KR101957208B1 - Pseudoruegeria sp. M32A2M strain having algicidal activity against Alexandrium tamarense and uses thereof - Google Patents

Pseudoruegeria sp. M32A2M strain having algicidal activity against Alexandrium tamarense and uses thereof Download PDF

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고소라
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최영순
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Abstract

The present invention relates to a Pseudoruegeria sp. M32A2M strain having algicidal activity against Alexandrium tamarense and uses thereof. More specifically, since the Pseudoruegeria sp. M32A2M strain of the present invention selectively exhibits algicidal activity only against Alexandrium tamarense which generates paralytic shellfish poison, it is possible to minimize disturbance of aquatic ecology if red tide is controlled. Also, it is possible to maintain algicidal activity relatively stably even if cultural filtrate or heat-treated cultural filtrate is treated without directly treating a strain, thereby being more useful for killing Alexandrium tamarense, which is toxic plankton.

Description

알렉산드리움 타마렌스에 대해 살조 활성을 가지는 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주 및 이의 용도{Pseudoruegeria sp. M32A2M strain having algicidal activity against Alexandrium tamarense and uses thereof}To Shodoru having a killing activity against Alexandrium tamarens, the genus Leica M32A2M and its use {Pseudoreregeria sp. M32A2M strain having algicidal activity against Alexandrium tamarense and uses thereof}

본 발명은 알렉산드리움 타마렌스에 대해 살조 활성을 가지는 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a strain Shirodoru having a killing activity against Alexandrium tamarense and a use thereof.

우리나라 연안 해역에서 발생하는 유해성 적조는 해양환경의 오염으로 발생빈도와 기간이 늘어나고 있을 뿐만 아니라, 그 영역이 확대되어 막대한 피해를 일으키는 사회ㆍ경제적 문제로 대두되고 있다. 적조는 해수 중 증식촉진 물질의 과잉공급과 일사량, 수온 등 해양 환경이 적조생물의 성장조건에 알맞을 때 대량으로 번식하여 발생하는 현상으로서, 적조생물은 호흡 및 사체 분해 시 수중의 용존산소를 소비하여 수중의 다른 생물의 생존을 저해하며, 유해물질 및 독소를 분비하여 어패류를 폐사시키는 결과를 초래한다. 또한, 적조생물의 일부는 어패류를 독화시키는 종이 있어, 이 독화된 패류를 사람이 섭취하면 마비성ㆍ설사성 중독을 일으켜 사람의 건강까지도 위협하고 있어 사회ㆍ경제적으로도 심각한 문제가 되고 있다.In addition, not only the frequency and duration of pollution caused by pollution of the marine environment but also the social and economic problems that cause huge damage are widened. Red tide is a phenomenon that occurs when a marine environment such as an excess supply of growth promoting substances in seawater and an ocean environment such as solar radiation and water temperature is suitable for the growth conditions of red tide creatures, and red tide creatures consume dissolved oxygen in the water during breathing and carcass decomposition It inhibits the survival of other organisms in the water and releases harmful substances and toxins, resulting in the death of fish and shellfish. In addition, some of the red tide creatures are poisoned by fish and shellfish, and ingestion of these poached shellfish by humans causes paralysis and diarrhea poisoning, threatening human health, which is a serious social and economic problem.

한국 연안에서 출현하는 적조생물은 34종 이상이 보고되고 있다. 1980년대까지는 캐토세로스(Chaetoceros), 스켈레토네마(Skeletonema), 탈라시오시라(Thalassiosira) 및 니츠쉬이아(Nitzschia) 속 등의 규조류가 주요 원인생물이었으나, 1981년부터 알렉산드리움(Alexandrium), 코클로디니움(Cochlodinium), 짐노디니움(Gymnodinium) 및 헤테로시그마(Heterosigma) 속 등의 편모조류가 주요적조 원인생물로 나타나고 있다. 특히, 유독성 와편모류인 알렉산드리움(Alexandrium) 속은 전 세계적으로 30여 종이 보고되고 있고, 일부 종은 독성은 다르지만 화학적으로 유사한 20여 종의 신경성 독소(neurotoxins)를 생산한다.More than 34 species of red tide creatures appearing on the Korean coast have been reported. Until the 1980s, Caterpillar Chitose Ross (Chaetoceros), skeletal Loreto nematic (Skeletonema), Tala Please Syrah (Thalassiosira) and Chemnitz sheet Ah (Nitzschia) yieoteuna Diatoms are a major cause of creatures, such as speed, since 1981 Alexandria Solarium (Alexandrium), kokeulrodinium ( Cochlodinium ), Gymnodinium ( Gymnodinium ) and Heterosigma genus are the major red tide organisms. Particularly, about 30 species of toxin-dominant Alexandrium genus are reported worldwide, and some species produce about 20 chemically similar neurotoxins with different toxicities.

상기 알렉산드리움(Alexandrium) 속의 유독종으로는 알렉산드리움 타마렌스(A.tamarense), 알렉산드리움 카테넬라(A. catenella) 및 알렉산드리움 미누툼(A. minutum) 등이 알려져 있고, 이 중에 우리나라에서는 진해만과 여수만에서 알렉산드리움 타마렌스(A. tamarense), 알렉산드리움 카테넬라(A. catenella) 등이 출현하는 것으로 보고되고 있다. remind Alexandria Solarium (Alexandrium) and toxic species of the genus is Alexandria Solarium Tama Lawrence (A.tamarense), Alexandria Solarium categories Nella (A. catenella) and Alexandria Solarium minu Tomb (A. minutum), such as is known, is in the country and Jinhae Alexandria Solarium Tama lances Yeosu only (A. tamarense), Alexandria Solarium Nella category (A. catenella) have been reported that such the appearance.

적조의 피해를 최소화하기 위한 적조생물의 구제 또는 제거 방법의 일환으로, 최근에 해양미생물 또는 바이러스를 이용한 생물학적 방제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 아직까지 적조를 효과적으로 방제하는 방법의 개발은 미진한 상황이다. 우리나라에서는 90년대 후반부터 '황토 살포법'을 실시해 오고 있다. 자연에서 산출되는 황토가 다른 방법에 비해 환경 친화적이라는 점을 중시하여 사용하고 있지만, 황토에 의한 2차 오염 또한 새로운 문제점으로 제기되고 있다. 적조 피해를 줄이기 위해서는 하수 처리 시설의 확충이나 가두리 양식장의 시설을 보다 환경친화적으로 만들어 부영양화의 원인을 줄이는 것이 근본적인 해결책이겠지만, 이 또한 막대한 비용과 시간이 요구되는 현실이다. 이에 최근에는 적조 발생 해역에 존재하는 해양미생물을 이용하는 방법이 보다 안전하고 환경친화적인 적조 제어법으로 인식되어 많은 연구가 진행되고 있다. 또한, 지금까지 보고된 적조생물에 대한 살조 미생물의 연구에 있어서 알렉산드리움 타마렌스(A. tamarense)를 제어하는 미생물에 대한 연구는 미진한 실정이다.Recently, research on biological control using marine microorganisms or viruses has been actively conducted as part of a method for eliminating or eliminating red tide organisms to minimize the damage of red tide. However, the development of methods to effectively control red tide has not been developed yet. In Korea, the 'Horticulture Spraying Act' has been implemented since the late 90s. Although green loam produced by nature is more environmentally friendly than other methods, secondary pollution caused by loam is also a new problem. In order to reduce the red tide damage, it is a fundamental solution to expand the sewage treatment facilities and to make the facilities of the cage farm more environmentally friendly and reduce the cause of eutrophication, but this is also a real cost and time. Recently, a method using marine microorganisms existing in a red tide area has been recognized as a safer and environmentally friendly red tide control method and many studies have been conducted. In addition, studies on microorganisms that control A. tamarense in the study of tidal microorganisms against red tide organisms reported so far are insufficient.

한편, 한국등록특허 제1661543호는 살조능을 갖는 슈도모나스 속 균주 및 이를 이용한 살조 미생물 제제를 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1746667호는 항조류 활성을 가지는 키메라 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물을 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 알렉산드리움 타마렌스에 대해 살조 활성을 가지는 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주 및 이의 용도에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.On the other hand, Korean Patent No. 1661543 discloses a Pseudomonas sp. Strain having a fungicidal action and a tidal microorganism preparation using the same. Korean Patent No. 1746667 discloses a chimeric peptide having an anti-algae activity and a red tide control ≪ / RTI > However, there has not yet been disclosed a strain of Lie genus M32A2M and its use for Shodoru having algae activity against Alexandrium tamarense of the present invention.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 국내 남해지역의 거제 인근 해수로부터 순수분리한 로제오박터(Roseobacter) 계통의 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주가 마비성 패독을 생산하는 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)에 대해서만 선택적으로 살조 활성을 나타내고, 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주의 배양여액 및 이를 열처리한 경우에도 살조 활성이 비교적 안정적으로 유지될 뿐만 아니라, 알렉산드리움 타마렌스에 대해 살조 활성을 나타내는 다른 균주들보다 살조 활성이 현저히 우수한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present inventors have found that Pseudoruegeria sp. M32A2M strains are effective against Shudoru strain of Roseobacter strain isolated purely from seawater near Geoje in Korea, Alexandrium tamarens, which produces podok ( Alexandrium tamarense ), exhibiting selective killing activity only against Shudoru , and the culturing filtrate of the strain M32A2M of Luax genus and the heat treatment thereof, as well as maintaining a relatively stable killing activity, and a strain showing a killing activity against alexandrite tamarense , The present invention was completed.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 살조 활성을 가지는 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주를 제공한다.In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides Pseudorugeia sp. M32A2M strains to Schodorus having a killing activity.

또한, 본 발명은 상기 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주, 이의 배양액, 이의 배양여액 또는 이의 열처리한 배양여액을 유효성분으로 포함하는 적조 방제용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for controlling red tide, which comprises the strain Pseudoruegeria sp. M32A2M, a culture thereof, a culture filtrate thereof, or a culture filtrate obtained by heat treatment thereof, as an active ingredient.

본 발명의 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주는 마비성 패독을 생산하는 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)에 대해서만 선택적으로 살조 활성을 나타내기 때문에 적조 제어시 수생태계의 교란을 최소화할 수 있으며, 균주를 직접 처리하지 않고 배양여액 및 열처리한 배양여액을 처리하더라도 비교적 안정적으로 살조 활성을 유지하므로, 유독성 플랑크톤인 알렉산드리움 타마렌스를 살조하는데 더욱 유용하게 사용될 수 있다. A shoe bases of the present invention in RIA (Pseudoruegeria sp.) Strains M32A2M Alexandria Solarium Tama lances (Alexandrium producing paralytic Paddock tamarense ), it is possible to minimize the disturbance of the aquatic ecosystem during red tide control, and even when the culture filtrate and the heat-treated culture filtrate are treated without the direct treatment of the strain, the tidal activity is maintained relatively stably, It can be used more effectively to alleviate the toxic plankton, Alexandrite tamarense.

도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주를 마비성 패독을 생산하는 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)에 처리하였을 때, 알렉산드리움 타마렌스의 세포 내의 클로로필-a(Chl-a; Chlorophyll-a) 및 카로티노이드(carotenoid) 농도를 측정함으로써 대조군(control)과 비교하여 클로로필-a 및 카로티노이드 농도의 감소 정도를 통해 살조 활성을 확인한 결과이다. Control은 본 발명의 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주를 처리하지 않고 알렉산드리움 타마렌스의 세포 내의 클로로필-a 및 카로티노이드 농도를 측정한 대조군이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주를 마비성 패독을 생산하는 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)에 처리하기 전의 알렉산드리움 타마렌스 세포(A), 처리 후의 사멸과정에 있는 알렉산드리움 타마렌스 세포(B) 및 사멸한 알렉산드리움 타마렌스 세포(C)를 현미경을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주의 배양여액 및 이를 열처리한 배양여액을 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)에 각각 처리하였을 때, 알렉산드리움 타마렌스의 세포 내의 클로로필-a(Chlorophyll-a) 농도의 감소율을 통해 살조 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주와 슈도루에게리아 속 및 루에게리아 속(Ruegeria sp.) 다른 균주들의 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)에 대한 살조 활성을 비교한 결과이다. M32A2M은 본 발명의 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주이며; KCTC42111은 슈도루에게리아 사부리리토리스(Pseudoruegeria sabulilitoris) KCTC42111 균주이며; KCTC12737은 슈도루에게리아 아퀴나리스(Pseudoruegeria aquinaris) KCTC12737 균주이며; 32N101M은 루에게리아 모빌리스(Ruegeria mobilis)와 99%의 높은 유사도를 나타내는 균주이며; 및 M22A1M은 루에게리아 아틀란티카(Ruegeria atlantica)와 99%의 높은 유사도를 나타내는 균주이다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주가 알렉산드리움 타마렌스 이외에 우리나라 해역에서 분리된 총 5개의 미세조류인 규조류에 속하는 2종의 케토세로스 속(Chaetoceros simplex 및 Chaetoceros sp.) 및 스켈레토네마 코스타툼(Skeletonema costatum)과 와편모조류에 속하는 알렉산드리움 인수에툼(Alexandrium insuetum) 및 헤테로캡사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)에 대해 살조 활성을 나타내는지 확인한 결과이다.FIG. 1 is a graph showing the results obtained when Shdooru was treated with a strain of Pseudoriegeria sp. M32A2M to produce Alexandrium tamarense , which produces paralytic podocyte , in a cell of Alexandrite tamarens Chlorophyll-a (Chl-a) and carotenoid concentrations were measured to confirm the killing activity through the reduction of chlorophyll-a and carotenoid concentration compared with the control (control). Control is a control group in which the concentration of chlorophyll-a and carotenoid in the cells of Alexandrium tamarencis was measured without treating the strain Shiaodoru of the present invention with genus M32A2M.
FIG. 2 is a graph showing the results of immunohistochemical staining of a Schizorrhoeae strain of A. pseudomonas sp. M32A2M strain (A) before treatment with Alexandrium tamarense producing paralytic podocyte , , Alexandrite tamarense cells (B) and killed Alexandrium tamarense cells (C) in the post-treatment killing process.
Figure 3 is when each treatment the culture filtrate and the culture filtrate is heat treated them in a shoe bases according to one embodiment of the present invention Ria in (Pseudoruegeria sp.) M32A2M strain in Alexandria Solarium Tama lances (Alexandrium tamarense), Alexandria Solarium Tama The result of confirming the killing activity through the reduction rate of chlorophyll-a concentration in the cells of lance.
FIG. 4 is a graph showing the distribution of the Pseudoruegeria sp. M32A2M strain according to an embodiment of the present invention to the strain Shiaoru, sp.) of other strains of Alexandrium tamarens ( Alexandrium tamarense ) were compared. M32A2M is the genus Leia M32A2M to Shudoru of the present invention; The KCTC42111 is used for Shudoru by Pseudoruegeria sabulilitoris ) KCTC42111 strain; KCTC12737 has been used to treat Shudoru as a Pseudoruegeria aquinaris ) KCTC12737 strain; The 32N101M was the first of its kind in Ruegeria mobilis ) and a strain with a high degree of similarity of 99%; And M22A1M are strains showing a high degree of similarity of 99% to L. atlantica ( Ruegeria atlantica ).
FIG. 5 is a graph showing the results of a comparison of the results of a comparison between the two species of Ketoseolus belonging to the diatom alga, a total of five microalgae isolated from Korean waters, in addition to Alexandrium tamarens, according to one embodiment of the present invention. ( Chaetoceros simplex and Chaetoceros sp.) And Skeletonema costatum and alexandria belonging to the epiphyte algae Alexandrium insuetum ) and Heterocapsa triquetra ( Heterocapsa triquetra ).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 살조 활성을 가지는 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides Pseudorugeeria sp. M32A2M strain to Schodorus having a killing activity.

상기 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주는 국내 남해지역의 거제 인근 해수로부터 분리하였으며, 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)에 대해 살조 활성이 뛰어난 균주로 선발되었다. 상기 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주를 한국생명공학연구원(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 2017년 09월 19일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC18616P).The Pseudoruegeria sp. M32A2M strain was isolated from seawater near Geoje in the southern coast of Korea and was selected as a strain with excellent killing activity against Alexandrium tamarense . The Pseudoruegeria sp. M32A2M strain was deposited at the Korean Collection for Type Culture (KCTC) on Sep. 19, 2017 (deposit number: KCTC18616P).

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 살조 활성은 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)에 대한 살조 활성일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a strain according to one embodiment of the present invention, the killing activity may be, but is not limited to, killing activity against Alexandrium tamarense .

또한, 본 발명은 상기 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주, 이의 배양액, 이의 배양여액 또는 이의 열처리한 배양여액을 유효성분으로 포함하는 적조 방제용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for controlling red tide, which comprises the strain Pseudoruegeria sp. M32A2M, a culture thereof, a culture filtrate thereof, or a culture filtrate obtained by heat treatment thereof, as an active ingredient.

본 발명의 용어 '적조 방제'란 항적조, 적조 방지, 살조 및 항조류 등의 여러 가지 용어로 사용되며, 적조를 일으키는 조류(algae)의 생장을 억제하거나, 사멸시키거나, 운동성을 억제하는 등 조류의 증식을 막아 적조를 일으키는 현상을 제거하는 것을 의미한다. 또한, 보다 넓게는 적조를 일으키는 원인 조류를 사멸시키거나 생육을 억제한다는 의미도 포함한다.The term " red tide control " of the present invention is used in various terms such as anti red tide, anti red tide, tidal red tide, and anti tide, and is used for suppressing the growth of algae causing red tide, This means eliminating the phenomenon of causing red tides by preventing the growth of algae. It also includes broader means of killing algae causing red tides or inhibiting growth.

본 발명의 적조 방제용 조성물은 유효성분으로서 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주의 효과를 저해하지 않는 범위 내에서 효과의 안정적 발현, 적용 대상 생물로의 부착 증진, 운반 및 처리의 간편화를 위해 제제학적으로 허용 가능한 고체 담체, 액체 담체, 액체 희석제, 액화된 기체 희석제, 고체 희석제, 또는 기타 적당한 보조제, 예를 들면 유화제, 분산제 또는 기포제 등의 계면활성제를 더욱 포함할 수 있다.The composition for preventing red tide according to the present invention can be used as an effective ingredient to stably express the effect of Shodoru in a range that does not inhibit the effect of Pseudorugeria sp. M32A2M strain, to improve adhesion to the target organism, For example, a surfactant such as a pharmaceutically acceptable solid carrier, liquid carrier, liquid diluent, liquefied gas diluent, solid diluent, or other suitable adjuvant such as an emulsifying agent, a dispersing agent or a foaming agent.

본 발명의 방제용 조성물은 바람직하게는 유제, 수화제, 입제, 분제, 캅셀형 및 젤상의 제형으로 제제화될 수 있고, 제제의 부력을 위해 도넛형과 같은 제형을 통한 접촉제로서 제공되는 것이 바람직하다.The control composition of the present invention is preferably formulated into emulsions, wettable powders, granules, powders, capsules and gels, and is preferably provided as a contact agent through a formulation such as a donut type for buoyancy of the formulation .

또한, 본 발명은 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주, 이의 배양액, 이의 배양여액 또는 이의 열처리한 배양여액의 유효량을 적조 발생 지역에 처리하는 단계를 포함하는 적조를 방제하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주, 이의 배양액, 이의 배양여액 또는 이의 열처리한 배양여액의 유효량을 유해조류가 발생되는 초기에 처리함으로써 대량증식을 사전에 차단하는 것이 바람직하며, 상기 유해조류는 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)인 것이 가장 바람직하다.In addition, the present invention provides a method for controlling red tides, which comprises treating the Shudoru with an effective amount of Pseudoruegeria sp. M32A2M strain, a culture solution thereof, a culture filtrate thereof, or a culture filtrate obtained by heat treatment thereof do. At this time, it is preferable to block the mass proliferation in advance by treating the Shudoru with an effective amount of Pseudoruegeria sp. M32A2M strain, the culture solution thereof, the culture filtrate thereof, or the culture filtrate subjected to the heat treatment thereof in the early stage when harmful algae are generated , The harmful bird is Alexandrium tamarens ( Alexandrium tamarense ) is most preferable.

또한, 본 발명은 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주를 배양하는 단계를 포함하는 적조 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preparing a red tide controlling composition comprising the step of culturing a strain of Pseudorugeeria sp. M32A2M in Shudoru .

상기 균주의 배양 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다. Any method known in the art can be used for culturing the strain, and the method is not particularly limited.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예Example 1.  One. 슈도루에게리아Shudoru Ria 속( genus( PseudoruegeriaPseudoruegeria spsp .) .) M32A2MM32A2M 균주의 분리 및 동정 Isolation and Identification of Strain

국내 남해지역의 거제 인근 해수에서 다양한 균주를 분리하기 위하여, 해수를 영양배지인 마린 브로스 2216 배지에 도말하여 25℃에서 24~48시간 동안 배양하였다. 다양한 미생물을 분리한 후, 3차례 계대를 통하여 순수 분리한 미생물에서 살조능이 우수한 미생물을 최종 선별하였으며, 선별된 균주의 16S rDNA 유전자(서열번호 1) 분석을 통해 동정한 결과, 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.)임을 확인하였으며, 이를 슈도루에게리아 속 M32A2M으로 명명하였다. 상기 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주를 한국생명공학연구원(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 2017년 09월 19일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC18616P).In order to isolate various strains from seawater near Geoje in Korea, seawater was cultured on marine broth 2216 medium for 24 ~ 48 hours at 25 ℃. After isolating various microorganisms, the microorganisms having excellent lyophilicity were finally selected from the microorganisms which were separated purely three times through the passage. As a result of the identification by the analysis of the 16S rDNA gene (SEQ ID NO: 1) of the selected strains, ( Pseudoruegeria sp.), And it was named Shuduoru Leia genus M32A2M. The Pseudoruegeria sp. M32A2M strain was deposited at the Korean Collection for Type Culture (KCTC) on Sep. 19, 2017 (deposit number: KCTC18616P).

실시예Example 2.  2. 슈도루에게리아Shudoru Ria 속  genus M32A2MM32A2M 균주의  Strain 알렉산드리움Alexandrium 타마렌스에Tamarens 대한 살조능 분석 Analysis of Killing Force

본 발명에 따른 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주의 유독성 적조를 일으키는 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)에 대한 살조능을 확인하기 위하여, 알렉산드리움 타마렌스를 F/2 배지에 접종하여 20℃, L:D=12:12(12시간 명조건/12시간 암조건 주기) 및 250μEm-2s-1 광 조건으로 15일 이상 배양하였으며, 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주는 O.D600 값이 0.3 이상 되도록 F/2 배지에 접종한 후, 25℃에서 24시간 동안 전배양하였다. 이후에, 전배양한 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주를 10%(v/v) 농도로 상기 알렉산드리움 타마렌스 배양액에 접종하여 혼합 배양하고 24시간 후 알렉산드리움 타마렌스의 세포 내의 색소농도를 측정함으로써 대조군(control)과 비교하여 색소농도의 감소 정도를 통해 살조 능력을 확인하였다. 그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 대조군(Control)과 비교하여 본 발명의 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주와 마비성 패독을 생산하는 알렉산드리움 타마렌스를 혼합 배양하였을 때, 알렉산드리움 타마렌스의 세포 내 클로로필-a의 농도가 80% 감소되고 카로티노이드의 농도가 75% 감소된 것을 확인하였다. A shoe bases according to the invention in Liao (Pseudoruegeria sp.) Alexander Solarium Tama lances (Alexandrium causing toxic blooms of M32A2M strain to confirm that the live joneung for tamarense), Alexandria Solarium Tama lances the F / 2 medium and inoculated to ℃ 20, L: D = 12: 12 (12 hours light conditions / 12 hr dark condition period) and 250μEm -2 s -1 light condition for 15 days or more. Shadoru was inoculated on F / 2 medium so as to have OD 600 value of 0.3 or more and then preincubated at 25 ° C for 24 hours. Subsequently, the strain Shia Dori, which had been pre-cultured, was inoculated into the culture medium of Alexandrium tamarencense at a concentration of 10% (v / v), and the mixture was cultured. After 24 hours, the concentration of dye in the cells of Alexandrium tamarenc was measured Compared with the control (control), the ability of killing was confirmed by the decrease of the pigment concentration. As a result, as shown in Fig. 1, when compared with the control (Control), when the strain of Leia genus M32A2M and the strain of Alexandrium tamarencense producing paralytic podox were mixed with Shudoru of the present invention, the cell of Alexandrite tamarens It was confirmed that the concentration of chlorochlorine-a was decreased by 80% and the concentration of carotenoid was decreased by 75%.

또한, 상기 방법과 동일한 방법으로 본 발명의 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주를 알렉산드리움 타마렌스에 처리하기 전의 알렉산드리움 타마렌스 세포(도 2A), 처리 후의 사멸과정에 있는 알렉산드리움 타마렌스 세포(도 2B) 및 사멸한 알렉산드리움 타마렌스 세포(도 2C)를 현미경으로 확인하였다. 현미경 관찰에서 알렉산드리움 타마렌스의 세포막이 파괴되면서 갈색의 세포질이 유출되는 것으로 보이며, 완전히 사멸한 이후에는 세포질이 전혀 남아있지 않고, 세포막만 관찰되었다. Further, in the same manner as the above-mentioned method, the shadoru of the present invention was treated with the Alexandrite tamarense cells (FIG. 2A) before the treatment with the Alexandrite tamarense of the genus Leah M32A2M, the Alexandrite tamarense cells 2B) and killed Alexandrium tamarens cells (Fig. 2C) were confirmed by microscopy. Microscopic observation showed that the cell membrane of Alexandrite tamarense was destroyed and the brown cytoplasm was leaked out. After complete killing, there was no cytoplasm and only cell membrane was observed.

실시예Example 3. 본 발명의  3. The 슈도루에게리아Shudoru Ria 속  genus M32A2MM32A2M 균주의  Strain 배양여액Culture filtrate 및 열처리 후 배양여액의 살조능 변화 And the change of the viability of the culture filtrate after heat treatment

본 발명의 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주의 배양여액의 살조 활성을 확인하기 위해, 0.4μm의 필터를 통과한 배양여액과 105℃에서 5분 열처리한 배양여액의 살조 활성을 평가한 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 알렉산드리움 타마렌스의 세포 내의 클로로피-a 농도는 배양여액에서 61% 감소되고 열처리한 배양여액에서 63% 감소되어, 상기 실시예 1의 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주 배양액과 비교하여 비교적 안정적으로 살조 활성이 유지되는 것을 확인하였다.In order to confirm the killing activity of the culture filtrate of the genus Leah M32A2M strain of the present invention against the Shudoru of the present invention, the killing activity of the culture filtrate passed through a filter of 0.4 mu m and the culture filtrate after heat treatment at 105 DEG C for 5 minutes was evaluated, , The chlorophyll-a concentration in the cells of Alexandrium tamarenc was decreased by 61% in the culture filtrate and decreased by 63% in the heat-treated culture filtrate. Thus, the shudoru of Example 1 was compared with the culture medium of Leia M32A2M strain And it was confirmed that the lyophilization activity remained relatively stable.

실시예Example 4. 본 발명의  4. The 슈도루에게리아Shudoru Ria 속  genus M32A2MM32A2M 균주와 다른 균주들과의  Of strains and other strains 알렉산드리움Alexandrium 타마렌스에Tamarens 대한  About 살조능A life force 비교 compare

본 발명의 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주와 슈도루에게리아 속 및 루에게리아 속의 다른 균주들과의 알렉산드리움 타마렌스에 대한 살조 활성을 비교하였다. 사용된 비교 균주로는 슈도루에게리아 사부리리토리스(Pseudoruegeria sabulilitoris, KCTC 42111) 및 슈도루에게리아 아퀴나리스(Pseudoruegeria aquinaris, KCTC 12737)와 이미 살조능이 있다고 보고된 루에게리아 모빌리스(Ruegeria mobilis) 및 루에게리아 아틀란티카(Ruegeria atlantica)와 99%의 높은 유사도를 나타내는 32N101M 및 M22A1M 균주들을 선정하였다. 그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 슈도루에게리아 사부리리토리스(Pseudoruegeria sabulilitoris, KCTC 42111)의 경우, 다른 비교 균주들에 비해 살조 효과가 높았으나, 본 발명의 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주가 살조능이 현저히 우수한 것을 확인하였다.The shaking activity of Shadoru of the present invention against A. india M32A2M strain, C. shudoru, C. india and C. lu other strains was compared. The comparative strains used were Shodoru , Pseudoruegeria sabulilitoris (KCTC 42111) and Shudoru to Pseudorue geria aquinaris , KCTC 12737) and rubies that have already been reported to have the ability to kill mobilis ) and 32N101M and M22A1M strains, which showed high similarity of 99% to L. atlantica ( Ruegeria atlantica ). As a result, as shown in Fig. 4, Shodoru had a higher killing effect than the other comparative strains in the case of Pseudoruegeria sabulilitoris (KCTC 42111), whereas the strain Shialoru of the present invention was resistant to the genus Lea M32A2M It was confirmed that the lyophilicity was remarkably excellent.

실시예Example 5. 본 발명의  5. The 슈도루에게리아Shudoru Ria 속  genus M32A2MM32A2M 균주의 다른 미세조류에 대한  For other microalgae of the strain 살조능A life force 확인 Confirm

본 발명의 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주가 알렉산드리움 타마렌스 이외에 우리나라 해역에서 분리된 총 5개의 미세조류인 규조류에 속하는 2종의 케토세로스 속(Chaetoceros simplex 및 Chaetoceros sp.) 및 스켈레토네마 코스타툼(Skeletonema costatum)과 와편모조류에 속하는 알렉산드리움 인수에툼(Alexandrium insuetum) 및 헤테로캡사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)에 대해 살조능이 있는지 확인 및 비교하였다. 상기 미세조류들의 세포 내 클로로필-a의 농도를 측정한 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 본 발명의 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주가 알렉산드리움 타마렌스에 대해서만 강한 살조능을 나타낸 반면, 다른 해양 미세조류에 대해서는 20% 미만의 매우 낮은 살조 능력을 나타내었다. 따라서 본 발명의 슈도루에게리아 속 M32A2M 균주는 알렉산드리움 타마렌스에 대해서만 선택적으로 살조 작용을 나타내므로, 해양 일차생산자 생태계에 영향을 최소화하면서 적조를 효율적으로 제어할 수 있다.In addition to Alexandrite Tamarens, the strain M32A2M of the present invention belongs to five species of microalgae ( Chaetoceros simplex and Chaetoceros sp.) Belonging to the diatom, in Alexandria Solarium argument that belongs to tatum (Skeletonema costatum) and dinoflagellates Tomb (Alexandrium insuetum ) and Heterocapsa triquetra were tested for their ability to kill . As a result of measuring the concentration of intracellular chlorophyll-a in the microalgae, as shown in FIG. 5, the Shia doru of the present invention showed a strong survival rate against A. alemanum only, And very low lyophilization ability of less than 20% for algae. Therefore, the strain Liao M32A2M of the present invention selectively kills only alexandrite tamarens, so that the red tide can be efficiently controlled while minimizing the influence on the primary producer ecosystem.

한국생명공학연구원Korea Biotechnology Research Institute KCTC18616PKCTC18616P 2017091920170919

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Pseudoruegeria sp. M32A2M strain having algicidal activity against Alexandrium tamarense and uses thereof <130> PN17440 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1331 <212> DNA <213> Pseudoruegeria sp. <400> 1 tgcagtcgag cgcactcttc ggagtgagcg gcggacgggt tagtaacgcg tgggaatatg 60 cccaaaggta gggaatagcc actggaaacg gtgagtaata ccctatgtgc ccttcggggg 120 aaagatttat cgcctttgga ttagcccgcg ttggattagg tagttggtga ggtaatggct 180 caccaagccg acgatccata gctggtttga gaggatgatc agcaacactg ggactgagac 240 acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatctt agacaatggg ggcaaccctg 300 atctagccat gccgcgtgag tgatgaaggc cctagggtcg taaagctctt tcgcctgtga 360 agataatgac ggtagcaggt aaagaaaccc cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa 420 tacggagggg gttagcgttg ttcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgta ggcggattag 480 tcagtcaagg gtgaaatccc agggctcaac cctggaactg cctttgatac tgctagtctt 540 gagttcgaga gaggtgagtg gaattccgag tgtagaggtg aaattcgtag atattcggag 600 gaacaccagt ggcgaaggcg gctcactggc tcgatactga cgctgaggtg cgaaagtgtg 660 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacaccgt aaacgatgaa tgccagtcgt 720 cgggtagcat gctattcggt gacacaccta acggattaag cattccgcct ggggagtacg 780 gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 840 tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac caacccttga catcctgatc gcggttttcc 900 gagaggaatt ccttcagttc ggctggatca gtgacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct 960 cgtgtcgtga gatgttcggt taagtccggc aacgagcgca acccacgtcc ttagttgcca 1020 gcagttcggc tgggcactct aaggaaactg ccggtgataa gccggaggaa ggtgtggatg 1080 acgtcaagtc ctcatggccc ttacgggttg ggctacacac gtgctacaat ggcagtgaca 1140 atgggttaat cccaaaaagc tgtctcagtt cggattgggg tctgcaactc gaccccatga 1200 agtcggaatc gctagtaatc gcgtaacagc atgacgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1260 tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg ggtctacccg aagacggtgc gccaaccttt 1320 acagggggca g 1331 <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Pseudoruegeria sp. M32A2M strain having algicidal activity          against Alexandrium tamarense and uses thereof <130> PN17440 <160> 1 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 1331 <212> DNA <213> Pseudorgegeria sp. <400> 1 tgcagtcgag cgcactcttc ggagtgagcg gcggacgggt tagtaacgcg tgggaatatg 60 cccaaaggta gggaatagcc actggaaacg gtgagtaata ccctatgtgc ccttcggggg 120 aaagatttat cgcctttgga ttagcccgcg ttggattagg tagttggtga ggtaatggct 180 caccaagccg acgatccata gctggtttga gaggatgatc agcaacactg ggactgagac 240 acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatctt agacaatggg ggcaaccctg 300 atctagccat gccgcgtgag tgatgaaggc cctagggtcg taaagctctt tcgcctgtga 360 agataatgac ggtagcaggt aaagaaaccc cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa 420 tacggagggg gttagcgttg ttcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgta ggcggattag 480 tcagtcaagg gtgaaatccc agggctcaac cctggaactg cctttgatac tgctagtctt 540 gagttcgaga gaggtgagtg gaattccgag tgtagaggtg aaattcgtag atattcggag 600 gaacaccagt ggcgaaggcg gctcactggc tcgatactga cgctgaggtg cgaaagtgtg 660 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacaccgt aaacgatgaa tgccagtcgt 720 cgggtagcat gctattcggt gacacaccta acggattaag cattccgcct ggggagtacg 780 gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 840 tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac caacccttga catcctgatc gcggttttcc 900 gagaggaatt ccttcagttc ggctggatca gtgacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct 960 cgtgtcgtga gatgttcggt taagtccggc aacgagcgca acccacgtcc ttagttgcca 1020 gcagttcggc tgggcactct aaggaaactg ccggtgataa gccggaggaa ggtgtggatg 1080 acgtcaagtc ctcatggccc ttacgggttg ggctacacac gtgctacaat ggcagtgaca 1140 atgggttaat cccaaaaagc tgtctcagtt cggattgggg tctgcaactc gaccccatga 1200 agtcggaatc gctagtaatc gcgtaacagc atgacgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1260 tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg ggtctacccg aagacggtgc gccaaccttt 1320 acagggggca g 1331

Claims (5)

알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)에 대한 살조 활성을 가지는 기탁번호가 KCTC18616P인 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주.The Pseudoruegeria sp. M32A2M strain, which has the killing activity KCTC18616P against Alexandrium tamarense . 삭제delete 삭제delete 제1항의 슈도루에게리아 속(Pseudoruegeria sp.) M32A2M 균주, 이의 배양액, 이의 배양여액 또는 이의 열처리한 배양여액을 유효성분으로 포함하는, 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)에 의해 발생하는 적조 방제용 조성물.A method for controlling redness caused by Alexandrium tamarense , which comprises the strain of Pseudoruegeria sp. M32A2M, a culture thereof, a culture filtrate thereof, or a culture filtrate obtained by heat treatment thereof, Composition. 삭제delete
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