KR101392345B1 - 영릉향 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학조성물 - Google Patents
영릉향 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 영릉향 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물 및 암 예방 또는 개선용 식품을 제공한다.
Description
본 발명은 영릉향 (Lysimachia foenum - graecum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물 및 암 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다.
암은 음식물, 화학적 오염물 등의 환경요인에 의하여 유전자에 돌연변이가 일어났을 때 발생된다. 이들 돌연변이는 조절 불능의 세포증식을 초래하고, 종양 (tumor) 이라는 세포 덩어리를 형성시키며, 그들 중 일부가 다른 조직으로 침투하여 악성종양 (malignant tumor)을 만드는 전이 (metastasis)를 일으켜 주위의 정상조직까지 파괴시켜 개체의 생명을 위협할 수 있는 질환군을 총칭한다.
최근 세계보건기구의 통계자료에 의하면 전 세계적으로 암환자가 연간 1,000만 명 이상이 발생하며, 미국의 경우 1,300,000명의 새로운 환자가 발생하고 약 550,000명이 암으로 사망하는 것으로 추정된다고 한다. 우리나라의 경우에도 매년 암환자 수가 꾸준하게 늘고 있으며 질병으로 인한 사망 원인 중 가장 높은 비율을 차지한다. 또한 각종 암의 발생률이나 그 양상 또한 선진국형으로 점차 바뀌고 있다.
암의 발생 요인으로는 유전인자, 면역학적 요인과 같은 내적인 요인과 바이러스, 환경, 화학물질과 같은 외적인 요인 등 여러 가지가 존재한다. 최근의 암 발생 증가는 유전인자와 같은 내적인 요인보다 환경이나 식습관과 같은 외적인 요인이 더 큰 비중을 차지하는 것으로 알려지고 있어서, 사람들의 식생활의 변화가 일어나지 않는 이상 암 발병률과 사망률은 지속적으로 증가할 것으로 보인다. 특히 암의 치료는 조기에 발견되지 않는 이상 완치가 힘들며, 병이 진행됨에 따른 재정적·정신적 손실 등으로 인하여, 암의 예방과 조기 치료에 대한 중요성이 더욱 부각되고 있다. 따라서 장기간 치료하게 되면 약제내성 (drug resistance)이 생기는 화학물질이 아닌 천연물에서 암 예방 효과를 낼 수 있는 물질의 개발이 필요하다고 여겨진다.
한편, 본 발명의 영릉향은 앵초과에 속하는 전초로, 원주형의 줄기와 어긋난 광난형의 잎을 가지고 있으며 줄기의 길이는 40~60cm이다. 잎의 길이는 4~6cm 정도로 선단은 뾰족하고 긴 엽병을 가지고 있으며, 꽃자루는 비교적 가늘고 연약하다. 강한 향기가 있고, 맛은 달고 쓰며, 기의 순환을 촉진하여 통증을 멎게 하고 오한, 치통, 설사, 염증 제거에 효과가 있다고 알려져 있다.
한국등록특허 제0863524호에는 '영릉향 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환의 예방 및 치료용 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2010-0076869호에는 '영릉향 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 및 치료용 조성물'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이, 영릉향 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학조성물에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 영릉향 (Lysimachia foenum - graecum) 에탄올 추출물에 의한 인간 유방암세포 (MCF-7), 대장암세포 (HT-29), 피부암세포 (B16F10) 및 간암세포 (Hep3B)의 암 세포 사멸효과 (apoptosis)를 확인하였고, 암 세포 종양 증식과 관련된 mTOR (Mammalian target of rapamycin), COX-2 (Cyclooxygenase-2)의 발현량 및 암세포의 전이와 관련된 VEGF (Vascular endothelial growth factor)의 발현량이 감소하는 것을 확인함으로써, 부작용 문제가 없는 천연물 유래의 영릉향 추출물의 암에 대한 예방, 치료 및 개선 효과를 밝히는데 그 목적이 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 영릉향 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 영릉향 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 식품을 제공한다.
본 발명에 따르면, 영릉향 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물은 천연물에서 유래한 물질로 부작용이 발생할 가능성이 적고, 세포 독성이 없으므로, 암에 대한 예방, 치료 및 개선을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 영릉향 에탄올 추출물의 섬유아세포 (fibroblast)에 대한 세포독성 확인 결과를 나타낸다. 섬유아세포를 이용하여 영릉향 추출물의 에탄올 pH에 따른 세포독성을 MTT 분석법으로 측정하였다. 상기 그래프에서 None은 비처리 대조구를 나타내고, 가로축의 수치는 영릉향 추출물의 투여량 (㎍/㎖)을 나타낸 수치이며, 세로축의 수치는 섬유아세포의 생존율을 나타낸 수치이다.
도 2는 영릉향 에탄올 추출물의 유방암세포 (MCF-7) 사멸에 따른 항암 효과를 측정한 결과를 나타낸다. MCF-7 세포주를 이용하여, 에탄올 pH에 따른 영릉향 추출물의 항암효과를 MTT 분석법으로 측정하였다. 상기 그래프에서 가로축의 수치는 영릉향 추출물의 농도를 나타내고, 세로축의 수치는 상대적인 세포 생존율을 나타낸다.
도 3은 영릉향 에탄올 추출물의 대장암세포 (HT-29)에 대한 항암 효과를 측정한 결과를 나타낸다. HT-29 세포주를 이용하여, 에탄올 pH에 따른 영릉향 추출물의 항암효과를 MTT 분석법으로 측정하였다. 상기 그래프에서 가로축의 수치는 영릉향 추출물의 농도를 나타내고, 세로축의 수치는 상대적인 세포 생존율을 나타낸다.
도 4는 영릉향 에탄올 추출물의 피부암세포 (B16F10)에 대한 항암 효과를 측정한 결과를 나타낸다. B16F10 세포주를 이용하여, 에탄올 pH에 따른 영릉향 추출물의 항암효과를 MTT 분석법으로 측정하였다. 상기 그래프에서 가로축의 수치는 영릉향 추출물의 농도를 나타내고, 세로축의 수치는 상대적인 세포 생존율을 나타낸다.
도 5는 영릉향 에탄올 추출물의 간암세포 (Hep3B)에 대한 항암 효과를 측정한 결과를 나타낸다. Hep3B 세포주를 이용하여, 시간에 따른 영릉향 에탄올 추출물의 항암효과를 MTT 분석법으로 측정하였다. 상기 그래프에서 가로축의 수치는 영릉향 추출물의 농도를 나타내고, 세로축의 수치는 상대적인 세포 생존율을 나타낸다.
도 6은 영릉향 에탄올 추출물의 암 세포 종양 증식과 관련된 단백질 저해 효과를 측정한 결과를 나타낸다. MCF-7 세포주를 이용하여, 영릉향 pH 3 에탄올 추출물의 항암효과를 확인하기 위하여, p-mTOR, COX-2 및 p-AMPKα1 (AMP-activated protein kinase α1)의 단백질 발현 정도를 웨스턴블럿 분석을 이용하여 확인하였다. 우측 세로축의 수치는 단백질의 크기 (kDa)를 나타낸 것이고, 좌측 세로축은 해당 단백질의 이름을 나타낸 것이며, 가로축의 수치는 영릉향 추출물의 투여량 (㎍/㎖)을 나타내는 수치이다.
도 2는 영릉향 에탄올 추출물의 유방암세포 (MCF-7) 사멸에 따른 항암 효과를 측정한 결과를 나타낸다. MCF-7 세포주를 이용하여, 에탄올 pH에 따른 영릉향 추출물의 항암효과를 MTT 분석법으로 측정하였다. 상기 그래프에서 가로축의 수치는 영릉향 추출물의 농도를 나타내고, 세로축의 수치는 상대적인 세포 생존율을 나타낸다.
도 3은 영릉향 에탄올 추출물의 대장암세포 (HT-29)에 대한 항암 효과를 측정한 결과를 나타낸다. HT-29 세포주를 이용하여, 에탄올 pH에 따른 영릉향 추출물의 항암효과를 MTT 분석법으로 측정하였다. 상기 그래프에서 가로축의 수치는 영릉향 추출물의 농도를 나타내고, 세로축의 수치는 상대적인 세포 생존율을 나타낸다.
도 4는 영릉향 에탄올 추출물의 피부암세포 (B16F10)에 대한 항암 효과를 측정한 결과를 나타낸다. B16F10 세포주를 이용하여, 에탄올 pH에 따른 영릉향 추출물의 항암효과를 MTT 분석법으로 측정하였다. 상기 그래프에서 가로축의 수치는 영릉향 추출물의 농도를 나타내고, 세로축의 수치는 상대적인 세포 생존율을 나타낸다.
도 5는 영릉향 에탄올 추출물의 간암세포 (Hep3B)에 대한 항암 효과를 측정한 결과를 나타낸다. Hep3B 세포주를 이용하여, 시간에 따른 영릉향 에탄올 추출물의 항암효과를 MTT 분석법으로 측정하였다. 상기 그래프에서 가로축의 수치는 영릉향 추출물의 농도를 나타내고, 세로축의 수치는 상대적인 세포 생존율을 나타낸다.
도 6은 영릉향 에탄올 추출물의 암 세포 종양 증식과 관련된 단백질 저해 효과를 측정한 결과를 나타낸다. MCF-7 세포주를 이용하여, 영릉향 pH 3 에탄올 추출물의 항암효과를 확인하기 위하여, p-mTOR, COX-2 및 p-AMPKα1 (AMP-activated protein kinase α1)의 단백질 발현 정도를 웨스턴블럿 분석을 이용하여 확인하였다. 우측 세로축의 수치는 단백질의 크기 (kDa)를 나타낸 것이고, 좌측 세로축은 해당 단백질의 이름을 나타낸 것이며, 가로축의 수치는 영릉향 추출물의 투여량 (㎍/㎖)을 나타내는 수치이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 영릉향 (Lysimachia foenum -graecum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 약학조성물에서, 상기 영릉향 추출물은 영릉향 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 약학조성물에서, 상기 영릉향 에탄올 추출물은 pH 3 내지 pH 11인 에탄올의 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 약학조성물에서 상기 암은 유방암, 대장암, 피부암, 간암, 위암, 자궁경부암, 림프종, 간모세포종 또는 폐암일 수 있으며, 바람직하게는 유방암, 대장암, 피부암 또는 간암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학조성물은, 약학조성물 총 중량에 대하여 상기 영릉향 추출물을 0.02 내지 80 중량%, 바람직하게는 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 영릉향 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 영릉향 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 영릉향 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 영릉향 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 영릉향 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 영릉향 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 식품을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 영릉향 추출물은 영릉향 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 영릉향 에탄올 추출물은 pH 3 내지 pH 11인 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 암은 유방암, 대장암, 피부암, 간암, 위암, 자궁경부암, 림프종, 간모세포종 또는 폐암일 수 있으며, 바람직하게는 유방암, 대장암, 피부암 또는 간암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 식품은 항암 활성을 증가시키기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 영릉향 추출물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 영릉향 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 영릉향 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 추출물 100㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g이다.
상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예
1.
영릉향
추출물의 제조
영릉향 (Lysimachia foenum - graecum) 분쇄 가루 100g에 각각 pH 3 에탄올 800㎖, pH 8 에탄올 800㎖, pH 11 에탄올 800㎖을 가하여 각각의 추출용매에 완전히 침지한 후, 상온에서 환류시키면서 추출하였다. 상기 추출 방법을 통해 제조된 영릉향 추출물 각각을 감압농축기를 이용하여 감압농축 한 뒤, 수득한 추출물은 -80℃에서 보관하였다. 상기 영릉향 추출물은 실험에 사용하기 전에 DMSO에 녹였고, 냉동보관 하였다.
실시예
2. 세포 독성 실험
상기 실시예 1에서 제조된 영릉향 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여, 섬유아세포 (fibroblast)를 ATCC (America Type Culture Collection, Gaithersburg, MD)에서 구입하여 이용하였다. 상기 세포의 배양에는 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium), FBS (fetal bovine serum), 항생제 (Gibco/BRL, USA)가 사용되었다. 상기 섬유아세포는 DMEM 배지에 10% FBS, 1% 항생제 (100mg/L 스트렙토마이신, 100U/㎖ 페니실린)를 첨가한 배양액을 사용하여 배양하였고, 37℃의 습윤한 CO2 배양기 (5% CO2)에서 배양하였다. 상기 세포가 배양 접시 (dish)의 약 80%가 되게 배양한 후, PBS로 세포의 단층을 세척한 다음, 1㎖의 트립신-EDTA를 처리하여 2일마다 계대 배양하였다. 배양한 세포는 세포 배양용 12 웰 플레이트에 세포 수 1×104개/㎖로 분주하고 24시간 동안 배양하여, 대조구에는 아무런 처리를 하지 않았고, 실험구에는 다양한 농도의 영릉향 추출물을 처리하였다. 24시간 후에 MTT 분석 방법을 이용하여 OD값을 측정하였다.
MTT 분석법은 탈수소 효소작용에 의하여 MTT 테트라졸리움 (tetrazolium)의 노란색 수용성 기질을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT 포마잔 크리스탈 (formazan crystal)로 환원시키는 세포 내 미토콘드리아를 이용한 검사법이다. 상기 실시예 1의 영릉향 추출물을 녹이기 위한 용매로는 세포 생존에 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 확인된 DMSO를 사용하였다. 각 농도별로 영릉향 추출물이 처리된 세포에 MTT 용액을 30㎕씩 처리하고, 1시간 뒤에 37℃의 CO2 배양기에서 1시간 더 배양하였다. 이후 배지를 제거한 후, DMSO 150㎕를 처리하여 포마잔 크리스탈을 녹여내고, 96 웰 플레이트에 100㎕씩 옮겨서 마이크로 플레이트 리더 (BIO-RAD)로 595nm 파장의 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.
섬유아세포에 24시간 동안 영릉향 추출물을 처리한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 나타낸 바와 같이 24시간을 처리한 경우에도, 아무런 시료를 처리하지 않은 대조구와 상기 실시예 1에서 제조된 영릉향 추출물을 다양한 농도로 처리한 경우 모두에서 세포 증식에 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 따라서 상기 결과로부터 영릉향 추출물은 50㎍/㎖까지는 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.
실시예
3.
영릉향
추출물의 암세포에 대한 항암 효과 측정
상기 실시예 1에서 제조된 영릉향 추출물의 항암효과를 측정하기 위하여, 인간의 유방암세포 (MCF-7), 대장암세포 (HT-29), 피부암세포 (B16F10) 및 간암세포 (Hep3B)를 ATCC에서 구입하였다. 상기 세포의 배양에는 RPMI 1640 (WelGENE lnc., Seul, Korea), FBS (fetal bovine serum), 항생제 (Gibco/BRL, USA)가 사용되었다. MCF-7 세포, HT-29 세포, B16F10 세포 및 Hep3B 세포는 RPMI 1640 배지에 10% FBS, 1% 항생제 (100mg/L 스트렙토마이신, 100U/㎖ 페니실린)를 첨가한 배양액을 사용하여 배양하였고, 37℃의 습윤한 CO2 배양기 (5% CO2)에서 배양하였다. 세포는 배양 접시의 약 80% 정도까지 배양하였고, PBS로 세포의 단층을 세척한 후, 트립신-EDTA 1㎖를 처리하여 2일마다 계대 배양하였다. 배양한 세포는 세포 배양용 12 웰 플레이트에 1×104개/㎖로 분주하고 24시간 동안 배양하여, 대조구에는 아무런 처리를 하지 않았고, 실험구에는 다양한 농도의 영릉향 추출물 (각각 에탄올 pH 3, 에탄올 pH 8, 에탄올 pH 11)을 처리하였다. 24시간 후에 MTT 분석 방법을 이용하여 OD값을 측정하였다.
MTT 분석 방법을 이용하여 MCF-7 유방암세포, HT-29 대장암세포, B16F10 피부암세포, Hep3B 간암세포에 24시간 동안 영릉향 추출물을 처리한 결과를 나타내었다. 각각의 결과에서 나타낸 바와 같이 에탄올의 pH에 따른 영릉향 추출물을 각각 농도별로 24시간 처리하였을 때, 농도가 증가함에 따라 세포의 증식이 억제됨을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 결과로부터 영릉향 추출물이 유방암 세포증식 억제에 효과가 있음을 알 수 있다. 그 중에서도 특히 MCF-7 세포의 경우 에탄올 pH 3, 8, 11 영릉향 추출물 모두에서 농도 의존적으로 고르게 암세포 증식의 억제 효과를 보였다 (도 2). HT-29 세포에서는 100㎍/㎖ 까지는 2가지 (pH 3, 8) 추출물의 효과가 크지 않았으나 고농도인 150㎍/㎖을 처리하였을 때 세포증식 억제 효과를 나타내었다 (도 3). 또한 B16F10 세포에서도 100㎍/㎖ 까지는 2가지 (pH 3, 8) 추출물의 효과가 크지 않았으나 150㎍/㎖을 처리하였을 때 세포증식 억제효과를 확인할 수 있었으며, 특히 에탄올 pH 11 추출물의 경우 농도 의존적으로 세포증식이 억제됨을 확인할 수 있었다 (도 4). Hep3B 세포에서는 에탄올 pH 8 추출물이 시간이 지남에 따라 암세포에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. 그 결과 농도가 증가함에 따라 암세포의 증식이 억제됨을 확인할 수 있었으며, 24시간 보다 48시간 처리한 후에 더 효과가 있음을 확인하여 결과적으로 농도와 시간에 의존적으로 세포증식이 억제됨이 확인 되었다. 따라서 상기 결과들로부터 에탄올의 pH에 따른 영릉향 추출물이 암세포에 독성을 가지고 있음을 알 수 있으며, pH에 변화를 주지 않은 약 pH 8인 에탄올 추출물보다 pH를 산성, 염기성으로 변화시킨 pH 3과 pH 11 에탄올에서 추출한 영릉향 추출물이 암세포 증식 억제 기능이 더 뛰어난 것으로 나타났다.
실시예
4.
영릉향
추출물의 암 세포 종양 증식과 관련된 단백질 저해 효과 측정
상기 실시예에서 확인된 암세포 전이의 억제효과 즉, 암세포 이동 억제효과, 침윤 억제효과 및 부착 억제효과를 확인하기 위하여, 암세포의 이동, 침윤 및 부착과 관련된 단백질의 발현량을 웨스턴블럿 분석을 수행하였다. 보다 구체적으로, 세포배양용 6 웰 플레이트에 MCF-7 세포를 1×105개/㎖로 분주하여 24시간 동안 배양한 다음 영릉향 추출물을 처리하고 6시간 동안 CO2 배양기에서 배양하였다. 단백질을 추출하기 위하여 배지 제거 후 PBS로 세척한 후, RIPA 용해 버퍼 (50 mM Tris-HCL (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.5% 소듐 디옥시클로레이트, 1mM PMSF)를 웰 당 150㎕씩 처리하여 4℃에서 5분간 용해시켰다. 그 다음 스크레이퍼 (scraper)를 이용하여 세포를 수집했고, 14000 rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리를 하여 상등액을 취했다. 단백질을 정량하기 위하여 브래드포드 시약에 1:100의 비율로 섞어 96 웰 플레이트에 옮겨 595nm에서 OD값을 측정하였다.
단백질 발현량을 확인하기 위한 웨스턴블럿은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 8% 아크릴아마이드 젤에 샘플을 로딩하여 전기영동법 (SDS-PAGE)으로 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 단백질을 이동시켰다. 단백질이 이동된 막을 2% BSA (bovine serum albumin)를 이용하여 블로킹한 후, 1차 항체를 4℃에서 밤새 반응시키고, TBST로 15분씩 6번 세척하였다. 그 후, 2차 항체를 반응시키고 TBST로 15분씩 6번 세척한 후에 WEST-ZOL을 이용하여 감광하여 실험결과를 측정하였다.
암 세포 종양 증식과 관련된 mTOR, COX-2의 발현량 및 암세포의 이동 즉, 혈관신생과 관련된 VEGF의 발현량은 영릉향 추출물의 농도에 의존적으로 감소하였다 (도 6). 또한 다양한 암세포에서 자연세포사멸을 유도하는 것으로 알려진 단백질인 AMPK의 발현량을 확인할 결과, 농도 의존적으로 AMPK 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이 중에서 특히 mTOR의 경우, 50㎍/㎖을 처리한 경우에 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 암의 진행과 관련이 없는 하우스키핑 유전자 (housekeeping gene)인 β-액틴의 경우 모든 실험구에서 유사한 정도의 밴드가 확인되어, 상기 밴드로부터 영릉향 추출물의 첨가가 세포생존과 관련이 없으며, 암의 발전과 관련이 없는 단백질에는 영향을 미치지 않는다는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 에탄올의 pH에 따른 영릉향 추출물이 암의 전이와 관련된 단백질 VEGF 및 종양의 증식에 관련된 단백질 mTOR 및 COX-2의 발현을 억제하여, 암세포의 이동, 침윤 및 부착을 현저하게 저해할 수 있을 뿐만 아니라, 항암작용을 유도하는 AMPK 단백질의 발현량을 증가시켜, 우수한 항암효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
Claims (8)
- pH 11의 영릉향 (Lysimachia foenum-graecum) 에탄올 추출물 100~150㎍/ml을 유효성분으로 함유하는 대장암 또는 피부암 예방 또는 치료용 약학조성물.
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- pH 11의 영릉향 (Lysimachia foenum-graecum) 에탄올 추출물 100~150㎍/ml을 유효성분으로 함유하는 대장암 또는 피부암 예방 또는 개선용 식품.
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