KR101895237B1 - 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수용성 항암제인 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 경구흡수촉진제인 담즙산 유도체와 옥살리플라틴의 이온결합에 의한 복합체를 형성하고, 이를 수중유중수형 (water-in-oil-in-water, w/o/w)의 다중 유화 나노 에멀젼의 내부 수상에 포함시켜 수용성 항암제인 옥살리플라틴의 경구 생체이용률을 향상시킴으로써 현재 주사제 제형으로만 투여되고 있는 옥살리플라틴을 경구 투여가 가능한 제형으로 제조하여 주사제 사용의 불편함과 문제점을 개선하고, 환자의 순응도 개선 및 의료비 절감에 기여할 수 있는 경구용 약물전달 조성물에 관한 것이다.

Description

옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물 및 이의 제조방법 {Oral drug delivery composition comprising oxaliplatin and method for producing the same}
본 발명은 수용성 활성물질인 옥살리플라틴과 경구흡수촉진제인 담즙산 유도체의 이온결합에 의한 복합체를 다중 유화 나노 에멀젼의 내부 수상에 포함하는 경구용 약물전달 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
옥살리플라틴 (oxaliplatin, cis-[(1R,2R)-1,2-cyclohexanediamine-N,N `][oxalato(2-)-O,O `]platinum, OXA)은 백금 (platinum, Pt)과 1,2-디아미노사이클로헥산으로 구성되며, 옥살레이트 리간드를 이탈기로 가지는 유기착화합물로, 제 3세대 백금 착제 항암 화합물이며, 핵 내 DNA와 부가체를 형성하여 DNA 복제 및 전사 메커니즘을 방해함으로써 항암 효과를 나타낸다. Pt-DNA 부가체는 일반적으로 백금-구아닌-구아닌 결합 형태를 가지며, 핵산 수준에서 DNA 복구메커니즘 또는 사멸경로 중 하나를 작동시킨다.
또한 옥살리플라틴은 엘록사틴ⓡ (Eloxatinⓡ)이라는 상품명으로 진행성 대장암 및 전이성 위암 치료제로 판매되고 있으며, 일반적으로 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil, 5-FU) 및 류코보린 (leucovorin)과 함께 병용 투여되기도 한다. 특히, 전이성 대장암은 Eloxatinⓡ　(옥살리플라틴) 혹은 FOLFOX (플루오로우라실/류코보린/옥살리플라틴 병용), FOLFIRI (플루오로우라실/류코보린/이리노테칸 병용) 등의 화학요법을 사용하며, Genentech/Roche사의 아바스틴 (Avastinⓡ, bevacizumab)은 2004년에 미국 FDA의 승인을 받은 바 있다.
옥살리플라틴은 현재 주사제로만 환자에게 투여되고 있으며, 동결건조 제제 형태로 환자에게 투여하기 직전에 주사용수, 글루코오스 용액 또는 0.9% 염화나트륨 용액으로 희석시켜 사용하여야 한다. 그러나 동결건조 공정은 복잡하고 제조비용이 많이 들며, 또한 동결 건조된 제품을 사용하기 위해서는 재구성이 필요하다. 그러나 이러한 재구성 과정에서 옥살리플라틴의 손실, 침전 발생, 재구성 시 바람직하지 못한 입자의 생성, 오염에의 노출 위험성 등의 문제점이 발생할 수 있으며, 특히 오염 문제는 항종양 물질의 독성 때문에 매우 심각하다.
최근 경구 투여를 통한 항암 치료 요법은 환자의 병원 방문 후 주사제 투여의 불편함을 최소화하고 집에서 수행될 수 있으며, 이로 인해 환자의 복용 편의성 및 삶의 질을 향상시킬 수 있어 주목받고 있다. 또한 장기간 혈중 약물 농도를 유지시켜 암세포에 항암제를 낮은 농도로 장기간 노출시킴에 따라 약물의 효능을 유지하고 부작용을 최소화함으로써 암의 재발 및 전이를 방지하기 위한 예방 차원의 만성 치료 요법으로써 항암제의 적용을 용이하게 할 수 있다.
그러나 항암제의 경구 약물전달은 활성성분의 물리화학적 특성과 생리학적 장애로 인하여 많은 제약이 존재한다. 이러한 장벽에는 약물의 전신혈 이행 전 대사 과정, 위장관에서의 약물 불안정성, 낮은 용해성, 낮은 장관막 투과성, p-glycoprotein (p-gp)에 의한 배출이 포함된다.
특히 옥살리플라틴은 낮은 장관막 투과성으로 인하여 낮은 경구 생체이용률을 나타내기 때문에 경구용 제제의 사용이 제한된다. 현재까지 옥살리플라틴을 경구용 제제로 만들기 위한 시도는 잘 알려져 있지 않지만, 옥살리플라틴의 경우 대장암 치료를 위해 대장 국소부위로의 전달을 위한, pH 민감성이며 점막 부착형 고분자인 키토산 기반 알긴산 마이크로입자 및 히알루론산이 결합된 키토산 나노 입자로 옥살리플라틴을 캡슐화한 후 Eudragit S100으로 코팅한 경구용 제제가 제시된 바 있으며, 5-플루오로우라실의 경우도 대장부위 국소 전달을 위해 펙틴과 에칠셀룰로오스로 코팅한 펠릿 형태의 제제 및 PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid) 나노 입자 형태의 경구용 제제가 제시된 바 있다.
이에 본 발명자들은 상기 옥살리플라틴 같은 수용성 활성물질을 경구 투여용 제형으로 제조하기 위하여 연구한 결과, 옥살리플라틴을 경구 흡수촉진제인 담즙산 유도체와 이온결합에 의한 복합체를 형성한 후 이를 w/o/w (water-in-oil-in-water) 다중 유화 나노 에멀젼의 내부 수상에 포함시키면 약물의 장관막 투과도가 증가하여 경구 투여용 제형으로 제조할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2016, Vol. 16, pp. 2061-2064.
본 발명의 목적은 수용성 항암제인 옥살리플라틴을 w/o/w (water-in-oil-in-water) 다중 유화 나노 에멀젼의 내부 수상에 포함시켜 약물의 장관막 투과도를 증가시킴으로써 경구 투여용 제형으로 제조함에 따라 주사제 사용의 불편함과 문제점을 개선하고 환자의 순응도 개선 및 의료비용 절감에 기여할 수 있는 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여,
(a) 옥살리플라틴에 양전하를 띠는 담즙산 유도체를 첨가하여 이온결합 복합체를 형성하는 단계; (b) 1차 오일상에 1차 계면활성제와 1차 보조 계면활성제의 혼합물을 첨가하는 단계; (c) 상기 이온결합 복합체와 상기 (b) 단계의 혼합물을 혼합하여 수중유형 (water-in-oil, w/o) 1차 나노 에멀젼을 제조하는 단계; (d) 상기 w/o 1차 나노 에멀젼에 2차 계면활성제와 2차 보조 계면활성제의 혼합물을 첨가하여 수중유중수형 (water-in-oil-in-water, w/o/w) 2차 나노 에멀젼을 제조하는 단계;를 포함하는 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 담즙산 유도체는 Nα-deoxycholyl-L-lysyl-methylester (DCK)이며, 옥살리플라틴 1 몰에 대하여, 0.5 내지 5 몰로 포함되는 것을 특징으로 한다.
상기 w/o 1차 나노 에멀젼 내 오일상은 실리콘 오일, 에스테르계 오일, 하이드로카본계 오일, 프로필렌 글리콜 모노카프릴레이트 (Capryol 90), 프로필렌 글리콜 디카프릴로카프레이트 (Labrafac PG), 올레오일 마크로골-6 글리세리드 (Labrafil M1944 CS), 라우로일 마크로골-6 글리세리드 (Labrafil M2130 CS), 리놀레오일 마크로골-6 글리세리드 (Labrafil M2125 CS), 중쇄 트리글리세리드 (Labrafac), 올레인산, 스테아르산, 글리세릴 베헤네히트 (Compritol 888), 글리세롤 모노스테아레이트 및 피마자유로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 w/o/w 2차 나노 에멀젼 내 오일상은 조성물 총 중량에 대하여, 1 내지 40 중량%로 포함되는 것을 특징으로 한다.
상기 1차 및 2차 계면활성제는 서로 독립적으로 폴록사머 (poloxamer), 카프릴로카프릴 마크로골-8 글리세리드 (Labrasol), 크레모포어 (Cremophor), 글리세롤 모노카프릴로카프레이트 (Capmul MCM), 라우로일 마크로골-32 글리세리드 (Gelucire 44/14), 솔루트롤 (Solutrol), 폴리솔베이트 (Tween) 및 소르비탄 모노라우레이트 (Span)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 1차 및 2차 보조 계면활성제는 서로 독립적으로 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (Transcutol HP), 폴리솔베이트, 폴리에틸렌글리콜, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 에탄올 및 이소프로판올로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 1차 계면활성제와 1차 보조 계면활성제의 혼합물 및 2차 계면활성제와 2차 보조 계면활성제의 혼합물은 조성물 총 중량에 대하여, 5 내지 90 중량%로 포함되는 것을 특징으로 한다.
상기 1차 및 2차 보조 계면활성제는 각각 1차 및 2차 계면활성제에 대하여 서로 독립적으로 1:0.1 내지 1:10 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 한다.
상기 (a) 단계에서 단당류, 다당류, 식이섬유, 검류, 계면활성제 또는 단백질 중에서 선택되는 응집방지제를 더 포함할 수 있으며, 상기 응집방지제는 옥살리플라틴 1 중량부에 대하여, 0.1 내지 100 중량부로 포함되는 것을 특징으로 한다.
상기 w/o 1차 나노 에멀젼은 내부 수상에 5-플루오로우라실 (5-FU) 또는 류코보린 중에서 선택되는 친수성 활성성분을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (d) 단계에서 w/o/w 2차 나노 에멀젼은 오일상에 난용성 항암제, 커큐민, 쿼세틴, 커큐민 또는 쿼세틴을 활성성분으로 함유하는 천연추출물, 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 지용성 활성성분을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물은 수용성 항암제인 옥살리플라틴을 경구흡수촉진제인 담즙산 유도체와 결합시켜 이온결합 복합체를 형성하고, 이를 w/o/w 다중 유화 나노 에멀젼에 담지함으로써 경구 생체이용률을 향상시킴에 따라 경구 투여가 가능한 제형으로 제조가 가능하며, 이로써 기존의 주사제 사용의 불편함과 문제점을 개선하고 환자의 순응도를 좋게 하며, 의료비 절감에 기여할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 3에 따른 (A) Smix,1 2:1, (B) Smix,1 1:1, (C) Smix,1 1:2에 대한 w/o 1차 나노 에멀젼 영역의 유사 3상 다이어그램이다.
도 2는 본 발명의 실시예 4에 따른 (A) Smix,2 2:1, (B) Smix,2 1:1, (C) Smix,2 1:2에 대한 w/o/w 2차 나노 에멀젼 영역의 유사 3상 다이어그램이다.
도 3은 본 발명의 실시예 5에 따른 (A) 분말 X-선 회절패턴 및 (B) 시차주사열량계 서모그램 (thermogram)이다.
도 4는 본 발명의 실시예 6에 따른 (A) OXA 혹은 (B) OXA/DCK 이온결합 복합체를 포함하는 w/o/w 2차 나노 에멀젼 조성 E (Smix,2 1:1) 내 액적의 크기 분포도 및 TEM 이미지이다.
도 5는 본 발명의 실시예 7에 따른 (A) OXA, (B) OXA/DCK 이온결합 복합체 및 (C) OXA/DCK 이온결합 복합체의 인공장관막 투과도이다.
도 6은 본 발명의 실시예 9에 따른 pH 1.2 조건에서 (A) OXA, (B) OXA/DCK 이온결합 복합체 및 (C) 5-FU의 누적약물방출과 pH 6.8 조건에서 (D) OXA, (E) OXA/DCK 이온결합 복합체 및 (F) 5-FU의 누적약물방출을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 10에 따른 랫드에 (A) OXA 정맥주입 후 시간에 따른 혈중약물농도, (B) OXA, OXA/DCK 이온결합 복합체 및 OXA/DCK 이온결합 복합체를 포함하는 2차 나노 에멀젼의 경구 투여 후 시간에 따른 혈중약물농도, (C) 5-FU 정맥주입 후 및 5-FU 또는 5-FU를 포함하는 2차 나노 에멀젼의 경구 투여 후 시간에 따른 혈중약물농도를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 11에 따른 (A) 시간에 따른 암조직의 크기, (B) 시간에 따른 마우스 체중 변화, (C) 18일 투여 후 적출한 암조직의 무게를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 11에 따른 적출한 암 조직 절편을 (A) PCNA와 (B) TUNEL로 염색한 절단면 이미지를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 따른 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물 및 이의 제조방법에 대해 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물의 제조방법은 (a) 옥살리플라틴에 양전하를 띠는 담즙산 유도체를 첨가하여 이온결합 복합체를 형성하는 단계; (b) 1차 오일상에 1차 계면활성제와 1차 보조 계면활성제의 혼합물을 첨가하는 단계; (c) 상기 이온결합 복합체와 상기 (b) 단계의 혼합물을 혼합하여 수중유형 (water-in-oil, w/o) 1차 나노 에멀젼을 제조하는 단계; (d) 상기 w/o 1차 나노 에멀젼에 2차 계면활성제와 2차 보조 계면활성제의 혼합물을 첨가하여 수중유중수형 (water-in-oil-in-water, w/o/w) 2차 나노 에멀젼을 제조하는 단계;를 포함한다.
상기 옥살리플라틴은 친수성이며 음전하를 띠는 활성물질로, 옥살리플라틴 수용액에 양전하를 띠는 경구흡수촉진제인 담즙산 유도체를 첨가하여 이온결합에 의한 복합체를 형성한다.
상기 담즙산 유도체는 수용액 상에서 양전하를 띠는 양친매성 물질로, L-라이신과 데옥시콜산을 화학적으로 결합한 Nα-deoxycholyl-L-lysyl-methylester (DCK)인 것이 바람직하다. 또한 옥살리플라틴 1 몰에 대하여, 0.5 내지 5 몰로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1 내지 2 몰로 포함될 수 있다.
상기 DCK는 경구흡수촉진제의 역할을 하며, 수용액 상태에서 양전하를 띠어 음전하를 띠는 친수성 활성성분과 이온결합에 의해 복합체를 형성함에 따라 친수성 약물 분자의 친유성을 증가시켜 유상으로의 분배를 향상시킬 수 있다. 데옥시콜산은 소수성 α부분과 친수성 β부분으로 구성된 양친매성 분자로, 세포 지질 이중층의 막 표면에 수직으로 결합하고 지질 매트릭스의 아실 사슬을 교란시켜 장관 세포막의 유연성 및 막에 대한 지용성 약물의 용해성을 증가시킴으로써 약물의 막 투과도를 향상시킬 수 있다. 또한 약물과 결합된 담즙산 유도체인 데옥시콜산은 장관막 표면에 존재하는 담즙산 재흡수 전달체에 의해 인식될 수 있으며, 이는 장관 점막 표면에서 약물의 높은 농도 구배를 유발하여 장관막에 대한 약물의 수동확산을 증가시킨다. 따라서 약물과 흡수촉진제의 이온결합 복합체의 담즙산 재흡수 전달체와의 선택적 상호작용에 의한 흡수증진 효과는 단순히 물리적 혼합에 의해 첨가되는 기존 흡수촉진제와 달리, 투여 후 위장관에서 흡수촉진제가 위장관 내 존재하는 유체에 의해 희석되어 그 작용이 감소하는 것을 최소화할 수 있기 때문에 최소의 사용으로 친수성 약물의 위장관 흡수율을 증가시킬 수 있다.
수용액 상태에서 형성된 이온결합 복합체를 고형의 분말 상태로 제조하기 위해 열풍건조, 동결건조, 분무건조 등 추가적인 건조과정을 거칠 수 있으며, 또한 건조 분말 형태의 이온결합 복합체의 수용액 상태에서의 신속한 재분산을 위해 이온결합 복합체 제조 시 응집방지제가 더 추가될 수 있다.
상기 응집방지제는 단당류, 다당류, 식이섬유, 검류, 계면활성제 또는 단백질 중에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 만니톨, 수크로오스, 락토오스, 글루코오스, 트레할로오스, 글리세롤, 프럭토오스, 말토오스, 덱스트란, 사이클로덱스트린, 글리신, 폴록사머, 폴리비닐피롤리돈, 알라닌 또는 라이신 중에서 선택되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 폴록사머, 폴리비닐피롤리돈, 사이클로덱스트린, 락토오스 또는 만니톨 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 상기 응집방지제는 옥살리플라틴 1 중량부에 대하여, 0.1 내지 100 중량부로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10 중량부로 포함될 수 있다.
상기 w/o 1차 나노 에멀젼은 내부 수상에 이온결합 복합체와 병용 투여하여 항암 시너지 효과를 나타낼 수 있는 친수성 활성성분을 더 포함할 수 있으며, 상기 친수성 활성성분은 5-플루오로우라실 (5-FU) 또는 류코보린 중에서 선택될 수 있다. 친수성 활성성분을 나노 에멀젼 제제에 포함시킴으로써 약물의 위장관 흡수율을 증진시켜 경구 생체이용률을 향상시킬 수 있다.
상기 w/o 1차 나노 에멀젼 제조 시 사용하는 1차 오일상은 실리콘 오일, 에스테르계 오일, 하이드로카본계 오일, 프로필렌 글리콜 모노카프릴레이트 (Capryol 90), 프로필렌 글리콜 디카프릴로카프레이트 (Labrafac PG), 올레오일 마크로골-6 글리세리드 (Labrafil M1944 CS), 라우로일 마크로골-6 글리세리드 (Labrafil M2130 CS), 리놀레오일 마크로골-6 글리세리드 (Labrafil M2125 CS), 중쇄 트리글리세리드 (Labrafac), 올레인산, 스테아르산, 글리세릴 베헤네히트 (Compritol 888), 글리세롤 모노스테아레이트 및 피마자유로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 1종 이상인 것이 바람직하다.
상기 w/o/w 2차 나노 에멀젼 내 w/o 1차 나노 에멀젼 (오일상)은 조성물 총 중량에 대하여, 1 내지 40 중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10 내지 30 중량%로 포함될 수 있다. 상기 w/o 1차 나노 에멀젼 (오일상)의 함량이 1 중량% 미만이면 내부 수상에 약물을 용해시킬 수 없으며 30 중량%를 초과하면 나노 에멀젼의 입자가 커져 유화 안정도가 떨어질 수 있다. 이때 w/o 1차 나노 에멀젼 (오일상)의 함량은 에멀젼 안정화제를 포함하지 않으며, 2차 외부 수상을 포함한 w/o/w 2차 나노 에멀젼 총 중량 중 w/o 1차 나노 에멀젼 (오일상)의 총량을 의미한다.
상기 (d) 단계에서 w/o/w 2차 나노 에멀젼은 오일상에 이온결합 복합체의 약리학적 치료 효능을 향상시킬 수 있는 지용성 활성성분을 더 포함할 수 있으며, 상기 지용성 활성성분은 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (docetaxel), 독소루비신 (doxorubicin)과 같은 난용성 항암제와 커큐민, 쿼르세틴 또는 이들 활성성분을 함유하는 천연 추출물 및 이들의 혼합물일 수 있다. 지용성 활성성분은 나노 에멀젼 제제의 오일상에 포함됨으로써 활성성분을 가용화시켜 위장관 흡수율을 증진킴에 따라 경구 생체이용률과 약리학적 활성을 향상시킬 수 있다.
상기 1차 및 2차 계면활성제는 이온결합 복합체가 분산된 내부 수상이 오일상에 분산될 수 있도록 하며, w/o 1차 나노 에멀젼이 w/o/w 2차 나노 에멀젼의 외부 수상에 잘 분산될 수 있도록 한다. 상기 1차 및 2차 계면활성제는 서로 독립적으로 폴록사머 (poloxamer), 카프릴로카프릴 마크로골-8 글리세리드 (Labrasol), 크레모포어 (Cremophor), 글리세롤 모노카프릴로카프레이트 (Capmul MCM), 라우로일 마크로골-32 글리세리드 (Gelucire 44/14), 솔루트롤 (Solutrol), 폴리솔베이트 (Tween) 및 소르비탄 모노라우레이트 (Span)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 1종 이상인 것이 바람직하다.
상기 1차 및 2차 보조 계면활성제는 이온결합 복합체가 분산된 내부 수상이 계면활성제에 의해 오일상에 분산될 수 있도록 표면에너지를 감소시키는 역할을 하며, w/o 1차 나노 에멀젼이 계면활성제에 의해 w/o/w 2차 나노 에멀젼의 외부 수상에 잘 분산될 수 있도록 한다. 상기 1차 및 2차 보조 계면활성제는 서로 독립적으로 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (Transcutol HP), 폴리솔베이트, 폴리에틸렌글리콜, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 에탄올 및 이소프로판올로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 1종 이상인 것이 바람직하다.
상기 1차 계면활성제와 1차 보조 계면활성제의 혼합물 및 2차 계면활성제와 2차 보조 계면활성제의 혼합물은 조성물 총 중량에 대하여, 5 내지 90 중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 20 내지 80 중량%로 포함될 수 있다. 상기 함량이 20 중량% 미만이면 에멀젼의 안정도가 떨어질 수 있으며 80 중량%를 초과하면 위장관 점막에 자극을 유발할 수 있다. 이때 1차 계면활성제와 1차 보조 계면활성제의 혼합물 및 2차 계면활성제와 2차 보조 계면활성제의 혼합물의 함량은 2차 외부 수상을 포함한 w/o/w 2차 나노 에멀젼 총 중량 중 1차 및 2차 계면활성제와 1차 및 2차 보조 계면활성제의 총량을 의미한다.
또한 상기 1차 및 2차 보조 계면활성제는 각각 상기 1차 및 2차 계면활성제와 혼합하여 사용되며, 각각 1차 및 2차 계면활성제에 대하여 서로 독립적으로 1:0.1 내지 1:10 중량비로 혼합되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1:0.5 내지 1:2 중량비로 혼합될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물을 포함한다.
본 발명에 의한 옥살리플라틴과 담즙산 유도체의 이온결합 복합체의 약물전달체로 w/o/w 다중 유화 나노 에멀젼 형태를 이용할 수 있다. 이 시스템 내 오일상은 위장관 내에서 이온결합 복합체를 보호하고, 흡수촉진제의 희석 효과를 최소화할 뿐만 아니라 복용 후 위장관 내에서 양친매성인 이온결합 복합체의 높은 분산성을 가능하게 한다. 또한 다중 유화 나노 에멀젼은 위장관 내에서 장관막의 구조와 유동성을 변형시켜 약물의 흡수를 증진시키는 것으로 알려져 있다. 특히, 내부 수상에 담즙산 유도체와 이온결합을 형성할 수 없는 친수성 약물인 5-플루오로우라실을 함께 담지할 경우 약물의 장관막 투과도와 경구 생체이용률은 다중 유화 나노 에멀젼에 의해 향상될 수 있다.
또한, 다중 유화 나노 에멀젼에 사용되는 계면활성제인 Labrasol과 Cremophor EL은 각각 1차 내부 수상을 오일상에 분산시키거나 w/o 1차 나노 에멀젼을 w/o/w 2차 나노 에멀젼의 외부 수상에 분산시키기 위해 사용될 수 있다. Labrasol은 F-액틴 (filamentous actin)과 ZO-1 (zonula occludens-1)과 상호작용하여 소장 상피세포 간 밀착연접 (tight junction)을 풀 수 있는 것으로 알려져 있으며, Cremophor EL의 경우 세포막의 유동성을 증가시킬 뿐만 아니라 밀착연접을 느슨하게 하여 흡수를 촉진시킬 수 있음이 확인되었다. 따라서 소장 상피세포 간 결합의 감소를 유도시키는 계면활성제의 적용으로 세포 사이 경로를 통해 친수성 활성성분인 5-FU의 막투과도가 증가될 수 있다. 또한 Cremophor EL은 P-gp의 소수성 영역과 결합할 수 있으며, 이로 인해 P-gp의 형태 변화가 초래되어 약물의 장관 내로의 배출을 감소시켜 5-FU와 같이 P-gp 매게 배출되는 약물의 제한적인 위장관 흡수율이 향상될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 담즙산 유도체 제조
경구흡수촉진제인 담즙산 유도체는 데옥시콜산에 양전하를 띠는 라이신을 화학적으로 결합시켜 제조하였다.
데옥시콜산 2.6 g을 ethyl chloroformate 6.4 mL, N-methylmorpholine 7.4 mL 및 tetrahydrofuran (THF) 800 mL의 혼합액에 용해한 후 2.7% (w/v) H-Lys(Boc)-OMe·HCl의 N-methylmorpholine 용액을 첨가한 뒤 2시간 동안 환류시켰다. 이후 상온에서 밤새 교반한 뒤 침전물을 여과하고 용매를 증발시켜 건조하였다. 얻어진 침전물을 클로로포름과 메탄올의 혼합액을 이용하여 컬럼을 통과시켜 Lys(Boc)DOCA를 분리하였다. 얻어진 Lys(Boc)DOCA를 다시 냉각수조 (ice bath)에서 에틸클로라이드와 메탄올의 혼합액에 용해한 후 용매를 완전히 제거한 다음 잔여물을 정제수에 용해한 뒤 클로로포름으로 세척하였다. 수용액층을 회수한 후 동결건조하여 분말형태의 데옥시콜산-라이신 유도체 (DCK)를 얻었다.
실시예 2: OXA / DCK 이온결합 복합체 제조
중탄산나트륨으로 pH 7.0으로 맞춘 정제수에 옥살리플라틴 및 상기 실시예 1에서 제조한 DCK를 각각 용해하였다. 상기 옥살리플라틴 수용액을 교반하면서, 옥살리플라틴:DCK의 몰 비율이 1:2가 되도록 DCK 수용액을 서서히 첨가하여 이온결합 복합체를 형성하였다. 상기 혼합액을 원심분리한 후 -70℃에서 동결건조하여 분말상태의 OXA/DCK 이온결합 복합체를 제조하였다.
실시예 3: OXA/DCK 이온결합 복합체 및 5- FU을 포함하는 w/o 1차 나노 에멀젼 제조
w/o/w 다중 유화 나노 에멀젼을 제조하기 위해 2단계의 자발적 다중 유화 방법을 이용하였으며, 1단계는 하기와 같다.
w/o 1차 나노 에멀젼은 1차 오일상 Capryol 90, 1차 계면활성제 Labrasol과 1차 보조 계면활성제 Transcutol HP의 혼합물 (Smix,1) 및 수상으로 정제수를 사용하여 오일 적정법에 의해 제조하였다.
w/o 1차 나노 에멀젼을 육안으로 관찰 시 투명한 액상이 얻어지는 영역을 유사 3상 다이어그램으로 확인하였으며, Smix,1의 혼합 비율 (2:1, 1:1, 1:2)에 따른 w/o 1차 나노 에멀젼 영역의 유사 3상 다이어그램을 도 1에 나타내었다. 상기 영역으로부터 가장 작은 크기의 내부 수상 액적이 형성되고 내부 수상 함량이 최대인 조성을 최적의 w/o 1차 나노 에멀젼 조성으로 선정하였다: 21.4% 수상, 50.0% 1차 계면활성제와 1차 보조 계면활성제 혼합물 (Smix,1; Labrasol:Transcutol HP=1:2(w/w)), 28.6% 오일상.
도 1에 나타낸 w/o 1차 나노 에멀젼의 유사 3상 다이어그램은 Smix,1의 비율이 2:1, 1:1 및 1:2인 조건에서 오일 Capryol 90, 1차 계면활성제 Labrasol 및 1차 보조 계면활성제 Transcutol HP를 포함한 w/o 시스템을 나타낸다. 1차 보조 계면활성제의 양을 1차 계면활성제의 양보다 상대적으로 적게 첨가한 경우, 예를 들어, Smix,1 2:1일 경우 w/o 1차 나노 에멀젼의 면적은 Smix,1 1:1일 때보다 작으며, 이는 Smix,1에 의한 오일상의 용해도가 상대적으로 낮음을 의미한다. Smix,1 2:1을 42% 첨가했을 때 오일상에 분산될 수 있는 최대 수상의 조성은 13%로 확인된 반면, Smix,1에서 보조 계면활성제의 비율을 1:2로 증가시킨 Smix,1 1:2에서 w/o 1차 나노 에멀젼이 형성되는 영역은 Smix,1 1:1과 비교하여 내부 수상의 양이 증가하는 쪽으로 이동했으며, 대략 50% Smix,1 1:2의 오일상에 분산될 수 있는 수상의 조성은 24%였다.
그러나 Smix,1에서 1차 보조 계면활성제인 Transcutol HP의 비율을 1차 계면활성제 대비 더욱 증가시키면 오히려 w/o 1차 나노 에멀젼 형성 영역이 감소하였다. 이는 Transcutol HP에 의해 액정이 형성되었으며, 주어진 양의 Labrasol에 의해 안정화되지 않았음을 의미한다. 이와 같은 결과는 나노 에멀젼 제형의 Gibbs 자유 에너지가 1차 계면활성제 및 1차 보조 계면활성제가 w/o 계면에서 수동적으로 계면장력을 감소시키는 정도와 계면의 파괴 엔트로피의 변화에 의존함을 의미한다.
상기 Smix,1 1:2로 제조한 나노 에멀젼 영역에서 몇 가지 조성을 선정하여 에멀젼 내 수상 액적 직경과 분산도 (PDI), 에멀젼 내 수상의 함량 및 약물의 인공장관막 투과도를 측정한 결과로부터 최적의 w/o 1차 나노 에멀젼 조성을 결정하였다: 21.4% 수상 (23.36% OXA 또는 67.52% OXA/DCK 이온결합 복합체와 23.36% 5-FU), 50% Labrasol:Transcutol HP의 1:2(w/w) 혼합물 및 28.6% Capryol 90.
실시예 4: OXA / DCK 이온결합 복합체 및 5-FU을 포함하는 w/o/w 2차 나노 에멀젼 제조
w/o/w 2차 나노 에멀젼은 w/o 1차 나노 에멀젼을 오일상으로 하고, Cremophor EL와 Transcutol HP의 혼합물을 2차 계면활성제와 2차 보조 계면활성제의 혼합물 (Smix,2)로 하여 수상에 오일상을 적정하는 방법을 통해 제조하였다.
23.36% OXA 또는 67.52% OXA/DCK 이온결합 복합체와 23.36% 5-FU를 수상에 분산시킨 후 w/o 1차 나노 에멀젼을 제조하였다. 또한 Smix,2를 2:1, 1:1, 1:2 비율로 혼합한 혼합물을 각각 상기 제조한 w/o 1차 나노 에멀젼에 1:9 내지 9:1의 중량비로 혼합하였다. 각각의 혼합물에 정제수를 서서히 첨가하여 최종 w/o/w 2차 나노 에멀젼을 제조하였으며, 각 비율의 Smix,2에 대한 유사 3상 다이어그램을 도 2에 나타내었다.
w/o/w 2차 나노 에멀젼 형성 영역은 2차 계면활성제의 함량이 증가함에 따라 상대적으로 증가하였다. Smix,2 1:1이 Smix,2 2:1보다 나노 에멀젼 영역이 증가하였으며, 29% Smix,2 1:1에서 외부 수상에 분산될 수 있는 w/o 1차 나노 에멀젼의 최대 조성은 35%로 확인되었다. 반면, 보조 계면활성제의 혼합 비율을 계면활성제에 비해 증가시킨 Smix,2 1:2의 경우, Smix,2 1:1과 비교하여 나노 에멀젼 영역이 감소하였으며, 47% Smix,2 1:2에서 분산된 w/o 1차 나노 에멀젼의 최대 조성은 23%로 확인되었다. 이로써 2차 보조 계면활성제의 비율이 2차 계면활성제에 비해 증가한 경우 나노 에멀젼의 형성 영역이 감소함을 확인할 수 있었다.
실시예 5: OXA / DCK 이온결합 복합체 형성 확인
옥살리플라틴 (OXA)과 데옥시콜산-라이신 유도체 (DCK) 사이의 이온결합 복합체 형성을 확인하기 위해 순수 OXA, DCK, OXA와 DCK의 물리적 혼합물 및 OXA/DCK 이온결합 복합체를 분말 X-선 회절분석기 (PXRD)와 시차주사열량계 (DSC)를 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
PXRD 스펙트럼의 2θ 범위에 걸쳐 순수 OXA은 11.95°, 15.77°, 17.92°, 19.57°, 22.25°, 23.95°, 25.42°, 26.09°, 31.57°, 31.61°, 33.15°, 36.76°에서 결정성 회절 피크를 나타냈으며, OXA와 DCK의 물리적 혼합물에서도 OXA의 특징적인 결정성 회절 피크가 관찰되었다. 이는 OXA가 DCK와의 혼합물에서 결정 형태로 존재함을 나타낸다. 반면, OXA/DCK 이온결합 복합체에서는 OXA의 결정성을 나타내는 날카로운 회절 피크가 소실된 것을 확인할 수 있었다.
DSC 열분석에서 순수 OXA의 흡열 피크는 292℃에서 관찰되었으나 OXA/DCK 이온결합 복합체에서는 OXA의 흡열 피크가 사라짐을 확인하였다. 따라서 OXA은 DCK와 분자 수준으로 분산되어 이온결합에 의한 복합체를 형성한 후 무정형 상태로 복합체 내에 존재함을 알 수 있었다.
실시예 6: OXA / DCK 이온결합 복합체 및 5-FU을 포함하는 w/o/w 2차 나노 에 멀젼의 물리화학적 성질 평가
도 2에 나타낸 유사 3상 다이어그램으로부터 투명한 나노 에멀젼 영역을 확인한 후 이 영역으로부터 선택된 8개의 조성을 대상으로 물리화학적 성질을 평가하였다. OXA/DCK 이온결합 복합체 및 5-FU을 포함하는 w/o/w 2차 나노 에멀젼에 분산된 w/o 1차 나노 에멀젼의 액적 직경, 분산도 (PDI) 및 표면전하 (제타 전위)를 dynamic laser light scattering analyzer (Zetasizer Nano ZS90; Malvern Instruments, UK)로 측정하고, 액적 형태를 transmission electron microscopy (JEM-200; JEOL, Tokyo, Japan)로 관찰하였으며, 이를 하기 표 1 및 도 4에 나타내었다.
다중 산란 효과를 최소화하기 위하여 각 시료를 정제수에 1:20의 비율로 희석하여 1분 동안 분산시킨 후 25℃에서 동적 광산란 측정장치 (dynamic laser light scattering analyzer)로 측정하였다.
또한 각 시료를 정제수로 100배 희석한 후 구리 격자판에 상기 희석액을 한 방울 떨어뜨리고, 초과액을 종이 필터로 제거한 후 2% phosphotungstic acid 수용액을 첨가하여 염색한 뒤 초과액은 종이 필터로 제거하여 transmission electron microscopy(TEM)를 측정하였다.
하기 표 1을 참고하면, 모든 조성에서 w/o/w 2차 나노 에멀젼 내 w/o 1차 나노 에멀젼 액적의 크기는 PDI 값이 0.59보나 낮은 균일한 분포를 나타냈으며, 액적의 크기는 13.5 nm 내지 232 nm 범위였다. w/o/w 2차 나노 에멀젼 내 분산된 w/o 1차 나노 에멀젼의 조성이 최대인 조성 A에서 액적의 크기가 최대로 평가되었으며, 각각의 Smix,2 비율에서 오일상인 w/o 1차 나노 에멀젼의 조성이 10%에서 30%로 증가함에 따라 분산된 액적의 크기가 급격히 증가함을 알 수 있었다. 즉, 조성 A와 조성 C에서 액적의 크기는 각각 Smix,2 2:1에서 61.4±4.06 nm 및 18.1±0.31 nm, Smix,2 1:1에서 146±1.17 nm 및 17.5±0.15 nm, Smix,2 1:2에서 232±5.06 nm 및 19.0±1.06 nm로 평가되었다. 이와 같은 결과는 w/o/w 2차 나노 에멀젼 내 w/o 1차 나노 에멀젼 액적의 크기가 제형 내 w/o 1차 나노 에멀젼 (오일상)의 농도에 비례하여 증가함을 나타낸다. w/o 1차 나노 에멀젼 (오일상)의 조성이 20% 또는 30%인 경우 2차 계면활성제의 농도가 증가함에 따라 액적의 크기가 감소되었다. 따라서 Smix,2 1:2이며 30%의 w/o 1차 나노 에멀젼 (오일상)을 포함한 조성 A에서 액적의 크기가 최대가 됨을 알 수 있다. 그러나 w/o 1차 나노 에멀젼 (오일상)을 10% 이하로 함유하는 조성의 경우 액적의 크기는 Smix,2 비율과 이의 함량에 관계없이 20 nm 이하로 평가되었다. Smix,2 1:1로 제조한 w/o/w 2차 나노 에멀젼 중 조성 E에서 액적의 크기와 분산도 (PDI)는 각각 20.3±0.22 nm 및 0.18±0.01로 평가되었으며, 조성 H는 다른 조성에 비해 가장 작은 크기의 액적 (13.5±0.14 nm)으로 분산됨을 알 수 있었다.
모든 w/o/w 2차 나노 에멀젼의 표면전하 (제타 전위) 값은 -4.65 mV 내지 0.14 mV (중성)의 범위로 평가되었으며, 이는 w/o 1차 나노 에멀젼의 오일층 지방산과 에스테르가 w/o/w 2차 나노 에멀젼의 2차 계면활성제 및 2차 보조 계면활성제에 의해 둘러싸여 분산되었음을 의미한다.
w/o/w 2차 나노
에멀젼 조성 (%)		 Crempmophor EL : Transcutol HP (Smix,2)
2:1 1:1 1:2
w/o
1차
나노
에멀젼		 Smix,2 정제수 액적
직경
(nm)		 분산도 제타
전위
(mV)		 액적
직경
(nm)		 분산도 제타
전위
(mV)		 액적
직경
(nm)		 분산도 제타
전위
(mV)
A 30 30 40 61.4
(4.06)		 0.59
(0.01)		 -2.03
(0.15)		 146
(1.17)		 0.30
(0.01)		 -1.59
(0.12)		 232
(5.06)		 0.51
(0.04)		 -0.80 (0.05)
B 20 30 50 13.5
(0.11)		 0.03
(0.00)		 -1.01
(0.13)		 22.6
(0.05)		 0.20
(0.00)		 -3.48
(1.58)		 118
(1.97)		 0.31
(0.01)		 -1.10 (0.32)
C 10 20 70 18.1
(0.31)		 0.20
(0.01)		 -0.27
(0.20)		 17.5
(0.15)		 0.18
(0.01)		 0.07
(0.52)		 19.0
(1.06)		 0.17
(0.02)		 -0.42 (0.29)
D 10 25 65 17.7
(1.08)		 0.08
(0.01)		 -0.88
(0.24)		 16.8
(0.29)		 0.16
(0.01)		 -0.04
(0.34)		 19.3
(0.44)		 0.16
(0.07)		 0.04 (0.35)
E 10 30 60 14.5
(0.11)		 0.16
(0.01)		 0.14
(0.58)		 20.3
(0.22)		 0.18
(0.01)		 -4.65
(1.68)		 18.3
(0.60)		 0.20
(0.01)		 -0.13 (0.30)
F 10 35 55 17.5
(0.19)		 0.20
(0.00)		 -0.86
(0.40)		 13.6
(0.04)		 0.04
(0.01)		 -0.04
(0.34)		 15.0
(0.58)		 0.08
(0.05)		 -0.53 (0.09)
G 10 40 50 18.0
(0.21)		 0.14
(0.01)		 -1.16
(0.25)		 20.0
(0.20)		 0.20
(0.00)		 -1.59
(0.12)		 15.0
(0.58)		 0.04
(0.01)		 0.14 (0.49)
H 10 60 30 14.1
(0.06)		 0.14
(0.01)		 -1.01
(0.58)		 13.5
(0.14)		 0.05
(0.01)		 -4.36
(1.13)		 14.0
(0.16)		 0.03
(0.01)		 -0.11 (0.34)
실시예 7: OXA / DCK 이온결합 복합체 및 5-FU을 포함하는 w/o/w 2차 나노 에멀젼의 인공장관막 투과도 측정
상기 표 1의 조성으로 제조한 OXA, OXA/DCK 이온결합 복합체 또는 5-FU를 각각 함유한 w/o/w 2차 나노 에멀젼의 막투과성을 인공장관막 (PAMPA; BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 이용하여 평가하고, 대조군으로 OXA, OXA/DCK 이온결합 복합체 및 5-FU 수용액을 사용하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
각각의 시료를 125.8 μM OXA, 125.8 μM OXA/DCK 이온결합 복합체, 384.4 μM 5-FU 농도가 되도록 인산염완충액 (PBS, pH 6.8)으로 희석한 후, 200 μL씩 PAMPA plate의 각 well의 공여체에 첨가하고, 각각의 수용체에 300 μL의 인산염완충액 (PBS, pH 6.8)을 첨가한 후 공여체와 수용체를 결합시켰다. 실온에서 5시간 동안 방치한 후 PAMPA plate 각 well의 공여체와 수용체로부터 시료를 회수하여 투과한 약물의 농도를 다음과 같이 측정하였다.
OXA 또는 OXA/DCK 이온결합 복합체의 경우 40℃에서 C18 컬럼 (4.6×250 mm, 5 μm, 100 Å; 20 μL 주입)을 사용하여 HPLC로 분석하였으며, 이동상인 물 (pH 3.0, 인산으로 조정)과 아세트니트릴의 99:1(v/v) 혼합액을 0.8 mL/min 유속으로 흘려 분석하였다. 또한 210 nm에서 UV 검출기를 사용하여 측정하였다.
5-FU의 경우 C18 컬럼 (4.6×250 mm, 5 μm, 100 Å; 20 μL 주입)을 장착한 HPLC 시스템에 주입하고 정제수 (pH 3.2, 인산으로 조정)를 이동상으로 하여 0.8 mL/min 유속으로 흘려 분석하였으며, UV 검출은 260 nm에서 수행하였다.
각 약물의 유효 투과도(P e)는 하기 식을 사용하여 계산하였다.
P e = -ln[1-CA(t)/Cequilibrium]/[A×(1/VD+1/VA)×t]
( P e : 투과도 (cm/s); A: 유효 필터 면적(f×0.3 cm2; f: 필터의 표면상 기공 (f=0.76)); VD: 공여체 부피 (0.2 mL); VA: 수용체 부피 (0.3 mL); t: 투과시간 (초); CA(t): 시간 t에서 수용체에서의 약물 농도; Cequilibrium: [CD(t)×VD+CA(t)×VA]/(VD+VA); CD(t): 시간 t에서 공여체의 잔존 약물 농도)
그 결과, OXA, OXA/DCK 이온결합 복합체 및 5-FU의 인공장관막을 통한 투과도는 전반적으로 w/o/w 다중 나노 에멀젼의 내상에 포함시킨 후 유의하게 증가하였다.
OXA의 경우 막투과도는 2차 계면활성제와 2차 보조 계면활성제 혼합물의 비율 (Smix,2)과 오일상 (1차 w/o 나노 에멀젼)에 대한 Smix,2의 비율에 의존하였다. 조성 H를 제외하고 Smix,2 1:1로 제조한 OXA w/o/w 다중 나노 에멀젼의 투과도는 동일 조성에서 Smix,2 2:1 및 Smix,2 1:2 w/o/w 다중 나노 에멀젼보다 상대적으로 증가하였다. 10% 오일상을 함유하는 w/o/w 다중 나노 에멀젼에서 Smix,2 1:1의 오일상에 대한 중량비를 2에서 6까지 증가시킬 때 (조성 C 내지 H), OXA의 최대 막투과도는 조성 E (오일상:Smix,2 1:1, 1:3)에서 관찰되었고, 이때 OXA의 막투과도 (4.99±0.59 (×10-6cm/s))는 OXA 수용액의 투과도 (0.54±0.12 (×10-6cm/s))보다 약 9.24배 증가했다.
그러나 OXA/DCK 이온결합 복합체의 투과성은 여전히 OXA 수용액과 OXA w/o/w 다중 나노 에멀젼 조성 E (Smix,2 1:1)보다 각각 37.4배 및 4.02배 높았다. 계면활성제의 비율이 보조 계면활성제보다 큰 Smix,2 2:1에서 OXA/DCK 이온결합 복합체의 인공장관막 투과도는 오일상 (1차 w/o 나노 에멀젼)의 함량이 높거나 낮은 나노 에멀젼의 투과도보다 상대적으로 높았다. 반면, 동일한 조성으로 Smix,2 1:2를 혼합시킨 OXA/DCK 이온결합 복합체의 막투과율은 크게 증가하지 않았다. w/o/w 다중 나노 에멀젼 E (Smix,2 1:1)로부터 OXA/DCK 이온결합 복합체의 인공장관막 투과도는 최대를 나타냈으며, 그 투과도 값은 수용액 상태 및 w/o/w 다중 나노 에멀젼 A (Smix,2 2:1)보다 각각 2.85배 및 1.46배 향상되었다. 또한, 조성 E (Smix,2 1:1)에서의 OXA/DCK 이온결합 복합체 막투과도 (57.2±5.23 (×10-6, cm/s))는 OXA 수용액 (0.54±0.12 (×10-6, cm/s)) 및 조성 E (4.99±0.59 (×10-6, cm/s))로부터의 OXA의 투과도보다 각각 107배 및 11.5배 향상되었다.
5-FU의 경우, 조성 C 내지 H로부터의 투과도는 오일상의 함량이 동일하고 액적의 크기가 유사하여 큰 차이를 나타내지 않았으며, 5-FU의 막투과도는 모든 Smix,2 비율에서 오일상의 양이 감소할수록 증가하였다. 조성 E (Smix,2 1:1)로부터 5-FU의 막투과도 (3.78±0.26 (×10-6, cm/s))는 5-FU 수용액 (1.27±0.46 (×10-6, cm/s))에 비해 3.05배 증가하였다.
실시예 8: OXA / DCK 이온결합 복합체 및 5-FU을 포함하는 w/o/w 2차 나노 에 멀젼의 in vitro 장관 세포막 투과도 측정
상기 표 1의 조성으로 제조한 OXA, OXA/DCK 이온결합 복합체 또는 5-FU를 각각 함유한 w/o/w 2차 나노 에멀젼의 막투과성을 Caco-2 세포 단층막을 이용하여 평가하고, 대조군으로 OXA, OXA/DCK 이온결합 복합체 및 5-FU 수용액을 사용하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
Caco-2 세포를 12-well Transwell® (pore size: 0.4 μm, 표면적: 1.12 cm2; Corning, NY, USA)의 각 well 당 3×105 cells을 처리하였다. 10% 소태아혈청 (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific)과 1% penicillin/streptomycin (Gibco)을 함유하는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Lonza, Basel, Switzerland) 배지는 48시간 마다 21일 내지 29일 동안 교체되었으며, 350 Ω·cm2 이상의 transepithelial 전기저항 (TEER)을 갖는 Caco-2 세포막을 in vitro 장관세포막 투과도 시험에 사용하였다.
먼저, 배양액을 제거한 후 37℃에서 20분 동안 Hanks’balanced salt solution (HBSS) 0.5 mL로 배양한 후 HBSS를 제거한 다음, HBSS로 125.8 μM OXA, 125.8 μM OXA/DCK 이온결합 복합체, 384.4 μM 5-FU로 희석한 각 시료 0.5 mL와 1.5 mL HBSS를 각각의 apical compartment와 basolateral compartment에 첨가한 후 37℃에서 배양하였다. 시료를 처리한 후 0.5, 1, 2, 3, 4, 5시간째 각 well의 basolateral compartment로부터 100 μL의 시료를 취해 멤브레인 필터로 여과한 후 상기 실시예 7과 동일한 HPLC 시스템 및 UV 검출기를 사용하여 장관 세포막을 투과한 OXA, OXA/DCK 이온결합 복합체 및 5-FU의 농도를 측정하였다. 또한 OXA, OXA/DCK 이온결합 복합체 및 5-FU의 겉보기 투과계수 (Papp)는 하기 식을 통해 산출하였다.
Papp = dQ/dt×1/(A×C0)
(dQ/dt: 단위시간 당 basolateral compartment로 투과된 약물의 중량 (μmol/s), C0: apical compartment에서 OXA, OXA/DCK 이온결합 복합체 또는 5-FU의 초기농도 (μmol/mL), A: 투과면적 (cm2))
하기 표 2를 참고하면, OXA을 나노 에멀젼 E (Smix,2 1:1)에 포함시킨 결과 OXA의 P app 는 2.50±1.96 (×10-6, cm/s)에서 7.08±1.42 (×10-6, cm/s)로 향상되었다.
또한, OXA의 투과도는 DCK와 이온결합 복합체를 형성시킴으로써 OXA 수용액 대비 상당히 증가하였다. OXA/DCK 이온결합 복합체를 나노 에멀젼 E 제형 내 포함시켰을 때 (12.0±1.91 ×10-6, cm/s) OXA/DCK 이온결합 복합체의 Papp는 OXA (5.63±3.03 ×10-6, cm/s) 및 OXA/DCK 이온결합 복합체 (2.50±1.96 ×10-6, cm/s)에 비해 각각 2.13배 및 4.80배 향상되었다.
5-FU의 막투과도 역시 5-FU를 나노 에멀젼에 포함시킨 후 상당히 증가하였으며, 조성 E (Smix,2 1:1)로부터 5-FU의 투과도 (14.9±3.08 ×10-6, cm/s)는 5-FU 수용액 (3.46±1.22 ×10-6, cm/s) 대비 4.30배 증가하였다.
또한 나노 에멀젼 제형으로부터 OXA, OXA/DCK 이온결합 복합체 및 5-FU의 Caco-2 세포 단층막에 대한 투과도는 오일상과 Smix,2의 중량 비율을 1:1에서 1:3으로 증가시킴에 따라 증가하는 경향을 보이다가 1:6 비율에서 급격히 감소하였다.
Smix,2 1:1/오일상
(w/w)		 겉보기 투과계수 (P app ×10- 6,cm/s)
OXA OXA/DCK 5-FU
Solution - 2.50±1.96 5.63±1.03 3.46±1.22
C 2 7.54±1.40 11.6±1.13 5.90±2.46
E 3 7.08±1.42 12.0±1.91 14.9±3.08
F 3.5 7.40±2.02 10.5±0.81 10.6±1.77
G 4 2.10±0.61 10.1±0.73 8.15±3.90
H 6 1.77±0.37 8.93±1.32 7.49±0.36
실시예 9: OXA / DCK 이온결합 복합체 및 5-FU을 포함하는 w/o/w 2차 나노 에멀젼의 약물방출 시험
용출 시험은 미국약전 용출시험법 제1법 (회전검체통법)으로 100 rpm, 37±0.2℃, 0.1 N HCl 수용액 (pH 1.2) 배지 또는 인산염완충액 (pH 6.8) 500 mL 조건에서 실시하였다.
OXA 분말 10 mg 또는 5-FU 분말 10 mg를 함유하는 OXA/DCK 이온결합 복합체 분말 38.8 mg (OXA 10 mg에 상응) 또는 이들 약물을 포함하는 w/o/Smix,2 (2차 외부수상을 제외한 나노 에멀젼 제형 C, E, F, G 및 H) 나노 에멀젼 800 mg을 00호 경질 젤라틴 캡슐에 충전한 후 용출 시험을 실시하였다. 용출 시험 시작 후 15, 30, 45, 60, 90 및 120분에 각 용출시험액을 1 mL씩 취하고 여과한 후 방출된 약물의 양을 상기 실시예 7과 동일한 HPLC 및 UV 검출 방법으로 분석하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6의 (A) 및 (B)에서 보는 바와 같이, pH 1.2의 조건에서 OXA 또는 OXA/DCK 이온결합 복합체의 90% 이상이 120분 이내에 나노 에멀젼으로부터 방출되었다. 그러나 나노 에멀젼 G 및 H로부터 OXA 또는 OXA/DCK 이온결합 복합체의 방출 속도는 분말 상태 및 다른 나노 에멀젼 조성과 비교하여 지연되었다. 반면, 도 6의 (C)에서 보는 바와 같이, 5-FU의 경우 모든 캡슐에서 15분 이내에 85% 이상의 용출율을 나타냈으며 pH 1.2에서 5-FU의 용출 속도는 나노 에멀젼의 조성에 크게 영향을 받지 않았다.
도 6의 (D) 및 (F)를 참고하면, pH 6.8 조건에서 OXA 및 5-FU는 나노 에멀젼으로부터 15분 이내 90% 이상 방출되었다. 분말 형태로 충전된 OXA/DCK 이온결합 복합체 캡슐은 제형 C를 제외하고 나노 에멀젼 제형보다 약물의 방출이 지연되었으며, 제형 C를 제외하고 나노 에멀젼으로부터 OXA/DCK 이온결합 복합체는 15분 이내 90%의 용출율을 나타내었다. 이러한 결과는 복합체 내 존재하는 DCK 분자들의 응집(aggregation)과 오일상에 대한 Smix,2의 낮은 조성비에 기인한 것으로 판단된다.
실시예 10: OXA / DCK 이온결합 복합체 및 5-FU을 포함하는 w/o/w 2차 나노 에멀젼의 in vivo 경구 흡수율 평가
담즙산 유도체와의 이온결합 복합체 형성 및 나노 에멀젼 제형으로 인한 OXA 및 5-FU의 경구 흡수 개선을 평가하기 위해 OXA 또는 OXA/DCK 이온결합 복합체와 5-FU를 포함하는 수용액 및 이를 포함하는 나노 에멀젼 제형 (상기 표 1의 조성 E, Smix,2 1:1)을 랫드에 경구투여하였다. 도 7, 하기 표 3 및 표 4는 랫드의 혈중약물농도-시간 프로파일과 OXA 및 5-FU의 약동학적 파라미터를 나타낸다.
랫드에 OXA (10 ㎎/㎏), OXA/DCK 이온결합 복합체 (OXA 10 mg/kg에 상응), 5-FU (20 mg/kg)를 수용액 상태로 각각 400 μL씩 경구투여하고, 마찬가지로 OXA (10㎎/㎏) 또는 OXA/DCK 이온결합 복합체 (OXA 10 mg/kg에 상응)와 5-FU (20 mg/kg)를 포함하는 나노 에멀젼 희석액을 400 μL씩 경구로 투여하였다. 또한 경구 생체이용률을 평가하기 위해 OXA (5㎎/㎏) 및 5-FU (5 ㎎/㎏) 수용액을 랫드에 각각 150 μL씩 꼬리 정맥에 주사하였다.
경구 및 정맥 투여 후 일정 시간 간격에서 랫드의 안와부위 모세혈관에서 200 μL의 혈액을 채취한 후 50 μL의 3.8% 구연산나트륨 수용액과 혼합한 뒤 원심분리하여 (2,500 ×g, 15분, 4℃) 혈장 시료를 채취한 후 분석 전까지 -70℃에서 냉동 보관하였다.
혈장 중 OXA의 농도는 분석하기 위해 채취한 혈장을 질산 5 mL로 희석 후 6시간 동안 100℃로 가열한 뒤 원자 흡수 분광법 (AAS)을 사용하여 백금 농도를 측정하여 추정하였다. 시료 측정 전, 샘플을 3% 질산 수용액 10 mL로 희석 한 다음 AAS 분석을 위해 노에 주입하였으며 GFS35 graphite furnace와 GFS35Z autosampler가 장착된 Thermo Scientific iCE 3500 AAS (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 측정하였다. Purging gas로 아르곤을 200 mL/min로 사용하였으며 시료의 주입량은 20 μL이었다. 백금 농도는 266 nm에서 Zeeman-based background corrector가 장착된 spectrometer로 측정하였다.
또한 5-FU의 혈장 농도를 측정하기 위해 100 μL의 표준액과 혈장 시료에 각각 20 μg/mL의 내부 표준 (IS, chlorouracil) 용액 50 μL와 포화 황산암모늄 용액 100 μL를 첨가한 후 1분간 혼합하였다. 희석된 혈장 시료를 2 mL의 프로판올과 디에틸에테르의 8:2 (v/v) 혼합 용매로 추출하였다. 혼합액을 10분 동안 2,500 ×g에서 원심분리하고 37℃ 질소 조건에서 증발시켜 유기용매 층을 수집하였다. 이후 건조 잔류물에 100 μL의 이동상 (pH 6.8 암모늄포스페이트 완충액과 메탄올의 98:2 (v/v) 혼합액)을 첨가하여 용해시킨 후 1 mL/min 유속에서 C8 컬럼 (4.6×250 mm, 5 μm)이 장착된 HPLC에 50 μL의 시료를 주입하고 260 nm에서 측정하였다.
그 결과, OXA의 경구 흡수율 역시 나노 에멀젼에 포함시킨 후 상당히 증가하였으며, Cmax와 AUClast는 각각 OXA 수용액 대비 1.66배 및 2.67배 증가하였다. 그러나 OXA의 경구 흡수율은 DCK와 이온결합 복합체 형성 후 더 증가했으며, OXA/DCK 이온결합 복합체의 Cmax와 AUClast 값은 OXA 수용액 대비 각각 306%와 540% 증가하였다.
또한 도 7에서 보는 바와 같이, OXA/DCK 이온결합 복합체를 포함하는 나노 에멀젼의 Cmax와 AUClast 값은 OXA/DCK 이온결합 복합체 수용액보다 각각 1.77배와 1.70배 증가하였으며, OXA 수용액 대비 5.41배 및 9.17배 향상되었다. 또한 하기 표 3을 참고하면, OXA/DCK 이온결합 복합체를 포함하는 나노 에멀젼 제제의 경구 생체이용률은 DCK와 이온결합에 의한 복합체 형성과 나노 에멀젼 형태로 제제화됨에 따라 단순 OXA 수용액의 경구 생체이용률보다 9.19배 증가하였다.
OXA OXA/DCK
Solution Solution Nanoemulsion Solution Nanoemulsion
투여경로 Intravenous Oral Oral Oral Oral
OXA 투여용량 (mg/kg) 5 10 10 10 10
Tmax(h) - 1.833±0.289 2.333±1.443 4.000±0.000 1.667±0.289
T1/2(h) 3.103±2.114 1.528±0.900 11.466±6.708 10.512±1.625 17.616±2.639
Cmax(μg/mL) 2.454±0.990 0.032±0.014 0.053±0.017 0.098±0.005 0.173±0.012
AUClast(μg·h/mL) 1.962±0.746 0.111±0.095 0.296±0.093 0.600±0.046 1.018±0.204
AUCinf(μg·h/mL) 2.537±1.312 0.170±0.061 0.924±0.621 1.755±0.333 4.198±0.876
Bioavailability(%) 100 2.824±2.428 7.543±2.359 15.290±1.182 25.951±5.190
{상기 표 3에서, Tmax: Cmax 도달 시간; T1/2: 혈장 농도 반감기; Cmax: 최대 혈장 농도; AUClast: 최종 측정 가능한 혈장 농도 측정 시간까지의 혈장 농도-시간 곡선하 면적; AUCinf: 무한대까지의 혈장 농도-시간 곡선하 면적}
하기 표 4에서 보는 바와 같이, 5-FU를 포함하는 나노 에멀젼의 Cmax는 0.164±0.044 μg/mL로 평가되었으며, 이는 5-FU 수용액의 Cmax 값 (0.092±0.008 μg/mL) 대비 1.78배 증가하였다. 또한 5-FU를 포함하는 나노 에멀젼의 AUClast값은 5-FU 수용액의 AUClast값 (0.242±0.058 μgh/mL)과 비교하여 1.39배 증가했으며 경구 생체이용률 역시 5-FU 수용액 대비 139% 향상되었다.
5-FU solution 5-FU solution 5-FU nanoemulsion
Administration Intravenous Oral Oral
5-FU dose(mg/kg) 5 20 20
Tmax(h) - 0.500±0.000 0.833±0.289
T1/2(h) 0.760±0.109 0.813±0.567 1.386±0.146
Cmax(μg/mL) 0.716±0.124 0.092±0.008 0.164±0.044
AUClast(μg·h/mL) 0.657±0.220 0.242±0.058 0.337±0.089
AUCinf(μg·h/mL) 0.670±0.221 0.287±0.096 0.360±0.091
Bioavailability(%) 100 9.218±2.198 12.808±3.403
{상기 표 4에서, Tmax: Cmax 도달 시간; T1/2: 혈장 농도 반감기; Cmax: 최대 혈장 농도; AUClast: 최종 측정 가능한 혈장 농도 측정 시간까지의 혈장 농도-시간 곡선하 면적; AUCinf: 무한대까지의 혈장 농도-시간 곡선하 면적}
실시예 11: OXA / DCK 이온결합 복합체 및 5-FU을 포함하는 w/o/w 2차 나노 에멀젼의 in vivo 암 성장억제 효능 평가
CT26 마우스 대장암 세포를 PBS (PH 7.4)에 1×106 cells/100 μL 농도로 분산시킨 후 BALB/c 마우스의 등 부위에 피하로 주입하였다. 14일 후 종양의 크기가 70-100 mm3일 때 무작위로 10마리씩 하기 5개 그룹으로 나누었다.
Control (무처치); OXA-S (10 ㎎/㎏ OXA 수용액, 1일 1회 경구투여); OXA/DCK-S (10 ㎎/㎏ OXA에 상응하는 OXA/DCK 이온결합 복합체 수용액, 1일 1회 경구투여); 5-FU-S (10 ㎎/㎏ 5-FU 수용액, 1일 1회 경구투여); OXA/DCK-5FU-NE (10 ㎎/㎏ OXA에 상응하는 OXA/DCK 이온결합 복합체와 10 ㎎/㎏ 5-FU를 포함하는 나노 에멀젼 조성 E (Smix,2 1:1), 1일 1회 경구투여);.
18일 동안, 마우스는 경구투여 전 4시간 동안 금식하였고, 투여 후 2시간 금식하였다. 3일 간격으로 종양의 크기를 측정한 후 종양의 부피를 하기 식으로 계산하였으며, 마우스의 체중도 측정하였다.
종양의 크기 = a2×b×0.52 (a=너비, b=길이)
투여 18일째 종양을 적출한 후 질량을 측정하였으며, 암 조직의 성장 저해 효능을 평가하기 위해 10% 포르말린 용액으로 고정시켰다. 적출한 암 조직 내 증식 세포 및 사멸 세포의 밀도를 평가하기 위해 TUNEL (fluorescent terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUPT nick end labeling) 및 PCNA (증식된 세포 핵 항원 염색) 염색을 실시하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 8 (A)에서 보는 바와 같이, 암 세포가 이식된 마우스에 OXA/DCK-S를 1일 1회 경구 투여한 경우 암 조직의 성장은 무처치 대조군 및 OXA-S군과 비교하여 각각 60.3% 및 21.4% 억제되었다. 5-FU-S 용액을 투여한 군 역시 대조군과 비교하여 암 조직의 성장이 57.9% 지연되었다. 또한, 5-FU 수용액을 경구로 투여한 군의 암 성장은 OXA/DCK 수용액을 경구 투여한 군과 비교하여 암 조직 성장 억제 효과에는 큰 차이가 없었다. 반면에 OXA/DCK-5FU-NE 그룹은 암 조직의 성장이 다른 그룹에 비해 최대로 억제되었다 (대조군 대비 73.9%, OXA-S 대비 48.5%, OXA/DCK-S 대비 34.4%, 5-FU-S 대비 38.1%). 18일 동안 약물 투여 후, OXA/DCK-5FU-NE 그룹에서 적출한 종양의 무게 역시 대조군, OXA-S, OXA/DCK-S, 5-FU-S에 비해 각각 43.0%, 26.0%, 11.6% 및 32.0% 감소하였으나 마우스 체중에는 큰 영향을 미치지 않았다 (도 8 (B) 및 (C)).
도 9를 참고하면, 지속적인 OXA/DCK-5-FU-NE 투여군은 대조군, OXA-S, OXA/DCK-S, 5-FU-S에 비해 증식 세포의 밀도가 현저히 감소했을 뿐 아니라 암 조직 내 사멸 세포도 증가하였음을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 OXA/DCK 이온결합 복합체와 5-FU를 포함하는 나노 에멀젼 제제의 경구 생체이용률 향상과 이들 약물의 암 성장억제 시너지 효과에 기인한 것으로 판단된다.
이상, 본 발명을 예시적으로 설명하였으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상과 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의해서 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (14)

  1. (a) 옥살리플라틴에 양전하를 띠는 Nα-deoxycholyl-L-lysyl-methylester (DCK)를 첨가하여 이온결합 복합체를 형성하는 단계;
    (b) 프로필렌 글리콜 모노카프릴레이트에 카프릴로카프릴 마크로골-8 글리세리드와 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르의 혼합물을 첨가하는 단계;
    (c) 상기 이온결합 복합체와 상기 (b) 단계의 혼합물을 혼합하여 수중유형 (water-in-oil, w/o) 나노 에멀젼을 제조하는 단계;
    (d) 상기 수중유형(w/o) 나노 에멀젼에 크레모포어와 디에틸렌 글리콜 모노 에틸 에테르의 혼합물을 첨가하여 수중유중수형 (water-in-oil-in-water, w/o/w) 나노 에멀젼을 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물의 제조방법
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 Nα-deoxycholyl-L-lysyl-methylester (DCK)는 옥살리플라틴 1 몰에 대하여, 0.5 내지 5 몰로 포함되는 것을 특징으로 하는 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물의 제조방법
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 수중유중수형 (water-in-oil-in-water, w/o/w) 나노 에멀젼 내 수중유형 (water-in-oil, w/o) 나노 에멀젼이 조성물 총 중량에 대하여, 1 내지 40 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물의 제조방법
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 카프릴로카프릴 마크로골-8 글리세리드와 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르의 혼합물 및 크레모포어와 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르의 혼합물은 조성물 총 중량에 대하여, 5 내지 90 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물의 제조방법
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르는 각각 카프릴로카프릴 마크로골-8 글리세리드 및 크레모포어에 대하여 서로 독립적으로 1:0.1 내지 1:10 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물의 제조방법
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 수중유형 (water-in-oil, w/o) 나노 에멀젼의 내부 수상에 5-플루오로우라실 (5-FU) 또는 류코보린 중에서 선택되는 친수성 활성성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 옥살리플라틴을 포함하는 경구용 약물전달 조성물의 제조방법
  13. 삭제
  14. 삭제
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