KR101942946B1 - Composition comprising NHERF1 inhibitor for the preventing of cancer metastasis or formation of pseudopod - Google Patents

Abstract

본 발명은 암세포의 위족 형성억제 또는 암전이 억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 NHERF1 저해제를 유효성분으로 포함하는 암세포의 위족 형성 억제용 조성물, 암전이 억제용 조성물 및 암 세포에 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1) 억제제를 처리하는 단계를 포함하는 암 세포의 전이 억제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 NHERF1 저해제는 암세포에서 LPA(Lysophosphatidic acid) 자극에 의한 ERM(Ezrin/Radixin/Moesin)의 인산화를 억제하고 NHERF1- cpERM(인산화된 ERM) 복합체 형성을 억제하며 NHERF1의 세포질에서 세포막으로의 이동을 억제하고 암세포의 위족 형성을 억제하여 궁극적으로 암의 전이를 억제할 수 있으므로, NHERF1 저해제를 포함하는 조성물은 암의 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다. More particularly, the present invention relates to a composition for inhibiting the formation of a stomach of a cancer cell comprising an NHERF1 inhibitor as an active ingredient, a composition for suppressing cancer metastasis, and a composition for inhibiting cancer formation by inhibiting NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) inhibitor. The NHERF1 inhibitor of the present invention suppresses ERM (Ezrin / Radixin / Moesin) phosphorylation by LPA (lysophosphatidic acid) stimulation in cancer cells, inhibits NHERF1- cpERM (phosphorylated ERM) complex formation, And inhibiting the formation of stomachs of cancer cells and ultimately inhibiting cancer metastasis. Therefore, a composition containing the NHERF1 inhibitor can be usefully used as a pharmaceutical composition for the treatment of cancer or inhibiting cancer metastasis.

Description

ＮＨＥＲＦ１ 저해제를 유효성분으로 포함하는 암세포의 위족 형성억제 또는 암전이 억제용 조성물{Composition comprising NHERF1 inhibitor for the preventing of cancer metastasis or formation of pseudopod}[0001] The present invention relates to a composition for suppressing the formation of stomach or inhibiting cancerous growth of cancer cells comprising an NHERF1 inhibitor as an active ingredient,

본 발명은 암세포의 위족형성 및 전이 억제능을 갖는 NHERF1 저해제 및 이의 항암 용도에 관한 것이다.The present invention relates to an NHERF1 inhibitor having the ability to inhibit cancer formation and metastasis of cancer cells and its anticancer use.

상피간엽이행(EMT)은 상피세포의 성질을 간엽세포의 성질로 전환하는 것으로 의미하는 것으로, 상피간엽이행은 암의 생성과 진행 과정에도 관련되어 있으며, 세포간 접합(junction), 정단부-기저부 극성과 같은 상피세포의 고유 기능을 상실하게 되고 전이, 이동성 및 침윤과 같은 기능이 증가하여 세포의 형태학적 변형을 초래한다. 이러한 전이(transition)는 신호전달, 세포 골격구조 및 세포막에서의 지방 조성과 연관된 다중 단백질 구조체들의 발현, 세포내 위치 및 기능에 특이적인 변화를 유발한다. 따라서 암 세포의 피층 구조의 다양성, 극성 및 역동성에 관여된 주요 인자들에 대한 연구가 진행되고 있다.The epithelial mesenchymal transition (EMT) refers to the conversion of epithelial cell properties into mesenchymal characteristics. The epithelial mesenchymal transition is also involved in the development and progression of cancer, and is associated with intercellular junctions, And the morphologic transformation of the cell is caused by an increase in functions such as metastasis, migration and invasion. These transitions lead to specific changes in intracellular location and function, expression of multiple protein constructs associated with signal transduction, cytoskeletal structure and fat composition in cell membranes. Therefore, research is being conducted on the major factors involved in diversity, polarity and dynamics of the cell structure of cancer cells.

한편, EBP50 (Ezrin-Binding Phosphoprotein 50)으로 불리우는 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor)는 NHERF의 패밀리 중 하나로 여러 상피 조직에서 발현되고 있고 극성 상피세포의 세포막 끝부분(apical)에 위치하고 있으며, 미세융모 형성에도 작용한다. 또한 NHERF1은 ERM(Ezrin/Radixin/Moesin) 결합 단백질로서 막 단백질과의 상호작용을 통해 막 도메인의 구성에 관여하고 세포막 끝에서 기본적인 세포골격을 형성하도록 한다. On the other hand, NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor) called EBP50 (Ezrin-Binding Phosphoprotein 50) is one of the NHERF family and is expressed in many epithelial tissues and is located apical of polar epithelial cells. . In addition, NHERF1 is an ERM (Ezrin / Radixin / Moesin) binding protein that interacts with the membrane protein to participate in the membrane domain formation and to form a basic cytoskeleton at the cell membrane end.

또한 NHERF 단백질은 다른 스캐폴딩 단백질과 같이 다중 단백질간 결합 모듈을 포함하고 있는데, 2개의 N 말단 탄뎀 PDZ 도메인과 C 말단 ERM 결합 도메인을 가지고 있다. PDZ 도메인은 성장인자 수용체, G- 단백질 결합 수용체, 이온 채널 및 세포 접합분자와 같은 막 단백질과 포스포리파아제 C, 인산화효소 및 ERM 패밀리 단백질과 같은 세포질 신호분자들과 상호작용을 한다. 분자 스캐폴드 기능을 갖는 NHERF1은 다중 결합 파트너들로 구성된 단백질 복합체의 기능적 단위를 형성하도록 매개한다. 이러한 분자간 상호작용에 의해 NHERF은 세포막의 신호유도, 세포골격의 재구성, 수용체 수송 및 포스포이노시티드(phosphoinositide) 대사과정의 주요 조절자로서 작용한다. In addition, the NHERF protein, like other scaffolding proteins, contains a multi-protein linkage module, which has two N-terminal tandem PDZ domains and a C-terminal ERM binding domain. The PDZ domain interacts with membrane proteins such as growth factor receptors, G-protein coupled receptors, ion channels and cell junction molecules and cellular signaling molecules such as phospholipase C, phosphorylase and ERM family proteins. NHERF1, which has a molecular scaffolding function, mediates the formation of functional units of a protein complex composed of multiple binding partners. Due to this intermolecular interaction, NHERF acts as a major regulator of cell membrane signaling, cytoskeletal reconstitution, receptor transport and phosphoinositide metabolism.

LPA(Lysophosphatidic acid)는 액틴 재구성, 세포 증식 자극, 세포사멸 억제 및 종양세포의 침윤 반응에 관여하는 것으로 알려져 있으며, LPA는 LPA 수용체와 결합하여 반응을 유도한다. 또한 일부 연구 결과를 통해 LPA/LPAR가 암의 병리학적 측면에서 중요한 역할을 하고 있다는 것을 알 수 있는데, FCS(fetal calf serum)의 중요 분자인 oleoyl-LPA가 쥐의 간암세포 침윤을 촉진시킨다는 사실이 밝혀졌고, LPA가 OCAF(ovarian cancer activating factor)의 활성형 지방 인자로서 난소암 세포를 자극한다는 것이 알려졌으며, 특히 난소암 환자의 복수 및 혈청에서 LPA의 수준이 특이적으로 증가되어 있다는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 LPA는 상피간엽이행(EMT)과도 관련되어 있는데, 상피간엽이행 중 LPARs이 상향 조절되어 있으며, EMT 이후의 세포는 LPA에 더 민감하게 반응한다. 게다가 LPA는 암 세포의 이동과 침윤을 촉진시켜 암전이를 유발하게 한다.LPA (lysophosphatidic acid) is known to be involved in actin remodeling, cell proliferation stimulation, inhibition of apoptosis, and invasion of tumor cells. LPA binds to LPA receptor and induces a response. In addition, some studies have shown that LPA / LPAR plays an important role in the pathology of cancer. The fact that oleoyl-LPA, a key molecule of FCS (fetal calf serum), promotes hepatocellular carcinoma infiltration in rats It is known that LPA stimulates ovarian cancer cells as an active fat factor of ovarian cancer activating factor (OCAF), and it is known that the level of LPA is specifically increased in ascites and serum of ovarian cancer patients . In addition, LPA is also involved in epithelial mesenchymal transition (EMT), in which LPARs are upregulated during epithelial mesenchymal transition and cells after EMT respond more sensitively to LPA. In addition, LPA promotes cancer cell migration and invasion, leading to cancer metastasis.

따라서 LPA에 의한 암세포의 이동 및 전이를 저해하는 물질은 항암 치료제로 사용 가능하다. 한편, 암의 발생과 진행에 관여하는 LPA 관여 인자들에 대한 연구가 진행되고 있으나, NHERF1 조절을 통한 암세포 이동 및 전이에 대한 연구는 미비한 실정이다.Therefore, substances that inhibit the migration and metastasis of cancer cells by LPA can be used as anticancer drugs. On the other hand, studies on the LPA participating factors involved in the development and progression of cancer are under way, but studies on the migration and metastasis of cancer cells through the regulation of NHERF1 are insufficient.

이에 본 발명에서는 종래 밝히지 못했던 세포질 내에서의 NHERF1이 암에 미치는 영향을 규명하였고, 특히 NHERF1의 발현 또는 활성을 억제할 경우 암세포의 위족 형성 및 암세포 이동을 저해할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present invention has clarified the effect of NHERF1 on cancer in the cytoplasm, and in particular, by inhibiting the expression or activity of NHERF1, it is possible to inhibit cancer cell migration and cancer cell migration. Respectively.

미국공개특허 2006-0246470A1U.S. Published Patent Application 2006-0246470A1

이에 본 발명자들은 암 세포의 위족 형성 및 암 전이를 억제할 수 있는 새로운 항암제로서 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1) 억제제의 신규 용도를 규명하였다.Accordingly, the present inventors have identified a novel use of NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) inhibitor as a novel anticancer agent capable of inhibiting cancer formation and cancer metastasis.

그러므로 본 발명의 목적은 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 세포의 위족 형성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide a composition for inhibiting the formation of stomach cancer cells comprising NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) inhibitor as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 조성물을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a composition for inhibiting cancer metastasis comprising an inhibitor of NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 암 세포에 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1) 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 암 세포의 전이 억제 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method of inhibiting cancer cell metastasis, comprising the step of treating cancer cells with a NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) inhibitor.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 세포의 위족 형성 억제용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for inhibiting the formation of a stomach cancer cell comprising NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) inhibitor as an active ingredient.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 서열번호 1로 이루어진 NHERF1 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor may be any one selected from the group consisting of antisense nucleotides, siRNA, shRNA, and antibodies capable of complementarily binding to the NHERF1 gene of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산을 갖는 NHERF1의 돌연변이체일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor may be a mutant of NHERF1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 5 또는 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the siRNA may comprise the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 난소암, 유방암, 간암, 폐암, 뇌종양 또는 상피세포암일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the cancer may be an ovarian cancer, a breast cancer, a liver cancer, a lung cancer, a brain tumor, or an epithelial cell cancer.

또한, 본 발명은 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for inhibiting cancer metastasis comprising an inhibitor of NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) as an active ingredient.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 암세포에서 LPA(Lysophosphatidic acid) 자극에 의한, ERM(Ezrin/Radixin/Moesin)의 인산화를 억제하고; NHERF1- cpERM(인산화된 ERM)의 복합체 형성을 억제하고; NHERF1의 세포질에서 세포막으로의 이동을 억제하고; 및 암세포의 위족 형성을 억제하여 암의 전이를 저해할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor inhibits ERM (Ezrin / Radixin / Moesin) phosphorylation by LPA (lysophosphatidic acid) stimulation in cancer cells; Inhibits complex formation of NHERF1-cpERM (phosphorylated ERM); Inhibiting the migration of NHERF1 from the cytoplasm to the cell membrane; And inhibiting the formation of the stomach of cancer cells and inhibiting cancer metastasis.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 서열번호 1로 이루어진 NHERF1 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor may be any one selected from the group consisting of antisense nucleotides, siRNA, shRNA, and antibodies capable of complementarily binding to the NHERF1 gene of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산을 갖는 NHERF1의 돌연변이체일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor may be a mutant of NHERF1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 5 또는 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the siRNA may comprise the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 난소암, 유방암, 간암, 폐암, 뇌종양 또는 상피세포암일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the cancer may be an ovarian cancer, a breast cancer, a liver cancer, a lung cancer, a brain tumor, or an epithelial cell cancer.

나아가 본 발명은 암 세포에 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1) 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 암 세포의 전이 억제 방법을 제공한다.Further, the present invention provides a method of inhibiting cancer cell metastasis, comprising the step of treating cancer cells with a NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) inhibitor.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산을 갖는 NHERF1의 돌연변이체; 또는 서열번호 5 또는 6의 염기서열로 이루어진 NHERF1에 대한 siRNA일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor is a mutant of NHERF1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4; Or an siRNA against NHERF1 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 LPA(Lysophosphatidic acid) 자극으로 유발되는 암 세포의 위족 형성 및 세포 이동을 저해하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor may be one that inhibits the formation of cancer cells and cell migration induced by LPA (lysophosphatidic acid) stimulation.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 난소암, 유방암, 간암, 폐암, 뇌종양 또는 상피세포암일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the cancer may be an ovarian cancer, a breast cancer, a liver cancer, a lung cancer, a brain tumor, or an epithelial cell cancer.

본 발명의 NHERF1 저해제는 암세포에서 LPA(Lysophosphatidic acid) 자극에 의한 ERM(Ezrin/Radixin/Moesin)의 인산화를 억제하고 NHERF1- cpERM(인산화된 ERM) 복합체 형성을 억제하며 NHERF1의 세포질에서 세포막으로의 이동을 억제하고 암세포의 위족 형성을 억제하여 궁극적으로 암의 전이를 억제할 수 있으므로, NHERF1 저해제를 포함하는 조성물은 암의 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.The NHERF1 inhibitor of the present invention suppresses ERM (Ezrin / Radixin / Moesin) phosphorylation by LPA (lysophosphatidic acid) stimulation in cancer cells, inhibits NHERF1- cpERM (phosphorylated ERM) complex formation, And inhibiting the formation of stomachs of cancer cells and ultimately inhibiting cancer metastasis. Therefore, a composition containing the NHERF1 inhibitor can be usefully used as a pharmaceutical composition for the treatment of cancer or inhibiting cancer metastasis.

도 1은 난소암 세포주에서 LPA 처리에 따른 NHERF1의 이동여부를 분석한 결과로서, 1a는 1uM LPA 처리 후, 2분 간격으로 NHERF1의 세포내 위치를 형광 현미경으로 분석한 결과이고 1b는 LPA 처리에 따른 NHERF1의 사이토졸에서 세포막으로의 이동여부 확인 및 세포 표면 돌출 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 NHERF1의 이동이 LPA 자극에 따른 인산화된 ERM 단백질과의 결합에 의존적임을 확인한 결과로서, 2a는 LPA 처리 농도별 인산화된 ERM 단백질(cpERM)의 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이고, 2b는 NHERF1-cp ERM의 상호작용을 면역침강법으로 확인한 것이며, 2c 및 2d는 NHERF1-WT과 NHERF1-△CT를 각각 형질도입 후, LPA 처리에 따른 세포내 NHERF1 및 cpERM의 위치를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 2e 및 2f는 cpERM 및 ERM에 대한 각각의 항체를 이용하여 NHERF1과 cpERM 및 ERM의 세포내 위치를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 NHERF1의 ERM 인산화에 미치는 영향을 분석한 것으로 3a 및 3b는 NHERF1 및 NHERF2에 대한 siRNA 처리 후, 시간에 따른 cpERM 단백질 수준 및 LPA 처리 농도에 따른 cpERM 단백질, pARK, pSGKα/β 및 pERK 수준을 웨스턴블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 3c는 다양한 난소 상피유래 세포주에서의 NHERF1 및 ERM의 단백질양을 확인한 것이며, 3d는 GFP 및 NHERF1에 대한 항체를 이용하여 NHERF1-WT과 NHERF1-△CT의 세포내 단백질 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이며, 3e는 LPA 처리 후, NHERF1-WT과 NHERF1-△CT이 cpERM 단백질의 인산화에 미치는 영향을 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 GFP-NHERF1-WT, GFP-NHERF1-△CT 및 GFP-NHERF1-CT에 대한 유전자 구조의 모식도를 나타낸 것이고, 4b는 GFP-NHERF1-WT, GFP-NHERF1-△CT 및 GFP-NHERF1-CT로 형질도입된 세포 내에서 각각의 NHERF1 및 cpERM의 세포내 위치를 공초점 현미경 분석으로 확인한 사진을 나타낸 것이며, 4c는 서로 다른 암세포주에 NHERF1에 대한 siRNA를 처리 후, NHERF1 발현억제 정도를 웨스턴블럿을 통해 확인한 것이고, 4d 및 4e는 NHERF1 발현억제 시 LPA 처리에 따른 암 세포이동 저해 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 NHERF1-cpERM 복합체에 대한 암세포 내에서의 위치 분포 및 피질 재구성에 대한 모식도를 나타낸 것이고, 5b는 암세포에서 LPA 자극에 의한 EMT 과정에 NHERF1이 작용하는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.FIG. 1 shows the results of analysis of NHERF1 migration by LPA treatment in ovarian cancer cell line. In FIG. 1, 1a shows the results of fluorescence microscopy of the intracellular location of NHERF1 at intervals of 2 minutes after 1 uM LPA treatment, And the results of confirming whether the NHERF1 migrated from the cytosol to the cell membrane and protruding from the cell surface.
FIG. 2 shows that the migration of NHERF1 is dependent on the binding of phosphorylated ERM protein with LPA stimulation. 2a shows the level of phosphorylated ERM protein (cpERM) by LPA treatment concentration by Western blot. 2c and 2d show the results of confirming the positions of intracellular NHERF1 and cpERM according to LPA treatment after transduction of NHERF1-WT and NHERF1-? CT, respectively, 2e and 2f show the results of confirming the intracellular location of NHERF1, cpERM and ERM using the respective antibodies against cpERM and ERM.
Fig. 3 shows the results of analysis of the effect of NHERF1 on ERM phosphorylation. 3a and 3b show the effect of cPERM protein, pARK, pSGKa / beta and pERK levels on siRNA treatment of NHERF1 and NHERF2, 3c shows the amount of NHERF1 and ERM protein in a variety of ovarian epithelial cell lines, and 3d shows the expression of NHERF1-WT and NHERF1-? CT cells using antibodies against GFP and NHERF1 And 3e shows Western blot analysis of the effect of NHERF1-WT and NHERF1-? CT on phosphorylation of cpERM protein after LPA treatment.
4A is a schematic diagram of the gene structure for GFP-NHERF1-WT, GFP-NHERF1-? CT and GFP-NHERF1-CT, and 4b is a schematic diagram of GFP- NHERF1-WT, GFP- FIG. 4C is a photograph showing the intracellular location of each of NHERF1 and cpERM in CT-transfected cells, and FIG. 4C is a graph showing the degree of inhibition of NHERF1 expression after treatment with NHERF1 siRNA in different cancer cell lines. And 4d and 4e showed inhibition of cancer cell migration by LPA treatment when inhibiting NHERF1 expression.
FIG. 5A is a schematic diagram showing the location of the NHERF1-cpERM complex in cancer cells and the cortical remodeling, and FIG. 5B is a schematic diagram showing a process in which NHERF1 acts on EMT by LPA stimulation in cancer cells.

본 발명은 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 세포의 위족 형성 억제용 조성물을 제공함을 특징으로 한다.The present invention provides a composition for inhibiting the formation of stomach cancer cells comprising NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) inhibitor as an active ingredient.

위족(pseudopodia)은 세포 표면에서 형성되는 가지 돌기로서 세포의 한쪽 부분이 늘어난 것으로, 이동하는 세포 표면에서 돌출된 특별한 구조이다. 위족의 작용방식을 가장 쉽게 이해할 수 있도록 도와주는 모델이 아메바이다. 세포는 자신이 지지체로 삼으려는 대상 쪽의 막을 늘려서 위족을 형성시킴으로써 그 표면에 부착하여 앞으로 나아갈 수 있게 된다. 이러한 방법을 무한 반복하여 세포는 이동할 수 있게 되는 것이다. 암 세포 역시 전이 및 침윤을 위해 암세포에 위족이 형성되고 전이가 발생되므로, 암세포에 대해 위족 형성을 억제하는 물질은 새로운 항암제로서 작용할 수 있다. Pseudopodia is a bifurcation formed on the surface of a cell. One part of the cell is stretched. It is a special structure protruding from the surface of the moving cell. The amoeba is the model that helps you to understand the way the stomach works most easily. Cells can attach themselves to the surface by stretching the membrane on the side of the target that they want to support and form the stomach. By repeating this method infinitely, the cells can move. Since cancer cells also form metastases in cancer cells for metastasis and invasion, substances that inhibit the formation of the stomach against cancer cells may act as new anticancer drugs.

이에 본 발명자들은 암세포의 위족 형성 억제 및 암전이 억제 활성을 갖는 새로운 항암 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1)의 발현 또는 활성 억제제가 이러한 기능을 할 수 있음을 확인하였다.Accordingly, the present inventors have conducted studies to develop a novel chemotherapeutic agent having an inhibitory effect on the formation of the stomach and inhibition of cancer metastasis of cancer cells, and have found that the expression or activity inhibitor of NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) Respectively.

NHERF1은 앞에서 살펴본 바와 같이, 여러 상피 조직에서 발현되고 있고 ERM(Ezrin/Radixin/Moesin)와 결합하는 단백질로서 막 단백질과의 상호작용을 통해 막 도메인의 구성에 관여하고 기본적인 세포골격 형성에 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 NHERF1은 피질-액틴 리치 구조를 나타내고 있으며 외부 자극인자에 대해 세포 내 분포가 역동적으로 조절된다. 그러나 세포 내 특정 위치에서 분포되어 있는 NHERF1에 대한 구체적인 역할 에 대해서는 연구가 미비한 상태이다.As described above, NHERF1 is expressed in several epithelial tissues and is a protein that binds to ERM (Ezrin / Radixin / Moesin). It interacts with the membrane protein and plays a role in the formation of the membrane domain. . In addition, NHERF1 has a cortex-actin-rich structure, and its intracellular distribution is dynamically regulated for external stimulants. However, the specific role of NHERF1, which is distributed in specific locations within the cell, has not yet been studied.

본 발명에서는 상기 NHERF1이 LPA로 자극된 암 세포주 내에서 위치 이동 발생을 확인하였는데, 세포질(cytosolic) 내에 위치하던 NHERF1이 LPA 자극 시, 세포막으로 급격히 이동되는 것으로 나타났고, 이때 인산화된 ERM(cpERM) 단백질과 복합체를 형성하며 세포 피질의 리모델링에 작용한다는 것을 확인하였다.In the present invention, NHERF1 was found to be localized in the LPA-stimulated cancer cell line. NHERF1, which was located in the cytosolic region, was rapidly transported to the cell membrane upon LPA stimulation. In this case, phosphorylated ERM (cpERM) Protein complexes and remodeling of the cell cortex.

특히 LPA로 자극된 암세포 내에서 NHERF1은 cpERM 단백질과 상호작용하며 세포 위족을 형성하고 암세포의 이동 및 전이에 관여한다는 것을 알 수 있었다.Especially, in the LPA - stimulated cancer cells, NHERF1 interacts with cpERM protein, and it is found that it is involved in cell migration and metastasis.

이에 본 발명자들은 NHERF1의 발현 또는 활성을 저해하는 저해자가 암 세포의 위족 형성 및 암 전이를 억제할 수 있는지 확인하였는데, NHERF1의 돌연변이체 및 NHERF1의 발현 저해제(siRNA)가 암 세포주 내에서 위족 형성 및 암세포 전이를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다. 구체적인 실험 결과는 하기 실시예에 기술되어 있는 실험을 통해 확인하였다.Therefore, the present inventors confirmed that the inhibitor that inhibits the expression or activity of NHERF1 can inhibit cancer formation and cancer metastasis in cancer cells. Mutants of NHERF1 and NHERF1 expression inhibitor (siRNA) It was confirmed that the cancer cell metastasis can be effectively inhibited. Specific experimental results were confirmed through experiments described in the following examples.

그러므로 본 발명은 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 세포의 위족 형성 억제용 조성물을 제공할 수 있다.Therefore, the present invention can provide a composition for inhibiting the formation of a stomach of a cancer cell comprising an inhibitor of NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) as an active ingredient.

본 발명에 다른 상기 억제제는 NHERF1의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 억제제로서, 이에 제한되지는 않으나 서열번호 1로 이루어진 NHERF1 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.The inhibitor according to the present invention is an inhibitor capable of inhibiting the expression or activity of NHERF1, but is not limited thereto, and may be an antisense nucleotide, an siRNA, an shRNA and an antibody capable of complementarily binding to the NHERF1 gene of SEQ ID NO: And the like.

본 명세서에서 사용된 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. NHERF1에 대한 안티센스 서열은 NHERF1 mRNA에 상보적이고 NHERF1 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, NHERF1 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙 (maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. As used herein, the term " antisense oligonucleotide " refers to DNA or RNA, or derivatives thereof, which contain an oligonucleotide sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, and binds to a complementary sequence in the mRNA, To the translation. The antisense sequence for NHERF1 refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to NHERF1 mRNA and capable of binding to NHERF1 mRNA and can be used for translation of NHERF1 mRNA, translocation into cytoplasm, maturation or any other overall biological function Lt; RTI ID = 0.0 > activity. ≪ / RTI >

상기 “siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자를 의미한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법 또는 유전자 치료 방법으로 제공될 수 있다. SiRNA " means an oligonucleotide molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing. Since siRNA can inhibit the expression of a target gene, it can be provided as an efficient gene knockdown method or gene therapy method.

본 발명에서 siRNA 분자가 이용되는 경우, 센스 가닥, 즉 NHERF1 mRNA 서열에 상응하는 서열과 안티센스 가닥, 즉 NHERF1 mRNA 서열에 상보적인 서열이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또는 자기-상보성 (self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(mismatch, 대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(bulge, 일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA 말단 구조는 NHERF1 유전자의 발현을 RNA 간섭 (RNAi) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 (blunt) 말단 혹은 점착 (cohesive) 말단 모두 가능하다. When the siRNA molecule is used in the present invention, the sense strand, that is, the sequence corresponding to the NHERF1 mRNA sequence and the sequence complementary to the antisense strand, that is, the NHERF1 mRNA sequence, may be located on opposite sides to form a double stranded structure, May have a single-stranded structure with self-complementary sense and antisense strands. siRNA is not limited to the complete pairing of double-stranded RNA moieties in RNA pairs, but rather to mismatch (corresponding bases are not complementary), bulge (no bases corresponding to one chain) A non-paired portion may be included. The siRNA terminal structure is capable of blunt or cohesive termini as long as it can inhibit the expression of the NHERF1 gene by an RNA interference (RNAi) effect.

또한, 발명에서 이용될 수 있는 NHERF1 단백질에 특이적으로 결합하여 활성을 억제하는 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. NHERF1 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법, 재조합 DNA 방법 또는 파아지 항체 라이브러리 방법에 의해 제조될 수 있다.In addition, the antibody that specifically binds to the NHERF1 protein and inhibits the activity, which can be used in the invention, may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. The antibody against the NHERF1 protein can be prepared by methods conventionally practiced in the art, for example, a fusion method, a recombinant DNA method, or a phage antibody library method.

본 발명의 일실시예에서는, 상기 억제제로서 NHERF1에 대한 돌연변이체를 사용하였는데, 상기 돌연변이체는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산을 갖는 NHERF1 돌연변이체이다.In one embodiment of the present invention, a mutant for NHERF1 was used as the inhibitor, wherein the mutant is the NHERF1 mutant having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.

서열번호 3의 돌연변이체는 NHERF1의 전장 펩타이드에서 C말단의 ERM 결합 도메인이 결손된 NHERF1-△CT 돌연변이체이며, 서열번호 4의 돌연변이체는 NHERF1의 C 말단부위만을 포함하는 곳으로 2개의 PDZ 도메인이 결손된 돌연변이체이다.The mutant of SEQ ID NO: 3 is a NHERF1-? CT mutant in which the ERM binding domain at the C terminus is deleted in the full-length peptide of NHERF1, and the mutant of SEQ ID NO: 4 contains two PDZ domains This is a defective mutant.

본 발명에서 상기 NHERF1의 유전자 서열은 서열번호 1로 기재하였고, NHERF1의 아미노산 서열은 서열번호 2로 기재하였다.In the present invention, the gene sequence of NHERF1 is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of NHERF1 is shown in SEQ ID NO: 2.

나아가 본 발명은 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 조성물을 제공한다. Further, the present invention provides a composition for inhibiting cancer metastasis comprising NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) inhibitor as an active ingredient.

앞서 기술된 상기 본 발명의 억제제는 LPA(Lysophosphatidic acid) 자극에 의한 암 세포에서, ERM(Ezrin/Radixin/Moesin)의 인산화를 억제하고; NHERF1- cpERM(인산화된 ERM)의 복합체 형성을 억제하고; NHERF1의 세포질에서 세포막으로의 이동을 억제하고; 및 암세포의 위족 형성을 억제하여 암의 전이를 저해할 수 있다.The inhibitor of the present invention described above suppresses phosphorylation of ERM (Ezrin / Radixin / Moesin) in cancer cells by stimulation with LPA (Lysophosphatidic acid); Inhibits complex formation of NHERF1-cpERM (phosphorylated ERM); Inhibiting the migration of NHERF1 from the cytoplasm to the cell membrane; And inhibiting the formation of the stomach of cancer cells and inhibiting cancer metastasis.

암은 비정상적이고 비제어성을 가지는 무질서한 세포증식의 산물이다. 특히, 파괴적인 성장성, 침투성 및 전이성이 있다면 악성으로 분류된다. 암환자의 주된 사망요인은 초기 종양에 의한 것이 아니고 암세포의 다른 조직으로의 전이에 의한 것이다. 암세포의 전이과정을 살펴보면, 먼저 원발종양으로부터 전이성 암세포가 떨어져 나와 정상조직의 간질과 기저막과 같은 지지구조체로 침윤해 들어가서 다른 목표 조직의 모세혈관 벽에 부착하고 세포외기질과 기저막을 분해한 후 모세혈관으로 유출, 새로운 조직에서 혈관 신생이 동반되어 이차종양이 형성되는 것이다. 따라서, 전이과정은 이동 (migration), 부착 (adhesion), 침윤 (invasion) 등의 주요 단계로 구성되어 있으며, 이중에서 어느 하나를 막을 수 있다면 암전이를 억제할 수 있다. Cancer is the product of abnormal, uncontrolled, disordered cell proliferation. In particular, it is classified as malignant if it has destructive growth, permeability and metastasis. The main cause of death in cancer patients is not due to early tumors, but by metastasis of cancer cells to other tissues. The metastatic process of cancer cells is as follows. First, metastatic cancer cells are separated from the primary tumor and invade into the supporting structure such as epilepsy and basement membrane of the normal tissue, attach to the capillary wall of the other target tissue, decompose the extracellular matrix and basement membrane, The blood flow to the blood vessels and the new tissue is accompanied by angiogenesis and secondary tumor formation. Thus, the metastasis process is composed of major steps such as migration, adhesion, and invasion, and it is possible to inhibit metastasis if one of them is blocked.

이와 관련하여 본 발명은 NHERF1의 발현 또는 활성을 억제할 경우 세포 이동과 관련된 암세포의 위족 형성을 억제할 수 있고 따라서 암세포 이동을 저해할 수 있다. In this regard, the present invention inhibits the expression or activity of NHERF1 to inhibit the formation of cancer cells related to cell migration, thereby inhibiting cancer cell migration.

또한 본 발명의 억제제가 적용될 수 있는 대상질환인 상기 암은 이에 제한되지는 않으나, 난소암, 유방암, 간암, 폐암, 뇌종양 또는 상피세포암일 수 있다. The cancer which is a target disease to which the inhibitor of the present invention can be applied is not limited to ovarian cancer, breast cancer, liver cancer, lung cancer, brain tumor, or epithelial cell cancer.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.  The composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier. The composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier can be of various oral or parenteral formulations. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, . In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. Various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used. have. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the non-aqueous solvent and the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.

본 발명의 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다. The composition of the present invention may be in the form of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, It can have one formulation.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. The composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, a " pharmaceutically effective amount " means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dosage level will vary depending on the species and severity, age, sex, , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art.

본 발명에 따른 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 NHERF1 유전자의 발현 억제제 또는 NHERF1 단백질의 활성 억제제를 포함하는 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.The administration route of the composition according to the present invention may be administered through any general route as long as it can reach the target tissues, and may be administered intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, Oral administration, intravenous administration, intra-pulmonary administration, intrarectal administration, and the like. In addition, the composition comprising the NHERF1 gene expression inhibitor or the NHERF1 protein activity inhibitor may be administered by any device capable of moving the active substance to the target cell.

나아가 본 발명은 암 세포에 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1) 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 암 세포의 전이 억제 방법을 제공할 수 있다.Further, the present invention can provide a method for inhibiting the cancer cell metastasis, which comprises treating cancer cells with a NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) inhibitor.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<재료준비><Materials Preparation>

1. 시약 및 항체1. Reagents and antibodies

LPA(1-Oleoyl-2-hydroxy-sn-glycerol-3-phosphate)는 Enzo™ Life Sciences사에서 구입한 것을 사용하였고, 합성 siRNA duplexes 및 Lipofectamine 2000™은 각각 Dharmacon 및 Life Technologies사로부터 구입한 것을 사용하였다. 세포 배양 디쉬 및 플레이트는 BD Bioscience (Falcon™)로부터 구입하여 사용하였고, 96-웰 변형된 Boyden 챔버(polycarbonate membranes)는 NeuroProbe (Cabin John, MD, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 또한 트랜스웰 이동 분석 및 위족 형성 분석을 위해서는 각각 8 μm 및 5 μm의 다른 기공사이즈를 갖는 것을 사용하였다. 혈청 및 배지는 Life Technologies 사의 것을 구입하여 사용하였고 이외 다른 시약들은 Sigma-Aldrich사 것을 사용하였다.LPA (1-Oleoyl-2-hydroxy-sn-glycerol-3-phosphate) was purchased from Enzo Life Sciences. Synthetic siRNA duplexes and Lipofectamine 2000 ™ were purchased from Dharmacon and Life Technologies Respectively. Cell culture dishes and plates were purchased from BD Bioscience (Falcon), and 96-well modified Boyden chambers were purchased from NeuroProbe (Cabin John, MD, USA). In addition, transwell migration analysis and stool formation analysis were performed with different pore sizes of 8 μm and 5 μm, respectively. The serum and medium were purchased from Life Technologies and other reagents were purchased from Sigma-Aldrich.

하기 실시예에서 사용된 항체로서, Rabbit polyclonal α-NHERF1 및 α-NHERF2 Ab는 NHERF1 또는 NHERF-2 (CT: aa 261351)의 6xHis-태그된 C-말단 절편의 접종을 통해 수득한 것을 사용하였고, α-ERM (Cat. no. #3142), α-cpERM (Cat. no. #3141), α-pGSKα/β (Cat. no. #9331), α-pERK1/2 (Cat. no. #3179) 및 α-pAKT (Cat. no. #4060) 항체들은 Cell Signaling Technology사로부터 구입하여 사용하였으며, α-VSVG 항체는 Sigma-Aldrich사로부터 구입하여 사용하였다.As the antibodies used in the following examples, Rabbit polyclonal α-NHERF1 and α-NHERF2 Ab were obtained by inoculation of a 6 × His-tagged C-terminal fragment of NHERF1 or NHERF-2 (CT: aa 261351) (Cat. # 3142), α-cpERM (Cat No. 3141), α-pGSKα / β (Cat. No. 9331), α-pERK1 / 2 ) And α-pAKT (Cat # no. 4060) antibodies were purchased from Cell Signaling Technology, and the α-VSVG antibody was purchased from Sigma-Aldrich.

2. 시약 및 항체2. Reagents and antibodies

하기 실시예에서 사용한 각종 플라스미드는 PCR 수행을 통해 제조한 것을 사용하였는데, 전장 hNHERF1의 cDNA는 특정 제한효소 사이트를 갖는 서열을 포함하도록 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 수득하였다. 즉, hNHERF1 WT (aa 1351) 및 결손 절편(ΔCT: aa 1260, CT: aa 261351)은 BamHI/XhoI의 제한효소를 처리하여 절단한 후, pEGFP-C1 또는 pET30a (+) 벡터에 라이게이션 시켰다. pCMV2-FLAG 클로닝을 위해 PCR 산물을 BglII/XhoI를 처리하여 절단시킨 후, BglII/SalI으로 처리된 pCMV2-FLAG 벡터에 라이게이션 시켰다. GFP-tagged NHERF1-WT은 pEGFPC1-hNHERF1-WT으로부터 증폭시켰는데, 앰플리콘(amplicon)을 NotI/ClaI으로 절단한 후, pAvCMV3에 도입하여 재조합 아데노바이러스를 제조하였다. VSVG epitopetagged Ezrin WT 및 pCB6+ 벡터에 클로닝되어 있는 T567A 돌연변이체는 Dr. Monique Arpin로부터 수득한 것을 사용하였다. 각각의 cDNA는 NotI/ClaI 제한효소 사이트를 지닌 채로 pAvCMV3 벡터로 클로닝하였고 모든 돌연변이체들은 시퀀싱하여 돌연변이 여부를 확인하고 사용하였다.Various plasmids used in the following examples were prepared by PCR. The cDNA of full length hNHERF1 was obtained by performing PCR using primer pairs so as to include a sequence having a specific restriction enzyme site. That is, hNHERF1 WT (aa 1351) and deletion fragments (ΔCT: aa 1260, CT: aa 261351) were digested with restriction enzymes of Bam HI / Xho I and ligated to pEGFP-C1 or pET30a . For pCMV2-FLAG cloning, the PCR product was digested with Bgl II / Xho I and then ligated into pCMV2-FLAG vector treated with Bgl II / Sal I. GFP-tagged NHERF1-WT is I ordered amplified from pEGFPC1-hNHERF1-WT, and then cutting the amplicon (amplicon) with Not I / Cla I, were prepared by introducing the pAvCMV3 recombinant adenovirus. The T567A mutant cloned in the VSVG epitopetagged Ezrin WT and pCB6 + Monique Arpin was used. Each cDNA was cloned into the pAvCMV3 vector with the Not I / Cla I restriction site and all mutants were sequenced and confirmed for mutation.

3. 세포배양 및 형질도입3. Cell culture and transduction

OVCAR-3, SK-OV-3 및 MDA-MB-231 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 수득한 것을 사용하였고, 세포주들은 penicillin (50 units/ml), streptomycin (50 units/ml) 및 10% fetal bovine serum (FBS, Life Technologies)을 함유하는 DMEM 배지를 이용하여 95%의 공기 및 5% 이산화탄소 조건으로 37℃에서 배양하였다. HIO-80, 불멸화 인간 정상 난소 표피 세포주는 필라델피아 Fox Chase Cancer Center에 있는 Andrew Godwin 박사로부터 수득하여 사용하였고, 이 세포주는 199배지 및 MCDB 105 배지가 1:1로 혼합되고 15% FBS, 0.25 U/ml insulin 및 2 mM L-glutamine가 첨가된 배지로 배양하였다. 형질도입을 위해 세포들을 100mm 디쉬에 분주하였고 siRNA duplexes 또는 플라스미드를 리포펙타민 2000을 이용하여 세포에 형질 도입시켰다.OVCAR-3, SK-OV-3 and MDA-MB-231 cell lines were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC), cell lines were penicillin (50 units / ml), streptomycin The cells were cultured in DMEM medium containing 5% fetal bovine serum (FBS, Life Technologies) under conditions of 95% air and 5% carbon dioxide at 37 ° C. HIO-80, an immortalized human normal ovarian epithelial cell line, was obtained from Dr. Andrew Godwin, Ph.D., at the Fox Chase Cancer Center in Philadelphia. The cell line was mixed with 1: 1 of 199 medium and MCDB 105 medium, ml insulin and 2 mM L-glutamine. For transduction, cells were plated in 100 mm dishes and siRNA duplexes or plasmids were transfected into cells using lipofectamine 2000.

4. 4. AgonistAgonist 처리 및 세포 수집 Treatment and cell collection

세포들을 1.5 × 10⁶ 세포수/웰의 양으로 6-웰에 분주하였다. 이후 혈청이 없는 상태에서 24시간 동안 배양 후, LPA를 세포들에 처리하였다. 이후 차가운 PBS 버퍼로 2회 세포들을 세척하고 150 μl의 차가운 세포용해버퍼(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM EDTA/EGTA, 1 mM Na3VO4 및 10% v/v glycerol)를 이용하여 세포들을 용해시켰다. 세포용해물을 부드럽게 초음파(sonication) 처리하고 4℃에서 원심분리하여 세포 용해물을 수득하였고, 세포용해물 내에 함유된 단백질의 양은 BCA 어세이를 통해 측정하였다.The cells in an amount of 1.5 × 10 ⁶ cells / well was dispensed into 6-well. After 24 h of incubation without serum, LPA was treated with the cells. The cells were then washed twice with cold PBS buffer and 150 μl of cold cell lysis buffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM EDTA / EGTA, 1 mM Na3VO4 and 10% v / v glycerol) To dissolve the cells. Cell lysates were gently sonicated and centrifuged at 4 ° C to obtain cell lysates, and the amount of protein contained in the cell lysates was measured via BCA assay.

55 . . siRNAsiRNA 처리를 통한  Through processing 넉다운Knockdown

NHERF1 (451469) 및 NHERF2 (862880)에 대한 SiRNA duplexes는 앞서 기술한 GE Dharmacon에 의해 합성한 것을 사용하였다. 이때 대조군으로는 Luciferase GL3 Duplex를 사용하였다. 배양된 세포에 20n의 SiRNA 올리고뉴클레오티드를 혈청이 없는 배지를 이용하여 Oligofectamine™ (Thermo Fisher Scientific)로 형질도입시켰고, 4시간 후, 세포들을 10% FBS가 함유된 새로운 배지로 세척하였으며, 72시간을 추가 배양한 후 실험에 사용하였다.The siRNA duplexes for NHERF1 (451469) and NHERF2 (862880) were synthesized by GE Dharmacon as described above. Luciferase GL3 Duplex was used as a control. The cultured cells were transfected with 20 n siRNA oligonucleotides using Oligofectamine ™ (Thermo Fisher Scientific) using serum-free medium. After 4 hours, the cells were washed with fresh medium containing 10% FBS and incubated for 72 hours After further culture, they were used in the experiment.

66 . 재조합 . Recombination 아데노바이러스Adenovirus 제조 및 감염 Manufacturing and Infection

GFP-tagged NHERF1 또는 VSVG-tagged Ezrin (WT 또는 T567A mutant)를 발현하는 재조합 아데노바이러스는 HEK-293T 세포주에서 증폭시켜 수득하였는데, 증폭된 바이러스는 CsCl 농도구배 방법을 이용하여 정제하였다. OVCAR-3 세포들은 6웰에 가득하도록 배양시킨 후 10 MOI(multiplicity of infection)로 4시간 동안 혈청 함유 배지에서 바이러스로 감염시켰다. 동시에 음성 대조군으로는 동일 세포주에 empty shuttle 벡터를 갖는 아데노바이러스를 감염시킨 것을 사용하였다. Recombinant adenovirus expressing GFP-tagged NHERF1 or VSVG-tagged Ezrin (WT or T567A mutant) was obtained by amplification in HEK-293T cell line, and the amplified virus was purified using CsCl concentration gradient method. OVCAR-3 cells were cultured to fill 6 wells and then infected with virus in serum-containing medium for 4 hours at 10 MOI (multiplicity of infection). At the same time, adenovirus infected with empty shuttle vector in the same cell line was used as a negative control.

77 . . 면역침강Immune sedimentation 및  And 웨스턴Western 블럿Blot

세포들을 용해 버퍼로 용해시킨 후, 항체 또는 α-FLAG affinity resin을 이용하여 면역반응을 수행하였다. 면역 복합체는 1,000 × g의 원심분리로 수집하였고 이후 1 ml의 용해 버퍼로 4회 세척하였다. 최종 침전물은 SDS-PAGE 전기영동을 수행하였고 웨스턴 블럿을 수행하였다. SDS-PAGE 전기영동 이전에 모든 시료들은 Laemmli buffer로 용해하여 가열시켰고 6~16%의 겔 상에서 전기영동하였다. 전기영동된 단백질들은 니트로셀룰로스막으로 이동시켰고, 이동된 단백질을 함유한 니트로셀룰로스막은 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20 및 5% non-fat milk를 함유한 T-TBS 버퍼로 1시간 동안 블록킹 하였으며, OVCAR-3 및 MDA-MB-231 세포 용해물들은 각 항체를 사용하여 반응시킨 후, ECL 용액을 사용하여 블럿팅 하였다. Cells were lysed in lysis buffer and immunoreacted with antibodies or α-FLAG affinity resin. The immune complexes were collected by centrifugation at 1,000 × g and then washed four times with 1 ml of lysis buffer. The final precipitate was subjected to SDS-PAGE electrophoresis and Western blot was performed. Prior to SDS-PAGE electrophoresis, all samples were dissolved in Laemmli buffer, heated and electrophoresed on a 6-16% gel. The electrophoresed proteins were transferred to nitrocellulose membranes and the nitrocellulose membranes containing the transferred proteins were incubated with 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20 and 5% non-fat milk The cells were blocked with T-TBS buffer for 1 hour. OVCAR-3 and MDA-MB-231 cell lysates were reacted with each antibody and blotted using ECL solution.

88 . 면역세포화학. Immune cell chemistry

OVCAR-3 세포들을 10 ug/ml collagen type I (Sigma-Aldrich Co.)으로 코팅된 커버 글라스에 분주하였다. 이후 siRNA duplexes 또는 cDNA들을 세포에 형질 도입시켰고 이후 혈청이 없고 0.1% fatty acidfree BSA가 첨가된 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 0.1% BSA에 용해된 LPA를 세포에 처리하였다. 그런 뒤, 세포들을 PBS로 세척하고 20분 동안 상온에서 3.7%의 파라포름알데히드가 함유된 PBS 용액으로 고정시킨 다음, TBS [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150mM NaCl] 버퍼로 세척 후, 침투성 버퍼[PBS supplemented with 0.2% Triton X-100]로 10분간 배양시켰다. 세포들을 5분씩 3회 TBS 버퍼로 세척한 다음, 블록킹 용액((10% horse serum, 1% BSA, and 0.02% NaN3 in PBS)로 1시간 동안 상온에서 배양하였고, α-ERM, α-cpERM 및 α-VSVG 항체로 세포를 염색하였으며, 핵 DNA는 Hoechst 33342로 염색하였다. 세포내 이미지는 공초점 현미경(LSM510, Karl Zeiss)을 사용하여 다중 채널을 동시에 획득하였고, Zeiss imaging software를 이용하여 디지털화하였으며, Adobe Photoshop Software를 이용하여 편집하였다.OVCAR-3 cells were dispensed into cover glasses coated with 10 ug / ml collagen type I (Sigma-Aldrich Co.). Subsequently siRNA duplexes or cDNAs were transfected into cells and then cultured in DMEM medium supplemented with 0.1% fatty acid free BSA for 24 hours. Then, the cells were treated with LPA dissolved in 0.1% BSA. Then, the cells were washed with PBS, fixed with PBS solution containing 3.7% paraformaldehyde at room temperature for 20 minutes, washed with TBS [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl] buffer, And incubated with permeabilized buffer [PBS supplemented with 0.2% Triton X-100] for 10 minutes. Cells were washed three times for 5 minutes each in TBS buffer and incubated with blocking solution (10% horse serum, 1% BSA, and 0.02% NaN3 in PBS) for 1 hour at room temperature and α-ERM, Cells were stained with α-VSVG antibody and nuclear DNA was stained with Hoechst 33342. Intracellular images were acquired simultaneously using a confocal microscope (LSM510, Karl Zeiss) and digitized using Zeiss imaging software , And edited using Adobe Photoshop Software.

9. 변형된 9. Modified BoydenBoyden chambers를 이용한 세포이동 분석  Analysis of cell migration using chambers

세포이동분석은 OVCAR-3 폴리카보네이트막을 함유한 변형된 Boyden chambers (tissue culturetreated, 5.7 mm diameter, 8 μm pores, ChemoTX®; NeuroProbe)를 이용하여 분석하였다. 상부 챔버의 막(멤브레인) 밑면에는 10 μg/ml collagen type I (Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 코팅하고 4℃에서 밤새도록 두었으며 1×PBS로 1회 세척 후, 300 μl의 이동버퍼(serum-free basal medium, with 0.1% fatty acidfree BSA)를 함유하는 하부 챔버에 위치시켰다. 디쉬에서 세포들은 trypsin/EDTA (PBS, 0.01% trypsin, and 5 mM EDTA)를 처리하여 떨어드린 후, 이동 버퍼로 2회 세척하고 이후 이동버퍼(5 × 105 cells/ml)로 용해시켰다. 이후 2.5 × 10⁴ 세포들을 각각의 이동 챔버 상단에 첨가하고 3시간 동안 챔버 상부의 밑면으로 이동하도록 두었다. 막 윗부분의 표면에 있는 이동하지 않은 세포들은 면봉으로 제거하였고, 막의 바닥면에 부착된 이동된 세포들은 고정 버퍼(PBS containing 2% paraformaldehyde)로 고정시켰으며, 0.2% Triton X-100으로 10분 동안 상온에서 배양한 후, Hoechst 33342으로 염색하였다. PBS로 3회 세척 후, 막은 틀로부터 꺼낸 다음 슬라이드 글라스에 고정시켰다. 각 막으로 이동된 세포의 수는 40배 대물렌즈를 장착한 인버티드 형광 현미경으로 카운팅 하였다.Cell migration assays were performed using modified Boyden chambers (tissue culturetreated, 5.7 mm diameter, 8 μm pores, ChemoTX®; NeuroProbe) containing OVCAR-3 polycarbonate membranes. The membrane (membrane) of the upper chamber was coated with 10 μg / ml collagen type I (Thermo Fisher Scientific Inc.) and incubated overnight at 4 ° C. After washing once with 1 × PBS, 300 μl of serum- free basal medium, with 0.1% fatty acid free BSA). In the dish, the cells were treated with trypsin / EDTA (PBS, 0.01% trypsin, and 5 mM EDTA), washed twice with moving buffer, and then lysed with transfer buffer (5 x 105 cells / ml). Then 2.5 x 10 ⁴ cells were added to the top of each mobile chamber and allowed to move to the underside of the chamber top for 3 hours. The non-migrated cells on the surface of the membrane were removed with a cotton swab, and the migrated cells attached to the bottom of the membrane were fixed with PBS containing 2% paraformaldehyde and incubated with 0.2% Triton X-100 for 10 min After incubation at room temperature, it was stained with Hoechst 33342. After washing three times with PBS, the membrane was taken out of the mold and fixed on a slide glass. The number of cells transferred to each membrane was counted with an inverted fluorescence microscope equipped with a 40X objective lens.

<< 실시예Example 1> 1>

LPALPA 처리에 따른  Depending on the treatment NHERF1의NHERF1's 사이토졸에서From cytosol 세포막으로 이동분석 및 표면 돌출분석 Cell membrane migration analysis and surface extrusion analysis

본 발명자들은 NHERF1이 외부자극인자에 대해 세포내 이동현상이 유발되는지 확인하기 위해, 외부자극인자로 LPA를 처리한 후 세포내에서의 NHERF1 이동여부를 관찰하였다. 이를 위해 복수 유래 OVCAR-3 난소암 세포주를 대상으로 GFP-tagged NHERF1을 형질도입한 후, LPA를 1uM의 농도로 세포에 처리하고 상기 세포를 배양한 후, 공초점 현미경으로 저속 촬영하여 이미지를 획득하여 분석하였으며 저속 촬영은 LPA 처리 후, 2분 간격으로 수행하였다.In order to confirm whether NHERF1 induces intracellular migration to external stimulants, the present inventors examined whether NHERF1 migrated in cells after treatment with LPA as an external stimulant. To this end, GFP-tagged NHERF1 was transfected into a pluripotent OVCAR-3 ovarian cancer cell line, LPA was treated at a concentration of 1 uM, the cells were cultured, and the images were acquired by low speed photographing using a confocal microscope And low - speed photography was performed at intervals of 2 minutes after LPA treatment.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, NHERF1은 사이토졸내에 분산된 형태로 발현되어 있다가 LPA 처리 후 빠르게 세포막으로 이동하는 것으로 나타났다(도 1a 참조). 또한 고배율로 세포를 관찰한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 세포의 형태가 변형된 것으로 나타났는데, 세포 표면이 돌출되는 형태로 변형이 되는 것을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 1, NHERF1 was expressed in a dispersed form in cytosol, and then rapidly migrated to the cell membrane after LPA treatment (see FIG. 1A). As a result of observing the cells at a high magnification, the cell morphology was changed as shown in Fig. 1B, and it was found that the cell surface was deformed into a protruding form.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 암세포 내에서 NHERF1은 LPA 자극에 의해 세포질로부터 세포막으로 단백질 이동이 발생한다는 것을 알 수 있었고, 세포 표면에 돌출부위가 형성된다는 것을 알 수 있었다. Therefore, the inventors of the present invention have found that NHERF1 protein migration from the cytoplasm to the cell membrane is induced by LPA stimulation in the cancer cells, and that a protruding site is formed on the cell surface.

<< 실시예Example 2> 2>

LPA에To LPA 의한  by NHERF1NHERF1 이동이  Move cpERMcpERM 단백질과의 직접적인 상호작용에 의한 것인지 분석 Whether it is due to direct interaction with proteins

본 발명자들은 난소암 세포에서 LPA에 의한 NHERF1의 이동이 활성형 ERM 단백질과의 상호작용과 관련성이 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 분석을 수행하였다. 먼저 LPA 처리 시 ERM 단백질이 인산화가 되는지 LPA 처리 농도별 인산화된 ERM 단백질 수준을 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다. 여기서 상기 ERM 단백질은 인산화될 경우 활성을 갖는다. The present inventors performed the following analysis to confirm whether the migration of NHERF1 by LPA in ovarian cancer cells is related to the interaction with the active ERM protein. First, the level of phosphorylated ERM protein by LPA treatment concentration was confirmed by western blotting whether ERM protein was phosphorylated during LPA treatment. Wherein the ERM protein is active when phosphorylated.

또한, LPA에 의한 NHERF1와 인산화된 ERM 단백질과의 결합 여부 확인을 위해 앞서 기술한 면역침강 방법을 이용하여 상기 단백질과의 결합 여부를 확인하였다.In order to confirm the binding of NHERF1 with the phosphorylated ERM protein by LPA, the binding with the protein was confirmed using the immunoprecipitation method described above.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 난소암 세포주에서 LPA를 처리하게 되면 농도 의존적으로 인산화된 ERM 단백질의 수준이 증가하는 것으로 나타났고, NHERF1와 인산화된 ERM 단백질과의 결합 여부 분석 결과 도 2b에서 확인한 바와 같이 NHERF1은 cpERM과 직접적으로 결합하고 있는 것으로 나타났고, 이러한 결합은 LPA 자극에 의해 유도됨을 확인할 수 있었다. 한편 ERM 결합 도메인은 포함하고 C 말단 부위는 결손된 NHERF-△CT는 cpERM과 결합하지 않는 것으로 나타났다.As a result, as shown in FIG. 2A, when LPA was treated in the ovarian cancer cell line, the level of the phosphorylated ERM protein increased in a concentration-dependent manner, and the result of analysis of the binding of NHERF1 with the phosphorylated ERM protein was also confirmed As shown, NHERF1 directly binds to cpERM, and this binding was confirmed to be induced by LPA stimulation. While the ERM binding domain was included and the C-terminal region was not found to bind to the deleted NHERF- [Delta] CT.

또한, 본 발명자들은 NHERF1-cpERM 결합 단백질의 세포내 위치를 확인하기 위해 난소암 세포주에 GFP-tagged NHERF1(NHERF1-WT) 및 C 말단 부위가 결손된 NHERF-△CT를 각각 형질 도입하고, LPA를 처리한 후, 세포 내에서 NHERF1-WT 및 cpERM의 위치를 공초점 현미경을 통해 관찰하였다.In order to confirm the intracellular location of the NHERF1-cpERM binding protein, the present inventors also transfected GFP-tagged NHERF1 (NHERF1-WT) and NHERF- [Delta] CT lacking the C terminal region into ovarian cancer cell lines, After treatment, the positions of NHERF1-WT and cpERM in the cells were observed through a confocal microscope.

분석 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 NHERF1-WT의 위치는 LPA 처리에 의해 세포질에서 세포막으로 빠르게 이동되는 것으로 나타났고 , cpERM 역시 LPA 자극에 의해 세포막에 위치하는 것으로 나타났다. 이들 두 단백질은 LPA에 의해 세포 내에서 같은 위치, 즉 세포막으로 위치되어지는 것을 알 수 있었다. 한편, C 말단 부위가 결손된 NHERF-△CT는 LPA 처리 시, 세포막으로의 이동이 차단되는 것으로 나타났고 cpERM과 서로 다른 위치에서 발현되고 있음을 알 수 있었다(도 2d 참조).As shown in FIG. 2C, the position of NHERF1-WT was rapidly transferred from the cytoplasm to the cell membrane by LPA treatment, and cpERM was also located in the cell membrane by LPA stimulation. These two proteins were found to be located in the same position in the cell, that is, the cell membrane by LPA. On the other hand, NHERF- [Delta] CT in which the C-terminal region was deleted showed that the LPA treatment blocked the migration to the cell membrane and was expressed at different positions from cpERM (see Fig. 2d).

또한, 본 발명자들은 NHERF1과 ERM의 결합이 ERM의 인산화에 의해 직접적으로 매개되는지 확인하기 위해, GFP-tagged NHERF1(NHERF1-WT)이 발현되는 난소암 세포주의 세포 용해물을 제조한 후, cpERM에 대한 항체 및 ERM에 대한 항체를 이용하여 공초점 현미경 관찰을 수행하였다. 이때 cpERM에 대한 항체는 인산화된 ERM과 반응하고, ERM에 대한 항체는 인산화되지 않은 ERM에 반응한다.In order to confirm whether the binding of NHERF1 and ERM is directly mediated by phosphorylation of ERM, the present inventors prepared a cell lysate of ovarian cancer cell line expressing GFP-tagged NHERF1 (NHERF1-WT) Confocal microscopy was performed using antibodies against Korean and ERM. Where the antibody to cpERM reacts with the phosphorylated ERM and the antibody to ERM responds to the non-phosphorylated ERM.

분석 결과, 도 2e에 나타낸 바와 같이, cpERM에 대한 항체를 이용하여 관찰한 결과, NHERF1과 cpERM 은 LPA 자극 시 세포막에 공동 위치되어 있음을 알 수 있었고, 특히 세포 표면의 돌출부가 형성되는 것을 확인할 수 있었다.As a result of the analysis, as shown in FIG. 2E, when the antibody against cpERM was observed, it was found that NHERF1 and cpERM were co-located in the cell membrane during LPA stimulation, there was.

반면, 인산화되지 않은 ERM은 세포막의 피질층 아래에 위치하고 있는 것으로 나타났고 NHERF1과는 상당 부분 동일 위치에 존재하고 있지 않는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명자들은 난소암 세포에서 LPA에 의해 유도된 인산화된 ERM은 세포막으로 이동된 NHERF1과 결합하여 피질 구조를 형성한다는 것을 알 수 있었다.On the other hand, ERM that was not phosphorylated was found to be located below the cortical layer of the cell membrane, and it was found that it was not located at the same position with NHERF1. Thus, the present inventors have found that LPA-induced phosphorylated ERM in ovarian cancer cells binds to NHERF1 transferred to the cell membrane to form a cortical structure.

<< 실시예Example 3> 3>

NHERF1의NHERF1's ERMERM 인산화 및  Phosphorylation and cpERM의of CPERM 안정성에 미치는 영향분석  Stability Analysis

NHERF1-cpERM의 복합체가 세포막에서 ERM의 조절에 역할을 하는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 세포 내에서 NHERF1의 발현을 억제하게 위해 난소암 세포주인 OVCAR-3세포에 NHERF1-specific siRNA duplex(siRNA 서열; [서열번호: 5] 5’-UGGUACAGAGCCGAGGCCG-3’ 및 [서열번호 6] 5’-CGGCCUCGGCUCUGUACCA 3’)을 도입하고 LPA를 처리한 후, NHERF1이 없는 상태에서 ERM의 인산화에 미치는 영향을 웨스턴블럿을 통해 확인하였다. 또한 동시에 ERM이외에 LPA에 의해 영향을 받을 수 있는 다른 인자들인 AKT, GSKα/β 및 ERK의 인산화 여부도 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다.The following experiment was conducted to confirm whether the NHERF1-cpERM complex plays a role in the regulation of ERM in the cell membrane. 5 '-UGGUACAGAGCCCCGAGGCCG-3' and [SEQ ID NO: 6] 5'-UGCAG-3 were added to ovarian cancer cell line OVCAR-3 cells to inhibit the expression of NHERF1 in the cells. CGGCCUCGGCUCUGUACCA 3 ') and LPA treatment, the effect of NHERF1 on phosphorylation of ERM was confirmed by Western blot analysis. At the same time, other factors that could be affected by LPA in addition to ERM, such as AKT, GSKα / β and ERK, were also confirmed by Western blot.

그 결과, 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, NHERF1의 발현 또는 활성이 억제된 상태에서는 LPA에 의한 ERM의 인산화가 억제되는 것으로 나타난 반면, AKT, GSKα/β 및 ERK의 인산화에는 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다.As a result, as shown in Figs. 3 (a) and 3 (b), phosphorylation of ERM by LPA was inhibited in the state where the expression or activity of NHERF1 was suppressed, but it did not affect phosphorylation of AKT, GSKa / appear.

또한 다른 다양한 난소암 상피세포인 HIO-80(human immortalized ovary epithelial cell line), OVCAR-3 및 SK-OV-3 세포주를 대상으로 NHERF1을 과발현시킨 상태에서 ERM의 발현 수준에 미치는 영향을 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다. 이때 사용한 상기 세포주들 중, HIO-80 세포주는 다른 세포주들에 비해 NHERF1의 발현이 매우 낮은 수준으로 발현되고 있었다. The effect of the overexpression of NHERF1 on the expression level of ERM in the HIO-80 (human immortalized ovary epithelial cell line), OVCAR-3 and SK-OV-3 cell lines, Respectively. Of these cells, HIO-80 cell line was expressed at a very low level of NHERF1 expression compared to other cell lines.

분석 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이 NHERF1의 발현정도는 ERM 단백질의 발현수준에는 영향을 주지 못하는 것으로 나타났고, ERM의 활성즉 인산화에 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 3C, the expression level of NHERF1 did not affect the expression level of ERM protein, and it was found that it affects the activity of ERM, that is, phosphorylation.

이에 NHERF1이 ERM의 활성, 즉 인산화에 영향을 주는 것인지 다시 확인하기 위해 GFP-tagged NHERF1 및 GFP-tagged NHERF1-△CT를 OVCAR-3 세포주에 과발현시킨 후, GFP에 대한 항체 및 NHERF에 대한 항체를 이용하여 웨스턴블럿을 수행하였다.GFP-tagged NHERF1 and GFP-tagged NHERF1-? CT were overexpressed in OVCAR-3 cell line to confirm whether NHERF1 affects ERM activity, that is, phosphorylation. Then, antibody against GFP and antibody against NHERF Western blot was performed.

분석 결과, 도 3d 및 3e 에 나타낸 바와 같이, 과발현된 NHERF1은 LPA에 의한 cpERM의 수준을 증가시키는 것으로 나타났고, 반면, NHERF-△CT 처리 군에서는 이러한 효과가 나타나지 않았다. 또한, 다른 신호전달 인자인 ERK2에도 아무런 영향을 주지 못하는 것으로 나타났다. Analysis showed that overexpressed NHERF1 increased the level of cpERM by LPA as shown in Figures 3d and 3e, whereas NHERF-? CT treatment did not. In addition, it did not affect ERK2, another signaling factor.

따라서 이러한 결과는, LPA 자극 시 NHERF1는 cpERM과 특이적인 결합을 유도하며 cpERM 단백질의 활성 및 안정성에 영향을 준다는 것을 알 수 있었고, 반면 C-말단이 결손된 NHERF-△CT은 이러한 효과를 유도하지 못함을 알 수 있었다.Thus, these results indicate that NHERF1 induces specific binding to cpERM during LPA stimulation and affects the activity and stability of cpERM protein, while NHERF- △ CT with C-terminal deletion induces this effect I could not see.

<< 실시예Example 4> 4>

NHERF1NHERF1 저해제에 대한 난소암 세포  Ovarian cancer cells for inhibitors 위족형성Stomach formation 억제 및 암세포 이동억제 분석 Inhibition and cancer cell migration inhibition assay

<4-<4- 1>NHERF11> NHERF1 돌연변이체의 암세포  Cancer cells of the mutant 위족형성Stomach formation 억제 및 이동저해  Inhibition and inhibition of movement

위족(pseudopia)은 세포의 한쪽 부분이 늘어난 것으로 이동하는 세포 표면에서 돌출된 특별한 구조형태를 말하는 것으로 세포는 자신이 지지체로 삼으려는 대상쪽의 막을 늘려 위족을 형성시켜 그 표면에 부착하여 이동할 수 있도록 한다. 한편, 암세포도 전이와 관련하여 이러한 위족을 형성함으로써 전이 및 침윤이 진행된다.A pseudopia is a special structural form protruding from a cell surface that is moved by one side of a cell. The cell grows a membrane on the side of the target cell that it wants to support, attaching to the surface and moving. do. On the other hand, cancer cells also develop metastasis and metastasis by forming these stasis.

이에 본 발명자들은 NHERF1의 저해제로서 돌연변이체들이 NHERF1-cpERM 복합체 형성에 의한 위족형성 및 암세포 이동을 저해할 수 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 GFP-tagged NHERF1 WT, GFP-tagged NHERF1-△CT(C말단 결손) 및 GFP-tagged NHERF1 CT(C 말단만 존재)의 DNA 구조물을 제작하고, 이들 구조물은 난소암 세포주인 OVCAR-3에 형질도입한 후, 각각의 발현 여부를 웨스턴블럿을 통해 확인하였고, 세포 내에서 이동 정도를 상기 기술된 세포이동 분석 방법을 통해 확인하였다. Therefore, the present inventors performed the following experiment to determine whether mutants as inhibitors of NHERF1 could inhibit the formation of the NHERF1-cpERM complex and formation of cancer cells. DNA constructs of GFP-tagged NHERF1 WT, GFP-tagged NHERF1-? CT (C terminal deletion) and GFP-tagged NHERF1 CT (C terminal only) were prepared and these constructs were transfected into ovarian cancer cell line OVCAR-3 After introduction, each expression was confirmed by Western blot and the degree of migration in the cells was confirmed by the above-described cell migration assay.

분석 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 상기 각각 제조된 DNA 구조물들의 형질도입에 의한 세포내 발현은 모두 잘 발현되고 있음을 알 수 있었고, 공초점 현미경을 통한 위족 형성 여부는 도 4b에 나타낸 바와 같이 NHERF1 WT은 cpERM과 복합체를 형성하여 세포내에서 같은 부위에 위치하고 있으며 위족 형성 및 세포 이동이 진행됨을 확인할 수 있었으나, GFP-tagged NHERF1-△CT(C말단 결손) 및 GFP-tagged NHERF1 CT(C 말단만 존재)은 위족 형성 및 세포 이동이 저해되고 있음을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 4A, it was found that the intracellular expression by the transduction of each of the DNA constructs prepared was well expressed, and whether the formation of a stall through the confocal microscope was as shown in FIG. 4B GFP-tagged NHERF1-? CT (C terminal deletion) and GFP-tagged NHERF1 CT (terminal C terminal) were found to be located in the same region of the cell, forming a complex with cpERM, ) Were found to be inhibited by stigmatization and cell migration.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 NHERF1의 돌연변이체인 GFP-tagged NHERF1-△CT(C말단 결손) 및 GFP-tagged NHERF1 CT(C 말단만 존재)은 난소암 세포의 전이를 저해할 수 있는 저해제로 사용될 수 있음을 알 수 있었고, 암의 전이를 위한 위족 형성에는 NHERF1의 2개의 N-말단 PDZ 도메인과 C 도메인인 cpERM 도메인이 모두 중요하게 작용함을 알 수 있었다. Therefore, the present inventors have found that GFP-tagged NHERF1-? CT (C terminal deletion) and GFP-tagged NHERF1 CT (C terminal only) mutants of NHERF1 are used as inhibitors capable of inhibiting metastasis of ovarian cancer cells And that the two N-terminal PDZ domains of NHERF1 and the cpERM domain, which is the C domain, both play important roles in the formation of the stigma for cancer metastasis.

<4-<4- 2>NHERF1에2> on NHERF1 대한  About siRNA의siRNA 암세포 이동저해 Inhibition of cancer cell migration

NHERF1에 대한 siRNA를 암세포주인 OVCAR-3(ascites-derived ovarian cancer cell line), SK-OV-3 (ascitesderived ovarian cancer cell line) 및 MDA-MB-231 cells (breast carcinoma cell line)에 처리하여 세포 내에서 NHERF1의 발현을 저해한 후, 각 암세포주에서의 NHERF1 발현수준을 웨스턴블럿을 통해 확인하였고, LPA 자극에 의한 암세포 이동을 상기 기술된 세포이동 분석(Boyden chamber 이동분석)을 통해 확인하였는데, 이때 1uM의 LPA 처리 후 3.5시간 동안 세포이동 여부를 확인 후, 하단 챔버로 이동된 세포를 Hoechst 33342 염색을 통해 확인하였다. 또한 상기 3가지 암세포주에 대한 세포이동 분석은 화학주성 세포이동 분석으로서, LPA 처리에 의한 이동여부를 형광현미경을 통해 확인하였고, 이동된 세포수를 카운팅하여 확인하였다. The siRNA against NHERF1 was treated with cancer cell lines OVCAR-3 (ascites-derived ovarian cancer cell line), SK-OV-3 (ascites derived ovarian cancer cell line) and MDA-MB-231 cells (breast carcinoma cell line) , NHERF1 expression level in each cancer cell line was confirmed by Western blotting and cancer cell migration by LPA stimulation was confirmed by the above described cell movement analysis (Boyden chamber migration analysis). At this time, After 1 uM of LPA treatment, cell migration was confirmed for 3.5 hours, and the cells transferred to the lower chamber were confirmed by Hoechst 33342 staining. In addition, the cell migration analysis for the above three cancer cell lines was carried out by chemoattractant cell migration assay. The migration by LPA treatment was confirmed by fluorescence microscopy and the number of transferred cells was counted and confirmed.

분석 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이 각 암세포주에서 NHERF1 siRNA 처리에 의해 NHERF1의 발현은 모두 저해되어 있음을 확인하였고, 4d의 결과를 통해 OVCAR-3 암세포 주에서 NHERF1의 발현이 저해된 경우, 세포 이동이 억제되는 것으로 나타났고, 도 4e의 결과를 통해 OVCAR-3, SK-OV-3 및 MDA-MB-231 세포주 모두에서도 NHERF1의 발현이 저해된 경우, 암세포 이동이 억제되는 것으로 나타났다.As a result of analysis, it was confirmed that NHERF1 expression was inhibited by treatment with NHERF1 siRNA in each cancer cell line, and when the expression of NHERF1 was inhibited in OVCAR-3 cancer cell line by the result of 4d, The inhibition of cell migration was inhibited when the expression of NHERF1 was inhibited in both OVCAR-3, SK-OV-3 and MDA-MB-231 cell lines.

이상의 결과를 통해 본 발명자들은 NHERF1의 발현 억제제 및 활성 억제제는 암세포의 위족 형성을 억제하여 궁극적으로 암의 전이를 억제함으로서 항암제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다. From the above results, the present inventors have found that NHERF1 expression inhibitor and activity inhibitor inhibit the formation of the stomach of cancer cells and ultimately inhibit metastasis of cancer, and thus can be used as anticancer drugs.

앞에서, 본 발명의 특정한 실시예가 설명되고 도시되었지만 본 발명은 기재된 실시예에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양하게 수정 및 변형할 수 있음은 이 기술의 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 일이다. 따라서, 그러한 수정예 또는 변형예들은 본 발명의 기술적 사상이나 관점으로부터 개별적으로 이해되어서는 안되며, 변형된 실시예들은 본 발명의 특허청구범위에 속한다 하여야 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but, on the contrary, It is obvious to those who have. Accordingly, it should be understood that such modifications or alterations should not be understood individually from the technical spirit and viewpoint of the present invention, and that modified embodiments fall within the scope of the claims of the present invention.

<110> Daegu gyeongbuk institute of science and technology <120> Composition comprising NHERF1 inhibitor for the preventing of cancer metastasis or formation of pseudopoda <130> NPDC-59773 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1077 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NHERF1 wild type DNA Sequence <400> 1 atgagcgcgg acgcagcggc cggggcgccc ctgccccggc tctgctgcct ggagaagggt 60 ccgaacggct acggcttcca cctgcacggg gagaagggca agttgggcca gtacatccgg 120 ctggtggagc ccggctcgcc ggccgagaag gcggggctgc tggcggggga ccggctggtg 180 gaggtgaacg gcgaaaacgt ggagaaggag acccaccagc aggtggtgag ccgcatccgc 240 gccgcactca acgccgtgcg cctgctggtg gtcgaccccg agacggacga gcagctgcag 300 aagctcggcg tccaggtccg agaggagctg ctgcgcgccc aggaagcgcc ggggcaggcc 360 gagccgccgg ccgccgccga ggtgcagggg gctggcaacg aaaatgagcc tcgcgaggcc 420 gacaagagcc acccggagca gcgcgagctt cggcctcggc tctgtaccat gaagaagggc 480 cccagtggct atggcttcaa cctgcacagc gacaagtcca agccaggcca gttcatccgg 540 tcagtggacc cagactcccc ggctgaggct tcagggctcc gggcccagga tcgcattgtg 600 gaggtgaacg gggtctgcat ggaggggaag cagcatgggg acgtggtgtc cgccatcagg 660 gctggcgggg acgagaccaa gctgctggtg gtggacaggg aaactgacga gttcttcaag 720 aaatgcagag tgatcccatc tcaggagcac ctgaatggtc ccctgcctgt gcccttcacc 780 aatggggaga tacagaagga gaacagtcgt gaagccctgg cagaggcagc cttggagagc 840 cccaggccag ccctggtgag atccgcctcc agtgacacca gcgaggagct gaattcccaa 900 gacagccccc caaaacagga ctccacagcg ccctcgtcta cctcctcctc cgaccccatc 960 ctagacttca acatctccct ggccatggcc aaagagaggg cccaccagaa acgcagcagc 1020 aaacgggccc cgcagatgga ctggagcaag aaaaacgaac tcttcagcaa cctctga 1077 <210> 2 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hNHERF1 wild type peptide Sequence <400> 2 Met Ser Ala Asp Ala Ala Ala Gly Ala Pro Leu Pro Arg Leu Cys Cys 1 5 10 15 Leu Glu Lys Gly Pro Asn Gly Tyr Gly Phe His Leu His Gly Glu Lys 20 25 30 Gly Lys Leu Gly Gln Tyr Ile Arg Leu Val Glu Pro Gly Ser Pro Ala 35 40 45 Glu Lys Ala Gly Leu Leu Ala Gly Asp Arg Leu Val Glu Val Asn Gly 50 55 60 Glu Asn Val Glu Lys Glu Thr His Gln Gln Val Val Ser Arg Ile Arg 65 70 75 80 Ala Ala Leu Asn Ala Val Arg Leu Leu Val Val Asp Pro Glu Thr Asp 85 90 95 Glu Gln Leu Gln Lys Leu Gly Val Gln Val Arg Glu Glu Leu Leu Arg 100 105 110 Ala Gln Glu Ala Pro Gly Gln Ala Glu Pro Pro Ala Ala Ala Glu Val 115 120 125 Gln Gly Ala Gly Asn Glu Asn Glu Pro Arg Glu Ala Asp Lys Ser His 130 135 140 Pro Glu Gln Arg Glu Leu Arg Pro Arg Leu Cys Thr Met Lys Lys Gly 145 150 155 160 Pro Ser Gly Tyr Gly Phe Asn Leu His Ser Asp Lys Ser Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Phe Ile Arg Ser Val Asp Pro Asp Ser Pro Ala Glu Ala Ser Gly 180 185 190 Leu Arg Ala Gln Asp Arg Ile Val Glu Val Asn Gly Val Cys Met Glu 195 200 205 Gly Lys Gln His Gly Asp Val Val Ser Ala Ile Arg Ala Gly Gly Asp 210 215 220 Glu Thr Lys Leu Leu Val Val Asp Arg Glu Thr Asp Glu Phe Phe Lys 225 230 235 240 Lys Cys Arg Val Ile Pro Ser Gln Glu His Leu Asn Gly Pro Leu Pro 245 250 255 Val Pro Phe Thr Asn Gly Glu Ile Gln Lys Glu Asn Ser Arg Glu Ala 260 265 270 Leu Ala Glu Ala Ala Leu Glu Ser Pro Arg Pro Ala Leu Val Arg Ser 275 280 285 Ala Ser Ser Asp Thr Ser Glu Glu Leu Asn Ser Gln Asp Ser Pro Pro 290 295 300 Lys Gln Asp Ser Thr Ala Pro Ser Ser Thr Ser Ser Ser Asp Pro Ile 305 310 315 320 Leu Asp Phe Asn Ile Ser Leu Ala Met Ala Lys Glu Arg Ala His Gln 325 330 335 Lys Arg Ser Ser Lys Arg Ala Pro Gln Met Asp Trp Ser Lys Lys Asn 340 345 350 Glu Leu Phe Ser Asn Leu 355 <210> 3 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hNHERF1 c-terminal deletion peptide sequence <400> 3 Met Ser Ala Asp Ala Ala Ala Gly Ala Pro Leu Pro Arg Leu Cys Cys 1 5 10 15 Leu Glu Lys Gly Pro Asn Gly Tyr Gly Phe His Leu His Gly Glu Lys 20 25 30 Gly Lys Leu Gly Gln Tyr Ile Arg Leu Val Glu Pro Gly Ser Pro Ala 35 40 45 Glu Lys Ala Gly Leu Leu Ala Gly Asp Arg Leu Val Glu Val Asn Gly 50 55 60 Glu Asn Val Glu Lys Glu Thr His Gln Gln Val Val Ser Arg Ile Arg 65 70 75 80 Ala Ala Leu Asn Ala Val Arg Leu Leu Val Val Asp Pro Glu Thr Asp 85 90 95 Glu Gln Leu Gln Lys Leu Gly Val Gln Val Arg Glu Glu Leu Leu Arg 100 105 110 Ala Gln Glu Ala Pro Gly Gln Ala Glu Pro Pro Ala Ala Ala Glu Val 115 120 125 Gln Gly Ala Gly Asn Glu Asn Glu Pro Arg Glu Ala Asp Lys Ser His 130 135 140 Pro Glu Gln Arg Glu Leu Arg Pro Arg Leu Cys Thr Met Lys Lys Gly 145 150 155 160 Pro Ser Gly Tyr Gly Phe Asn Leu His Ser Asp Lys Ser Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Phe Ile Arg Ser Val Asp Pro Asp Ser Pro Ala Glu Ala Ser Gly 180 185 190 Leu Arg Ala Gln Asp Arg Ile Val Glu Val Asn Gly Val Cys Met Glu 195 200 205 Gly Lys Gln His Gly Asp Val Val Ser Ala Ile Arg Ala Gly Gly Asp 210 215 220 Glu Thr Lys Leu Leu Val Val Asp Arg Glu Thr Asp Glu Phe Phe Lys 225 230 235 240 Lys Cys Arg Val Ile Pro Ser Gln Glu His Leu Asn Gly Pro Leu Pro 245 250 255 Val Pro Phe Thr 260 <210> 4 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hNHERF1 c-terminal peptide sequence <400> 4 Asn Gly Glu Ile Gln Lys Glu Asn Ser Arg Glu Ala Leu Ala Glu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Glu Ser Pro Arg Pro Ala Leu Val Arg Ser Ala Ser Ser Asp 20 25 30 Thr Ser Glu Glu Leu Asn Ser Gln Asp Ser Pro Pro Lys Gln Asp Ser 35 40 45 Thr Ala Pro Ser Ser Thr Ser Ser Ser Asp Pro Ile Leu Asp Phe Asn 50 55 60 Ile Ser Leu Ala Met Ala Lys Glu Arg Ala His Gln Lys Arg Ser Ser 65 70 75 80 Lys Arg Ala Pro Gln Met Asp Trp Ser Lys Lys Asn Glu Leu Phe Ser 85 90 95 Asn Leu <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NHERF1 siRNA sequence <400> 5 ugguacagag ccgaggccg 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NHERF1 siRNA sequence <400> 6 cggccucggc ucuguacca 19 <110> Daegu gyeongbuk institute of science and technology <120> Composition comprising NHERF1 inhibitor for the preventing of          cancer metastasis or formation of pseudopoda <130> NPDC-59773 <160> 6 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 1077 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NHERF1 wild type DNA Sequence <400> 1 atgagcgcgg acgcagcggc cggggcgccc ctgccccggc tctgctgcct ggagaagggt 60 ccgaacggct acggcttcca cctgcacggg gagaagggca agttgggcca gtacatccgg 120 ctggtggagc ccggctcgcc ggccgagaag gcggggctgc tggcggggga ccggctggtg 180 gaggtgaacg gcgaaaacgt ggagaaggag acccaccagc aggtggtgag ccgcatccgc 240 gccgcactca acgccgtgcg cctgctggtg gtcgaccccg agacggacga gcagctgcag 300 aagctcggcg tccaggtccg agaggagctg ctgcgcgccc aggaagcgcc ggggcaggcc 360 gagccgccgg ccgccgccga ggtgcagggg gctggcaacg aaaatgagcc tcgcgaggcc 420 gacaagagcc acccggagca gcgcgagctt cggcctcggc tctgtaccat gaagaagggc 480 cccagtggct atggcttcaa cctgcacagc gacaagtcca agccaggcca gttcatccgg 540 tcagtggacc cagactcccc ggctgaggct tcagggctcc gggcccagga tcgcattgtg 600 gggtgaacg gggtctgcat ggaggggaag cagcatgggg acgtggtgtc cgccatcagg 660 gctggcgggg acgagaccaa gctgctggtg gtggacaggg aaactgacga gttcttcaag 720 aaatgcagag tgatcccatc tcaggagcac ctgaatggtc ccctgcctgt gcccttcacc 780 aatggggaga tacagaagga gaacagtcgt gaagccctgg cagaggcagc cttggagagc 840 cccaggccag ccctggtgag atccgcctcc agtgacacca gcgaggagct gaattcccaa 900 gacagccccc caaaacagga ctccacagcg ccctcgtcta cctcctcctc cgaccccatc 960 ctagacttca acatctccct ggccatggcc aaagagaggg cccaccagaa acgcagcagc 1020 aaacgggccc cgcagatgga ctggagcaag aaaaacgaac tcttcagcaa cctctga 1077 <210> 2 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hNHERF1 wild type peptide Sequence <400> 2 Met Ser Ala Asp Ala Ala Gly Ala Pro Leu Pro Arg Leu Cys Cys   1 5 10 15 Leu Glu Lys Gly Pro Asn Gly Tyr Gly Phe His Leu His Gly Glu Lys              20 25 30 Gly Lys Leu Gly Gln Tyr Ile Arg Leu Val Glu Pro Gly Ser Pro Ala          35 40 45 Glu Lys Ala Gly Leu Leu Ala Gly Asp Arg Leu Val Glu Val Asn Gly      50 55 60 Glu Asn Val Glu Lys Glu Thr His Gln Gln Val Val Ser Arg Ile Arg  65 70 75 80 Ala Ala Leu Asn Ala Val Arg Leu Leu Val Val Asp Pro Glu Thr Asp                  85 90 95 Glu Gln Leu Gln Lys Leu Gly Val Gln Val Arg Glu Glu Leu Leu Arg             100 105 110 Ala Gln Ala Ala Ala Glu Ala         115 120 125 Gln Gly Ala Gly Asn Glu Asn Glu Pro Arg Glu Ala Asp Lys Ser His     130 135 140 Pro Glu Gln Arg Glu Leu Arg Pro Arg Leu Cys Thr Met Lys Lys Gly 145 150 155 160 Pro Ser Gly Tyr Gly Phe Asn Leu His Ser Asp Lys Ser Lys Pro Gly                 165 170 175 Gln Phe Ile Arg Ser Val Asp Pro Asp Ser Pro Ala Glu Ala Ser Gly             180 185 190 Leu Arg Ala Gln Asp Arg Ile Val Glu Val Asn Gly Val Cys Met Glu         195 200 205 Gly Lys Gln His Gly Asp Val Val Ser Ala Ile Arg Ala Gly Gly Asp     210 215 220 Glu Thr Lys Leu Leu Val Val Asp Arg Glu Thr Asp Glu Phe Phe Lys 225 230 235 240 Lys Cys Arg Val Ile Pro Ser Gln Glu His Leu Asn Gly Pro Leu Pro                 245 250 255 Val Pro Phe Thr Asn Gly Glu Ile Gln Lys Glu Asn Ser Arg Glu Ala             260 265 270 Leu Ala Glu Ala Ala Leu Glu Ser Pro Arg Pro Ala Leu Val Arg Ser         275 280 285 Ala Ser Ser Asp Thr Ser Glu Glu Leu Asn Ser Gln Asp Ser Pro     290 295 300 Lys Gln Asp Ser Thr Ala Pro Ser Ser Thr Ser Ser Serp Pro Ile 305 310 315 320 Leu Asp Phe Asn Ile Ser Leu Ala Met Ala Lys Glu Arg Ala His Gln                 325 330 335 Lys Arg Ser Ser Lys Arg Ala Pro Gln Met Asp Trp Ser Lys Lys Asn             340 345 350 Glu Leu Phe Ser Asn Leu         355 <210> 3 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hNHERF1 c-terminal deletion peptide sequence <400> 3 Met Ser Ala Asp Ala Ala Gly Ala Pro Leu Pro Arg Leu Cys Cys   1 5 10 15 Leu Glu Lys Gly Pro Asn Gly Tyr Gly Phe His Leu His Gly Glu Lys              20 25 30 Gly Lys Leu Gly Gln Tyr Ile Arg Leu Val Glu Pro Gly Ser Pro Ala          35 40 45 Glu Lys Ala Gly Leu Leu Ala Gly Asp Arg Leu Val Glu Val Asn Gly      50 55 60 Glu Asn Val Glu Lys Glu Thr His Gln Gln Val Val Ser Arg Ile Arg  65 70 75 80 Ala Ala Leu Asn Ala Val Arg Leu Leu Val Val Asp Pro Glu Thr Asp                  85 90 95 Glu Gln Leu Gln Lys Leu Gly Val Gln Val Arg Glu Glu Leu Leu Arg             100 105 110 Ala Gln Ala Ala Ala Glu Ala         115 120 125 Gln Gly Ala Gly Asn Glu Asn Glu Pro Arg Glu Ala Asp Lys Ser His     130 135 140 Pro Glu Gln Arg Glu Leu Arg Pro Arg Leu Cys Thr Met Lys Lys Gly 145 150 155 160 Pro Ser Gly Tyr Gly Phe Asn Leu His Ser Asp Lys Ser Lys Pro Gly                 165 170 175 Gln Phe Ile Arg Ser Val Asp Pro Asp Ser Pro Ala Glu Ala Ser Gly             180 185 190 Leu Arg Ala Gln Asp Arg Ile Val Glu Val Asn Gly Val Cys Met Glu         195 200 205 Gly Lys Gln His Gly Asp Val Val Ser Ala Ile Arg Ala Gly Gly Asp     210 215 220 Glu Thr Lys Leu Leu Val Val Asp Arg Glu Thr Asp Glu Phe Phe Lys 225 230 235 240 Lys Cys Arg Val Ile Pro Ser Gln Glu His Leu Asn Gly Pro Leu Pro                 245 250 255 Val Pro Phe Thr             260 <210> 4 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hNHERF1 c-terminal peptide sequence <400> 4 Asn Gly Glu Ile Gln Lys Glu Asn Ser Glu Ala Leu Ala Glu Ala   1 5 10 15 Ala Leu Glu Ser Pro Arg Pro Ala Leu Val Arg Ser Ala Ser Ser Asp              20 25 30 Thr Ser Glu Glu Leu Asn Ser Gln Asp Ser Pro Pro Lys Gln Asp Ser          35 40 45 Thr Ala Pro Ser Ser Thr Ser Ser Asp Pro Ile Leu Asp Phe Asn      50 55 60 Ile Ser Leu Ala Met Ala Lys Glu Arg Ala His Gln Lys Arg Ser Ser  65 70 75 80 Lys Arg Ala Pro Gln Met Asp Trp Ser Lys Lys Asn Glu Leu Phe Ser                  85 90 95 Asn Leu         <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NHERF1 siRNA sequence <400> 5 ugguacagag ccgaggccg 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NHERF1 siRNA sequence <400> 6 cggccucggc ucuguacca 19

Claims (15)

서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1)의 돌연변이체를 유효성분으로 포함하며,
상기 NHERF1의 돌연변이체는 LPA(Lysophosphatidic acid) 자극에 의한, ERM(Ezrin/Radixin/Moesin)의 인산화를 억제하고, NHERF1- cpERM(인산화된 ERM)의 복합체 형성을 억제하며, NHERF1의 세포질에서 세포막으로의 이동을 억제하고 및 난소암세포의 위족 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는,
난소암 세포의 위족 형성 억제용 조성물.A mutant of NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 as an active ingredient,
The mutant of NHERF1 inhibits phosphorylation of ERM (Ezrin / Radixin / Moesin) by LPA (lysophosphatidic acid) stimulation, inhibits NHERF1- cpERM (phosphorylated ERM) complex formation, Inhibiting the movement of ovarian cancer cells and inhibiting the formation of stools of ovarian cancer cells.
A composition for inhibiting the formation of stomach of ovarian cancer cells. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1)의 돌연변이체를 유효성분으로 포함하며,
상기 NHERF1의 돌연변이체는 LPA(Lysophosphatidic acid) 자극에 의한, ERM(Ezrin/Radixin/Moesin)의 인산화를 억제하고, NHERF1- cpERM(인산화된 ERM)의 복합체 형성을 억제하며, NHERF1의 세포질에서 세포막으로의 이동을 억제하고 및 난소암세포의 위족 형성을 억제하여 난소암의 전이를 저해하는 것을 특징으로 하는,
난소암 전이 억제용 조성물.A mutant of NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 as an active ingredient,
The mutant of NHERF1 inhibits phosphorylation of ERM (Ezrin / Radixin / Moesin) by LPA (lysophosphatidic acid) stimulation, inhibits NHERF1- cpERM (phosphorylated ERM) complex formation, Inhibiting the migration of ovarian cancer cells and inhibiting the formation of ovarian cancer cells and thereby inhibiting ovarian cancer metastasis.
A composition for inhibiting ovarian cancer metastasis. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 시험관 내에서 난소암 세포에 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 NHERF1(Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1)의 돌연변이체를 처리하는 단계를 포함하며,
상기 NHERF1의 돌연변이체는 LPA(Lysophosphatidic acid) 자극으로 유발되는 난소암 세포의 위족 형성 및 세포 이동을 저해하는 것을 특징으로 하는,
시험관 내에서 난소암 세포의 전이 억제 방법.Treating a mutant of NHERF1 (Na + / H + Exchanger Regulatory Factor 1) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 in ovarian cancer cells in vitro,
Wherein the mutant of NHERF1 inhibits the formation of ovarian cancer cells caused by LPA (lysophosphatidic acid) stimulation and cell migration,
A method for inhibiting metastasis of ovarian cancer cells in vitro. 삭제delete 삭제delete 삭제delete

Images