KR101908659B1 - 인삼열매로부터 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼열매 내에 존재하는 진세노사이드 기질을 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase) 또는 이들의 혼합 효소로 처리하여 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 제조방법은 인삼열매 내에 포함된 다수의 기질을 효과적으로 분해하여 생체 이용률이 높은 다양한 희귀 진세노사이드의 함량을 효과적으로 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법으로 제조된 희귀 진세노사이드 소재는 흡수도와 효능이 우수하여 건강기능식품이나 화장품 원료 등으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법으로 제조된 희귀 진세노사이드 소재를 순도가 높은 단일 성분으로 분리하면 의약품 원료 등으로도 사용될 수 있다.

Description

인삼열매로부터 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법{Method for producing rare ginsenosides from ginseng berry}

본 발명은 인삼열매로부터 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 인삼열매의 착즙액 또는 인삼열매의 추출액을 특정 효소로 처리하여 인삼에 존재하지 않은 희귀 진세노사이드를 새롭게 생성하거나 인삼에 미량으로 존재하는 희귀 진세노사이드의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 한반도가 원산인 우리나라의 특유의 약용식물로 2,000여년 전부터 널리 사용되어 왔다. 인삼의 반복적인 습열 처리와 건조를 거쳐 제조한 홍삼은 약효가 뛰어난 미량 진세노사이드가 새롭게 생성되어 인삼과는 다른 활성을 나타낸다. 인삼의 생리 활성에 대한 연구로부터 인삼의 여러 약리적 효과들은 주로 그 핵심성분인 인삼 특유의 사포닌, 즉 진세노사이드(ginsenoside) 때문인 것으로 알려져 있다. 진세노사이드는 탄소 수가 30개인 triterpene 골격에 글루코스, 아라비노스, 람노스 등 당이 붙어 있는 배당체 구조이며 그 골격에 따라 protopanaxadiol(PPD) 계열과 protopanaxatriol(PPT) 계열로 구분된다. 다른 배당체들과 마찬가지로 인삼 배당체인 진세노사이드는 섭취 후 소화과정에서 장관에 존재하는 미생물이 보유한 분해효소에 의해 당을 제거하는 탈당과정을 거쳐야 체내 흡수가 용이하다. 식약처 조사 결과 한국인의 상당수는 장관에 당 분해효소의 활성이 없거나 매우 약하여 인삼의 효능을 제대로 제공받지 못하는 것으로 보고되었다.

따라서 개인 간의 진세노사이드 흡수율 및 효능의 차이를 최소화시키고 진세노사이드의 효과를 극대화시키기 위해서는 고분자 배당체를 섭취 전에 저분자화 시켜 체내 흡수율을 높이는 것이 바람직하며 이에 대한 연구가 다양하게 이루어지고 있다. 예를 들면, 최근 열 처리, 산/염기 처리 등의 물리적 화학적 처리법보다는, 반응에 따른 다양한 전환이 가능하고 특정 저분자 배당체를 선택적으로 생산할 수 있는 미생물이나 효소를 이용한 생물학적 처리방법에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 지금까지 이들 진세노사이드를 연구하는데는 주로 인삼의 지하부인 뿌리를 이용하여 왔다. 그러나 최근 연구를 통해 인삼 지하부인 인삼근 외에도 인삼 엽 및 인삼열매 등 지상부에도 진세노사이드의 함량이 높은 것으로 알려졌다(Attele AS et al, Biochem Pharmacol, 58; 1685-1693, 1999). 인삼은 대개 4~6년근을 수확하여 건삼, 홍삼 및 이를 이용한 각종 제품들로 상품화되며, 그 과정에서의 인삼의 잎과 열매는 폐기물로 취급되어 왔다.

인삼열매는 조 사포닌 함량이 중량 g 당 240㎎ 이상으로 6년근 인삼의 중량 g당 80㎎에 비해 3배 정도 높아 사포닌 생산에 좋은 자원으로 평가된다. 그러나 인삼 재배농가에서는 6년근 재배 시 인삼근의 성장을 촉진하고 종자를 확보하기 위해 4년생 때 종자를 수확하고 3년생, 5년생, 6년생 때는 종자를 받지 않고 꽃대뿐 아니라 줄기부터 원천적으로 모두 제거하여 연간 3천여 톤의 열매가 버려지고 있다. 인삼근의 진세노사이드는 재배토양과 기후조건에 따라 성분을 달리하는 반면 인삼열매의 경우 조성과 함량 차이가 적은 것으로 알려져 있다. 인삼열매는 높은 사포닌 함량으로 인해 최근 음료 등으로 개발되고 있고 인삼열매 추출물은 남성 성기능 개선(대한민국 등록특허 제10-1241050호), 파킨슨병/알츠하이머 예방 및 치료(대한민국 등록특허 제10-1581497호), 제2형 당뇨병 치료(대한민국 등록특허 제10-1484502호)와 관련된 여러 활성을 가지는 것으로 보고되고 있다. 최근 인삼열매로부터 활성 효과가 뛰어난 사포닌을 회수하는 방법이 연구되고 있다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 제10-1330935호에는 인삼열매로부터 과육을 탈피하여 인삼과육액을 제조하는 단계; 상기 인삼과육액을 초음파에 30분 내지 2시간 동안 방치하여 인삼열매 과육 성분을 용출시킨 후 원심분리하는 단계; 상기 원심분리된 상층액을 여과하는 단계; 및 상기 여과액을 분자량 1000 내지 2000 크기로 한외여과하여 물, 이온성 물질 및 수용성 저분자 물질을 제거하고 15 내지 30%로 농축액을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Re가 강화된 인삼열매 추출물의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1416669호에는 1 중량부의 인삼 열매를 5~300 중량부의 증류수에 넣고, 35분~45분 범위 내의 시간 동안 90℃~110℃ 범위 내의 온도에서 초음파 처리하는 단계; 및 상기 초음파 처리한 인삼 열매를 감압하에 농축시키고 동결 건조하는 단계;를 포함하여, 진세노사이드 Rg2, Rg3, Rh1, Rk1 및 F4의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 인삼 열매 제제의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1051519호에는 인삼열매를 증숙한 후 인삼열매의 수분함량이 12±3%가 되도록 건조하여 분쇄하는 단계와; 상기 분쇄된 인삼열매 분말을 수용성 용매 또는 수용성 용매와 유기 용매가 혼합된 용매에 용해시켜 알파-갈락토시다제, 펙티나제, 셀룰라제, 락타제 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상과 효소 반응시키는 단계와; 상기 효소반응된 조성물에 EM(Effective Micro-organisms) 발효함초액을 혼합하여 추출하는 단계를 포함함을 특징으로 인삼열매 추출물의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1182741호에는 Aspergillus niger KCCM 11239 균주 유래의 분자량 123 kDa 이며 최적 온도안정성 70℃, 최적 PH 안정성 4.0인 β-glucosidase 효소를 이용함을 특징으로 하는 인삼 사포닌 성분 ginsenoside Rb1 을 Rd, F2 및 Rg3으로 생물전환하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-0443411호에는 페니실리움 속 또는 유박테리움 속 유래 베타글리코시다제(β-glycosidase)를 이용하여 진세노사이드 Re 또는 진세노사이드 Rg1으로부터 진세노사이드 F1을 제조하는 방법이 개시되어 있다.

본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 인삼열매로부터 생리활성이 우수한 희귀 진세노사이드를 효과적으로 제조하는 방법을 제공하는데에 있다.

본 발명자들은 인삼열매가 희귀 진세노사이드를 생산하는데 필요한 유효 기질인 진세노사이드 Rd와 Rd 등을 충분히 보유하고 있다는 점과 인삼열매에 존재하는 진세노사이드를 특정 효소 단독 또는 특정 효소들의 조합으로 처리하면 다양한 희귀 진세노사이드를 생산할 수 있다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 해결하기 위하여 본 발명은 인삼열매 착즙액, 인삼열매 추출액, 인삼열매 과육 착즙액, 인삼열매 과육 추출액 또는 이들의 농축액을 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase) 또는 이들의 혼합 효소와 반응시켜 희귀 진세노사이드의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 인삼열매로부터 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법은 인삼열매 내에 포함된 다수의 기질을 효과적으로 분해하여 생체 이용률이 높은 다양한 희귀 진세노사이드의 함량을 효과적으로 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법으로 제조된 희귀 진세노사이드 소재는 흡수도와 효능이 우수하여 건강기능식품이나 화장품 원료 등으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법으로 제조된 희귀 진세노사이드 소재를 순도가 높은 단일 성분으로 분리하면 의약품 원료 등으로도 사용될 수 있다.

도 1은 성숙 인삼열매 착즙 농축액을 정제 DT-BGL 및 정제 CS-BGL과 반응시켰을 때 반응 생성물내 진세노사이드의 함량 변화를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 본 발명에서 사용되는 용어인 '희귀 진세노사이드'는 인삼에 미량으로 존재하거나 별도의 물리적, 화학적 또는 생물학적 처리를 통해 새롭게 생성된 진세노사이드를 모두 포함하는 개념이다.

본 발명은 인삼열매로부터 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 희귀 진세노사이드의 제조방법은 인삼열매로부터 얻은 진세노사이드 함유 기질을 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase) 또는 이들의 혼합 효소와 반응시키는 것으로 구성된다. 구체적으로 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 희귀 진세노사이드의 제조방법은 인삼열매 착즙액, 인삼열매 추출액, 인삼열매 과육 착즙액, 인삼열매 과육 추출액 또는 이들의 농축액을 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase) 또는 이들의 혼합 효소와 반응시키는 것으로 구성된다.

상기 인삼열매의 공급원인 인삼은 품종, 원산지 등이 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 상기 인삼열매는 고려인삼의 청경, 연풍, 선풍, 청선, 천량, 고풍, 금풍, 선원, 선향 등과 같이 다양한 품종에서 선택되는 인삼의 열매를 사용할 수 있고 삼칠삼, 전칠삼, 미국삼, 중국삼, 베트남삼, 죽절삼 등과 같이 다양한 원산지에서 선택되는 인삼을 열매를 사용할 수도 있다.

또한, 상기 인삼열매는 미성숙 열매 또는 성숙 열매에서 선택될 수 있으며, 인삼열매에 존재하는 진세노사이드의 조성비를 고려할 대 성숙 열매인 것이 바람직하다.

또한, 상기 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 인삼열매에 존재하는 진세노사이드의 희귀 진세노사이드로의 전환시 반응 효율 및 생성되는 희귀 진세노사이드의 생리 활성과 다양성 등을 고려할 때 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 클로스트리디움 스테르코라리움(Clostridium stercorarium)에서 유래하는 것이 바람직하고, 클로스트리디움 스테르코라리움 아종 스테르코라리움(Clostridium stercorarium subsp. stercorarium) DSM 8532 균주로부터 유래하는 것이 더 바람직하다. 상기 클로스트리디움 스테르코라리움 아종 스테르코라리움(Clostridium stercorarium subsp. stercorarium) DSM 8532 균주로부터 유래하는 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된다.

또한, 상기 헤미셀룰라아제(hemicellulase)는 식물 세포벽 구성성분인 자일란, β-1,3-1,4-글루칸, 자일로글루칸, 글루코만난 등을 분해하는 효소에서 선택되며, 바람직하게는 자일라나아제(xylanase), 갈락타나아제(galactanase), 만나나아제(mannanase) 또는 아라비나아제(arabinase)로부터 선택되는 1종 이상으로 구성되고, 인삼열매에 존재하는 진세노사이드에 대한 기질 이용성과 희귀 진세노사이드의 전환 효율 그리고 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)와의 조합에 의한 상승 작용 등을 고려할 때 자일라나아제(xylanase)와 갈락타나아제(galactanase)의 조합인 것이 바람직하다.

또한, 상기 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)와 헤미셀룰라아제(hemicellulase)의 혼합 효소에서 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 대 헤미셀룰라아제(hemicellulase)의 혼합 중량비는 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 0.1:99.9 내지 99.9:0.1에서 선택될 수 있다. 다만, 효소 처리에 의한 희귀 진세노사이드의 함량 증가 수준을 고려할 때 상기 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 대 헤미셀룰라아제(hemicellulase)의 혼합 중량비는 1:4 내지 4:1인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 의해 반응 후 함량이 증가하는 희귀 진세노사이드는 Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2, F2, Compound Mc, Compound K 또는 Compound Y에서 선택되는 1종 이상이고, 바람직하게는 Rg3, Rh1, Rh2, F2, Compound Mc, Compound K 또는 Compound Y에서 선택되는 1종 이상이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.

1. 인삼열매 착즙액의 제조 및 진세노사이드 조성 분석

포천지역 농가로부터 7월 말에 채취한 미성숙 인삼열매 1종과 8월 말에 채취한 성숙 인삼열매 1종을 각각 40㎏씩 공급받아, 종자를 제거하지 않은 상태로 압착하여 인삼열매 착즙액을 제조하였다. 상기 미성숙 인삼열매는 표피가 주로 초록색을 띠어 GBG(ginseng berry green)로 명명하고 성숙 인삼열매는 표피가 완연한 적색을 나타내어 GBR(ginseng berry red)로 명명한다. 이후, 인삼 착즙액을 15배 정도 농축하여 고형분 농도가 약 60 브릭스(brix)인 인삼열매 착즙 농축액을 제조하였다.

인삼열매 착즙 농축액 10g씩을 메탄올에 5배수로 희석하고, 0.2 ㎛ membrane filter로 여과하여 얻은 여과액을 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 분석용 시료로 사용하였다. 하기에 HPLC 분석 조건을 나타내었다.

* 전체 시스템 : Agilent 1200 HPLC 시스템

* 검출기 및 분석 파장 : UV detector, 203㎚

* 이동상 용매 : Acetonitrile (용매 A)와 물 (용매 B)

* 이동상 용매의 농도 구배 : 용매 A의 비율을 초기 25%로 시작하고 총 45분에 걸쳐 100%가 될 때가지 점진적으로 증가시킴

* 표준품 : Facechem사와 Sigma사에서 구매하여 사용

하기 표 1은 GBG 착즙 농축액과 GBR 착즙 농축액의 진세노사이드 조성을 HPLC로 분석한 결과이다. GBG 착즙 농축액과 GBR 착즙 농축액의 총 진세노사이드 함량은 각각 중량 g 당 135.34㎎ 및 174.32㎎ 이었다. GBG 착즙 농축액에서는 진세노사이드 Rd 함량이 가장 높았고, GBR 착즙 농축액에서는 진세노사이드 Re 함량이 가장 높게 나타났다. 이후 실험에서는 효소 반응의 기질로 GBR 착즙 농축액을 사용하였다.

진세노사이드 구분	GBG 착즙 농축액(㎎/g)	GBR 착즙 농축액(㎎/g)
Rb1	8.35	14.75
Rb2	5.15	9.6
Rb3	5.94	10.2
Rc	10.68	12.96
Rd	47.46	38.28
Re	39.48	61.36
Rf	1.21	1.34
Rg1	8.67	9.9
Rg2	6.32	12.3
Rg3	0.45	0.53
Rh1	0.97	1.09
Rh2	0.0	0.0
F1	0.0	0.0
F2	0.0	0.0
Compound Mc	0.0	0.0
Compound Mc1	0.0	0.0
Compound Y	0.0	0.0
Compound K	0.0	0.0
APPD	0.0	0.0
APPT	0.0	0.0

2. 재조합 베타-글루코시다아제(β- glucosidase )의 클로닝 및 생산

(1) Dictyoglomus turgidum DSM 6724 균주 유래 재조합 베타-글루코시다아제의 클로닝 및 생산

Dictyoglomus turgidum DSM 6724 균주 유래 재조합 베타-글루코시다아제(GenBank 번호 : ACK415480; 'DT-BGL'로 명명함) DNA를 공지된 Lee 등((Biotechnol. Lett. 2012, 34(9): 1679)의 방법으로 클로닝하고 형질전환 균주에서 발현시켰다. 이후, 형질전환 균주를 시트레이트-인산 완충액에 희석하고 초음파를 이용하여 파쇄한 후, 원심분리하여 DT-BGL 발현 상등액을 수거하였다. 상기 상등액을 펩티드 태그로 정제하여 정제 DT-BGL을 얻었다. 후술하는 실험에서 DT-BGL 발현 상등액 및 정제 DT-BGL을 선택적으로 사용하였다. DT-BGL은 최적 반응 조건에서 기질인 진세노사이드 Rb1로부터 Rd, F2, Compound K를 거쳐 APPD를 생산하고, 기질인 진세노사이드 Rb2로부터 Compound Y를 생산하며 기질인 진세노사이드 Rc로부터 Compound Mc를 생산한다. DT-BGL의 최적 반응조건은 시트레이트-인산 완충액 50mM, pH 5.5, 반응온도 80℃이다.

(2) 클로스트리디움 스테르코라리움 아종 스테르코라리움(Clostridium stercorarium subsp. stercorarium) DSM 8532 균주 유래 재조합 베타-글루코시다아제의 클로닝 및 생산

클로스트리디움 스테르코라리움 아종 스테르코라리움(Clostridium stercorarium subsp. stercorarium) DSM 8532 균주 유래 재조합 베타-글루코시다아제(GenBank 번호 : AGC67337; 'CS-BGL'로 명명함)는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되며 Dictyoglomus turgidum DSM 6724 균주 유래 재조합 베타-글루코시다아제 DT-BGL과 아미노산 서열 상동성 차이가 67%이다. 서열번호 2의 염기서열로 구성된 CS-BGL DNA 단편를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭하여 확보하였다. 중합효소연쇄반응(PCR)에 사용된 프라이머는 아래와 같으며, 클로닝을 위해 제한효소 NheI과 XhoI을 사용하였다.

Forward primer : 5' -CGGCGCTAGCGTAATACCAATTGTTGCAAGAGTGTC - 3'

Reverse primer : 5' - AGTACTCGAGAGCCTGTTCAGCTTTTCCTCGTTCAGTTCC - 3‘

중합효소연쇄반응(PCR)에 사용된 주형 DNA는 다음과 같은 방법으로 확보하였다. 클로스트리디움 스테르코라리움 아종 스테르코라리움(Clostridium stercorarium subsp. stercorarium) DSM 8532 균주를 한천 농도가 15g/ℓ인 Clostridium medium(DSM medium No. 255)에서 접종하고 혐기 조건에서 2일 동안 배양하여 집락을 형성시켰다. 이후, Clostridium medium(DSM medium No. 255) 5㎖가 수용된 vial(Wheaton, 10㎖ 용량)에 질소를 치환하여 산소를 제거한 후 클로스트리디움 스테르코라리움 아종 스테르코라리움(Clostridium stercorarium subsp. stercorarium) DSM 8532 균주의 집락을 접종하고 밀봉한 후 60℃의 온도 및 150 rpm의 교반 조건하에서 30시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 세포를 회수하고, genomic DNA isolation kit(Bioneer)를 사용하여 회수된 세포로부터 주형 DNA를 확보하였다.

중합효소연쇄반응(PCR)은 Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase kit(NEB)를 사용하여 수행하였고 98℃에서 2분 동안 predenaturation을 실시한 후, denaturation 98℃, 10초; annealing 55℃, 30초; extention 72℃, 130초를 1 cycle로 하여 총 30 cycle을 수행하고 최종적으로 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, agarose gel 전기영동상에서 증폭된 DNA 단편을 확인하고, DNA 단편을 elution 한 후 gel elution kit(Qiagen)를 이용하여 분리하였다. 분리한 DNA 단편을 NheI과 XhoI 제한 효소로 절단한 후 동일한 제한 효소로 처리한 pET-24a 벡터(Novagen)에 cloning 하고 염기서열을 확인하였다. CS-BGL가 클로닝된 pET-24a vector를 pCSBG 플라스미드로 명명하고 상기 플라스미드 50ng을 electroporation을 통해 대장균 ER2566 균주에 형질전환 후 LB-kanamycin 한천 배지에서 단일 집락을 획득하였다. 이후, 획득한 단일 집락을 kanamycin의 농도가 50㎍/㎖인 LB broth에 접종하고 하룻밤 동안 배양하고 이를 종균으로 사용하였다. 상기 종균을 kanamycin의 농도가 50㎍/㎖인 LB broth 500㎖에 접종하고, 37℃의 shaking incubator에서 230 rpm으로 교반배양하면서 배양액의 흡광도(Optical density at 600㎚)가 0.5에 도달하였을 때 IPTG를 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가하여 목적 효소의 발현을 유도하고 16℃의 온도 및 150 rpm의 교반 조건에서 15시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 완료된 후, 형질전환 균주의 배양액을 3000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 회수하고, 회수한 세포를 생리식염수로 20회 세척한 후 시트레이트-인산 완충액에 희석하였다. 이후, sonicator(Branson, model 100)를 이용하여 희석된 세포를 파쇄하고, 세포 파쇄액을 14,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 비가용성 단백질 부분을 제거하고 CS-BGL 발현 상등액을 수거하였다. 또한, 상기 상등액을 pET-24a 벡터에 포함된 히스티딘 태그로 정제하여 정제 CS-BGL을 얻었다. 정제 시 metal ion affinity chromatography(IMAC) cartridge (Bio-Rad)와 immidazole을 사용하였고, 정제 CS-BGL은 시트레이트-인산 완충액에 가용화시킨 후 후술하는 실험에 사용하였다.

3. 재조합 베타-글루코시다아제에 의한 희귀 진세노사이드의 함량 증대

시트레이트-인산 완충액(50mM, pH 5.5)에 앞에서 수득한 GBR 착즙 농축액 1g을 넣고 여기에 효소 발현 상등액 2㎖(총 단백질 양은 4㎎임)를 넣은 후 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 생성물의 진세노사이드 조성을 HPLC로 분석하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

진세노사이드 구분	GBR 착즙 농축액(㎎/g)
	효소와 반응 전	CS-BGL과 반응 후	DT-BGL과 반응 후
Rb1	14.75	0.0	0.20
Rb2	9.60	7.78	7.80
Rb3	10.20	5.36	10.12
Rc	12.96	9.42	9.56
Rd	38.28	50.34	48.24
Re	61.36	49.22	54.76
Rf	1.34	0.89	0.96
Rg1	9.90	10.94	7.32
Rg2	12.3	11.57	5.11
Rg3	0.53	4.55	0.0
Rh1	1.09	2.83	2.46
Rh2	0.0	2.12	0.0
F1	0.0	0.0	0.0
F2	0.0	3.64	1.55
Compound Mc	0.0	2.35	2.43
Compound Mc1	0.0	0.0	0.0
Compound Y	0.0	1.58	1.64
Compound K	0.0	0.78	0.68
APPD	0.0	0.0	0.0
APPT	0.0	0.0	0.0

상기 표 2에서 보이는 바와 같이 베타-글루코시다아제 CS-BGL은 진세노사이드 Rh1, Compound MC, Compound Y, Compound K의 생성량 측면에서 베타-글루코시다아제 DT-BGL과 유사하였다. 그러나, 베타-글루코시다아제 CS-BGL은 베타-글루코시다아제 DT-BGL에 비해 진세노사이드 Rg3 및 Rh2를 새롭게 생성시켰고, 진세노사이드 Rg1 및 F2의 생성량도 매우 높았다. 또한, 베타-글루코시다아제 CS-BGL에 의해 기질인 진세노사이드 Rb1은 모두 분해되었고, 진세노사이드 Rd의 함량은 오히려 증가한 것에 비추어볼 때 베타-글루코시다아제 CS-BGL의 반응속도는 PPD(protopanaxadiol) 계열의 진세노사이드에 대해 높은 것으로 보인다. 또한, 베타-글루코시다아제 CS-BGL과의 반응에 의해 진세노사이드 Re의 반응 생성물인 Rg1의 함량이 증가한 것으로 보아, 베타-글루코시다아제 CS-BGL은 PPT(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드 20번 탄소 위치에 존재하는 글루코스를 분해하는 것으로 추정된다.

이를 보다 명확히 확인하기 위해 효소 발현 상등액 대신 정제 DT-BGL 및 정제 CS-BGL을 사용하여 효소 발현 상등액과 동일한 조건으로 반응시켰고 반응 생성물의 미량 진세노사이드인 Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2 및 F2의 함량을 비교하였다. 도 1은 성숙 인삼열매 착즙 농축액을 정제 DT-BGL 및 정제 CS-BGL과 반응시켰을 때 반응 생성물내 진세노사이드의 함량 변화를 나타낸 것이다. 도 1에서 보이는 바와 같이 성숙 인삼열매 착즙 농축액은 정제 CS-BGL과 반응하였을 때 진세노사이드 Rg3 및 Rh1의 함량이 각각 반응전보다 8배 및 2배 이상 증가하였다. 또한, 정제 CS-BGL은 정제 DT-BGL에 비해 진세노사이드 Rh2 및 F2를 새롭게 생성시켰고, 다른 미량 진세노사이드 생성량도 더 높은 것으로 나타났다. 결과적으로 베타-글루코시다아제 CS-BGL은 인삼열매 착즙 농축액 내 진세노사이드와 반응하여 미량 진세노사이드의 함량을 골고루 증가시킬 수 있는 것으로 판단된다.

4. 헤미셀룰라아제에 의한 희귀 진세노사이드의 함량 증대

시트레이트-인산 완충액(50mM, pH 5.5)에 앞에서 수득한 GBR 착즙 농축액 1g을 넣고 여기에 상업적 효소인 헤미셀룰라아제 2㎖를 넣은 후 35℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 생성물의 진세노사이드 조성을 HPLC로 분석하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 상기 상업적 효소인 헤미셀룰라아제는 자일라나아제(xylanase)와 갈락타나아제(galactanase)로 구성되어 있고, 일본 기업인 Amno사의 제품이다.

진세노사이드 구분	GBR 착즙 농축액(㎎/g)
	효소와 반응 전	헤미셀룰라아제와 반응 후
R2	2.21	0.0
Rb1	14.75	10.27
Rb2	9.6	7.78
Rb3	10.2	5.19
Rc	12.96	9.42
Rd	38.28	55.10
Re	61.36	50.37
Rf	1.34	1.29
Rg1	9.90	13.01
Rg2	12.3	16.78
Rg3	0.53	1.13
Rh1	1.09	3.54
Rh2	0.0	1.33
F1	0.0	0.0
F2	0.0	3.36
Compound Mc	0.0	2.01
Compound Mc1	0.0	0.0

상기 표 3에서 보이는 바와 같이 헤미셀룰라아제는 아라비노스 또는 자일로스가 함유된 진세노사이드 Rb2, Rb3, Rc 또는 R2를 분해하여 진세노사이드 Rd, Rh1 또는 Compound Mc 등의 함량을 증가시키는데에 효과가 있었다. 또한, 헤미셀룰라아제는 진세노사이드 R2를 모두 분해시켜 진세노사이드 Rh1으로 전환시켰고, 그 결과 Rh1이 반응 후 약 3.2배 증가하였다. 또한, GBR 착즙 농축액과 헤미셀룰라아제의 반응 후 진세노사이드 Re의 반응 산물인 진세노사이드 Rg1 및 Rg2의 함량이 각각 1.3배씩 증가하였다. 또한, GBR 착즙 농축액과 헤미셀룰라아제의 반응 후 진세노사이드 Rc는 Compound Mc로 30% 이상 전환되었다. 또한, 헤미셀룰라아제는 GBR 착즙 농축액 내 진세노사이드 Rb2 및 Rb3를 각각 23% 및 50.8% 정도 분해하였고, 진세노사이드 Rb1을 약 30% 이상 분해하여 모두 Rd로 전환시켰다. 결론적으로, 헤미셀룰라아제는 종래 효소 처리로 분해가 어려운 진세노사이드의 아라비노스나 자일로스를 효과적으로 분해하여 인삼열매 착즙 농축액 내 다양한 미량 진세노사이드 함량을 유의적으로 증가시킬 수 있다.

5. 베타-글루코시다아제와 헤미셀룰라아제의 혼합 효소에 의한 희귀 진세노사이드의 함량 증대

시트레이트-인산 완충액(50mM, pH 5.5)에 앞에서 수득한 GBR 착즙 농축액 1g을 넣고 여기에 베타-글루코시다아제와 헤미셀룰라아제의 혼합 효소 2㎖를 넣은 후 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 생성물의 진세노사이드 조성을 HPLC로 분석하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 상기 베타-글루코시다아제는 CS-BGL 발현 상등액이다. 또한, 상기 상업적 효소인 헤미셀룰라아제는 자일라나아제(xylanase)와 갈락타나아제(galactanase)로 구성되어 있고, 일본 기업인 Amno사의 제품이다. 하기 표 4에서 보이는 바와 같이 베타-글루코시다아제와 헤미셀룰라아제의 혼합 효소는 GBR 착즙 농축액 내 미량 진세노사이드 함량을 현저하게 증가시켰다. 이는 혼합 효소가 PPD 계열의 진세노사이드와 PPT 계열의 진세노사이드를 모두 기질로 사용하고 골고루 분해한 것에서 기인하는 것으로 판단된다.

진세노사이드 구분	GBR 착즙 농축액(㎎/g)
	효소와 반응 전	혼합 효소 1과 반응 후	혼합 효소 2와 반응 후	혼합 효소 3과 반응 후
R2	2.21	0.0	0.0	0.0
Rb1	14.75	9.14	9.12	5.54
Rb2	9.6	7.28	5.55	3.21
Rb3	10.2	3.39	5.98	7.37
Rc	12.96	6.21	7.42	8.99
Rd	38.28	57.20	50.10	45.10
Re	61.36	41.17	47.35	49.86
Rf	1.34	0.73	0.73	0.41
Rg1	9.90	17.23	15.08	12.45
Rg2	12.3	21.34	16.54	13.10
Rg3	0.53	1.13	3.93	4.98
Rh1	1.09	3.78	3.63	3.33
Rh2	0.0	2.21	2.45	2.83
F1	0.0	0.0	0.0	0.0
F2	0.0	3.64	3.98	4.53
Compound Mc	0.0	4.95	4.71	2.95
Compound Mc1	0.0	0.0	0.0	0.0

* 혼합 효소 1 : 베타-글루코시다아제와 헤미셀룰라아제의 혼합 중량비가 1:4임

* 혼합 효소 2 : 베타-글루코시다아제와 헤미셀룰라아제의 혼합 중량비가 1:1임

* 혼합 효소 3 : 베타-글루코시다아제와 헤미셀룰라아제의 혼합 중량비가 4:1임

이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 특정 실시 형태로 국한되는 것이 아니며, 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Kbiopharm Co., Ltd. <120> Method for producing rare ginsenosides from ginseng berry <130> DP-16-742 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 794 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> beta-glucosidase derived from Clostridium stercorarium subsp. stercorarium DSM 8532 <400> 1 Met Val Ile Pro Ile Val Ala Arg Val Ser Glu Lys Val Ile Ile Tyr 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Thr Val Tyr Glu Asn Leu Asn Asp Lys Gly Ile Thr Gly 20 25 30 Val Ile Lys Met Gln Arg Asp Ile Lys Lys Ile Ile Ser Gln Met Thr 35 40 45 Leu Glu Glu Lys Ala Ser Leu Cys Ser Gly Leu Asp Ala Trp Asn Leu 50 55 60 Lys Ser Val Glu Arg Leu Gly Ile Pro Ser Ile Met Val Ser Asp Gly 65 70 75 80 Pro His Gly Leu Arg Lys Glu Thr Thr Asp Pro Thr Asp Pro Gly Lys 85 90 95 Lys Thr Thr Val Pro Ala Thr Cys Phe Pro Thr Ala Val Gly Leu Ala 100 105 110 Ser Ser Trp Asn Arg Glu Leu Val Glu Lys Val Gly Ala Ala Leu Gly 115 120 125 Glu Glu Cys Gln Ala Glu Gly Ile Ala Val Leu Leu Gly Pro Gly Thr 130 135 140 Asn Ile Lys Arg Ser Pro Leu Cys Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Phe Ser 145 150 155 160 Glu Asp Pro Tyr Leu Ser Ser Glu Met Ala Ala Ser His Ile Lys Gly 165 170 175 Val Gln Ser Arg Gly Val Gly Thr Ser Leu Lys His Phe Ala Ala Asn 180 185 190 Asn Gln Glu His Arg Arg Met Ser Val Asp Ala Val Ile Asp Glu Arg 195 200 205 Thr Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Ala Ser Phe Glu Gly Ala Val Lys Lys 210 215 220 Ala Lys Pro Trp Thr Ile Met Cys Ser Tyr Asn Arg Val Asn Gly Glu 225 230 235 240 Tyr Ala Ser Glu Asn Lys Phe Leu Leu Thr Asp Val Leu Arg Asn Glu 245 250 255 Trp Gly Phe Glu Gly Ile Val Val Ser Asp Trp Gly Ala Val Asn Glu 260 265 270 Arg Val Lys Gly Leu Glu Ala Gly Leu Asp Leu Glu Met Pro Ser Ser 275 280 285 Phe Gly Ile Gly Asp Gln Lys Ile Val Glu Ala Val Lys Lys Gly Glu 290 295 300 Leu Pro Glu Glu Val Leu Asp Arg Thr Val Glu Arg Ile Leu Asn Leu 305 310 315 320 Ile Phe Lys Ala Val Asp Asn Arg Lys Glu Asn Ala Gly Tyr Asp Arg 325 330 335 Glu Ala His His Lys Leu Ala Arg Glu Ala Ala Arg Glu Cys Met Val 340 345 350 Leu Leu Lys Asn Glu Asp Lys Ile Leu Pro Leu Arg Lys Gln Gly Thr 355 360 365 Ile Ala Val Ile Gly Glu Phe Ala Lys Arg Pro Arg Tyr Gln Gly Gly 370 375 380 Gly Ser Ser His Val Asn Pro Thr Ile Met Asp Ser Pro Tyr Glu Glu 385 390 395 400 Ile Lys Lys Ser Ala Gly Asn Asn Ala Asp Val Ile Tyr Ala Gln Gly 405 410 415 Tyr Phe Ile Glu Lys Asp Glu Pro Asp Glu Lys Leu Leu Glu Glu Ala 420 425 430 Lys Gln Ala Ala Leu Lys Ala Asp Val Ala Val Ile Phe Ala Gly Leu 435 440 445 Pro Glu His Tyr Glu Cys Glu Gly Tyr Asp Arg Gln His Met Arg Met 450 455 460 Pro Glu Ser His Cys Thr Leu Ile Glu Glu Val Ala Lys Val Gln Pro 465 470 475 480 Asn Val Val Val Val Leu Cys Asn Gly Ser Pro Val Glu Met Pro Trp 485 490 495 Ile Asp Lys Val Lys Gly Leu Leu Glu Ala Tyr Leu Gly Gly Gln Ala 500 505 510 Met Gly Gly Ala Ile Ala Asp Leu Leu Phe Gly Asp Ala Asn Pro Ser 515 520 525 Gly Lys Leu Ala Glu Thr Phe Pro Lys Gln Leu Ser Asp Asn Pro Ser 530 535 540 Tyr Leu Asn Phe Pro Gly Glu Gly Asp Arg Val Glu Tyr Arg Glu Gly 545 550 555 560 Ile Phe Val Gly Tyr Arg Tyr Tyr Asp Lys Lys Asn Met Glu Pro Leu 565 570 575 Phe Pro Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Glu Tyr Gly Asp 580 585 590 Leu Lys Ile Ser Arg Lys Glu Ile Ser Asp Asn Glu Thr Val Thr Val 595 600 605 Ser Val Lys Val Lys Asn Thr Gly Asp Met Ala Gly Lys Glu Ile Val 610 615 620 Gln Leu Tyr Val Arg Asp Ile Glu Ser Ser Val Ile Arg Pro Glu Lys 625 630 635 640 Glu Leu Lys Gly Phe Glu Lys Val Glu Leu Lys Pro Gly Glu Glu Lys 645 650 655 Thr Val Val Phe Glu Leu Asp Lys Arg Ala Phe Ala Tyr Tyr Asn Thr 660 665 670 Gly Ile Arg Asp Trp His Val Glu Thr Gly Glu Phe Glu Ile Leu Ile 675 680 685 Gly Arg Ser Ser Arg Asp Ile Val Leu Lys Asp Lys Ile Phe Val Lys 690 695 700 Ser Thr Val Thr Ile Lys Lys Pro Val Asp Arg Asn Thr Leu Val Gly 705 710 715 720 Asp Leu Leu Ser Asp Arg Val Leu Glu Pro Val Phe Arg Glu Phe Ile 725 730 735 Ile Asn Glu Ile Lys Asn Arg Tyr Leu Leu Asp Leu Leu Glu Asn Glu 740 745 750 Asp Lys Ser Leu Leu Ser Val Trp Met Arg Tyr Thr Pro Leu Arg Ser 755 760 765 Leu Ala Asn Ser Thr Gly Gly Glu Leu Asn Glu Glu Lys Leu Asn Arg 770 775 780 Leu Ile Asp Thr Leu Asn Ala Asn Ile Lys 785 790 <210> 2 <211> 2385 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> DNA fragment encoding beta-glucosidase derived from Clostridium stercorarium subsp. stercorarium DSM 8532 <400> 2 gtggtaatac caattgttgc aagagtgtct gagaaagtta taatttatta tgccggaacg 60 gtttacgaaa atttgaacga taaaggcata acaggagtga taaaaatgca aagggacatc 120 aaaaaaatta tttcacaaat gacgctggaa gaaaaggcga gcttatgctc gggccttgac 180 gcctggaacc ttaaaagcgt agaacgtttg ggcattccgt ccattatggt atctgacggc 240 ccccatggtc tcagaaaaga gacaacggat cccactgatc ccggtaagaa aaccactgtc 300 ccggccacat gtttccccac tgcggttggc cttgcaagct catggaaccg tgaactggtg 360 gagaaagtag gcgccgcatt gggggaagaa tgccaggctg aaggaatagc agtgcttctt 420 gggccgggaa ccaatataaa acgttcccct ctttgcggaa gaaactttga atatttttcg 480 gaagacccgt acctttcttc ggagatggca gcaagccata taaaaggagt gcagagccgg 540 ggagtgggga cgtccctgaa gcattttgcg gcaaataacc aggaacaccg cagaatgagc 600 gtggatgcgg taattgacga aagaacgctg cgtgaaattt acctcgccag tttcgaaggg 660 gcggttaaaa aggcgaagcc gtggacgatc atgtgttcat acaacagggt aaacggcgag 720 tatgcatctg aaaataaatt tctgttaaca gatgtactga gaaatgaatg gggttttgaa 780 ggcattgtgg tatccgactg gggagcggtg aatgagaggg taaagggact ggaagccgga 840 cttgatcttg aaatgccgtc aagcttcggt attggagacc aaaaaatagt tgaagccgta 900 aagaagggtg agctgcccga agaggtattg gacagaaccg ttgaaaggat acttaattta 960 atttttaaag cggtggataa caggaaagaa aatgccggat atgaccggga agctcatcac 1020 aaactggcca gagaagcggc aagggagtgc atggtgctgc ttaagaacga ggacaaaata 1080 cttccgctta ggaagcaggg aaccatagcc gtaataggcg aatttgctaa aagaccacgg 1140 tatcagggcg gaggaagctc ccatgtaaat cccacaatca tggatagtcc atatgaagaa 1200 atcaaaaaat cagcgggaaa caatgcagat gttatatatg cgcaaggtta ttttattgaa 1260 aaggacgagc cagatgaaaa actcctggag gaagcaaagc aggcggcgct gaaggcagat 1320 gtcgccgtga tatttgcagg gcttcccgag cattatgaat gcgagggcta tgaccgtcag 1380 catatgagaa tgcccgaaag ccactgcacg cttatcgaag aagtggcgaa agtacaaccc 1440 aatgtggtgg tggtattatg caacggttca ccggtggaga tgccgtggat tgacaaagtg 1500 aagggattgc tggaggctta cctgggcgga caagccatgg gcggagccat tgccgatctt 1560 ctgttcggag acgccaatcc cagcgggaag ctcgccgaga ctttcccgaa acagttaagc 1620 gataaccctt catatttgaa ttttcccggg gaaggggaca gggttgaata cagggaaggc 1680 atattcgtgg gctacaggta ttatgacaaa aagaatatgg aaccgctgtt cccgttcgga 1740 tacgggctca gctacactac gtttgagtac ggcgatctga aaataagcag gaaagaaata 1800 tctgataacg aaacggtgac tgtgagcgta aaggttaaga ataccggaga tatggcgggt 1860 aaggagattg tgcagcttta cgtaagggat attgaaagct cggtaataag accggagaag 1920 gaactgaagg gttttgaaaa agttgaactt aagcccggcg aggaaaaaac ggtggtgttt 1980 gaacttgaca agagggcgtt tgcttattac aacaccggta taagggactg gcatgttgaa 2040 accggtgaat ttgagatttt aataggcaga tcctcaaggg acatagtgct taaagacaag 2100 atattcgtca aatcaaccgt taccataaaa aaaccggtgg acagaaacac gctggtgggg 2160 gatttgcttt ctgatcgggt tcttgagcct gtattcagag agtttattat taacgagata 2220 aaaaacaggt acttgttgga tttactggag aacgaggata aatccctcct gagtgtgtgg 2280 atgaggtata ctcctctgcg ttcattggcg aacagtacgg gtggggaact gaacgaggaa 2340 aagctgaaca ggctgattga tacactgaat gcaaatatta aataa 2385

Claims (7)

1. 인삼열매 착즙액, 인삼열매 추출액, 인삼열매 과육 착즙액, 인삼열매 과육 추출액 또는 이들의 농축액을 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 및 헤미셀룰라아제(hemicellulase)의 혼합 효소와 반응시켜 희귀 진세노사이드의 함량을 증가시키는 단계를 포함하는 방법으로서,
   상기 인삼열매는 성숙 열매이고,
   상기 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 인삼열매로부터 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 헤미셀룰라아제(hemicellulase)는 자일라나아제(xylanase), 갈락타나아제(galactanase), 만나나아제(mannanase) 또는 아라비나아제(arabinase)로부터 선택되는 1종 이상으로 구성되는 것을 특징으로 하는 인삼열매로부터 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 대 헤미셀룰라아제(hemicellulase)의 혼합 중량비는 1:4 내지 4:1인 것을 특징으로 하는 인삼열매로부터 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 희귀 진세노사이드는 Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2, F2, Compound Mc, Compound K 또는 Compound Y에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인삼열매로부터 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법.

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