KR101680052B1 - 탄저병의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본원은 탄저병의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물, 및 이를 이용한 탄저병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
Description
본원은 탄저병의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물, 및 이를 이용한 탄저병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
탄저병은 그람 양성 간균인 탄저균(Bacillus anthracis)에 의하여 주로 가축에게 감염되나 사람에게도 발병하는 인수 공통 감염성 질환이다. 탄저균은 오래 전부터 생물학 무기로 개발되어 왔는데, 최근에는 실전에도 배치될 정도가 되어 1990년 걸프전 때와 1998년에 재외주둔 미군에 탄저 백신이 접종되는 사태에 이르렀으며, 2001년에 탄저 포자를 무기로 사용한 생화학 테러로 인해 이 질병에 대한 더욱 효과적인 대책에 관심이 집중되었다. 탄저균 감염에 의해서 발생하는 탄저병은 매우 치사율이 높은 것으로 알려져 있다.
이와 같은 탄저균의 병원성은 독소 생성 능력과 협막 형성에 의해 결정되는 것으로 알려져 있다. 이중 탄저균의 독소 생성 능력에 영향을 주는 단백질은 방어항원 (protective antigen, PA), 부종 인자 (edema factor, EF). 치사 인자 (lethal factor, LF) 임이 알려져 이들에 대한 연구가 진행 중이다. 이들 각각은 독성을 나타내지 못하나, 방어항원 (PA)과 부종 인자 (EF)가 결합하여 부종독소 (EdTx, edema toxin)를 형성하고, 방어항원 (PA)과 치사 인자 (LF)가 결합하여 치사독소 (LeTx, ethal toxin)를 형성한다. 여기서 PA는 대식세포와 같은 감염세포주 표면의 수용체 단백질 (ATR)에 결합한 후 단백질 분해효소 (furin family protease)에 의해 PA20과 PA63으로 잘리는데, 이중 PA63이 헵타머화되면서 LF 혹은 EF와 결합하여 이를 세포 내로 운반시키는 독소 단백질 운반체 (Toxin delivery channel)의 역할을 수행하는 것이 널리 보고되어 있다. 이들 복합체는 엔도시토시스 기전으로 세포 내로 들어가고 엔도좀의 pH가 낮아지면 PA63 헵타머의 구조적 변화가 생기며 엔도좀 멤브레인에 기공을 형성하고 결과적으로 LF 혹은 EF는 세포질로 유리되어 독성효과를 나타내게 된다.
현재 미국에서 승인된 인간용 탄저백신 AVA의 경우 초기 18개월 동안 6차례 연속 면역이 요구되고 면역성을 유지하기위해서 연 1회의 추가면역이 필요하다. 또한 동정되지 않은 세포성분에 의한 통증이나 부종을 수반하는 국부적인 부작용, 일부 병원성 탄저균에 대해 방어효과를 나타내지 못하는 등 문제점이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 임상시험이 진행 중인 방어항원(rPA) 백신의 경우 독소중화항체를 유도하기 때문에 탄저포자 감염 후 발아되고 세포내에서 분화되면서 분비되는 독소의 중화에 대해서는 효과적이지만 탄저포자감염 초기단계에서 포자의 발아를 차단할 수 있는 백신항원의 개발은 아직 미흡한 상황이다. 대한민국 등록특허공보 제0974485호에서 "탄저병의 치료제, 조성물 및 그의 관련 방법" 등에 대해 개시하고 있으나, 탄저포자감염 초기단계에서 포자의 발아를 효과적으로 차단할 수 있는 백신항원의 개발이 여전히 요구되고 있는 상황이다.
본원은, 면역단백체학적 접근방법을 이용하여 탄저균의 면역원을 분석하여 발견한, 탄저감염 초기단계에서 탄저포자의 발아를 저해하거나 활성을 억제할 수 있는 새로운 백신후보물질을 포함하는 약제학적 조성물 및 이를 이용한 탄저병의 예방 또는 치료방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 기술한 과제로 제한되지 않으며, 기술되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 서열목록 1 또는 서열목록 2의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 탄저병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본원의 제 2 측면은, (a) 탄저균 알킬 하이드로페록사이드 환원효소 서브유닛 C 단백질 또는 탄저균 마로닐 CoA-아실 운반 단백질 아실전달효소 단백질; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 탄저병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면 또는 제 2 측면의 약제학적 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 것을 포함하는, 탄저병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
탄저병은 포자-형성 박테리아인 탄저균(Bacillus anthracis)에 의해 유발되며, 생화학 무기로서도 사용되어 온 바 있다. 탄저병에 대한 최근의 백신들도 효과적이나, 이들은 오랜 기간 동안 연속 면역이 요구되며 종종 부작용을 유발하기도 한다. 따라서, 높은 치사율을 가지는 탄저병에 대한 향상된 백신의 개발이 최우선적으로 요구된다. 신규한 백신 후보물질들을 알아내기 위하여, 본 발명자들은 면역단백체학(immunoproteomics)적인 접근을 시도하였다. 탄저병 회복기의 기니피그 또는 인간 환자의 혈청을 이용하여, 악성 탄저균 H9401에 대한 34 개의 면역원 단백질을 식별하였다. 백신 후보물질들을 평가하기 위하여, 이들 중 여섯 종류가 재조합 단백질로서 발현되었고 생체 내(in vivo)에서 시험되었다. 두 종의 단백질, rGBAA_0345 (알킬 하이드로페록사이드 환원효소 서브유닛 C) 및 rGBAA_3990 (마로닐 CoA-아실 운반 단백질 아실전달효소)가 이어진 악성-포자 시험에서 탄저병에 대하여 부분적인 보호를 제공하였다. 게다가, rGBAA_0345와 rPA (방어항원)의 혼합백신은 탄저병 치사율에 대하여 향상된 효과를 나타내었다. 마지막으로, 본 발명자들은 GBAA_0345가 탄저병 포자 및 간균(bacilli)에 편재한다는 것을 입증하였다. 실험 결과들은 GBAA_0345가 다가(multivalent) 탄저병 백신의 요소가 될 가능성이 있다는 것을 보여주며, rPA 백신의 효과를 향상시킨다는 것을 보여준다. 본원은 탄저병 환자의 혈청을 이용하여 악성 탄저균 영양세포(vegetative cell)의 프로테옴(proteome)을 연구한 최초의 시도이다.
도 1a 내지 도 1c는 본원의 일 실시예에 따라 탄저균 영양세포 단백질을 이용하여 2차원 겔 전기영동(2DE)을 수행한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 2a 및 도 2b는 본원의 일 실시예에 따라 선별된 탄저균 백신 후보물질들의 질량분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 탄저균 추출물 및 기니피그 혈청을 이용한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 선별된 탄저균 백신 후보물질들의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 5는 본원의 일 구현예에 따른 약제학적 조성물을 이용하여 면역화된 기니피그의 탄저균 감염 생존 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 본원의 일 실시예에 따라 선별된 탄저균 백신 후보물질들의 질량분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 탄저균 추출물 및 기니피그 혈청을 이용한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 선별된 탄저균 백신 후보물질들의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 5는 본원의 일 구현예에 따른 약제학적 조성물을 이용하여 면역화된 기니피그의 탄저균 감염 생존 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는, “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.
탄저균은 그람 양성의 포자-형성 박테리아로서, 탄저병을 유발한다. 2001년에 탄저 포자를 무기로 사용한 생화학 테러로 인해 이 질병에 대한 더욱 효과적인 대책에 관심이 집중되었다. 숙주 내로 들어간 후에, 탄저 포자는 대식세포(macrophage) 내에서 발아하여 박테리아를 국소림프절들로 이동시킨다. 이들이 대식세포로부터 방출되면, 세포외의 간균들은 빠르게 증식하여, 고농도의 외독소을 분비하고, 혈류를 따라 전신으로 퍼진다. 외독소는 3 개의 구분된 단백질들로 구성되며, 독성이 없는 단량체들로서 별도로 분비된다: 방어항원(PA), 부종 인자(EF) 및 치사 인자(LF). PA가 LF 또는 EF에 결합하면 치사 독소 또는 부종 독소가 각각 형성된다. 이들 인자들의 조합은 대규모의 부종 및 장기 부전을 유발한다. PA가 면역 반응을 유도하여 이들 탄저 독소를 방어하므로, 현재 존재하는 탄저 백신의 목적 항원으로서 PA가 사용된다.
미국에서 최초로 승인된 인간용 탄저백신 AVA(anthrax vaccine adsorbed, Biothrax로도 불림)은 PA-함유 박테리아 여과액과 알루미늄 면역보조제(adjuvant)로 구성된다. 이 백신은 효과적이나, 길고 복잡한 투여 스케쥴(초기 18 개월 동안 6 차례 연속 면역 및 연 1회의 추가면역) 및 부작용 때문에 또한 한계가 있다. 부작용은 백신 내의 소량의 EF 및 LF에 의한 것으로 생각된다. 이들 두 가지 요소들 - 투여 요법 및 반응생성력(reactogenicity) - 을 고려할 때, 향상된 탄저 백신의 개발은 필수적이다. 2-세대 백신들은 미국 및 한국에서 임상적으로 실험되었으며, 재조합 PA(rPA)와 알루미늄 면역보조제로 구성된다. 몇몇 연구에서 rPA-함유 백신들이 토끼와 짧은꼬리원숭이(macaque)에서 악성 탄저-포자 시험에서 방어 효과를 보이는 것으로 나타났으나, 이 백신에 의해 생성된 항체들은 먼저 독소의 효과를 중화시킨다. 이어서, 방어 항체의 수준을 충분히 유지하기 위해서, 매년 약효 지속을 위한 주사(booster shot)가 요구된다. 더욱이, rPA가 이 백신의 주된 항원이므로, 면역화된 개체는 유전적으로 변형된 탄저균 (PA가 변형된)의 공격에는 취약하다는 단점이 있다. 이러한 문제점을 고려할 때, 변형된 탄저균에도 적용할 수 있는 더욱 효과적인 백신의 개발할 수 있는 전략이 요구된다. 이들 전략들은 신규 면역보조제, 다양한 투여 루트 또는 감염 초기에 서로 상이한 독성 인자를 타겟으로 하는 다가 백신 성분을 포함한다. 사실, rPA와 비활성화된 포자의 공동면역시의 증가된 생존률은 추가적인 백신 요소가 탄저병에 대한 향상된 면역을 제공할 수 있다는 것을 의미한다.
질병-유발 미생물의 면역원을 분석하고 확인하기 위한 면역단백체학적 접근은 2DE, 회복기 혈청의 웨스턴 블롯, 및 MS을 이용한다. 미생물 유전체 서열을 이용한 역백신학(reverse vaccinology)과의 결합은, 이 기술을 이용한 신규 백신 후보물질의 개발을 가속화시킨다. 탄저균의 경우, AVA-면역화된 인간 혈청, 피부 탄저병으로부터 살아남은 환자의 인간 혈청, 또는 과다면역 동물 혈청에 대해 반응성 있는 몇몇 면역원들이 식별되었다.
신규 탄저-백신 후보물질들을 식별하기 위해, 회복기의 기니피그(GP) 또는 탄저병을 가진 인간 환자들의 혈청을 이용하여 악성 탄저균 H9401종 (B. anthracis H9401)의 영양세포의 프로테옴을 탐색하였다. 기니피그 혈청은 악성 포자의 반복적인 감염으로부터 살아남은 동물로부터 분리하였다. 또한 한국에서 1995년 및 2000년에 발발한 피부 및/또는 소화기 탄저병에 걸린 5 명의 환자로부터 혈청을 수득하였다. 34 종의 면역원이 식별되었으며, 이 중 6 종이 재조합 기술을 이용하여 발현되고 백신 후보물질로서 생체 내에서 실험되었다. 특히, rGBAA_0345 또는 rGBAA_3990에 의해 면역화는 악성 포자 감염으로부터 기니피그를 부분적으로 보호하였으며, rGBAA_0345 및 rPA의 공동면역시에는 월등히 향상된 생존률을 나타내었다.
본원의 제 1 측면은, 서열목록 1 또는 서열목록 2의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 탄저병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 백신 조성물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 서열목록 1에 개시된 서열은 rGBAA_0345의 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 서열목록 2에 개시된 서열은 rGBAA_3990의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 서열목록 4에 개시된 서열은 rGBAA_0345의 아미노산 서열일 수 있으며, 서열목록 5에 개시된 서열은 rGBAA_3990의 아미노산 서열일 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 탄저균 방어항원(PA)을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 방어항원은 재조합 방어항원(rPA)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 방어항원은 서열목록 3의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 약제학적 조성물은 약학적 유효량에 따라 단위 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있으며, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여의 방법은 복막내, 정맥내, 근육내, 피하, 피부내, 경구, 비강, 폐내 및 직장내 투여 등을 포함하나, 이에 한정되지 않을 수 있다. 그러나 경구 투여 시 단백질은 소화되기 때문에, 조성물을 가진 유효한 약물이 경구 투여되기 위해서는 위산에 의한 분해를 막기 위하여 코팅 되거나 제형화 되어야 한다. 추가적으로, 상기 약제학적 조성물은 유효 물질을 표적세포에 운반할 수 있는 어떠한 장치를 이용하여 투여될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 약학적 유효량에 따라 투여될 수 있다. 본 명세서에서 용어“약학적 유효량”은 의학적 치료 또는 예방에 적용할 수 있는 합리적인 수혜/위험 비율(benefit/risk ratio)로 질병을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미한다. 상기 조성물의 유효용량은 질병의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 다른 요인에 의하여 결정할 수 있으며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정할 수 있다. 또한 상기 약제학적 조성물은 단독 치료제로서 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있으며, 기존의 치료제와 함께 순차적으로 또는 동시에 투여할 수도 있다. 상기 투여는 단일 또는 다중 용량으로 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 상기 서열목록 1 또는 서열목록 2의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 단백질 1 중량부에 대하여 상기 탄저균 방어항원 약 0.36 내지 1 중량부를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 상기 서열목록 1 또는 서열목록 2의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 단백질 1 중량부에 대하여 상기 탄저균 방어항원 약 0.05 내지 5 중량부, 약 0.1 내지 5 중량부, 약 0.5 내지 5 중량부, 약 1 내지 5 중량부, 약 3 내지 5 중량부, 약 0.05 내지 3 중량부, 약 0.05 내지 1 중량부, 약 0.05 내지 0.5 중량부, 약 0.05 내지 0.1 중량부, 또는 약 0.1 내지 0.5 중량부일 수 있으며, 또는 약 0.36 중량부일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 면역보조제를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 면역보조제는 수산화알루미늄 을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 면역보조제는 알하이드로겔(alhydrogel)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 생체 내에서 탄저균에 대한 항체의 생성을 유도하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 생체 내에서 탄저균 포자, 세포막 및/또는 세포질에 결합하는 항체의 생성을 유도하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 2 측면은, (a) 탄저균 알킬 하이드로페록사이드 환원효소 서브유닛 C 단백질 또는 탄저균 마로닐 CoA-아실 운반 단백질 아실전달효소 단백질; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 탄저병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 백신 조성물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 탄저균 알킬 하이드로페록사이드 환원효소 서브유닛 C 단백질 또는 탄저균 마로닐 CoA-아실 운반 단백질 아실전달효소 단백질은 각각 탄저균 H9401의 알킬 하이드로페록사이드 환원효소 서브유닛 C 단백질 또는 탄저균 마로닐 CoA-아실 운반 단백질 아실전달효소 단백질인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 탄저균 방어항원(PA)을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 방어항원은 재조합 방어항원(rPA)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 면역보조제를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 면역보조제는 수산화알루미늄을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 를 들어, 상기 면역보조제는 알하이드로겔(alhydrogel)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 생체 내에서 탄저균에 대한 항체의 생성을 유도하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 생체 내에서 탄저균 포자, 세포막 및/또는 세포질에 결합하는 항체의 생성을 유도하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면 또는 제 2 측면에 따른 약제학적 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 것을 포함하는 탄저병의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.
본원의 약제학적 조성물은 투여를 위하여 약학적으로 수용할 수 있는 담체를 포함하여 인간 또는 수의학적 용도로 제형화 할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 경구 투여 시, 예를 들어 캡슐제 또는 정제; 분말제 또는 과립제; 용제(solution), 시럽 또는 현탁제(suspension)(수성 또는 비수성 액상물 중; 식용 발포제(edible foam) 또는 휩 제형(whip formulation); 또는 유탁액제(emulsion)) 같은 별개의 단위로서 상기 약제학적 조성물을 제시할 수있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어 비경구(parental) 투여 시, 상기 약제학적 조성물은 산화방지제, 완충제, 정균제, 및 의도한 수용자의 혈액과 등장액 상태가 되도록 한 용질 등을 포함하는 수성 및 비수성 멸균 주사 용제를 포함할 수 있으며, 수성 및 비수성 멸균 현탁제는 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 주사용 용제로 이용하기에 유용한 첨가제는 예를 들어 물, 알코올, 폴리올(polyol), 글리세린 및 식물성 오일 등을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 조성물은 단위 용량(1 회분) 또는 다중 용량(수 회분) 용기로 나타낼 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 앰풀(ampoule) 및 바이알(vial)에 제시될 수 있고, 사용직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면 주사액을 만들시 필요한 물의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 조건 하에 저장할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균 분말제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 투여는 근육주사를 통한 투여인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 약제학적 조성물을 투여함으로써 생체 내에서 탄저균에 대한 항체의 생성을 유도할 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물을 투여함으로써 생체 내에서 탄저균 포자, 세포막 및/또는 세포질에 결합하는 항체의 생성을 유도할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
제 1 세대 및 제 2 세대 탄저병 백신은 PA를 주로 또는 단일 면역원으로 사용하였으나, 그 반응은 명백히 탄저균의 간균형이 탄저병 독소를 분비하는 박테리아 감염의 최종 단계의 탄저병 독혈증을 타겟으로 한다. 따라서, 탄저병 감염의 초기에 면역 반응을 일으키거나 (예를 들어, 포자의 발아) 또는 숙주의 면역세포의 박테리아 제거 활성을 증가시키는 신규한 항원의 식별이 중요하다.
여기에서 본 발명자들은 회복기의 기니피그 또는 인간 탄저병 환자의 혈청에 면역반응성인 34 개의 탄저균 단백질을 식별하기 위해 면역단백체학적인 접근방식을 사용하였다. 웨스턴 블롯 면역반응성에 기초하여(강도 및 이종간 인식), 여섯 면역원의 재조합 버전이 발현되었고 탄저병 감염 기니피그 모델에서 실험되었다. 이들 단백질들 중, rGBAA_0345의 면역화가 탄저균 H9401 포자에 대하여 가장 효과적인 방어를 제공하였다. rGBAA_0345는 알킬 하이드로페록사이드 환원효소 서브유닛 C(Ahpc)에 해당하며, 이는 유기 하이드로페록사이드를 상응하는 알코올로 환원한다. 나병균(Mycobacterium leprae)에서, AhpC는 가용성의 세포질 단백질과 결합되나 또한 세포막 부분에서도 발견된다. AhpC는 면역 반응 동안 대식 세포가 높은 수준의 반응성 산소를 생산할 때 나병균이 생존하도록 촉진하는 것으로 보인다. 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)의 AhpC는 반응성 질소 중간체(intermediate)로부터 박테리아와 인간 세포를 모두 보호한다. 헬리코박터 파이로리 감염은 AhpC에 대한 면역원성을 유발하며, AhpC에 대한 항체의 수준은 위궤양의 진전과 양의 상관관계가 있다. 최근의 논문은 rAhpC를 헬리코박터 파이로리 감염에 대한 가능성있는 후보물질로 기술하고 있다. GBAA_0345의 호모로그(homolog)는 탄저균의 세포막 부분, 세크리톰, 및 포자에서 발현된다. 기니피그, 토끼, 및 인간에서 탄저균 감염시의 이의 면역원성이 또한 보고된 바 있다. GBAA_0345는 또한 세포질 부분에도 존재하는 것으로 보고되어 있으나, 탄저균의 배양 배지에는 존재하지 않는다. 비록 GBAA_0345가 세포 밖 분비를 위한 신호 펩타이드가 존재하지 않는 것으로 예측되나, 그 효소는 포자 형성 중에 모세포의 포자 껍질에 결합할 수 있으며, 이는 탄저균 포자-감염 숙주에서 항체-반응을 유발할 수 있다. 본 발명자들의 실험에서, GBAA_0345는 탄저균의 영양세포 형태의 세포질 및 세포막 부분 및 포자를 모두 포함하는 영양세포 단백질(VCP) 분획에서 발현되었다 (도 1b 참조). 더욱이, 이 연구에서, 본 발명자들은 완전히 악성인 탄저균 포자 감염에 대하여 rGBAA_0345 및 rPA의 공동 투여에 의한 방어의 증가를 명백히 처음으로 보고하였다. 그 결과, rGBAA_0345 또는 rGBAA_0345-rPA에 의해 면역화된 기니피그는 각각 탄저균 노출로부터 부분적으로 또는 거의 완전하게 방어되었다. rGBAA_0345에 대한 항체는 포자 및 간균 모두에 결합하며, 이는 이 단백질을 이용한 백신접종이 포자 또는 영양세포에 존재하는 천연 GBAA_0345 단백질에 결합하는 항체를 생성할 수 있으며, 대식세포로부터 높은 수준의 반응성 산소가 생성되도록 하여 항체에 의해 촉진된 식세포작용에 의한 박테리아의 제거를 유발한다.
이는 탄저균 감염에 대한 숙주의 저항을 매우 강화시킨다. 이 백신의 안전성을 분석하는 첫 번째 단계로서, 본 발명자들은 백신 접종 과정에서 체중을 모니터링하였다. rGBAA_0345 그룹과 PBS 대조군 그룹 사이에 유의적인 체중 변화의 차이는 없었다. 마지막으로, rGBAA_0345의 면역반응성이 탄저병 회복기의 기니피그 및 인간 환자 모두의 혈청에서 탐지되었기 때문에, rGBAA_0345와 관련된 면역화가 효과적으로 체액성 면역 반응을 유도한 것으로 추정된다.
탄저병 감염에 대하여 부분적인 방어를 제공하는 다른 면역원은 GBAA_3990이다. 이 단백질은 FabD, 마로닐 CoA-아실 운반 단백질 아실전달효소에 해당하며, 이는 지방산의 생합성 도중에 말로네이트(마로닐-CoA로부터 유래)의 아실 운반 단백질로의 아실 전달을 촉진한다. 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에서 이 단백질의 호모로그는 마이코박테리아의 세포벽을 상대적으로 비투과성으로 만들어 숙주 대식세포에 대한 내재적인 저항성을 부여한다. 비록 rGBAA_3990 백신접종에 의해 제공되는 부분적인 방어에 대해 분자 수준의 근거를 밝히지는 않았으나, rPA와의 조합시 생존률의 증가는 rGBAA_3990의 백신 후보물질로서의 가능성을 보여준다. 외막(exosporium, BclA 및 BxpB)의 두 요소는 비록 악성-포자 감염에 대해 그 자체로서 방어를 제공하지는 않으나, 공동면역에서 rPA의 효과를 상승시키는 것으로 보고되었다.
지난 수십 년 동안, 다양한 탄저병 면역원이 면역단백체학적 접근을 통하여 확인되었다. 기존에 밝혀진 면역원의 DNA백신 또는 유전적으로 조작된 포자를 면역한 경우, 탄저병 감염으로부터 기니피그를 방어하는데 실패했다. 반면, 본 발명자들의 백신 접종 전략은 기니피그가 GBAA_0345 또는 GBAA_0345-rPA로 백신화된 경우 각각 부분적인 또는 거의 완전한 방어를 제공하였다. 이러한 차이는 백신 접종의 상이한 수단, 면역원의 상이한 형태, 및 상이한 면역 보조제를 포함하는 많은 요소들에 의한 것으로 보인다. 본 발명자들은 재조합-단백질 백신 접종을 근육 주사를 통하여 투여하였다. 이러한 노동 집약적인 접근이 많은 수의 확인된 면역원을 실험하는데 적절하지 않을 수 있으나, 백신의 가능성을 가늠하는 데에 가장 정확한 방법이다. 더욱이, 적은 용량의 rPA(예를 들어, ~28%의 방어를 제공할 수준)와의 공동면역은 면역원의 유용성을 평가하는 또다른 중요한 수단을 제공하며, 다가백신접종은 미래에 탄저병으로부터 더욱 효과적인 방어를 제공할 것이다.
이하, 본원의 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하며, 본 실시예에 의하여 본원의 범위가 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
1. 박테리아 배양 및 단백질 추출
완전한 악성, 협막형 및 독소성 탄저균 H9401종이 면역단백체학 분석에 사용되었다. 탄저균 H9401의 콜로니 하나를 배지 200 mL (0.3 w/v 효모 추출물, 0.5% w/v 포도당, 및 0.9% NaHCO3을 포함하는 0.8% w/v 영양 배지(broth))에 접종하고, 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 이후 박테리아는 수집되어 분석을 위하여 용해(lysate) 되었다. 영양세포들은 10,000 x g에서 15 분 동안 원심분리되어 수집되었다. 박테리아 펠렛은 1 M PMSF를 함유하는 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5)로 세척되고 이어서 2DE 샘플 버퍼 (7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v 3-[3-cholamidopropyl)-dimethylammonium]-1-propanesulfonate (CHAPS), 0.5% v/v ampholyte, 100 mM DTT, 120 mM Tris-HCl (pH 7.5), 및 1 × 프로테아제 저해제) 내에 재분산되었다. 박테리아 세포들은 초음파처리에 의해 용해되었고 DNase I 처리되었다 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). 가용성 단백질들이 원심분리에 의하여 수집되었고 트리클로로아세트산(Sigma, St. Louis, MO, USA) 침전에 의하여 농축되었다.
2. 혈청 준비
6주령 암컷 Hartley SPF 기니피그 (Samtaco, Osan, Korea)가 완전한 악성 종인 B. anthracis H9401의 포자에 의하여 근육주사(i.m.)를 통하여 감염되었다. 용량은 25 내지 200 포자 범위였다. 14 일 후, 동물들은 동일한 방법을 통하여 다시 감염되었다. 다시 13 일 후, 살아남은 동물들로부터 혈청을 채취하고 면역단백체학적 분석을 위하여 풀(pool) 되었다. 정상 인간 혈청의 풀(pool)된 샘플들은 Innovative Research Inc. (Peary Court Novi, MI, USA)로부터 구입하였다. 탄저병에 감염된 다섯 명의 환자의 혈청이 또한 사용되었다. 이들 환자들은 한국의 서울 또는 창녕에서 탄저병에 감염되었다. 서울에서, 환자들은 탄저병에 감염된 소의 생고기를 먹고 소화기 탄저병 진단을 받았다 (환자 1명 사망). 창녕 환자는, 오염된 소고기와 접촉하여 손에 탄저 병변을 나타내었다. 이들은 피부 탄저병 진단을 받았다. 이들 환자들 중 한 명은 구개에 병변을 가지고 있었으며, 이는 소화기 탄저병의 구강인두 형태를 나타낸다. 이들 환자들의 발병으로부터 1 주일 내의 혈청이 수집되었다. 환자의 혈청은 면역단백체학적 분석을 위하여 풀(pool) 되었다. 동물의 고통을 줄이기 위하여 국립보건연구원의 동물실험윤리위원회로부터 동물 실험 프로토콜(NIH-08-09)을 승인받았다. 동물의 사육 및 관리는 국립보건연구원의 동물실험윤리위원회의 모든 관련 가이드라인 및 요건에 따랐다. 동물들은 SPF(specific pathogen free) 및 감염실험 시설에서 사육되었고, 기니피그들은 국립보건연구원의 BL3 시설로 이동하였다. 인간 혈청과 관련된 실험들은 국립보건연구원의 기관윤리심의위원회의 규정에 따라 수행되었다.
3. 전기영동 및 웨스턴 블롯
2DE 분석을 위하여, 단백질 펠렛들이 7 M 요소(urea), 2 M 티오우레아, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 및 1% v/v 파말레이트(pharmalyte, pH 범위 4-10) 내에 재용해되었다. 단백질 (400 ㎍)이 동일한 용액으로 동일화(equilibrate)된 23-cm IPG 스트립(비선형, pH 구배 4-10, Genomine, 포항, 한국)에 적용되었다. IEF를 위하여, 샘플이 진입할 수 있도록 최초 3 시간 동안 150 내지 2500 V의 전압이 선형으로 증가하도록 적용되었다. 이어서 전압은 3500 V으로, 총 98 kVh가 되도록 유지되었다. 이어서 수행되는 IEF에서, 각각의 스트립은 ISO-DALT 2DE 시스템 (Amersham Biosciences, San Francisco, CA, USA)을 이용하여 2DE가 수행되었다. 하나의 겔이 CBB를 이용하여 염색되고, 다른 겔들의 단백질은 Hoefer-DALT 웨스턴 버티칼 버퍼 순환 챔버 내의 전기장(230 mA) 하의 PVDF 멤브레인 상으로 트리스-글리신 버퍼(25 mM 트리스, 192 mM 글리신, 20% v/v 메탄올; pH8.0) 내에서 16 내지 20 시간 동안 트랜스퍼되었다. 0.05% w/v Tween 20을 함유한 Tris-buffered saline 내의 10% w/v 탈지유를 이용하여 PVDF 멤브레인을 블로킹한 후, 멤브레인에 탄저병 환자 또는 정상 인간으로부터 수득된 풀(pool)된 혈청 각각을 적용하였다 (각각 10 ㎍/mL). 회복기의 기니피그 혈청 또는 정상 기니피그 혈청 또한 별도로 웨스턴 블롯이 수행되었다. HRP-컨쥬게이트된, 인간 IgG에 대한 염소 2차항체(Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) 및 화학 발광-생성 ECL 시약(Amersham Biosciences, San Francisco, CA, USA)을 이용하여 특이적인 결합을 탐지하였다. CBB-염색 단백질 스팟 및 웨스턴 블롯 신호를 대비적으로 비교하여, 면역반응성 단백질 스팟들이 선별되었다. VCP 샘플이 2DE에 의하여 분리되고 CBB로 염색된 결과는 도 1a에 나타나 있다. 웨스턴 블롯 분석에서, 2DE 겔의 단백질들이 PVDF 멤브레인으로 이동되고 이어서 회복기의 GP의 혈청 (도 1b) 및 탄저병 환자의 혈청 (도 1c)을 프로브로 하여 분석한 결과가 도 1b 및 도 1c에 나타나 있다. 기니피그 및 인간 프로브를 사용한 경우 각각 25 개 내지 14 개의 면역반응성 스팟들이 확인되었다. 이들 단백질을 판별하기 위하여, 각각 별개의 단백질 스팟을 함유하는 겔 절편들을 잘라 내고, 트립신을 이용하여 분리한 후, Ettan MALDI TOF Pro MS (MALDI-TOF-MS) (Amersham Biosciences, San Francisco, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. GBAA_0345의 질량분석 결과는 도 2a에, GBAA_0399의 질량분석 결과는 도 2b에 각각 나타나 있다. MALDI-TOF-MS에 의하여 단백질을 식별한 결과를 SWISS-PROT (http://expasy.org/tools/tagdent.html) 및 NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) databases with the ProFound program developed by Rockefeller University (http://prowl.rockefeller.edu/prowl-cgi/profound.exe)에서 검색하였다. 이 중, GBAA_0345 및 GBAA_3990의 정보는 하기 표 1에 나타나 있다.
4. DNA 구성체(constructs) 및 재조합 단백질의 발현
식별된 면역원들 중, GBAA_0345, GBAA_2267, GBAA_3338, GBAA_3609, GBAA_3990, 및 GBAA_4182 (B. anthracis Ames Ancestor의 유전자 위치)의 코딩 서열이 탄저균 H9501의 유전체 DNA로부터 PCR-증폭되었다. 이 반응에 사용된 프라이머들은 제한효소 인식 자리를 포함하였다. PCT은 PCR 시약 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 DNA thermal cycler (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) 내에서 수행되었다. PCR은 94℃에서 60 초, 60℃에서 60 초, 그리고 72℃에서 90 초 동안 30 사이클 수행되었다. PCR 산물은 TA-벡터(Promega, Madison, WI, USA) 내로 클로닝되었고 대장균 DH10B 컴피턴트 세포(competent cells) 내로 형질전환하였다. 백색/청색 선발 후, PCR 산물들은 각각 N-말단 His6-태그를 함유하는 pET19b(+), pET28a(+), 또는 pET30a(+) 발현 벡터 (Novagen, Madison, WI, USA) 내로 서브클로닝 되었다. 각각의 구성체는 DNA 서열분석에 의하여 확인되었고 컴피턴트 대장균 BL21 (DE3) pLys S (GBAA_2267) 또는 대장균 BL21 (DE3) (다른 모든 샘플) (Novagen, Madison, WI, USA 내로 형질전환하였다. 박테리아들은 OD600 nm = 0.6가 될 때까지 배양되었고, 1 mM IPTG 하에서 단백질 발현이 유도되었다. 세포 펠렛을 용해한 후, 각각의 재조합 단백질들이 Ni-NTA 세파로즈 컬럼(Qiagen)을 이용한 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제되었다. 정제된 단백질들은 사용할 때까지 영하 70℃에서 보관되었다.
5. 기니피그 면역화 및 생체 방어 분석
5주령 암컷 Hartley 기니피그 (Samtaco, 오산, 한국)이 그룹들로 무작위 분류되고, 다양한 양의 rPA 및/또는 재조합 항원들을 이용하여 1 일차 및 28 일차에 근육주사를 통해 면역화하였다. 항원들은 250 ㎍의 알하이드로겔(alhydrogel) 면역보조제(Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark)를 함유하는 500 ㎕의 PBS 내에 용해되었다. 250 ㎍의 알하이드로겔을 함유하는 PBS 가 음성 대조군으로 사용되었다. 마취된 기니피그는 2차 면역화 14 일 후에 심장 천공을 통하여 출혈을 발생시켰다. 각각의 항원에 대한 방어 활성을 측정하기 위하여, 면역화된 기니피그는 최종 면역화 28 일 후에 탄저균 H9401 10 LD50으로 감염되었다. 14 일 후에 살아남은 동물들을 생존 개체로 간주하였다.
6. 통계 분석
샘플 그룹들 사이의 차이점을 측정하기 위하여 로그순위법(Log-rank test)을 사용하였다. 생존 비교를 위하여, Kaplan-Meier 분석이 수행되었다. 확률값(probability value)이 p < 0.05이면 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
7. 탄저균 H9401 단백질의 면역반응성
기니피그는 악성종인 탄저균 H9401의 포자를 이용하여 반복적으로 감염되었다. 생존 동물로부터 분리된 혈청은 이어진 웨스턴 블롯 분석의 프로브로 사용되었다. 탄저균 H9401로부터 3 개의 상이한 단백질 추출물(포자 용해물, 분비된 단백질(SP), 및 영양세포 단백질(VCP))이 준비되었고, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯이 수행되었다. VCP 샘플은 회복기의 기니피그 혈청에 대하여 가장 강한 면역반응성을 나타내었으며, 상대분자량(Mr) ~22 및 80 kDa의 2 개의 주된 밴드들과 ~36, 50, 57 kDa의 3 개의 부수적인 밴드들을 각각 나타내었다 (도 3 참조 ). 100 ㎍의 SP가 2DE 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 사용된 Chitlaru 등의 이전 결과와 상반되게, 본 실험의 SP 샘플들은 웨스턴 블롯에서 인식가능한 밴드들을 많이 나타내지 않았으며, 이는 분석에 사용된 SP 단백질의 양이 적었기 때문으로 추측된다. SP 면역반응성 단백질들은 상기 그룹에 의해 심도있게 연구되었으므로, 본 발명자들은 항원-풍부 VCP 분획을 이용하여 2DE 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하는 것에 초첨을 맞추었다.
8. 면역반응성 단백질의 확인
탄저균 H9401의 VCP 추출물이 2DE를 통하여 분리되었으며, 겔이 CBB를 이용하여 염색되었다 (도 1a 내지 도 1c 참조). 여기에서 850 개 이상의 단백질 스팟들이 발견되었으며, 이들은 일차적으로 30 내지 100 kDa이었고, 4.5 내지 7.0의 pI값을 가졌다. 웨스턴 블롯에서, 기니피그 혈청-반응성 스팟들이 pI 및 Mr 모두에서 넓게 위치하였으나, 인간 탄저병 환자의 대부분의 혈청-반응성 스팟들은 Mr 40-90 kDa, pI 5-6 부근에 무리지어 있었다. 81개의 면역반응성 스팟들 (인간 혈청 23개 및 기니피그 38개)이 겔 내부 트립신 분리 및 MALDI-TOF MS로부터 확인되었다. 22 개의 스팟(인간 혈청 9개 및 기니피그 13개)은 총 확인된 34 개의 단백질의 복수의 아형(isoform)에 해당하는 것이고, 이들 중 5 개는 인간 환자 및 회복기의 기니피그 모두의 혈청에 있었다. 확인된 면역원은 1세대 백신의 여섯 개의 단백질 (GBAA_pXO1_0164, GBAA_pXO1_0172, GBAA_0885, GBAA_0887, GBAA_4035, and GBAA_5580) 및 인간 피부 탄저병 환자 에서 확인된 9 개의 단백질(GBAA_pXO1_0164, GBAA_0107, GBAA_0108, GBAA_0309, GBAA_0345, GBAA_3744, GBAA_4182, GBAA_5369, 및 GBAA_5547)을 포함하였다. 이들 14 개의 단백질들 중, 9 개의 단백질(GBAA_pXO1_0164, GBAA_pXO1_0172, GBAA_0108, GBAA_0309, GBAA_0885, GBAA_0887, GBAA_5369, GBAA_5580) 및 추가적으로 3 개의 단백질(GBAA_0344, GBAA_3338, 및 GBAA_3609)은 종래에 동물 면역원으로서 보고된 바 있었다. 마지막으로, 본 발명자들은 잠재적으로 에너지 대사, 단백질 합성, 및 지방산 합성의 기능이 있는, 신규한 17 개의 탄저병 면역원을 확인하였다.
9. 백신 후보물질의 선별 및 발현
면역원 목록으로부터, 가장 가능성있는 백신 타겟으로서 8 개의 단백질이 추가적인 분석을 위하여 선별되었다. 기니피그 및 인간 모두에 면역 반응성을 가지는 단백질이 백신 타겟을 선별하기 위한 가장 중요한 요소 중 하나로 고려되었으므로, 기니피그 및 인간 혈청 모두에서 공동으로 확인되는 3 종의 단백질 (GBAA_0309, GBAA_3338, 및 GBAA_4182)들이 선택되었다. 비록 인간과 기니피그의 감염 히스토리는 상이하나, 이들의 공통된 면역원이 탄저병에 대한 보편적인 타겟이 될 수 있을 것으로 추측되었다. 다른 5 종의 단백질 (기니피그 혈청으로부터 GBAA_0067, GBAA_0345, 및 GBAA_3990; 인간 혈청으로부터 GBAA_2267, 및 GBAA_3609)들이 농도계에 의한 웨스턴 블롯 대 CBB 염색의 신호 강도에 따라 선택되었다. 8 개의 타겟 중 GBAA_0067 및 GBAA_0309를 제외한 6 개의 타겟들의 재조합 형태들이 대장균 pET 시스템을 이용하여 성공적으로 발현되었다. 다섯 단백질들은 가용 형태로 생성되어 분비되었으나, rGBAA_3990는 봉입체(inclusion body) 내에서 발견되었다. 모든 여섯 종의 단백질들이 정제되었다. rGBAA_0345 및 rGBAA_3990의 정제 및 웨스턴 블롯 분석 결과가 도 4에 나타나 있다.
10. 기니피그에서 후보 단백질들의 방어 효과
각각의 정제된 재조합 단백질들에서, 기니피그를 이용한 생체 내 방어 분석을 수행하였다. 동물들은 재조합 단백질을 이용하여 4 주 간격을 두고 2 회 면역화되었으며, 알하이드로겔 (250 ㎍)을 면역보조제로 사용하였다. 기니피그는 또한 각각 양성 대조군과 음성 대조군으로서 rPA(5 ㎍) 또는 PBS 주입(vehicle)에 의하여 면역화되었다. 2차 면역 4 주 후, 동물들은 10 LD50의 악성 탄저균 H9401 포자에 감염되었으며, 14 일 동안 생존을 모니터링하였다. PBS만 주입된 동물은 모두 사망하였으나, rPA를 주입받은 동물들은 생존하였다. rGBAA_0345 또는 rGBAA_3990는 각각 33% 및 17% 생존률을 보였다 (하기 표 2 참조). 다른 재조합 단백질들은 탄저균 감염에 대하여 방어 효과를 나타내지 않았다.
방어 효과를 나타낸 두 재조합 단백질들은 이어서 rPA와의 조합으로 실험되었다. 기니피그는 1.8 ㎍의 rPA로 면역화되었으며, 이는 5 ㎍의 재조합 단백질과 250 ㎍의 알하이드로겔과 함께 사용되었을 때 차선의(suboptimal) 생존률을 나타내었다. rPA-면역화된 그룹이 28%(5/18)의 생존률을 보인 것과 비교하였을 때, rPA와 rGBAA_0345 (즉, rGBAA_0345-rPA)로 면역화된 그룹은 10 LD50의 악성 탄저균 H9401 포자 감염 후 현저하게 향상된 94%의 생존률을 보였다 (17/18; p=0.0001). 반면, rGBAA_3990-rPA 그룹은 65%(13/20; p=0.0166)의 생존률을 보였다. 면역원성의 분석을 위하여, 2차 면역 2 주 후 약간의 혈액을 분리하였다. 동일한 그룹의 각각의 혈청은 풀(pool) 되고 ELISA로 분석하여 각각의 재조합 항원에 역가인 특정 IgG를 측정하였다. 2가(bivalent) 백신접종 그룹의 항-rPA 항체의 종점(endpoint) 역가는 일가(monovalent) rPA 그룹만큼 높았으며, 이는 rPA의 면역원성이 다른 항원의 존재에 의하여 억제되지 않았음을 의미한다. 특히, rGBAA_0345 및 rPA로 구성된 2가 백신은 악성 탄저균 H9401 포자에 대한 현저히 향상된 저항성을 부여하였다.
도 5는 악성 탄저균 H9401 포자 감염에 따른 백신 접종된 기니피그의 생존 커브이다. Hartey 기니피그 (n=그룹당 18~20)들은 해당 단백질 또는 단백질의 조합을 이용하여 근육주사를 통하여 면역화되었다. 250 ㎍의 알하이드로겔을 포함하는 PBS가 대조군으로 사용되었다. 최종 면역접종 후에, 기니피그들은 10 LD50의 탄저균 H9401의 포자를 근육주사하여 감염되었다. 기니피그들의 생존은 14 일 동안 관찰되었으며, 생존 커브는 Kaplan-Meier 분석에 의하여 수득되었다 (*p<0.05, ***p < 0.0005).
인간 혈청을 웨스턴 블롯의 프로브로서 사용했을 때 2DE 분석에서 rGBAA_0345는 탐지되지 않았다 (도 1c 참조). 인간 감염에서의 rGBAA_0345의 항원성을 확인하기 위하여, 탄저병 환자의 혈청을 프로브로 이용하여 VCP와 rGBAA_0345에서 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. VCP 샘플에서 천연 GBAA_0345는 탐지되지 않았으나, rGBAA_0345 특이적인 신호는 탐지되었다. 탄저병 환자의 혈청은 GBAA_0345에 대한 항체를 포함한다. 프로브로서 일반 혈청이 사용되었을 때는, VCP 또는 rGBAA_0345 샘플에서 신호가 탐지되지 않았다.
11. GBAA_0345의 편재 (localization)
종래의 연구에서, GBAA_0345는 탄저균의 세포막 부위, 세크리톰(secretome) 및 포자의 단백질체에서 발견되었다. GBAA_0345 단백질의 편재를 확인하기 위하여, rGBAA_0345에 특이적인 항체를 제조하였다. 이 시약을 이용하여, 공초점 레이저 주사 현미경 및 투과 전자 현미경을 이용하여, 탄저균의 포자 및 간균 모두에서 GBAA_0345를 탐지하였으며, 일반 혈청에서는 특이적인 결합을 보이지 않았다. 이는 rGBAA_0345를 이용한 면역화는 포자 및 영양세포 모두에 결합하는 항체를 생성할 수 있다는 것을 의미하며, 따라서 식세포에 의해 탄저병 감염 위험을 경감할 수 있을 것이다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION GREEN CROSS CORPORATION
<120> PHAMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF ANTHRAX
<130> 0000
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 564
<212> DNA
<213> Bacillus anthracis
<400> 1
atgttattaa tcggcacaga agtaaaaccg tttaaagcta atgcttacca taatggagaa 60
tttatccaag ttactgacga aagtttaaaa ggaaaatgga gtgtagtttg tttctaccca 120
gctgacttca cattcgtttg cccaactgaa cttgaagact tacaaaacca atatgcaact 180
cttaaagagt taggcgttga agtatactct gtatctacag acactcactt cactcacaaa 240
gcatggcatg atagctcaga aactatcggt aaaatcgagt acatcatgat tggtgaccca 300
actcgcacaa tcactacaaa cttcaacgtt ttaatggaag aagaaggtct tgctgctcgt 360
ggtacattca tcatcgatcc agacggtgtt atccaatcta tggaaatcaa tgctgacggt 420
atcggccgtg acgcaagcat tcttgttaac aaaattaaag cagctcaata cgtacgtaac 480
aacccaggtg aagtttgccc agctaaatgg caagagggtt ctgctacact taaaccaagc 540
cttgaccttg taggcaaaat ctaa 564
<210> 2
<211> 945
<212> DNA
<213> Bacillus anthracis
<400> 2
atgggaaaac tagcatttct ttttccgggc caaggttcac aggcagttgg aatgggtaaa 60
cagttagcag agaataataa agaggttgca aatgtatttg caaaagcaga tgaagtgttg 120
caagattcac tttcagaagt gatttttgaa gggtcgcagg aaaagcttac gttaacgaca 180
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gatattacac cagactttgt cgcagggcat agtttaggtg agtatagcgc tcttgtagca 300
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atgctgaaac gagttacaga agaggtaaca ggtgaagggt atgcagtaca aatcgctaat 480
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cactctgcgc ttatgaagcc agcagcggag aaattccaaa gtgtcttaaa tgaaattaca 660
attcaagata caaatattcc ggtaatcgca aatgtaacag cagacgttat tacaagtggt 720
gcgcatattc aagaaaagct aatcgaacag ctctactcgc ctgtcttatg gtacccatcc 780
attgaatata tggtgaatca aggggtcgat acatttattg aaattggacc tgggaaagta 840
cttgctggac ttatgaagtc aattgattca tcagtgaaag catacgcgat atacgatgaa 900
gagacattaa aagataccat ttcaaatttg agaggagaaa actga 945
<210> 3
<211> 764
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 3
Met Lys Lys Arg Lys Val Leu Ile Pro Leu Met Ala Leu Ser Thr Ile
1 5 10 15
Leu Val Ser Ser Thr Gly Asn Leu Glu Val Ile Gln Ala Glu Val Lys
20 25 30
Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser Ser Ser Gln Gly Leu
35 40 45
Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn Phe Gln Ala Pro Met Val Val
50 55 60
Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp Leu Ser Ile Pro Ser Ser Glu Leu Glu
65 70 75 80
Asn Ile Pro Ser Glu Asn Gln Tyr Phe Gln Ser Ala Ile Trp Ser Gly
85 90 95
Phe Ile Lys Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr Phe Ala Thr Ser Ala
100 105 110
Asp Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gln Glu Val Ile Asn Lys
115 120 125
Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg Leu Tyr Gln
130 135 140
Ile Lys Ile Gln Tyr Gln Arg Glu Asn Pro Thr Glu Lys Gly Leu Asp
145 150 155 160
Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gln Asn Lys Lys Glu Val Ile Ser
165 170 175
Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu Leu Lys Gln Lys Ser Ser Asn Ser
180 185 190
Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro Asp Arg Asp
195 200 205
Asn Asp Gly Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp
210 215 220
Val Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser Asn Ile His
225 230 235 240
Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu Lys Trp Ser
245 250 255
Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile
260 265 270
Asp Lys Asn Val Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Tyr
275 280 285
Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser Lys Asn Glu
290 295 300
Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr Ile Ser Lys
305 310 315 320
Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn Ala
325 330 335
Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly
340 345 350
Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His Ser Leu Ser
355 360 365
Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr Ala
370 375 380
Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn Thr Gly Thr
385 390 395 400
Ala Pro Ile Tyr Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly Lys
405 410 415
Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln Leu Ser Gln
420 425 430
Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile
435 440 445
Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met Asn
450 455 460
Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu Arg Leu Asp
465 470 475 480
Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe Glu Asn Gly
485 490 495
Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val Leu Pro Gln
500 505 510
Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn
515 520 525
Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Glu
530 535 540
Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ala Phe
545 550 555 560
Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly Lys Asp Ile
565 570 575
Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln Asn Ile Lys
580 585 590
Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr Val Leu Asp
595 600 605
Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg Asp Lys Arg
610 615 620
Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val
625 630 635 640
Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu
645 650 655
Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile
660 665 670
Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg
675 680 685
Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe
690 695 700
Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn
705 710 715 720
Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile
725 730 735
Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys
740 745 750
Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly
755 760
<210> 4
<211> 187
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 4
Met Leu Leu Ile Gly Thr Glu Val Lys Pro Phe Lys Ala Asn Ala Tyr
1 5 10 15
His Asn Gly Glu Phe Ile Gln Val Thr Asp Glu Ser Leu Lys Gly Lys
20 25 30
Trp Ser Val Val Cys Phe Tyr Pro Ala Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro
35 40 45
Thr Glu Leu Glu Asp Leu Gln Asn Gln Tyr Ala Thr Leu Lys Glu Leu
50 55 60
Gly Val Glu Val Tyr Ser Val Ser Thr Asp Thr His Phe Thr His Lys
65 70 75 80
Ala Trp His Asp Ser Ser Glu Thr Ile Gly Lys Ile Glu Tyr Ile Met
85 90 95
Ile Gly Asp Pro Thr Arg Thr Ile Thr Thr Asn Phe Asn Val Leu Met
100 105 110
Glu Glu Glu Gly Leu Ala Ala Arg Gly Thr Phe Ile Ile Asp Pro Asp
115 120 125
Gly Val Ile Gln Ser Met Glu Ile Asn Ala Asp Gly Ile Gly Arg Asp
130 135 140
Ala Ser Ile Leu Val Asn Lys Ile Lys Ala Ala Gln Tyr Val Arg Asn
145 150 155 160
Asn Pro Gly Glu Val Cys Pro Ala Lys Trp Gln Glu Gly Ser Ala Thr
165 170 175
Leu Lys Pro Ser Leu Asp Leu Val Gly Lys Ile
180 185
<210> 5
<211> 314
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 5
Met Gly Lys Leu Ala Phe Leu Phe Pro Gly Gln Gly Ser Gln Ala Val
1 5 10 15
Gly Met Gly Lys Gln Leu Ala Glu Asn Asn Lys Glu Val Ala Asn Val
20 25 30
Phe Ala Lys Ala Asp Glu Val Leu Gln Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile
35 40 45
Phe Glu Gly Ser Gln Glu Lys Leu Thr Leu Thr Thr Asn Ala Gln Pro
50 55 60
Ala Leu Leu Thr Thr Ser Phe Ala Ile Leu Thr Ala Leu Lys Glu Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Thr Pro Asp Phe Val Ala Gly His Ser Leu Gly Glu Tyr Ser
85 90 95
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100 105 110
Val Arg Lys Arg Gly Glu Tyr Met Glu Glu Ala Val Pro Gly Gly Glu
115 120 125
Gly Ala Met Ala Ala Ile Leu Gly Ala Asp Pro His Met Leu Lys Arg
130 135 140
Val Thr Glu Glu Val Thr Gly Glu Gly Tyr Ala Val Gln Ile Ala Asn
145 150 155 160
Met Asn Ser Thr Lys Gln Ile Val Ile Ser Gly Thr Lys Gln Gly Val
165 170 175
Glu Ile Ala Ser Gln Arg Ala Lys Glu Asn Gly Ala Lys Arg Ala Ile
180 185 190
Pro Leu Lys Val Ser Gly Pro Phe His Ser Ala Leu Met Lys Pro Ala
195 200 205
Ala Glu Lys Phe Gln Ser Val Leu Asn Glu Ile Thr Ile Gln Asp Thr
210 215 220
Asn Ile Pro Val Ile Ala Asn Val Thr Ala Asp Val Ile Thr Ser Gly
225 230 235 240
Ala His Ile Gln Glu Lys Leu Ile Glu Gln Leu Tyr Ser Pro Val Leu
245 250 255
Trp Tyr Pro Ser Ile Glu Tyr Met Val Asn Gln Gly Val Asp Thr Phe
260 265 270
Ile Glu Ile Gly Pro Gly Lys Val Leu Ala Gly Leu Met Lys Ser Ile
275 280 285
Asp Ser Ser Val Lys Ala Tyr Ala Ile Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Lys
290 295 300
Asp Thr Ile Ser Asn Leu Arg Gly Glu Asn
305 310
Claims (15)
- 서열목록 1 또는 서열목록 2의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 단백질;
서열목록 3의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 탄저균 방어항원(PA); 및
약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 탄저병 치료용 약제학적 조성물로,
상기 서열목록 1 또는 서열목록 2의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 단백질 1 중량부에 대하여 상기 탄저균 방어항원 0.36 내지 1 중량부인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
면역보조제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물. - 제 4 항에 있어서,
상기 면역보조제는 수산화알루미늄을 포함하는 것인, 약제학적 조성물. - 제 1 항에 있어서,
생체 내에서 탄저균에 대한 항체의 생성을 유도하는, 약제학적 조성물. - (a) 탄저균 알킬 하이드로페록사이드 환원효소 서브유닛 C 단백질 또는 탄저균 마로닐 CoA-아실 운반 단백질 아실전달효소 단백질;
(b) 서열목록 3의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 탄저균 방어항원(PA); 및
(c) 약제학적으로 허용되는 담체
를 포함하며,
상기 탄저균 알킬 하이드로페록사이드 환원효소 서브유닛 C 단백질 또는 탄저균 마로닐 CoA-아실 운반 단백질 아실전달효소 단백질 1 중량부에 대하여 상기 탄저균 방어항원은 0.05 내지 5 중량부인 것을 특징으로 하는, 탄저병 치료용 약제학적 조성물. - 제 7 항에 있어서,
상기 탄저균 알킬 하이드로페록사이드 환원효소 서브유닛 C 단백질 또는 탄저균 마로닐 CoA-아실 운반 단백질 아실전달효소 단백질은 각각 탄저균 H9401의 알킬 하이드로페록사이드 환원효소 서브유닛 C 단백질 또는 탄저균 마로닐 CoA-아실 운반 단백질 아실전달효소 단백질인 것인, 탄저병 치료용 약제학적 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제 7 항에 있어서,
면역보조제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물. - 제 11 항에 있어서,
상기 면역보조제는 수산화알루미늄을 포함하는 것인, 약제학적 조성물. - 제 7 항에 있어서,
생체 내에서 탄저균에 대한 항체의 생성을 유도하는, 약제학적 조성물. - 제 1 항, 제 4항 내지 8항, 제 11항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 것을 포함하는, 탄저병 치료 방법.
- 제 14 항에 있어서,
상기 투여는 근육주사를 통한 투여인 것인, 탄저병 치료 방법.
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KR1020140128929A KR101680052B1 (ko) | 2014-09-26 | 2014-09-26 | 탄저병의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물 |
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KR20160036828A KR20160036828A (ko) | 2016-04-05 |
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ID=55800096
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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KR1020140128929A KR101680052B1 (ko) | 2014-09-26 | 2014-09-26 | 탄저병의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물 |
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-
2014
- 2014-09-26 KR KR1020140128929A patent/KR101680052B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
Title |
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GenBank: CP001215.1(2014.01.31.)* |
Identification of the immunogenic spore and vegetative proteins of Bacillus anthracis vaccine strain A16R, PLoS One., 8(3):e57959, 1-10(2013.)* |
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Publication number | Publication date |
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