KR101885994B1

KR101885994B1 - 발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법

Info

Publication number: KR101885994B1
Application number: KR1020170032193A
Authority: KR
Inventors: 김수한
Original assignee: 산청군
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2018-08-06

Abstract

본 발명은 발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 홍화 추출액을 미생물 발효하여 홍화 내 아케세틴 성분 및 폴리페놀 성분이 증가된 샴푸을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법은, 발효균주를 28℃ 온도에서 3일 동안 MRS 배지에서 배양하는 제 1단계; 홍화씨를 수세하는 제 2단계; 상기 수세한 홍화씨를 전처리하는 제 3단계; 상기 전처리한 홍화씨 1중량부에 대하여 증류수 15 내지 20중량부를 혼합하여 80 내지 95℃ 온도에서 열수추출하여 홍화 추출액을 제조하는 제 4단계; 상기 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 발효균주를 0.001중량부 접종하는 제 5단계; 상기 접종된 홍화 추출액을 발효시키는 제 6단계; 봉선화 1중량부에 대하여 증류수 10 내지 20중량부를 혼합하여 45 내지 55℃ 온도에서 6 내지 8시간 동안 열수추출하여 봉선화 추출물을 제조하는 제 7단계; 발효 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 식물성 계면활성제 25 내지 30중량부, 상기 봉선화추출물 0.1 내지 0.5중량부, 에센셜오일 0.04 내지 0.1중량부를 혼합하여 홍화 샴푸을 제조하는 제 8단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 홍화씨 전처리 단계는, 고압멸균처리 공정, 70% 에탄올처리 공정 중에서 선택된 한가지의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 홍화 추출액 발효는 35℃의 온도에서 28일 동안 진행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 식물성 계면활성제는 디소듐라우레스설포썩시네이트, 코카마이도프로필베타인, 데실글루코사이드, 디소듐코코암포디프로피오네이트, 레시틴, 애플워시 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법{Manufacture of Shampoo with fermented safflower seed extracts}

본 발명은 발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 홍화 추출액을 미생물 발효하여 홍화 내 아케세틴 성분 및 폴리페놀 성분이 증가된 샴푸을 제조하는 방법에 관한 것이다.

홍화 (Safflower, Carthamus tinctorious L.)는 국화과에 속하는 일년생 식물으로 홍화씨는 한국, 중국 및 일본 등지에서 약용으로 사용되어 왔으며 특히 미국 및 인도에서 식용유 생산용으로 재배되고 있는 유용한 식물 종자이다.

홍화씨는 국내에서 골절 및 골다공증 등 골질환 치료제로 이용되고 있으며, 홍화씨 분말 및 추출물은 혈장 및 간 지질대사 개선에 효과가 있는 것으로 보고되었다. 홍화씨의 리그난 및 플라보노이드 성분이 주된 생리활성 물질로서 작용함이 밝혀졌다. 이외에도 홍화씨 유박에 함유되어 있는 세레토닌 유도체 및 리그난과 플라보노이드 등의 폴리페놀화합물이 항암 항산화 항염증 효과가 있는 것이 보고되었다.

또한, 홍화씨에는 다량의 불포화 지방산인 Linoleic acid와 토코페롤 및 식물성스테롤 성분을 함유 하고 있으며 단백질 및 식이성 섬유소를 가지고 있다. 홍화씨는 국내에서 골절 및 골다공증등 골질환 치료제로 이용되고 있으며 최근 홍화씨 분말 및 추출물의 쥐의 늑골 골절 회복 및 골절 치유 효과, 쥐의 경골골절 치유 효과 및 난소 절제 쥐의 골다공증 유발 모델에서 홍화씨 탈지박 분말과 추출물이 골손실 억제 효과를 가지고 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 근거로 홍화씨 추출물이 골질환 관련 치료에 효과적인 것이 증명되었다. 홍화씨 분말 및 추출물은 고 콜레스테롤 식이 흰쥐 및 난소절제 쥐의 혈장 및 간 지질대사 개선효과가 우수함이 보고되었으며 난소 절제 쥐의 골다공증 유발 모델을 이용하여 홍화씨의 탈지박 에탄올 추출물이 혈장 및 간 지질대사 개선효과가 보고되었으며 홍화씨의 리그난 및 플라보노이드 성분이 주된 생리활성 물질로서 작용함이 밝혀졌다. 이외에도 홍화씨 유박에 함유되어 있는 세레토닌 유도체 및 리그난과 플라보노이드 등의 폴리페놀화합물(Figure 3)이 항암, 항산화, 항염증 효과가 있는 것을 보고되었다. 이와 같이 홍화씨는 골질환 동맥경화증 및 염증을 예방하는 기능성식품 소재로써 기대 되고 있다.

그러나, 홍화를 활용한 식품 및 건강보조제품에 대한 연구는 다소 활발하나 홍화의 항염증 및 항산화 효과를 적용하여 피부의 염증을 개선할 수 있는 의약외품에 대한 연구가 다소 부족한 실정이다.

한국등록특허 제10-1663285호

본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로, 홍화를 특정 미생물로 발효하여 항산화 효과 및 항염증 효과가 있는 아케세틴, 폴리페놀 화합물을 증가시키고, 이를 이용하여 샴푸을 제조하는 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

발명이 해결하고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법은, 발효균주를 28℃ 온도에서 3일 동안 MRS 배지에서 배양하는 제 1단계; 홍화씨를 수세하는 제 2단계; 상기 수세한 홍화씨를 전처리하는 제 3단계; 상기 전처리한 홍화씨 1중량부에 대하여 증류수 15 내지 20중량부를 혼합하여 80 내지 95℃ 온도에서 열수추출하여 홍화 추출액을 제조하는 제 4단계; 상기 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 발효균주를 0.001중량부 접종하는 제 5단계; 상기 접종된 홍화 추출액을 발효시키는 제 6단계; 봉선화 1중량부에 대하여 증류수 10 내지 20중량부를 혼합하여 45 내지 55℃ 온도에서 6 내지 8시간 동안 열수추출하여 봉선화 추출물을 제조하는 제 7단계; 발효 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 식물성 계면활성제 25 내지 30중량부, 상기 봉선화추출물 0.1 내지 0.5중량부, 에센셜오일 0.04 내지 0.1중량부를 혼합하여 홍화 샴푸을 제조하는 제 8단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 홍화씨 전처리 단계는, 고압멸균처리 공정, 70% 에탄올처리 공정 중에서 선택된 한가지의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 홍화 추출액 발효는 35℃의 온도에서 28일 동안 진행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 식물성 계면활성제는 디소듐라우레스설포썩시네이트, 코카마이도프로필베타인, 데실글루코사이드, 디소듐코코암포디프로피오네이트, 레시틴, 애플워시 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다.

삭제

상기 과제의 해결수단에 의해 본 발명에 의한 발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법은 홍화를 특정 미생물로 발효하여 항산화 효과 및 항염증 효과가 있는 아케세틴, 폴리페놀 화합물을 증가시키고, 이를 이용하여 샴푸을 제조하여 두피의 이물질을 효과적으로 세정하고 트러블과 염증을 예방하는 효과가 있다.

또한, 인체와 환경에 유해한 SLS, SLES와 같은 성분이 포함되지 않은 식물성 계면활성제를 사용함으로써 인체 및 환경에 무해한 샴푸을 제조할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법의 순서도이다.
도 2는 비교예 1의 0일차 HPCL Chromatogram 결과이다.
도 3은 실시예 1의 7일차 HPCL Chromatogram 결과이다.
도 4는 실시예 2의 7일차 HPCL Chromatogram 결과이다.
도 5는 실시예 1의 14일차 HPLC Chromatogram 결과이다.
도 6은 실시예 2의 14일차 HPLC Chromatogram 결과이다.
도 7은 AGS cell morphology 관찰 결과이다.
도 8은 wound healing 분석 결과이다.

이상과 같은 본 발명에 대한 해결하려는 과제, 과제의 해결 수단, 발명의 효과를 포함한 구체적인 사항들은 다음에 기재할 일실시예 및 도면들에 포함되어 있다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 일실시예를 참조하면 명확해질 것이다.

하기에서는 발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법을 도면을 이용하여 상세하게 설명한다.

<발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법>

먼저, 제 1단계(S1)에서는 발효미생물을 배양한다.

구체적으로, Lactobacillus Acidophilus(환경미생물은행 등록번호 9001-008)를 MRS배지에서 배양한다. 이때, 온도 조건은 28℃로 유지하며 3일동안 배양한다.

상기 MRS배지는 Proteose peptone no.3, Beef extract, Yeast extract, Dextrose, Polysorbate 80, Ammonium citrate, Sodium acetate, Magnesium sulfate, Manganese sulfate, Dipotassium phosphate를 포함하며, pH농도는 6.5±2이다.

다음으로, 제 2단계(S2)에서는 홍화씨를 수세한다.

구체적으로, 홍화생씨를 깨끗한 물로 씻어서 준비한다.

다음으로, 제 3단계(S3)에서는 홍화씨를 전처리한다.

구체적으로, 고압멸균처리 공정 또는 70% 에탄올처리 공정으로 홍화씨를 전처리한다.

홍화씨를 전처리함으로써 발효 과정 중에 외부 미생물에 의하여 발생할 수 있는 오염을 방지할 수 있다.

다음으로, 제 4단계(S4)에서는 홍화 추출액을 제조한다.

구체적으로, 상기 전처리한 홍화씨를 열수추출하여 홍화 추출액을 제조한다.

홍화 추출액은 상기 전처리한 홍화씨 1중량부에 대하여 증류수 15 내지 20중량부를 혼합하여 80 내지 95℃에서 열수추출하여 제조한다.

상기 전처리한 홍화씨와 증류수의 혼합비율은 상기 전처리한 홍화씨 1중량부에 대하여 증류수 15 내지 20중량부를 혼합하는 것이 가장 바람직하다. 상기 전처리한 홍화씨 1중량부에 대하여 증류수가 15중량부보다 적으면 제조된 홍화 추출액의 농도가 과도하게 높고 향이 짙어 사용자의 기호도가 떨어질 수 있으며, 상기 전처리한 홍화씨 1중량부에 대하여 증류수가 20중량부보다 많으면 제조된 홍화 추출액의 농도가 과도하게 낮아 홍화의 유용성분이 충분하게 추출되지 않는 문제점이 있다.

또한, 상기 홍화 추출액을 제조할 때의 온도 조건은 80 내지 95℃가 가장 바람직하다. 85℃ 보다 낮은 온도 조건에서는 홍화 내의 유용성분이 충분하게 추출되지 않거나 작업 시간이 과도하게 늘어나서 효율성이 떨어지는 문제점이 있으며, 95℃보다 높은 온도 조건에서는 홍화의 유용성분이 파괴될 수 있는 문제점이 있다.

다음으로, 제 5단계(S5)에서는 상기 홍화 추출액에 발효균주를 접종한다.

구체적으로, 상기 제 4단계에서 제조한 홍화 추출액에 상기 제 1단계에서 배양한 발효균주를 접종한다.

이때, 상기 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 발효균주 0.001중량부를 접종하는 것이 가장 바람직하다. 상기 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 발효균주가 0.001중량부보다 적으면 효과적으로 발효가 일어나지 않는 문제점이 있다.

다음으로, 제 6단계(S6)에서는 상기 접종된 홍화 추출액을 발효한다.

구체적으로, 상기 발효균주를 접종한 홍화 추출액을 35℃의 온도에서 28일 동안 발효한다.

상기 발효균주는 35℃의 온도에서 가장 활발한 생육 활동을 보이므로, 발효과정은 35℃에서 이루어지는 것이 가장 바람직하다.

또한, 발효 기간이 28일 보다 짧아지면 충분하게 발효되지 않는 문제점이 있고, 28일 보다 길어지면 작업시간이 과도하게 늘어나 작업능률이 떨어지게 되므로 상기 발효균주를 접종한 홍화 추출액을 35℃의 온도에서 28일 동안 발효하는 것이 가장 바람직하다.

다음으로, 제 7단계(S7)에서는 봉선화추출물을 제조한다.

봉선화추출물은 봉선화 1중량부에 대하여 증류수 10 내지 20중량부를 혼합하여 45 내지 55℃에서 6 내지 8시간 동안 열수추출하여 제조한다. 상기 봉선화추출물은 향균, 항염 기능을 가지고 있어서 두피의 트러블 및 염증을 효과적으로 개선 및 예방하는 효과가 있다. 상기 가열온도가 45℃ 미만일 경우 봉선화 잎과 줄기 내에 있는 약효성분이 충분히 추출되지 않거나, 추출시간이 길어져 작업의 효율성을 해칠 수 있으며, 55℃를 초과하는 경우 봉선화 잎과 줄기의 약효성분이 파괴될 수 있으므로 상기 제안된 범위 내의 가열온도로 가열하는 것이 바람직하다. 또한, 가열시간은 6 내지 8시간인 것을 특징으로 한다. 상기 가열시간이 6시간 미만일 경우 봉선화 잎과 줄기 내에 있는 약효성분이 충분히 추출되지 않을 수 있으며, 8시간을 초과할 경우 봉선화 잎과 줄기의 약효성분이 파괴되거나 작업의 효율성을 해칠 수 있으므로 상기 제안된 범위 내의 시간동안 가열하는 것이 바람직하다.

다음으로, 제 8단계(S8)에서는 홍화 샴푸을 제조한다. 구체적으로, 상기 발효 홍화 추출액에 식물성 계면활성제, 봉선화추출물, 에센셜오일을 혼합하여 홍화 샴푸을 제조한다.

식물성 계면활성제는 식물성 기름으로 만든 계면활성제로 생분해가 잘되어 인체와 환경에 무해한 특징이 있다. 상기 홍화 샴푸을 제조하기 위하여 사용되는 상기 식물성 계면활성제는 디소듐라우레스설포썩시네이트, 코카마이도프로필베타인, 데실글루코사이드, 디소듐코코암포디프로피오네이트, 레시틴, 애플워시 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 식물성 계면활성제의 두피의 기름기와 이물질을 효과적으로 세정하고, 수용성의 혼합물과 지용성의 혼합물을 잘 혼합하는 효과도 가지고 있다.

삭제

에센셜오일은 그레이프푸르트 에센셜오일, 라벤더 에센셜오일, 라임 에센셜오일, 레몬 에센셜오일, 레몬그래스 에센셜오일, 로즈 에센셜오일, 로즈마리 에센셜오일, 로즈우드 에센셜오일, 만다린 에센셜오일, 바이올렛 에센셜오일, 바질 에센셜오일, 버베나 에센셜오일, 티트리 에센셜오일, 페퍼민트 에센셜오일로 이루어진 군에서 선택된 한가지가 될 수 있다. 에센셜오일은 식물체가 가지고 있는 각각의 강장, 강정, 향균, 살균 성분이 함유되어 있고 각각 고유의 향을 가지고 있다. 에센셜오일이 상기 홍화 샴푸에 첨가됨으로써 두피의 청결유지, 트러블 방지, 탈모예방, 머릿결 개선 등의 효과를 기대할 수 있다.

상기 홍화 샴푸 제조에 사용되는 재료 혼합비율은 상기 발효 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 식물성 계면활성제 25 내지 30중량부, 상기 봉선화추출물 0.1 내지 0.5중량부, 에센셜오일 0.04 내지 0.1중량부이다.

상기 발효 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 식물성 계면활성제가 25중량부보다 적으면 제조된 홍화 추출액 내의 수상층과 지상층, 봉선화추출물, 에센셜오일이 충분하게 혼합되지 않는 문제가 있으며, 상기 식물성 계면활성제가 30중량부보다 많으면 세정력은 좋으나, 두피와 머리카락의 수분을 빼앗아 건조한 느낌을 주는 문제가 있다. 그러므로 상기 발효 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 식물성 계면활성제가 25 내지 30중량부 첨가되는 것이 가장 바람직하다.

상기 발효 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 봉선화추출물이 0.1중량부보다 적으면 봉선화추출물의 항염, 항균 효과를 기대하기 어려우며, 상기 발효 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 봉선화추출물이 0.5중량부보다 많으면 사용자에 따라 두피에 자극을 받을 수 있다. 그러므로 상기 발효 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 봉선화추출물이 0.1 내지 0.5중량부 첨가되는 것이 가장 바람직하다.

상기 발효 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 에센셜오일이 0.04중량부보다 적으면 에센셜오일의 기능과 향을 충분하게 샴푸에 포함시키지 못하고, 상기 발효 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 에센셜오일이 0.1중량부보다 많으면 사용자에 따라 두피에 자극을 받을 수 있다. 그러므로 상기 발효 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 에센셜오일이 0.04 내지 0.1중량부 첨가되는 것이 가장 바람직하다.

상기 디소듐라우레스설포썩시네이트, 코카마이도프로필베타인, 데실글루코사이드, 디소듐코코암포디프로피오네이트는 계면활성제, 세정제, 거품생성제로 주로 사용되며 세정력을 높이며 산뜻한 사용감을 주는 효과가 있다. 상기 레시틴은 난황, 콩기름, 간, 뇌 등에 다량 존재하는 복합지질로 지방부의 피막이나 지질단백질을 이룬다. 한쪽에는 친유성이 강한 지방산기를 가지고 다른 쪽에는 친수성이 강한 인산, 콜린 부분이 있어 물과 유지의 혼합물을 안정화시켜주는 유화제로서 널리 사용된다. 상기 애플워시는 사과쥬스에서 추출되는 천연계면활성제로 거품의 밀도를 부드럽게 하고 거품이 풍성하도록 돕는다.

이하는 본 발명의 홍화 내의 아케세틴 성분을 증가시키는 미생물 발효 방법의 실시예이다.

[실시예 1]

실시예 1은 본 발명의 아케세틴 성분을 증가시키는 미생물 발효 방법을 바탕으로 홍화씨를 전처리하고, 발효균주를 접종하여 발효하였다. 표 1과 같이, 발효균주는 Lactobacillus Acidophilus 9001-008를 사용하였으며, 28℃의 온도조건의 MRS배지에서 3일 동안 배양하여 사용하였다. 분쇄한 홍화씨는 autoclave에 투입하고 고압멸균 처리함으로써 전처리하였다. 전처리한 홍화씨 1중량부에 대하여 상기 배양한 발효균주 0.001중량부를 접종하여 발효하되, 진탕배양기에서 30℃의 온도조건하에서 100rpm으로 혼합함으로써 발효하였다.

[실시예 2]

실시예 2는 본 발명의 아케세틴 성분을 증가시키는 미생물 발효 방법을 바탕으로 홍화씨를 전처리하고, 발효균주를 접종하여 발효하였다. 표 1과 같이, 발효균주는 Lactobacillus Acidophilus 9001-008를 사용하였으며, 28℃의 온도조건의 MRS배지에서 3일 동안 배양하여 사용하였다. 분쇄한 홍화씨는 70% 에탄올 처리함으로써 전처리하였다. 구체적으로, 70% 에탄올을 처리한 후, 표 2의 MSM 배지로 2회 세척하였다. 전처리한 홍화씨 1중량부에 대하여 상기 배양한 발효균주 0.001중량부를 접종하여 발효하되, 진탕배양기에서 30℃의 온도조건하에서 100rpm으로 혼합함으로써 발효하였다.

조성물	조성물의 양
Proteose peptone no.3	10.0g
Beef extract	10.0g
Yeast extract	5.0g
Dextrose	20.0g
Polysorbate 80	1.0g
Ammonium citrate	2.0g
Sodium acetate	5.0g
Magnesium sulfate	0.1g
Manganese sulfate	0.05g
Dipotassium phosphate	2.0g
D.W	1L
pH adjust to	6.2±2

조성물	조성물의 양
KH₂PO₄	0.1g
K₂HPO₄	0.1g
(NH₄)₂SO₄	0.05g
NaCl	30g
Glucose	1g
Yeast	1g
MgSO₄·7H₂O	0.2g
CaCl₂·2H₂O	0.02g
FeCl₃·7H₂O	0.01g
1X Trace element solution SL-6	2mL
1X VA vitamin solution	1mL
D.W	1L
pH adjust to	6.8

*1X Trace element solution SL-6 : 0.1 g ZnSO₄·7H₂O, 0.03g MnCl₂·4H₂O, 0.3g H₃BO₃, 0.2g CoCl₂·6H₂O, 0.01g CuCl₂·2H₂O, 0.02g NiCl₂·6H₂O, 0.03g NaMoO₄·2H₂O per 1L of distilled water.

*1X VA vitamin solution : 10 mg Biotin, 35 mg Nicotinamide, 30 mg thiamine dichloride, 20 mg p-Aminobenzoic acid, 10mg pyridoxal chloride, 10mg Ca-pantothenate, 5 mg Vitamin B12 per 1 L of distilled water.

[비교예 1]

비교예 1은 발효를 진행하지 않은 홍화씨 샘플이다.

이하는 본 발명의 발효 과정으로 인한 홍화 내 아케세틴 물질의 증가 효과에 대한 실험이다.

1. 홍화씨의 crude phenolic compound 추출

비교예 1과 7일 동안 발효한 실시예 1 내지 2를 105℃에서 30분 동안 건조하여 수분을 제거하였다. 건조한 홍화씨는 1g당 10mL의 70% 에탄올에 넣고, 60℃의 sonicator bath에서 1시간 처리함으로써 crude phenolic compound를 추출하였다. 추출 후 필터(Whatman filter paper, no. 540, 8㎛)하여 에탄올 추출물을 감압농축기를 이용하여 농축하고 1mL의 70%에탄올을 이용하여 재용해시켰다. 그 후 24시간 동안 정치하여 부유물을 침전시킨 뒤 상층액만 취하여 동결건조였다.

1-1. crude phenolic compound 추출물 정제

(1) Dialysis 정제

발효한 홍화씨를 채취하여 60℃에서 4시간 동안 건조하여 수분을 제거한다. 건조한 100g의 발효한 홍화씨는 1L의 70% 에탄올에 넣어 sonicator bath를 이용하여 60℃에서 1시간 처리하여 추출하였다. 추출 후 필터하여 에탄올 추출물을 감압농축기를 이용하여 농축하고 50mL의 70% 에탄올을 이용하여 재용해시켰다. 원심분리기를 이용하여 13,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 취하고, Dialysis tubing을 이용하여 M.W 100~2000 사이의 물질을 분리한 후 건조하였다.

(2) Column 정제

발효한 홍화씨를 채취하여 60℃에서 4시간 동안 건조하여 수분을 제거한다. 건조한 200g의 발효한 홍화씨를 2L의 헥산과 섞어 60℃에서 1시간동안 sonicator bath를 이용하여 지질 성분을 추출하였다. 헥산 추출물은 모두 필터하여 제거하고 탈지된 홍화씨를 2L의 70% 에탄올에 넣어 위와 같은 방법으로 phenolic compounds를 추출한다. 에탄올 추출물은 농축하여 재용해시키고 24시간을 방치하여 부유물을 가라앉힌다. 가라앉힌 샘플은 극성 차이로 분리하여 Diaion HP-20 column(6cm×50cm)에 샘플을 로딩하였고 40, 60, 80, 100% 메탄올(v/v)을 각각 1L, 2L, 2L, 1L를 흘려주었다. 100% 메탄올 샘플은 Sephadex LH-20 column에 로딩하여 100% 메탄올을 이용하여 정제하였다. HPLC분석을 통하여 단일 물질로 정제되었는지 확인하였다.

1-2. Phenolic compounds 함량측정

(1) 분석방법

용해시킨 샘플을 1/100으로 희석하여 100㎕를 취해 200㎕의 10% Folin-ciocalteous phenol reagent와 섞고 Voltex하여 30분간 실온에서 반응시킨다. 반응 후 800㎕의 700mM Sodium carbonate solution과 섞어 voltext하여 2시간 동안 실온에서 반응시킨다. 반응 후 2분동안 원심분리하여 상층액 200㎕를 96well에 분주하고 735nm로 흡광도를 측정한다.

(2) 검량선 작성

Total phenolic compounds의 검량선을 작성하기 위하여 tannic acid를 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200mg/L로 농도를 설정하고 위에 언급된 분석 방법을 통해 흡광도를 측정한다. 이 결과 값은 Y축으로 농도를 X축으로 설정하여 일차함수 식을 구하였다. 미지의 시료는 흡광도 값을 y값에 대입하여 phenolic compounds의 농도를 계산하였다.

(3) 시료의 농도 계산

건조한 홍화씨 1g에 들어있는 총 phenolic compounds를 계산하였다. 수식은 아래와 같다.

*TP(mg) = TP(mg/L) × Total extract volume(mL)/100

= TP(mg/g) = TP(mg)/건조량(g)

1-3. HPLC 분석

발효과정을 통해 변화된 phenic compounds를 알아보기 위하여 100mg/mL로 70% 에탄올에 용해시킨 시료를 1/10으로 희석하여 HPLC 분석을 실시하였다. 실험에 사용한 column은 Cap-sell C18 column이며 Gradient 조건으로 분석하였다. Solvent A는 0.05% (v/v) 인산이 들어있는 20% Methanol (v/v)이며 Solvent B는 80% Methanol (v/v)을 이용하였다. 시료 주입량은 20㎕이며 flow rate는 0.8ml/min, 파장은 270nm로 측정하였다. Gradient 조건은 표 3과 같다. Acacetin은 (sigma-aldrich)의 표준물질을 구매하여 같은 조건으로 분석하여 머무름시간을 확인하였다.

시간(min)	Solvent A(%)	Solvent B(%)
0-2	100	0
5-10	80	20
15-20	60	40
25-30	40	60
35-40	0	100
50-60	100	0

도 2 내지 4에서 보는 바와 같이, 비교예 1의 아케세틴의 양은 0.004mg/g이 측정되었다. 또한, 실시예 1은 아케세틴의 양이 0.378mg/g으로 증가하였고, 실시예 2는 아케세틴의 양이 0.583mg/g으로 증가하여 미생물 발효과정을 거친 실시예 1 내지 2에서는 아케세틴이 증대되는 것을 알 수 있다.

또한, 도 5 내지 6에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 홍화씨의 M.W 100~2000사이의 물질을 1.52g을 얻었으며 더욱 정제된 것을 확인하였다. 실시예 2의 홍화씨의 M.W 100~2000사이의 물질이 1.62g이 정제된 것을 확인하였다.

1-4. 아케세틴 추출물의 AGS cell viability 측정

실시예 1 내지 2에서 얻은 아케세틴 추출물을 준비한다. 그리고 AGS 위암 유래 세포를 12 well plate에 seeding 후 DMSO에 용해시킨 상기 아케세틴 추출물들을 50㎍/mL로 24시간 동안 처리하였다. 24시간이 지난 후, 2 내지 3시간 동안 MTT를 처리하고 상층액을 제거한 후에 세포를 DMSO에 용해시켰다. 이 용액을 595nm 파장에서 흡광도를 측정하여 나온 값으로 cell viability를 계산하였다.

아케세틴을 처리한 AGS cell morphology 관찰 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 아케세틴을 처리하지 않은 A군보다 실시예 1에서 얻은 아케세틴 추출물 50㎍/mL를 24시간 동안 처리한 B군과 실시예 2에서 얻은 아케세틴 추출물 50㎍/mL를 24시간 동안 처리한 C군에서 세포성장이 더딘 것을 확인할 수 있었다. 특히, B 군 및 C군에서는 death floating cell이 증가하였다.

1-5. Wound healing 분석

AGS 위암 유래 세포를 6 well plate에 seeding하고, 세포가 well에 90% 이상 성장하면 well 바닥에 여러개의 선을 그어 빈 공간을 만들었다. 배지를 교체한 후 상기 실시예 1에서 얻은 아케세틴 추출물을 50㎍/mL 농도로 24시간 동안 처리하였다. 24시간이 지난 후에 빈 공간에 cell migration 현상이 일어났는지 현미경으로 관찰하였다. 관찰 사진은 image J 소프트웨어로 분석하여 wound healing 결과를 도출하였다.

wound healing assay를 통해 wound closure를 확인한 결과, 도 8에서 보는 바와 같이 아케세틴을 처리하지 않은 A군보다 실시예 1에서 얻은 아케세틴 추출물 50㎍/mL를 24시간 동안 처리한 B군에서 wound closure가 확연하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.

이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

S1. 발효균주를 배양
S2. 홍화씨 수세
S3. 홍화씨 전처리
S4. 홍화 추출액 제조
S5. 발효균주 접종
S6. 홍화 추출액 발효
S7. 봉선화 추출물 제조
S8. 홍화 샴푸 제조

Claims

발효균주를 28℃ 온도에서 3일 동안 MRS 배지에서 배양하는 제 1단계;
홍화씨를 수세하는 제 2단계;
상기 수세한 홍화씨를 전처리하는 제 3단계;
상기 전처리한 홍화씨 1중량부에 대하여 증류수 15 내지 20중량부를 혼합하여 80 내지 95℃ 온도에서 열수추출하여 홍화 추출액을 제조하는 제 4단계;
상기 홍화 추출액 1중량부에 대하여 상기 발효균주를 0.001중량부 접종하는 제 5단계;
상기 접종된 홍화 추출액을 발효시키는 제 6단계;
봉선화 1중량부에 대하여 증류수 10 내지 20중량부를 혼합하여 45 내지 55℃ 온도에서 6 내지 8시간 동안 열수추출하여 봉선화 추출물을 제조하는 제 7단계;
발효 홍화 추출액 1중량부에 대하여 식물성 계면활성제 25 내지 30중량부, 상기 봉선화추출물 0.1 내지 0.5중량부, 에센셜오일 0.04 내지 0.1중량부를 혼합하여 홍화 샴푸을 제조하는 제 8단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법
삭제
제 1항에 있어서,
상기 홍화씨 전처리 단계는,
고압멸균처리 공정, 70% 에탄올처리 공정 중에서 선택된 한가지의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법
삭제
삭제
제 1항에 있어서,
상기 홍화 추출액 발효는 35℃의 온도에서 28일 동안 진행되는 것을 특징으로 하는 발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법
삭제
제 1항에 있어서,
상기 식물성 계면활성제는 디소듐라우레스설포썩시네이트, 코카마이도프로필베타인, 데실글루코사이드, 디소듐코코암포디프로피오네이트, 레시틴, 애플워시 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효 홍화 추출액을 이용한 샴푸 제조방법
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