KR20190068246A - A composition for inhibiting metastasis cancer comprising an inhibitor of LPA1R and LPA2R - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a cancer metastasis inhibitor composition comprising an expression or activity inhibitor of LPA1R or LPA2R as an active component. More specifically, the present invention relates to the cancer metastasis inhibitor composition comprising the expression or activity inhibitor of LPA1R or LPA2R as the active component and a method for inhibiting cancer metastasis comprising a step of administering the composition to a subject.

Description

LPA1R 및 LPA2R의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제제 조성물 {A composition for inhibiting metastasis cancer comprising an inhibitor of LPA1R and LPA2R}[0001] The present invention relates to a composition for inhibiting the expression or activity of LPA1R and LPA2R and an inhibitor for inhibiting the activity of LPA1R and LPA2R,

본 발명은 LPA1R 또는 LPA2R의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제제 조성물에 관한 것으로, 더 자세하게는 LPA1R 또는 LPA2R의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제제 조성물, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이 억제 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a cancer metastasis inhibitor composition comprising as an active ingredient an expression or activity inhibitor of LPA1R or LPA2R, and more particularly to a cancer metastasis inhibitor composition comprising as an active ingredient an expression or activity inhibitor of LPA1R or LPA2R, Which comprises administering to a subject an effective amount of a compound of the present invention.

암은 세계적으로 높은 사망률을 보이고 있으며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망 원인이다. 특히, 인구의 고령화와 더불어 흡연 인구의 증가 및 대기 오염으로 인해 폐암이 증가하고 있으며, 식생활이 서구화되어 고지방식의 섭취가 일반화되고, 환경 오염 물질의 급격한 증가, 음주량의 증가 등으로 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암 등이 지속적으로 증가하는 추세에 있다. 이러한 실정에서 암의 조기 예방 및 치료를 가능하게 하여 인간 건강의 증진, 건강한 삶의 질 향상 및 인류 보건 증진에 기여할 수 있는 항암 물질의 창출이 절실히 요구되고 있다 (한국공개특허 제10-2015-0047995호).Cancer has a high mortality rate globally and is the second most common cause of death after cardiovascular disease in Western societies. In particular, the aging of the population, the increase in the number of smokers and the increase in lung cancer due to air pollution, the westernization of eating habits, generalization of high-fat diet, rapid increase of environmental pollutants, increase of drinking water, , Prostate cancer, and ovarian cancer are on the rise. In such a situation, it is urgently required to create an anticancer substance that can contribute to the promotion of human health, the improvement of a healthy life quality, and the improvement of human health by enabling early prevention and treatment of cancer (Korean Patent Publication No. 10-2015-004799 number).

악성 종양은 대부분의 경우 하나의 장기 (폐, 간, 신장, 위, 대장, 직장, 난소 등)에서 발생한 후 처음 발생한 원발부위인 장기로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는데, 이렇게 원발 부위로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는 것을 전이 (metastasis)라 한다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상으로, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 전이에 필요한 새로운 유전 형질을 획득한 후 혈관과 림프선으로 침윤하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착한 후 증식하게 된다. 최근 연구 결과에서 전이와 관련된 유전 형질들이 밝혀지고 있으며, 원발 조직의 유전자 검사를 통해 차후 타 장기로의 전이를 통한 재발 고위험군을 유추할 수 있다 (한국공개특허 제10-2015-0122786호).Malignant tumors spread from other organs, such as the primary site of the first occurrence after a single organ (lung, liver, kidney, stomach, colon, rectum, ovary, etc.) to most other tissues, It is called metastasis. Metastasis is a phenomenon associated with the progression of malignant tumors. As malignant tumor cells proliferate and cancer progresses, they acquire new genetic traits necessary for metastasis, infiltrate into the blood vessels and lymph nodes, circulate along the blood and lymph, And then proliferate. Genetic traits related to metastasis have been identified in recent studies, and genetic testing of primary tissues can be used to infer high risk recurrence through subsequent metastasis to other organs (Korean Patent Laid-Open No. 10-2015-0122786).

악성 종양의 전이에 대한 치료는 국소 치료와 전신 치료로 나누어 볼 수 있는데, 악성 종양의 전이에 대한 치료의 원칙은 종양의 종류와 종양의 전이 부위에 따라 다르다. 전이에 의한 국소 증상이 심하거나, 전이에 대한 수술적 치료가 악성 종양의 자연 경과를 호전시킬 수 있다고 알려진 일부 악성 종양의 경우 전이에 대해 치료 수술 혹은 방사선 치료와 같은 국소 치료 방침을 고려할 수 있다. 일반적으로는 악성 종양에서 전이가 일어난 경우 국소적인 치료보다는 항암 화학 요법과 같은 전신적인 치료를 통하여 전이 부위뿐 아니라 원발 부위의 종양을 함께 치료하는 것이 도움이 된다. 하지만 림프종과 같은 극소수의 종양을 제외하고는 전이가 발생한 악성 종양의 경우 완치의 가능성은 대단히 낮다.Treatment of malignant metastasis can be divided into local treatment and systemic treatment. The principles of treatment for metastasis of malignant tumors depend on the type of tumor and the metastasis site of the tumor. In some malignant tumors, where localized symptoms due to metastasis are severe or surgical treatment for metastasis is known to improve the natural history of malignancy, local treatment strategies such as surgical treatment or radiation therapy may be considered for metastasis. Generally, when metastasis occurs in a malignant tumor, it is helpful to treat the primary site as well as the metastatic site through systemic treatment such as chemotherapy, rather than local treatment. However, with the exception of very few tumors, such as lymphoma, the likelihood of cure for metastatic malignancy is very low.

전이가 발생한 악성 종양에 대한 경과는 다양하며, 원발성 악성 종양의 종류와 전반적인 종양의 진행 속도에 따라 경과가 결정된다. 어떤 장기에 전이가 되었느냐에 따라 합병증은 다양하게 발생할 수 있다. 예를 들어, 뇌전이의 경우 두통, 시야 감소, 구역, 구토 등의 증상이 발생할 수 있다. 골 전이의 경우 골의 통증이 발생할 수있으며, 병적 골절이 발생할 수도 있다. 골 전이에 동반하여 고칼슘 혈증으로 의식 혼탁이 발생할 수도 있다.따라서 검진을 통한 종양의 조기 발견 및 원발 종양의 유전자 검사는 전이로 인한 사망률 증가를 예방할 수 있는 방법이다.The course of metastatic malignancy is variable and depends on the type of primary malignant tumor and the overall rate of tumor progression. Complications can occur in a variety of ways, depending on which organ has metastasized. For example, in the case of brain metastases, symptoms such as headache, decreased vision, nausea and vomiting may occur. Bone metastases may cause bone pain and pathological fractures. Early detection of tumors and genetic testing of primary tumors through screening are methods to prevent an increased mortality from metastasis.

리소포스파티드산 (Lysophosphatidic acid)은 포스포리파아제 A1 및 A2, 모노아실글리세롤 키나아제, 글리세롤-3-포스페이트 아실 트랜스퍼라아제 및 오토자신과 같은 다수의 대사 효소의해 생성되는 다양한 글리세롤인지질, 글리세롤-3-포스페이트 및 포스파티틴산을 비롯한 다양한 전구체로부터 생성된 생첼 활성 인지질이다. 리소포스파티드산 (Lysophosphatidic acid)은 세포표면에서 LPA 수용체(LPAR)를 활성화시킴으로써, LPA는 증식, 생존, 분화 및 이동과 같은 다양한 세포 반응을 유발한다. LPA / LPAR 시스템은 진행 중에 다양한 역할을 수행하고 여러 유형의 조직에서 다중 신호 전달 경로를 통해 다양한 병태리학적 사건을 중재한다. LPA / LPAR 축은 부인과적 악성 종양 중 사망률이 가장 높은 난소암의 병리학에 연루되어있다. 많은 후속 연구에서 예후가 나쁜 대부분의 난소 암 환자의 복수 및 혈청에서 LPA 수준이 상승한 것을 발견했다. 또한 LPARs의 발현은 난소 암 세포에서 높게 발현된다. LPA / LPAR의 변화는 난소 암 세포의 이동과 침입을 촉진하여 전이와 불량한 임상 결과를 초래한다. 난소 암 진행의 병리학 적 중요성에도 불구하고, 특히 LPA- 유발 난소 암 세포 이동과 관련하여, LPAR 하류의 세포 내 신호 전달 경로가 명확하게 정의되지 않았다Lysophosphatidic acid is a glycerol phospholipid produced by a number of metabolic enzymes such as phospholipase A1 and A2, monoacylglycerol kinase, glycerol-3-phosphate acyltransferase and Otog's, glycerol-3- Phosphates, and phosphatidic acid. Lysophosphatidic acid activates the LPA receptor (LPAR) at the cell surface, and LPA causes a variety of cellular responses such as proliferation, survival, differentiation and migration. The LPA / LPAR system performs various roles during the course and mediates various pathological events through multiple signaling pathways in different types of organizations. The LPA / LPAR axis is implicated in the pathology of ovarian cancer, which has the highest mortality rate among gynecologic malignancies. Many subsequent studies have found elevated LPA levels in ascites and serum of most ovarian cancer patients with poor prognosis. Expression of LPARs is also highly expressed in ovarian cancer cells. Changes in LPA / LPAR promote migration and invasion of ovarian cancer cells, resulting in metastasis and poor clinical outcome. Despite the pathological significance of ovarian cancer progression, in particular with regard to LPA-induced ovarian cancer cell migration, the intracellular signaling pathway downstream of the LPAR has not been clearly defined

따라서 본 발명자들은 인간 난소선암 세포주인 OVCAR-3을 사용하여 LPA로 유도 된 난소 암 세포의 이동에서 LPAR 아형과 그 하류 신호 전달 경로의 역할을 연구하였고, 그 결과 LPA1R / LPA2R / cpERM 경로가 난소 암 세포의 피질 리모델링 및 전이에 필수적임을 확인하고, 상기 LPA1R / LPA2R의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 인간 난소선암 세포주에 처리한 결과 세포 이동성 및 전이활성을 억제할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Thus, the present inventors have studied the role of LPAR subtype and its downstream signaling pathway in the migration of LPA-induced ovarian cancer cells using OVCAR-3, a human ovarian adenocarcinoma cell line. As a result, the LPA1R / LPA2R / It was confirmed that the siRNA capable of inhibiting the expression of LPA1R / LPA2R could be inhibited from cell mobility and metastasis activity by treating human ovarian adenocarcinoma cell line with siRNA capable of inhibiting the expression of LPA1R / LPA2R. Respectively.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명자들은 LPA1 / LPA2의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 인간 난소선암 세포주에 처리하였고, 상기 LPA1 / LPA2의 발현을 억제할 수 있는 siRNA이 난소암세포의 이동성 및 전이활성을 억제할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다. Disclosure of the Invention The present invention has been conceived in order to solve the above-mentioned problems. The present inventors treated siRNA capable of inhibiting the expression of LPA1 / LPA2 in human ovarian adenocarcinoma cell line and siRNA capable of suppressing the expression of LPA1 / LPA2 Can inhibit the mobility and metastasis activity of the ovarian cancer cells, thereby completing the present invention.

상기와 같은 본 발명의 과제를 달성하기 위해서, 본 발명은 LPA1R 또는 LPA2R의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 조성물을 제공하는 것이다. In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention provides a composition for inhibiting cancer metastasis comprising, as an active ingredient, an agent for suppressing the expression or activity of LPA1R or LPA2R.

상기 LPA1R 또는 LPA2R의 발현 또는 활성 억제제는 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA 발현을 억제하는 뉴클레오티드, 또는 LPA1R 또는 LPA2R의 단백질, 또는 LPA1R 또는 LPA2R에 대한 리간드 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. The LPA1R or LPA2R expression or activity inhibitor may be a nucleotide that inhibits mRNA expression of LPA1R or LPA2R, or a protein of LPA1R or LPA2R, or an antibody or antigen-binding fragment thereof that inhibits the activity of a ligand protein for LPA1R or LPA2R .

상기 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA 발현을 억제하는 뉴클레오티드는 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머 (aptamer), shRNA 또는 siRNA일 수 있다.The nucleotide that inhibits mRNA expression of LPA1R or LPA2R may be an antisense oligonucleotide, aptamer, shRNA or siRNA specific for the LPA1R or LPA2R mRNA.

상기 siRNA는 서열번호 1에 염기서열로 표시되는 유전자 또는 서열번호 2에 염기서열로 표시되는 유전자일 수 있다.  The siRNA may be a gene represented by a base sequence in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.

상기 암은 난소암 일 수 있다. The cancer may be an ovarian cancer.

본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 LPA1R 또는 LPA2R 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이 억제 방법을 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for inhibiting cancer metastasis comprising administering a pharmaceutical composition comprising an LPA1R or LPA2R inhibitor as an active ingredient to a subject other than a human.

상기 LPA1R 또는 LPA2R의 발현 또는 활성 억제제는 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA 발현을 억제하는 뉴클레오티드, 또는 LPA1R 또는 LPA2R의 단백질, 또는 LPA1R 또는 LPA2R에 대한 리간드 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. The LPA1R or LPA2R expression or activity inhibitor may be a nucleotide that inhibits mRNA expression of LPA1R or LPA2R, or a protein of LPA1R or LPA2R, or an antibody or antigen-binding fragment thereof that inhibits the activity of a ligand protein for LPA1R or LPA2R .

상기 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA 발현을 억제하는 뉴클레오티드는 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머 (aptamer), shRNA 또는 siRNA일 수 있다.The nucleotide that inhibits mRNA expression of LPA1R or LPA2R may be an antisense oligonucleotide, aptamer, shRNA or siRNA specific for the LPA1R or LPA2R mRNA.

상기 siRNA는 서열번호 1에 염기서열로 표시되는 유전자 또는 서열번호 2에 염기서열로 표시되는 유전자일 수 있다.  The siRNA may be a gene represented by a base sequence in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.

상기 암은 난소암 일 수 있다. The cancer may be an ovarian cancer.

본 발명의 LPA1R 또는 LPA2R의 억제제를 포함하는 조성물은 암세포의 이동성 및 전이활성을 저해하여 암의 전이를 억제하므로, 암의 전이 억제 조성물로 우수한 효과가 있다. The composition comprising the inhibitor of LPA1R or LPA2R of the present invention inhibits the mobility and metastasis activity of cancer cells and inhibits the metastasis of cancer, and thus has an excellent effect as a cancer metastasis inhibiting composition.

도 1의 A 내지 E은 ERM 단백질의 C 말단 인산화에 LPA 자극의 효과 결과로서, A-B는 OVCAR-3 세포는 0, 5, 10, 30분 동안 LPA에 의해 자극된 웨스턴 블랏 결과이고, C 내지 E 는 0, 0.1, 1, 10 uM의 농도로 10분 동안 LPA 또는 EGF 의해 자극된 웨스턴 블랏 결과이며, F 내지 H는 EGF 자극이 ERM 단백질의 C 말단 인산화에 미치는 영향의 결과로서, F 내지 H는 혈청 박탁 OVCAR-3 세포를 0, 0.1, 1 um농도의 EGR로 10분 동안 자극 시킨 웨스턴 블랏의 결과이다.
도 2의 A 및 B는 LPA1과 LPA2는 OVCAR-3 세포에서 LPA에 의한 ERM 단백질의 인산화 결과로서, A 내지 B는 특정 LPAR 아형(LPA₁, LPA₂ 및 LPA₃)의 유전자를 표적으로 siRNA 이중 가닥으로 형질 감염 한 후 정량적인 PCR을 수행하여 각 LPAR 아형의 상대적인 유전자 발현 수준을 본 결과이고, C 및 D는 LPA 유도 된 ERM 인산화에 대한 각 LPAR 아형의 침묵 효과로서, siRNA 형질 감염한 세포에 혈청을 제거하고 1 μM LPA로 10 분 동안 처리하여 ERM 및 cpERM의 상대적인 수준을 본 결과이며, E 및 F는 LPA- 유도 된 ERM 인산화에 대한 각 LPAR 아형의 과발현 효과로서, LPAR 과발현 플라스미드의 형질 감염 1 일 후에, 세포를 24 시간 동안 혈청 박탈하고 다양한 농도의 LPA로 10 분 동안 처리하여 cpERM의 수준을 웨스턴 불랏으로 본 결과이다.
도 3는 LPA에 의한 ERM 인산화는 RhoA 경로에 의존하지만 PLC / Ca2 + / PKC 또는 PKA 경로에는 의존하지 않는 다는 것을 확인 한 것으로, A 내지 D는 LPA- 유도 된 ERM 인산화에 대한 다양한 화학적 억제제 및 활성제의 효과로서, PLC 억제제 (A), PKC / Ca2 + 억제제 (B), PKA 억제제 (C), 및 PKC 또는 PKA 활성화 제 (D)의 존재하에 혈청 박리 된 OVCAR-3 세포를 1 μM LPA로 10 분간 처리하여, cpERM의 상대적인 수준을 웨스턴 블랏으로 본 결과이며, E는 Rho 계열 GTPase의 LPA- 유도 된 활성화로서, 혈청 박탈 된 OVCAR-3 세포를 0, 2, 5, 10, 30 분 동안 1 μM LPA 처리하여, ST-RBD (RhoA) 또는 GST-PBD (Rac1 및 Cdc42)를 사용하여 Rho-GTP의 풀다운의 수준을 웨스턴 블랏으로 본 결과이고, F 내지 G는 LPA 유발 ERM 인산화에 Rho GTPases의 효과로서, HA-tagged WT Rho GTPase (RhoA-WT, Rac1-WT 및 Cdc42-WT) 또는 이들의 구성 활성 형태 (RhoA-CA, Rac1-CA 및 Cdc42-CA)를 갖는 플라스미드로 OVCAR-3 세포를 형질 감염한 후, 세포를 1 일 동안 혈청 박탈하고 지시 된 바와 같이 10 분 동안 1 μM LPA (LPA +) 또는 비히클 (LPA -)로 처리 한 뒤, 상기 유전자를 웨스턴 블랏으로 본 결과이며, H는 PA- 유도 된 ERM 인산화에 대한 Rho 키나아제 억제 효과로서,혈청 박탈 OVCAR-3 세포는 선택적 Rho 키나아제 저해제 인 Y-27632의 농도에서 1 μM LPA로 처리 한 후, cpERM의 수준을 웨스턴 블랏으로 본 결과이다.
도 4은 ERC 단백질의 인산화는 OVCAR - 3 세포 피질의 LPA 유발 재조직에 중요하다는 것을 보여주는 결과로서, A 내지 B는 LPA 자극 된 OVCAR-3 세포에서 ERM 및 cpERM 단백질의 세포 내 지방화를 본 결과로서, 혈청을 제거한 OVCAR-3 세포는 자극을 주지 않았으며 (LPA-), 10 분 동안 1μM LPA로 자극 (LPA +) 한 후, 고정 된 세포를 항 ERM 항체 (A) 또는 항 cpERM 항체 (B)를 본 현미경 결과이고, C 및 D는 피질 돌출부에서의 c- 말라 틴과 c- 말단의 콜로 칼리화를 confocal을 통해보여주는 결과이며, E 내지 G는 LPA에 의한 세포 피질의 재조직에서 ERM 인산화의 중요한 역할로서, VSVG- 표지 된 ezrin-WT 및 T567 인산화 결함있는 돌연변이 체를 포함하는 아데노 바이러스 포장 플라스미드가 생성되었고 (E), OVCAR-3 세포는 VSVG- 표지 된 ezrin-WT 또는 -T567A (F)를 보유하는 재조합 아데노 바이러스로 감염시킨 뒤에, 감염된 세포를 1 μM LPA로 10 분간 처리하고, 고정하고, 항 -VSVG 및 항 -cpERM 항체로 면역 염색 한 뒤에 confocal로 관찰한 결과이다. \
도 5은 LPA1 및 LPA2의 ERM 활성화 하류는 OVCAR-3 세포가 LPA 농도 의존적으로 이동하는 것을 매개하는 결과로서, A 및 B는 PA 유발 세포 이동에 대한 각 LPAR 하위 유형의 침묵 효과로서, OVCAR-3 세포를 각 LPAR 아형 또는 siRNA에 특이적인 siRNA로 형질 감염시킨 뒤, 형질 감염 된 세포를 하부 챔버에서 1 uM LPA를 포함하거나 포함하지 않은 뒤 3.5 시간 동안 변형 된 보이든 (Boyden) 챔버에서 이동 분석을 한 결과이고, C 및 D는 LPA 유도 된 세포 이동에 대한 ERM 억제 효과로서, OVCAR-3 세포는 VSVG- 태그 ezrin (WT 또는 T567A) 또는 대조 아데노 바이러스를 보유하는 아데노 바이러스로 감염시킨 뒤, 0, 0.1, 10 uM의 LPA를 사용하여 세포를 이동 분석한 결과이다.
도 6은 LPA1 / LPA2 / cpERM 경로에 의해 매개되는 LPA- 유발 난소 암 세포 이동의 모식도로서, A는 ERM 인산화를 일으키는 LPA1 및 LPA2의 하류 신호 경로의 모식도이고, LPA 유발 세포 이동의 cpERM 의존적 조절의 개략도이다. Figures 1 A-E are the results of LPA stimulation on C-terminal phosphorylation of ERM protein, AB is Western blot results stimulated by LPA for OVCAR-3 cells for 0, 5, 10, Is the result of Western blotting stimulated by LPA or EGF for 10 min at a concentration of 0, 0.1, 1, 10 uM and F to H as a result of the effect of EGF stimulation on the C-terminal phosphorylation of the ERM protein, The results of Western blotting in which serum-stained OVCAR-3 cells were stimulated with EGR of 0, 0.1, 1 um for 10 minutes.
2 A and B show that LPA1 and LPA2 are results of phosphorylation of ERM protein by LPA in OVCAR-3 cells, and A and B are the results of phosphorylation of specific LPAR subtypes (LPA ₁ , LPA ₂ And LPA ₃ ) were targeted and transfected with siRNA duplexes, followed by quantitative PCR to see the relative gene expression levels of each LPAR subtype. C and D were the results of each LPAR subtype for LPA induced ERM phosphorylation The results of the silencing effect of siRNA transfected cells are shown in the results of the relative levels of ERM and cpERM by removing serum and treating with 1 [mu] M LPA for 10 minutes, and E and F are the results of each LPAR subtype for LPA-induced ERM phosphorylation , One day after the transfection of the LPAR overexpressing plasmid, the cells were deprived of serum for 24 hours and treated with various concentrations of LPA for 10 minutes, and the level of cpERM was seen as Western blot.
Figure 3 confirms that ERM phosphorylation by LPA is dependent on the RhoA pathway, but not on the PLC / Ca2 + / PKC or PKA pathways, where A through D represent various chemical inhibitors and activators for LPA-induced ERM phosphorylation OVCAR-3 cells in the presence of PLC inhibitor (A), PKC / Ca2 + inhibitor (B), PKA inhibitor (C), and PKC or PKA activator (D) The results obtained by Western blotting the relative level of cpERM and showing that LP was the LPA-induced activation of the Rho family of GTPases. Serially deprived OVCAR-3 cells were incubated for 1, 2, 5, LPA treatment, and the level of pull-down of Rho-GTP using Western blotting using ST-RBD (RhoA) or GST-PBD (Rac1 and Cdc42). F to G show the effect of Rho GTPases on LPA induced ERM phosphorylation Tagged WT Rho GTPase (RhoA-WT, Rac1-WT and Cdc42-WT) or their constitutive active forms (Rho After transfection of the OVCAR-3 cells with plasmids with the plasmids A-CA, Rac1-CA and Cdc42-CA, the cells were serum deprived for one day and incubated with 1 μM LPA (LPA +) or vehicle (LPA -), the result of Western blotting of the gene, H is Rho kinase inhibitory effect on PA-induced ERM phosphorylation, and serum deprived OVCAR-3 cells were treated with selective Rho kinase inhibitor Y-27632 , And the level of cp ERM was measured by Western blotting after treatment with 1 μM LPA.
Figure 4 shows that phosphorylation of the ERC protein is important for LPA-induced reorganization of the OVCAR-3 cell cortex, where A to B are intracellular localization of ERM and cpERM proteins in LPA-stimulated OVCAR-3 cells, Serum-depleted OVCAR-3 cells were not stimulated (LPA-), stimulated with 1 μM LPA for 10 min (LPA +), fixed cells were stained with anti-ERM antibody (A) C and D are confocal results of c-malatin and c-terminal colocalization in the cortical overhangs, and E to G are important roles of ERM phosphorylation in the reorganization of the cortex by LPA (E), and the OVCAR-3 cells harbored VSVG-labeled ezrin-WT or -T567A (F) plasmid containing the VSVG-labeled ezrin-WT and T567 phosphorylated defective mutants Infected with recombinant adenovirus Keen processing after 10 minutes the infected cells with 1 μM LPA, and fixed, and the results of observation by confocal after immunostaining with anti -VSVG and wherein -cpERM antibody. \
Figure 5 shows that ERM activation downstream of LPA1 and LPA2 mediates LPA concentration-dependent migration of OVCAR-3 cells, while A and B are silencing effects of each LPAR subtype on PA-induced cell migration. OVCAR-3 Cells were transfected with siRNA specific for each LPAR subtype or siRNA and the transfected cells were analyzed for migration in a modified Boyden chamber for 3.5 hours with or without 1 uM LPA in the lower chamber C and D are ERM inhibitory effects on LPA-induced cell migration. OVCAR-3 cells are infected with adenovirus carrying the VSVG-tagged ezrin (WT or T567A) or control adenovirus, 0.1, and 10 uM of LPA, respectively.
FIG. 6 is a schematic diagram of LPA-induced ovarian cancer cell migration mediated by the LPA1 / LPA2 / cpERM pathway, wherein A is a schematic representation of downstream signaling pathways of LPA1 and LPA2 causing ERM phosphorylation and cPERM- Fig.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 LPA1 / LPA2 / cpERM 경로에 의해 매개되는 LPA-유발 난소암 세포의 이동을 확인 것으로, 더 자세하게는 LPA 자극시, LPA1과 LPA2는 Rho GTPase 뉴클레오타이드 교환 인자 (RhoGEFs)를 통해 Rho 계열 GTPase (RhoA, Cdc42 및 Rac1)를 차례로 활성화시키는 Gα12 / 13과 결합하고, Rho 계열 GTPase 중에서 RhoA 활성화는 ROCK 독립적 인 방식으로 ERM 인산화를 유도하는 것을 확인하여 한 것이다 (도 6A). 또한, ERM 단백질은 인산화를 통해 활성화 되고, 활성화 된 ERM 단백질의 N 말단 도메인은 인지질 (PIP2) 및 세포 부착 분자 (CD43, CD44, ICAM-1 및 ICAM-2)를 비롯한 많은 막 횡단 단백질과 직접 상호 작용하고 간접적으로 이온 채널 (NHE3 및 CFTR ) 및 다른 GPCR (β2- 아드레날린 성 수용체 및 LPA2R)을 NHERF 패밀리 단백질을 통해 검출 한 반면에활성화 된 ERM 단백질의 C- 말단 도메인은 세포 막 아래의 액틴 세포 골격과 연결되어있는 것을 확인하였고, cpERM 단백질의 분자 복합체는 세포 피질의 역동적 인 재편성을 중재하는 원형질 막 바로 아래에있는 여러 막 및 세포질 파트너를 연결하는 분자 발판으로 핵심적인 역할을 하는 것을 확인 함으로써, 상기의 메커니즘으로 LPA에 의한 난소 암 세포의 이동을 하는 것을 확인 것이다 (도 6B). The present invention confirms the migration of LPA1-induced ovarian cancer cells mediated by the LPA1 / LPA2 / cpERM pathway. Specifically, LPA1 and LPA2 activate Rho GTPase (RhoGEFs) via Rho GTPase nucleotide exchange factors (RhoGEFs) RhoA, Cdc42 and Rac1), and that RhoA activation in Rho-GTPase induces ERM phosphorylation in a ROCK-independent manner (Fig. 6A). In addition, the ERM protein is activated through phosphorylation and the N-terminal domain of the activated ERM protein is directly interacted with many transmembrane proteins including phospholipid (PIP2) and cell adhesion molecules (CD43, CD44, ICAM-1 and ICAM-2) (NHE3 and CFTR) and other GPCRs (beta2-adrenergic receptor and LPA2R) were detected through the NHERF family protein while the C-terminal domain of the activated ERM protein was detected in the actin cytoskeleton And confirming that the molecular complex of the cpERM protein plays a key role as a molecular scaffold for connecting various membranes and cytoplasmic partners immediately below the plasma membrane mediating the dynamic reorganization of the cell cortex, (Fig. 6B). As shown in Fig.

본 발명은 LPA1R 또는 LPA2R의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 조성물을 제공하는 것이다. The present invention provides a composition for inhibiting metastasis of cancer comprising an expression or activity inhibitor of LPA1R or LPA2R as an active ingredient.

본 발명의 LPA1R 또는 LPA2R은 Lysophosphatidic acid receptor의 아형이다. 상기와 같이 LPA- 유발 난소 암 세포 이동과 관련하여, LPAR 하류의 세포 내 신호 전달 경로가 명확하게 정의되지 않았다.The LPA1R or LPA2R of the present invention is a subtype of the Lysophosphatidic acid receptor. As described above, regarding the migration of LPA-induced ovarian cancer cells, the intracellular signaling pathway downstream of LPAR is not clearly defined.

본 발명의 일 실시예에서 　LPA 자극에 따른 ERM 단백질의 활성화 확인하였고 (도 1), LPA1 및 LPA 2가 ERM 단백질의 활성화한다는 것을 확인 하였으며 (도 2), RhoA가 관여하는 경로가 LPA에 의한 ERM 단백질의 활성화의 역할에 결정적인 역할을 한다는 것을 확인했으며 (도 3), cpERM은 LPA 유도된 막 형태 형성을 매개로 하며, 결국에는 LPA1R / LPA2R / cpERM 경로는 난소 암 세포의 LPA 유도 이동을 매개한다는 것을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 상기 결과를 통해 LPA1R 또는 LPA2R의 억제제가 난소 암의 전이를 억제한다는 사실을 알 수 있었다. In one embodiment of the present invention, activation of the ERM protein was confirmed by LPA stimulation (Fig. 1), confirming that LPA1 and LPA2 activate the ERM protein (Fig. 2) (Fig. 3), cPERM mediates LPA-induced membrane morphogenesis, and eventually the LPA1R / LPA2R / cpERM pathway mediates LPA-induced migration of ovarian cancer cells Respectively. Thus, the present inventors have found that inhibitors of LPA1R or LPA2R inhibit the metastasis of ovarian cancer.

본 발명에서 용어 "LPA1R 또는 LPA2R 억제제"는 LPA1R 또는 LPA2R의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로는 LPA1R 또는 LPA2R에 직접적으로 작용하거나 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 등의 방식으로, LPA1R 또는 LPA2R의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나 그 활성을 방해함으로써, LPA1R 또는 LPA2R의 발현 수준 또는 그 활성을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다.In the present invention, the term "LPA1R or LPA2R inhibitor" is used to collectively refer to any agent that decreases the expression or activity of LPA1R or LPA2R, and specifically refers to a compound that directly acts on LPA1R or LPA2R, May include all agents that reduce the level of expression of LPA1R or LPA2R or its activity by reducing the expression of LPA1R or LPA2R at the transcription level or by interfering with its activity.

상기 LPA1R 또는 LPA2R의 발현 또는 활성 억제제는 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA 발현을 억제하는 뉴클레오티드, 또는 LPA1R 또는 LPA2R의 단백질, 또는 LPA1R 또는 LPA2R에 대한 리간드 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. The LPA1R or LPA2R expression or activity inhibitor may be a nucleotide that inhibits mRNA expression of LPA1R or LPA2R, or a protein of LPA1R or LPA2R, or an antibody or antigen-binding fragment thereof that inhibits the activity of a ligand protein for LPA1R or LPA2R .

본 발명에서 용어, "항체"는 생체의 면역계에서 혈액이나 림프를 순환하면서 외부 물질인 항원이 침입한 경우 이에 반응하는 물질을 말하며, 림프조직에서 형성되는 글로불린계 단백질로 면역글로불린이라고도 불린다. 항체는 B세포가 생산해서 체액으로 흘려 보내는 단백질로 항원과 특이적으로 결합하며, 하나의 항체 분자에는 두 개의 중사슬 (heavy chain)과 두 개의 경사슬 (light chain)이 있으며, 각각의 중사슬과 경사슬은 그의 N-터미널 말단에 가변영역을 갖고 있다. 각각의 가변영역은 3 개의 상보성 결정부위 (Complementarity determining region: CDR)와 4 개의 구조 형성부위 (framework regions: FRs)로 구성되는데, 상보성 결정 부위들은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 가변영역의 구조형성 부위들로 유지되는 비교적 짧은 펩티드 서열로 존재한다. 본 발명의 목적상 상기 항체는 LPA1R 또는 LPA2R 또는 LPA1R 또는 LPA2R의 리간드 단백질과 결합하여 LPA1R 또는 LPA2R의 활성을 억제할 수 있는 항체일 수 있다.The term "antibody" in the present invention refers to a substance that reacts when an antigen, which is an external substance, enters the circulation of blood or lymph through the immune system of a living body, and is also called an immunoglobulin as a globulin protein formed in lymphoid tissue. Antibody is a protein produced by B cells that flows into body fluids and specifically binds to an antigen. An antibody molecule has two heavy chains and two light chains, and each heavy chain And the light chain has a variable region at its N-terminal end. Each variable region consists of three complementarity determining regions (CDRs) and four framework regions (FRs), where the complementarity determining regions determine the antigen binding specificity of the antibody and the structure of the variable region Lt; RTI ID = 0.0 > relatively < / RTI > For the purposes of the present invention, the antibody may be an antibody capable of binding LPA1R or LPA2R or a ligand protein of LPA1R or LPA2R to inhibit the activity of LPA1R or LPA2R.

본 발명에서 용어 "리간드"는 생분자 (biomolecule)와 복합체를 형성하여 생물학적 반응을 가져오는 물질을 의미하며, "LPA1R 또는 LPA2R의 리간드 단백질" 또는 "LPA1R 또는 LPA2R에 대한 리간드 단백질"은 LPA1R 또는 LPA2R와 결합하여 LPA1R 또는 LPA2R를 활성화시키거나 활성을 증가시키는 단백질일 수 있다. 구체적으로 상기 LPA1R 또는 LPA2R의 리간드 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The term "ligand protein of LPA1R or LPA2R" or "ligand protein for LPA1R or LPA2R" refers to a substance that forms a complex with a biomolecule to cause a biological reaction. Examples of the ligand protein include LPA1R or LPA2R Lt; RTI ID = 0.0 > LPA1R < / RTI > or LPA2R or increase the activity. Specifically, the ligand protein of LPA1R or LPA2R may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, but is not limited thereto.

상기 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA 발현을 억제하는 뉴클레오티드는 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머 (aptamer), shRNA 또는 siRNA일 수 있다.The nucleotide that inhibits mRNA expression of LPA1R or LPA2R may be an antisense oligonucleotide, aptamer, shRNA or siRNA specific for the LPA1R or LPA2R mRNA.

본 발명에서 용어, "안티센스 올리고 뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드 서열은 상기 LPA1R 또는 LPA2R mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 LPA1R 또는 LPA2R mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위 (translocation), 성숙 (maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 합성하는 한 가지 예는 RNA 중합효소 I을 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위 (MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 디자인은 LPA1R 또는 LPA2R의 염기서열을 참조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.As used herein, the term "antisense oligonucleotide" refers to DNA, RNA or derivatives thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, which binds to a complementary sequence in the mRNA and inhibits translation of the mRNA into a protein . The antisense oligonucleotide sequence refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to the LPA1R or LPA2R mRNA and capable of binding to the mRNA. Which may interfere with the translation of the LPA1R or LPA2R mRNA, the translocation into the cytoplasm, the maturation, or the essential activity for all other overall biological functions. The length of the antisense oligonucleotide may be 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, more preferably 10 to 40 bases. The antisense oligonucleotides may be synthesized in vitro by conventional methods and administered in vivo or may be used to synthesize antisense oligonucleotides in vivo. One example of the synthesis of antisense oligonucleotides in vitro is the use of RNA polymerase I. One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to allow the antisense RNA to be transcribed using a vector whose origin is a multi-cloning site (MCS) in the opposite direction. It is preferred that the antisense RNA is such that translation stop codon is present in the sequence so that it is not translated into the peptide sequence. The design of the antisense oligonucleotides that can be used in the present invention can be readily produced by methods known in the art with reference to the nucleotide sequences of LPA1R or LPA2R.

본 발명에서 용어, "앱타머 (aptamer)"는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 20 내지 60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 서열에 따라 다양한 3 차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된 (modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 앱타머는 LPA1R 또는 LPA2R에 결합하여 LPA1R 또는 LPA2R의 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 앱타머는 LPA1R 또는 LPA2R의 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.As used herein, the term "aptamer" refers to a single-stranded oligonucleotide, which is about 20 to 60 nucleotides in size and has a binding activity to a given target molecule. Depending on the sequence, it has various three-dimensional structures and can have a high affinity with a specific substance such as an antigen-antibody reaction. The aptamer can inhibit the activity of a given target molecule by binding to a predetermined target molecule. The aptamers of the present invention may be RNA, DNA, modified nucleic acids, or mixtures thereof, and may also be in linear or cyclic form. Preferably, the aptamer is capable of binding to LPA1R or LPA2R and acting to inhibit the activity of LPA1R or LPA2R. Such an aptamer can be prepared from a sequence of LPA1R or LPA2R by a method known to a person skilled in the art.

본 발명에서 용어, "siRNA" 및 "shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱 (silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운 (knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다. shRNA는 단일 가닥의 올리고 뉴클레오티드 내에서 상보적인 서열간의 결합에 의해 헤어핀 (hairpin) 구조를 형성한 것이고, 생체 내에서 상기 shRNA는 다이서 (dicer)에 의해 절단되면서 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 이중 가닥의 올리고 뉴클레오티드인 siRNA가 되며, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 따라서 shRNA 및 siRNA 중 어느 수단을 이용할지는 당업자의 선택에 의해 결정될 수 있으며 이들이 표적으로 하는 mRNA 서열이 동일한 경우라면 유사한 발현 감소 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 목적상 LPA1R 또는 LPA2R에 특이적으로 작용하여 LPA1R 또는 LPA2R mRNA 분자를 절단하여 RNA 간섭 (RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 LPA1R 또는 LPA2R를 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 (in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내 (in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR (polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트 (cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.The term "siRNA" and "shRNA" in the present invention are nucleic acid molecules capable of mediating RNA interference or gene silencing, and can inhibit the expression of a target gene. Therefore, an efficient gene knockdown method or gene It is used as a treatment method. A shRNA is a hairpin structure formed by the binding between complementary sequences in a single strand oligonucleotide. In vivo, the shRNA is cleaved by a dicer and a small RNA fragment of 21 to 25 nucleotide size SiRNA, which is a double strand oligonucleotide, can be specifically bound to mRNA having a complementary sequence to inhibit its expression. Thus, the use of either shRNA or siRNA can be determined by the choice of those skilled in the art, and similar expression reduction effects can be expected if the mRNA sequences to which they are targeted are identical. For the purpose of the present invention, LPA1R or LPA2R can be inhibited by specifically acting on LPA1R or LPA2R to induce RNA interference (RNAi, RNA interference) phenomenon by cleaving LPA1R or LPA2R mRNA molecules. siRNA can be chemically or enzymatically synthesized. The method for producing siRNA is not particularly limited, and methods known in the art can be used. For example, a method of directly synthesizing siRNA, a method of synthesizing siRNA using in vitro transcription, a method of cutting long double-stranded RNA synthesized by in vitro transcription using an enzyme, expression through an intracellular delivery of an shRNA expression plasmid or a viral vector, and expression through an intracellular delivery of a polymerase chain reaction (siRNA) expression cassette.

상기 siRNA는 서열번호 1에 염기서열로 표시되는 유전자 또는 서열번호 2에 염기서열로 표시되는 유전자일 수 있다.  The siRNA may be a gene represented by a base sequence in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.

특히, 본 발명의 LPA1R 또는 LPA2R에 대한 siRNA는 서열번호 1 , 또는 서열번호 2 의 올리고 뉴클레오티드 및 이의 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드의 이중 가닥으로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In particular, the siRNA for LPA1R or LPA2R of the present invention may comprise, but is not limited to, a double strand of an oligonucleotide having an oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and a complementary sequence thereof.

상기 암은 난소암 일 수 있다. The cancer may be an ovarian cancer.

본 발명에서 용어 "암"은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양 (tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양 (benign tumor)과 악성 종양 (malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암(cancer)'이라 하며, 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중프종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암을 포함하나, 상기 예들에 의해 본 발명의 암의 종류가 한정되는 것은 아니다. 상기 암은 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로는 고형암이 적합할 수 있으며, 보다 구체적으로는 난소암 일 수 있다.The term "cancer" in the present invention refers to a disease associated with the control of death of a cell, which is caused by excessive proliferation of cells when a normal apoptosis balance is broken. These abnormal hyperproliferative cells sometimes invade surrounding tissues and organs to form a mass, which destroys or transforms normal structures in the body. Such a condition is called cancer. In general, a tumor refers to a mass abnormally grown by autonomous overgrowth of the body tissue, and can be divided into a benign tumor and a malignant tumor. Malignant tumors have a much faster growth rate than benign tumors, and they invade the surrounding tissues, causing metastasis and endangering life. Such malignant tumors are commonly referred to as 'cancer', and the types of cancer include cerebrospinal tumors, head and neck cancer, lung cancer, breast cancer, thymoma, mesothelioma, esophageal cancer, cervical cancer, colon cancer, liver cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, But not limited to, renal cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, germ cell tumor, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, colon cancer, lymphoma, acute leukemia, chronic leukemia, multiple myeloma, sarcoma, malignant melanoma, The types of cancer of the present invention are not limited by examples. The cancer is not limited to this, but specifically, a solid cancer may be suitable, and more specifically, it may be an ovarian cancer.

본 발명에서 용어 "전이 (metastasis)"는 악성 종양이 발병한 장기에서 떨어진 다른 조직으로 전파한 상태를 말한다. 하나의 장기에서 시작한 악성 종양이 진행함에 따라 처음 발생한 원발 부위인 장기로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는데, 이렇게 원발 부위로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는 것을 전이라 할 수 있다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상이라고 할 수 있는데, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 새로운 유전 형질을 획득하면서 전이가 일어날 수 있다. 새로운 유전 형질을 획득한 종양 세포가 혈관과 림프선으로 침입하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착, 증식하게 되면 전이가 일어날 수 있다.The term "metastasis" in the present invention refers to a condition in which malignant tumors have spread to other tissues distant from the onset of the disease. As a malignant tumor originating from one organs progresses, it spreads from other organs, such as the first primary site, to other tissues. Metastasis is a phenomenon associated with the progression of malignant tumors, which can occur when malignant tumor cells multiply and cancer progresses to acquire new genetic traits. Metastasis can occur when tumor cells that acquire new genetic traits enter the blood vessels and lymph nodes, circulate along the blood and lymph, and settle and proliferate in other tissues.

전이가 발생하는 조직에 따라, 간암, 신장암, 폐암, 위암, 대장암, 직장암, 췌장암 등 각종 암질환이 유발될 수 있다. 본 발명의 조성물은 전이를 억제하여 암이 퍼지는 것을 예방 및 치료할 수 있다.Depending on the tissues where the metastasis develops, various cancer diseases such as liver cancer, kidney cancer, lung cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer and pancreatic cancer may be induced. The composition of the present invention can prevent metastasis and prevent cancer spreading.

본 발명에서 용어, "억제"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암 전이를 억제시키는 모든 행위를 말한다.In the present invention, the term "inhibition" refers to any action that inhibits cancer metastasis by administration of a composition according to the present invention.

본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients or diluents conventionally used in the manufacture of pharmaceutical compositions. Compositions comprising a pharmaceutically acceptable carrier can be of various oral or parenteral formulations. In the case of formulation, it can be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, surfactants and the like which are usually used. Solid formulations for oral administration may include tablet pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain one or more excipients, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. Various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used. have. Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the non-aqueous solvent and the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may also be in the form of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, nonaqueous solutions, suspensions, emulsions, ≪ / RTI > and suppositories.

본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 LPA1R 또는 LPA2R 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이 억제 방법을 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for inhibiting cancer metastasis comprising administering a pharmaceutical composition comprising an LPA1R or LPA2R inhibitor as an active ingredient to a subject other than a human.

본 발명에서 용어, "개체"는 본 발명의 암 질환을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 인간을 제외한 개체일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여함으로써, 간암을 비롯한 암의 전이를 억제할 수 있다.In the present invention, the term "individual" refers to all animals, including humans, who have or have developed the cancerous disease of the present invention, and may be individuals other than humans. Administration of the pharmaceutical composition of the present invention to an individual can inhibit metastasis of cancer including liver cancer.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.The term "administering" as used herein refers to introducing a pharmaceutical composition of the present invention to a subject by any suitable method, and the administration route can be administered through various routes of oral or parenteral administration as long as it can reach the target tissue.

상기 약학 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition may be appropriately administered to an individual according to the purpose or necessity, depending on the conventional methods, routes of administration and dosage used in the art. Examples of routes of administration include oral, parenteral, subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary, and intranasal routes, and parenteral injection includes intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration. The amount and the frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention to be actually administered can be appropriately selected according to the type of the symptom to be treated, route of administration, sex, health condition, Diet, age and weight of the individual, and the severity of the disease.

본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 혈관 투과성 증가를 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The term "pharmaceutically effective amount " as used herein means an amount sufficient to inhibit or alleviate an increase in vascular permeability at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical use, and effective dosage levels will vary depending on the species and severity, Sex, the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of excretion, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art.

상기 LPA1R 또는 LPA2R의 발현 또는 활성 억제제는 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA 발현을 억제하는 뉴클레오티드, 또는 LPA1R 또는 LPA2R의 단백질, 또는 LPA1R 또는 LPA2R에 대한 리간드 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. The LPA1R or LPA2R expression or activity inhibitor may be a nucleotide that inhibits mRNA expression of LPA1R or LPA2R, or a protein of LPA1R or LPA2R, or an antibody or antigen-binding fragment thereof that inhibits the activity of a ligand protein for LPA1R or LPA2R .

상기 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA 발현을 억제하는 뉴클레오티드는 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머 (aptamer), shRNA 또는 siRNA일 수 있다.The nucleotide that inhibits mRNA expression of LPA1R or LPA2R may be an antisense oligonucleotide, aptamer, shRNA or siRNA specific for the LPA1R or LPA2R mRNA.

상기 siRNA는 서열번호 1에 염기서열로 표시되는 유전자 또는 서열번호 2에 염기서열로 표시되는 유전자일 수 있다.  The siRNA may be a gene represented by a base sequence in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.

상기 암은 난소암 일 수 있다. The cancer may be an ovarian cancer.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. The following examples are only exemplary embodiments of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the scope of the following examples.

실시예 1: 난소암 세포 배양 및 형질 감염 (trancsfection)/Example 1: Ovarian cancer cell culture and transfection /

난소암 세포주인 OVCAR-3은 37 ℃의 조건의 세포 배양기에서 10 % FBS이 첨가된 DMEM 배제에서 배양하였다. 6-well plate 또는 100mm 디쉬에 배양한 후에 제조사의 지시에 따라 리포펙타민 2000^TM 를 사용하여 일시적으로 형질 감염하였다. OVCAR-3, an ovarian cancer cell line, was cultured in a DMEM exclusion medium supplemented with 10% FBS in a cell incubator at 37 ° C. Cultured in 6-well plates or 100 mm dishes and transiently transfected using Lipofectamine 2000 ^™ according to the manufacturer's instructions.

실시예 2: 아고니스트(Agonist) 처리 및 웨스턴 블럿 분석Example 2: Agonist treatment and western blot analysis

OVCAR-3 세포를 1.5 × 10⁶ cel/well의 농도로 6-well plates에 시딩하였다. 24시간 동안 혈청을 없이 배양한 후, 세포를 아고니스트로 처리하였다. 각각의 플레이트를 PBS에 세척한 후, 포스파타아제 저해제(10 mM NaF, 30 mM b-glycerophosphate 및 1 mM Na₃VO₄)를 추가하였다. 샘프을 수집하고, 초음파를 처리한 뒤, , 1X Laemmli 샘플 버퍼에서 끓여서 전기 영동하였다. 1차 항체는 5 % IgG가 없는 소혈청알부민 (BSA)이 보충 된 Tris 완충 생리 식염수 (50mM Tris-HCl pH 7.4 및 135mM NaCl)로 희석하고 완만하게 흔들어 주면서 4 ℃에서 밤새 배양 하였다. 블롯은 향상된 화학 발광 시약 (GE Healthcare)을 사용하여 표준 절차를 통해 활성 되었다. OVCAR-3 cells were seeded in 6-well plates at a concentration of 1.5 × 10 ⁶ cel / well. After 24 hours of serum-free culture, the cells were treated with agonists. Each plate was washed in PBS and then a phosphatase inhibitor (10 mM NaF, 30 mM b-glycerophosphate and 1 mM Na ₃ VO ₄ ) was added. The sample was collected, sonicated, and then boiled in 1X Laemmli sample buffer for electrophoresis. The primary antibody was diluted with Tris buffered saline (50 mM Tris-HCl pH 7.4 and 135 mM NaCl) supplemented with 5% IgG-free bovine serum albumin (BSA) and incubated overnight at 4 ° C with gentle shaking. The blot was activated by standard procedures using an enhanced chemiluminescence reagent (GE Healthcare).

실시예 3　: siRNA-mediated gene silencingExample 3: siRNA-mediated gene silencing

각각의 LPAR 아형에 대해 지시 된 siRNA 이중 가닥은 Dharmacon (GE Healthcare)에 의해 합성되었고, 염기서열을 하기 표 1와 같다. 미리 합성 된 siRNA 이중 가닥 (Luciferase GL3 Duplex)을 대조군으로 사용 하였다. 표준 절차를 통해 무 혈청 OPTI-MEM에서 리포펙타민 2000^TM 을 사용하여 OVCAR-3 세포를 20 nM 올리고 뉴클레오티드로 형질 감염시켰다.The siRNA duplexes indicated for each LPAR subtype were synthesized by Dharmacon (GE Healthcare) and the nucleotide sequences are shown in Table 1 below. A pre-synthesized siRNA double strand (Luciferase GL3 Duplex) was used as a control. Lipofectamine 2000 ^TM in serum-free OPTI-MEM via standard procedures OVCAR-3 cells were transfected with 20 nM oligonucleotides.

LPA 1, LPA 2 및 LPA3의 siRNA 염기서열. SiRNA base sequences of LPA 1, LPA 2 and LPA 3. 유전자gene 염기 서열 Base sequence LPA 1 (서열번호 1)LPA 1 (SEQ ID NO: 1) 5'-GGACUUGGAAUCACUGUUUUU-35'-GGACUUGGAAUCACUGUUUUU-3 LPA 2 (서열번호 2)LPA 2 (SEQ ID NO: 2) 5'-GGUCAAUGCUGCUGUGUACUU-35'-GGUCAAUGCUGCUGUGUACUU-3 LPA 3 (서열번호 3)LPA 3 (SEQ ID NO: 3) 5'-GGUCAAUGCUGCUGUGUACUU-35'-GGUCAAUGCUGCUGUGUACUU-3

실시예 4 : RT-PCR 분석Example 4: RT-PCR analysis

RNA는 RNeasy 키트 (QIAGEN)를 사용하여 분리하였다. 추출된 RNA, M-MLV 역전사 효소 및 pd(6) 프라이머를 이용하여 cDNA를 제작하였다. PCR 완충액, 각 dNTP 0.25 mM, 각 프라이머 0.5 mM, 템플리트 1μl (총 RNA 0.1 μg에 해당) 및 Taq 중합 효소 0.5 unit를 포함하고 있는 25μl의 PCR 혼합물을 CT 값이 결정될 때까지 94 °C (변성, 30 sec), 59 °C (어닐링, 30 sec) 및 72°C (연장, 1 min)에서 30 회 미만으로 실행하였다. 정량적 PCR 분석을위한 프라이머는 다음과 같다.RNA was isolated using an RNeasy kit (QIAGEN). CDNA was prepared using the extracted RNA, M-MLV reverse transcriptase and pd (6) primer. 25 μl of PCR mixture containing PCR buffer, 0.25 mM each dNTP, 0.5 mM each primer, 1 μl of template (corresponding to 0.1 μg of total RNA) and 0.5 unit of Taq polymerase was added at 94 ° C (denaturation, 30 sec), 59 C (annealing, 30 sec) and 72 C (extension, 1 min). Primers for quantitative PCR analysis were as follows.

유전자 gene 염기 서열 Base sequence LPA 1LPA 1 F5'-ATTTCACAGCCCCAGTTCAC-3F5'-ATTTCACAGCCCCAGTTCAC-3 R5'-CTGTAGAGGGGTGCCATGTT-3R5'-CTGTAGAGGGGTGCCATGTT-3 LPA 2LPA 2 F5'-CCATCTACTACCTGCTCGGC-3F5'-CCATCTACTACCTGCTCGGC-3 R5'-AAGGGTGGAGTCCATCAGTGG-3R5'-AAGGGTGGAGTCCATCAGTGG-3 LPA 3LPA 3 F5'-GGAATTGCCTCTGCAACATCT-3F5'-GGAATTGCCTCTGCAACATCT-3 R5'-GAGTAGATGATGGGGTTC-3R5'-GAGTAGATGATGGGGTTC-3 LPA 4LPA 4 F5'-TCCTTACCAACATCTATGGGAGC-3F5'-TCCTTACCAACATCTATGGGAGC-3 R5'-ACGTTTGGAGAAGCCTTCAA-3R5'-ACGTTTGGAGAAGCCTTCAA-3 LPA 5LPA 5 F5'-CACTTGGTGGTCTACAGCTTG-3F5'-CACTTGGTGGTCTACAGCTTG-3 R5'-GCGTAGTAGGAGAGACGAACG-3R5'-GCGTAGTAGGAGAGACGAACG-3 LPA 6LPA 6 F5'-TTGTATGGGTGCATGTTCAGC-3F5'-TTGTATGGGTGCATGTTCAGC-3 R5'-GCCAATTCCGTGTTGTGAAGT-3R5'-GCCAATTCCGTGTTGTGAAGT-3 LPA 7LPA 7 F5'-TCACCAACTGGGACGACATG-3F5'-TCACCAACTGGGACGACATG-3 R5'-GTACAGGGATAGCACAGCCT-3R5'-GTACAGGGATAGCACAGCCT-3

생성 된 생성물을 2% 아가로즈 겔상에서 전기 영동하고, 에티디움 브로마이드 염색에 의해 가시화 하였다.The resulting product was electrophoresed on 2% agarose gel and visualized by ethidium bromide staining.

실시예 5: 재조합 아데노 바이러스의 생성 Example 5: Generation of recombinant adenovirus

VVSVG 에피토프 - 태그 야생형 (WT) 에즈린 또는 도미넌트 네거티브 돌연변이 체 (T567A)를 발현하는 재조합 아데노 바이러스가 생성되어 HEK-293T 세포에서 증폭되고 표준 프로토콜에 따라 정제되었다.OVCAR-3 세포는 완전한 배양 배지에서 4 시간 동안 10의 감염 다중도에서 감염되었다. 세포 생존력에 대한 바이러스 성 감염의 비특이적 효과를 모니터하기 위해, 세포를 음성 대조군으로서 병행하여 빈 셔틀 벡터를 함유하는 아데노 바이러스에 감염시켰다.Recombinant adenovirus expressing the VVSVG epitope-tagged wild type (WT) ezrin or dominant negative mutant (T567A) was generated and amplified in HEK-293T cells and purified according to standard protocols. OVCAR-3 cells were grown in complete culture medium Infected at a multiplicity of infection of 10 for 4 hours. To monitor the nonspecific effects of viral infection on cell viability, cells were infected with adenovirus containing empty shuttle vectors in parallel as negative control.

실시예 6 : 세포 이동 분석Example 6: Cell migration assay

8 ㎛의 공극 크기를 갖는 Transwell 이동 챔버 (Neuro-Probe Inc.)를 사용하여 세포 이동을 조사 하였다. 상부 챔버 멤브레인의 밑면을 4 ℃에서 밤새 10μg / ml 콜라겐 I 형 (Merck Millipore)으로 코팅하고 멸균 이중 증류수로 1 회 세척하였다. 그 다음, 건조 된 막을 300㎕의 이동 완충액 (0.1 % 지방산 없는 BSA가 보충 된 무 혈청 기초 배지)을 포함하는 하부 챔버에 넣고, LPA를 포함하거나 포함하지 않았다. 세포를 0.01 % 트립신 및 5mM EDTA를 함유하는 1X PBS를 사용하여 배양 접시로부터 분리하고, 이동 완충액으로 2 회 세척 한 후, 이동 완충액 (5 × 10⁵ cell/ml)에 재 현탁시켰다. 세포 (2.5 × 10⁴ cell/ml)를 상부 챔버에 넣고 3 시간 동안 이동시켰다. 막의 상부 표면상의 비-이동성 세포를 면봉으로 제거 하였다. 막의 하부 표면에 부착 된 이동성 세포를 2 % 파라포름 알데하이드로 고정시키고, 핵을 1 × PBS로 제조 한 Hoechest 33342로 염색 하였다. PBS로 3 회 세척 한 후, 막을 프레임으로부터 제거하고 유리 슬라이드 상에 장착 하였다. 막 당 이동성 세포의 수를 역 형광 현미경으로 40 배 대물렌즈를 사용하여 계수 하였다. Cell migration was examined using a Transwell mobile chamber (Neuro-Probe Inc.) with a pore size of 8 mu m. The bottom surface of the upper chamber membrane was coated with 10 μg / ml collagen type I (Merck Millipore) overnight at 4 ° C and washed once with sterile double distilled water. The dried membranes were then placed in the lower chamber containing 300 μl of migration buffer (serum-free basal medium supplemented with 0.1% fatty acid free BSA) and either with or without LPA. After the cells by using 1X PBS containing 0.01% trypsin and EDTA 5mM separated from culture dishes, washed twice with a mobile buffer was resuspended in the mobile buffer ^{(5 × 10 5 cell / ml} ). Cells (2.5 x 10 ⁴ cells / ml) were transferred into the upper chamber for 3 hours. Non-migrating cells on the upper surface of the membrane were swabbed. Mobile cells attached to the lower surface of the membrane were fixed with 2% paraformaldehyde, and the nuclei were stained with Hoechest 33342 prepared in 1x PBS. After three washes with PBS, the membrane was removed from the frame and mounted on a glass slide. The number of mobile cells per membrane was counted using an inverted fluorescence microscope with a 40X objective lens.

실시예7 : ImmunocytochemistryExample 7: Immunocytochemistry

OVCAR-3 세포를 4 ℃에서 밤새 10 μg / ml 콜라겐 타입 I (Upstate Biotechnology Inc.)로 코팅 한 커버 유리에 시딩 하였다. 혈청이 박리 된 세포를 0.1 % 지방산이 없는 BSA가 보충 된 무 혈청 배지에 희석 된 작용제로 처리하고, PBS로 세척하고, PBS로 제조 된 2 % 파라 포름 알데히드로 10 분 동안 실온에서 고정시켰다. 고정 세포를 PBS로 씻어 내고 PBS로 10 분간 준비한 0.2 % Triton X-100으로 투과성을 되찾고 PBS로 다시 헹구고 1 % BSA, 10 % 말 혈청 및 0.05 % NaN3를 함유 한 PBS로 1 시간 방치했다 온도. 마지막으로, 세포를 cpERM, ERM 및 VSVG에 대한 항체 또는 트리스 완충 식염수로 희석 된 로다 민 - 표지 된 phalloidin (Sigma-Aldrich Inc.)으로 염색 하였다. 이미지는 공 촛점 현미경 (LSM510, 자이스 혈구)으로 캡처하여 Zeiss 이미징 소프트웨어를 사용하여 디지털화하고 Adobe Photoshop 소프트웨어를 사용하여 컴파일하였다. OVCAR-3 cells were seeded overnight at 4 占 폚 in a cover glass coated with 10 占 퐂 / ml collagen type I (Upstate Biotechnology Inc.). The serum-exfoliated cells were treated with diluted actives in serum-free medium supplemented with 0.1% fatty acid-free BSA, washed with PBS, and fixed with 2% paraformaldehyde in PBS for 10 minutes at room temperature. Fixed cells were washed with PBS, permeabilized with 0.2% Triton X-100 for 10 minutes, rinsed again with PBS, and incubated with PBS containing 1% BSA, 10% horse serum and 0.05% NaN3 for 1 hour. Finally, cells were stained with an antibody against cp ERM, ERM and VSVG or rhodamine-labeled phalloidin (Sigma-Aldrich Inc.) diluted in Tris buffered saline. Images were captured with a confocal microscope (LSM510, Zeiss) and digitized using Zeiss imaging software and compiled using Adobe Photoshop software.

실험예 1 :　LPA 자극에 따른 ERM 단백질의 활성화 확인Experimental Example 1: Activation of ERM protein by LPA stimulation

본 발명자들은 LPA 자극이 ERM 단백질을 활성화시키는 지 확인하기 위해, 난소선암 세포주 OVCAR-3에서 시간 의존적으로 및 농도 의존적으로 처리하여, cpERM 및 ERM의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 그 결과 LPA 자극은 OVCAR-3에서 ERM 단백질의 인산화를 시간 의존적으로 (도 1A 및 도 1B) 및 농도 의존적으로 (도 C 내지 E) 유도하는 것을 확인하였다. 상기 인산화는 ERM 단백질의 활성화된 표지로서, ERM 단백질이 인산화되어 활성상태가 되면 인지질, 막 횡단 단백질 및 원형질 막아래의 액틴 필라메트를 포함하는 다중 분자 복합체를 접착, 형태 형성 및 극성을 비롯한 다양한 세포 반응을 조절하는데 핵심적인 역을 한다. LPA와 표피성장인자 (EGF)는 모두 세포증식의 중요한 중재자인 ERK1 / 2의 활성화를 유도하였으나 LPA만이 ERM 단밸의 활성을 유도한다는 것을 확인 하였다 (도 1F 내지 H). 상기의 결과는 LPA 특이적 신호 전달 경로가 ERM 단백질을 활성화시키고 이것이 인지질에 대한 난소암 세포이 뚜렷한 반응의 기초가 된 다는 것을 시사한다. To confirm whether LPA stimulation activates the ERM protein, we examined the expression of cpERM and ERM by western blotting in a time-dependent and concentration-dependent manner in the ovarian adenocarcinoma cell line OVCAR-3. As a result, it was confirmed that LPA stimulation induces phosphorylation of ERM protein in OVCAR-3 in a time-dependent manner (FIGS. 1A and 1B) and in a concentration-dependent manner (FIGS. The phosphorylation is an activated marker of the ERM protein. When the ERM protein is phosphorylated and becomes active, a multimolecular complex comprising phospholipids, trans-membrane proteins and actin filaments under the plasma membrane is adhered, formed and polarized It plays a key role in controlling the reaction. Both LPA and epidermal growth factor (EGF) induced the activation of ERK1 / 2, an important mediator of cell proliferation, but only LPA induced the activation of ERM monocytes (FIGS. 1F-H). The above results suggest that the LPA-specific signaling pathway activates the ERM protein and that this is the basis for a clear response of the ovarian cancer cells to the phospholipids.

실험예 2 :　LPA1 및 LPA 2가 ERM 단백질의 활성화 확인Experimental Example 2: Activation of ERM protein by LPA1 and LPA2

LPAR은 특정 세포 유형 및 그의 발현 양상이 상이하므로, 본 발명자들은 어떤 LPAR 아형들이 ERM 인사화를 담당하는지 확인하였다. 먼저, OVCAR-3 세포의 개별 LPAR 아형을 다른 아형에 대한 off-target 효과없이 효과적으로 silenced 시켰다 (도 2A-B). 그 뒤에 cpERM 및 ERM의 발현을 PCR 및 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 그 결과 ERM 인산화는 LPA1 또는 LPA2의 사일런싱에 의해 현저히 약화되었지만 LPA3는 사일런싱에 의해서는 약화되지 않았다 (도 2C-D). 반대로, 본 발명자들은 개별 LPAR 하위 유형을 과발현하는 효과를 조사하였다. 일관되게, LPA1 또는 LPA2의 과발현은 ERM 인산화를 증가시키는 반면, LPA3의 과발현은 LPA- 유도 된 ERM 인산화를 유의 적으로 억제 하였다 (도 3E-F). 상기의 결과를 통해 LPA에 의해 유발 된 ERM 단백질의 활성화가 공통 하류 신호 전달 경로를 통한 LPA1과 LPA2 사이의 협력을 필요하다는 것을 아게 되었다. Since LPARs differ in specific cell types and their expression patterns, we have identified which LPAR subtypes are responsible for ERM humanization. First, individual LPAR subtypes of OVCAR-3 cells were effectively silenced without off-target effects on other subtypes (Fig. 2A-B). The expression of cpERM and ERM was then confirmed by PCR and Western blotting. As a result, ERM phosphorylation was significantly attenuated by silencing of LPA1 or LPA2, but LPA3 was not attenuated by silencing (Fig. 2C-D). Conversely, we investigated the effect of overexpressing individual LPAR subtypes. Consistently, overexpression of LPA1 or LPA2 increased ERM phosphorylation, while overexpression of LPA3 significantly inhibited LPA-induced ERM phosphorylation (FIG. 3E-F). These results suggest that activation of ERA proteins induced by LPA requires cooperation between LPA1 and LPA2 through a common downstream signaling pathway.

실험예 3 : RhoA가 관여하는 경로의 LPA에 의한 ERM 단백질의 활성화의 역활 확인 Experimental Example 3: Role of ERA protein activation by LPA in the pathway involved in RhoA

본 발명자들은 LPA1과 LPA2의 하류에서 ERM 인산화로 이끄는 세포 내 신호 전달 경로를 확인하였따. 처음에 GPCR의 즉각적인 효과를 표적으로하기 위해 몇 가지 화학 억제제와 활성제를 사용했다. LPA에 의해 유도 된 ERM 단백질의 인산화는 U73122 (PLC 억제제), GF109204X (pan-PKC 억제제), GFP (Glucose) 억제제와 같은 Gαq / phospholipase C (PLC) -β / Ca2 + / PKC 경로의 화학적 억제제 및 BAPTA-AM (세포 내 Ca2 + 킬 레이터) (도 3A-B), 또는 H89 및 PKI (PKA 억제제)와 같은 Gαs / 아데닐레이트 사이클라제 / PKA 경로의 화학적 억제제 (도 3C)에 영향을 받지 않았다. 또한 phorbol-13-myristate 및 forskolin (PKA 활성화 제)으로 처리 한 결과 ERM 인산화에 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로 본 발명자들은 Gαq / PLC 및 Gαs / PKA 경로가 OVCAR-3 세포에서 LPA에 의한 ERM 인산화에 관여하지 않는다고 결론지었다. LPA는 다양한 세포 유형에서 Gα12 / 13을 통해 RhoA, Cdc42 및 Rac1과 같은 작은 Rho GTPase를 활성화시킨다. 본 발명자들은 상기 단백질이 LPA- 유발 ERM 인산화에 관여 하는지를 조사하였다.LPA 자극은 OVCAR-3 세포에서 3 가지 Rho GTPase의 즉각적이고 강력한 활성화를 유도했다 (도 3E). RhoA의 과발현은 OVCAR-3 세포에서 LPA에 의한 ERM 인산화를 강화 시켰지만, Cdc42 또는 Rac1의 과발현은 그렇지 않았다. 이러한 사실은 RohA가 ERM 인산화에 중요한 역할을 한다는 사실을 입증하는 것이다. Rho 관련 키나아제 (ROCK)는 세린 - 트레오닌 키나아제의 AGC (PKA / PKG / PKC) 계열에 속하며 GTP- 결합 활성 RhoA 25의 주요 하류 이펙터이다. LPA에 의해 유발 된 ERM 인산화는 세포 투과성 ROCK 억제제 (IC50 = 0.7 μM) 26에 의한 처리에 의해 영향을받지 않았으며, 이는 ROCK이 아니라 RhoA가 OVCAR-3 세포에서 ERM 단백질의 인산화에 관여 함을 시사한다 (그림 3E). 정리하면, LPA1, LPA2, Gα12 / 13 및 RhoA를 포함하는 경로가 LPA- 유도 ERM 인산화의 기초가된다는 것을 확인하엿다.  We have identified intracellular signaling pathways downstream of LPA1 and LPA2 leading to ERM phosphorylation. Initially, several chemical inhibitors and activators were used to target the immediate effects of GPCRs. The LPA-induced phosphorylation of the ERM protein is a chemical inhibitor of the Gαq / phospholipase C (PLC) -β / Ca2 + / PKC pathway such as U73122 (PLC inhibitor), GF109204X (pan-PKC inhibitor), GFP (Figure 3C) of the Gαs / adenylate cyclase / PKA pathway such as BAPTA-AM (intracellular Ca2 + chelator) (Figure 3A-B) or H89 and PKI (PKA inhibitor) I did. In addition, treatment with phorbol-13-myristate and forskolin (PKA activator) did not affect ERM phosphorylation. Based on these results, the present inventors concluded that the Gαq / PLC and Gαs / PKA pathways are not involved in ERA phosphorylation by LPA in OVCAR-3 cells. LPA activates small Rho GTPases such as RhoA, Cdc42 and Rac1 through Gα12 / 13 in various cell types. We investigated whether the protein was involved in LPA-induced ERM phosphorylation. LPA stimulation induced immediate and potent activation of three Rho GTPases in OVCAR-3 cells (FIG. 3E). Overexpression of RhoA enhanced ERP phosphorylation by LPA in OVCAR-3 cells, but not Cdc42 or Rac1 overexpression. This demonstrates that RohA plays an important role in ERM phosphorylation. Rho-associated kinase (ROCK) belongs to the AGC (PKA / PKG / PKC) family of serine-threonine kinases and is a major downstream effector of GTP-binding active RhoA25. LPA-induced ERM phosphorylation was not affected by treatment with the cell permeable ROCK inhibitor (IC50 = 0.7 μM) 26, suggesting that RhoA, rather than ROCK, is involved in the phosphorylation of ERM protein in OVCAR-3 cells (Figure 3E). Taken together, it has been confirmed that the pathway including LPA1, LPA2, Gα12 / 13 and RhoA is the basis for LPA-induced ERM phosphorylation.

실험예 4:　cpERM의 LPA-유도 된 막 형태 형성을 매개 확인 Experimental Example 4: mediating LPA-induced membrane morphogenesis of cpERM

본 발명자들은 LPA 자극의 유무에에 따른 ERM 단백질의세포 내 위치를 confocal을 통해 시각화 하였다. LPA 자극 전에 ERM 단백질은 원형 막 아래의 조밀 한 층에 국한되었다. LPA 자극 전에 ERM 단백질은 원형 막 아래의 조밀 한 층에 국한되어 있고, C- 말단 인산화가없는 자체 고정 단량체 또는 올리고머이다 (그림 4A). 그러나, LPA 자극 직후, ERM 단백질의 조밀 한 층은 세포 피질에서 일부 붕괴되고 단백질은 막 돌출부로 재배치된다 (도 4A : 화살표). 일관되게, LPA 자극은 특히 돌출부 내에서 cpERM 단백질의 수준을 증가시켰다 (그림 4B). Rhodamine으로 표지 된 phalloidin으로 액틴 세포 골격을 염색 한 결과 cpERM 단백질은 LPA 자극 세포의 고배율 이미지에서 명확하게 증명 된 것처럼 세포 피질에서 F-actin 기반 돌출부에서 매우 풍부해졌다 (그림 4C : 화살표). (도 4D : 화살표). cpERM 단백질이 세포 피질의 LPA에 의해 유도 된 형태 형성에 관여하는지 여부를 더 조사했다. 이를 위해 ezrin-WT 또는 인산화 결함이있는 돌연변이 체 (ezrin-T567A)를 발현하고 OVCAR-3 세포에 이들 바이러스를 감염시킨 재조합 아데노 바이러스를 생성했다 (그림 4E-F). LPA- 자극 세포에서, ezrin-WT는 cpERM 단백질이 풍부한 돌기에 적절하게 위치한다. 대조적으로, 세포 표면에 대한 ezrin-T567A의 표적화는 결함이 있었고,이 돌연변이 체의 과발현은 내재적 ERM 단백질의 인산화 및 세포 피질에 대한 그들의 표적화를 손상시켰다 (도 4G). 돌연변이 체는 LPA에 의한 대뇌 피질의 리모델링을 없애고, 활성 ERM 단백질이 LPA에 의한 세포막과 세포 골격의 재구성에 필수적임을 시사한다.The present inventors visualized the intracellular location of ERM protein with confocal according to the presence or absence of LPA stimulation. Prior to LPA stimulation, the ERM protein was confined to a dense layer beneath the circular membrane. Before LPA stimulation, the ERM protein is a self-immolative monomer or oligomer that is confined to the dense layer beneath the circular membrane and lacks C-terminal phosphorylation (Figure 4A). However, immediately after LPA stimulation, a dense layer of ERM protein is partially disrupted in the cell cortex and the protein is relocated to membrane overhangs (Fig. 4A: arrow). Consistently, LPA stimulation increased the level of cp ERM protein, especially in the protrusions (Figure 4B). Staining of the actin cytoskeleton with rhodamine-labeled phalloidin revealed that the cpERM protein was highly enriched in the F-actin-based protrusions in the cortex as evidenced in the high magnification image of LPA-stimulated cells (Fig. 4C: arrow). (Fig. 4D: arrow). We further investigated whether the cpERM protein is involved in the LPA-induced morphogenesis of the cell cortex. To this end, recombinant adenoviruses expressing ezrin-WT or a phosphorylated deficient mutant (ezrin-T567A) and infecting the OVCAR-3 cells with these viruses were generated (Fig. 4E-F). In LPA-stimulated cells, ezrin-WT is appropriately located on cpERM protein-rich protrusions. In contrast, the targeting of ezrin-T567A to the cell surface was defective and overexpression of this mutant impaired phosphorylation of the endogenous ERM protein and their targeting to the cell cortex (Fig. 4G). Mutants eliminate LPA - mediated cortical remodeling, suggesting that active ERM protein is essential for LPA - mediated cell membrane and cytoskeletal reconstitution.

실험예 5 :　LPA1 / LPA2 / cpERM 경로의 난소암 세포에서의 LPA 유도된 이동 매개의 확인.Experimental Example 5: Identification of LPA-induced migration pathway in ovarian cancer cells of LPA1 / LPA2 / cpERM pathway.

ERM 단백질은 유방 암종, 골육종 및 횡문근 육종과 같은 여러 암에서 많이 과발현되어 있으며 종양 침윤 및 전이에 관여되어있다. 상기 연구들은 난소 암 세포 이동에 LPA1 / LPA2 / cpERM 경로의 관련성을 조사하도록 이끌었다. LPA1과 LPA2가 ERM 단백질의 활성화를 중재한다는 아이디어와 일치하는 LPA3이나 LPA2의 침묵 화에 의해 OVCAR-3 세포의 화학 주성 이동이 LPA 구배로 이동하지 못했다 (도 5A-B). 또한, ezrin-T567A의 과발현은 OVCAR-3 세포의 LPA 유도 된 이동을 유의하게 손상시켰다 (도 5C-D). 이는 난소 암 세포의 이동에서 LPA1 / LPA2 / cpERM 경로의 기능적 중요성을 입증한다. ERM protein is overexpressed in many cancers such as breast, osteosarcoma, and rhabdomyosarcoma, and is involved in tumor invasion and metastasis. The studies led to investigate the association of the LPA1 / LPA2 / cpERM pathway with ovarian cancer cell migration. The chemotactic migration of OVCAR-3 cells did not migrate to the LPA gradient due to the silencing of LPA3 or LPA2 consistent with the idea that LPA1 and LPA2 mediate ERM protein activation (Fig. 5A-B). In addition, overexpression of ezrin-T567A significantly impaired LPA-induced migration of OVCAR-3 cells (Fig. 5C-D). This demonstrates the functional significance of the LPA1 / LPA2 / cpERM pathway in the migration of ovarian cancer cells.

Claims (10)

LPA1R 또는 LPA2R의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 조성물. A composition for inhibiting metastasis of cancer comprising an expression or activity inhibitor of LPA1R or LPA2R as an active ingredient. 제 1항에 있어서, 상기 LPA1R 또는 LPA2R의 발현 또는 활성 억제제는 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA 발현을 억제하는 뉴클레오티드, 또는 LPA1R 또는 LPA2R의 단백질, 또는 LPA1R 또는 LPA2R에 대한 리간드 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인, 암의 전이 억제용 약학적 조성물. The method according to claim 1, wherein the expression or activity inhibitor of LPA1R or LPA2R is a nucleotide that inhibits mRNA expression of LPA1R or LPA2R, or a protein of LPA1R or LPA2R, or an antibody that inhibits the activity of a ligand protein to LPA1R or LPA2R, Wherein the antigen-binding fragment is an antigen-binding fragment. 제 1항에 있어서, 상기 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA 발현을 억제하는 뉴클레오티드는 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클로에티드, 앱타머 (aptamer), shRNA 또는 siRNA인 것인 조성물. 2. The composition of claim 1, wherein the nucleotide that inhibits mRNA expression of LPA1R or LPA2R is an antisense oligonucleotide, aptamer, shRNA or siRNA specific to mRNA of LPA1R or LPA2R. 제 3항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 1에 염기서열로 표시되는 유전자 또는 서열번호 2에 염기서열로 표시되는 유전자인, 조성물. 4. The composition according to claim 3, wherein the siRNA is a gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. 제 1항에 있어서, 상기 암은 난소암인, 조성물. 2. The composition of claim 1, wherein the cancer is an ovarian cancer. LPA1R 또는 LPA2R 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이 억제 방법.A method of inhibiting metastasis of cancer comprising administering to a subject other than a human a pharmaceutical composition comprising an LPA1R or LPA2R inhibitor as an active ingredient. 제 6항에 있어서, 상기 LPA1R 또는 LPA2R의 발현 또는 활성 억제제는 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA 발현을 억제하는 뉴클레오티드, 또는 LPA1R 또는 LPA2R의 단백질, 또는 LPA1R 또는 LPA2R에 대한 리간드 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인, 암의 전이 억제 방법.7. The method according to claim 6, wherein the expression or activity inhibitor of LPA1R or LPA2R is a nucleotide that inhibits mRNA expression of LPA1R or LPA2R, or an antibody that inhibits the activity of a protein of LPA1R or LPA2R, or a ligand protein to LPA1R or LPA2R, Antigen binding fragment. ≪ / RTI > 제 6항에 있어서, 상기 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA 발현을 억제하는 뉴클레오티드는 LPA1R 또는 LPA2R의 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클로에티드, 앱타머 (aptamer), shRNA 또는 siRNA인 것인, 암의 전이 억제 방법.7. The method according to claim 6, wherein the nucleotide that inhibits mRNA expression of LPA1R or LPA2R is an antisense oligonucleotide, an aptamer, shRNA or siRNA specific to mRNA of LPA1R or LPA2R . 제 8항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 1에 염기서열로 표시되는 유전자 또는 서열번호 2에 염기서열로 표시되는 유전자인, 암의 전이 억제 방법.9. The method according to claim 8, wherein the siRNA is a gene represented by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. 제 1항에 있어서, 상기 암은 난소암인, 암의 전이 억제 방법.The method according to claim 1, wherein the cancer is ovarian cancer.

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