KR101872163B1 - 플루오로퀴놀론계 항생제의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 플루오로퀴놀론계 항생제의 용도에 있어서, 신체 조직 내 세포 염색 및 이를 이용하여 감염 원인균 진단법에 활용하는 것을 특징으로 한다. 또한, 플루오로퀴놀론계 항생제 염색 방법에 있어서, 세포 단위로 형광염색을 하고자 하는 조직을 마련하는 단계, 조직에 플루오로퀴놀론계 항생제를 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은, 세포 단위로 형광염색을 하고자 하는 조직을 마련하는 단계, 조직에 플루오로퀴놀론계 항생제를 가하여 염색하는 단계 및 조직을 다광자 형광 기반 광학영상을 통해 검사하여 감염 원인균에 대한 정보를 제공하는 단계를 포함하는 감염 원인균 진단에 대한 정보 제공하는 방법을 포함한다.
또한 본 발명은, 세포 단위로 형광염색을 하고자 하는 조직을 마련하는 단계, 조직에 플루오로퀴놀론계 항생제를 가하여 염색하는 단계 및 조직을 다광자 형광 기반 광학영상을 통해 검사하여 감염 원인균에 대한 정보를 제공하는 단계를 포함하는 감염 원인균 진단에 대한 정보 제공하는 방법을 포함한다.
Description
본 발명은 플루오로퀴놀론계 항생제의 용도에 관한 것이다.
생물학 연구에서 많이 활용되고 있는 형광물질을 이용한 염색, 형광 영상 및 측정 방법은, 인간을 제외한 생물의 생체기관 중 특정 관심부위만을 형광 발현시키는 방법으로, 고 대비도로 촬영할 수 있는 장점이 있다. 하지만 현재 인체 대상 형광 염색물질로는 ICG와 fluorescein만이 혈관 염색에 사용되고 있으며, 세포나 미생물의 염색에 활용되는 물질은 없다.
플루오로퀴놀론계 항생제는 일반적으로 하나의 고에너지 입사 광자로 하나의 형광 광자를 발생시키는 단광자 형광을 가지고 있다. 하지만, 이들이 발현하는 여기광이 목시플록사신은 280 nm, 가티플록사신은 292 nm의 자외선 영역이어서, 이러한 형광 특성을 통해서는 인체 내 세포 등에서 질병의 원인균을 판단하는 데에는 활용되지 못하고 있다.
단광자 형광이 있는 물질은 비선형 형광인 이광자 형광, 삼광자 형광 등 두세 개의 저에너지 입사 광자들이 공조를 통해 하나의 형광 광자를 발생시키는 다광자 형광 특성을 가질 수도 있다. 그러나 실제로 실험적으로 확인하기 전까지는 알 수 없으며, 형광 효율에 대해서도 측정으로만 확인할 수 있다.
따라서 현재 인체의 세포 등에 사용되는 형광 염색 물질은 없으며, 원인균을 파악하기 위해서는 감염원인균 진단법을 이용한다.
감염원인균 진단법은 슬릿 램프를 통해 감염에 의한 염증을 확인하고, 면봉으로 문질러 염증 부위의 조직을 채취한 후, 염색을 통해 관찰하거나 수일간 배양 후에 관찰하는 방법이다. 이 방법은 시간이 많이 걸려 치료 시기가 늦어지는 단점이 있다.
따라서 본 발명의 목적은, 플루오로퀴놀론계 항생제로 신체 조직 내 세포를 염색하는 용도 및 방법, 신체 조직 내 세포를 염색하여 감염 원인균 진단법에 활용하는 용도 및 감염 원인균 진단에 대한 정보를 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적은 플루오로퀴놀론계 항생제의 용도에 있어서, 신체 조직 내 세포를 염색하는 것에 의해 달성된다.
조직은 각막, 피부 및 대장 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
염색은 다광자 형광 발현을 이용할 수 있다.
플루오로퀴놀론계 항생제는 목시플록사신을 포함할 수 있다.
플루오로퀴놀론계 항생제는 가티플록사신을 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 목적은 플루오로퀴놀론계 항생제의 용도에 있어서, 신체 조직 내 세포를 염색하여 감염 원인균 진단법에 활용하는 것에 의해 달성된다.
조직은 각막, 피부 및 방광 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
감염 원인균은 녹농균, 포도상구균 및 진균 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
염색은 다광자 형광 발현을 이용할 수 있다.
플루오로퀴놀론계 항생제는 목시플록사신 및 가티플록사신 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 목적은 플루오로퀴놀론계 항생제로 염색하는 방법에 있어서, 세포 단위로 형광염색을 하고자 하는 조직을 마련하는 단계, 조직에 플루오로퀴놀론계 항생제를 주입하는 단계를 포함하는 것에 의해 달성된다.
조직은 각막, 피부 및 방광 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
염색은 다광자 형광 발현을 이용할 수 있다.
플루오로퀴놀론계 항생제는 목시플록사신 및 가티플록사신 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 목적은 감염 원인균 진단에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 세포 단위로 형광염색을 하고자 하는 조직을 마련하는 단계, 상기 조직에 플루오로퀴놀론계 항생제를 가하여 염색하는 단계, 조직을 다광자 형광 기반 광학영상을 통해 검사하여 감염 원인균에 대한 정보를 제공하는 단계를 포함할 수 있다.
감염 원인균은 각막, 피부 및 방광 원인균 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
감염 원인균은 녹농균, 포도상구균 및 진균 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
플루오로퀴놀론계 항생제는 목시플록사신 및 가티플록사신 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 플루오로퀴놀론계 항생제로 신체 조직 내 세포를 염색하는 용도 및 방법, 신체 조직 내 세포를 염색하여 감염 원인균 진단법에 활용하는 용도 및 감염 원인균 진단에 대한 정보를 제시하는 방법이 제공된다.
도 1은 본 발명에서 사용된 염산목시플록사신의 구조식 및 화학식을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 가티플록사신의 구조식 및 화학식을 도시한 것이다.
도 3의 (a)는 염산목시플록사신(M)과 가티플록사신(G)의 여기 스펙트럼, 도 3의 (b)는 염산목시플록사신(M)과 가티플록사신(G)의 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 4의 (a)는 마우스의 각막 상피층(superficial epithelium), 도 4의 (b)는 각막 상피층(basal epithelium), 도 4의 (c)는 각막 스트로마층(stroma), 도 4의 (d)는 각막 내피층(endothelium)의 자가 형광 발현 사진을 도시한 것이며, 도 4의 (e)는 도 4의 (a)~(d)의 평균 신호 그래프를 도시한 것이다.
도 5의 (a)~(e)는 마우스의 각막에 각각 염산목시플록사신을 주입하여 형광 발현된 사진이며, 도 5의 (g)~(l)은 마우스의 각막에 각각 가티플록사신을 주입하여 형광 발현된 사진을 도시한 것이다. 도 5의 (a) 및 (g)는 각막 상피층(superficial epithelium), (b) 및 (h)는 각막 상피층(basal epithelium), (c) 및 (i)는 각막 스트로마층(stroma), (d) 및 (j)는 각막 내피층(endothelium), (e) 및 (k)는 상피층, 스트로마층, 내피층의 단층을 도시한 것이며, (f) 및 (l)은 각각 염산목시플록사신 및 가티플록사신을 주입한 상피층, 스트로마층, 내피층의 평균 신호 그래프를 도시한 것이다.
도 6의 (a)~(d)는 마우스의 귀의 피부 상피세포부터 진피세포로 내려가며 이광자 현미경으로 촬영한 자가 형광 발현 사진이며, 도 6의 (e)~(h)는 염산목시플록사신을 주입하여, 각각 (a)~(d)의 같은 위치에서 형광 발현된 사진을 도시한 것이다.
도 7은 염산목시플록사신을 주입한 마우스의 방광 세포 형광 발현 실험의 프로토콜을 도시한 것이다.
도 8의 (a)는 방광 외부(serosa) 조직, 도 8의 (b)는 방광의 내부(lumen) 조직에 염산목시플록사신을 주입하여 형광 발현된 사진을 도시한 것이다.
도 9의 (a)는 본 실험에서 활용한 녹농균(pseudomonas), 도 9의 (b)는 포도상구균(staphylococcus)을 현미경으로 관찰한 모습을 도시한 것이다.
도 10의 (a)는 염산목시플록사신을 투여 전 녹농균(pseudomonas), 도 10의 (b)는 염산목시플록사신 투여 후 녹농균(pseudomonas), 도 10의 (c)는 염산목시플록사신 투여 전 포도상구균(staphylococcus), 도 10의 (d)는 염산목시플록사신 투여 후 포도상구균(staphylococcus)의 형광 발현 사진을 도시한 것이다.
도 11은 녹농균(pseudomonas) 및 포도상구균(staphylococcus)에 염산목시플록사신을 투여하기 전 및 투여 후의 그래프를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 가티플록사신의 구조식 및 화학식을 도시한 것이다.
도 3의 (a)는 염산목시플록사신(M)과 가티플록사신(G)의 여기 스펙트럼, 도 3의 (b)는 염산목시플록사신(M)과 가티플록사신(G)의 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 4의 (a)는 마우스의 각막 상피층(superficial epithelium), 도 4의 (b)는 각막 상피층(basal epithelium), 도 4의 (c)는 각막 스트로마층(stroma), 도 4의 (d)는 각막 내피층(endothelium)의 자가 형광 발현 사진을 도시한 것이며, 도 4의 (e)는 도 4의 (a)~(d)의 평균 신호 그래프를 도시한 것이다.
도 5의 (a)~(e)는 마우스의 각막에 각각 염산목시플록사신을 주입하여 형광 발현된 사진이며, 도 5의 (g)~(l)은 마우스의 각막에 각각 가티플록사신을 주입하여 형광 발현된 사진을 도시한 것이다. 도 5의 (a) 및 (g)는 각막 상피층(superficial epithelium), (b) 및 (h)는 각막 상피층(basal epithelium), (c) 및 (i)는 각막 스트로마층(stroma), (d) 및 (j)는 각막 내피층(endothelium), (e) 및 (k)는 상피층, 스트로마층, 내피층의 단층을 도시한 것이며, (f) 및 (l)은 각각 염산목시플록사신 및 가티플록사신을 주입한 상피층, 스트로마층, 내피층의 평균 신호 그래프를 도시한 것이다.
도 6의 (a)~(d)는 마우스의 귀의 피부 상피세포부터 진피세포로 내려가며 이광자 현미경으로 촬영한 자가 형광 발현 사진이며, 도 6의 (e)~(h)는 염산목시플록사신을 주입하여, 각각 (a)~(d)의 같은 위치에서 형광 발현된 사진을 도시한 것이다.
도 7은 염산목시플록사신을 주입한 마우스의 방광 세포 형광 발현 실험의 프로토콜을 도시한 것이다.
도 8의 (a)는 방광 외부(serosa) 조직, 도 8의 (b)는 방광의 내부(lumen) 조직에 염산목시플록사신을 주입하여 형광 발현된 사진을 도시한 것이다.
도 9의 (a)는 본 실험에서 활용한 녹농균(pseudomonas), 도 9의 (b)는 포도상구균(staphylococcus)을 현미경으로 관찰한 모습을 도시한 것이다.
도 10의 (a)는 염산목시플록사신을 투여 전 녹농균(pseudomonas), 도 10의 (b)는 염산목시플록사신 투여 후 녹농균(pseudomonas), 도 10의 (c)는 염산목시플록사신 투여 전 포도상구균(staphylococcus), 도 10의 (d)는 염산목시플록사신 투여 후 포도상구균(staphylococcus)의 형광 발현 사진을 도시한 것이다.
도 11은 녹농균(pseudomonas) 및 포도상구균(staphylococcus)에 염산목시플록사신을 투여하기 전 및 투여 후의 그래프를 도시한 것이다.
본 발명은 신체 조직 내 세포 염색 및 이를 감염 원인균 진단법에 활용하는 플루오로퀴놀론계 항생제의 용도를 제공한다.
본 발명에서 플루오로퀴놀론계의 신체 조직 내 세포 염색방법은, (a) 세포 단위로 형광 염색을 하고자 하는 조직을 마련하는 단계, (b) 상기 조직에 플루오로퀴놀론계 항생제를 가하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명에서는, (a) 세포 단위로 형광 염색 하고자 하는 조직을 마련하는 단계, (b) 상기 조직에 플루오로퀴놀론계 항생제를 가하여 염색하는 단계, (c) 상기 조직을 다광자 형광 기반 광학 영상을 통해 검사하여 감염 원인균에 대한 정보를 제공하는 단계를 포함하는 감염 원인균 진단에 대한 정보를 제공한다.
생물체의 분자, 세포, 조직의 활동 모습은 형광물질(Fluorescent Probe, FP)로 처리하면 형광현미경을 통해 관찰할 수 있다. FP 내의 전자가 입사 광자에 의해 들뜬 상태로 되었다가 다시 제자리로 돌아가는 과정에서 독특한 색체의 형광 광자를 방출하기 때문이다.
이러한 형광 광자 방출 현상이 가시광선 영역에서 발생한다면, 인체 내 세포 등에서 질병의 원인균을 판단하는 데 활용이 가능하게 된다. 본 발명에서는 플루오로퀴놀론계 항생제가 자외선 뿐 아니라, 가시광선 영역에서 형광 발현이 가능함을 발견하였다. 또한, 플루오로퀴놀론계 항생제가 인체 내 세포 염색이 가능함을 발견하고, 박테리아균의 염색도 가능함을 확인하였다. 따라서 플루오로퀴놀론계 항생제를 이용하여, 인체 내에서 조직의 세포 염색 방법 및 감염 원인균 진단에 대한 정보를 제공할 수 있게 되었다.
플루오로퀴놀론계 항생제로는 목시플록사신, 가티플록사신, 페플록사신, 디플록사신, 노플록사신, 시프로플록사신, 오플록사신 및 엔로플록사신 등이 있으나, 바람직하게는 자가 형광이 가시광선 영역에서의 발현되거나, 가시광선 영역을 포함하는 다광자 형광의 발현이 가능한 플루오로퀴놀론계 항생제가 적합하다. 이하 실험예에서는 이 중 안구 항생제로 주로 사용되는 가티플록사신 및 염산으로 치환된 염산목시플록사신으로 실험을 실시하였다.
염산목시플록사신 및 가티플록사신은 700 nm ~ 800 nm 범위의 근적외선 파장 광원에서도 형광 신호 발현이 가능함을 이하 실험예에서 확인하였다. 또한, 상기 항생제를 투여한 생체 조직의 형광 효율이, 자가 형광 대비 10배 ~ 100배 이상이며, 조직을 떼어내지 않고도 조직 내에서 항생제 기반 세포 영상촬영이 가능함을 이하 실험예들을 통해 확인하였다.
본 발명은 다양한 신체 조직에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 조직 내 세포에 적용될 수 있다. 본 발명의 실험예에서는 각막 세포, 피부 세포 및 방광 세포에 염산목시플록사신 및 가티플록사신을 투여하여 형광 발현을 측정하였다.
플루오로퀴놀론계 항생제를 감염 원인균 진단법을 사용하기 위해서는, 조직 내 세포 뿐 아니라 각 세포에 존재하는 박테리아균 등의 원인균이 염색되어야 감염 여부를 판단할 수 있다. 본 발명의 방법은, 다양한 박테리아균에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 신체 조직 내 세포에 감염될 수 있는 박테리아균들에 적용될 수 있다. 또한 본 발명의 방법은, 사람과 같은 진핵세포(eukaryote)로 이루어진 진균(fungus)에도 적용될 수 있다.
본 발명의 실험예에서는 녹농균(pseudomonas) 및 포도상구균(staphylococcus)을 배양하여 플루오로퀴놀론계 항생제를 투여하였고, 다광자 현미경을 통해 형광 발현이 됨을 확인할 수 있었다.
먼저 도 1 내지 도 3을 참조하여 실험에 사용된 목시플록사신 및 가티플록사신과 이 항생제들의 형광 발현의 영역 및 세기에 대해 설명한다.
목시플록사신은 시중에서 판매되고 있는 비가목스 점안액 0.5% (한국 알콘 社)으로서, 도 1에서 제시한 구조식처럼, 염산이 합성된 염산목시플록사신(Moxifloxacin HCl (염산목시플록사신) 5.45 mg)이다.
가티플록사신은 도 2에서 제시한 구조식의 가티플로 점안액(한독약품 社, 가티플록사신 3 mg)이다.
도 3의 (a)는 염산목시플록사신 및 가티플록사신의 여기 스펙트럼(excitation spectrum)을 보여준다. 여기서 X축은 실험에서 사용된 펨토초 레이저 광원의 파장(nm)을 나타내며, 이 펨토초 레이저 파장의 측정 범위인 700nm 내지 800nm에서의 이광자 여기 형광(two-photon excited fluorescence, TPF)의 정도(a.u.)는 Y축으로 나타나고 있다. 이 그래프를 통해 염산목시플록사신 및 가티플록사신은 근적외선 파장인 700 ~ 800 nm 범위의 광원에서 형광 신호를 나타낼 수 있음을 알 수 있다. 또한, Y축의 여기 형광 그래프의 세기로 보아 광원의 파장이 700 nm일 경우, 다른 파장에 비해 좀 더 강한 형광 신호를 나타내는 것을 알 수 있다.
도 3의 (b)는 펨토초 레이저를 염산목시플록사신 및 가티플록사신에 가하였을 때, 각 항생제의 형광 발현 정도를 나타내는 스펙트럼 (emission spectrum)을 보여준다. X축은 파장(nm), Y축은 이광자 여기 형광(two-photon excited fluorescence, TPF)의 정도(a.u.)를 나타낸다. 이 그래프를 볼 때, 염산목시플록사신과 가티플록사신은 주로 450 ~ 550 nm 사이의 파장의 형광 신호가 주로 발현되며, 약 520 nm의 파장이 가장 세게 발현되는 것을 알 수 있다. 또한 Y축의 그래프 세기로 보아, 염산목시플록사신이 가티플록사신보다 형광 발현이 훨씬 뛰어나다는 것도 알 수 있다.
이하, 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실험예에 의해 제한되지 않는다. 이하의 실험에서 조직의 세포로는 각막, 피부(귀), 방광을 대상으로 하였지만, 이에 한정되지 않고, 전립선, 대장 등 다양한 신체 내 조직의 세포에 적용 가능하다.
박테리아균은 녹농균(pseudomonas) 및 포도상구균(staphylococcus)을 대상으로 하였지만, 신체 내 조직의 세포가 감염될 수 있는 다양한 박테리아균에 적용 가능하며, 하기 실험예에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 박테리아균 뿐 아니라, 사람과 같은 진핵생물(eukaryote)인 진균(fungus)에도 적용 가능하며, 진균(fungus)의 종류에도 제한되지 않는다.
<실험예 1: 플루오로퀴놀론계 항생제(염산목시플록사신 및 가티플록사신)의 각막 세포 다광자 형광 측정>
1) 재료 및 시료 준비
5, 6주 된 Blab/c female mice, 가티플록사신 및 염산목시플록사신, 포인트 스캐닝 방식으로 사용될 2축 스캐너(x축 galvano 스캐너, y축 galvano 스캐너)를 포함하는 다광자 현미경을 준비했다.
이번 실험예에는 펨토초 레이저를 광원으로 이용한 이광자 현미경을 사용했으며, 실험 과정 내내 다음 조건에서 동일하게 측정하였다.
·Excitation wavelength: 780 nm for vigamox(moxifloxacin)
·Filter set: Ch01:<430nm, Ch02:>430nm
·현미경 제조사/ 제품명: Leica/ TCS SP5II MP SMD FLIM
·필터: 500/25 bandpass filter, chroma
·광원: chameleon vision II, coherent
·카메라: photon multiplier tube (PMT) 6357, Hamamatsu Photonics
·대물렌즈: 25x 0.95NA objective lens, leica
2) 플루오로퀴놀론계 항생제(염산목시플록사신 및 가티플록사신)의 각막 세포 다광자 형광 측정
마우스의 각막 세포의 자가 형광 발현과 염산목시플록사신에 의한 형광 발현을 비교하기 위해, 염산목시플록사신을 도포하지 않은 마우스의 각막 세포 먼저 촬영하였다.
실험에 사용될 Blab/c 마우스를 마취시킨 뒤 안구 촬영용 마우스 고정대 (eye holder)에 고정하여 상기 이광자 현미경으로 촬영하였다. 레이저 파워는 30.8 mW로 세팅되었고, 이때 촬영된 마우스 각막의 자가 형광 세기를 기록하였다.
비가목스(염산목시플록사신)에 의한 마우스 각막의 형광 발현 정도를 측정하기 위해, 마우스 왼쪽 안구에 염산목시플록사신을 10 ㎕ 점안하였고, 30초 동안 눈꺼풀을 닫았다. 약 20분 동안 염산목시플록사신이 마우스 각막 안쪽 세포까지 침투할 수 있도록 기다렸다.
항생제가 침투하는 시간(incubation time)은 조직에 따라 다르나, 예를 들어 5분 후, 10분 후 처럼 time lapse로 촬영하여 확인하였다. 각막의 경우에는 약 수십 분 이내이다. 상기 이광자 현미경을 통해 포인트 스캐닝 방식으로 각막을 형광 영상 촬영하였다. (이 때, 스펙트럼의 여기 파장은 790 nm로 세팅되었고, 염산목시플록사신의 레이저 파워는 약 14.8 mW, 가티플록사신은 항생제를 투여하기 전 레이저 파워와 같은 30.8 mW로 세팅되었다.)
도 4는 염산목시플록사신 및 가티플록사신을 처리하지 않은 마우스의 왼쪽 안구의 각막을 상기 이광자 현미경을 이용하여, X-Y 평면의 포인트 스캐닝 방식으로 촬영한 사진 및 평균 신호 그래프를 도시한 것이다.
도 4의 (a)는 각막 최표피 상피세포층(superficial epithelial cell layer, (b)는 각막 기저세포층(basal epithelial cell layer), (c)는 각막 스트로마층, (d)는 각막 내피층에 투여된 염산목시플록사신이 X-Y 평면에서 형광 발현된 모습을 도시한 것이다. 여기서 노란색 실선은 스케일 바(scale bar)를 나타낸 것이며, 길이는 100 ㎛를 의미한다.
도 4의 (e)는 도 4의 (a)의 위치부터 (d)로 내려가면서 형광 발현된 각 각막의 위치들의 평균신호 그래프를 나타낸 것이며, X축은 depth로 표면에서부터 각막 내피층까지 깊이 방향의 신호의 세기를 나타낸 것이다. 즉, 0의 깊이(depth)는 각막 표면이며, 아래로 내려올수록, 각막 상피, 스트로마층, 각막 내피층을 의미한다.
도 4의 (a) ~ (d)에서 도시한 사진을 볼 때, 30.8 mW의 레이저 파워에서는 생체 조직 내 자가 형광 발현이 매우 약함을 알 수 있었고, 이때의 형광 신호의 크기는 도 4의 그래프 (e)에서 확인되는 것처럼 20 ~ 50 a.u.로 현저히 낮은 것을 알 수 있다.
도 5는 형광 발현된 마우스의 각막을 다광자 현미경으로 촬영한 사진이다. 여기서 도 5의 (a) 및 (g)는 각막 최표피 상피세포층(superficial epithelial cell layer), (b) 및 (h)는 각막 기저세포층(basal epithelial cell layer), (c) 및 (i)는 각막 스트로마층, (d) 및 (j)는 각막 내피층이 X-Y 평면에서 염산목시플록사신에 의해 형광 발현된 모습이다. 여기서 노란색 실선은 스케일 바(scale bar)를 나타낸 것이며, 길이는 100 ㎛ 를 의미한다.
도 5의 (a) ~ (d) 및 (g) ~ (j)에서 나타나는 형광색의 농도 차이를 볼 때, 각 각막 세포마다 플루오로퀴놀론 항생제(염산목시플록사신 및 가티플록사신)에 의한 형광 발현이 차이가 있음을 알 수 있다. 이러한 형광 발현 정도는, 플루오로퀴놀론 항생제가 각막 상피층에서부터 점안되어 각막 내부로 확산되어 들어가기 때문이며, 따라서 각막 표면인 도 4의 (a) 및 도 5의 (g) 최표피 상피세포층에서 형광 발현이 강하게 나타남이 확인된다.
도 5의 (e) 및 (k)는 염산목시플록사신으로 염색된 각막을 X-Z평면으로 포인트 스캐닝하여 촬영한 사진이다. 즉, Z축 맨 위는 각막 상피층이며, 아래로 내려올수록 각막 내피층을 나타낸다. 이 사진 또한 최표피 상피 세포층에서 형광 발현이 강하게 나타남이 확인된다.
도 5의 (f) 및 (l) 그래프에서 X축의 depth는 표면에서부터 각막 내피층까지 깊이 방향의 신호의 세기를 나타낸 것이다. 즉, 0의 깊이(depth)는 각막 표면이며, 그래프의 파란색 점선이 표시하는 깊이까지가 각막 상피 전체 층의 두께이며, 그 밑은 각각 스트로마층, 각막 내피층을 의미한다.
같은 30.8 mW의 레이저 파워 조건인 도 4 및 도 5의 (g) ~ (l)을 비교해 볼 때, 자가 형광 발현보다 가티플록사신을 투여했을 때의 형광 발현의 세기가 훨씬 큼을 알 수 있다. 또한, 염산목시플록사신의 경우에는 14.8 mW의 레이저 파워에서도, 30.8 mW로 측정되었던 마우스 각막의 자가 형광 발현 및 가티플록사신에 의한 형광 발현보다 신호의 세기가 큰 것으로 보아, 각막 내에 주입 시 형광 발현에 있어서 훨씬 뛰어난 효과가 있음을 알 수 있다.
또한, 도 5의 (f) 및 (l)의 그래프와 도 4의 (e)그래프를 비교해 볼 때, 가장 안쪽의 각막 내피층의 경우에도, 자가 형광 발현의 형광 세기보다 염산목시플록사신 및 가티플록사신을 투여했을 경우의 형광 세기가 높은 것을 알 수 있다. 이를 통해 조직 내 가장 안쪽의 세포층도, 염산목시플록사신 및 가티플록사신을 통한 형광 발현 신호로 확인할 수 있다는 것을 알 수 있다.
이하 실험예들은 가티플록사신보다 형광 발현이 뛰어난 염산목시플록사신만을 이용하여 실험을 진행하였다.
<실험예 2: 염산목시플록사신의 피부 세포 다광자 형광 측정>
1) 재료 및 시료 준비
5, 6주 된 Blab/c female mice, 염산목시플록사신, 포인트 스캐닝 방식으로 촬영될 2축 스캐너(x축 galvano 스캐너, y축 galvano 스캐너)를 포함하는 이광자 현미경, 스카치테이프, PBS를 준비했다.
이번 실험예에는 펨토초 레이저를 광원으로 이용한 이광자 현미경을 사용했으며, 실험 과정 내내 다음 조건에서 동일하게 측정하였다.
·Excitation wavelength: 780 nm for vigamox (moxifloxacin)
·Filter set: Ch01: < 490 nm, Ch02: >490 nm
·광원: Chameleon Ultra II, Coherent
·카메라: photomultiplier tube (PMT) H7421-40P, Hamamatsu Photonics
·대물렌즈: 20X 1.0NA objective lens, XLUMPlanFL, Olympus
·촬영영역: 300 μm x 300 μm (512 x 512 pixels)
2) 염산목시플록사신의 피부 세포 다광자 형광 측정
마우스의 피부 세포의 자가 형광 발현과 염산목시플록사신의 형광 발현을 비교하기 위해서, 염산목시플록사신을 도포하지 않은 마우스의 피부 세포 먼저 상기 이광자 현미경으로 촬영하였다. 마우스는 흡입마취를 통해 마우스가 살아있는 상태에서 피부(귀) 조직을 촬영하였다.
마우스의 피부조직의 염산목시플록사신의 형광 발현 촬영을 위해, 상기 같은 마우스의 귀 조직에 일반 스카치테이프를 이용하여 약 15회 정도 붙였다 떼는 것을 반복하며 각질층을 제거하고 비가목스를 발라주었다.
약 20분 정도 비가목스가 침투되도록 한 후 PBS를 이용하여 닦아내고(washing), 비가목스 사전 촬영과 마찬가지로 흡입 마취를 통해 마우스가 살아있는 상태에서 피부(귀) 조직을 다광자 현미경을 통해 포인트 스캐닝 방식으로 영상 촬영하였다.
도 6의 (a) ~ (d)는 염산목시플록사신 주입 전 마우스 귀 조직을 제일 바깥 쪽 상피 세포에서 진피 세포로 내려가며 촬영한 자가 형광 발현 사진을 도시한 것이며, 도 6의 (e) ~ (h)는 염산목시플록사신 주입 후 같은 위치의 귀 조직을 같은 방법으로 촬영한 형광 발현 사진이다. 이때 사용한 레이저의 파워는 염산목시플록사신을 주입 전에는 121 mW, 주입 후에는 17 mW 로 촬영되었다.
도 6의 (a) ~ (d), (e) ~ (h)의 형광 발현 정도를 살펴볼 때, 가장 바깥 쪽 상피 세포 부근에서 형광 발현이 뛰어나며, 진피세포로 내려갈수록 형광 신호의 세기가 약해짐을 알 수 있다.
또한, 도 6의 (e) ~ (h)와 각각 같은 위치의 도 6의 (a) ~ (d)와 비교해볼 때, 염산목시플록사신을 주입한 조직이 레이저 파워가 현저히 낮은 데도 불구하고 선명하게 촬영이 되었음을 알 수 있다. 특히, 가장 안쪽의 진피층인 도 6의 (d) 및 (h)를 비교해볼 때, 자가 형광 발현으로는 보이지 않던 세포들, 특히 나뭇가지 모양의 dendritic cell (Langerhans cell)들이 염산목시플록사신의 강한 세기의 형광 발현으로 뚜렷하게 관찰됨을 알 수 있었다.
<실험예 3: 염산목시플록사신의 방광 세포 다광자 형광 측정>
1) 재료 및 시료 준비
염산목시플록사신, Rat(normal), 비가목스 점안액(염산목시플록사신), 마취제, 온열기, 슬라이드 글라스, forcep, PBS, 다광자 형광 발현 정도를 측정하기 위해 포인트 스캐닝 방식으로 사용될 2축 스캐너(x축 galvano 스캐너, y축 galvano 스캐너)를 포함하는 이광자 현미경을 준비하였다.
이번 실험예에서 사용된 비가목스와 펨토초 레이저를 광원으로 이용한 이광자 현미경은, 실험 과정 내내 다음 사양 조건에서 측정하였다.
·Excitation wavelength: 780 nm for vigamox (moxifloxacin)
·Filter set: Ch01: < 490 nm, Ch02: >490 nm
·광원: Chameleon Ultra II, Coherent
·카메라: photomultiplier tube (PMT) H7421-40P, Hamamatsu Photonics
·대물렌즈: 20X 1.0NA objective lens, XLUMPlanFL, Olympus
·촬영영역: 300 μm x 300 μm (512 x 512 pixels)
2) 염산목시플록사신의 방광 세포 다광자 형광 측정
이하 도 7을 통해 방광 세포의 다광자 형광 측정의 실험과정을 설명한다.
Rat normal을 희생(sacrifice)시키고 방광(bladder) 조직을 적출하고, 적출한 조직을 비가목스(염산목시플록사신)에 20분 동안 담가두고, 배양(incubation)한다. 그리고 나서 방광 조직을 포셉으로 잡고, PBS에서 2 ~ 3번 정도 흔들어주면서 가볍게 워싱한다.
이후, 루멘이 노출되도록 조직 샘플을 슬라이드 글라스에 준비하고, 세포가 활성화 되어 있을 때 촬영을 완료할 수 있도록 비가목스가 처리된 지 30분 이내에 TPM 촬영을 한다.
이 때, 세포 안쪽인 루멘 조직과 세포 바깥쪽인 세로사 조직을 각각 한번 씩 촬영한다.
이 실험예도 마찬가지로 항생제가 침투하는 시간을 타임랩스로 촬영하여 확인한다. 상기 이광자 현미경을 통해 포인트 스캐닝 방식으로 방광을 형광 영상 촬영한다. 이번 실험에서는 방광조직의 내부는 15 mW, 외부는 10 mW의 레이저 파워가 사용되었다.
도 8은 염산목시플록사신을 주입한 마우스의 (a) 방광조직의 내부, (b) 방광조직의 외부를 이광자 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 8의 (a)의 방광조직의 내부를 보면, 혈관 벽을 따라 배열되어 있는 혈관 내피 세포들이 염색되어 관찰할 수 있음을 알 수 있었다.
도 8의 (b)의 방광조직 외부에서도, 사진 상부에서 가로로 두껍게 관찰되는 근육 및 근육 조직 사이에 존재하는 세포들도 관찰됨을 알 수 있다. 또한, 혈관의 내피 세포 및 그 주변에 분포하고 있는 세포들도 함께 염색되어 관찰되었음을 알 수 있었다.
<실험예 4: 염산목시플록사신의 박테리아 다광자 형광 측정>
1) 재료 및 시료 준비
실험에 사용될 박테리아(pseudomonas, staphylococcus), 염산목시플록사신, 포인트 스캐닝 방식으로 사용될 2축 스캐너(x축 galvano 스캐너, y축 galvano 스캐너)를 포함하는 이광자 현미경을 준비했다.
이번 실험예에는 펨토초 레이저를 광원으로 이용한 이광자 현미경을 사용했으며, 실험 과정 내내 다음 조건에서 동일하게 측정하였다.
·Excitation wavelength: 780 nm for vigamox(moxifloxacin)
·Filter set: Ch01:<430nm, Ch02:>430nm
·현미경 제조사/ 제품명: Leica/ TCS SP5II MP SMD FLIM
·필터: 500/25 bandpass filter, chroma
·광원: chameleon vision II, coherent
·카메라: photon multiplier tube (PMT) 6357, Hamamatsu Photonics
·대물렌즈: 25x 0.95NA objective lens, leica
2) 염산목시플록사신의 박테리아 다광자 형광 측정
도 9는 본 실험에서 사용된 박테리아 (a) 녹농균(pseudomonas) 및 (b) 포도상구균(staphylococcus)을 나타낸 것이다.
박테리아는 다음과 같은 조건에서 배양되었다.
가. 사용 medium
·녹농균(pseudomonas) - nutrient broth(영양 배지)
·포도상구균(staphylococcus) - lysogeny broth (LB 배지)
나. 배양과정
1. Bacteria stock을 medium 3 mL에 넣고 overnight incubation (37℃, 200 rpm) 한 후 배양 (culture) 했다.
2. 여기서 0.03 mL을 취해 fresh medium 3 mL에 넣고 OD600 = 1.5까지 배양 (37℃, 200 rpm)한다.
3. 고압/멸균 처리된 e-tube 2개에 1.0 mL씩 넣고, centrifugation (6,000 x g, 20 min, 4℃)을 이용하여 상층액(supernatant) 제거하고, sterile PBS로 다시 잘 섞어준다 (resuspension).
4. 이때 colony forming unit (CFU)는 PBS 0.1 mL로 resuspension(부유)한 뒤, serial dilution(계열 희석)을 하고 agar plate에 도말한다.
5. 그러면 그 때의 농도가 나오는데, 이를 이용하여 107 CFU/5 μL가 되게 하는 PBS 부피를 구할 수 있다.
다. 박테리아 (녹농균(pseudomonas), 포도상구균(staphylococcus))의 자가 형광 발현 및 염산목시플록사신의 형광 발현 실험
박테리아의 자가 형광 발현과 염산목시플록사신의 형광 발현을 비교하기 위해, 염산목시플록사신을 도포하지 않은 박테리아 (녹농균(pseudomonas), 포도상구균(staphylococcus))의 형광 발현 먼저 촬영하여 자가 형광 발현 세기를 기록하였다. 이어서 상기 배지에 염산목시플록사신을 주입하고 incubation time 후의 형광 발현 세기를 측정하였다.
도 10의 (a) 및 (c)는 각각 염산목시플록사신을 투여 하기 전 녹농균(pseudomonas) 및 포도상구균(staphylococcus)의 자가 형광 발현 사진이며, 도 10의 (b) 및 (d)는 각각 염산목시플록사신을 투여한 후의 형광 발현된 녹농균(pseudomonas) 및 포도상구균(staphylococcus)을 촬영한 것이다.
우선, 도 10의 (b) 및 (d)를 통해, 염산목시플록사신으로 녹농균(pseudomonas) 및 포도상구균(staphylococcus) 염색이 가능하였음을 알 수 있다.
또한, 도 10의 (a) 와 (b) 및 도10의 (c)와 (d)를 각각 비교하였을 때, 염산목시플록사신을 각 박테리아에 투여할 경우 자가 형광 신호보다 높은 세기의 형광 신호를 확인할 수 있다.
정확한 형광 발현에 대한 수치는 도 11에 도시된 그래프를 통해 확인할 수 있다. 녹농균(pseudomonas)의 경우, 염산목시플록사신을 투여하기 전의 수치는 9.5334 a.u, 후의 수치는 101.2196 a.u.로 약 10배 정도의 신호 세기의 차이가 나타나는 것을 알 수 있다. 포도상구균(staphylococcus)의 경우에도, 염산목시플록사신을 투여하기 전 수치는 10.4277 a.u., 후의 수치는 110.3189 a.u로 10배가 차이나는 것을 확인할 수 있다.
즉, 플루오로퀴놀론계 항생제들은 박테리아균의 염색이 가능하고, 이때 형광 발현의 세기가 자가 형광보다 10배 이상 강하며, 실험예 1 ~ 실험예 3에서 알 수 있었듯이 신체 조직 내 세포 조직의 염색이 가능하기 때문에, 체내 속에 박테리아균의 존재 여부를 상기 항생제의 투여만으로도 쉽게 파악할 수 있다는 것을 알 수 있다.
플루오로퀴놀론계 항생제는 임상적으로 사용할 수 있도록 판매되고 있는 항생제이기 때문에 쉽게 구할 수 있고, 데미지를 최소화하면서 세포를 관찰할 수 있는 장점이 있다. 이때, 관찰하고자 하는 조직을 적출 또는 세포의 배양 없이도, 살아있는 상태(in vivo)에서도 고속 영상 촬영(high-speed imaging)이 가능하다.
또한, 각막 이외에도 피부 및 방광 세포의 염색이 가능한 것으로 보아, 다양한 신체 조직의 세포 형광 염색체 및 세포의 검사법으로 활용이 가능하다.
플루오로퀴놀론계 항생제는 세포 내에서 자가 형광 신호보다 최소 10배 이상 형광 신호를 발현할 수 있기 때문에, 적은 수치의 레이저 파워를 사용하여도 생체 조직 내 세포를 관찰할 수 있고, 특히 혈관 내피의 세포 염색 뿐 아니라, 박테리아균의 형광 염색도 가능한 것으로 보아, 사람과 같은 진핵세포(eukaryote)로 이루어진 진균(fungus) 및 다양한 조직 및 세포의 감염 원인균 검사에 활용 가능하다.
특히, 세포를 적출하여 수일간 배양하는 기존의 감염 원인균 진단법보다 시간이 단축될 수 있어, 치료시기를 앞당길 수 있는 장점이 있다.
전술한 실험예들은 본 발명을 설명하기 위한 예시로서, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양하게 변형하여 본 발명을 실시하는 것이 가능할 것이므로, 본 발명의 기술적 보호범위는 첨부된 특허 청구 범위에 의해 정해져야 할 것이다.
Claims (8)
- 조직에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서,
조직을 준비하는 단계와;
상기 조직을 목시플록사신을 포함하는 플루오로퀴놀론계 항생제를 가하여 상기 조직 내 세포 영상 촬영이 가능하며 상기 플루오로퀴놀론계 항생제가 가시광선 영역의 형광을 발현하도록 염색하는 단계;및
상기 염색된 조직을 다광자 형광기반 광학영상을 통해 검사하는 단계;를 포함하는 정보를 제공하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 염색된 조직을 다광자 형광기반 광학영상을 통해 검사하는 단계;이후에,
상기 조직에 감염된 원인균을 확인하는 단계;
를 더 포함하는 정보를 제공하는 방법. - 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조직은,
각막, 피부 및 방광 세포 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 정보를 제공하는 방법. - 제2항에 있어서,
상기 조직에 감염된 원인균은,
녹농균, 포도상구균 및 진균 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 정보를 제공하는 방법. - 조직에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서,
조직을 준비하는 단계와;
상기 조직을 목시플록사신을 포함하는 플루오로퀴놀론계 항생제를 가하여 상기 조직 내 세포 영상 촬영이 가능하며 상기 플루오로퀴놀론계 항생제가 가시광선 영역의 형광을 발현하도록 염색하는 단계를 포함하는 정보를 제공하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 조직은,
각막, 피부 및 방광 세포 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 정보를 제공하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 조직을 목시플록사신을 포함하는 플루오로퀴놀론계 항생제를 가하여 염색하는 단계;에서는 상기 조직에 감염된 원인균도 염색되는 것을 특징으로 하는 정보를 제공하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 조직에 감염된 원인균은,
녹농균, 포도상구균 및 진균 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 정보를 제공하는 방법.
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B.-G. WANG et al, ‘Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its meritsin clinical research’, Journal of Microscopy, 2010, Vol.238, 1-20* |
Martin Wirtz et al, ‘Moxifloxacin penetration into human gastrointestinal tissues’, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2004, Vol.53, 875-877* |
V Vedantham et al, ‘Vitreous and aqueous penetration of orally administered moxifloxacin in humans’, Eye, 2006, Vol.20, 1273-1278* |
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