시료 용액 100 μL에 실험 직전 제조된 동량의 4 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 용액을 첨가하고 차광하여 10 분간 실온에서 반응시켰다.
517 nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 소거능을 다음 공식에 의해 산출하였다.
% inhibition = [{(C-CB)-(S-SB)}/(C-CB)] × 100;
S: absorbance of the sample, SB: Sample blank, C: control, CB: control blank
DPPH는 산화 유도체로 상쇄 능력이 큰 항산화 물질에 의하여 환원 반응이 진행됨에 따라 탈색되는 특성을 지니고 있어 항산화 효과를 측정하는 지표로 많이 사용되는 방법이다. 각 시료의 전자공여능을 측정한 결과는 도 8과 같다. IC50값을 계산하여 정리한 표 1에 나와 있는 것과 같이 8월 수확물에서 100% MeOH의 IC50값은 0.9 mg/mL로 70% EtOH (1.2 mg/mL)의 값과 유사하였으나 열수 (2.5 mg/mL)에서 유의하게 그 값이 증가하여 100% MeOH과 70% EtOH에 비해 낮은 전자공여 활성을 보인 반면, 11월 수확물에서는 페놀성 화합물이 합성됨에 따라 비례적으로 증가하여 0.6-0.8 mg/mL로 전자공여효과가 우수하였다. 또한, 도 8에 나타난 그래프를 비교한 결과 2월과 5월 수확물에서 100% MeOH 추출물이 높은 활성을 나타내는 것을 관찰할 수 있었으며, 최고농도인 1 mg/mL에서 양성대조군으로 측정한 ascorbic acid에 도달하는 등의 높은 값을 나타내었다. 수확시기별 추출물의 전체적인 경향은 100% MeOH에서 70% EtOH과 열수보다 유의적으로 높게 측정됨을 알 수 있었으며, 양성대조군에 가까운 값을 나타내어 상당히 높은 DPPH 소거 활성을 지니고 있다는 것을 확인하였다.
2-6. 동백나무 유래 겨우살이의 Superoxide 라디칼 소거 활성
Superoxide radical은 ROS에서 유래된 가장 대표적인 산소 라디칼로 dismutation 반응 후 hydroxyl radical로 전환되며 생체 거대분자를 손상시킨다. 산화형 철(Fe3 +)을 환원형 철(Fe2 +)로 환원시켜 fenton 반응을 유도하게 되거나, 단백질의 구조에 직접적인 변형을 가하여 효소의 불활성을 유도하는 등 물질의 산화와 발암 과정에 밀접한 관계를 갖고 있어, 이를 통해 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이의 항산화능을 측정하고자 하였다.
동백나무 유래 겨우살이 시료 10 μL에 50 mM sodium carbonate buffer (pH 10.5), 3 mM xanthine 10 μL, 3 mM ethylenediamind tetraacetic acid (EDTA) 10 μL, 0.15% bovine serum albumin solution 10 μL를 순서대로 넣고 실온에서 반응시켰다. 반응 후 6 mU/mL xanthine oxidase 100 μL를 넣고 실온에서 20분간 반응시킨 다음 6 mM copper (Ⅰ) chloride (CuCl) 10 μL를 넣어 반응을 정지시키고 560 nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 소거능을 다음 공식에 의해 산출하였다.
% inhibition = [{(C-CB)-(S-SB)}/(C-CB)] × 100;
S: absorbance of the sample, SB: Sample blank, C: control, CB: control blank
도 9에서 나타난 결과와 같이 농도-의존적인 증가를 보이는 것을 확인하였다. 2월 수확물의 추출물 최고농도(1 mg/mL)에서 100% MeOH에서 72%, 70% EtOH에서 59%로 100% MeOH의 소거활성이 유의적으로 높은 활성을 나타내었으나, 5월 수확물에서는 100% MeOH에서 80%, 70% EtOH에서 90%의 소거활성을 나타내어 70% EtOH이 양성대조군으로 측정한 rutin (IC50값; 0.2 mg/mL)에 가깝게 높은 소거 활성을 나타내었다. 표 1에는 superoxide 라디칼 소거활성의 IC50값을 계산하여 정리하였으며, 다른 라디칼 소거 활성과 비교하여 살펴보았을 때 비슷한 소거활성을 가지는 것을 확인하였다.
2-7. 동백나무 유래 겨우살이의 Nitric oxide 라디칼 소거능 측정
Nitric oxide (NO)는 생체 내에서 NO synthase (NOS) 효소에 의해 L-araginine으로부터 생성되는 반응성이 강한 라디칼이다. NO는 여러 생리적 기능에 있어 중추적 역할을 하지만 과량생성 시 염증반응을 일으키고 조직의 파괴 및 면역체계에 이상을 일으켜 암을 비롯한 질병을 유발한다.
상기 실시예 1에서 수득한 동백나무 유래 겨우살이 고형 추출물에 DMSO 또는 PBS를 첨가하여 제조한 겨우살이 농축물 시료 50 μL에 인산완충용액(pH 7.0)으로 제조한 동량의 10 mM sodium nitroprusside를 첨가하여 25℃에서 3 시간동안 incubation한 후, 100 μL Griess reagent (1% sulfanilamide and 0.1% N-naphthylethylene diamine dihydrochloride in 2.5% polyphosphoricacid)와 혼합하여 5 분간 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 소거능을 다음 공식에 의해 산출하였다.
% inhibition = [{(C-CB)-(S-SB)}/(C-CB)] × 100;
S: absorbance of the sample, SB: Sample blank, C: control, CB: control blank
도 10과 표 1에 제시한 바와 같이 수확시기별 산화질소 소거능을 IC50값으로 살펴보면 8월, 11월 100% MeOH은 1.5-1.6 mg/mL, 70% EtOH 1.1-1.2 mg/mL으로 차이가 없었으며, 열수는 1.7-3.2 mg/mL으로 11월의 소거활성이 소폭 증가함을 보였다. 2월 수확물은 100% MeOH에서 0.5 mg/mL, 70% EtOH에서 0.6 mg/mL로 8월, 11월보다 약 2-3배가량의 높은 산화질소 소거활성을 보였으며, 통계적으로 유의함을 확인하였다. 또한, 수확시기 중에서 가장 높은 소거활성을 가지며 양성대조군으로 사용한 gallic acid (IC50값; 0.4 mg/mL)의 소거활성과 비교하여 살펴본 결과 유사한 소거활성을 나타내어 효능이 뛰어남을 알 수 있었다. 5월 수확물의 IC50값은 100% MeOH과 70% EtOH에서 모두 0.7 mg/mL로 유의한 활성을 나타내었으며, 2월 수확물과 비슷한 경향으로 8월과 11월에 비해 약 1.7-2배가량 높은 소거활성을 나타내었다.
2-7. 동백나무 유래 겨우살이의 금속 이온 소거능 측정
Fe2 + 나 Cu2 +를 포함하는 금속 이온 혹은 금속염은 유리 라디칼 생성을 촉진하여 산화적 스트레스를 유발하는데, 금속 봉쇄력은 이와 같은 금속 촉매제로 인한 자유 라디칼 생성을 억제함으로써 지질 산화를 방지할 수 있는 능력을 측정하는 지표로 이용된다.
각 동백나무 유래 겨우살이 시료를 250 μL 씩 96 well plate에 분주하여 2 mM ferrous chloride (FeCl2) 5 μL, 5 mM ferrozine [3-(2-pyridyl)-5,6-diphenyl-1,2,4-triazine-p,p-disulfonic acid monosodium salt hydrate] solution 10 μL를 가하고 상온에서 10 분간 반응시켰다.
562 nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 소거능을 다음 공식에 의해 산출하였다.
% inhibition = [{(C-CB)-(S-SB)}/(C-CB)] × 100;
S: absorbance of the sample, SB: Sample blank, C: control, CB: control blank
동백나무 유래 겨우살이의 금속 봉쇄력 측정 결과는 도 10와 같이 산출되었으며, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)를 양성대조군으로 이용하여 비교하였다. 금속 봉쇄력은 시료 농도가 증가함에 따라 비례적으로 상승하였으며 가장 낮은 농도(0.25 mg/mL)에서 측정한 수확시기별 모든 추출물에서 50%의 활성을 넘는 것으로 보아 상당한 활성을 나타내는 것을 알 수 있다. 표 1에 정리한 바와 같이 IC50값이 모든 시기별 수확물에서 0.3-0.5 mg/mL로 양성대조군으로 수행된 EDTA (0.1 mg/mL)와 비교하여 효율적으로 작용함을 확인하였다. 금속 이온 소거능은 다른 라디칼 소거 양상과 다소 판이한 경향으로 100% MeOH이 가장 낮은 효능을 보였으나, 이는 추출 용매 간의 활성 차이가 미미할 뿐 아니라 시료 중 금속이온을 포집할 기능 물질의 함량이 낮을 가능성 등 여러 가지 요인이 영향을 끼친 것으로 추정된다.
2-8. 동백나무 유래 겨우살이의 환원력 측정
동백나무 유래 겨우살이 환원력 측정은 ferric-ferricyanide 반응물이 수소를 제공하여 Fe2 +로 전환되면서 생성되는 반응물인 prussian blue 값을 흡광도 측정을 통해 산정하는 원리로, 일반적으로 전자공여를 통한 라디칼 소거활성 반응인 DPPH나 ABTS의 라디칼 소거능과 유사한 양상을 나타내는 것으로 알려져 있다.
환원력은 Fe3 + 혼합물이 항산화 물질에 의해 Fe2 +로 환원되며 FeCl3와 반응하여 생성되는 Perl's prussian blue를 검증하여 확인하였다.
동백나무 유래 겨우살이 400 μL 당 동량의 200 mM sodium phosphate buffer (pH 6.6) 및 1% potassium ferricyanide를 가하여 50℃에서 20 분간 반응시킨 후 10% trichloroacetic acid를 동량 첨가하여 반응을 정지시켰다. 모든 시료에 20 μL의 0.1% ferric chloride 와 100 μL의 DW를 각각 첨가한 뒤 700 nm에서 흡광도를 측정하여 소거능을 다음 공식에 의해 산출하였다.
% inhibition = [{(C-CB)-(S-SB)}/(C-CB)] × 100;
S: absorbance of the sample, SB: Sample blank, C: control, CB: control blank
본 연구 결과 역시 전자공여능과 상동한 추이를 보이는 성과를 수립할 수 있었다(도 12, 표 1). 동백나무 유래 겨우살이 8월 수확물의 경우, 100% MeOH (1.0 mg/mL)의 IC0.5값과 70% EtOH (1.1 mg/mL)의 IC0.5값 간의 유의차가 없었으나 열수 추출물에서는 환원력이 현저히 떨어져 IC0.5값이 2.9 mg/mL로 산출된다. 11월 수확물의 경우 100% MeOH 0.9 mg/mL과 70% EtOH 1.1 mg/mL으로 8월 수확물과 비슷한 값을 나타내었으나 열수에서는 1.8 mg/mL으로 8월 수확물에 비교하여 환원력이 소폭 상승한 것을 볼 수 있었으며, 통계적 유의성을 확인할 수 있었다. 2월 수확물에서는 100% MeOH에서 1.1 mg/mL, 70% EtOH에서 1.2 mg/mL으로 추출물간의 유의함을 확인하였고, 5월 수확물에서 또한 100% MeOH 0.9 mg/mL, 70% EtOH 1.1 mg/mL으로 추출물 간의 유사성과 동백나무 유래 겨우살이의 환원력은 수확시기별로 차이가 없음을 확인하였다.
2-9. 동백나무 유래 겨우살이의 항산화 활성 측정
동백나무 유래 겨우살이 항산화 활성을 IC50값으로 계산하여 정리한 결과는 표 1과 같다. 전체적인 항산화 활성을 추출물별로 살펴보면 100% MeOH 추출물이 다른 추출물 보다 높은 활성을 나타나는 것을 볼 수 있다. 또한 8월 수확시기가 넘어가면서 활성이 증가하는 양상을 보였으며, 2월 수확물에서는 nitric oxide 소거활성과 금속 봉쇄력이 가장 높은 활성을 가진 것을 볼 수 있다. 동백나무 유래 겨우살이의 활성은 수확시기 별로 소폭의 증가와 감소를 반복하였으나 전체적으로 높은 항산화 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다.
| Group | Solvent | IC 50 values (mg/mL) 1) | IC 0.5 (mg/mL)1) | |||
| DPPH 라디칼 소거활성 | Superoxide 라디칼 소거활성 |
Nitric oxide
소거활성 |
금속 봉쇄력 | 환원력 | ||
| AUG | 100% MeOH | 0.9 ±0.0022)a | - | 1.6 ± 0.04a | 0.4 ± 0.0004a | 1.0 ± 0.01a |
| 70% EtOH | 1.2 ± 0.02a | - | 1.2± 0.12a | 0.3 ± 0.01b | 1.1 ± 0.01b | |
| Hot water | 2.5 ± 0.47b | - | 3.2 ± 0.9b | 0.3 ± 0.01c | 2.9 ± 0.01c | |
| NOV | 100% MeOH | 0.6± 0.003a | - | 1.5 ± 0.1a | 0.4 ± 0.05a | 0.9 ± 0.01a |
| 70% EtOH | 0.8 ± 0.03b | - | 1.1 ± 0.07b | 0.3 ± 0.01b | 1.1 ± 0.01b | |
| Hot water | 0.7 ± 0.06c | - | 1.7 ± 0.07c | 0.3 ± 0.01b | 1.8 ± 0.02c | |
| FEB | 100% MeOH | 0.6 ±0.02* | 0.6 ±0.01* | 0.5 ±0.02* | 0.1 ±0.01* | 1.1 ±0.01* |
| 70% EtOH | 0.7 ±0.01 | 0.7 ±0.02 | 0.6 ±0.01 | 0.1 ±0.01 | 1.2 ±0.02 | |
| MAY | 100% MeOH | 0.5 ±0.001 | 0.4 ±0.03 | 0.7 ±0.01* | 0.5 ±0.01* | 0.9 ±0.02* |
| 70% EtOH | 0.7 ±0.003 | 0.4 ±0.02 | 0.7 ±0.02 | 0.4±0.003 | 1.1 ±0.004 | |
| All value are mean ± S.D . 1) IC 50 ,IC 0 . 5 means the effective concentration at which the antioxidant was 50%. 2) Meanswithinacolumnwithdifferentletter(a-c)aresignificantlydifferent, p < 0.05. * Each value is expressed as mean on at which the statistically differences from 100% MeOH extracts ( p < 0.05). | ||||||
<실시예 3>
동백나무 유래 겨우살이의 미백 활성평가
티로시나아제(Tyrosinase)는 피부 기저층에 있는 melanocyte의 melanosome에서 tyrosine 혹은 3,4-dihydroxy-phenylalanine (DOPA)를 기질로 하여 피부의 색소성분인 melanin을 생합성하는데 있어서 key enzyme으로 작용하는 효소이다. 멜라닌(Melanin)은 생물체에 매우 널리 분포되어 있는 색소로 quinone과 hydroquinone monomer unit의 중합체이다. 주로 암갈색 또는 적갈색이며 티로시나아제의 작용에 의한 quinone의 생성이 선행된 후에 아미노산 혹은 단백질과의 중합 반응에 의해 합성되며 피부보호 작용을 하나, 과잉 생성 시 각질형성세포로 이송되어 기미, 주근깨, 검버섯 등 색소침착을 유발한다. 티로시나아제 저해 활성은 피부암과 멜라닌 색소침착으로 인한 피부 질환의 치료 능력 때문에 임상학적으로 사용 가능할 뿐 아니라 햇볕에 탄 후 피부의 색소탈색과 미백 작용을 하기 때문에 화장품 산업에서 매우 중요하므로, 이에 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물의 tyrosianse inhibitor로서의 작용 유무를 mushroom tyrosinase 효소 활성 억제능 분석을 통해 확인하였다.
동백나무 유래 겨우살이를 1 mM L-tyrosine, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) 및 40 μL의 110 units/mL mushroom tysinase 혼합액에 첨가하여 25℃에서 15 분간 반응시켰다. 475 nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였으며 활성은 다음 공식에 의해 산출하였다.
Inhibitory activity (%) = {1-(S-SB)/(C-CB)} × 100;
S: sample, SB: sample blank, C: control, CB: control blank
그 결과, 동백나무 유래 겨우살이의 tyrosinase 억제율을 in vitro 상에서 탐색하였을 때 도 13에 제시한 바와 같이 겨우살이 추출물과 비례적으로 tyrosinase 억제능이 증강되었음을 확인할 수 있었다. Tyrosinase 억제 효능을 세부적으로 열거하여 보자면 8월 수확물의 경우 최고농도(500 μg/mL)에서 100% MeOH이 23.6%, 70% EtOH이 22.3%, 열수가 15.1%로 흡사한 값을 보였으며, 11월 수확물 역시 100% MeOH (27.4%), 70% EtOH (22.4%), 열수 (20.6%) 순으로 유사한 효력을 보임을 확인하였다. 2월과 5월 수확물에서는 100% MeOH에서 높은 효력을 보였으며, 각각 100% MeOH에서 28.1%, 17.8%, 70% EtOH에서 19.8%, 16.0%의 효력을 보여 본 발명의 동백나무 유래 겨우살이 추출물이 높은 티로시나아제 저해 효과를 소지한 것으로 확인하였다.
| Group | Solvent | IC 50 values (mg/mL) 1) |
| DPPH 라디칼 소거활성 | ||
| AUG | 100% MeOH | 1049.6 ±66.57a |
| 70% EtOH | 1101.2±118.39a | |
| Hot water | 1638.8 ±131.26b | |
| NOV | 100% MeOH | 886.6 ± 26.33a |
| 70% EtOH | 1131.5 ±100.38b | |
| Hot water | 1238.0 ±127.73b | |
| FEB | 100% MeOH | 859.0 ±24.522)* |
| 70% EtOH | 1300.2 ±67.23 | |
| MAY | 100% MeOH | 1406.4 ±159.63 |
| 70% EtOH | 1560.5 ±107.74 | |
| All value are mean ±S.D. 1)IC50meanstheeffectiveconcentrationatwhichtheantioxidantwas50%.2)Meanswithinacolumnwithdifferentletter(a-c)aresignificantlydifferent,p < 0.05. *Each value is expressed as mean on at which the statistically differences from 100% MeOH extracts (p < 0.05). | ||
통계처리
본 실험의 결과는 3회 반복 수행하여 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 통계 처리는 SPSS program (12.0)의 분산분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test, student’s t-test에 의해 p < 0.05인 경우 유의한 것으로 판정하였다.
또한, 라디칼 혹은 기능성의 50%를 소거할 수 있는 소거농도 IC50를 dose-response 곡선의 수식으로부터 계산하여 시험군 간의 활성을 비교하였다.
Claims (9)
- 동백나무 유래 겨우살이(Korthalsella japonica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 티로시나아제 활성을 억제하는 것인, 피부 미백용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 피부 항산화용인 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알코올 추출물인 화장료 조성물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 팩, 계면활성제 함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것인, 화장료 조성물.
- 동백나무 유래 겨우살이(Korthalsella japonica) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 식품 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 동백나무 유래 겨우살이 추출물은 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알코올 추출물인 식품 조성물. - 제6항의 식품 조성물을 포함하는 피부 미백용 건강기능성식품.
- 제6항의 식품 조성물을 포함하는 피부 항산화용 건강기능성식품.
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| J Food Science and Nutrition, Vol. 10, Pages 244-250(공개일: 2005.)* |
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