KR101903778B1 - Hbv 치료 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 RNA 간섭(RNAi) 작용제 및 개인의 B형 간염(hepatitis B) 감염 치료를 위한 RNAi 작용제의 용도, 뿐만 아니라 본 발명의 RNAi 작용제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 적어도 하나의 B형 간염 바이러스(HBV) 유전자의 발현을 억제시키기 위해 RNAi 작용제 또는 이를 발현시키기 위한 구조체가 사용되며, 이 때 각각의 작용제는 표적 영역으로부터 전사되는 예측 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 형태에 있어서, 작용제는 하나보다 많은 이펙터 서열을 갖는다. 다수 이펙터는 HBV 유전자의 동일한 영역, 동일한 유전자의 상이한(오버래핑 가능) 영역 및/또는 상이한 HBV 유전자를 표적화할 수 있다.
Description
본 발명은 RNA 간섭(RNAi) 작용제 및 개인의 B형 간염(hepatitis B) 감염 치료를 위한 RNAi 작용제의 용도, 뿐만 아니라 본 발명의 RNAi 작용제를 포함하는 약학적 조성물(pharmaceutical compositions)에 관한 것이다.
간염은 '간의 염증'을 의미하는 일반적인 용어이며, 다수의 원인을 가진다. 그 중 가장 일반적 원인은 바이러스성 원인이며, A형, B형, C형, D형 또는 E형 간염 바이러스에 의해 유발될 수 있다. 특히 B형 간염 바이러스(HBV)는 심각하면서도 일반적인 감염성 간 질환으로, 전세계적으로 수 백만명의 사람들이 감염되어 있다.
HBV는 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae)에 속하는 간친화(hepatotrophic) DNA 바이러스이다. 이 바이러스 게놈의 총 길이는 약 3.2kb이며, 표면 항원("S 유전자"), 코어 항원("C 유전자"), DNA 폴리머라제("P 유전자") 및 "X 유전자"라고 칭하는 미정의 기능을 가진 유전자를 포함하는 4개의 개방형 판독 프레임(open reading frames; ORFs)을 가진다.
현재 생존하는 20억명 이상의 사람들이 그들의 일생의 어느 시점에서 HBV에 감염된 적이 있고, 이들 중 약 3억5천만 명은 만성 감염되어 있으며 바이러스 보균자가 된다. HBV에 감염은 급성 및 만성 B형 간염을 유발할 수 있으며, 결국에는 만성 간 부전(chronic hepatic insufficiency), 간경변(cirrhosis) 및 간세포암(hepatocellular carcinoma)의 발병을 초래할 수 있다. 또한, HBV 보균자는 수년 동안 그 질환을 전염시킬 수 있다.
HBV는 감염된 체액 또는 혈액과의 경피적(percutaneous) 또는 비경구적(parenteral) 접촉에 의해 전염된다. 가장 일반적인 감염 경로는 엄마로부터 그녀의 아기로의 수직적 전달을 통해서이며, 성인에 있어서는 성관계 또는 공유되는 정맥주사침 또는 귀-피어싱 기구를 통해서이다. 그러나, 급성 HBV 감염의 많은 경우는 추적가능한 감염 경로없이 발생한다.
만성 HBV 감염을 가지고 있는 사람("보균자" - 전세계적으로 약 3억5천만 내지 4억 명의 사람)은 비보균자에 비해 간세포암 발병의 위험성이 12 내지 300배 높으며, 세계적으로 HBV가 세계의 원발성 간암의 60 내지 80%를 유발한다. 매년 4백만명 초과의 급성 임상시험의 약 25%(즉, 전세계적으로 백만명의 사람)가 만성 활성 간염, 간경변 또는 HBV-유도 간암으로 사망한다. 결과적으로, HBV는 알려져 있는 인간 발암물질로서 담배 다음으로 두번째에 랭크되어 있다.
HBV에 대한 백신이 수십년 동안 광범위하게 사용되어 왔으나, 인구 중 HBV 발생율이 여전히 높다. 만성 HBV 감염에 대한 현 치료법은 만성 감염 환자의 대부분에 있어서 바이러스 유전자 발현 및 복제에 미치는 억제 효과가 제한적이다. 예를 들어 라미부딘(Lamivudine)은 보균자의 HBV 복제를 억제시키나, 그 효과는 치료가 중단되면 원상으로 되돌아 간다. 더군다나, 만성 라미부딘 치료법의 중요한 한계점은 바이러스성 내성의 발생으로, 전형적으로 치료 6개월 후에 발생한다. 내성은 통상적으로 HBV 폴리머라제 유전자의 고도로 보존되는 촉매 영역의 돌연변이와 관련이 있다.
이러한 이유로 인해, HBV 감염을 치료하기 위한 신규한 치료제의 필요성이 존재한다. 본 발명은 RNA 간섭(RNAi) 작용제 및 개인의 B형 간염 감염 치료를 위한 RNAi 작용제의 용도에 관한 것이다.
RNAi 경로는 이중가닥 RNA(dsDNA) 분자를 약 20 내지 25개의 뉴클레오티드의 짧은 단편(일반적으로 siRNA라고 칭함)을 분해하는 효소 다이서(Dicer)에 의해 개시된다. 그 다음, 각 단편의 두 가닥 중 가이드 스트랜드 또는 활성 스트랜드라고 알려져 있는 한 가닥을 아고너트 단백질 계통(argonaute protein family)의 한 멤버와의 결합을 통해 RNA-유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex; RISC) 내에 편입시킨다. RISC에 통합한 후에, 가이드 스트랜드가 그 표적 mRNA와 염기쌍을 형성하여 번역 방해(번역 기구들의 스톨링에 의해)에 의해 및/또는 mRNA의 절단 유도에 의해 표적을 방해하고, 그럼으로써 번역 템플릿(translation template)으로서 사용되는 것을 방지하는 것으로 생각된다.
다이서에 의해 생성되는 단편은 이중가닥이며, 이 중 가이드 스트랜드 만이 유전자 침묵을 유도한다. 통상적으로 패신저 스트랜드, 캐리어 스트랜드 또는 * 스트랜드라고 칭하는 나머지 하나의 안티-가이드 스트랜드는 흔히 RISC 활성화 과정 동안 분해된다(Gregory R, Chendrimada T, Cooch N, Shiekhattar R (2005). "인간 RISC는 마이크로RNA 생합성 및 전사후 유전자 침묵을 연결시킨다(Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing)", Cell 123 (4): 631-40). RISC 어셈블리(assembly)는 RISC에 로딩되는 dsRNA 다이서 산물의 스트랜드를 선택하는 효소에 의해 지배되는 것으로 생각된다. 이 스트랜드는 일반적으로 5' 말단이 그 보체(complement)와 덜 타이트하게 짝을 이루는 가닥이며, 또한 일부 아고너트 단백질에 대한 결합을 촉진하기 위해서 5'위치에서 A, 보다 적은 수준으로 U에 대해 클리어 바이어스(clear bias)인 것으로 보여진다(Schwarz DS, Hutvaner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD (2003). "RNAi 효소 복합체의 어샘블리의 비대칭(Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex)". Cell 115 (2): Frank F, Sonenberg N, Nagar (2010) "인간 AGO2에 의한 가이드 RNA의 5'-뉴클레오티드 염기-특이적 식별을 위한 구조학적 기초(Structural basis for 5'-nucleotide base-specific recognition of guide RNA by human AGO2)", Nature. 465(7299):818-22).
본 명세서에서 종래의 해당 기술에 관한 언급은 종래의 기술이 호주 또는 어느 다른 법역에서는 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다거나, 종래의 기술이 당해 분야의 숙련자에 의해 관련된 것으로 확인, 이해 및 평가되도록 합리적으로 예측될 수 있다는 인정 또는 어떠한 형태의 제안이 아니며, 그렇게 간주되지 않아야 한다.
본 발명자는 B형 간염 바이러스(HBV) 게놈 내의 고유한 서열(unique sequences)이 바이러스를 억제시키기 위해 표적화될 수 있다는 것을 발견하였다. 하나 이상의 유전자의 특정 영역을 표적화함으로써, 이들 유전자의 발현 억제되어 효과적으로 유전자를 "침묵"시킨다. 이는 HBV 감염을 치료하기 위해 세포 내의 HBV 발현을 표적화하는 신규한 기회를 제공한다.
본 발명의 한 양태에 있어서, 하나 이상의 B형 간염 바이러스(HBV) 유전자의 발현을 억제시키기 위해서, DNA-지향 RNA 간섭(ddRNA) 작용제(RNA 분자임) 및 이 작용제를 세포 내에서(생체 내에서 포함) 발현하기 위한 발현 카세트(expression cassett) 또는 구조체(construct)를 제공하며, 이 때 작용제는 표적 영역으로부터 전사되는 예측 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 뉴클레오티트 길이의 이펙터 서열(effector sequence)(이후에 보다 상세하게 기술됨)을 포함하고, 표적 영역은 SEQ ID NO: 1 내지 19 중 어느 하나로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드(contiguous nucleotide)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 대안적 구현예에서, 표적 영역은 SEQ ID NO: 20 내지 27 중 어느 하나로부터의 서열 내의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열이다.
이펙터 서열은 표적 RNA 서열의 표적 영역을 지향하며, 이 때 표적 서열은 표적 유전자의 전사체이다. 따라서 이펙터 서열은 표적 영역을 포함하는 표적 유전자로부터의 전사체에 충분히 서열 상보적이므로 표적 영역을 "지향한다". 그러므로, 이펙터 서열을 포함하는 이중가닥 부분을 갖는 ddRNAi 작용제와 같은 RNAi 작용제는 표적 영역을 포함하는 표적 유전자 서열로 인해 "표적 유전자 서열의 발현을 억제"시킬 수 있다. 따라서, HBV에 감염된 세포 내에서, 이펙터('이펙터'는 이후 정의됨)의 서열이 표적 유전자의 예측 mRNA 표적 서열의 적어도 일 영역에 실질적으로 상보적이기 때문에 RNAi 작용제는 표적 유전자 서열의 발현을 억제시킬 수 있다. 이는 하기의 짧은 서열로 설명될 수 있다.
5'ATTGCG3' - 유전자의 DNA 표적 서열
5'AUUGCG3' - 유전자의 전사로부터의 mRNA 표적 영역/서열
3'AUUGCG5' - 이펙터 서열 - 예측 mRNA 표적 서열의 영역에 실질적으로 상보적임.
전형적으로, 표적 영역은 침묵되거나 그 발현(전사 또는 번역 레벨에서)이 감소되도록 의도되는 유전자의 mRNA의 영역이다.
또한 작용제는 이펙터 보체 서열, 즉 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열로서, 어닐링되어 이중가닥 RNA 단편을 형성하게 될 서열을 함유하도록 설계된다 - 필요한 상보성 정도는 이후에 특히 상세하게 설명된다. 더욱이, 통상적으로 이중가닥 단편의 한 말단은 '헤어핀' 모양의 구조를 형성하도록 루프 서열(loop sequence)에 의해 연결될 것이다. 이는 또한 이러한 RNA 서열을 암호화하는 DNA가, 이펙터 서열로 전사되는 표적 유전자의 영역의 역위 반복부(inverted repeat)를 포함하므로, 루프를 암호화하는 스퍼터(stuffer) 또는 스페이서(spacer)에 의해 중단되는 '중단 역위 반복부' 구조로도 알려져 있다.
본 발명의 일부 형태에 있어서, 작용제는 하나보다 많은 이펙터 서열을 갖는다. 다수 이펙터는 HBV 유전자의 동일 영역, 동일한 유전자의 상이한(오버랩핑 가능) 영역 및/또는 상이한 HBV 유전자를 표적으로 할 수 있다. ddRNAi 작용제와 같은 RNAi 작용제는 2 또는 3개의 상이한 이펙터 서열을 포함할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, ddRNAi 작용제는 각 이펙터 서열에 대한 이펙터 보체 서열을 포함하며, 따라서 이펙터 - 이펙터 보체 쌍(즉, 제1 이펙터 - 제1 이펙터 보체 쌍, 제2 이펙터 - 제1 이펙터 보체 쌍, 등)을 형성한다. 이들 쌍은 RNAi 작용제가 각 쌍이 어닐링하도록 폴딩될 수 있는 한, 서로 연속될 수 있으나 반드시 필요한 것은 아니다. 여러 다른 고려사항으로, RNAi 작용제의 길이에 따라 이펙터 및 이펙터 보체의 한 순서 또는 또 다른 순서가 제안된다. 따라서 본 발명의 구현예는 하기 작용제들 중 하나 이상을 포함한다.
·5' 에서 3' 방향으로, 제1 이펙터 서열; 제2 이펙터 서열; 제2 이펙터 보체 서열; 및 제1 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제;
·5' 에서 3' 방향으로, 제1 이펙터 서열; 제2 이펙터 서열; 제3 이펙터 서열; 제3 이펙터 보체 서열; 제2 이펙터 보체 서열; 및 제1 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제;
·5' 에서 3' 방향으로, 제1 이펙터 서열; 제1 이펙터 보체 서열; 제2 이펙터 서열; 및 제2 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제;
·5' 에서 3' 방향으로, 제1 이펙터 서열; 제1 이펙터 보체 서열; 제2 이펙터 서열; 및 제2 이펙터 보체 서열; 제3 이펙터 서열; 제3 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제;
·5' 에서 3' 방향으로, 제1 이펙터 서열; 제2 이펙터 서열; 2 내지 100개의 비-자기-상보적(non-self-complementary) 뉴클레오티드의 서열; 제2 이펙터 보체 서열; 및 제1 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제;
·5' 에서 3' 방향으로, 제1 이펙터 서열; 2 내지 100개의 비-자기-상보적 뉴클레오티드의 서열; 제1 이펙터 보체 서열; 제2 이펙터 서열; 2 내지 100개의 비-자기-상보적 뉴클레오티드의 서열; 및 제2 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제.
당해 숙련자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 그리고 도면에서 설명되는 바와 같이, 어떠한 특정 이펙터 서열도 작용제 내에서 그 보체와 함께 적소에서 스와핑될(swapped) 수 있다. 앞서 기술한 각 구현예의 특정 형태에 있어서, 각 이펙터 서열은 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이이며, SEQ ID NO: 1 내지 19 또는 SEQ ID NO: 20 내지 27 중의 어느 하나로부터의 서열의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이펙터 서열은 모두 동일할 수도 있고, 모두 상이할 수도 있으며, 예를 들어 SEQ ID NO: 1의 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드의 이펙터 서열 2개와 SEQ ID NO: 4의 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드의 이펙터 서열 1개가 배합되어 있을 수도 있다.
바람직하게, 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 19 또는 SEQ ID NO: 20 내지 27 중의 어느 한 서열 내의 임의의 인접 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 뉴클레오티드, 및 가장 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 내지 19 또는 SEQ ID NO: 20 내지 27 중의 어느 한 서열 내의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된다. 전형적으로, 이펙터 보체는 그 상응 이펙터 서열과 동일한 길이 또는 대략 동일한 길이(즉, ± 15% 뉴클레오티드 길이)일 것이다.
대안적 구현예에서, dsRNA는, 어닐링되어 듀플렉스를 형성하는 2개의 별개의 RNA 가닥으로 구성되어 있다. ddRNAi 작용제는 임의의 적합한 벡터 또는 ddRNAi 구조체 내에 삽입되는 DNA 발현 카세트로부터 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명의 양태에 있어서, 다음을 포함하는 ddRNAi 발현 카세트가 제공된다.
·하나 이상의 프로모터 서열;
·바람직하게는 SEQ ID NO: 1 내지 19 또는 SEQ ID NO: 20 내지 27 중의 어느 하나로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드를 암호화하는 서열인 하나 이상의 DNA 서열;
·하나 이상의 이펙터 보체 서열을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열;
·하나 이상의 터미네이터(terminator) 서열;
그리고 임의선택적으로
·루프 서열을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열; 및
·하나 이상의 인핸서(enhancer) 서열.
일부 구현예에서는, 하나의 프로모터가 다수 이펙터-암호화 영역과 작동가능하게 연결되어 그 프로모터가 다수의 이펙터-암호화 영역의 발현을 가동시킬 수 있도록 하는 반면, 다른 구현예에서는, 각 이펙터-암호화 영역이 그 자체의 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다. 다수 프로모터가 존재하는 구조체에 있어서, 이들 프로모터는 모두 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. 바람직한 프로모터는 U6 및 H1이다.
발현을 위해 ddRNAi 발현 카세트가 삽입되는 ddRNAi 발현 구조체가 또한 제공된다. 또한, 구조체의 벡터 백본(vector backbone)이 전달 시스템과 상용할 수 있는(compatible) 경우, ddRNAi 발현 구조체는 전달 구조체이기도 하다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1 내지 19 또는 SEQ ID NO: 20 내지 27 중 어느 하나로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 서열 및 이 서열과 함께 듀플렉스를 형성하는 서열 보체를 포함하며, HBV 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 siRNA 작용제를 제공한다.
본 발명은 또한 대상자의 급성 또는 만성 HBV 감염 치료, 대상자의 HBV 바이러스 부하량(viral load) 감소, 대상자의 HBV 감염과 관련한 증상의 중증도 감소 및 HBV 감염성(infectivity) 감소 방법으로, 치료학적 유효량의 본 발명의 ddRNAi 구조체, ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 이 때 ddRNAi 구조체, ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제는 B형 간염 바이러스(HBV) 유전자, 바람직하게는 적어도 HBV의 폴리머라제 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시킨다.
또한 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트, ddRNAi 구조체 또는 siRNA 작용제, 및 약학적으로 허용가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier) 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
도 1a 내지 1f는 본 발명의 ddRNAi 작용제 구조들 중 일부를 도시한다.
도 2는 HBV 폴리머라제 유전자를 따라 얻어진 642개의 siRNA 클론의 분포를 보여주며, 여기서 라인은 각각의 전체 siRNA 표적(EsT) 클론에 상응하는 영역을 나타낸다.
도 3은 HBV 폴리머라제 발현 3의 SEC 억제로 얻어진 초기 스크리닝 결과를 검증하기 위해서 siRNA 발현 카세트(SECs)와 이에 상응하는 합성 siRNA의 HBV 폴리머라제 mRNA 양에 미치는 RNAi 효과를 비교한 것이다.
도 4는 EsT 라이브러리로부터 유래되는 501개의 siRNA 서열을 이용한 HBV 폴리머라제 억제 스크린의 결과이다.
도 5a는 HBV 폴리머라제 유전자를 따라 가장 효과적인 상위 100개의 siRNA 서열(도 4의 대규모 스크린에서 확인됨)의 분포를 도시한 것이다. 도 5b는 소정의 서열이 어떻게 HBV 폴리머라제 유전자에 매핑될(mapped) 수 있는지를 도시한다. SEQ ID NO: 1 내지 3이 기반이 되는 영역이 도시되어 있다.
도 6은 5개의 개별적 발현 카세트 및 이에 의해 암호화되는 RNAi 작용제와 함께, 다이서에 의한 프로세싱 후의 이펙터 서열의 개략도이다. 이 발현 카세트는 SEQ ID NO: 3, 9, 12, 13 및 23에 기반한다.
도 7은 (a) 짧은 헤어핀 RNAi(shRNAi) 작용제 형태에서 개별적 RNAi 작용제를 발현하기 위해 각각 별도의 프로모터 및 터미네이터 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 이펙터 서열(도 7a); 또는 (b) 단일 다중 스템 루프 RNAi 작용제가 발현되도록 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 제1 이펙터 서열 및 터미네이터와 작동가능하게 연결되어 있는 제3 이펙터 서열을 포함하는 다수 이펙터 서열 발현 카세트의 개략도이다. 이 발현 카세트는 SEQ ID NO: 1, 4 및 6에 기반한다.
도 8은 단일 긴 헤어핀 RNAi 작용제를 생성시키는, SEQ ID NO: 1, 4 및 6에 기반하는 다수 이펙터 서열 발현 카세트의 개략도이다.
도 9는 HepG2 2.2.15 세포 내로 트랜스펙션(transfection) 후 SEQ ID NO: 1 내지 14 및 20 내지 27의 유전자 넉다운(knockdown) 효율을 도시한다. 넉다운 효율은 폴리머라제 유전자 mRNA의 qRT-PCR 분석에 의해 결정되었다. siNC는 음의 대조용으로, HBV 내의 미지의 표적 서열을 갖는 siRNA이며, 정상은 트랜스펙션되지 않은 세포 내의 폴리머라제 mRNA 양으로, 레벨 1으로 표준화된다.
도 10a 및 10b는 표 3 및 4에 기재된 조건을 사용하여 pGL3-23을 표적화하는 다양한 양의 화학적으로 합성된 siRNA23(A) 또는 shRNA23 발현 구조체(B)로 트랜스펙션된 세포 내의 루시퍼라제(luciferase) 활성(+/- SD; n=4)을 보여준다. 도 10a에서, siNC는 음의 대조용으로서, 그리고 동일하지 않은 트랜스펙션으로 인한 잠재적 아티팩트(potential artifact)를 피하기 위해 세포에 첨가되는 siRNA의 총량을 조절하는데 둘 다에 사용되었으며, siRNA GL3는 양의 대조용으로서 사용되었으며, 이는 루시퍼라제 유전자에 표적화되는 siRNA이다. 도 10b에서는, pUC57이 음의 대조용으로서 그리고 동일하지 않은 트랜스펙션으로 인한 잠재적 아티팩트를 피하기 위해 세포에 첨가되는 플라스미드 DNA의 총량을 조절하는데 둘 다에 사용되었다. GL3 siRNA에 기반한 루시퍼라제 shRNA를 발현하는 플라스미드가 양의 대조용으로서 사용되었다.
도 2는 HBV 폴리머라제 유전자를 따라 얻어진 642개의 siRNA 클론의 분포를 보여주며, 여기서 라인은 각각의 전체 siRNA 표적(EsT) 클론에 상응하는 영역을 나타낸다.
도 3은 HBV 폴리머라제 발현 3의 SEC 억제로 얻어진 초기 스크리닝 결과를 검증하기 위해서 siRNA 발현 카세트(SECs)와 이에 상응하는 합성 siRNA의 HBV 폴리머라제 mRNA 양에 미치는 RNAi 효과를 비교한 것이다.
도 4는 EsT 라이브러리로부터 유래되는 501개의 siRNA 서열을 이용한 HBV 폴리머라제 억제 스크린의 결과이다.
도 5a는 HBV 폴리머라제 유전자를 따라 가장 효과적인 상위 100개의 siRNA 서열(도 4의 대규모 스크린에서 확인됨)의 분포를 도시한 것이다. 도 5b는 소정의 서열이 어떻게 HBV 폴리머라제 유전자에 매핑될(mapped) 수 있는지를 도시한다. SEQ ID NO: 1 내지 3이 기반이 되는 영역이 도시되어 있다.
도 6은 5개의 개별적 발현 카세트 및 이에 의해 암호화되는 RNAi 작용제와 함께, 다이서에 의한 프로세싱 후의 이펙터 서열의 개략도이다. 이 발현 카세트는 SEQ ID NO: 3, 9, 12, 13 및 23에 기반한다.
도 7은 (a) 짧은 헤어핀 RNAi(shRNAi) 작용제 형태에서 개별적 RNAi 작용제를 발현하기 위해 각각 별도의 프로모터 및 터미네이터 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 이펙터 서열(도 7a); 또는 (b) 단일 다중 스템 루프 RNAi 작용제가 발현되도록 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 제1 이펙터 서열 및 터미네이터와 작동가능하게 연결되어 있는 제3 이펙터 서열을 포함하는 다수 이펙터 서열 발현 카세트의 개략도이다. 이 발현 카세트는 SEQ ID NO: 1, 4 및 6에 기반한다.
도 8은 단일 긴 헤어핀 RNAi 작용제를 생성시키는, SEQ ID NO: 1, 4 및 6에 기반하는 다수 이펙터 서열 발현 카세트의 개략도이다.
도 9는 HepG2 2.2.15 세포 내로 트랜스펙션(transfection) 후 SEQ ID NO: 1 내지 14 및 20 내지 27의 유전자 넉다운(knockdown) 효율을 도시한다. 넉다운 효율은 폴리머라제 유전자 mRNA의 qRT-PCR 분석에 의해 결정되었다. siNC는 음의 대조용으로, HBV 내의 미지의 표적 서열을 갖는 siRNA이며, 정상은 트랜스펙션되지 않은 세포 내의 폴리머라제 mRNA 양으로, 레벨 1으로 표준화된다.
도 10a 및 10b는 표 3 및 4에 기재된 조건을 사용하여 pGL3-23을 표적화하는 다양한 양의 화학적으로 합성된 siRNA23(A) 또는 shRNA23 발현 구조체(B)로 트랜스펙션된 세포 내의 루시퍼라제(luciferase) 활성(+/- SD; n=4)을 보여준다. 도 10a에서, siNC는 음의 대조용으로서, 그리고 동일하지 않은 트랜스펙션으로 인한 잠재적 아티팩트(potential artifact)를 피하기 위해 세포에 첨가되는 siRNA의 총량을 조절하는데 둘 다에 사용되었으며, siRNA GL3는 양의 대조용으로서 사용되었으며, 이는 루시퍼라제 유전자에 표적화되는 siRNA이다. 도 10b에서는, pUC57이 음의 대조용으로서 그리고 동일하지 않은 트랜스펙션으로 인한 잠재적 아티팩트를 피하기 위해 세포에 첨가되는 플라스미드 DNA의 총량을 조절하는데 둘 다에 사용되었다. GL3 siRNA에 기반한 루시퍼라제 shRNA를 발현하는 플라스미드가 양의 대조용으로서 사용되었다.
정의
본 명세서에서 사용되는, "포함한다" 및 그 변형어, 예컨대 "포함하는", "포함하다" 및 "포함되는"이라는 용어는 전후 문맥이 요구되는 경우를 제외하고는, 추가적 첨가물, 성분, 정수 또는 단계를 배제하기 위한 의도는 아니다.
"RNA 간섭" 또는 "RNAi"라는 용어는 일반적으로 세포의 세포질 내의 이중가닥 RNA(dsRNA) 분자에 의해 개시되는 RNA 의존성 유전자 침묵 프로세스를 의미한다. dsRNA는 표적 핵산 서열의 발현을 감소시키며, RNA 발현 산물이 감소되는 DNA이거나, 또는 dsRNA 분자와 실질적인 또는 전체적인 상동관계를 공유하는 RNA일 수 있다.
"이중가닥 RNA" 또는 dsRNA는 상동성을 공유하는 표적 핵산 서열의 발현을 억제시킬 수 있는 이중가닥 RNA 분자를 의미한다. 일부 구현예에서, dsRNA는 적어도 1개의 뉴클레오티드에 의해 임의선택적으로 연결되어 있는 듀플렉스 영역을 가지는 헤어핀 또는 스템 루프 구조이며, "헤어핀 RNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNAi 작용제" 또는 "shRNA"라고 칭한다. 듀플렉스는 이펙터 서열과 본 명세서에서 "이펙터 보체"라고 칭하는 이펙터 서열에 상보적인 서열 사이에 형성된다. 전형적으로, 이펙터 보체는 그 상응 이펙터 서열과 동일한 길이일 것이다. 이후에 설명되는 바와 같이, 이펙터 서열은 표적 핵산 배열에 상보적이다.
"이펙터 서열"은 RISC 복합체의 일부가 HBV 표적 뉴클레오티드 서열에 결합하고, 그럼으로써 세포에 의한 파괴를 위해 그 서열을 표적화하는 뉴클레오티드 서열이다. 이는 배경기술 항목에서 논의된 "가이드" 스트랜드와 유사하다. 이펙터 서열은 표적 영역으로부터의 전사체에 서열 상보적이거나 실질적으로 상보적이어서 표적 영역을 "지향하므로", 이펙터 서열을 포함하는 이중가닥 부분을 갖는 RNA 작용제는 표적 유전자 서열의 발현을 억제시킨다.
배경기술 항목에서 논의된 패신저 스트랜드와 유사한 "이펙터 보체"는 이펙터 서열로 어닐링되기에 충분히 이펙터에 상보적이다. 이펙터 보체는 표적 유전자 서열과 유사한 서열을 가질 것으로 생각되나, 반드시 그래야 할 필요는 없다.
"RNAi 작용제"라는 용어는 RNAi를 유도해 내는 dsRNA 서열을 의미한다. 이 용어는 "작은 간섭 RNA"(siRNA 작용제) 및 작은 헤어핀 RNA(shRNA 또는 hpRNAi 작용제)와 상호교환하여 사용될 수 있다.
RNAi 작용제의 이중가닥 또는 듀플렉스 영역은 적어도 17개의 염기쌍 길이를 가지며, 일반적으로 17 내지 30개의 염기쌍의 범위 내에 있다. RNAi 작용제는 세포 외부에서 화학적으로 또는 효소적으로 합성된 후에 세포로 전달되거나, 또는 세포 내에서 적합한 벡터에 의해 생체내 발현될 수 있다(예컨데 U.S. Pat. No.6,573,099, WO 2004/106517 및 WO99/49029 참조, 이 모두는 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다).
"DNA-지향 RNAi 작용제" 또는 "ddRNAi 작용제"라는 용어는 DNA 발현 카세트("ddRNA 발현 카세트")로부터 전사되는 RNAi 작용제를 의미한다. 발현 카세트로부터 전사되는 ddRNA 작용제는 적어도 2개의 뉴클레오티드에 의해 연결되는 듀플렉스 영역을 가지는 헤어핀 구조 내로 자기-어닐링(self-annealing)을 할 수 있는 단일 RNA로서, 또는 다중 shRNA 도메인을 가지는 단일 RNA 또는 각각 단일 shRNA로서 폴딩될 수 있는 다중 전사체로서 전사될 수 있다.
ddRNAi 발현 카세트는 ddRNAi 벡터 또는 ddRNAi 구조체라고 칭하는 벡터에 결찰(ligated)될 수 있다. 벡터는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 ddRNAi 발현 카세트의 전사를 특정하는 서열을 제공할 수 있다. 벡터는 추가적으로 ddRNAi 발현 카세트의 전달 매체(delivery vehicle)로서 역할을 할 수 있다. 예를 들어 바이러스 기반 벡터는 ddRNAi 발현 카세트의 발현에 유용할 뿐만 아니라 바이러스성 전달과 상용할 수 있는 ddRNAi 구조체를 생성할 것이다.
외인성(exogenous) 또는 이종(heterologous) 핵산이 세포 내로 도입되는 경우, 세포는 이러한 헥산 또는 벡터에 의해 "형질전환(transformed)", "형질도입(transduced)" 또는 "트랜스펙션(transfected)"된다. 형질전환 DNA는 세포의 게놈 내에 통합(공유 결합)될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 진핵세포의 경우, 안전하게 형질전환된 세포는 형질전환 DNA가 세포 복제과정 동안 딸세포에 의해 유전되도록 형질전환 DNA가 숙주세포 염색체 내에 통합되거나 염색체 외에서(에피솜으로) 유지되는 세포이다. 비복제 분화 세포의 경우, 형질전환 DNA는 에피솜으로서 지속될 수 있다.
"유전자 발현"은 전사 또는 번역 중 하나 또는 둘 다에 대한 언급일 수 있다.
"발현의 억제"는 표적 유전자로부터의 단백질 및/또는 mRNA 산물의 양의 부재 또는 관측가능한 감소를 의미한다. 억제는 완전하지 않아도 되며, 본 발명의 RNAi 또는 ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제 또는 ddRNAi 구조체의 투여 결과로서 검출가능하거나 관찰가능한 변화가 존재하기에 충분한 부분적 억제일 수 있다. 억제는 ddRNAi 작용제 또는 구조체가 없는 세포에 비해 표적 핵산으로부터의 mRNA 및/또는 단백질 산물의 양의 감소를 결정함으로써 측정될 수 있으며, 1%, 5% 또는 10%와 같이 낮은 수준일 수도 있고 완전한, 즉 100% 억제일 수도 있다. 억제 효과는 외관 특성(outward properties), 즉 세포나 유기체의 정량적 및/또는 정성적 표현형(phenotype)의 검사에 의해 결정될 수 있으며, 또한 본 발명의 ddRNAi 작용제 또는 구조체 투여 후 바이러스 부하량의 평가를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "정량적 표현형 특징"이라는 것은 숙주세포 내의 핵산의 분자 발현과 관련된 특징을 의미하며, 따라서 전사 또는 복제된 RNA 분자의 양, 전사후 단계에서(post-transcriptionally) 변형된 RNA 분자의 양, 번역된 펩티드 또는 단백질의 양, 또는 이러한 펩티드 또는 단백질의 활성을 포함할 수 있다.
핵산의 표현형 발현 감소는 표현형이 정성적 특징인 경우 본 발명의 RNAi 작용제의 존재 하에 RNAi 작용제가 없는 경우와 비교할 때 표현형 특징이 다른 상태로 전환된다는 것을 의미한다. 따라서, 핵산의 표현형 발현 감소는 그 핵산(의 일부)의 안정한 상태 수준의 감소, 그 핵산(의 일부)의 번역의 감소로서, 혹은 전사된 RNA(들) 또는 번역된 폴리펩티드(들)의 존재가 진핵 세포 또는 그 기관에 미치는 영향의 감소로서 측정될 수 있으며, 최종적으로 변화된 표현형 특징을 유도할 것이다. 관심의 대상인 핵산의 표현형 발현 감소는 관찰가능한 표현형 변화를 수반할 수 있거나 그와 관련성이 있을 수 있다는 것이 분명하다. 평가는 노던 하이브리다이제이션(Northern hybridization), 정량적 실시간 PCR 분석, 유전자 발현 분석, 항체 결합, ELISA, RIA, 웨스턴 블로팅(western blotting) 및 기타 다른 분석과 같은 생화학적 기법 및 당해 분야에 알려진 기법에 의해 이루어질 수 있다.
"표적 핵산"은 그 전사 산물이 표적화, 암호화 또는 비암호화 서열인, 내인성 또는 외인성 RNA 또는 DNA일 수 있다. 바람직한 구현예에서, DNA 바이러스 B형 간염 바이러스의 폴리머라제(P) 유전자가 억제를 위해 표적화된다. 따라서, 이 구현예에서, 표적 핵산은 적어도 폴리머라제 유전자의 RNA 전사체이다.
표적을 위한 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 상보적이거나 실질적으로 상보적이다. "실질적으로 상보적"이라는 것은 서열이 혼성화될 수 있거나 어닐링될 수 있다는 것을 의미한다. 실질적으로 상보적이라는 것은 바람직하게는 표적 유전자의 한 부분에 약 85% 상보적이다. 보다 바람직하게는 적어도 85 내지 90% 상보적이며, 가장 바람직하게는 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 상보적이다. 그러므로, 실질적인 상보성은 100% 상보성을 포함하지만, 100% 상보성은 또한 본 명세서 전체에 걸쳐 "상보적" 또는 "상보적인"이라고 칭할 수 있다.
표적 유전자의 영역에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 서열은 연속 표적 서열에 대해 서열 상보성 정도를 가진다. 일반적으로, 본 발명의 이중가닥 RNA 영역은 단일 또는 다수 뉴클레오티드 치환, 삭제 또는 첨가를 달성하기 위해 돌연변이될 수 있다.
"치료적 조성물" 또는 "약학적 조성물" 또는 "HBV 감염 치료를 위한 조성물"은 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트, ddRNAi 구조체 또는 siRNA 작용제를 포함하는 조성물을 의미한다.
"치료하다" 또는 "치료"라는 단어는 대상자의 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애를 완화(감소)시키기 위한 치료적 처리를 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 유리한 또는 원하는 임상 결과는 HBV 감염 증상의 완화, HBV 감염성 감소, 질환 정도의 최소화, 질환의 안정화(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 회복(부분적 또는 전체적 여부), 검출가능 또는 검출불가능 여부를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예측되는 생존기간에 비해 생존기간을 연장시키는 것을 의미한다. 치료는 반드시 HBV 감염의 완전한 제거의 결과를 얻게 되는 것이 아니라, 감염 합병증 및 부작용 및 감염 진행을 감소 또는 최소화할 수 있다.
"치료학적으로 유효한 양"이라는 것은 (i) 특정 질환, 상태 또는 장애를 치료하거나, (ii) 특정 질환, 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상을 감소, 완화 또는 제거하거나, (iii) 본 명세서에 기재된 특정 질환, 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상의 시작을 지연시키는 본 발명의 화합물의 양을 의미한다.
상세한 설명
본 발명은 신규한 RNAi 작용제 및 감염된 개인의 HBV 표적화를 위한 RNAi 작용제의 용도를 제공한다. HBV 치료는 다음을 목적으로 한다.
i. 한 개인으로부터 다른 개인으로 HBV의 전염 및 확산을 방지하기 위해 감염성을 제거; 및
ii. 감염된 개인의 간 질환의 전체 진행을 최소화.
ddRNAi 작용제
DNA 기반 ddRNAi 발현 카세트로부터 발현되는 RNAi 작용제는 DNA-지향 RNAi 작용제 또는 ddRNAi 작용제라고 칭한다. 이 작용제는 최소의 오프-타겟 이벤트(off-target events)를 갖는 유전자의 활성을 직접 표적화할 수 있다. "오프-타겟 이벤트"는 표적이 아닌 핵산의 발현은 RNAi 또는 ddRNAi 작용제에 의해 억제되지 않는다는 것을 의미한다. HBV 감염의 경우, 이 작용제는 충족되지 않는 HBV에 대한 임상적 치료 요구를 해결하기 위한 특별한 기회를 제공한다. 따라서, 본 발명의 한 양태에 있어서, B형 간염 바이러스(HBC) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키기 위한 DNA-지향 RNA 간섭(ddRNAi) 작용제가 제공되며, 이 때 ddRNAi 작용제는 적어도,
길이가 적어도 17개 뉴클레오티드인 제1 이펙터 서열; 및
제1 이펙터 보체 서열
을 포함하며, 여기서 제1 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적이다.
전형적으로, 제1 이펙터 서열은 제1 이펙터 보체 서열과 이중가닥 영역을 형성한다.
본 발명의 ddRNAi 작용제의 서열은 표적 특이적 RNAi를 매개하기 위해서 HBV 유전자의 영역에 대해 충분한 상보성을 가진다. "실질적으로 상보적"이라는 것은 서열이 혼성화될 수 있거나 어닐링될 수 있다는 것을 의미하며, 다음의 두 경우 중 하나이다.
·제1 이펙터 서열의 서열은 표적 서열 중 적어도 17개 이상의 인접 뉴클레오티드에 적어도 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 또는 90% 상보적이며, 보다 바람직하게는 적어도 약 90, 91, 92, 92, 94 또는 95% 상보적이며, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95, 96, 97, 98 또는 99% 상보적이거나, 또는 표적 서열 중 17개 이상의 인접 뉴클레오티드에 완전히(즉, 100%) 상보적이다. 혹은
·이펙터 서열은 표적과 100% 상보적인 적어도 10개 이상의 인접 뉴클레오티드 및 바람직하게는 표적 서열과 염기쌍을 형성할 수 없는 6개 미만의 뉴클레오티드를 가진다. 그러므로 제1 이펙터 서열은 표적 서열과 G-C/A-U 염기쌍을 형성하지 않을 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 이러한 정도의 차이는 표적 서열의 발현을 억제시킬 수 있는 ddRNAi 작용제의 능력에 악영향을 주지 않을 것으로 생각된다.
제1 이펙터 서열이 표적 서열과 G-C/A-U 염기쌍을 형성하지 않을 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드를 가지는 경우, 그 차이는 제1 이펙터 서열의 처음 또는 마지막 5개 뉴클레오티드 내에 존재하며 이펙터 서열의 중심 부분에서 단지 1 또는 2개의 뉴클레오티드 변화를 가지는 것이 바람직하다.
ddRNAi 작용제는 또한 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드 길이로 구성되는 제1 이펙터 서열을 포함할 수 있으며, 이 때 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적이다. 그러므로 본 발명의 이 구현예에 따르는 ddRNA 작용제는 이펙터 서열/들의 길이 및 수에 의해 결정되는 최대 길이를 가진다. 즉, 각 이펙터 서열은 보다 긴 서열 내에 포함되지 않는다.
앞서 기술한 바와 같이, 실질적 상보성은 서열이 혼성화될 수 있거나 어닐링될 수 있다는 것을 의미하기 위한 것이다. "혼성화" 및 "어닐링" (및 문법적 동의어)이라는 용어는 뉴클레오티드 서열 면에서 본 명세서에서 상호교환하여 사용되며, 그 상보성으로 인해 왓슨-크리크(Watson-Crick) 염기쌍을 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 바람직하게 실질적으로 상보적인 서열은 중간 또는 높은 엄격성 조건 하에 혼성화될 수 있다.
·높은 엄격성 조건: 0.1xSSPE (or 0.1xSSC), 0.1%SDS, 65?
·중간 엄격성 조건: 0.2xSSPE (or 1.0xSSC), 0.1%SDS, 50?
대안적으로, 또한 "실질적으로 상보적"인 것이 특히 RNA 서열 면에서 RNA 내의 구아노신과 우리실 잔기 사이에 형성될 수 있는 소위 "워블쌍(wobble pair)"과 같은 비왓슨-크리크 염기쌍 형성과 관련이 있다는 점은 당해 숙련자에 의해 이해될 것이다. "상보적"은 왓슨-크리크 염기쌍 형성을 나타내는 일반적 방식으로 본 명세서에서 사용되며, "비-상보적"은 비-왓슨-크리크 염기쌍 형성을 의미하는 것으로 사용되나, 이러한 비-상보적 서열은 워블쌍 또는 다른 상호작용을 형성할 수 있다. 본 발명에 있어서, "비-쌍 형성" 서열은 그 사이에 왓슨-크리크 염기쌍이 형성되지 않는 서열과 특히 관련이 있다.
제1 이펙터 서열은 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 17 내지 50개의 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 17 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 제1 이펙터 서열은 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 제1 이펙터 서열이 17개의 뉴클레오티트보다 긴 경우, 제1 이펙터 서열의 적어도 17개의 인접 뉴크레오티드는 상보적 가닥과 이중가닥 영역을 형성하는 것이 바람직하다.
본 발명의 ddRNAi 작용제는 HBV 핵산 서열의 발현을 억제시킨다. 바람직하게, HBV 표적 유전자는 폴리머라제(P) 유전자로 표현되는 핵산 서열이다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 ddRNAi 작용제는 B형 간염 바이러스(HBV) 폴리머라제 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시킨다. HBV 게놈은 오버래핑 개방형 판독 프레임을 가진다. 그리하여, 폴리머라제 유전자의 특정 서열 표적화는 또한 오버래핑 유전자 내의 동일한 서열을 표적화할 것이다. 그러므로 본 발명의 작용제는 단일 이펙터 서열을 가진 다중 유전자를 표적화할 수 있다. 그러나 각각의 바람직한 구현예에서, 적어도 폴리머라제 유전자가 표적화된다.
특정 구현예에서, 제1 이펙터 서열은 하기에 기재되어 있는 ddRNAi HBV 폴리머라제 이펙터 서열 SEQ ID NO: 1 내지 19, 또는 SEQ ID NO: 20 내지 27 중 어느 한 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택된다. 간단하게, SEQ ID NOS:는 SEQ ID NO: 1 내지 27를 일괄하여 칭하는 것이다.
| SEQ ID | RNAi 이펙터 서열 a |
HBV
표적 부위 b |
nts |
유전자
표적 c |
| 1 | GAUUGACGAUAAGGGAGA | 109-126 | 18 | pol |
| 2 | UUGAAGUCCCAAUCUGGAU | 2935-2953 | 19 | pol |
| 3 | GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC | 1139-1161 | 23 | pol |
| 4 | UAUUUGCGGGAGAGGACAACAGAGUUAUC | 1335-1363 | 29 | pol |
| 5 | UCCUGAUGUGAUGUUCUCCAUGU | 155-177 | 23 | pol & HBsAg |
| 6 | AAGGCCUCCGUGCGGUGGGG | 3019-3038 | 20 | pol |
| 7 | GGUAUUGUUUACACAGAAAGGC | 1116-1137 | 22 | pol |
| 8 | GAUGUGUUCUUGUGGCAAG | 908-926 | 19 | pol |
| 9 | GGGAAAGCCCUACGAACCACU | 698-718 | 21 | pol & HBsAg |
| 10 | GUGGAGACAGCGGGGUAGGC | 3128-3147 | 20 | pol |
| 11 | GAGGACAACAGAGUUAUC | 1335-1352 | 18 | pol |
| 12 | GCCCACUCCCAUAGGAAUUUUCC | 631-653 | 23 | pol & HBsAg |
| 13 | GGAUCUUGCAGAGUUUGG | 18-35 | 18 | pol |
| 14 | CGUUGCCGGGCAACGGGGUA | 1146-1165 | 20 | pol |
| 15 | GCAAUUUCCGUCCGAAGGUUUGG | 575-597 | 23 | pol & HBsAg |
| 16 | GUUGGAGGACAGGAGGUUGG | 340-359 | 20 | pol & HBsAg |
| 17 | GUUGGAGGACAGGAGGUUGGUG | 338-359 | 22 | pol & HBsAg |
| 18 | GAAGUGCACACGGUCCGGCAGA | 1568-1589 | 22 | pol & X |
| 19 | CAAGAUGCUGUACAGACUUGGC | 762-783 | 22 | pol & HBsAg |
| 20 | GGGAGAGGACAACAGAGUUAUC | 1335-1356 | 22 | pol |
| 21 | CGGGAGAGGACAACAGAGUUAU | 1336-1357 | 22 | pol |
| 22 | GCGGGAGAGGACAACAGAGUUA | 1337-1358 | 22 | pol |
| 23 | UGCGGGAGAGGACAACAGAGUU | 1338-1359 | 22 | pol |
| 24 | UUGCGGGAGAGGACAACAGAGU | 1339-1360 | 22 | pol |
| 25 | UUUGCGGGAGAGGACAACAGAG | 1340-1361 | 22 | pol |
| 26 | AUUUGCGGGAGAGGACAACAGA | 1341-1362 | 22 | pol |
| 27 | UAUUUGCGGGAGAGGACAACAG | 1342-1363 | 22 | pol |
a Genbank ID U95551에 따르는 HBV 게놈의 표적에 기반한 이펙터 서열의 서열
b U95551의 서열에 기반한 HBV 게놈 내의 표적 위치; 이펙터 서열은 이들 위치의 역상보(reverse complement)이다.
c ORFs 표적화: pol은 폴리머라제를 나타내고, HBsAg는 HBV 표면 항원을 나타내고, X는 X 단백질을 나타낸다.
배경기술 항목에서 설명한 바와 같이, dsRNA의 두 가닥은 이펙터 서열이 될 잠재성을 가진다. 그러나, 서열의 특정한 특징이 RISC에 진입하기 위해 한 가닥을 선호할 수 있고 나머지 다른 한 가닥은 파괴되는 증거가 존재한다. RISC 복합체의 단백질 Argonaut 2(AGO2)가 5'A 및 보다 적은 수준으로 5'U를 갖는 서열에 대한 선호도를 가진다는 증거가 존재한다. 또한 RNA 듀플렉스에 대한 열역학적 안정성(thermodynamic stability)을 "감지"하고 듀플렉스의 덜 안정한 말단으로부터의 서열을 도입하는 것을 선호하는 메커니즘으로 인해, 5' 영역 내의 높은 AU 함량을 가진 RNA 서열이 RISC 복합체 내에 우선적으로 로딩되는 것으로 생각된다. 이들 서열 선호도가 바람직한 구현예에서 반영되지만, 필수적인 것은 아니다.
예를 들어, 본 발명의 이러한 양태의 한 구현예에서, B형 간염 바이러스(HBV) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키기 위한 DNA-지향 RNA 간섭(ddRNAi) 작용제가 제공되며, 이 때 ddRNA 작용제는 적어도
GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQ ID NO:1) 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 제1 이펙터 서열; 및
제1 이펙터 보체 서열을 포함한다.
제1 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적이다.
바람직하게 제1 이펙터 서열은 GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQ ID NO:1) 내의 적어도 17개 이상의 인접 뉴클레오티드이다.
제1 이펙터 서열이 SEQ ID NO:1과 다른 뉴클레오티드를 1, 2, 3, 4 또는 5개 가지는 경우, 그 차이는 바람직하게는 처음 또는 마지막 5개의 뉴클레오티드 내에 존재하며, 적어도 중심의 10개의 뉴클레오티드는 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 100% 상보적인 것이 바람직하다.
대안적인 구현예에서, ddRNAi 작용제는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID:19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:26 및 SEQ ID NO:27 내의 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드의 제1 이펙터 서열을 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, ddRNAi 작용제는 적어도 70%까지 표적 유전자 영역의 발현을 억제시킬 수 있는 서열 내의 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드의 제1 이펙터 서열을 포함한다. 바람직하게, 이 구현예에서, 제1 이펙터는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:23으로부터 선택된다.
제1 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있거나, 아니면 각 이펙터 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드가 변화된 SEQ ID NO: 1 내지 27의 변형체일 수 있다. 추가적인 구현예에서, 각 이펙터는 22개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 이 중 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개 모든 뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열의 인접 뉴클레오티드이다.
다수 표적화 ddRNAi 작용제
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, ddRNAi 작용제는 HBV 게놈의 하나보다 많은 표적 서열을 표적화할 수 있는 둘 이상의 이펙터 서열을 포함한다. 다수 표적 서열은 HBV 유전자의 동일 영역에 존재할 수 있다. 예를 들어, 가닥들 사이의 서열의 자연적 변화를 갖는 17 내지 30개의 뉴클레오티드 영역, 또는 약물 내성을 부여하는 단일 뉴클레오티드 다형(polymorphism)이 있다. 대안적으로, 표적 서열은 하나의 표적 유전자의 상이한 영역에 존재할 수 있다.
보다 높은 특이성을 제공하기 위해서, ddRNAi 작용제는
·적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제1 이펙터 서열;
·적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제2 이펙터 서열;
· 제1 이펙터 보체 서열; 및
· 제2 이펙터 보체 서열
을 포함한다(특정 순서 없음).
다수 표적화 ddRNAi 작용제의 제1 및 제2 이펙터 서열은 그들의 각 이펙터 보체와 이중가닥 영역을 형성한다. 바람직하게, 제1 및 제2 이펙터 서열은 17 내지 30개의 뉴클레오티드 길이이다. 보다 바람직하게, 제1 및 제2 이펙터 서열은 둘 다 앞서 표 1에 기재되어 있는 서열 중의 어느 한 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택되거나, 표 1에 기재되어 있는 서열과 다른 뉴클레오티드를 1, 2, 3, 4 또는 5개 가지는 서열이다.
한 구현예에서, 제1 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군 중 하나로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택되며, 제2 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군 중 하나로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택된다. 제1 및 제2 이펙터 서열은 둘 다 동일한 서열일 수도 있고, 아니면 상이한 서열일 수도 있다.
제1 및 제2 이펙터 서열은 각각 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택되는 서열을 포함할 수도 있고, 아니면 각 이펙터 서열은 또한 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드가 변화된 SEQ ID NO: 1 내지 27의 변형체일 수 있다. 추가적인 구현예에서, 각 이펙터 서열은 22개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 이 중 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개 모든 뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열의 인접 뉴클레오티드이다. 둘 이상의 이펙터 서열이 존재하는 경우, 이 서열들은 앞서 기술한 3가지 유형의 조합을 제공할 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 제1 및 제2 이펙터 서열은 적어도 70%까지 표적 유전자 영역의 발현을 억제시킬 수 있는 서열 내의 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 이 구현예에서 각 이펙터 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:23으로부터 선택된다.
다수 이펙터 서열을 갖는 ddRNAi 작용제의 사용은 많은 현 항바이러스 치료법의 문제점인, 회피 돌연변이체(escape mutants)의 출현을 제한하고 이를 표적화하는 장점을 가진다. 본 발명의 한 양태는 표적 유전자의 유전적 서열에 기반한 RNAi 서열 및 추가로 RNAi 치료에 저항하기 위해 생기는 점 돌연변이체(point mutations)의 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제로 새로 나타난 회피 돌연변이체를 중화시킨다.
유사하게, 다수 이펙터 서열을 갖는 ddRNAi 작용제는 상이한 바이러스 표현형 또는 유사종(quasi-species)에서 발견되는 일련의 서열을 표적화할 수 있는 장점, 뿐만 아니라 단일 이펙터 서열에 비하여 다수 이펙터 서열을 사용하여 달성되는 추가적 또는 상승적 효과의 이점을 가진다.
그러나 앞서 기술한 바와 같이, 단일 이펙터 서열은 표적 서열이 2개 이상의 유전자에서 공통일 때 다중 표적화를 달성할 수 있다. HBV는 다수의 오버래핑 판독 프레임을 포함하므로, 오버래핑 영역 내의 서열을 표적화함으로써 그 서열을 포함하는 유전자 둘 다의 발현을 억제시킬 것이다.
긴 헤어핀 버전
ddRNAi 작용제가 하나보다 많은 이펙터 서열을 포함하고 ddRNAi 작용제가 RNA의 단일가닥으로서 발현되는 경우, 그 ddRNAi 작용제는 이펙터 서열 및 이 이펙터 서열에 상보적인 서열의 순서에 따라 상이한 구조를 형성하도록 폴딩될 것이다. 한 구현예에서, B형 간염 바이러스(HBV) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키기 위한 DNA-지향 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되며, 이 때 ddRNAi 작용제는 5' 에서 3' 방향으로 적어도,
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제1 이펙터 서열;
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제2 이펙터 서열;
제2 이펙터 보체 서열; 및
제1 이펙터 보체 서열
을 포함하며, 여기서 각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적이다. 이로써 도 1a에 도시된 바와 같은 구조를 갖는 ddRNAi 작용제를 얻게 될 것이다. 또한 본 명세서에 참조 문헌으로 포함되는 WO2004/106517을 참조한다.
대안적으로, 적어도 하나의 이펙터 및 바람직하게 두 이펙터 서열이 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 100% 상보적이다.
바람직하게 제1 및 제2 이펙터 서열은 둘 다 SEQ ID NO: 1 내지 27 중의 어느 한 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 한 구현예에서, B형 간염 바이러스(HBV) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키기 위한 DNA-지향 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되며, 이 때 ddRNAi 작용제는 5' 에서 3' 방향으로, 적어도
GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQ ID NO:1) 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 제1 이펙터 서열;
UUGAAGUCCCAAUCUGGAU(SEQ ID NO:2) 또는 GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC(SEQ ID NO:3) 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 제2 이펙터 서열;
제2 이펙터 보체 서열; 및
제1 이펙터 보체 서열
을 포함한다.
각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적이다.
대안적으로, 적어도 하나의 이펙터 및 바람직하게 두 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 100% 상보적이다.
특히 바람직한 구현예에서, 제1 및 제2 이펙터 서열은 적어도 70%까지 표적 유전자 영역의 발현을 억제시킬 수 있는 서열 내의 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 이 구현예에서 각 이펙터 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:23으로부터 선택된다.
ddRNAi 작용제가 3개의 이펙터 서열을 가지는 구현예인 또 다른 구현예에서, B형 간염 바이러스(HBV) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키기 위한 DNA-지향 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되며, 이 때 ddRNAi 작용제는 5' 에서 3' 방향으로, 적어도
GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQ ID NO:1) 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 제1 이펙터 서열;
UUGAAGUCCCAAUCUGGAU(SEQ ID NO:2) 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 제2 이펙터 서열;
GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC(SEQ ID NO:3) 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 제3 이펙터 서열;
제3 이펙터 보체 서열;
제2 이펙터 보체 서열; 및
제1 이펙터 보체 서열
을 포함한다.
각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적이다.
대안적으로, 적어도 하나의 이펙터 및 임의선택적으로 3개 이펙터 중 2개 또는 3개 모든 이펙터는 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 100% 상보적이다.
특히 바람직한 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 이펙터 서열은 적어도 70%까지 표적 유전자 영역의 발현을 억제시킬 수 있는 서열 내의 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 이 구현예에서, 각 이펙터 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:23으로부터 선택된다.
dsRNA를 형성하기 위해 이펙터 서열이 그 이펙터 보체와 함께 어닐링됨으로써 단일 긴 헤어핀 구조가 형성된다면, 이펙터 및 이펙터 보체의 순서는 변경될 수 있다는 점을 당해 숙련자는 또한 인지할 것이다. 예를 들어, 2-이펙터 서열 ddRNAi 작용제의 경우, 서열은 다음과 같은 예시적인 5' 에서 3' 순서로 배열될 수 있다.
·제1 이펙터 - 제2 이펙터 - 제2 이펙터 보체 - 제1 이펙터 보체,
·제1 이펙터 - 제2 이펙터 보체 - 제2 이펙터 - 제1 이펙터 보체,
·제1 이펙터 보체 - 제2 이펙터 보체 - 제2 이펙터 - 제1 이펙터,
·제1 이펙터 보체 - 제2 이펙터 - 제2 이펙터 보체 - 제1 이펙터.
3-이펙터 서열 ddRNAi 작용제의 경우, 서열은 다음과 같은 예시적인 5' 에서 3' 순서로 배열될 수 있다.
·제1 이펙터 - 제2 이펙터 - 제3 이펙터 - 제3 이펙터 보체 - 제2 이펙터 보체 - 제1 이펙터 보체,
·제1 이펙터 - 제2 이펙터 보체 - 제3 이펙터 - 이펙터 보체 - 제2 이펙터 보체 - 제1 이펙터 보체,
·제1 이펙터 - 제2 이펙터 - 제3 이펙터 보체 - 제3 이펙터 - 제2 이펙터 보체 - 제1 이펙터 보체,
·제1 이펙터 보체 - 제2 이펙터 보체 - 제3 이펙터 보체 - 제3 이펙터 - 제2 이펙터 - 제1 이펙터 보체,
·제1 이펙터 보체 - 제2 이펙터 보체 - 제3 이펙터 - 제3 이펙터 보체 - 제2 이펙터 - 제1 이펙터.
추가적 구현예에서, 제1 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택될 수 있고; 제2 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택될 수 있고; 제3 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택될 수 있고; 임의의 추가적 이펙터 서열은 SEQ ID NOS: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 각 이펙터 서열은 또한 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드가 변화된 SEQ ID NOS: 1 내지 27의 변형체일 수 있다. 바람직하게, 그 차이는 처음 및/또는 마지막 5개 뉴클레오티드 내에 존재하며, 적어도 중심의 11 내지 12개의 뉴클레오티드는 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 100% 상보적이다. 이러한 구현예는 특히 HBV 회피 돌연변이체, 뿐만 아니라 상이한 바이러스 표현형 또는 유사종을 표적화하는데 특히 유용하다.
제1, 제2 및 제3 이펙터 서열은 각각 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있고, 아니면 각 이펙터 서열은 또한 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드가 변화된 SEQ ID NOS: 1 내지 27의 변형체일 수 있다. 추가적인 구현예에서, 각 이펙터 서열은 22개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 이 중 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개 모든 뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열의 인접 뉴클레오티드이다. 다수 이펙터 서열이 존재하는 경우, 이 서열들은 앞서 기술한 3가지 유형의 조합을 제공할 수 있다.
다중 헤어핀 버전
대안적 구현예에서, B형 간염 바이러스(HBV) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키기 위한 DNA-지향 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되며, 이 때 ddRNAi 작용제는 5' 에서 3' 방향으로 적어도,
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제1 이펙터 서열;
제1 이펙터 보체;
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제2 이펙터 서열; 및
제1 이펙터 보체
를 포함하며, 여기서 각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적이다.
대안적으로, 적어도 하나의 이펙터, 및 바람직하게는 두 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 100% 상보적이다.
이는 ddRNAi 작용제를 발현하기 위해 사용되는 발현 카세트의 유형에 따라, 도 1b 또는 도 1c에 도시된 바와 같은 구조를 갖는 ddRNAi 작용제를 얻게 될 것이다(본 명세서에서 후술 내용 참조). 또한 본 명세서에 참조 문헌으로 포함되는 WO2005/087926 및 WO2006/084209를 참조한다.
바람직하게 제1 및 제2 이펙터 서열은 둘 다 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택된다. 예를 들어, 한 구현예에서, B형 간염 바이러스(HBV) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키기 위한 DNA-지향 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되며, 이 때 ddRNAi 작용제는 5' 에서 3' 방향으로, 적어도
GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQ ID NO:1) 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 제1 이펙터 서열;
제1 이펙터 보체 서열;
UUGAAGUCCCAAUCUGGAU(SEQ ID NO:2) 또는 GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC(SEQ ID NO:3) 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 제2 이펙터 서열; 및
제2 이펙터 보체 서열
을 포함한다.
각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적이다.
대안적으로, 적어도 하나의 이펙터 및 바람직하게 두 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 100% 상보적이다.
특히 바람직한 구현예에서, 제1 및 제2 이펙터 서열은 적어도 70%까지 표적 유전자 영역의 발현을 억제시킬 수 있는 서열 내의 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 이 구현예에서 각 이펙터 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:23으로부터 선택된다.
ddRNAi 작용제가 3개의 이펙터 서열을 갖는 구현예에서, B형 간염 바이러스(HBV) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키기 위한 DNA-지향 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되며, 이 때 ddRNAi 작용제는 5' 에서 3' 방향으로, 적어도
GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQ ID NO:1) 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 제1 이펙터 서열;
제1 이펙터 보체 서열;
UUGAAGUCCCAAUCUGGAU(SEQ ID NO:2) 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 제2 이펙터 서열;
제2 이펙터 보체 서열;
GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC(SEQ ID NO:3) 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 제3 이펙터 서열; 및
제3 이펙터 보체 서열
을 포함한다.
각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적이다.
대안적으로, 적어도 하나의 이펙터 및 임의선택적으로 3개 이펙터 중 2개 또는 3개 모든 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 100% 상보적이다.
특히 바람직한 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 이펙터 서열은 적어도 70%까지 표적 유전자 영역의 발현을 억제시킬 수 있는 서열 내의 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 이 구현예에서, 각 이펙터 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:23으로부터 선택된다.
추가적 구현예에서, 제1 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는군으로부터 선택되는 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드일 수 있고; 제2 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드일 수 있고; 제3 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드일 수 있고; 임의의 추가적 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드일 수 있다. 바람직하게, 각 이펙터 서열은 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드이다.
또한 각 이펙터 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드가 변화된 SEQ ID NO: 1 내지 27의 변형체일 수 있다. 바람직하게, 그 차이는 처음 및/또는 마지막 5개 뉴클레오티드 내에 존재하며. 적어도 중심의 10 내지 12개의 뉴클레오티드는 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 100% 상보적이다. 이러한 구현예는 특히 HBV 회피 돌연변이체, 뿐만 아니라 상이한 바이러스 표현형 또는 유사종을 표적화하는데 특히 유용하다.
제1, 제2 및 제3 이펙터 서열은 각각 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있고, 아니면 각 이펙터 서열은 또한 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드가 변화된 SEQ ID NOS: 1 내지 27의 변형체일 수 있다. 추가적인 구현예에서, 각 이펙터 서열은 22개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 이 중 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개 모든 뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열의 인접 뉴클레오티드이다. 다수 이펙터 서열이 존재하는 경우, 이 서열들은 앞서 기술한 3가지 유형의 조합을 제공할 수 있다. 또한, 긴 헤어핀 구조 또는 다중 헤어핀 구조에 있어서, ddRNAi 작용제는 하기의 공식 중 하나에 따르는 추가적 이펙터 서열 및 상응 보체 서열을 포함할 수 있다.
긴 헤어핀:
·[이펙터 서열]1 - 10[이펙터 보체 서열]1 - 10
다중 헤어핀:
·[이펙터 서열 - 이펙터 보체 서열]1 - 10
바람직하게, 긴 헤어핀 공식에 있어서, 이펙터 서열의 수는 이펙터 보체 서열의 수와 동일하다. 전형적으로, 2, 3, 4 또는 5개의 이펙터 서열과, 따라서 각각 2, 3, 4 또는 5개의 이펙터 보체 서열이 존재한다.
ddRNAi 작용제가 하나보다 많은 이펙터 서열을 포함하는 경우, 이펙터 서열은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. 예를 들어, ddRNAi 작용제가 3개 이펙터 서열을 포함하는 경우, 2개 이펙터 서열은 동일한 서열을 가지는 반면 하나는 상이할 수 있다. 대안적으로 3개 모든 이펙터가 상이할 수도 있다. 바람직하게, 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드이고, 아니면 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드가 변화된 SEQ ID NO: 1 내지 27의 서열의 변형체이다. 바람직하게, 그 차이는 처음 및/또는 마지막 5개 뉴클레오티드 내에 존재하며. 적어도 중심의 10개 내지 12개의 뉴클레오티드는 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 100% 상보적이다.
자연 발생적 변형체(예컨데, 상이한 표현형 또는 유사종), 회피 변이체 또는 단일 뉴클레오티드 다형(polymorphism)을 갖는 표적 서열의 단일 영역을 표적화하는 경우, 적어도 하나의 이펙터 서열이 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택되는 반면, 다른 이펙터 서열은 선택된 서열의 변형체인 것이 바람직하다. 예를 들어, 제1 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1의 20개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 따라서 제2 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1의 변형체이어야 한다.
헤어핀 구조
상술한 구현예에서, 이펙터 서열은 상응 이펙터 보체 서열과 혼성화함으로써 헤어핀 구조를 형성한다. 헤어핀의 말단에는 둘 이상의 비결합 뉴클레오티드가 '힌지(hinge)' 또는 '루프(loop)'를 형성한다. 한 구현예에서, 비결합 뉴클레오티드는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열의 일부이므로, 이펙터 서열의 적어도 17개 이상의 뉴클레오티드의 단지 일부가 상응 이펙터 보체 서열과 듀플렉스를 형성할 것이다. 예를 들어, 이펙터 서열 및 그 보체가 둘 다 22개의 뉴클레오티드 길이인 경우, 그 뉴클레오티드 중 19개가 염기쌍을 이루어 이중가닥 영역을 형성함으로써, 총 6개(각 가닥으로부터 3개)의 뉴클레오티드가 남게 되며 이펙터 서열과 그 이펙터 보체 서열 사이에 이를 연결하는 단일가닥 루프를 형성한다.
대안적 구현예에서, 그 자체에 비상보적인 추가적 서열, 표적 서열, 이펙터 서열 또는 이펙터 서열에 상보적인 서열이 ddRNAi에 포함될 수 있다. 이리하여, 본 발명의 또 다른 구현예에서, ddRNAi 작용제는 루프를 형성할 수 있는 2 내지 100개의 쌍을 이루지 않은(unpaired) 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 2 내지 10개의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 서열을 추가적으로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 루프는 뉴클레오티드 서열 AA, UU, UUA, UUAG, UUACAA, CAAGAGA 또는 N1AAN2를 포함하며, 이때 N1 및 N2는 C, G, U 및 A 중 어느 것이어도 되며, 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다.
ddRNAi 작용제 구조에 따라 하나 이상의 루프가 존재할 수 있다. ddRNAi 작용제가 공식 [이펙터 서열]1-10 [이펙터 보체 서열]1-10에 기반한 긴 헤어핀 구조를 가지는 경우, 추가적인 비-자기-상보적 서열은 단일 루프 구조를 생기게 하도록 도 1d에 도시된 바와 같이, 마지막 이펙터 서열과 이 마지막 이펙터 서열의 이펙터 보체 서열 사이에 포함된다. 그러므로 이 구현예에서, B형 간염 바이러스(HBV) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키기 위한 DNA-지향 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되며, 이 때 ddRNAi 작용제는 5' 에서 3' 방향으로 적어도,
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제1 이펙터 서열;
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제2 이펙터 서열;
2 내지 100개의 비-자기-상보적 뉴클레오티드의 서열;
제2 이펙터 보체 서열; 및
제1 이펙터 보체 서열
을 포함하며, 여기서 각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적이다.
ddRNAi 작용제가 공식 [이펙터 서열 - 이펙터 보체 서열]1-10에 기반한 다중 헤어핀 구조를 가지는 경우, 추가적인 비-자기-상보적 서열은 ddRNAi 작용제를 발현하기 위해 사용되는 발현 카세트의 유형에 따라, 도 1e 및 도 1f에 도시된 바와 같이, 루프 구조를 생기게 하도록 각 이펙터 서열과 그 상보적 서열 사이에 포함된다(본 명세서에서 후술 내용 참조). 이 구현예에서, B형 간염 바이러스(HBV) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키기 위한 DNA-지향 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제가 제공되며, 이 때 ddRNAi 작용제는 적어도 5' 에서 3' 방향으로,
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제1 이펙터 서열;
2 내지 100개의 비-자기-상보적 뉴클레오티드의 서열;
제1 이펙터 보체 서열;
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제2 이펙터 서열;
2 내지 100개의 비-자기-상보적 뉴클레오티드의 서열; 및
제2 이펙터 보체 서열
을 포함하며, 여기서 각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적이다.
이 구현예에서, 두개 보다 많은 이펙터 및 두개의 이펙터 보체 서열이 존재하고 따라서 두개 보다 많은 헤어핀 구조가 존재하는 경우, 각 루프 구조를 형성하는 추가적인 비-자기-상보적 서열의 길이는 동일하지 않아도 된다. 예를 들어, 하나의 루프 구조는 5개의 뉴클레오티드를 가질 수 있는 있는 반면, 다른 하나의 루프 구조는 9개의 뉴클레오티트를 가질 수 있다.
두가닥 ddDNAi 작용제
당해 분야 숙련자에 의해 인지되는 바와 같이, 전체 ddRNAi 작용제가 하나의 서열로서 발현되는 것이 필수적이지는 않다. 예를 들어, 본 발명의 한 구현예에서, 제1 이펙터 서열이 생성될 수 있고(예컨대, 한 DNA 서열에 의해 전사됨), 제1 이펙터 보체 서열이 생성될 수 있다(예컨대, 별도의 DNA 서열에 의해 전사됨). 임의선택적으로, 루프 서열은 전사체 또는 한 전사체의 3'말단 및 나머지 다른 전사체의 5'말단에 부착된 루프의 일부에 부착될 수 있다. 그 다음, 세포 내부에서, 두 전사체는 이펙터 서열/들과 그 보체/들 사이에서 어닐링을 통한 혼성화에 의해 ddRNAi 작용제를 형성한다.
시험관내 발현되는 ddDNAi 작용제 또는 화학적으로 합성되는 siRNA 작용제
만성 HBV 감염의 효과적인 치료는 (이후 약술될 바와 같이) ddRNAi 작용제가 ddRNAi 구조체로부터 생체내 발현되는 것이 필요할 것이라 예상되는 반면, 시험관내 발현되는 ddDNAi 작용제를 투여하거나 화학적으로 합성되는 siRNA 작용제를 투여하고, 그럼으로써 일시적인 치료법으로서 더 기능을 하는 것이 바람직한 경우가 존재할 수 있다. 예를 들어, 급성 HBV 감염은 세포 내에서 통합 및 복제되지 않는 siRNA를 이용한 단기간 치료의 이점을 가질 수 있다.
그러므로 본 발명의 ddRNAi 작용제는 시험관 내에서 발현된 후에 표적 세포로 전달될 수 있다. 대안적으로, siRNA는 화학적으로 합성된 후에 표적 세포로 전달될 수 있다. 이러한 점에서 볼 때, 본 발명의 또 다른 양태에서, B형 간염 바이러스(HBV) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키기 위한 작은 간섭 RNA 작용제(siRNA 작용제)가 제공되며, 이 때 siRNA는
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제1 이펙터 서열; 및
제1 이펙터 보체 서열
을 포함하며, 여기서 각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적이다.
앞서 기술한 ddRNAi 작용제와 유사하게, siRNA 작용제도 또한 다수 표적화를 위해 하나 보다 많은 이펙터 서열을 포함할 수 있다. 이펙터 서열은 바람직하게 HBV 폴리머라제 유전자를 표적화하며, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택된다.
siRNA의 설계에 있어서 상당한 융통성이 가능하다. 전형적으로 siRNA는 5'-인산염 및 3'-수산 잔기를 가지는 dsRNA 분자로 구성되며, 가닥의 길이는 21 내지 29 뉴클레오티드로 다양할 수 있고, 임의선택적으로 2개의 뉴클레오티드 3' 돌출부(overhangs)를 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 실시예에서, 각 가닥은 N19-27TT(여기서 TT는 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있음)로서 합성될 수 있다. siRNA는 앞서 기술한 바와 같이 SEQ ID NO: 1 내지 27의 영역에 기반하여 용이하게 설계될 수 있으며, 단일 서열 또는 어떠한 조합으로서 치료학적으로 사용될 수 있다. 대안적으로 siRNA 작용제는 ddRNA 발현 카세트로부터 발현되는 것과 유사하거나 동일한 이펙터 및 이펙터 보체 서열을 포함하는 단일 RNA 분자로 구성될 수 있다. 이들 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27에 기반할 수 있으며, 단일 서열 또는 어떠한 조합으로서 치료학적으로 사용될 수 있다. siRNA는 적절하게 보호되는 리보뉴클레오시드 포스포라미디트 및 통상적인 신시사이저(synthesizer)를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있으며, 따라서 상업적으로 광범위하게 입수할 수 있고 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 설계 및 합성될 수 있다. 바람직한 구현예에서, siRNA는 SEQ ID NOS: 1 내지 27 중 하나 이상으로부터 서열 내의 임의의 10개 이상 인접 뉴클레오티드의 서열을 가진다.
siRNA를 다른 세포계로 전달하기 위해서 다수의 트랜스펙션 시제가 사용되어 왔다. 통상적으로 리포펙타민 2000 및 올리고펙타민이 siRNA 전달에 사용된다. 또한 나출(naked) siRNA도 유체역학적 트랜스펙션 방법에 의해 전달될 수 있다. 다른 전달 방법은 당해 숙련자에 의해 알려져 있다.
ddDNAi 작용제 발현 카세트
앞서 설명한 바와 같이, ddRNAi 작용제는 임의의 적합한 벡터 또는 ddRNAi 구조체 내에 삽입되는 DNA 발현 카세트로부터 발현된다. ddRNAi 발현 카세트는
·하나 이상의 프로모터 서열;
·하나 이상의 이펙터 서열을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열;
·하나 이상의 이펙터 보체 서열을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열;
·하나 이상의 터미네이터 서열;
그리고 임의선택적으로
·루프 서열을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열;
·하나 이상의 인핸서 서열
을 포함한다(특정 순서 없음).
한 구현예에서, ddRNAi 작용제를 발현시키기 위한 DNA-지향 RNA 간섭 (ddRNAi) 발현 카세트가 제공되며, 이 때 ddRNA 작용제는 B형 간염 바이러스(HBV) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키며, ddRNAi 발현 카세트는 5' 에서 3' 방향으로
프로모터 서열;
제1 이펙터 서열을 암호화하는 DNA 서열;
임의선택적으로 루프를 형성할 수 있는 서열을 암호화하는 서열;
제1 이펙터 보체 서열을 암호화하는 DNA 서열; 및
터미네이터 서열
을 포함한다.
제1 이펙터 서열을 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27 중의 어느 하나로부터의 서열 내의 10개 이상, 바람직하게는 17개 이상의 인접 뉴클레오티드를 암호화하는 DNA인 것이 바람직하다. 특히 바람직한 구현예에서, 제1 이펙터 서열은 적어도 70%까지 표적 유전자 영역의 발현을 억제시킬 수 있는 서열 내의 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 이 구현예에서, 제1 이펙터 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:23으로부터 선택된다.
대안적으로, ddRNAi 작용제 자체에 대해 앞서 약술한 바와 같이, 이펙터 서열을 암호화하는 서열은, 표적 서열과 염기쌍을 형성하여 표적 서열의 발현을 억제시키는 암호화된 이펙터 서열의 능력에 영향을 주지 않고 SEQ ID NO: 1 내지 27로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드에 의해 변화되는 이펙터 서열을 암호화할 수 있다.
당해 숙련자는 소정의 RNA 서열을 암호화하는 DNA 서열이 우라실(U) 염기대신 티민(T) 염기를 가진다는 것을 제외하고는 RNA와 동일한 서열이라는 것을 인지할 것이다.
긴 헤어핀 구조의 하나보다 많은 이펙터 서열을 가지는 ddRNAi 작용제를 암호화하는 ddRNAi 발현 카세트는 5' 에서 3' 방향으로,
프로모터 서열;
제1 이펙터 서열을 암호화하는 DNA 서열;
제2 이펙터 서열을 암호화하는 DNA 서열;
임의선택적으로 루프를 형성할 수 있는 서열을 암호화하는 서열;
제2 이펙터 보체 서열을 암호화하는 DNA 서열;
제1 이펙터 보체 서열을 암호화하는 DNA 서열; 및
터미네이터 서열
을 포함한다.
바람직하게 DNA 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택되는 제1 및 제2 이펙터 서열을 암호화한다. 바람직하게, 제1 및 제2 이펙터 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:23으로부터 선택된다. 대안적으로, DNA 서열은, 표적 서열과 염기쌍을 형성하여 표적 서열의 발현을 억제시키는 암호화된 이펙터 서열의 능력에 영향을 주지 않고 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드에 의해 SEQ ID NO: 1 내지 27로부터 변화되는 이펙터 서열을 암호화할 수 있다.
ddRNAi 작용제가 하나보다 많은 이펙터 서열 및 공식 [이펙터 서열 - 이펙터 보체 서열]1-10에 기반한 다중 헤어핀 구조를 가지는 경우, 각 [이펙터 서열 - 이펙터 보체 서열] 쌍의 발현은 단일 프로모터에 의해, 아니면 별도의 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 별도의 프로모터가 고려되는 경우, ddRNAi 발현 카세트는 5' 에서 3' 방향으로,
프로모터 서열;
제1 이펙터 서열을 암호화하는 DNA 서열;
제1 이펙터 보체 서열을 암호화하는 DNA 서열;
임의선택적으로 터미네이터 서열;
프로모터 서열;
제2 이펙터 서열을 암호화하는 DNA 서열;
제2 이펙터 보체 서열을 암호화하는 DNA 서열; 및
터미네이터 서열
을 포함한다.
단일 프로모터가 고려되는 경우, ddRNAi 발현 카세트는 5' 에서 3' 방향으로,
프로모터 서열;
제1 이펙터 서열을 암호화하는 DNA 서열;
제1 이펙터 서열에 대한 이펙터 보체 서열을 암호화하는 DNA 서열;
제2 이펙터 서열을 암호화하는 DNA 서열;
제2 이펙터 서열에 대한 이펙터 보체 서열을 암호화하는 DNA 서열; 및
터미네이터 서열
을 포함한다.
이전 구현예와 유사하게, DNA 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택되는 제1 및 제2 이펙터 서열, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드에 의해 SEQ ID NOS: 1 내지 27의 서열이 변화된 이펙터 서열을 암호화하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 제1 및 제2 이펙터 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:23으로부터 선택된다.
대안적으로 ddRNAi 발현 카세트는 발현되는 ddRNAi 작용제의 총 길이를 기준으로 하여 기술될 수 있으며, 프로모터와 터미네이터 사이의 총 길이의 서열의 산물이다. 예를 들어, 단일 이펙터 ddRNAi의 이펙터 서열 길이가 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드로 구성되는 경우, ddRNAi 발현 카세트는 프로모터와 터미네이터 사이에 34 내지 60개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 것이다. 이 길이는 추가적으로 "루프" 또는 "힌지" 서열의 2 내지 100개의 뉴클레오티드를 포함함으로써, 36 내지 160개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 다수 이펙터 서열을 가지는 ddRNAi 작용제에 있어서, 각 이펙터 서열이 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드로 구성되는 경우, 총 길이는 비례적으로 증가한다.
본 발명의 ddRNAi 발현 카세트를 설계하는 유용한 한 방법은 다이서가 22개 뉴클레오티드(22nt 페이징(phasing)이라고도 칭함)마다 절단하고 shRNA의 염기로부터 프로세싱한다고 가정하는 것이다. 그러므로 이펙터 서열을 암호화하는 DNA 서열은 적절한 스페이서 및 적절한 프로모터에 필요한 다른 서열 요건과 함께, SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상, 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드를 암호화하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1 내지 27에 열거된 서열 중 몇몇은 22개 뉴클레오티드 보다 크다. 이 경우, 서열의 일부만이 프로모터와 작동가능하게 연결되는 것이 요구된다.
mRNA의 상이한 부위(site)를 표적화하는 작용제가 shRNA 구조체에 적합한데, 그 이유는 그 작용제가 mRNA의 2차 구조의 영향을 피할 수 있고, 따라서 독립적으로 그 기능을 수행할 수 있기 때문이다.
U6 프로모터가 사용되는 경우, 프로모터와 작동가능하게 연결되는 DNA 서열은 구아닌(G) 염기로 시작되는 것이 바람직하며; H1 프로모터가 사용되는 경우, 프로모터와 작동가능하게 연결되는 DNA 서열은 아데닌(A) 염기로 시작되는 것이 바람직하다. 그러므로 이에 따라 이펙터 암호화 서열이 변경될 수 있다. SEQ ID NO: 1 내지 27로부터의 일부 서열의 경우, 이펙터 서열이 22nts보다 짧을 수 있으며, 이 경우 HBV mRNA 표적 부위에 인접한 HBV 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 이는 HBV mRNA에 대한 이펙터 서열의 상동성을 최대화시키는 역할을 할 수 있으며, 또한 앞서 기술한 바와 같이 H6 또는 H1 프로모터로부터 효율적인 전사 개시가 이루어지도록 A 또는 G 잔기의 혼입을 가능하게 할 수 있다. 또한, 특히 US 전사의 경우, 이펙터 서열은 바람직하게 효율적인 U6 전사를 위해 필요한 5'G를 피하기 위해서 루프의 3'에 위치하는 것이 바람직하다.
일부의 경우, 이펙터, 이펙터 보체 또는 루프 서열 내의 DNA 서열 TTTT를 피하는 것이 바람직한데, 그 이유는 이 서열이 U6 또는 H1과 같은 Pol III 프로모터를 사용하는 발현 구조체 내에서 전사 터미네이터로서 역할을 할 수 있기 때문이다. 또한 shRNA 설계는 U6 종료(termination)가 shRNA에 대한 3'말단에 UU를 가하는 것으로 예상되는 점을 고려해야 한다. 긴 헤어핀 RNA를 설계할 때, 다이서 프로세싱된 이펙터 서열이 5'U 또는 A를 포함할 가능성을 최대화하기 위해서 이펙터 서열의 정밀한 선택(SEQ ID NO: 1 내지 27로부터 또는 이에 인접한 서열을 사용)을 수정함으로써 AGO2 내로의 도입을 촉진하는 것이 때로는 유리하다.
각 [이펙터 서열 - 이펙터 보체 서열]쌍의 발현을 조절하는지 여부에 대한 선택은 다수의 인자에 따라 다르다. 프로모터들 사이의 간섭을 최소화하기 위해서 단일 프로모터가 사용될 수 있다. 단일 프로모터만을 포함하는 ddRNAi 구조체는 또한 크기도 작으며, 이는 일부 경우에 있어서 제조(예컨대 대장균(E.coli)의 복제) 및 전달 과정 동안 구조체의 안정성을 위해 중요할 수 있다. 또한 단일 프로모터의 사용은 프로모터들 사이의 상동 재조합(homologous recombination)의 가능성을 방지한다.
각 이펙터 서열 또는 보체의 일정 정도의 발현 조절이 요구되는 경우, 다수 프로모터를 갖는 ddRNAi를 설계함으로써 각 [이펙터 서열 - 이펙터 보체 서열]쌍의 발현이 별도의 프로모터에 의해 조절되는 것이 유리하다. 이펙터 서열들이 상이한 서열인 경우, 서열의 본질은 한 서열이 보다 높은 발현 정도로 발현되는 것을 의미할 수 있다. 각 이펙터 서열의 보다 동등한 발현 정도를 보장하는 것이 바람직한 경우, 보다 고도로 발현되는 이펙터 서열이 보다 약한 프로모터와 짝을 이룰 수 있으며, 그 반대일 수도 있다. 또한, 보다 효율적인 발현은 전사되어야 하는 어느 한 서열의 길이가 보다 짧을 때 달성될 수 있다. 다수 프로모터가 사용되는 경우, 프로모터들 사이의 상동 재조합의 위험성을 최소화하기 위해서 모든 프로모터가 동일한 것은 아닌 것이 바람직하다. 2개 프로모터의 경우, 각 프로모터는 상이한 것이 바람직하다. 3개 프로모터의 경우, 최소한 2개 및 임의선택적으로 3개 모두 서로 상이하다.
이펙터 서열을 암호화하는 DNA 서열은 프로모터 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. 한 서열이 또 다른 뉴클레오티드 서열과 기능적 관계에 위치하고 있을 때, 한 서열이 또 다른 뉴클레오티드 서열과 "작동가능하게 연결되어" 있다고 한다. 예를 들어, 코딩 서열이 프로모터 서열과 작동가능하게 연결되어 있다면, 이는 일반적으로 프로모터가 코딩 서열의 전사를 촉진한다는 것을 의미한다. 작동가능하게 연결된다는 것은 연결되는 DNA 서열이 전형적으로 연속적이며, 두단백질 코딩 영역을 합치는데 필요한 경우 연속적이고 판독 프레임 내에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 수개 킬로베이스(kilobases)에 의해 프로모터로부터 분리되는 경우 인핸서가 기능을 할 수 있고 인트론 서열(intronic sequences)이 변화가능한 길이를 가질 수 있기 때문에, 일부 뉴클레오티드 서열은 작동가능하게 연결되어 있으나 연속적이지 않을 수 있다.
"프로모터" 또는 "프로모터 서열" 또는 "프로모터 요소"는 일반적으로 세포 내에서 RNA 폴리머라제를 결합시키고, mRNA 또는 임의의 클래스의 RNA 폴리머라제에 의해 전사되는 임의 종류의 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 RNA 조절 영역이다. 프로모터 및 터미네이터는 상이한 유전자로부터 취할 수 있으나, 전형적으로 서로 매치된다. 즉, 프로모터 및 터미네이터 서열 또는 요소는 이들이 자연적으로 생성되는 동일 유전자로부터 취한다. 또한 프로모터는 보다 높거나 낮은 수준의 전사를 달성하기 위해, 분자 기법을 사용하거나 아니면 예를 들어 인핸서와 같은 조절 요소의 변이를 통해 수정될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
프로모터와 관련해서 "항시성(constitutive)"이라는 용어는 프로모터가 특이적 자극(예컨대 열충격, 화학물질, 빛 등)의 존재 하에 또는 존재 없이 작동가능하게 연결되어 있는 핵산 서열의 전사를 유도할 수 있다는 것을 의미한다. 전형적으로, 항시성 프로모터는 실질적으로 모든 세포 및 모든 조직 내에서도 코딩 서열의 발현을 유도할 수 있다. 바람직하게는, ddRNAi 작용제를 전사하기 위해 발현 카세트에서 사용되는 프로모터는, 발현이 프로모터, 또는 RNA 폴리머라제 I에 의해 결합되는 프로모터 요소와 결합하는 RNA 폴리머라제 II에 의해 조절되는 유비퀴틴(ubiquitin), CMV, β-액틴, 히스톤 H4, EF-1 알파 또는 pgk 유전자에 대한 프로모터와 같은 항시성 프로모터이다. 다른 구현예에서, Pol II 프로모터, 예컨대 CMV, SV40, hAAT, U1, β-actin 또는 하이브리드(hybrid) Pol Il 프로모터가 사용된다. 다른 구현예에서, RNA 폴리머라제 III에 의해 결합되는 프로모터 요소, 예컨대 U6 프로모터(예를 들어 U6-1, U6-8, U6-9), H1 프로모터, 7SL 프로모터, 인간 Y 프로모터(hY1, hY3, hY4 (Maraia, 외., 핵산(Nucleic Acids) Res 22(15):3045-52 (1994) 참조) 및 hY5 (Maraia, 외., 핵산(Nucleic Acids) Res 24(18):3552-59 (1994) 참조), 인간 MR-p7-2 프로모터, 아데노바이러스(Adenovirus) VA1 프로모터, 인간 tRNA 프로모터, 5S 리보좀 RNA 프로모터, 뿐만 아니라 기능적 하이브리드 및 이들 프로모터의 임의의 조합이 사용된다. 또한 이들 프로모터의 변형체도 사용될 수 있으며, 이 때 프로모터는 그 활성을 감소 또는 증가시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 강한 프로모터가 이와 작동가능하게 연결되어 있는 DNA 서열의 과도한 발현을 초래한다면, 그 활성을 감소시키도록 변형될 수 있다.
U6 프로모터가 사용되는 경우, 프로모터와 작동가능하게 연결되는 DNA 서열은 구아닌(G) 염기로 시작되는 것이 바람직하며; H1 프로모터가 사용되는 경우, 프로모터와 작동가능하게 연결되는 DNA 서열은 아데닌(A) 염기로 시작되는 것이 바람직하다. 그러므로 핵산의 서열은 한 프로모터의 사용을 또 다른 프로모터보다 더 선호할 수 있다.
대안적으로 일부 구현예에서, ddRNAi 구조체로부터 발현되는 다수 ddRNAi 작용제의 유도성 발현을 가능하게 하는 프로모터를 선택하는 것이 최선일 수 있다. 이러한 프로모터를 이용한 다수의 유도성 발현 시스템은 당해 분야에 알려져 있으며, 테트라사이클린(tetracycline) 반응 시스템 및 lac 오퍼레이터-리프레서(operator-repressor) 시스템(WO 03/022052 A1 국제공개공보; 및 특허공개공보 U.S. 2002/0162126 A1 참조), 엑디손(ecdysone) 조절 시스템, 또는 글루코코르티코이드, 프로게스틴, 에스트로겐, RU-486, 스테로이드, 티로이드 호르몬, 사이클릭 AMP, 사이토카인(cytokines), 칼시페롤 계열의 조절자 또는 메탈로티오네인 프로모터(무기 금속에 의해 조절됨)에 의해 조절되는 프로모터를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일부 구현예에서 유용한 프로모터는 조직-특이적 또는 세포-특이적일 수 있다. 프로모터에 적용할 때 "조직-특이적"이라는 용어는 다른 유형의 조직(예컨대 뇌)의 동일한 관심 뉴클레오티드 서열의 상대적 발현 부재하에 특정 유형의 조직의 관심 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 의미한다. 프로모터에 적용되는 경우 "세포-특이적"이라는 용어는 동일한 조직 내에서, 다른 유형의 세포의 동일한 관심 뉴클레오티드 서열의 상대적 발현 부재하에 특정 유형의 세포의 관심 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 의미한다. 프로모터에 적용될 때 "세포-특이적"이라는 용어는 또한 단일 조직 내의 일 영역에서 관심 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 촉진시킬 수 있는 프로모터를 의미한다. 대안적으로, 프로모터는 항시적일 수도 있고 조절될 수도 있다. 또한 프로모터는 상이한 특이성을 가지도록 수정될 수 있다.
HBV 감염의 경우, 간 특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 간 특이적 프로모터의 예로는 인간 알파 안티트립신 프로모터(hAAT) 아포리포프로테인(apolipoprotein) H (ApoH) 및 레시틴 콜레스테롤 아세틸 트랜스퍼라제 프로모터(LCAT)가 있다. 대안적으로, 트랜스티레틴 또는 TTR 프로모터가 사용될 수 있다. TTR 프로모터는 생쥐 프레알부민(prealbumin) 유전자로부터 유래되며 프레알부민이라고도 칭한다. 총길이의 TTR 프로모터는 일반적으로 성인에 있어서 간세포에 의해 그리고 맥락총(choroid plexus) 상피세포에 의해 생성되는 혈청 티록신-결합 단백질의 발현을 조절한다. 한 구현예에 있어서, 바람직한 TTR 프로모터는 맥락총 발현을 조절하는 영역은 제거되지만 간 특이적 발현을 구동하는 영역은 보유하는 TTR 프로모터이다. 예를 들어, 본 명세서에 참조 문헌으로 포함되는 WO2007/120533 및 US20060189561을 참조한다.
앞서 기술한 바와 같이, 인핸서 요소는 임의선택적으로 본 발명의 ddRNAi 구조체에 포함된다. 한 바람직한 인핸서 요소는 ApoE이다. ApoE 인핸서 요소는 아포리포단백질 E(ApoE)로부터 유래되는 약 155bp로 구성된다. ApoE는 리포단백질 입자의 결합, 내재화(internalization) 및 이화작용(catabolism)을 매개하며, 간 조직의 저밀도 리포단백질(ApoB/E) 수용체 및 ApoE 수용체에 대한 리간드이다. ApoE 유전자와 관련된 유전적 인핸서는 특히 간에서 핵산의 전사를 증가시킬 수 있는 진핵 조절 요소이다. ApoE 인핸서는 간 특이적 프로모터의 상류쪽이나 하류쪽에 2000개 이하의 뉴클레오티드로 위치할 수 있으며, 하나보다 많은 복사체(copy) 내에 존재할 수 있다. ApoE/hAAT는 한 바람직한 인핸서/프로모터 조합이다.
대안적으로, US20060189561(본 명세서에 참조 문헌으로 포함됨)에 기재된 것와 같은 합성 인핸서(SynEnh)가 사용될 수 있다.
ddRNAi 발현 카세트 또는 구조체가 하나보다 많은 터미네이터 서열 또는 요소를 포함하는 경우, 터미네이터 서열 또는 요소는 동일한 또는 상이한 것일 수 있고, 임의의 카세트 내에서 1회만 나타내는 종료 요소와 2회 이상 나타내는 종료 요소의 조합일 수도 있다. 어떤 터미네이터 서열 또는 요소가 사용되든지 간에, 사용되는 간-특이적 프로모터와 적절하게 작용하는 것을 보장하도록 선택되어야 한다. Pol I, Pol III 또는 Pol III 프로모터가 사용되는 경우, 적절한 터미네이터 서열이 사용되어야 한다. 본 발명에 유용한 종료 요소는 U1 종료 서열(U1 box), 합성 폴리A 터미네이터 및 소위 최소 PolyA 터미네이터를 포함한다. MAZ1 및 MAZ2와 같은 전사 정지 부위(Transcriptional pause sites)(Ashfield 외 EMBO J 1994 Vol13 No 23 5656 pp, 및 Yonaha와 Proudfoot EMBO J. 2000 Jul. 17;19(14):3770-7 참조)는 전사 종료 및 폴리아데닐레이션(polyadenylation)의 결합에 도움을 주기 위해 폴리A 터미네이터의 상류쪽에 삽입될 수 있다. Pol III 프로모터의 경우, 통상적으로 서열 TTTT, TTTTT 또는 TTTTTT가 터미네이터로서 사용될 수 있다. 이 경우, 전사는 전형적으로 서열 UU에 의해 종료된다.
ddRNAi 구조체- 바이러스 기반 ddRNAi 구조체의 전달
HBV 치료법 개발에 있어서 난제는 사실상 환자의 모든 간세포가 감염되어 있다는 점이다. 이리하여, 만성 HBV 감염에 대한 효과적인 유전자 치료법을 제공하기 위해서는 본 발명의 ddRNAi 작용제를 사용하여 모든 간세포의 효율적이고 균일한 형질도입을 달성하는 수단이 요구된다. 더욱이, HBV 감염의 효과적인 생체내 치료를 위해서는 본 발명의 ddRNAi 발현 카세트가 일차 세포(primary cell), 줄기 세포 및 비분할 세포에 트렌스펙션될 수 있어야 한다.
이러한 한계점을 극복하기 위해서, 본 발명의 ddRNAi 발현 카세트는 ddRNAi 구조체를 생성하기 위해 바이러스성 전달과의 상용성(compatibility)을 보장하도록 바람직하게 바이러스로부터 유래되는 전달 벡터 내에 도입된다. 앞서 기술한 바와 같이, 벡터 백본은 전달 벡터뿐만 아니라 발현 벡터인 이중 기능의 역할을 할 수 있다. 구조체의 생성은 당해 분야에 잘 알려져 있는 임의의 적합한 유전공학 기법을 사용하여 달성될 수 있으며, 이에는 PCR 표준 기법, 올리고뉴클레오티드 합성, DNA 합성, 제한 엔도뉴클레아제 소화, 결찰(ligation), 형질전환(transformation), 플라스미드 정제 및 DNA 시퀀싱이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 구조체는 바람직하게 바이러스 입자 내에 ddRNAi 구조체를 패키징하기 위해 필요한 서열 및/또는 표적 세포 게놈 내로 ddRNAi 구조체의 통합을 가능하게 하는 서열을 포함한다. 바이러스 구조체는 또한 바이러스의 복제 및 전파를 가능하게 하는 유전자를 포함할 수 있지만, 바람직한 구현예에서 이러한 유전자는 트랜스 형태로 제공될 것이다. 추가적으로, ddRNAi 구조체는 본래 형태 또는 변형된 형태로 도입되는 공지된 생물의 게놈으로부터의 유전자 또는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 바이러스 구조체는 박테리아 내의 구조체 복제에 유용한 서열을 포함한다.
바이러스 벡터 백본은 렌티바이러스(lentiviral), 아데노바이러스(Adv) 및 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 ddRNAi 작용제의 분할 세포에서의 임시 발현을 위해 또는 비분할 세포에서의 장기간 안정한 발현을 위해 비통합 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 렌티바이러스 벡터와 같은 통합 바이러스 벡터는 분할 및 비분할 세포 둘 다에서의 안정한 장기간 발현을 매개한다.
대안적으로, ddRNAi 발현 카세트를 전달하기 위해서 US20040214329에 기술된 것과 같은 미니서클(minicircles)이 사용될 수 있다. 미니서클은 지속적으로 높은 수준의 핵산 전사를 제공하며, 발현-침묵 박테리아 서열이 없는 것이 특징이다.
AAV 벡터는 다른 바이러스 벡터와 비교해서 비병원성이며 덜 면역적이다. 분할 및 비분할 세포 둘 다를 감염시키고, 이들 조직 내에서 장기간 유전자 발현을 유도하는 AAV 벡터의 능력은 유전자 치료에 유용한 담체(vehicle)로서 가능하게 한다. 더욱이, AAV는 상이한 조직 향성(tropism)을 갖는 다양한 모조형(pseudotype)을 가진다. 바람직한 AAV 벡터는 이중가닥 AVV 모조형 8(ddAAV8)이다.
전형적으로 AAV의 게놈은 단지 2개의 유전자를 포함한다. "rep" 유전자는 DNA 복제에 사용되는 적어도 4개의 별도의 단백질을 암호화한다. "cap" 유전자 산물은 바이러스의 캡시드(capsid)를 포함하는 3개의 단백질을 생성시키기 위해 차별적으로 접합된다. 발생기의 바이러스 내에 게놈을 패키징하는 경우, 역방향 말단 반복부(Inverted Terminal Repeats; ITRs) 만이 절대 서열(obligate sequences)이며, rep 및 cap는 게놈으로부터 제거될 수 있고 선택가능한 이종(heterologous) 서열로 대체될 수 있다. 그러나, 발생기 비리온(virion)내에 AAV-기반 이종 구조체를 복사 및 패키징하는데 필요한 단백질을 생성시키기 위해서, rep 및 cap는 트랜스 형태로 제공되어야 한다. 또한 일반적으로 아데노바이러스 또는 포진바이러스(herpesvirus)와 같은 헬퍼 바이러스와의 공감염(co-infection)에 의해 제공되는 헬퍼 기능은 하나 이상의 DNA 발현 플라스미드 형태의 트랜스 형태로 제공될 수 있다. 게놈은 일반적으로 단지 2개의 유전자를 암호화하기 때문에, 전달 담체로서 AAV가 4.5 단일가닥 킬로베이스(kb)의 패키징 용량에 의해 제한된다는 점이 놀랄만한 것은 아니다. 그러나, 이 크기 제한이 대체 유전자 치료를 위해 전달될 수 있는 유전자를 한정할 수 있으나, ddRNAi 벡터와 같은 짧은 서열의 패키징 및 발현에 악영향을 주지 않는다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명에 따르는 ddRNAi 발현 카세트가 삽입되는 바이러스 벡터를 포함하는 ddRNAi 구조체가 제공된다. 바람직하게 발현 카세트는 긴 헤어핀 구조 또는 다중 헤어핀 구조로서 다수 RNAi 작용제를 암호화한다. 한 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다.
바이러스 기반 ddRNAi 구조체의 생성 후에, 이 구조체는 바이러스 입자 내에 패키징된다. 게놈이 바이러스 ddRNAi 구조체의 복사체를 포함하는 감염성 바이러스 입자를 생성하기 위해서 당해 분야에 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다. 한 방법은 바이러스 입자 내에 바이러스 ddRNAi 구조체를 도입하기 위해 필요한 바이러스 단백질을 트랜스 형태로 안정하게 발현시키는 패키징 세포, 뿐만 아니라 특정 바이러스성 전달 시스템에 필요하거나 바람직한 다른 서열(예를 들어 복제, 구조 단백질 및 바이러스 어셈블리에 필요한 서열) 및 조직에 진입하기 위한 바이러스-유래 또는 인공 리간드를 사용한다. 바이러스 ddRNAi 구조체를 패키징 세포 내에 트랜스펙션한 후에, 이 패키징 세포는 바이러스 서열을 복제하고, 바이러스 단백질을 발현한 다음, ddRNAi 발현 구조체를 감염성 바이러스 입자 내에 패키징한다. 패키징 세포계는 바이러스성 단백질을 발현시킬 수 있는 임의의 세포계일 수 있으며, 293, HeLa, A549, PerC6, D17, MDCK, BHK, 빙체리(bing cherry), 피닉스(phoenix), Cf2Th, 당해 분야의 숙련자에 의해 알려지거나 개발된 다른 세포계를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 한 패키징 세포계는 예를 들어 U.S. Pat. No.6,218,181에 기술되어 있다.
대안적으로, 필수 바이러스 단백질을 안정하게 발현시키지 않는 세포계는 기능적 입자의 효과적인 생성을 달성하기 위해 하나 이상의 구조체와 공동-트랜스펙션될(co-transfected) 수 있다. 이 구조체들 중 하나는 바이러스 기반 ddRNAi 구조체이고, 나머지 다른 구조체는 세포가 기능적 바이러스 뿐만 아니라 다른 헬퍼 기능을 생성하게 할 수 있기 위해 필요한 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다.
패키징 세포계 또는 복제 및 패키징 구조체는 엔벨로프(envelope) 유전자 산물을 발현시킬 수 없다. 이들 구현예에서, 엔벨로프 유전자를 암호화하는 유전자가 바이러스 기반 ddRNAi 구조체와 공동-트랜스펙션되는 별도의 구조체 상에 제공될 수 있다. 엔벨로프 단백질이 바이러스성 입자의 숙주 범주에 대해 부분적으로 책임이 있으므로, 바이러스는 모조형일 수 있다. 앞서 기술한 바와 같이, "모조형" 바이러스는 게놈의 유래가 되는 바이러스와는 다른 바이러스로부터 생성되는 엔벨로프 단백질을 갖는 바이러스 입자이다. 당해 분야의 숙련자는 사용되는 바이러스성 전달 시스템에 적합한 모조형 및 표적화되는 세포를 선택할 수 있다. 특이적 숙주 범주를 제공하는 것 이외에도, 선택된 모조형은 바이러스를 매우 높은 역가로 농축되게 할 수 있다. 대안적으로 바이러스는 특이적 종에 감염되는 것을 제한하는 에코트로픽(ecotropic) 엔벨로프 단백질을 갖는 모조형일 수 있다(예를 들어, 에코트로픽 엔벨로프는 예컨대 오직 쥐 세포의 감염만을 허용하고, 양종향성(amphotropic) 엔벨로프는 예컨대 인간 및 쥐 세포 둘 다의 감염을 허용함). 또한, 유전자 변형된 리간드는 간세포용 아시알로당단백질 또는 수용체 매개 결합을 위한 트랜스페린과 같이 세포-특이적 표적화를 위해 사용될 수 있다.
패키징 세포계에서 생성 후에, ddRNAi 발현 카세트를 포함하는 바이러스 입자는 정제되고 정량화(적정)된다. 정제 전략은 밀도구배 원심분리 또는 바람직하게 컬럼 크로마토그래피 방법을 포함한다.
치료 방법
본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 구조체 또는 siRNA 작용제의 투여는 HBV에 감염된 세포 내에서 발현되는 HBV 유전자의 발현을 억제시킨다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 대상자의 HBV 감염 치료 방법으로서 치료를 요 하는 환자에 치료학적 유효량의 ddRNAi 작용제를 공급하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 이 때 ddRNAi 작용제는 B형 간염 바이러스(HBV) 유전자, 바람직하게는 HBV의 폴리머라제 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시킨다. 환자에 투여되어야 하는 ddRNAi 작용제는 하기 작용제들 중 하나 이상일 수 있다.
·제1 이펙터 서열; 및 제1 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제, 이 때 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적임
·5' 에서 3' 방향으로 제1 이펙터 서열; 제2 이펙터 서열; 제2 이펙터 보체 서열; 및 제1 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제, 이 때 각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적임
·5' 에서 3' 방향으로 제1 이펙터 서열; 제2 이펙터 서열; 제3 이펙터 서열; 제3 이펙터 보체 서열; 제2 이펙터 보체 서열; 및 제1 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제, 이 때 각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적임
·5' 에서 3' 방향으로 제1 이펙터 서열; 제1 이펙터 보체 서열; 제2 이펙터 서열; 및 제2 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제, 이 때 각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적임
·5' 에서 3' 방향으로 제1 이펙터 서열; 제1 이펙터 보체 서열; 제2 이펙터 서열; 및 제2 이펙터 보체 서열; 제3 이펙터 서열; 제3 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제, 이 때 각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적임
·5' 에서 3' 방향으로 제1 이펙터 서열; 제2 이펙터 서열; 2 내지 100개의 비-자기-상보적 뉴클레오티드의 서열; 제2 이펙터 보체 서열; 및 제1 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제, 이 때 각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적임
·5' 에서 3' 방향으로 제1 이펙터 서열; 2 내지 100개의 비-자기-상보적 뉴클레오티드의 서열; 제1 이펙터 보체 서열; 제2 이펙터 서열; 2 내지 100개의 비-자기-상보적 뉴클레오티드의 서열; 및 제2 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제, 이 때 각 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적임
당해 숙련자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 그리고 도면에서 설명되는 바와 같이, 어떠한 특정 이펙터 서열도 작용제 내에서 그 보체와 함께 적소에서 스와핑될 수 있다. 앞서 기술한 각 구현예의 특정 형태에 있어서, 각 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27 중의 어느 하나로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드 길이이다. 이펙터 서열은 모두 동일할 수도 있고, 모두 상이할 수도 있으며, 예를 들어 SEQ ID NO: 1의 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드의 이펙터 서열 2개와 SEQ ID NO: 4의 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드의 이펙터 서열 1개가 배합되어 있을 수도 있다.
바람직하게, 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 27 중 어느 한 서열 내의 임의의 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 인접 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 내지 27 중 어느 한 서열 내의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된다. 전형적으로, 이펙터 보체는 그 상응 이펙터 서열과 동일한 길이 또는 대략 동일한 길이(즉, ± 15% 뉴클레오티드 길이)일 것이다.
이들 ddRNAi 작용제 각각은 본 명세서의 이전 항목에서 기술한 바와 같이, ddRNAi 구조체 내의 ddRNAi 발현 카세트를 통해 투여될 수 있다. 다중 표적화는, 각각이 단일 ddRNAi 작용제를 발현할 수 있는 둘 이상의 ddRNAI 발현 카세트 또는 구조체를 전달함으로써, 아니면 각각이 하나보다 많은 ddRNAi 작용제를 발현시킬 수 있는 하나 이상의 ddRNAI 발현 카세트 또는 구조체를 전달함으로써 달성될 수 있다.
대안적인 구현예에서, 이펙터 서열들 각각은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 100% 상보적일 수도 있고, 단지 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티트에 의해서 변화될 수 있다.
HBV 감염 치료 방법은 임의선택적으로 HBV 분리체(isolate)의 혈청형 확인을 포함하여 HBV 감염을 가진 개인을 확인하는 예비 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 ddRNAi 작용제의 장기간 또는 안정한 제공을 위해서, ddRNAi 작용제는 본 발명의 ddRNAi 구조체를 통해, 즉 세포에 전달되는 적합한 벡터 내에 삽입되는 ddRNAi 발현 카세트로부터 ddRNAi 작용제의 생체내 발현을 통해 제공된다. ddRNAi 발현 카세트는
·하나 이상의 프로모터 서열;
·SEQ ID NO: 1 내지 27로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드를 암호화하는 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 서열;
·하나 이상의 이펙터 보체 서열을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열;
·하나 이상의 터미네이터 서열;
그리고 임의선택적으로
·루프 서열을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열;
·하나 이상의 인핸서 서열
을 포함한다.
본 명세서에서 앞서 약술한 바와 같이, 이들 ddRNAi 발현 카세트 성분은 상이한 5' 에서 3' 배열을 가질 수 있으며, 이들 모두 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다.
본 발명의 방법에서, HBV 표적 유전자는 적어도 폴리머라제(P) 유전자이고, 표적 서열이 오버래핑 개방형 판독 프레임 내에 포함되는 경우 잠재적으로 표면 항원 또는 X 유전자이며, ddRNAi 작용제는 표 1에 기재되어 있는 SEQ ID NO: 1 내지 27로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드의 ddRNAi 이펙터 서열을 포함한다. 대안적으로, 앞서 상술한 바와 같이, 이펙터 서열 또는 제1 이펙터 서열에 상보적인 서열을 암호화하는 서열은, 표적 서열과의 염기쌍을 형성하여 HBV 표적 서열의 발현을 억제시키는 암호화된 이펙터 서열의 능력에 영향을 주지 않고 SEQ ID NO: 1 내지 27에서 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드가 변경될 수 있다.
전형적으로, 각 이펙터 서열은 그 상응 이펙터 보체 서열과 이중가닥 영역을 형성한다.
대안적인 구현예에서, 개인의 HBV 감염 치료 방법은 앞서 기재된 것과 같이 하나보다 많은 이펙터 서열을 갖는 ddRNAi 작용제를 암호화하는 ddRNAi 구조체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
치료하고자 하는 HBV 감염은 만성 HBV 감염이다. "만성"은 HBV 감염이 장기간 지속되거나 유지되는 것을 의미한다. 만성이라는 용어는 질환의 과정, 또는 발병 및 진행률을 설명한다. 만성 감염 치료시, ddRNAi 구조체이 투여되고 나서 표적 세포 내에 안정하게 유지되거나 통합되어 ddRNAi 작용제의 장시간 발현을 보장하는 것이 바람직하다. 앞서 상술한 바와 같이, 이는 바이러스 벡터 백본을 가진 ddRNAi 구조체를 사용하여 달성될 수 있다. 이에 따라서, 개인의 만성 HBV 감염 치료 방법으로서, 치료를 요하는 환자에게 치료학적 유효량의 본 발명의 ddRNAi 구조체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
만성 HBV 감염 치료는 바이러스 복제를 간섭함으로써 바이러스의 감염성을 감소시키는 것이 목적이다. 이는 결국 HBV의 전염 및 확산의 위험을 감소시킨다. 그러므로, HBV 감염된 개인의 HBV 감염성을 감소시키는 방법으로서, HBV 유전자, 바람직하게는 폴리머라제 유전자를 표적화하기 위해 본 발명의 ddRNAi 구조체를 개인에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 만성 B형 간염 치료에 사용되는 임상적 종료점은 보상된(compensated) B형 간염(지속적인 바이러스 억제, 혈청학적 반응, 조직학적 개선, 간기능 검사의 정상화 및 비임상적 진행이 주요 종결점인 경우)을 가진 환자와 비보상(decompensated) B형 간염을 가진 환자 사이에 다를 것이다. 비보상 질환을 가진 환자의 경우, 간이 광범위하게 상처나 있고 섬유증이 있으므로 간 손상의 예방/반전 및 질환 진행의 방지 및 간 이식의 배제가 치료의 주목적이다. 보상 B형 간염의 종료점은 혈청학적 및 생화학적 개선, 조적학적 개선, 간부전(liver failure) 및 말기 간질환의 판단, 합병증, 이식 및 사망과 함께 바이러스 부하량의 감소이다.
또 다른 구현예에서, HBV 감염의 결과로서 대상자의 간질환 진행을 최소화하는 방법으로서, HBV 유전자, 바람직하게는 폴리머라제 유전자를 표적화하기 위해 본 발명의 ddRNAi 구조체를 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 대상자의 HBV 감염과 관련한 증상을 최소화하는 방법으로서, HBV 유전자, 바람직하게는 폴리머라제 유전자를 표적화하기 위해 본 발명의 ddRNAi 구조체를 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
개인의 HBV 감염 상태 또는 중증도는 바이러스 부하량을 측정함으로써 평가될 수 있다. "바이러스 부하량"이라는 것은 관여된 체액 중 바이러스의 양을 의미한다. 예를 들어, 혈장(blood plasma) 밀리리터 당 RNA 복사체로서 주어질 수 있다. 바이러스 부하량이 높은 개인은 보다 심각한 HBV 전염을 가지고 있는 것으로 간주된다. 대안적으로, 바이러스 부하량은 특정 치료에 대한 개인의 반응성의 지표이다. 치료가 수행되면서 바이러스의 양이 낮게 유지되면, 성공적인 치료를 나타낸다. 그러므로, 치료 목적은 개인의 바이러스 부하량을 감소시키는 것이다. 따라서 HBV 감염을 가진 개인의 바이러스 부하량을 감소시키는 방법으로서, HBV 유전자, 바람직하게는 폴리머라제 유전자를 표적화하기 위해 본 발명의 ddRNAi 구조체를 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
그러므로, 본 발명의 ddRNAi 구조체로 치료를 받는 개인의 바이러스 부하량을 연속적으로 모니터링하는 것이 본 발명의 ddRNAi 구조체 및 ddRNAi 작용제의 유효성의 표현형 지표가 된다.
대안적으로, 급성 HBV 감염 치료는 장기간 치료를 요하지 않으며, 사실상 통합된 또는 안정하게 유지되는 ddRNAi 구조체로부터 ddRNAi 작용제의 장기간 발현과 반대로 ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제의 일시적인 존재에 의존하는 것이 바람직할 수 있다. "급성"이라는 것은 HBV 감염이 급속한 발병 및/또는 짧은 지속기간을 가진다는 것을 의미한다.
본 발명의 이 구현예에 따르면, 개인의 급성 HBV 감염 치료 방법으로서, B형 간염 바이러스(HBV) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키기 위해서, 치료를 요하는 환자에게 시험관내 합성되거나 화학적으로 합성된 ddRNAi 작용제를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 이 때 ddRNAi 작용제는 적어도,
SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택되는 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제1 이펙터 서열; 및
제1 이펙터 보체 서열
을 포함하며, 여기서 이펙터 서열은 표적 유전자의 영역의 예측 전사체에 실질적으로 상보적이다. 이 구현예에서, 본 발명의 ddRNAi 작용제는 시험관 내에서 제조되거나 또는 화학적으로 합성되어 세포에 제공된다.
본 명세서에서 기술되는 본 발명의 모든 siRNA 작용제 또는 ddRNAi 작용제는 시험관내 발현 및 세포로의 전달에 적합하다.
바람직하게, HBV 표적 유전자는 적어도 폴리머라제(P) 유전자이고, 표적 서열이 오버래핑 개방형 판독 프레임 내에 포함되는 경우 잠재적으로 표면 항원, 코어 항원 또는 X 유전자이다. 따라서, 본 발명의 한 구현예에서, ddRNAi 작용제는 B형 간염 바이러스(HBV) 폴리머라제 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시킨다. 제1 이펙터 서열은 표 1에 기재되어 있는 이펙터 서열 SEQ ID NO: 1 내지 27로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 이펙터 서열은, 표적 서열과의 염기쌍을 형성하여 HBV 폴리머라제 유전자의 발현을 억제시키는 이펙터 서열의 능력에 영향을 주지 않고 SEQ ID NO: 1 내지 27에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오티드가 변경될 수 있다.
대안적인 구현예에서, siRNA 작용제가 투여될 수 있다. 바람직하게 siRNA 작용제는 ddRNAi 작용제와 유사하게, HBV 폴리머라제 유전자를 표적화하며, SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로부터 선택되는 서열을 가질 수도 있고, 아니면 표적 서열과의 염기쌍을 형성하여 HBV 폴리머라제 유전자의 발현을 억제시키는 이펙터 서열의 능력에 영향을 주지 않고 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드에 의해 SEQ ID NO: 1 내지 27로부터 변화될 수 있다.
또한 급성 HBV 감염을 가진 개인에게 본 발명의 ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제를 투여함으로써 바이러스 부하량을 감소시키고, 급성 감염과 관련된 증상의 중증도를 감소시키고 HBV 감염성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, HBV 감염, 바람직하게는 만성 HBV 감염의 치료, HBV 바이러스 부하량의 감소, HBV 감염과 관련된 증상의 중증도 감소, 및 HBV 감염성의 감소를 위한 약제(medicaments)의 제조에 사용되는 본 발명의 ddRNAi 구조체, ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가적 양태에 있어서, HBV 감염, 바람직하게는 만성 HBV 감염 치료, HBV 바이러스 부하량 감소, HBV 감염과 관련된 증상의 중증도 감소, 및 HBV 감염성 감소를 위해 ddRNAi 구조체, ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제가 제공된다.
본 발명의 추가적 양태에 있어서, HBV 감염, 바람직하게는 만성 HBV 감염 치료, HBV 바이러스 부하량 감소, HBV 감염과 관련된 증상의 중증도 감소, 및 HBV 감염성 감소를 위해 활성 성분으로서 ddRNAi 구조체, ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 방법에 사용되는 ddRNAi 구조체, ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제의 하나 이상의 이펙터 서열은 적어도 70%까지 표적 유전자 영역의 발현을 억제시킬 수 있는 서열 내의 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 하나 이상의 이펙터 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:23으로부터 선택된다.
약학적 조성물
본 발명의 ddRNAi 발현 카세트를 포함하는 ddRNAi 작용제, siRNA 작용제 또는 벡터는 적합한 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석제와의 배합에 의해 약학적 조성물로 조성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 ddRNAi 작용제, ddRNAi 발현 카세트, ddRNAi 구조체 또는 siRNA 작용제 및 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
약학적 제형에 있어서, ddRNAi 발현 카세트를 포함하는 작용제 또는 벡터는 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 함께 또는 배합하여 투여될 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 ddRNAi 발현 카세트를 포함하는 작용제 또는 벡터의 사용량이 전달 담체의 성질, 표적 세포의 형질도입의 상대적 용이성, 표적 세포내의 RNAi 작용제의 발현 수준 등의 함수로서 달라질 것이라는 점을 쉽게 인지할 것이다.
본 발명의 ddRNAi 발현 카세트를 포함하는 ddRNAi 작용제, siRNA 작용제 또는 벡터는 원한다면 용해제(solubilisers), 등장제(isotonic agent), 현탁제, 유화제, 안정화제 및 보존제와 같은 통상적인 첨가물와 함께, 오일, 합성 지방족산 글리세라이드, 고지방족산의 에스테르 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수성 또는 비수성 용매 속에 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 주사 또는 투여용 제제(preparations)로 조성될 수 있다.
본 발명에 의해 고려되는 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석제는 사용되는 용량 및 농도에서 수령인에게 비독성인 어떠한 희석제, 운반체, 부형제 및 안정화제도 포함하며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜(catechol); 레조르시놀(resorcinol); 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 플라즈마 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코오즈, 만노오즈 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 슈크로오즈, 만니톨, 트레할로오즈 또는 솔비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염-형성 카운터이온(counter-ion); 금속 복합체(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN™ PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온 계면활성제를 포함한다.
약학적 조성물은 다양한 투여 경로 및 유형으로 제조될 수 있다. 일반적으로 제형(formulations)은 활성 성분을 액체 운반체 또는 미분화된 고체 운반체 또는 둘 다와 함께 균일하고 친밀하게 배합하고, 필요하다면 생성물을 형상화함으로써 제조된다. 제형화는 대기 온도에서 적절한 pH에서 원하는 순도로, 생리학적으로 허용가능한 운반체, 즉 사용되는 용량 및 농도에서 수령인에게 비독성인 운반체와 함께 혼합함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용되는 ddRNAi 구조체, ddRNAi 작용제 또는 siRNA 작용제의 하나 이상의 이펙터 서열은 적어도 70%까지 HBV 표적 유전자 영역의 발현을 억제시킬 수 있는 서열 내의 임의의 10개 이상, 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 하나 이상의 이펙터 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:23으로부터 선택된다.
실시예
하기 실시예들은 설명을 위한 것으로 제한하기 위한 의도는 아니다.
실시예 1: 전체 siRNA 표적(EsT) 라이브러리의 제조
전체 siRNA 표적(EsT) 라이브러리를 제조하기 위해서 HBV Adr-1 (Accession M38454)로부터의 전장 HBV RNA-의존성 DNA 폴리머라제 유전자를 서브클론닝(sub-cloned)하여 사용하였다. 5000개의 클론을 시퀀싱하였고, 이 중 642개가 19 내지 23 bp의 범위의 비반복 서열을 가진 것으로서 확인하였다. 이 서열들은 본 발명의 ddRNAi 작용제에 대한 잠재적 표적을 나타내는 것으로, 표적 유전자를 따라 분포되었다(도 2).
실시예 2: = 50% 넉다운을 갖는 SECs를 이용한 대규모 스크리닝 결과
본 발명의 ddRNAi 작용제를 제조하기 위해 사용될 수 있는 가장 효과적인 siRNA 서열을 확인하기 위해서, PCR에 의해 증폭된 siRNA 발현 카세트(SECs)를 HepG2 2.2.15 세포 내에 트랜스펙션시켰다. 기능적인 siRNA 서열을 확인하기 위해서 HBV 폴리머라제 mRNA 발현 정도에 미치는 효과를 평가하였다.
오리지널 폴리머라제 mRNA 넉다운 정도를 확인하기 위해서 스크리닝된 최초 SECs에 상응하는 40개의 siRNA를 화학적으로 합성하고 HepG2 2.2.15 세포 내에 트랜스펙션시켰다. HepG2 2.2.15는 HBV 게놈(Genebank Accession #: U95551)의 통합 직렬 다이머를 포함하는 안정한 세포계이며, HBV 항원 및 HBV 데인 입자(Dane particles)를 안정하게 발현시킬 수 있다. 상관관계 결과는 도 3에 도시되어 있다.
도 3으로부터 볼 수 있는 바와 같이, SECs의 폴리머라제 발현 억제는 >50%였으며, 상응하는 합성 siRNA 서열 대부분이 약 70%의 HBV mRNA 넉다운을 나타내었고 단지 2/23 만이 50% 미만의 넉다운 정도를 나타내었다. 침묵 효율이 <50%인 SECs와 대조적으로, 상응하는 합성 siRNA의 단지 18%(3/17) 만이 >70% 넉다운(p<0.05 - 피어슨의 카이-제곱 검정(Pearson's chi-square test), |t Stat| = 4.29>1.68)을 나타내었다. 또한, >90% 넉다운을 나타낸 합성 siRNA(이에 대한 설명 필요)는 >65% 넉다운을 나타낸 SEC 클론과 상응하였다. 이로부터, SECs에 의한 =50% 넉다운의 절단값(cut-off value)에 대해, SECs의 siRNA에 의한 HBV mRNA의 넉다운과 합성 siRNA에 의해 나타난 넉다운 사이에 합당한 상관관계가 존재하였다는 결론에 도달하였다. 이 절단값은 SECs의 나머지 스크리닝에 사용되었다.
실시예 3: siRNA 발현 카세트(SECs)에 의한 표적 스크리닝
도 4는 HBV mRNA 축적 억제를 위한 시험관내 대규모 스크리닝의 결과를 보여준다(501개의 비반복 siRNA 작용제). 스크리닝된 이들 서열 중 100개의 siRNA 서열은 =50%까지 HBV mRNA를 넉다운시키는데 효과적이었으며, 이 중 14개는 >70% 넉다운의 결과를 얻었다(표 2). HBV 폴리머라제 유전자 상의 상위 100개의 siRNA 표적의 분포는 도 5a에 도시되어 있으며, 어떠한 서열도 폴리머라제 상에 매핑될 수 있다. 도 5b는 예를 들어 처음 3개의 서열을 매핑한 것이다.
| SEQ ID NO | RNAi 이펙터 서열 a | 길이(bp) | 상대적 mRNA 발현 |
| 1 | GAUUGACGAUAAGGGAGA | 18 | 0.1 |
| 2 | UUGAAGUCCCAAUCUGGAU | 19 | 0.14 |
| 3 | GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC | 23 | 0.19 |
| 4 | UAUUUGCGGGAGAGGACAACAGAGUUAUC | 29 | 0.25 |
| 5 | UCCUGAUGUGAUGUUCUCCAUGU | 23 | 0.25 |
| 6 | AAGGCCUCCGUGCGGUGGGG | 20 | 0.26 |
| 7 | GGUAUUGUUUACACAGAAAGGC | 22 | 0.26 |
| 8 | GAUGUGUUCUUGUGGCAAG | 19 | 0.27 |
| 9 | GGGAAAGCCCUACGAACCACU | 21 | 0.27 |
| 10 | GUGGAGACAGCGGGGUAGGC | 20 | 0.28 |
| 11 | GAGGACAACAGAGUUAUC | 18 | 0.29 |
| 12 | GCCCACUCCCAUAGGAAUUUUCC | 23 | 0.29 |
| 13 | GGAUCUUGCAGAGUUUGG | 18 | 0.29 |
| 14 | CGUUGCCGGGCAACGGGGUA | 20 | 0.29 |
상대적 mRNA 발현은, 레벨을 임의로 1.0에 설정한 빈 벡터(empty vector) 대조용에 비해 트랜스펙션된 HepG2 2.2.15 세포 내에서 (제조자의 안내서에 따라 SensiMix SYBR 원-스텝 키트(Bioline, USA)를 이용한 원-스텝 정량적 RT-PCR 방법에 의해) 측정되었다. HBV 폴리머라제 유전자에 특이적인 프라이머는 정방향 프라이머 5'-TGTGGTTATCCTGCGTTAATG-3' 역방향 프라이머 5'- GCGTCAGCAAACACTTGG-3'였으며, 그 PCR 산물은 158bp 길이였다. 내부 대조용으로서으로서 U6 snRNA(정방향 프라이머 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' 역방향 프라이머 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3')를 사용하였으며, 그 PCR 산물은 94bp 길이였다. 폴리머라제 유전자의 상대적 발현 정도는 2-??Ct 분석 방법을 사용하여 정규화되었다. 실험은 4중의 독립적인 형질도입을 이용하여 수행되었다.
실시예 4: 합성 siRNA를 사용하여 활성 확인
스크리닝의 제1 라운드는 대향(opposing) 프로모터(pU6H1-GFP)를 포함하는 벡터를 사용하였다. shRNA 발현 구조체에서, shRNA는 단일 프로모터의 지배하에 있다. 따라서, 표 2에 보여지는 상위 14개의 siRNA 서열의 효능을 확인하기 위해서, 이들 서열에 기반하는 shRNA 발현 구조체를 전개시키기 전에, HepG2 2.2.15 세포를 각 siRNA로 트랜스펙션시키고 HBV 복제의 억제를 분석함으로써 HBV 폴리머라제 mRNA 양을 결정하였다.
14개의 siRNA는 dTdT 3' 돌출부로 화학적으로 합성하였다. 5'FAM-라벨링된 siRNA-GL3(비관련 siRNA 서열을 가진 pGL3 루시퍼라제 리포터 벡터)는 음의 대조용으로서 역할을 하였다. siRNA를 DEPC-처리수 100 uM 속에 용해시키고, 분취한 다음 -20 oC에서 저장하였다. 또한, 29bp 길이의 SEQ ID NO:4를 8개의 siRNA (SEQ ID NO:20 내지 27)로 재설계하였으며, 각 22bp는 SEQ ID NO:4로부터의 오버래핑 서열로 구성되었다(하기 표 3).
| SEQ ID NO | RNAi 이펙터 서열 |
| 4 | UAUUUGCGGGAGAGGACAACAGAGUUAUCTT |
| 20 | GGGAGAGGACAACAGAGUUAUCTT |
| 21 | CGGGAGAGGACAACAGAGUUAUTT |
| 22 | GCGGGAGAGGACAACAGAGUUATT |
| 23 | UGCGGGAGAGGACAACAGAGUUTT |
| 24 | UUGCGGGAGAGGACAACAGAGUTT |
| 25 | UUUGCGGGAGAGGACAACAGAGTT |
| 26 | AUUUGCGGGAGAGGACAACAGATT |
| 27 | UAUUUGCGGGAGAGGACAACAGTT |
트랜스펙션 최적화는 5' FAM-라벨링된 siRNA-GL3 및 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 변화시킴으로써 수행되었다. 세포는 37oC, 5％ CO2에서 10% PBS (Excellbio, 중국) 및 200 ㎍/mL G418 (Sangon, 중국)로 보충된 DMEM (GIBCO, USA) 속에서 유지되었다.
최적화된 프로토콜을 사용하여 HepG2 2.2.15 세포를 siRNA로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션 후 72시간에 수확하였다. 트리졸(Trizol)(Invitrogen)을 사용하여 총 RNA를 분리하고, 실시예 3에서 이미 설명한 바와 같이 제조자의 안내서에 따라 SensiMix SYBR 원-스텝 키트(Bioline, USA)를 사용하여 원-스텝 정량적 RT-PCR 방법으로 정량화하였다.
결과
그 결과는 평균 ±STDV로 표시된다(표 4 및 도 9)
| SEQ ID NO | 폴리머라제 mRNA 양 | |||||
| Lot 1 | Lot 2 | Lot 3 | Lot 4 | 평균 | STDV | |
| 1 | 0.39 | 0.52 | 0.51 | 0.72 | 0.54 | 0.1373 |
| 2 | 0.79 | 0.24 | 0.18 | 0.43 | 0.41 | 0.2722 |
| 3 | 0.58 | 0.27 | 0.18 | 0.14 | 0.29 | 0.2014 |
| 4 | 0.41 | 0.34 | 0.22 | 0.33 | 0.0928 | |
| 5 | 0.34 | 0.35 | 0.44 | 0.37 | 0.37 | 0.0450 |
| 6 | 0.36 | 0.32 | 0.26 | 0.54 | 0.37 | 0.1190 |
| 7 | 0.45 | 0.30 | 0.26 | 0.63 | 0.41 | 0.1702 |
| 8 | 0.48 | 0.46 | 0.33 | 0.72 | 0.50 | 0.1653 |
| 9 | 0.45 | 0.26 | 0.20 | 0.28 | 0.30 | 0.1068 |
| 10 | 0.17 | 0.40 | 0.43 | 0.67 | 0.42 | 0.2053 |
| 11 | 0.32 | 0.33 | 0.30 | 0.30 | 0.31 | 0.0178 |
| 12 | 0.32 | 0.28 | 0.16 | 0.26 | 0.25 | 0.0704 |
| 13 | 0.23 | 0.25 | 0.23 | 0.26 | 0.24 | 0.0152 |
| 14 | 0.36 | 0.34 | 0.38 | 0.36 | 0.36 | 0.0180 |
| 20 | 0.43 | 0.23 | 0.19 | 0.30 | 0.29 | 0.1027 |
| 21 | 0.33 | 0.40 | 0.24 | 0.19 | 0.29 | 0.0915 |
| 22 | 0.37 | 0.51 | 0.84 | 0.27 | 0.50 | 0.2453 |
| 23 | 0.18 | 0.29 | 0.20 | 0.32 | 0.25 | 0.0648 |
| 24 | 0.31 | 0.38 | 0.46 | 0.45 | 0.40 | 0.0686 |
| 25 | 0.50 | 0.33 | 0.54 | 0.25 | 0.41 | 0.1400 |
| 26 | 0.43 | 0.41 | 0.32 | 0.43 | 0.40 | 0.0518 |
| 27 | 0.38 | 0.44 | 0.33 | 0.31 | 0.37 | 0.0585 |
| siNC | 0.72 | 0.73 | 0.69 | 0.78 | 0.73 | 0.0398 |
| 정상 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 0.0000 |
siNC=음의 대조용; 정상=트랜스펙션되지 않은 세포
테스트된 22개 siRNA 중 모두가 적어도 약 50% 억제를 나타내었으며, 대부분이 60 내지 70% 억제를 나타내었다. SEQ ID NO:4의 22bp 변이체 SEQ ID NO: 20 내지 27 사이의 높은 서열 유사성에도 불구하고, 이들 서열의 발현 억제 능력은 50 내지 71%로 다양하였다. 이 결과를 기반으로 하여, 추가 진행을 위해 SEQ ID NOS: 3, 9, 12, 13 및 23을 선택하였다. 이 SEQ ID NOS 모두는 폴리머라제 유전자를 표적화하므로, 폴리머라제 유전자 mRNA에 따른 이들 서열의 확산에 기반하여 이들 서열을 또한 선택하였다(표 1의 세로열 "HBV 표적 부위" 참조)
실시예 5: siRNA 설계 및 구축
1 단계 -
이펙터
서열 설계
siRNA 발현 구조체는 SEQ ID NOS: 3. 9, 12, 13 및 23에 기반하여 설계되었다. 구조체는 상이한 고유 활성을 갖는 상이한 버전의 인간 U6 프로모터 (Domitrovich, AM 및 Kunkel, GR (2003), "다양한 전사 효능을 갖는 다중 분산형 인간 U6 소핵 RNA 유전자(Multiple, dispersed human U6 small nuclear RNA genes with varied transcriptional efficiencies)" Nucleic Acids Research 31: 2344-2352) 또는 다양한 pol II 프로모터를 포함한 다양한 프로모터를 사용하여 용이하게 합성될 수 있다. 이들 구조체의 설계에 있어서, 다음의 고려사항이 적용되었다.
·다이서는 shRNA의 염기로부터 프로세싱한다.
·다이서 프로세싱은 부정확하나 주로 22개의 뉴클레오티드 마다 절단하는 것으로 예측된다.
·U6 종료는 shRNA에 대한 3' 말단에 UU를 가하는 것으로 예측된다.
·프로세싱된 이펙터 서열은 효율적인 Ago2 로딩을 촉진시키기 위해 5' U 또는 A를 포함하는 것이 바람직하다.
· 이펙터 서열은 최대 U6 전사에 바람직한 5'G를 피하기 위해서 루프의 3'에 위치한다.
·5' A 또는 U 잔기는 RNAi 작용제에 의해 표적화되는 서열의 상류쪽 또는 하류쪽에 서열 2 또는 3개 뉴클레오티드를 삽입함으로써 shRNA 이펙터 서열 내에 도입될 수 있다; 이는 "슬라이딩(sliding)" 서열 1, 2 또는 3개 뉴클레오티드라고 칭한다. 즉 shRNA에 대한 이펙터 서열은 siRNA 이펙터 서열의 5' 말단에 비해서 서열 1, 2 또는 3개 뉴클레오티드 5' 또는 3'에 기반할 수 있다.
SEQ ID NO: 3. 9, 12, 13 및 23에 기반한 5개의 shRNA에 적용될 때:
i) SEQ ID NO:3: gccgggcaacgggguaaagguucTT에 기반한 shRNA의 경우,
"최상" shRNA 이펙터 서열(5' GC 서열 최소화, 3nt 슬라이드"다운")
GGGCAACGGGGUAAAGGUUCuu (pol III 종료로부터의 uu)
ii) SEQ ID NO:9: gggaaagcccuacgaaccacuTT에 기반한 shRNA의 경우,
"최상" RNA 이펙터 서열(5' Gs 최소화, 5'A로 3nt 슬라이드다운, 3'에 GA 첨가) (상동성을 최대화하기 위해 HBV 게놈으로부터)
AAAGCCCUACGAACCACUGAuu
iii) SEQ ID NO:12: gcccacucccauaggaauuuuccTT에 기반한 shRNA의 경우,
"최상" shRNA 이펙터 서열은 UUUU(조기 종료를 초래할 것임)를 피하기 위해 안티센스 가닥 상에 2 nts를 이동시키고, HBV 서열로부터의 AG를 첨가하며, 이로써 5'A를 우연히 도입한다.
AGGCCCACUCCCAUAGGAAUU
iv) SEQ ID NO:13: ggaucuugcagaguuuggTT에 기반한 shRNA의 경우,
"최상" shRNA 이펙터 서열(길이를 20 nts로 증가시키고, 2 nts를 슬라이드업하고, HBV 서열로부터 TG를 첨가하며, 이로써 5'T(즉 U)의 결과를 얻는다
TGGGAUCUUGCAGAGUUUGGuu.
v) SEQ ID NO:23: ugcgggagaggacaacagaguuTT에 기반한 shRNA의 경우,
"최상" shRNA 이펙터 서열은 2 nts에 의해 3'말단에서 크기를 감소시킨다.
UGCGGGAGAGGACAACAGAGUU
2 단계 - 발현 카세트
(a)단계에서 설계된 이펙터 서열에 기반한 U6 shRNA 카세트(Genscript)를 제조하고 pUC57로 클로닝하였다.
후속 처리를 위해 일부 플랭킹(flanking) 제한 부위를 포함시킨 발현 카세트의 삽입물은 하기의 서열을 가졌다.
U6.HBVshRNA 3
GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAAGAGACCGGGCAACGGGGTAAAGGTTCTTTTTTGTTAACGAATTC(SEQ ID NO: 28)
U6.HBVshRNA 9
GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCAAGAGAGGAAAGCCCTACGAACCACTGATTTTTTGTTAACGAATTC(SEQ ID NO: 29)
U6.HBVshRNA 12
GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCACAAGAGATGAGGCCCACTCCCATAGGAATTTTTTTGTTAACGAATTC (SEQ ID NO: 30)
U6.HBVshRNA 13
GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCCAAACTCTGCAAGATCCCAGACAAGAGATCTGGGATCTTGCAGAGTTTGGTTTTTTGTTAACGAATTC(SEQ ID NO: 31)
U6.HBVshRNA 23
GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTCTGTTGTCCTCTCCCGCAAACAAGAGATTTGCGGGAGAGGACAACAGAGTTTTTTGTTAACGAATTC (SEQ ID NO: 32)
이들 발현 카세트들 각각에 상응하는 발현 shRNA는 도 6에 도시되어 있다(SEQ ID NO: 36 내지 40으로서). 부호 "∧" 및 "∨"는 shRNA의 잠재적 프로세싱 부위를 나타내며, 이는 전사 개시/종료 또는 22nt 페이즈 및 2nt 3' 돌출부를 사용한 다이서 프로세싱으로부터 생성되고, 이러한 프로세싱을 추정하는 예측 이펙터 서열이 이후에 도시되어 있다.
실시예 6: 다중 서열 구조체를 사용하여 안정한 shRNA 발현 세포 생성
앞서 약술한 바와 같이, 본 발명의 ddRNAi 발현 카세트를 설계하는 한 유용한 방법은 다이서가 22 뉴클레오티드 마다 절단한다(22nt 페이징이라고도 칭함)고 추정하는 것이다. 그러므로, 이펙터 서열을 암호화하는 DNA 서열은 적합한 스페이서, 및 프로모터 및/또는 터미네이터를 위한 다른 서열 필수요건과 함께, SEQ ID NO: 1 내지 27로 구성되는 군으로부터의 서열 내의 임의의 10개 이상 및 바람직하게는 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드를 암호화하도록 설계될 수 있다.
하기 구조를 갖는 ddRNAi 구조체가 생성될 것이다(비-한정적인 예시적 서열을 사용하여).
i) 단일 헤어핀 발현 카세트
앞서 언급한 바와 같이, 도 6은 SEQ ID NO: 3 (도 6a), SEQ ID NO:9 (도 6b) 및 SEQ ID NO:12 (도 6c), SEQ ID NO: 13 (도 6d) 및 SEQ ID NO: 23 (도 6e)에 기반하는 발현 카세트, 발현된 헤어핀 RNAi 작용제 및 다이서에 의해 프로세싱되는 이론적 이펙터 서열(22 뉴클레오티드 페이징으로 추정)을 도시한다. 도 6a 및 6b의 카세트에서는, 각각 SEQ ID NO:3 및 9의 20개의 인접 뉴클레오티드가 암호화되고, 도 6c 내지 6e의 카세트에서는 각각 SEQ ID NO: 12, 13 및 23의 21개의 인접 뉴클레오티드가 암호화된다. 헤어핀 RNAi 작용제 상의 화살표는 아래쪽에 도시된 이펙터 서열을 생성하기 위해 다이서가 절단하는 것으로 예측되는 지점을 표시한다.
도 6a 내지 6e의 발현 카세트의 서열은 이미 앞서 제공되어 있다(SEQ ID NO: 28 내지 32).
ii)다중 헤어핀발현 카세트
도 7은 개개의 헤어핀 RNAi 작용제(도 7a) 또는 프로세싱 이전 3개의 헤어핀 RNAi 작용제를 포함하는 단일 RNA(도 7b)의 발현을 유발하도록 카세트 내에 배치될 때, 발현 카세트, 발현된 헤어핀 RNAi 작용제(SEQ ID NOS: 41 내지 43), 및 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 6에 의거하는 다이서에 의해 프로세싱되는 이론적 이펙터 서열(22 뉴클레오티드 페이징으로 추정)을 도시한다. SEQ ID NO:1, 4 및 6은 단일 헤어핀 발현 카세트에 대해서 앞서 기술한 바와 동일하다. 헤어핀 RNAi 작용제 상의 "∧" 및 "∨" 부호는 아래쪽에 도시된 이펙터 서열을 생성하기 위해 다이서가 절단하는 것으로 예측되는 지점을 표시한다.
도 7a의 발현 카세트는 TACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCTCCCTTATCGTCAATCTTCAAGAGAAAGATTGACGATAAGGGAGATTTTTTTTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGATAACTCTGTTGTCCTCTTTCAAGAGAAGAGGACAACAGAGTTATCTTTTTTTTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCCCCACCGCACGGAGGCCTTTTCAAGAGAAAGGCCTCCGTGCGGTGGGGTTTTTTT (SEQ ID NO: 33)의 DNA 서열을 갖는다.
도 7a의 카세트에서, 각 이펙터 보체는 프로모터 서열과 작동가능하게 연결되어 있고, 상응 이펙터 서열은 종료 요소 또는 서열과 작동가능하게 연결되어 있다.
대조적으로, 도 7b의 발현 카세트에서 첫번째 이펙터 보체(이펙터 1 보체)는 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있고 마지막 이펙터(이펙터 6)은 종료 요소 또는 서열와 작동가능하게 연결되어 있으며, 화살표는 다이서 프로세싱을 위한 예상 부위를 표시한다. 이 카세트는 단일 RNA 분자(SEQ ID NO: 44)를 발현하도록 설계되며, TACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTGCTGTTGACAGTGAGCGTCTCCCTTATCGTCAATCTTCAAGAGAAAGATTGACGATAAGGGAGATGCCTACTGCCTCGGATTCTGCTGTTGACAGTGAGCGGTTGTCCTCTCCCGCAAATACAAGAGATATTTGCGGGAGAGGACAACTGCCTACTGCCTCGGATTCTGCTGTTGACAGTGAGCGCCCCACCGCACGGAGGCCTTCAAGAGAAAGGCCTCCGTGCGGTGGGGTGCTGTTGACAGTGAGCGTTTTTTT (SEQ ID NO: 34)의 DNA 서열을 갖는다.
iii)긴 헤어핀 발현 카세트
도 8은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 및 SEQ ID NO: 4(순서대로)에 의거하는 발현 카세트, 발현된 헤어핀 RNAi 작용제(SEQ ID NOS: 45) 및 다이서에 의해 프로세싱되는 이론적 이펙터 서열(22 뉴클레오티드 페이징으로 추정)을 도시한다. 도 8의 카세트에서, SEQ ID NO: 1의 17개의 인접 뉴클레오티드가 암호화되며, SEQ ID NO: 6의 20개의 인접 뉴클레오티드는 이전 실시예에서와 같으나, 도 7 및 8의 카세트와 대조적으로, SEQ ID NO: 4의 18개의 인접 뉴클레오티드 만이 암호화된다. 헤어핀 RNAi 작용제 상의 화살표는 아래쪽에 도시된 이펙터 서열을 생성하기 위해 다이서가 절단하는 것으로 예측되는 지점을 표시한다.
도 8의 발현 카세트는 TACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTCCCTTATCGTCAATCTTCACCCCACCGCACGGAGGCCTTCTGATGTCCTCTCCCGCAAATACAAGAGATATTTGCGGGAGAGGACAACAGAAGGCCTCCGTGCGGTGGGGTGAAAGATTGACGATAAGGGAGATTTTTTT (SEQ ID NO: 35)의 DNA 서열을 갖는다.
실시예 7: 시험관내 ddRNAi 작용제의 효능 분석
ddRNAi 작용제의 효능을 검사하기 위해서, 적합한 세포 및 세포계를 본 발명의 RNA 작용제로 트랜스펙션시키고 HBV 복제 억제를 분석할 수 있다.
본 발명의 ddRNAi 구조체의 효능을 분석하기 위해서, pGL3 루시퍼라제 리포터 벡터에 기반한 플라스미드 DNA를 구축하였다. 제1 "pGL3 멀티"는 각각 SEQ ID NO: 3. 9, 12, 13 및 23에 기반하는 siRNA 또는 shRNA 3, 9, 12, 13 및 23에 대한 표적 부위를 암호화하는 반딧불이 루시퍼라제 발현 플라스미드 pGL3의 3' 비번역 영역(UTR) 내의 서열의 단일 복사체를 포함한다. 제2 "pGL3-23"은 SEQ ID NO: 23에 기반하는 shRNA 23의 3중 반복부를 포함한다. 이들 플라스미드의 HBV 표적 부위는 특정 siRNA 또는 shRNA에 의해 인식되는 HBV의 센스 서열에 상응하며, 표적 부위의 상류쪽 및 하류쪽에 HBV 서열의 추가적인 10nts를 포함한다.
하기 정보는 pGL3-23 구조체를 사용하여 수행되는 실험에 관한 것이다.
편의상 본 발명자는 HEK293 세포 내에서 일시적 분석을 포함한 이중-루시퍼라제 분석을 이용하여 초기 검사를 시작하는 것을 선택하였다. 세포를 96-웰(well) 플레이트(0.1 ml 배지/웰) 내에서 배양시킴으로써 트랜스펙션 이전에 약 50% 컨플루언스(confluence)에 도달하였다. 제조자(Invitrogen)의 프로토콜을 이용하여 플라스미드 DNA 및 화학적으로 합성된 siRNA(또는 shRNA 벡터)를 리포펙타민™ 2000을 포함하는 HEK293 세포 내로 공동-트랜스펙션시켰다. 검사 구조체는 트랜스펙션 효능에 대한 내부 대조용 역할을 하는 레닐라(Renilla) 루시퍼라제(pRL-TK, Promega)를 발현하는 구조체와 함께 사용되었다.
벡터로부터 발현된 화학적으로 합성된 siRNA, 또는 shRNA이 표적 서열을 침묵시키는데 있어서 효과적이면, 트랜스펙션된 세포의 루시퍼라제 양은 표적 서열이 루시퍼라제 유전자와 작동가능하게 연결되어 있으므로 감소될 것이다.
따라서, 다양한 양의 화학적으로 합성된 siRNA 또는 shRNA 발현 벡터는 일정량의 pGL3-23 및 대조용 플라스미드와 함께 공동-트랜스펙션되었다(하기 표들 참조)
| pGL3-23(ng) | pRL-TK(ng) | siRNA(pmol) | siNC (pmol) | |
| 20 | 2 | siNC | 0 | 10.0 |
| HBV-siRNA23 | 0.5 | 9.5 | ||
| 1.0 | 9.0 | |||
| 2.5 | 7.5 | |||
| 5.0 | 5.0 | |||
| 10.0 | 0.0 | |||
| siRNA-GL3 | 5.0 | 5.0 | ||
세포는 제시된 양의 pGL3-23 및 대조용 (pRL-TK) 플라스미드와 다양한 양의 SEQ ID NO:23에 기반한 siRNA(HBV-shRNA23)로 트랜스펙션되었다. HBV의 공지된 표적 서열을 갖지 않는 비관련 siRNA인 siNC는 음의 대조용으로서, 그리고 동등하지 않은 트랜스펙션으로 인한 잠재적 아티팩트를 피하기 위해 세포에 가해지는 siRNA의 총량을 조절하기 위해서 사용되었다. siRNA GL3는 양의 대조용으로서 사용되었으며, 이는 루시퍼라제 유전자에 표적화된 siRNA이다.
| pGL3-23(ng) | pRL-TK (ng) | shRNA (ng) |
pUC57 (ng) |
|
| 20 | 2 | pUC57 | 0 | 100 |
| HBV shRNA23 | 2 | 98 | ||
| 5 | 95 | |||
| 10 | 90 | |||
| 20 | 80 | |||
| 50 | 50 | |||
| 100 | 0 | |||
| U6 shRNA-GL3 | 50 | 50 | ||
세포는 제시된 양의 pGL3-23 및 대조용 (pRL-TK) 플라스미드와 다양한 양의 SEQ ID NO:23에 기반한 shRNA(HBV shRNA23)를 발현시키기 위한 검사 플라스미드로 트랜스펙션되었다. pUC57은 음의 대조용으로서, 그리고 동등하지 않은 트랜스펙션으로 인한 잠재적 아티팩트를 피하기 위해 세포에 가해지는 플라스미드 DNA의 총량을 조절하기 위해서 사용되었다. GL3 siRNA에 기반한 루시퍼라제 shRNA를 발현시키는 플라스미드는 양의 대조용으로서 사용되었다.
검사용 샘플을 4개의 개별 웰 내에 트랜스펙션시키고, 각각의 제조자의 프로토콜에 따라 듀얼-루시퍼라제 분석 시스템(Promega) 및 Synergy™ 2 발광 마이크로플레이트 판독기(Biotek)를 사용하여 트랜스펙션후 48시간 후에 반딧불이 및 레닐라 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 반딧불이/레닐라 활성비는 각 웰에 대해 측정되었으며, siRNA 또는 shRNA의 억제 효율은 각 대조용에 대해 정규화함으로써 산정되었다.
결과
도 10a 및 10b의 그래프는 표 5 및 6에 기재된 조건을 사용하여 pGL3-23을 표적화하는 다양한 양의 화학적으로 합성된 siRNA23 (A) 또는 shRNA23 발현 구조체(B)로 트랜스펙션된 세포의 루시퍼라제 활성(+/- SD; n=4)을 보여준다. 최저 농도에서도, SEQ ID NO:23에 기반한 siRNA 및 shRNA는 음의 대조용(siNC 또는 shNC - 임의로 1로 설정)에 비해 억제된다. 또한 양의 대조용 루시퍼라제 siRNA 및 shRNA도 pGL3-23로부터 루시퍼라제 발현 정도를 억제하였다.
실시예 8: 생체내 ddRNAi 작용제의 유효성 분석
HBV용 생쥐 모델, 예컨대 HBV 감염된 NOD/SCID 생쥐 (Yang 외. 2002; Ketzinel-Gilad 외. 2006), 뿐만 아니라 HBV를 발현하는 유전자변이된 생쥐 계통이 입수될 수 있으며, 이들 중 하나 또는 둘다를 이 실험에 사용될 수 있다.
간에 ddRNAi 작용제를 전달하기 위해서 생쥐의 꼬리정맥 내로 ddRNAi 작용제를 주입하는 방식을 이용할 것이다. 앞서 기술한 바와 같이, 스크램블된 서열 또는 비관련 DNA가 주입된 생쥐와 같은 적절한 대조용 동물과 비교하여, 본 발명의 ddRNAi 작용제로 처리된 동물의 간조직의 HBV pol mRNA의 양을 결정하기 위해 qRT-PCR 분석을 이용하거나 또는 HBsAg 및 HBeAg 순환량을 정량화함으로써 여러 시점에서 HBV 복제의 억제를 모니터링할 수 있다.
ddRNAi 작용제의 안정한 발현에 적합한 발현 구조체는 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
실시예 9: 정상 생쥐 모델의 전-임상 후보자의 생체내 검사
정상 생쥐 모델의 전-임상 후보자의 생체내 검사에서 예견되는 한 전달 시스템은 AVV이다. AVV의 경우, ddRNAi 구조체는 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 전략을 사용하여 시험관 내에서 패키징될 것이며, HBV 감염된 NOD/SCID 생쥐 및/또는 HBV 유전자변이된 생쥐에 정맥내로 주입될 것이다. HBV 복제의 억제는 앞서 기술한 바와 같이 모니터링될 것이다.
본 명세서에 개시되고 정의되는 본 발명은 본문 또는 도면으로부터 설명되거나 명백해지는 둘 이상의 개별적인 특징의 모든 대안적인 조합까지 확장된다 는 점을 이해할 것이다. 이들 모든 상이한 조합은 본 발명의 다양한 대안적 양태를 구성한다.
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uugaaguccc aaucuggau 19
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uauuugcggg agaggacaac agaguuauc 29
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uccugaugug auguucucca ugu 23
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aaggccuccg ugcggugggg 20
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gguauuguuu acacagaaag gc 22
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gauguguucu uguggcaag 19
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gggaaagccc uacgaaccac u 21
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guggagacag cgggguaggc 20
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cguugccggg caacggggua 20
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gcaauuuccg uccgaagguu ugg 23
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guuggaggac aggagguugg 20
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<213> Hepatitis B virus
<400> 26
auuugcggga gaggacaaca ga 22
<210> 27
<211> 22
<212> RNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 27
uauuugcggg agaggacaac ag 22
<210> 28
<211> 351
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 28
gggacccggt acctcgagag atctgggcag gaagagggcc tatttcccat gattccttca 60
tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga gagataatta gaattaattt gactgtaaac 120
acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca 180
gttttaaaat tatgttttaa aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc 240
gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgaaccttt accccgttgc 300
ccggcaagag accgggcaac ggggtaaagg ttcttttttg ttaacgaatt c 351
<210> 29
<211> 352
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 29
gggacccggt acctcgagag atctgggcag gaagagggcc tatttcccat gattccttca 60
tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga gagataatta gaattaattt gactgtaaac 120
acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca 180
gttttaaaat tatgttttaa aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc 240
gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgtcagtgg ttcgtagggc 300
tttcccaaga gaggaaagcc ctacgaacca ctgatttttt gttaacgaat tc 352
<210> 30
<211> 352
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 30
gggacccggt acctcgagag atctgggcag gaagagggcc tatttcccat gattccttca 60
tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga gagataatta gaattaattt gactgtaaac 120
acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca 180
gttttaaaat tatgttttaa aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc 240
gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgattccta tgggagtggg 300
cctcacaaga gatgaggccc actcccatag gaattttttt gttaacgaat tc 352
<210> 31
<211> 352
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 31
gggacccggt acctcgagag atctgggcag gaagagggcc tatttcccat gattccttca 60
tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga gagataatta gaattaattt gactgtaaac 120
acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca 180
gttttaaaat tatgttttaa aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc 240
gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgccaaact ctgcaagatc 300
ccagacaaga gatctgggat cttgcagagt ttggtttttt gttaacgaat tc 352
<210> 32
<211> 294
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 32
gggacccggt acctcgagag atctgggcag gaagagggcc tatttcccat gattccttca 60
tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga gagataatta gaattaattt gactgtaaac 120
acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgt tgaaagtatt 180
tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa caccgctctg ttgtcctctc 240
ccgcaaacaa gagatttgcg ggagaggaca acagagtttt ttgttaacga attc 294
<210> 33
<211> 613
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 33
tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat 60
gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt 120
tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg tctcccttat cgtcaatctt caagagaaag 180
attgacgata agggagattt tttttacaaa atacgtgacg tagaaagtaa taatttcttg 240
ggtagtttgc agttttaaaa ttatgtttta aaatggacta tcatatgctt accgtaactt 300
gaaagtattt cgatttcttg gctttatata tcttgtggaa aggacgaaac accgataact 360
ctgttgtcct ctttcaagag aagaggacaa cagagttatc ttttttttac aaaatacgtg 420
acgtagaaag taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta aaattatgtt ttaaaatgga 480
ctatcatatg cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc ttggctttat atatcttgtg 540
gaaaggacga aacaccgccc caccgcacgg aggccttttc aagagaaagg cctccgtgcg 600
gtggggtttt ttt 613
<210> 34
<211> 408
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 34
tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat 60
gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt 120
tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg tgctgttgac agtgagcgtc tcccttatcg 180
tcaatcttca agagaaagat tgacgataag ggagatgcct actgcctcgg attctgctgt 240
tgacagtgag cggttgtcct ctcccgcaaa tacaagagat atttgcggga gaggacaact 300
gcctactgcc tcggattctg ctgttgacag tgagcgcccc accgcacgga ggccttcaag 360
agaaaggcct ccgtgcggtg gggtgctgtt gacagtgagc gttttttt 408
<210> 35
<211> 292
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 35
tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat 60
gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt 120
tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg ctcccttatc gtcaatcttc accccaccgc 180
acggaggcct tctgatgtcc tctcccgcaa atacaagaga tatttgcggg agaggacaac 240
agaaggcctc cgtgcggtgg ggtgaaagat tgacgataag ggagattttt tt 292
<210> 36
<211> 53
<212> RNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 36
gaaccuuuac cccguugccc ggcaagagac cgggcaacgg gguaaagguu cuu 53
<210> 37
<211> 56
<212> RNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 37
gucagugguu cguagggcuu ucccaagaga ggaaagcccu acgaaccaca cugauu 56
<210> 38
<211> 53
<212> RNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 38
gauuccuaug ggagugggcc ucacaagaga ugaggcccac ucccauagga auu 53
<210> 39
<211> 54
<212> RNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 39
gccaaacucu gcaagauccc agacaagaga ucugggaucu ugcagaguuu gguu 54
<210> 40
<211> 54
<212> RNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 40
gcucuguugu ccucucccgc aaacaagaga uuugcgggag aggacaacag aguu 54
<210> 41
<211> 50
<212> RNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 41
gucucccuua ucgucaaucu ucaagagaaa gauugacgau aagggagauu 50
<210> 42
<211> 51
<212> RNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 42
guuguccucu cccgcaaaua uucaagagau auuugcggga gaggacaacu u 51
<210> 43
<211> 50
<212> RNA
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<400> 43
gccccaccgc acggaggccu ucaagagaaa ggccuccgug cggugggguu 50
<210> 44
<211> 250
<212> RNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 44
gugcuguuga cagugagcgu cucccuuauc gucaaucuuc aagagagauu gacgauaagg 60
gagaugccua cugccucgga uucugcuguu gacagugagc gguuguccuc ucccgcaaau 120
acaagaguau uugcgggaga ggacaacugc cuacugccuc ggauucugcu guugacagug 180
agcgccccac cgcacggagg ccuucaagag aaggccuccg ugcggugggg ugcuguugac 240
agugagcguu 250
<210> 45
<211> 137
<212> RNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 45
gucucccuua ucgucaaucu ucaccccacc gcacggaggc cuucugaugu ccucucccgc 60
aaauacaaga gauauuucgg gagaggacaa cagaaggccu ccgugcggug gggugaagau 120
uaacgauaag ggagauu 137
Claims (23)
- 하나 이상의 B형 간염 바이러스(HBV) 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열의 발현을 억제시키기 위한 DNA-지향 RNA 간섭 (ddRNAi) 작용제로서, 상기 ddRNAi 작용제는
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제1 이펙터 서열;
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제2 이펙터 서열;
제2 이펙터 보체 서열; 및
제1 이펙터 보체 서열
을 포함하며, 여기서, 각 이펙터 서열은 표적 서열의 하나의 예측 전사체에 혼성화될 수 있고, 제1 및 제2 이펙터 서열의 하나는 SEQ ID NO: 9로 나타내는 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ddRNAi 작용제. - 제1항에 있어서, 각 이펙터 서열은 표적 서열의 하나의 예측 전사체에 적어도 85% 상보적인, ddRNAi 작용제.
- 제1항에 있어서, 5' 에서 3' 방향으로 하기를 포함하는 ddRNAi 작용제:
(i) 적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제1 이펙터 서열;
제1 이펙터 보체 서열;
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제2 이펙터 서열; 및
제2 이펙터 보체 서열, 또는
(ii) 제1 이펙터 보체 서열;
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제1 이펙터 서열;
제2 이펙터 보체 서열; 및
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제2 이펙터 서열. - 제1항에 있어서,
적어도 17개의 뉴클레오티드 길이의 제3 이펙터 서열 및 제3 이펙터 보체 서열을 포함하는 ddRNAi 작용제. - 제1항에 있어서,
제1 및 제2 이펙터 서열의 하나는 SEQ ID NO: 9로 나타내는 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
다른 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 8 및 10 내지 27로 나타내는 서열로부터 선택되는 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ddRNAi 작용제. - 제5항에 있어서,
제1 및 제2 이펙터 서열의 하나는 SEQ ID NO: 9로 나타내는 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
다른 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 3, 12, 13 및 23으로 나타내는 서열로부터 선택되는 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ddRNAi 작용제. - 제1항에 있어서,
제1 및 제2 이펙터 서열의 하나는 SEQ ID NO: 9로 나타내는 서열 내의 임의의 15개 이상의 인접 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ddRNAi 작용제. - 제1항에 있어서,
제1 및 제2 이펙터 서열의 하나는 SEQ ID NO: 9로 나타내는 서열 내의 임의의 16개 이상의 인접 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ddRNAi 작용제. - 제1항에 있어서,
제1 및 제2 이펙터 서열의 하나는 SEQ ID NO: 9로 나타내는 서열 내의 임의의 17개 이상의 인접 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ddRNAi 작용제. - 제1항에 있어서,
제1 및 제2 이펙터 서열의 하나는 SEQ ID NO: 9로 나타내는 서열 내의 임의의 18개 이상의 인접 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ddRNAi 작용제. - 제1항에 있어서,
제1 및 제2 이펙터 서열의 하나는 SEQ ID NO: 9로 나타내는 서열 내의 임의의 19개 이상의 인접 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는, ddRNAi 작용제. - 제1항에 있어서,
제1 및 제2 이펙터 서열의 하나는 SEQ ID NO: 9로 나타내는 서열을 포함하거나 SEQ ID NO: 9로 나타내는 서열로 이루어지는, ddRNAi 작용제. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 ddRNAi 작용제를 발현하기 위한 ddRNAi 발현 카세트로서, 상기 발현 카세트는
하나 이상의 프로모터 서열;
하나 이상의 이펙터 서열을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열;
하나 이상의 이펙터 보체 서열을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열; 및
하나 이상의 터미네이터 서열
을 포함하는 ddRNAi 발현 카세트. - 제13항에 있어서,
루프 서열을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열;
하나 이상의 인핸서 서열; 또는
루프 서열을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열 및 하나 이상의 인핸서 서열
을 포함하는 ddRNAi 발현 카세트. - 제13항에 있어서,
하나 이상의 이펙터 서열을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열은
SEQ ID NO: 9로 나타내는 서열 내의 임의의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이펙터 서열을 코딩하는 DNA 서열; 및
각 이펙터 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 8 및 10 내지 27 중 어느 하나로 나타내는 서열 내의 10개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하는, 하나 이상의 이펙터 서열을 암호화는 하나 이상의 DNA 서열
을 포함하는 ddRNAi 발현 카세트. - 제13항에 따르는 ddRNAi 발현 카세트를 포함하는 ddRNAi 발현 구조체.
- 제14항에 따르는 ddRNAi 발현 카세트를 포함하는 ddRNAi 발현 구조체.
- 제15항에 따르는 ddRNAi 발현 카세트를 포함하는 ddRNAi 발현 구조체.
- 제16항에 따르는 ddRNAi 발현 구조체 및 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
- 대상자의 급성 또는 만성 HBV 감염 치료, 대상자의 HBV 바이러스 부하량(viral load) 감소, 대상자의 HBV 감염과 관련된 증상의 중증도 감소, 또는 대상자의 HBV 감염성(infectivity) 감소에 사용하기 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 ddRNAi 작용제.
- 대상자의 급성 또는 만성 HBV 감염 치료, 대상자의 HBV 바이러스 부하량 감소, 대상자의 HBV 감염과 관련된 증상의 중증도 감소, 또는 대상자의 HBV 감염성 감소에 사용하기 위한 제13항의 ddRNAi 발현 카세트.
- 대상자의 급성 또는 만성 HBV 감염 치료, 대상자의 HBV 바이러스 부하량 감소, 대상자의 HBV 감염과 관련된 증상의 중증도 감소, 또는 대상자의 HBV 감염성 감소에 사용하기 위한 제16항의 ddRNAi 발현 구조체.
- 대상자의 급성 또는 만성 HBV 감염 치료, 대상자의 HBV 바이러스 부하량 감소, 대상자의 HBV 감염과 관련된 증상의 중증도 감소, 또는 대상자의 HBV 감염성 감소에 사용하기 위한 제19항의 약학적 조성물.
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