KR101951788B1

KR101951788B1 - 라말린을 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101951788B1
Application number: KR1020170121786A
Authority: KR
Inventors: 김일찬; 서승석; 임정한; 한세종; 윤의중; 김태경; 김정은; 홍주미; 짱 뚜 띠 뉘엔
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2017-09-21
Publication date: 2019-02-25
Also published as: WO2019059470A1

Abstract

본 발명은 라말린(Ramalin)을 유효성분으로 함유하는 대장암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 라말린을 유효성분으로 함유하는 조성물은 아폽토시스, 세포주기 정지 및 암세포의 이동, 침윤 억제를 통한 항암 효과를 나타내므로, 대장암의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

라말린을 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for Preventing or Treating Colorectal Cancer Comprising Ramalin}

본 발명은 라말린(Ramalin)을 유효성분으로 함유하는 대장암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아폽토시스, 세포주기 정지 및 암세포의 이동, 침윤 억제를 통한 항암 효과를 나타내는 라말린을 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

결장암은 이환율 (morbidity)과 사망률 (mortality)의 주요 원인 중 하나이며 전 세계적으로 남성과 여성 모두에서 세 번째로 흔한 암이다. 미국 암 협회의 연례 보고서에 따르면 2012년에 약 120만 건의 대장암 환자가 새로 진단되었으며 대장암으로 774,000 명이 사망했다. 암의 특징 중 하나는 비정상적인 암세포가 전이 과정에서 신체의 인접한 부분으로 침투하여 다른 장기로 퍼질 수 있다는 것이다 (Van Zijl et al., Mutat . Res. 728:23-34, 2011). 환자 생존과 관련하여 전이성 대장암은 다른 암에 비해 예후가 매우 나쁘며, 대장암 환자의 약 20-25%가 진단 당시 전이로 진행되었고, 대장암 환자의 약 50%가 결국 전이암을 앓게 된다 (Riihiaki, M et al., Sci . Rep. 6:29765, 2016). 따라서, 결장암을 치료할 수 있고 전이를 예방할 수 있는 약제에 대한 요구가 시급하다.

최근 대장암의 원인에 대한 많은 연구 결과에 따르면 발암 과정은 염색체 불안정성, 현미부수체 불안정성 (MSI) 및 50-C-phosphate-G-30 (CPG) 섬 메틸화의 세 가지 경로를 통해 복잡한 병원성 과정에 의해 발생한다 (Colussi et al., Int . J. Mol. Sci . 14:16365-16385, 2013; Armaghany et al., Gastrointest . Cancer Res. 5:19-27, 2012). 염색체의 불안정성은 종양 발생 관련 유전자들, 즉 adenomatous polyposis coli (APC), kirsten rat sarcoma 2 viral oncogene homolog (KRAS) 및 종양 단백질 p53 (TP53)과 같은 종양 억제 및 종양 형성 인자의 규제 완화를 통해 산발성 대장암 발생에 중요한 역할을 한다 (Pino et al., Gastroenterology 138:2059-2072, 2010). 대장암은 APC 종양 억제 유전자의 돌연변이로 시작하여 종양 유전자 KRAS 및 종양 억제 유전자 TP53의 돌연변이 활성화 및 불활성화가 각각 나타난다. 이러한 유전자 돌연변이는 선종, 과형성 용종 및 염증성 용종으로 분류되고 대장암으로 진행될 수 있는 다수의 결장 폴립을 유발하는 경향이 있다 (Delker et al., PLoS ONE 9:e88367, 2014). 현미부수체 불안정성 (MSI)은 hMSH2, hMSH6, MSH3 및 MLH1과 같은 DNA 불일치 복구 유전자의 불활성화 변이를 일으키는 손상된 DNA 불일치 복구에 의해 유발되어 결장에서 종양 형성을 유도한다 (Iacopetta et al., Asia Pac . J. Clin . Oncol. 6:260-269, 2010). 예를 들어, MLH1 프로모터의 과메틸화는 MSI가 매개하는 산발성 대장암의 80% 이상에서 발견된다 (Iacopetta et al., Asia Pac . J. Clin . Oncol. 6:260-269, 2010). CpG 섬 메틸화 경로에서는 발암 관련 유전자의 프로모터 서열이 상당히 메틸화되어 CDKN2A와 TIMP3와 같은 종양 억제 유전자의 전사 불활성화를 일으킨다 (Mojarad et al., Gastroenterol. Hepatol . Bed Bench 6:120-128, 2013; Ng et al., Int . J. Mol . Sci.16:2472-2496, 2015). 최근 염증과 microRNA (miRNA) 경로를 포함하여 결장암의 종양 발생에 다른 경로가 관여되어 있음이 보고되었다 (Okayama et al., Dig. Dis. 30:9-15, 2012).

대장암 발병 및 진행의 기전에 관한 지식의 부족은 표적 항암제의 개발을 방해하고 있다. 그러나, 이러한 제한에도 불구하고 대장암 환자에서 화학 요법제를 연구하는 많은 임상 시험이 진행되어 현재 식품 의약품 안전청 (FDA)의 승인을 받은 24 개의 약물이 대장암 치료를 위한 임상 시험 중이다. 류코보린과 이리노테칸 또는 옥살로플라틴과 같은 8가지 항암제와의 병용 요법은 대장암 환자의 전반적인 생존율을 크게 향상시킨다. 또한, 많은 연구들은 최근 종양 발생 또는 진행의 분자 병리학적 변화를 조사하여 발암에 대한 환경적, 유전적 요인 및 화학 요법제와 같은 특정 노출의 영향을 조사했다. 이러한 노출은 결장 직장암에서 예후 및 예측 바이오 마커일 수 있다. 이 새로운 연구 분야는 특정 노출이 결장 직장암의 발암 과정에 어떻게 영향을 미치는지 이해하고 특정 분자 또는 경로를 표적화하기 위한 맞춤 치료법 개발에 도움이 되는 새로운 통찰력을 제공할 수 있는 분자 병리적 역학 (MPE)을 대표한다 (Ogino et al., Epidemiology 27:602-611, 2016; Ogino et al., Gut 60:397-411, 2011).

최근에는 치료를 위한 약리학적 생리 활성제의 잠재적 원천으로서 지의류에 대한 관심이 증가하고 있다 (Zambare et al., Pharm . Biol. 50:778-798, 2012; Fernndez-Moriano et al., Pharm . Biol. 54:1-17, 2016; Thadhani et al., Oxid . Med. Cell. Longev. 2079697, 2017). 지의류는 곰팡이와 조류 또는 시아노박테리아로 구성된 공생 생물이며, 뎁시드, 뎁시돈 및 디벤조푸란과 같은 많은 페놀릭 화합물을 포함하여 다양한 생체 활성 대사산물을 생산한다. 1000 가지가 넘는 대사산물이 지의류 유래 화합물로 밝혀졌으며, 이들 화합물은 항염증, 항산화, 세포 독성 및 항증식 활성과 같은 광범위한 생물학적 활성을 가지고 있다 (Muller et al., Appl. Microbiol . Biotechnol . 56:9-16, 2001). 최근의 연구에 따르면 남극 지의류 Ramalina terebrata에서 추출한 이차 대사산물인 라말린은 항산화 및 항염증 작용이 매우 크다는 사실이 밝혀졌다 (Paudel et al., Phytomedicine 18:1285-1290, 2011; Park et al., Phytother . Res. 30:1978-1987, 2016). 그러나, 발암 및 암 치료에서의 라말린의 생물학적 활성은 잘 알려져 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 대장암 예방 또는 치료에 효과적인 항암제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 라말린이 인간 대장암 세포주 HCT116에서 세포의 증식, 침윤 및 이동을 억제하고 세포주기 정지 및 세포사멸 유도를 통해 항암 활성을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 아폽토시스, 세포주기 정지 및 암세포의 이동, 침윤 억제를 통한 항암 효과를 나타내는 라말린(Ramalin)을 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 라말린(Ramalin)을 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 I]

본 발명은 또한, 상기 화학식 I로 표시되는 라말린을 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 화학식 I로 표시되는 라말린을 유효성분으로 함유하는 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 화학식 I로 표시되는 라말린을 유효성분으로 함유하는 조성물을 대장암 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 라말린을 유효성분으로 함유하는 조성물은 아폽토시스, 세포주기 정지 및 암세포의 이동, 침윤 억제를 통한 항암 효과를 나타내므로, 대장암의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 인간 대장암 세포 HCT116에서의 세포증식에 대한 라말린의 효과에 관한 것으로, (A) 50 및 100㎍/ml 라말린 농도에서 시간 의존적으로 세포증식이 억제되며, (B) 농도 의존적으로 세포증식이 억제됨을 확인한 것이다.
도 2는 인간 대장암 세포 HCT116에서의 세포주기에 대한 라말린의 효과에 관한 것으로, 농도 의존적으로 G2/M 단계에서 세포주기 정지를 유도함을 확인한 것이다.
도 3은 인간 대장암 세포 HCT116에서의 G2/M 세포주기와 관련된 유전자의 (A) 번역 및 (B) 전사에 대한 라말린의 효과에 관한 것으로, 농도 의존적으로 TP53 및 p21 발현을 증가시키고, cyclin B1 및 CDK1 발현은 감소시킴을 확인한 것이다.
도 4는 인간 대장암 세포 HCT116에서의 아폽토시스에 대한 라말린의 효과에 관한 것으로, 100㎍/ml 라말린 농도에서 세포사멸이 증가됨을 확인한 것이다.
도 5는 인간 대장암 세포 HCT116에서의 상처치유에 대한 라말린의 효과에 관한 것으로, 농도 의존적으로 상처치유력이 억제됨을 확인하였다.
도 6은 인간 대장암 세포 HCT116에서의 세포 침윤 및 이동 활성에 대한 라말린의 효과에 관한 것으로, 농도 의존적으로 암세포의 (A) 침윤 및 (B) 이동을 억제함을 확인한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 남극 지의류 라말리나 테레브라타(Ramalina terebrata )에서 유래한 이차 대사산물인 라말린 (γ-glutamyl-N-(2-hydroxyphenyl)hydrazide; C₁₁H₁₅N₃O₄)이 결장암 세포주 HCT116에서 유의한 항암 활성을 갖는다는 것을 보여주었다. 상기 항암 활성에는 항증식, 세포주기 정지 및 세포사멸 유도, 암세포 이동 및 침윤 억제가 포함된다. 본 발명은 대장암 세포에서의 라말린 매개 항증식 활성은 세포주기 정지 유도에 의해 발생한다는 것을 보여주는 최초의 연구이며, 라말린은 이동과 침윤을 유의하게 억제하여 결장암 전이를 방해할 수 있다. 따라서, 라말린은 결장 종양 형성을 조절하는데 중요한 역할을 하며, 항암제로서 매우 유용하다.

따라서, 본 발명은 일관점에서 하기 화학식 I로 표시되는 라말린(Ramalin)을 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

[화학식 I]

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본 발명에 있어서, 상기 라말린은 남극 지의류인 라말리나 테레브라타(Ramalina terebrata)로부터 신규 화합물인 라말린을 분리 (KR 10-1025612)하여 사용할 수 있으며, 또한 공지의 라말린 합성방법 (KR 10-1182334)으로 합성하여 사용할 수 있다.

지의류 유래의 1000 가지가 넘는 대사산물 화합물이 밝혀졌으며, 이들 화합물은 항염증, 항산화, 세포 독성 및 항증식 활성과 같은 광범위한 생물학적 활성을 가지고 있다 (Muller et al., Appl . Microbiol . Biotechnol . 56:9-16, 2001). 또한, 지의류 Ramalina fraxinea 및 Ramalina fastigiata의 추출물에서의 항암 효과가 보고되어 있으나 (Svetlana et al., Current Pharmaceutical Biotechnology, 17, 2016), 라말린 화합물에 대해서는 알려져 있지 않다. 특히, 지의류 추출물에는 여러가지 화합물이 포함되어 있으므로 추출물의 효과를 라말린 화합물의 항암 효과라고 볼 수는 없다.

암 전이는 혈관 내 삽관, 혈액 순환, 이차 수술 부위의 세포외 유출 및 세포 성장과 관련된 여러 차례 순차적인 과정을 통해 발생하며, 암세포의 이동과 침윤은 이러한 과정에서 필수적인 부분이다 (Van Zijl et al., Mutat . Res. 728:23-34, 2011).

본 발명의 일 실시예에서는 라말린이 대장암 세포의 이동 및 침윤을 농도 의존적으로 유의하게 억제하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 라말린은 암세포의 전이를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 암세포의 이동 또는 침윤을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

세포주기 신호 전달은 mitogen-activated protein kinase와 wingless/integrated (Wnt) 신호 전달 경로 (Duronio et al., Cold Spring Harb . Perspect. Biol. 5,:a008904, 2013; Martin et al., Cancer Cell 4:167-174, 2003)와 같은 다양한 성장 인자 신호 전달 경로를 통해 엄격히 통제된 조절 시스템을 통해 세포 증식을 조절한다. 이러한 경로는 다양한 사이클린과 복합체 형성을 통해 cyclin-dependent kinase (CDKs)로 알려진 여러 단백질 키나아제의 순차적 활성화에 의해 조절된다 (Lim et al., Development 140:3079-3093, 2013). 세포주기는 S, G2, M 및 G1을 포함한 여러 단계로 구성되며, Cyclic과 같은 이종이량체 단백질 키나아제의 인산화와 분해와 같은 순차적인 생화학적 사건에 의해 조절된다 ((Lim et al., Development 140:3079-3093, 2013). 예를 들어 cyclin-dependent kinase 1 (CDK1)의 cyclin B1-의존성 활성화는 세포주기의 G2/M 전이의 원인이 된다. 또한, 종양 단백질 (TP53) 종양 억제 인자와 그것의 하류 유전자 p21은 G2/M 전이를 포함한 다중 세포주기 조절에 중요한 역할을 한다 (Taylor et al., Oncogene 20, 1803-1815, 2001). TP53 의존하는 G2/M 정지는 cyclin B1와 CDK1의 수준의 감소를 통해 일어난다.

본 발명의 다른 실시예에서는 라말린이 종양 단백질 p53 (TP53), CDKN1A (cyclin-dependent kinase inhibitor 1A), 사이클린 의존성 키나아제 1 (CDK1) 및 사이클린 B1 (CCNB1)과 같은 G2/M기 전이에 관여하는 특징적인 유전자의 조절을 통해 G2/M 단계에서 세포주기 정지를 유도한 것을 확인하였다. 또한, 전사 및 번역 수준 모두에서, 라말린은 TP53 및 그 하위 유전자 CDKN1A의 발현을 점진적으로 증가시켰고, CDK1 및 CCNB1의 발현은 농도 의존적으로 감소시켰다.

따라서, 본 발명의 라말린은 암세포의 세포주기 정지를 유도하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 많은 연구 결과에 의하면 초기 세포사멸 경로는 TP53, Bcl-2, Bax와 같은 여러 단백질에 의해 엄격하게 제어된다는 것이 밝혀졌다. 특히, TP53 종양억제 유전자는 수많은 외인성 또는 내인성 세포사멸 신호에 대한 반응을 조절하는 데 결정적인 역할을 하며, 세포 완전성을 유지하기 위해 세포사멸을 자극한다. 따라서 TP53 돌연변이가 있는 많은 인간 종양은 기능적 TP53을 가진 인간 암과 비교하여 세포사멸을 회피할 수 있고 뚜렷한 약물 내성을 나타낸다.

HCT116 세포에서의 TP53의 활성화는 유전독성 스트레스에 반응하여 세포주기 정지와 세포사멸을 유도하며 (Mirzayans et al., Int . J. Mol . Sci . 18:928, 2017), 이것과 일치하는 이전의 연구는 남극 지의류 유래 라말린이 야생형 TP53을 가진 유방암 세포에서 TP53 의존 경로를 통해 세포사멸을 유도했다는 것을 밝혀냈다 (KR 10-1642291).

암세포는 프로그래밍 된 세포사멸이나 세포사멸 없이 통제되지 않은 세포분열을 겪는다 (Labi et al., Cell Death Dis . 6:e1675, 2015). 따라서 많은 치료적 한계에도 불구하고 암 치료법은 세포사멸을 주요 표적으로 삼고 있다 (Hassan et al., Biomed . Res. Int . 150845, 2014; Baig et al., Cell Death Dis. 7:e2058, 2016). 원형질막의 지질 조성 변화는 세포사멸 과정의 특징 중 하나이다. 예를 들어, 세포사멸이 진행되는 세포에서 정상적으로 원 세포막의 내부 표면에 위치한 포스파티딜 세린은 외부 표면으로 급속히 흘러들어가며, 아넥신 V 단백질에 결합하여 유세포 분석법으로 검출할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 라말린이 HCT116 세포에 대하여 농도 의존적으로 증식을 현저히 억제하고 세포 사멸을 유도하여, 항암 활성을 나타냈다.

따라서, 이는 라말린이 대장암의 표적 치료에 대한 강력한 치료제 후보일 수 있음을 시사한다.

본 발명에 있어서, 상기 라말린은 암세포의 사멸을 유도하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본원의 용어 "아폽토시스"는 "세포사멸" 또는 "세포자살"과도 같은 의미이며, 세포가 유전자에 의해 제어되어 사멸하는 방법 중 하나로서, 세포의 괴사(necrosis)와는 구별된다. 아폽토시스는 이상이 생긴 세포를 제거하는 일을 수행하며, 괴사와는 달리 능동적인 사멸과정을 취한다. 다세포생물에서 유전자 발현에 의한 세포의 세포자살은 발생과 항상성 유지를 위한 필수적 과정이다. 이 과정에서 세포 유전자의 조각화와 세포의 수축 등이 일어나며, 조각난 세포 유전자는 세포질에 싸여 작은 포낭 형태로 식세포활동에 의해 제거 (phagocytosis)된다. 따라서 세포자살은 세포괴사 (necrosis)와는 달리 염증반응을 일으키지 않아 정상적인 발생에 중요한 기능을 수행하게 된다.

아폽토시스는 크게 외경로(extrinsic pathway) 혹은 사멸수용체(death receptor) 경로와 내경로(intrinsicpathway) 혹은 미토콘드리아(mitochondria) 경로로 구별된다. 두 경로 모두 세포사멸 과정은 "카스파제(caspase)"라 하는 세포내 시스테인 프로테아제(cysteine protease)에 의해 수행된다. 외경로는 주로 Fas ligand 등 tumor necrosis factor 계열의 리간드가 세포 표면의 사멸수용체에 결합한 후 Fas-associated death domain (FADD) 단백질 등 연결기 단백질을 경유하여 카스파제 8을 활성화시켜 세포자살을 유발한다. 내경로는 DNA 손상 등 외적 스트레스가 가해지면 미토콘드리아 외막의 투과(permeabilization)에 의한 cytochrome C의 유리 및 이에 수반되는 Apaf-1과 카스파제 9의 활성화에 의해 진행된다. 두가지 경로에 의해 각각 활성화되는 caspase-8 및 9는 down-stream에 있는 카스파제 (caspase-3, 6, 7)를 활성화 시키며 이들은 세포단백질들을 절단하여 세포자살을 유도한다.

본 발명의 라말린을 함유하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전문, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 라말린을 함유하는 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수용액제, 현탁액, 동결 건조제 및 좌제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.001~100 mg/kg으로 바람직하게는 0.01~10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 경구 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 하기 화학식 I로 표시되는 라말린을 유효성분으로 함유하는 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 하기 화학식 I로 표시되는 라말린을 유효성분으로 함유하는 조성물을 대장암 예방 또는 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.

[화학식 I]

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화학식 I로 표시되는 라말린(Ramalin)을 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명의 식품 조성물은, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 라말린을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지, 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치츠 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 라말린을 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 건강기능식품 또한, 식품조성물로써 기능성 식품, 영양보조제, 건강식품, 식품 첨가제 등의 다양한 형태를 포함하는 것이며, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태, 예컨대, 앞서 언급한 라말린을 차, 쥬스, 드링크의 형태로 제조하거나, 과립화, 캡슐화, 분말화 하거나, 이러한 화합물 또는 추출물을 음료, 과실 및 가공식품, 어유, 육류 및 그 가공식품, 빵류, 면류, 조미료 등 각종 식품에 첨가하여 제조함으로써 제공될 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 라말린의 분리 및 추출

라말린은 지의류인 라말리나 테라브라타(Ramalina terebrata)의 표본을 동결-건조하여 추출하고 정제하였으며(Paudel, B. et al. Phytomedicine 18: 1285-1290, 2011), 메탄올을 이용한 분리방법으로 라말린을 분리(KR 10-1025612)하거나, 또는 천연물 유래의 라말린과 같은 효능을 나타내는 안정한 라말린을 합성(KR 10-1182334)하여 사용하였다. 라말린(γ-glutamyl-N-(2-hydroxyphenyl)hydrazide)의 분자식 C₁₁H₁₅N₃O₄은 HRESIMS (High-Resolution Electrospray Ionisation Mass Spectrometry, 고해상도 전자분무 이온화 질량분석기)으로 분석하였고, 상기 화학식은 ¹H와 ¹³C NMR 결과로 확인하였다. 분리된 화합물의 순도는 99% 이상이며, 라말린은 100 mg/ml의 농도로 증류수에 용해시켜, 배양배지에 적합한 농도로 희석하여 사용하였다.

실시예 2: 대장암 세포 증식에 대한 라말린의 효과

인간 대장암 세포 HCT116는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 5 x 10³ 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하여 37℃의 5% CO₂ 배양기로 배양하였다. 하룻밤 배양한 후 라말린을 처리하였다. 라말린 농도 범위는 세포 독성 분석 결과에 기초하여 결정하였다.

라말린이 결장 직장암 세포에 세포 독성 효과를 나타내는지 확인하기 위해, 서로 다른 농도의 라말린 (0, 12.5, 25, 50 및 100㎍/mL)과 다른 배양 시간 (0, 24, 48 및 72 시간)으로 처리하여, 세포 증식을 측정하였다. 매 24시간 간격으로 20μL의 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (Promega, Madison, WI, USA)를 각 웰에 첨가하여 1시간 배양후, Multilabel Counter (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 광학 밀도를 측정하였다.

그 결과, 대장암 세포 HCT116의 증식은 50 및 100㎍/mL에서 시간 의존적으로 유의하게 억제되었으며, 가장 높은 농도 100㎍/mL는 50㎍/mL 농도보다 더 강한 억제 효과를 나타냈다 (도 1A).

다음으로, 대장암 세포의 콜로니 형성능에 대한 라말린의 효과를 조사하기 위해 HCT116 세포를 6-웰 플레이트에 1,000 cells/mL로 접종한 후, 세포부착을 위해 24시간 배양하였다. 이후 12시간 동안 다양한 농도의 라말린 (0-100 ㎍/mL)에 노출시고 이전 연구의 방법 (Suh, S.S et al., Int . J. Med . Sci . 14: 560-569, 2017)과 동일하게 고정하고 염색하여 계수하였다. 세포 형태의 변화는 Nikon D700 위상-대비 역상 현미경 (Nikon, Melville, NY, UAS)으로 관찰하였다.

그 결과, 라말린 처리는 12.5㎍/mL 농도를 제외하고 모든 농도에서 농도 의존적으로 콜로니 수를 현저하게 감소시켰다 (도 1B). 이는 라말린이 HCT116 세포에서 콜로니 형성에 대한 강한 억제 효과를 갖는다는 것을 시사한다.

실시예 3: 세포주기 유전자의 조절을 통한 세포주기 정지에 대한 라말린의 효과

3-1: 유세포 분석을 통한 세포주기 확인

라말린이 세포주기 정지를 유도하여 세포 증식을 억제하는지 여부를 확인하기 위해, HCT116 세포를 상이한 농도의 라말린으로 처리하여 유세포 분석을 수행하였다. HCT116 세포를 다양한 농도 (0, 25, 50, 100㎍ / mL)의 라말린으로 처리한 다음 24시간 동안 배양한 세포를 70% ice-cold 에탄올로 고정시틴 후 4℃에서 12시간 동안 보관하였다. 다음으로 세포를 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척하고, 50g/mL 요오드화 프로피듐 (PI) 및 50㎍/mL RNase A를 함유하는 PBS 용액에 재수화시키고 재현탁시켰다. 세포내 DNA 함량은 유세포분석기 (Becton Dickinson, Holdrege, NE, USA)로 측정하였다.

그 결과, 라말린 농도 의존적으로 세포주기의 합성 (S) 단계의 세포 집단 감소와 gap 2/유사 분열 (G2/M) 단계의 세포 증가가 관찰되었다 (도 2A). 대조군 세포에서는 51.97%가 G0/G1 단계에 있었고 37.49%는 S 단계에 있었으며 10.53%는 G2/M 단계에 있었다. 그러나 G1기의 세포 비율은 라말린 농도 50μg/mL까지 감소하였으며 (0μg/mL에서 51.97%, 25μg/mL에서 47.84%, 50μg/mL에서 41.18 %), 100㎍/mL 농도에서는 48.03% 였다. S기 세포의 비율은 0㎍/mL에서 37.49%, 25㎍/mL에서 38.63% 및 50㎍/mL에서 41.01%로 증가하였지만, G2/M기는 100㎍/mL의 최고 농도까지 증가하였다 (도 2B). 이러한 결과는 G2/M 단계에서의 세포주기 정지, 즉 대장암 세포에서 라말린에 의해 유도된 세포 분열 억제의 강력한 증거를 제공한다.

3-2: 세포주기 유전자 발현 확인

실시예 3-1에서 유세포분석을 이용하여 라말린이 HCT116 세포에서 G2/M기 세포주기의 정지를 유도했다는 것을 확인하였다. 따라서, 라말린이 매개하는 세포주기 정지 기작을 조사하기 위해 우리는 TP53, p21, CDK1 및 cyclin B1 (CCNB1)을 포함한 G2/M 전이에 관여하는 유전자의 발현 패턴에 대한 라말린의 효과를 조사하였다.

라말린을 처리한 HCT116 세포를 방사성 면역 침전 분석 (RIPA) 완충액 (Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 얼음으로 용해시키고 30분 동안 지속적으로 교반하였다. 세포 용해물을 4℃의 미세 원심분리기에서 원심분리하여, 상등액을 새 튜브에 넣었다. 동량의 총 단백질 (30㎍)을 4-20 % 프리캐스트 겔 (Bio-Rad Laboratories)의 웰에 넣고 100V에서 1시간 동안 전기영동 한 다음, 분리된 단백질을 겔에서 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 5% 밀크 용액을 사용하여 실온에서 1시간 동안 블로킹하고 4℃에서 밤새 배양한 다음, TP53, p21, CDK1 및 cyclin B1에 대한 1차 항체 (Cell Signaling, Beverly, MA, USA)로 분석하였다. 실온에서 1시간 동안 horseradish peroxidase가 결합된 2차 항체 IgG (Santa Cruz Biotechnology Dallas, TX, USA)을 반응시킨 후, chemiluminescence 키트 (Amersham Pharmacia, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 분석하였다.

그 결과, 라말린 농도 의존적으로 TP53과 p21의 단백질 수준을 유의하게 증가하였으며, CCNB1과 CDK1의 단백질 발현은 감소하였다 (도 3A).

다음으로, 라말린을 처리한 5x10⁶HCT116 세포를 1 mL TRIzol Reagent (Invitrogen, Waltham, MA, USA)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 추출이 끝나면 분리된 RNA를 35㎕의 RNase가 없는 물에 녹여 55℃에서 10 분간 배양하였다. 이어서 5μg RNA을 Super Script first strand cDNA 합성 키트 (Invitrogen, Waltham, MA, USA)를 사용하여 상보적 DNA (cDNA)를 합성하고, 유전자 발현 프라이머가 포함된 SYBR 그린 실시간 PCR 마스터 믹스 (ThermoFisher Inc., Waltham, MA, USA)로 분석하였다.

사용된 프라이머는 다음과 같다.

p53:

5'-CCGCAGTCAGATCCTAGCG-3' (서열번호 1)

5'-AATCATCCATTGCTTGGGACG-3' (서열번호 2)

p21:

5'-TGCCGAAGTCAGTTCCTTGT-3' (서열번호 3)

5'-CATGGGTTCTGACGGACATC-3' (서열번호 4)

Cyclin B1:

5'-AAAGGCGTAACTCGAATGGA-3' (서열번호 5)

5'-CCGACCTTTTATTGAAGAGCA-3' (서열번호 6)

Cdk1:

5'-CCGAAATCTGCCAGTTTGAT-3' (서열번호 7)

5'-CTGGCCAGTTCATGGATTCT-3' (서열번호 8)

GAPDH:

5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' (서열번호 9)

5'-GAAGATGGTGATGGATTTC-3' (서열번호 10)

그 결과, TP53과 p21의 mRNAs 수준은 라말린 처리된 세포에서 더 높았으며, CCNB1과 CDK1의 발현은 상당히 하향 조절되었다 (도 3B). 이러한 결과는 G2/M 전이에 필요한 유전자의 발현 조절을 통한 G2/M기 세포주기 정지 유도를 통해, 라말린에 의해 유도된 세포증식 억제가 매개된다는 것을 시사한다.

실시예 4: 라말린에 의한 대장암 세포의 아폽토시스

본 실시예에서는 HCT116 세포에서 라말린의 항증식 효과의 상당 부분이 세포 사멸에 의한 것임을 확인하기 위하여, 유세포분석을 수행하였다. 유세포분석 시스템 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 사용하여 아폽토시스 세포의 외막에 있는 포스파티딜세린 잔기에 아넥신 V-FITC (fluorescein isothiocyanate)의 결합을 측정하였다. 라말린으로 처리한 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하여 ~1x10⁶ cells/mL로 1x 결합 완충용액에 재현탁하였다. 다음으로, 100㎕의 세포용액 (~1x10⁵ cells/mL)을 5mL 배양 튜브에 옮기고, 아넥신 V-FITC 5㎕ 및 PI (propidium iodide) 2㎕ 용액을 각 튜브에 가한 후 피펫으로 부드럽게 혼합하였다. 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 유세포분석을 수행하여 라말린에 반응하는 아폽토시스 세포의 비율을 확인하였다.

그 결과, 세포사멸이 진행되는 HCT116 세포의 집단은 라말린의 최고 농도 (100㎍/mL에서 27.56%)에서 유의적으로 증가한 반면, 낮은 라말린 농도에서의 아폽토시스 세포의 집단은 낮은 비율을 나타냈으며, 라말린을 처리하지 않은 그룹보다 유의하게 높지 않았다 (도 4).

또한, HCT116 세포에서의 TP53의 활성화는 유전독성 스트레스에 반응하여 세포주기 정지와 세포사멸을 유도한다고 알려져 있다 (Mirzayans et al., Int . J. Mol. Sci . 18:928, 2017). 이에. 본 실시예에서도 라말린 처리가 HCT116 세포에서 TP53 발현을 유의하게 증가시키는 것을 확인하였다 (도 3).

따라서, 라말린에 의해 유도된 아폽토시스는 부분적으로 TP53-의존성 세포사멸 경로를 통해 발생할 수 있음을 시사한다. 아울러, 라말린을 매개로 하는 대장암의 세포사멸은 주로 초기 세포사멸 경로에서 일어난다. 즉, 라말린이 TP53을 활성화시킴으로써 세포사멸 경로의 초기 신호 변환에 관여할 수 있음을 시사한다.

실시예 5: 라말린에 의한 대장암 세포의 이동 및 침윤 억제

5-1: 라말린의 상처치유 억제 효과

라말린의 항산화 활성과 같은 많은 생물학적 효과가 밝혀졌지만, 대장암 세포에 대한 라말린의 상처 치유 효과는 아직 보고된 바가 없다. 암세포의 이동은 상처 치유와 혈관 신생을 위해 필수적이다. 이에, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)를 이용한 HCT116 세포 생존능 분석 결과 (도 1A)에서 세포독성을 유발하지 않은 라말린 농도 (12.5 및 25㎍ / mL)에서 상처 치유 효과를 평가하였다.

HCT116 세포를 6-웰 플레이트에 0.5~10⁶ cells/mL로 접종하여 5% CO₂ 배양기에서 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 선형 스크래치는 살균 p200 피펫 팁으로 표면을 부드럽게 긁어서 각 웰의 융합 단층에서 수행하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하여 세포 데브리스를 제거한 다음, 라말린을 함유하는 신선한 배지를 각 웰에 첨가하였다. 24시간 후, 상처 부위에서 이동한 세포의 이미지를 디지털 카메라를 이용하여 포착하였다. 모든 스크래치 검정은 3중으로 수행하였다.

상처 치유의 조절에 있어서 라말린 역할을 조사하기 위해, HCT116 세포를 비 세포 독성의 라말린으로 처리하고 상처 치유 과정에 대한 억제 효과를 확인하였다.

그 결과, 라말린은 HCT116 세포의 상처 치유를 농도 의존적으로 유의하게 억제하였다 (도 5). 특히, 대장암 세포의 이동은 가장 높은 농도의 라말린 (25㎍/mL)에 의해 거의 완전히 억제되어 대조군의 세포와 유사한 이동이 일어났다. 이러한 결과는 라말린이 인간의 결장 직장암에서 상처 치유 과정을 억제함을 나타낸다.

5-2: 침윤 및 이동 분석

암세포의 이동성과 침습성을 억제함으로써 전이가 억제될 수 있음이 보고되었다 (Van Zijl et al., Mutat . Res. 728, 23-34, 2011). 이에, 대장암 세포 이동과 침윤에 대한 라말린의 억제 효과를 조사하기 위해 Boyden chamber system을 사용하였다.

이동 및 침윤 분석은 폴리카보네이트 멤브레인 인서트를 함유하는 24-웰 이동 및 침윤 플레이트 (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 10% FBS 500㎕를 함유하는 배지를 침윤 또는 이동 플레이트의 하부 챔버에 첨가하였다. 세포를 1.0 x 10⁶ cells/mL의 농도로 혈청이 없는 배지에 현탁하였다. 세포 현탁액 300㎕를 상부 챔버에 첨가하고, 상이한 농도의 라말린 (12.5 및 25㎍/mL)을 처리하여 세포 배양기에서 48시간 동안 유지시켰다. 세포를 Cell Stain Solution (400 μL)을 사용하여 염색하고 사진 촬영을 하였다.

그 결과, HCT116 세포의 이동 및 침윤은 농도 의존적으로 라말린에 의해 유의하게 억제되었다 (도 6). 이는 라말린이 이동과 침윤을 억제함으로써 암 전이를 효과적으로 조절할 수 있다는 증거를 제시한 최초의 보고이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> Composition for Preventing or Treating Colorectal Cancer Comprising Ramalin <130> P17-B212 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53-F <400> 1 ccgcagtcag atcctagcg 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53-R <400> 2 aatcatccat tgcttgggac g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21-F <400> 3 tgccgaagtc agttccttgt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21-R <400> 4 catgggttct gacggacatc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclin B1-F <400> 5 aaaggcgtaa ctcgaatgga 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclin B1-R <400> 6 ccgacctttt attgaagagc a 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cdk1-F <400> 7 ccgaaatctg ccagtttgat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cdk1-R <400> 8 ctggccagtt catggattct 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F <400> 9 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R <400> 10 gaagatggtg atggatttc 19

Claims

하기 화학식 I로 표시되는 라말린(Ramalin)을 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 I]

.
제1항에 있어서, 암세포의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 암세포의 이동 또는 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 암세포의 세포주기 정지를 유도하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
하기 화학식 I로 표시되는 라말린(Ramalin)을 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 개선용 건강기능식품:
[화학식 I]

.
제5항에 있어서, 암세포의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제5항에 있어서, 암세포의 세포주기 정지를 유도하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제5항에 있어서, 암세포의 이동 또는 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 개선용 건강기능식품.