KR101864908B1 - 피리다지논, 그의 제조 방법 및 사용 방법 - Google Patents

피리다지논, 그의 제조 방법 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

Btk 키나제를 억제하기에 그리고 Btk 키나제에 의해 매개된 염증과 같은 면역 장애를 치료하기에 유용한 화학식 I의 피리돈 및 피라지논 화합물(그의 입체이성체, 호변이성체 및 약제학적으로 허용되는 염을 포함함). 포유류 세포에서의 그러한 장애, 또는 관련 병리학적 병태의 시험관내(in vitro), 동일계내(in situ) 및 생체내(in vivo) 진단 및 치료에 있어서의 화학식 I의 화합물의 사용 방법이 개시된다.
[화학식 I]

Description

피리다지논, 그의 제조 방법 및 사용 방법 {PYRIDAZINONES, METHOD OF MAKING, AND METHOD OF USE THEREOF}
관련 출원과의 상호 참조
37 CFR §1.53(b)에 따라서 출원된 이 정식 출원은 2010년 9월 1일자로 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/378,964호에 대하여 35 USC §19(e)에 따라서 이득을 주장하며, 이는 전체가 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명은 대체로 염증, 면역학적 장애 및 암을 포함한 브루톤 티로신 키나제(Bruton's Tyrosine Kinase, Btk)에 의해 매개된 장애를 치료하기 위한 화합물에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 Btk 활성을 억제하는 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유류 세포 또는 관련 병리학적 병태의 시험관내(in vitro), 동일계내(in situ) 및 생체내(in vivo) 진단 또는 치료에 있어서의 화합물의 사용 방법에 관한 것이다.
인간 효소의 가장 큰 족인 단백질 키나제는 500개가 훨씬 넘는 단백질을 포함한다. 브루톤 티로신 키나제(Btk)는 티로신 키나제의 Tec 족의 구성원이며, 초기 B-세포의 발생뿐만 아니라 성숙 B-세포의 활성화, 신호전달 및 생존의 조절인자이다.
B-세포 수용체(BCR)를 통한 B-세포 신호전달은 넓은 범위의 생물학적 결과를 유도할 수 있으며, 이러한 생물학적 결과는 결국 B-세포의 발생 단계에 의존한다. BCR 신호의 크기와 지속 기간은 정밀하게 조절되어야 한다. 비정상적인 BCR 매개 신호전달은 비조절된 B-세포 활성화를 야기하고/야기하거나, 다중 자가면역 및/또는 염증성 질환을 일으키는 병원성 자가항체의 형성을 야기할 수 있다. 인간에서 Btk의 돌연변이는 X 연관 무감마글로불린혈증(XLA)을 일으킨다. 이 질환은 B-세포의 손상된 성숙, 감소된 면역글로불린 생산, 약화된 T-세포 비의존성 면역 반응, 및 BCR 자극시 지속적인 칼슘 신호의 현저한 감쇠와 관련된다.
알러지성 장애 및/또는 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환에서 Btk의 역할에 대한 증거는 Btk 결핍 마우스 모델에서 확립되었다. 예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스(SLE)의 표준 뮤린 전임상 모델에서, Btk 결핍은 질환의 진행을 현저히 개선시키는 것으로 나타났다. 게다가, Btk 결핍 마우스는 또한 콜라겐-유도 관절염의 발병에 내성이 있을 수 있으며, 포도상구균 유도 관절염에 덜 민감할 수 있다.
증거의 대부분이 자가면역 및/또는 염증성 질환의 발병에서 B-세포 및 체액성 면역 체계의 역할을 지지한다. B-세포를 격감시키기 위해 개발된 단백질 기재 치료제(예컨대, 리툭산(Rituxan))는 수많은 자가면역 및/또는 염증성 질환의 치료에 대한 접근을 나타낸다. B-세포 활성화에서의 Btk의 역할로 인하여, Btk의 억제제는 B-세포 매개 병원성 활성(예컨대, 자가항체 생산)의 억제제로 유용할 수 있다.
Btk는 또한 파골세포, 비만 세포 및 단핵구에서 발현되며, 이들 세포의 기능에 중요한 것으로 밝혀진 바 있다. 예를 들어, 마우스에서 Btk 결핍은 손상된 IgE 매개 비만 세포 활성화(TNF-알파의 현저한 감소 및 기타 다른 염증성 사이토카인 방출)와 연관되며, 인간에서 Btk 결핍은 활성 단핵구에 의한 TNF-알파 생산을 크게 감소시키는 것과 연관된다.
따라서, Btk 활성의 억제는 알러지성 장애 및/또는 자가면역 및/또는 염증성 질환, 예컨대 SLE, 류마티스성 관절염, 다발성 혈관염, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 중증 근무력증, 알러지성 비염 및 천식의 치료에 유용할 수 있다. 추가로, Btk가 아폽토시스에서 역할을 하는 것으로 보고된 바 있으며, 따라서 Btk 활성의 억제는 암뿐만 아니라 B-세포 림프종 및 백혈병의 치료에도 유용할 수 있다. 게다가, 파골세포 기능에서의 Btk의 역할을 고려하면, Btk 활성의 억제는 골다공증과 같은 골 장애의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명은 대체로 브루톤 티로신 키나제(Btk) 조절 활성을 갖는 화학식 I의 화합물에 관한 것이다.
화학식 I의 화합물은 하기 구조를 가지며, 그의 입체이성체, 호변이성체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 다양한 치환체가 이하에 정의된다.
[화학식 I]
Figure 112013027357114-pct00001
본 발명의 일 태양은 화학식 I의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체, 활택제, 희석제 또는 부형제로 구성된 약제학적 조성물이다. 약제학적 조성물은 제2 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 태양은 화학식 I의 화합물을 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하는 것을 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법이다.
본 발명은 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물을 면역 장애, 암, 심혈관 질환, 바이러스 감염, 염증, 대사/내분비 기능 장애 및 신경학적 장애로부터 선택되고, 브루톤 티로신 키나제에 의해 매개된 질환 또는 장애를 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료 방법을 포함한다.
본 발명은 a) 화학식 I의 화합물을 포함하는 제1 약제학적 조성물; 및 b) 사용 설명서를 포함하는, 브루톤 티로신 키나제에 의해 매개된 병태를 치료하기 위한 키트를 포함한다.
본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 그리고 면역 장애, 암, 심혈관 질환, 바이러스 감염, 염증, 대사/내분비 기능 장애 및 신경학적 장애로부터 선택되고, 브루톤 티로신 키나제에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료함에 있어서 사용하기 위한 화학식 I의 화합물을 포함한다.
본 발명은 면역 장애, 암, 심혈관 질환, 바이러스 감염, 염증, 대사/내분비 기능 장애 및 신경학적 장애를 치료하기 위한, 브루톤 티로신 키나제를 매개하는 약제의 제조에 있어서의 화학식 I의 화합물의 용도를 포함한다.
본 발명은 화학식 I의 화합물의 제조 방법을 포함한다.
도 1은 화학식 I의 화합물(8)을 제조하기 위한 예시적인 합성 경로를 나타내는데, 이 경로는 바이사이클릭 피롤론(4)을 메틸 또는 하이드록시메틸 벤젠(5)과 커플링시켜 중간체(6)를 수득하기 위한 부흐발트 반응(Buchwald reaction)에 이어, 보로네이트(7)를 제조하고 이를 브로모-피리돈 또는 브로모-피라지논(2)과 커플링시키기 위한 연속적인 스즈키 반응(Suzuki reaction), 또는 6을 피리돈-보로네이트 또는 피라지논-보로네이트(3)와 커플링시키기 위한 단일 스즈키 반응을 수반한다. 브로모-피리돈 또는 브로모-피라지논(2)은 헤테로사이클릭 아민 또는 아닐린 화합물과의 디브로모-피리돈 또는 디브로모-피라지논의 부흐발트 반응에 의해 제조될 수 있다. 피리돈-보로네이트 또는 피라지논-보로네이트(3)는 디보로네이트와 2의 스즈키 반응에 의해 제조될 수 있다.
도 2는 화학식 I의 화합물(8)을 제조하기 위한 예시적인 합성 경로를 나타내는데, 이 경로는 바이사이클릭 피롤론을 브로모아닐린 유도체 상에 어셈블링하여 도 I에 기술된 역할에서 사용될 수 있는 브로마이드를 제공하는 것을 수반한다.
도 3은 화학식 I의 화합물(8)을 제조하기 위한 예시적인 합성 경로를 나타내는데, 이 경로는 바이사이클릭 피롤론을 이 분자의 나머지의 아미노 유도체(12) 상에 어셈블링하는 것을 수반한다.
이제, 본 발명의 임의의 실시 형태를 상세히 언급할 것인데, 그의 예가 구조 및 화학식을 수반하여 예시된다. 본 발명은 열거된 실시 형태와 함께 설명될 것이지만, 이들이 본 발명을 이러한 실시 형태로 한정하고자 하지 않음이 이해될 것이다. 반대로, 본 발명은 특허청구범위에 의해 한정된 본 발명의 범주 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 균등물을 포괄하고자 한다. 당업자는 본 명세서에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 많은 방법 및 재료를 인식할 것이며, 이는 본 발명의 실시에 있어 사용될 수 있을 것이다. 본 발명은 기술된 방법 및 재료로 어떤 식으로든 한정되지 않는다. 포함된 문헌, 특허 및 유사 자료 중 하나 이상이 본 출원 명세서(정의된 용어, 용어 사용, 설명된 기술 등을 포함하지만 이로 한정되지 않음)와 상이하거나 모순될 경우, 본 출원 명세서가 우선한다.
정의
본 명세서에 사용되는 용어 "알킬"은 1개 내지 12개의 탄소 원자(C1-C12)의 포화 직쇄 또는 분지쇄 1가 탄화수소 라디칼을 말하며, 여기서 알킬 라디칼은 독립적으로 하기에 기재된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 알킬 라디칼은 1개 내지 8개의 탄소 원자(C1-C8), 또는 1개 내지 6개의 탄소 원자(C1-C6)이다. 알킬 기의 예에는 메틸(Me, -CH3), 에틸(Et, -CH2CH3), 1-프로필(n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필(i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸(n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필(i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸(s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필(t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸(n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸(-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸(-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸(-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸(-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸(-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸(-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸(-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸(-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸(-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-디메틸-2-부틸(-CH(CH3)C(CH3)3, 1-헵틸, 1-옥틸 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 용어 "알킬렌"은 1개 내지 12개의 탄소 원자(C1-C12)의 포화 직쇄 또는 분지쇄 2가 탄화수소 라디칼을 말하며, 여기서 알킬렌 라디칼은 독립적으로 하기에 기재된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 알킬렌 라디칼은 1개 내지 8개의 탄소 원자(C1-C8), 또는 1개 내지 6개의 탄소 원자(C1-C6)이다. 알킬렌 기의 예에는 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(-CH2CH2-), 프로필렌(-CH2CH2CH2-) 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
용어 "카보사이클", "카보사이클릴", "카보사이클릭 고리" 및 "사이클로알킬"은 모노사이클릭 고리로서 3개 내지 12개의 탄소 원자(C3-C12)를 갖거나, 바이사이클릭 고리로서 7개 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 1가 비방향족 포화 또는 부분 불포화 고리를 말한다. 7개 내지 12개의 원자를 갖는 바이사이클릭 카보사이클은, 예를 들어 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로서 배열될 수 있으며, 9개 또는 10개의 고리 원자를 갖는 바이사이클릭 카보사이클은 바이사이클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로서 배열되거나, 바이사이클로[2.2.1]헵탄, 바이사이클로[2.2.2]옥탄 및 바이사이클로[3.2.2]노난과 같은 가교 시스템(bridged system)으로서 배열될 수 있다. 모노사이클릭 카보사이클의 예에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 1-사이클로펜트-1-에닐, 1-사이클로펜트-2-에닐, 1-사이클로펜트-3-에닐, 사이클로헥실, 1-사이클로헥스-1-에닐, 1-사이클로헥스-2-에닐, 1-사이클로헥스-3-에닐, 사이클로헥사디에닐, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐, 사이클로데실, 사이클로운데실, 사이클로도데실 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
"아릴"은 부모 방향족 고리 시스템의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 6개 내지 20개의 탄소 원자(C6-C20)의 1가 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 일부 아릴 기는 예시적인 구조에서 "Ar"로 나타낸다. 아릴에는 포화, 부분 불포화 고리, 또는 방향족 카보사이클릭 고리에 융합된 방향족 고리를 포함하는 바이사이클릭 라디칼이 포함된다. 통상적인 아릴 기에는 벤젠(페닐), 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 바이페닐, 인데닐, 인다닐, 1,2-디하이드로나프탈렌, 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸 등으로부터 유도된 라디칼이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 아릴 기는 독립적으로 본 명세서에 기재된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환된다.
"아릴렌"은 부모 방향족 고리 시스템의 2개의 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 6개 내지 20개의 탄소 원자(C6-C20)의 2가 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 일부 아릴렌 기는 예시적인 구조에서 "Ar"로 나타낸다. 아릴렌에는 포화, 부분 불포화 고리, 또는 방향족 카보사이클릭 고리에 융합된 방향족 고리를 포함하는 바이사이클릭 라디칼이 포함된다. 통상적인 아릴렌 기에는 벤젠(페닐렌), 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 바이페닐렌, 인데닐렌, 인다닐렌, 1,2-디하이드로나프탈렌, 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸 등으로부터 유도된 라디칼이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 아릴렌 기는 임의로 치환된다.
용어 "헤테로사이클", "헤테로사이클릴" 및 "헤테로사이클릭 고리"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 3개 내지 약 20개의 고리 원자를 갖되, 적어도 하나의 고리 원자는 질소, 산소, 인, 황 및 규소로부터 선택된 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자는 C인 포화 또는 부분 불포화(즉, 고리 내에 하나 이상의 이중 결합 및/또는 삼중 결합을 가짐) 카보사이클릭 라디칼을 말하며, 여기서 하나 이상의 고리 원자는 독립적으로 하기에 기재된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환된다. 헤테로사이클은 3개 내지 7개의 고리 구성원(2개 내지 6개의 탄소 원자, 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1개 내지 4개의 헤테로원자)을 갖는 모노사이클 또는 7개 내지 10개의 고리 구성원(4개 내지 9개의 탄소 원자, 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1개 내지 6개의 헤테로원자)을 갖는 바이사이클, 예를 들어 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다. 헤테로사이클은 문헌[Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), 특히 1장, 3장, 4장, 6장, 7장 및 9장; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 내지 현재), 특히 13권, 14권, 16권, 19권 및 28권; 및 J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566]에 기재되어 있다. "헤테로사이클릴"은 또한 헤테로사이클 라디칼이 포화, 부분 불포화 고리, 또는 방향족 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리와 융합된 라디칼을 포함한다. 헤테로사이클릭 고리의 예에는 모르폴린-4-일, 피페리딘-1-일, 피페리도닐, 옥소피페라지닐, 피페라지닐, 피페라진-4-일-2-온, 피페라진-4-일-3-온, 피롤리딘-1-일, 티오모르폴린-4-일, S-디옥소티오모르폴린-4-일, 아조칸-1-일, 아제티딘-1-일, 옥타하이드로피리도[1,2-a]피라진-2-일, [1,4]디아제판-1-일, 피롤리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 디하이드로푸라닐, 테트라하이드로티에닐, 테트라하이드로피라닐, 디하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 피페리디노, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 티옥사닐, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 호모피페리디닐, 옥세파닐, 티에파닐, 옥사제피닐, 디아제피닐, 티아제피닐, 2-피롤리닐, 3-피롤리닐, 인돌리닐, 2H-피라닐, 4H-피라닐, 디옥사닐, 1,3-디옥솔라닐, 피라졸리닐, 디티아닐, 디티올라닐, 디하이드로피라닐, 디하이드로티에닐, 디하이드로푸라닐, 피라졸리디닐이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 3-아자바이사이클로[3.1.0]헥사닐, 3-아자바이사이클로[4.1.0]헵타닐, 아자바이사이클로[2.2.2]헥사닐, 3H-인돌릴 퀴놀리지닐 및 N-피리딜 우레아가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 스피로 부분(spiro moiety)이 또한 이 정의의 범주 내에 포함된다. 2개의 고리 원자가 옥소(=O) 부분으로 치환된 헤테로사이클릭 기의 예는 피리미디노닐 및 1,1-디옥소-티오모르폴리닐이다. 본 명세서의 헤테로사이클 기는 독립적으로 본 명세서에 기재된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환된다.
용어 "헤테로아릴"은 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 함유하는 5원, 6원, 또는 7원 고리의 1가 방향족 라디칼을 말하며, 5개 내지 20개의 원자의 융합 고리 시스템(이 중 하나 이상은 방향족임)을 포함한다. 헤테로아릴 기의 예는 피리디닐(예를 들어, 2-하이드록시피리디닐을 포함함), 이미다졸릴, 이미다조피리디닐, 피리미디닐(예를 들어, 4-하이드록시피리미디닐을 포함함), 피라졸릴, 트리아졸릴, 피라지닐, 테트라졸릴, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 옥사디아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 신놀리닐, 인다졸릴, 인돌리지닐, 프탈라지닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 이소인돌릴, 프테리디닐, 푸리닐, 옥사디아졸릴, 트리아졸릴, 티아디아졸릴, 티아디아졸릴, 푸라자닐, 벤조푸라자닐, 벤조티오페닐, 벤조티아졸릴, 벤족사졸릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐 및 푸로피리디닐이다. 헤테로아릴 기는 독립적으로 본 명세서에 기재된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환된다.
헤테로사이클 또는 헤테로아릴 기는 가능한 경우 탄소 결합(탄소 연결) 또는 질소 결합(질소 연결)될 수 있다. 예로서 그리고 제한 없이, 탄소 결합된 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6, 피리다진의 위치 3, 4, 5, 또는 6, 피리미딘의 위치 2, 4, 5, 또는 6, 피라진의 위치 2, 3, 5, 또는 6, 푸란, 테트라하이드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라하이드로피롤의 위치 2, 3, 4, 또는 5, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4, 또는 5, 이속사졸, 피라졸, 또는 이소티아졸의 위치 3, 4, 또는 5, 아지리딘의 위치 2 또는 3, 아제티딘의 위치 2, 3, 또는 4, 퀴놀린의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 또는 이소퀴놀린의 위치 1, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8에서 결합된다.
예로서 그리고 제한 없이, 질소 결합된 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸의 위치 1, 이소인돌 또는 이소인돌린의 위치 2, 모르폴린의 위치 4, 및 카바졸 또는 β-카볼린의 위치 9에서 결합된다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료학적 치료를 말하는 것으로, 그의 목적은 원하지 않는 생리학적 변화 또는 장애, 예를 들어 관절염 또는 암의 발생 또는 전이를 늦추는(줄이는) 것이다. 본 발명의 목적을 위하여, 이롭거나 원하는 임상 결과에는, 검출가능하든 검출 불가능하든 어느 것이든지 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 고식, 및 관해(부분적으로든 전체적으로든 어느 것이든지)가 이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우의 예측된 생존과 비교하여 연장된 생존을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상에는 병태 또는 장애를 가진 대상이 포함된다.
어구 "치료학적 유효량"은 (i) 본 명세서에 기재된 특정 질환, 병태 또는 장애를 치료하거나, (ii) 특정 질환, 병태 또는 장애의 하나 이상의 증상을 감쇠, 개선, 또는 제거하거나, (iii) 특정 질환, 병태 또는 장애의 하나 이상의 증상의 발현을 예방 또는 지연시키는 본 발명의 화합물의 양을 의미한다. 암의 경우에, 약물의 치료학적 유효량은 암 세포의 개수를 감소시키고/감소시키거나; 종양 크기를 감소시키고/감소시키거나; 말초 기관 내로의 암 세포 침윤을 억제(즉, 어느 정도까지 감속, 및 바람직하게는 정지)하고/억제하거나; 종양 전이를 억제(즉, 어느 정도까지 감속, 및 바람직하게는 정지)하고/억제하거나; 종양 성장을 어느 정도까지 억제하고/억제하거나; 암과 관련된 증상 중 하나 이상을 어느 정도까지 완화시킬 수 있다. 약물이 성장을 예방하고/예방하거나 기존 암 세포를 사멸할 수 있는 한도에 있어서, 이는 세포증식억제성(cytostatic) 및/또는 세포독성(cytotoxic)일 수 있다. 암 치료의 경우, 효능은, 예를 들어 질환 진행까지의 시간(time to disease progression, TTP)을 평가하고/평가하거나 반응 속도(response rate, RR)를 결정함으로써 측정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "염증성 장애"는 과도하거나 비조절된 염증성 반응이 과도한 염증성 증상, 숙주 조직 손상, 또는 조직 기능의 손실로 이어지는 임의의 질환, 장애, 또는 증후군을 말할 수 있다. "염증성 장애"는 또한 백혈구의 유입(influx) 및/또는 호중구 주화성에 의해 매개된 병리학적 상태를 말한다.
본 명세서에 사용되는 "염증"은 조직의 상해 또는 파괴에 의해 유발된 국소화된 보호 반응을 말하는 것으로, 이는 상해성 물질(injurious agent) 및 상해된 조직 둘 모두를 파괴, 희석, 또는 벽으로 분할하는(wall off)(격리하는) 역할을 한다. 염증은 특히 백혈구의 유입 및/또는 호중구 주화성과 관련된다. 염증은 병원성 유기체 및 바이러스에 의한 감염으로부터, 그리고 심근 경색 또는 뇌졸중 후의 외상 또는 재관류, 외래 항원에 대한 면역 반응, 및 자가면역 반응과 같은 비감염성 수단으로부터 생길 수 있다. 따라서, 화학식 I의 화합물에 의한 치료에 적합한 염증성 장애는 특이적 방어 시스템의 반응과 관련된 장애뿐만 아니라 비특이적 방어 시스템의 반응과 관련된 장애도 포괄한다.
"특이적 방어 시스템"은 특이적 항원의 존재에 대해 반응하는 면역 시스템의 구성요소를 말한다. 특이적 방어 시스템의 반응으로부터 생기는 염증의 예에는 외래 항원에 대한 고전적인 반응, 자가면역 질환, 및 T-세포에 의해 매개된 지연형 과민성 반응이 포함된다. 만성 염증성 질환, 이식된 고형 조직 및 기관, 예를 들어 신장 및 골수 이식의 거부, 및 이식편 대 숙주 질환(GVHD)이 특이적 방어 시스템의 염증성 반응의 추가의 예이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "비특이적 방어 시스템"은 면역학적 기억이 불가능한 백혈구(예를 들어, 과립구 및 대식세포)에 의해 매개되는 염증성 장애를 말한다. 비특이적 방어 시스템의 반응으로부터 적어도 일부 생기는 염증의 예에는 성인(급성) 호흡 곤란 증후군(ARDS) 또는 다발성 기관 상해 증후군; 재관류 상해; 급성 사구체신염; 반응성 관절염; 급성 염증성 구성요소를 갖는 피부병; 급성 화농성 수막염 또는 기타 다른 중추 신경계 염증성 장애, 예컨대 뇌졸중; 열상; 염증성 장질환; 과립구 수혈 관련 증후군; 및 사이토카인 유도 독성과 같은 병태와 관련된 염증이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 "자가면역 질환"은 조직 상해가 신체 자체의 성분에 대한 체액성 또는 세포 매개 반응과 관련된 장애의 임의의 군을 말한다.
본 명세서에 사용되는 "알러지성 질환"은 알러지로부터 생기는 임의의 증상, 조직 손상, 또는 조직 기능의 손실을 말한다. 본 명세서에 사용되는 "관절염성 질환"은 다양한 병인에 기인되는 관절의 염증성 병변에 의해 특징지어지는 임의의 질환을 말한다. 본 명세서에 사용되는 "피부염"은 다양한 병인에 기인되는 피부의 염증에 의해 특징지어지는 피부의 질환의 큰 족 중 임의의 것을 말한다. 본 명세서에 사용되는 "이식 거부"는 이식 조직 및 주위 조직의 기능 손실, 통증, 종창, 백혈구증가증 및 혈소판감소증에 의해 특징지어지는, 이식 조직, 예컨대 기관 또는 세포(예를 들어, 골수)에 대한 임의의 면역 반응을 말한다. 본 발명의 치료학적 방법은 염증성 세포 활성화와 관련된 장애의 치료 방법을 포함한다.
"염증성 세포 활성화"는 증식성 세포성 반응의 자극물질(사이토카인, 항원 또는 자가항체를 포함하지만 이로 한정되지 않음), 가용성 매개체(사이토카인, 산소 라디칼, 효소, 프로스타노이드, 또는 혈관활성 아민을 포함하지만 이로 한정되지 않음)의 생산, 또는 염증성 세포(단핵구, 대식세포, T 림프구, B 림프구, 과립구(즉, 다형핵 백혈구, 예컨대 호중구, 호염기구 및 호산구), 비만 세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포 및 내피 세포를 포함하지만 이로 한정되지 않음)에서 새로운 또는 증가된 개수의 매개체(주요 조직적합성 항원 또는 세포 접착 분자를 포함하지만 이로 한정되지 않음)의 세포 표면 발현에 의한 유도를 말한다. 이들 세포에서의 이들 표현형 중 하나 또는 조합의 활성화가 염증성 장애의 개시, 영구화, 또는 악화에 기여할 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
용어 "NSAID"는 "비스테로이드성 항염증 약물(non-steroidal anti-inflammatory drug)"의 두문자이며, 진통, 해열(상승된 체온을 낮추고, 의식 손상 없이 통증을 완화시킴), 및 더 높은 용량에서는 항염증 효과(염증 감소)를 갖는 치료제이다. 용어 "비스테로이드성"은 이들 약물을 스테로이드와 구별하기 위해 사용되는데, 스테로이드는 (넓은 범위의 기타 다른 효과 중에서) 유사한 에이코사노이드 억제 항염증 작용을 갖는 것이다. 진통제로서, NSAID는 이들이 비마약성이라는 점에서 통상적이지 않다. NSAID는 아스피린, 이부프로펜 및 나프록센을 포함한다. NSAID는 통증 및 염증이 존재하는 급성 또는 만성 병태의 치료에 통상적으로 권고된다. NSAID는 일반적으로 류마티스성 관절염, 골관절염, 염증성 관절병증(예를 들어, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 라이터 증후군, 급성 통풍, 월경곤란증, 전이성 골 통증, 두통 및 편두통, 수술후 통증, 염증 및 조직 상해로 인한 경도 내지 중등도 통증, 발열(pyrexia), 장폐색증 및 신산통의 병태의 증상 완화에 권고된다:. 대부분의 NSAID는 효소 사이클로옥시게나제의 비선택적 억제제로서 작용하여, 사이클로옥시게나제-1(COX-1) 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 동종효소 둘 모두를 억제한다. 사이클로옥시게나제는 아라키돈산(그 자체는 포스포리파제 A2에 의해 세포 인지질 이중층으로부터 유도됨)으로부터 프로스타글란딘 및 트롬복산의 형성을 촉매한다. 프로스타글란딘은 (특히) 염증의 과정에서 메신저 분자로서 작용한다. COX-2 억제제에는 셀레콕시브, 에토리콕시브, 루미라콕시브, 파레콕시브, 로페콕시브, 로페콕시브 및 발데콕시브가 포함된다.
용어 "암"은 통상적으로 비조절된 세포 성장에 의해 특징지어지는 포유류에서의 생리학적 병태를 말하거나 기술한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성 종양이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 그러한 암의 더 특정한 예에는 편평 세포 암(예를 들어, 상피성 편평 세포 암), 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암("NSCLC"), 폐의 선암종 및 폐의 편평 세포 암종을 포함한 폐암, 복막의 암, 간세포성 암, 위장암을 포함한 위암(gastric cancer, stomach cancer), 췌장암, 교모세포종, 경부암, 난소암, 간암(liver cancer), 방광암, 간암(hepatoma), 유방암, 결장암, 직장암, 결직장암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암(kidney cancer, renal cancer), 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종뿐만 아니라 두경부암도 포함된다.
"화학치료제"는 작용 기전에 관계없이 암의 치료에 있어서 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 부류에는 알킬화제, 항대사제, 방추체 저해제(spindle poison) 식물 알칼로이드, 세포독성/항종양 항생제, 토포이소머라제 억제제, 항체, 감광제 및 키나제 억제제가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 화학치료제에는 "표적 요법" 및 종래의 화학요법에 사용되는 화합물이 포함된다. 화학치료제의 예에는 에를로티니브(TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), 도세탁셀(TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU(플루오로우라실, 5-플루오로우라실, CAS No. 51-21-8), 젬시타빈(GEMZAR®, Lilly), PD-0325901(CAS No. 391210-10-9, Pfizer), 시스플라틴(시스-디아민, 디클로로백금(II), CAS No. 15663-27-1), 카보플라틴(CAS No. 41575-94-4), 파클리탁셀(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스턴 소재), 트라스투주맙(HERCEPTIN®, Genentech), 테모졸로미드(4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜트아자바이사이클로 [4.3.0] 노나-2,7,9-트리엔-9-카복스아미드, CAS No. 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), 타목시펜((Z)-2-[4-(1,2-디페닐부트-1-에닐)페녹시]-N,N-디메틸에탄아민, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®), 및 독소루비신(ADRIAMYCIN®), Akti-1/2, HPPD, 및 라파마이신이 포함된다.
화학치료제의 추가의 예에는 옥살리플라틴(ELOXATIN®, Sanofi), 보르테조미브(VELCADE®, Millennium Pharm.), 수텐트(SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), 레트로졸(FEMARA®, Novartis), 이마티니브 메실레이트(GLEEVEC®, Novartis), XL-518(Mek 억제제, Exelixis, 국제 특허 공개 WO 제2007/044515호), ARRY-886(Mek 억제제, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126(PI3K 억제제, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235(PI3K 억제제, Novartis), XL-147(PI3K 억제제, Exelixis), PTK787/ZK 222584(Novartis), 풀베스트란트(FASLODEX®, AstraZeneca), 류코보린(폴린산), 라파마이신(시롤리무스, RAPAMUNE®, Wyeth), 라파티니브(TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), 로나파르니브(SARASARTM, SCH 66336, Schering Plough), 소라페니브(NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), 제피티니브(IRESSA®, AstraZeneca), 이리노테칸(CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), 티피파르니브(ZARNESTRATM, Johnson & Johnson), ABRAXANETM(크레모포어 무함유), 파클리탁셀의 알부민이 조작된 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, 미국 일리노이주 샴버그 소재), 반데타니브(rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), 클로람부실, AG1478, AG1571(SU 5271; Sugen), 템시롤리무스(TORISEL®, Wyeth), 파조파니브(GlaxoSmithKline), 칸포스파미드(TELCYTA®, Telik), 티오테파 및 사이클로스포스파미드(CYTOXAN®, NEOSAR®; 알킬 설포네이프, 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카보큐온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민(알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포아미드, 트리에틸렌티오포스포아미드 및 트리메틸로멜라민을 포함함); 아세토제닌스(특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함함); 크립토피신(특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라머스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 염산염, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니머스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소 우레아, 예를 들어 카르머스틴, 클로로조토신, 포테머스틴, 로머스틴, 니머스틴 및 라님너스틴; 항생제, 예를 들어 엔디인(enediyne) 항생제(예를 들어, 칼리키아마이신, 칼리키아마이신 감마 1I, 칼리키아마이신 오메가I1(문헌[Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186]); 다인마이신, 다인마이신 A; 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소 단백질 엔디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 네모루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 푸로마이신, 큐엘라마이신, 루도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미푸린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제(anti-adrenal), 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지큐온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK® 다당류 복합체(JHS Natural Products, 미국 오레곤주 유진 소재); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지큐온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노머스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈(NAVELBINE®; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 카페시타빈(XELODA®, Roche); 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 및 유도체가 포함된다.
"화학치료제"의 정의에는 또한, (i) 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하도록 작용하는 항호르몬제, 예를 들어 항에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM)(예를 들어, 타목시펜(NOLVADEX®; 타목시펜 시트레이트를 포함함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 FARESTON®(토레미핀 시트레이트)를 포함함); (ii) 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE®(메게스트롤 아세테이트), AROMASIN®(엑세메스탄; Pfizer), 포르메스탄, 파드로졸, RIVISOR®(보로졸), FEMARA®(레트로졸; Novartis) 및 ARIMIDEX®(아나스트로졸; AstraZeneca); (iii) 항안드로겐제, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 사이토신 유사체); (iv) 단백질 키나제 억제제, 예를 들어 MEK 억제제(국제 특허 공개 WO 제2007/044515호); (v) 지질 키나제 억제제; (vi) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식에 관여하는 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것들, 예를 들어 PKC-알파, Raf 및 H-Ras, 예컨대 오블리머센(GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) 리보자임, 예를 들어 VEGF 발현 억제제(예를 들어, ANGIOZYME®) 및 HER2 발현 억제제; (viii) 백신, 예를 들어 유전자 치료 백신(예를 들어, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® 및 VAXID®); PROLEUKIN® rIL-2; 토포이소머라제 1 억제제, 예를 들어 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) 항혈관형성제, 예를 들어 베바시주맙(AVASTIN®, Genentech); 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 및 유도체가 포함된다.
"화학치료제"의 정의에는 또한 알렘투주맙(Campath), 베바시주맙(AVASTIN®, Genentech); 세툭시맙(ERBITUX®, Imclone); 파니투무맙(VECTIBIX®, Amgen), 리툭시맙(RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), 퍼투주맙(OMNITARGTM, 2C4, Genentech), 트라스투주맙(HERCEPTIN®, Genentech), 토시투모맙(Bexxar, Corixia), 및 항체 약물 접합체, 젬투주맙 오조가마이신(MYLOTARG®, Wyeth)과 같은 치료 항체가 포함된다.
본 발명의 Btk 억제제와 병용하여 화학치료제로서 치료 가능성을 갖는 인간화 단일클론 항체에는 알렘투주맙, 아폴리주맙, 아셀리주맙, 아틀리주맙, 바피뉴주맙, 베바시주맙, 비바투주맙 머탄신, 칸투주맙 머탄신, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 시드푸시투주맙, 시드투주맙, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 에를리주맙, 펠비주맙, 폰톨리주맙, 젬투주맙 오조가마이신, 이노투주맙 오조가마이신, 이필리무맙, 라베투주맙, 린투주맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 모타비주맙, 모토비주맙, 나탈리주맙, 니모투주맙, 놀로비주맙, 누마비주맙, 오크렐리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파스콜리주맙, 펙푸시투주맙, 펙투주맙, 퍼투주맙, 펙셀리주맙, 랄리비주맙, 라니비주맙, 레슬리비주맙, 레슬리주맙, 레시비주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 시브로투주맙, 시플리주맙, 손투주맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 테피바주맙, 토실리주맙, 토랄리주맙, 트라스투주맙, 투코투주맙 셀모류킨, 투쿠시투주맙, 우마비주맙, 우르톡사주맙 및 비실리주맙이 포함된다.
"대사물질(metabolite)"은 명시된 화합물 또는 그의 염의 체내 대사를 통해 생산된 산물이다. 화합물의 대사물질은 당업계에 공지된 일상 기술을 사용하여 확인될 수 있으며, 이들의 활성은 본 명세서에 기재된 것들과 같은 시험을 사용하여 결정될 수 있다. 그러한 산물은, 예를 들어 투여된 화합물의 산화, 환원, 가수분해, 아미드화, 탈아미드화, 에스테르화, 탈에스테르화, 효소 절단 등으로부터 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물의 대사물질을 포함하며, 이러한 대사물질에는 본 발명의 화학식 I의 화합물을 그의 대사 산물을 수득하기에 충분한 기간 동안 포유류와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 생성된 화합물이 포함된다.
용어 "포장 삽입물(package insert)"은 치료 제품의 시판 포장 내에 관례적으로 포함되는 설명서를 말하는 데 사용되는데, 이러한 설명서는 그러한 치료 제품의 사용에 관한 지시, 용법, 투약량, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 수록한다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너의 비겹침성(non-superimposability)의 특성을 갖는 분자를 말하며, 용어 "아키랄(achiral)"은 거울상 파트너에 대해 겹쳐질 수 있는 분자를 말한다.
용어 "입체이성체"는 동일한 화학 구성을 갖지만, 공간 내의 원자 또는 기(group)의 배열에 관하여 상이한 화합물을 말한다.
"부분입체 이성체"는 2개 이상의 키랄성 중심을 가지며 분자들이 서로의 거울상이 아닌 입체이성체를 말한다. 부분입체 이성체는 상이한 물리적 특성(예를 들어, 융점, 비점, 스펙트럼 특성 및 반응성)을 갖는다. 부분입체 이성체의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피와 같은 고분해능 분석 절차 하에서 분리될 수 있다.
"거울상 이성체"는 화합물의 서로 겹쳐질 수 없는 거울상인 2개의 입체이성체를 말한다.
본 명세서에서 사용된 입체화학 정의 및 규약은 일반적으로 문헌[S. P. Parker, Ed., McGraw - Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York]; 및 [Eliel, E. 및 Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994]을 따른다. 본 발명의 화합물은 비대칭 또는 키랄 중심을 함유할 수 있으며, 따라서 상이한 입체이성체 형태로 존재할 수 있다. 부분입체 이성체, 거울상 이성체 및 아트로프이성체뿐만 아니라 이들의 혼합물, 예를 들어 라세미 혼합물을 포함하지만 이로 한정되지 않는 본 발명의 화합물의 모든 입체이성체 형태는 본 발명의 일부를 형성하는 것으로 의도된다. 많은 유기 화합물은 광학적으로 활성인 형태로 존재하며, 즉 이들은 평면 편광의 평면을 회전시킬 수 있는 능력을 갖는다. 광학적으로 활성인 화합물을 기술할 때, 접두사 D와 L 또는 R과 S는 키랄 중심(들) 주위에서의 분자의 절대 배치를 나타내는 데 사용된다. 접두사 d와 l 또는 (+)와 (-)는 화합물에 의한 평면 편광의 회전의 기호를 지정하는 데 사용되는데, 이때 (-) 또는 1은 화합물이 좌선성임을 의미한다. 접두사 (+) 또는 d를 갖는 화합물은 우선성이다. 주어진 화학 구조에 있어서, 이들 입체이성체는 이들이 서로 거울상인 것을 제외하고는 동일하다. 특정 입체이성체는 또한 거울상 이성체로서 지칭될 수 있으며, 그러한 이성체의 혼합물은 흔히 거울상 이성체 혼합물이라 불린다. 거울상 이성체의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세미체로서 지칭되는데, 이는 화학 반응 또는 과정에서 입체선택(stereoselection) 또는 입체특이성(stereospecificity)이 없는 경우에 일어날 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세미체"는 광학 활성이 없는, 2개의 거울상 이성체 종의 등몰 혼합물을 말한다. 일 태양에서, 본 발명의 입체이성체는 우세한 형태로, 예를 들어 50% ee(enantiomeric excess, 거울상 이성체 과잉률) 초과, 80% ee 초과, 90% ee 초과, 95% ee 초과, 또는 99% ee 초과로 존재할 수 있다.
용어 "호변이성체" 또는 "호변이성체 형태"는 낮은 에너지 장벽을 통해 상호변환될 수 있는 상이한 에너지의 구조 이성체를 말한다. 예를 들어, 양성자 호변이성체(또한 양성자성 호변이성체로도 알려짐)는 양성자의 이동을 통한 상호변환, 예를 들어 케토-엔올 및 이민-엔아민 이성체화를 포함한다. 원자가 호변이성체는 결합 전자 중 일부의 재편성에 의한 상호변환을 포함한다.
용어 "부분입체 이성체"는 거울상 이성체가 아닌 입체이성체 분자를 말한다. 부분입체 이성체에는 동일한 분자식을 갖지만 상이한 기하 구조를 갖는 시스-트랜스 이성체 및 입체형태 이성체가 포함된다.
본 명세서에 사용되는 어구 "약제학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용되는 유기 또는 무기 염을 말한다. 예시적인 염에는 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트 "메실레이트", 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌-비스(2-하이드록시-3-나프토에이트)) 염이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 약제학적으로 허용되는 염은 아세테이트 이온, 석시네이트 이온 또는 기타 다른 반대 이온과 같은 다른 분자의 함유를 포함할 수 있다. 반대 이온은 부모 화합물 상의 전하를 안정화하는 임의의 유기 또는 무기 부분일 수 있다. 더욱이, 약제학적으로 허용되는 염은 그의 구조 내에 하나 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 약제학적으로 허용되는 염의 일부인 경우는 다수의 반대 이온을 가질 수 있다. 따라서, 약제학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대 이온을 가질 수 있다.
본 발명의 화합물이 염기일 경우, 원하는 약제학적으로 허용되는 염은 당업계에서 이용가능한 임의의 적합한 방법, 예를 들어 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 메탄설폰산, 인산 등에 의한, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레산, 석신산, 만델산, 푸마르산, 말론산, 피루브산, 옥살산, 글리콜산, 살리실산, 피라노시딜산(예: 글루쿠론산 또는 갈락투론산), 알파 하이드록시산(예: 시트르산 또는 타르타르산), 아미노산(예: 아스파르트산 또는 글루탐산), 방향족 산(예: 벤조산 또는 신남산), 설폰산(예: p-톨루엔설폰산 또는 에탄설폰산) 등에 의한 유리 염기의 처리에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물이 산일 경우, 원하는 약제학적으로 허용되는 염은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 무기 또는 유기 염기, 예컨대 아민(1차, 2차 또는 3차), 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 등에 의한 유리 산의 처리에 의해 제조될 수 있다. 적합한 염의 예시적인 예에는 아미노산, 예컨대 글리신 및 아르기닌, 암모니아, 1차, 2차 및 3차 아민, 및 사이클릭 아민, 예컨대 피페리딘, 모르폴린 및 피페라진으로부터 유도된 유기 염, 및 나트륨, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 망간, 철, 구리, 아연, 알루미늄 및 리튬으로부터 유도된 무기 염이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
어구 "약제학적으로 허용되는"은 그 물질 또는 조성물이, 제형을 구성하는 기타 다른 성분들 및/또는 이에 의해 치료되는 포유류와 화학적으로 및/또는 독물학적으로 상용성(compatible)이어야 함을 나타낸다.
"용매화물"은 하나 이상의 용매 분자와 본 발명의 화합물의 회합체(association) 또는 복합체(complex)를 말한다. 용매화물을 형성하는 용매의 예에는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸아세테이트, 아세트산 및 에탄올아민이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
용어 "본 발명의 화합물" 및 "본 발명의 화합물들"은 화학식 I의 화합물 및 그의 입체이성체, 호변이성체, 용매화물, 대사물질, 및 약제학적으로 허용되는 염 및 전구약물을 포함한다.
화학식 I의 화합물을 포함한 본 명세서에 제공된 임의의 화학식 또는 구조는 또한 그러한 화합물의 수화물, 용매화물 및 다형체, 및 이들의 혼합물을 나타내고자 한다.
화학식 I의 화합물을 포함한 본 명세서에 제공된 임의의 화학식 또는 구조는 또한 이들 화합물의 비표지 형태뿐만 아니라 동위원소 표지 형태를 나타내고자 한다. 동위원소 표지 화합물은 하나 이상의 원자가 선택된 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자에 의해 대체된 것을 제외하고는 본 명세서에 제공된 화학식으로 나타낸 구조를 갖는다. 본 발명의 화합물 내로 혼입될 수 있는 동위원소의 예에는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 불소 및 염소의 동위원소, 예를 들어 이로 한정되지는 않지만 2H(중수소, D), 3H(삼중수소), 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 36Cl 및 125I가 포함된다. 본 발명의 다양한 동위원소 표지 화합물, 예를 들어 방사성 동위원소, 예컨대 3H, 13C 및 14C가 혼입된 것들. 그러한 동원원소 표지 화합물은 대사 연구, 반응 속도론 연구, 검출 또는 영상화 기술, 예컨대 양전자 방출 단층촬영(PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)(약물 또는 기질 조직 분포 검정을 포함함)에, 또는 환자의 방사능 치료에 유용할 수 있다. 중수소로 표지 또는 치환된 본 발명의 치료 화합물은 분포, 대사 및 배출(ADME)에 관한 개선된 DMPK(drug metabolism and pharmacokinetics, 약물 대사 및 약동학) 특성을 가질 수 있다. 중수소와 같은 더 무거운 동위원소에 의한 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들어 증가된 생체내 반수명 또는 감소된 용량 요건으로부터 얻어지는 임의의 치료적 이점을 제공할 수 있다. 18F 표지 화합물이 PET 또는 SPECT 연구에 유용할 수 있다. 본 발명의 동위원소 표지 화합물 및 그의 전구약물은 일반적으로 용이하게 입수가능한 동위원소 표지 시약을 동위원소 비표지 시약 대신 사용하여 하기에 기재된 반응식 또는 실시예 및 제조에 개시된 절차를 수행함으로써 제조될 수 있다. 또한, 더 무거운 동위원소, 특히 중수소(즉, 2H 또는 D)에 의한 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들어 증가된 생체내 반수명 또는 감소된 용량 요건 또는 치료 지수(therapeutic index)의 개선으로부터 얻어지는 임의의 치료적 이점을 제공할 수 있다. 이 문맥에서 중수소는 화학식 I의 화합물에서의 치환체로서 간주되는 것으로 이해된다. 그러한 더 무거운 동위원소, 특히 중수소의 농도는 동위원소 농축 계수에 의해 한정될 수 있다. 본 발명의 화합물에서, 특정 동위원소로 구체적으로 지정되지 않은 임의의 원자는 그 원자의 임의의 안정적인 동위원소를 나타내는 것으로 의미된다. 달리 언급되지 않는 한, 위치가 "H" 또는 "수소"로 구체적으로 지정될 때, 그 위치는 그의 자연 존재비 동위원소 조성에서 수소를 갖는 것으로 이해된다. 따라서 본 발명의 화합물에서, 중수소(D)로 구체적으로 지정된 임의의 원자는 중수소를 나타내는 것으로 의미된다.
피리다지논 화합물
본 발명은 Btk 키나제에 의해 조절되는 질환, 병태 및/또는 장애의 치료에 있어서 잠재적으로 유용한, 화학식 I의 피리다지논 화합물 및 그의 약제학적 제형을 제공한다.
화학식 I의 화합물은 하기 구조를 가지고, 그의 입체이성체, 호변이성체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며,
[화학식 I]
Figure 112013027357114-pct00002
상기 화학식 I에서,
R1은
Figure 112013027357114-pct00003
로부터 선택되고, 여기서 물결선은 부착 부위를 나타내며;
R4는 OH, CN, NRbRc, C1-C6 알킬 또는 C1-C4　할로알킬로 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬, 및 OH 또는 OC1-C4　알킬로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
R2는 H, CH3 또는 CF3이며;
고리 B는 페닐, 적어도 하나의 질소 고리 원자를 갖는 5원 내지 6원 헤테로아릴, 및 적어도 하나의 질소 고리 원자를 갖는 8원 내지 11원 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
R3은 독립적으로 H, -Ra, -ORb, -SRb, -NRbRc, 할로, 시아노, 니트로, -CORb, -CO2Rb, -CONRbRc, -OCORb, -OCO2Ra, -OCONRbRc, -NRcCORb, -NRcCO2Ra, -NRcCONRbRc, -CO2Rb, -CONRbRc, -NRcCORb, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRbRc 및 -NRcSO2Ra로부터 선택되거나, 또는 2개의 인접한 R3 기는 임의로 함께 취하여져, O, S 또는 N으로부터 선택된 0개 내지 2개의 헤테로원자를 갖는 5원 내지 6원 고리를 형성하며, 여기서 상기 5원 내지 6원 고리는 고리 B에 융합되고;
Ra는 C1-C6　알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 여기서 Ra의 각각의 구성원은 1개 내지 3개의 R11 기로 임의로 치환되고;
Rb는 H, C1-C6　알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 여기서 H를 제외한 Rb의 각각의 구성원은 1개 내지 3개의 R11 기로 임의로 치환되고;
Rc는 H 또는 1개 내지 3개의 R11 기로 임의로 치환된 C1-C4　알킬이거나, 또는 Rb 및 Rc와 이들이 부착되어 있는 질소가 임의로 치환된 헤테로사이클로알킬 기를 형성하며;
각각의 R11은 독립적으로 C1-C4　알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴-C1-C4　알킬-, 헤테로아릴-C1-C4　알킬-, 사이클로알킬-C1-C4　알킬-, 헤테로사이클로알킬-C1-C4　알킬-, C1-C4　할로알킬-, -OC1-C4　알킬, -O-헤테로사이클로알킬, -OC1-C4　알킬페닐, -C1-C4　알킬-OH, -OC1-C4　할로알킬, 할로, -OH, -NH2, -C1-C4　알킬-NH2, -NH(C1-C4　알킬), -N(C1-C4　알킬)(C1-C4　알킬), -N(C1-C4　알킬)(C1-C4　알킬페닐), -NH(C1-C4　알킬페닐), 시아노, 니트로, 옥소, -CO2H, -C(O)OC1-C4　알킬, -CON(C1-C4　알킬)(C1-C4　알킬), -CONH(C1-C4　알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C4　알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C4　알킬)C(O)(C1-C4　알킬), -N(C1-C4　알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C4　알킬, -C(O)C1-C4　페닐, -C(O)C1-C4　할로알킬, -OC(O)C1-C4　알킬, -SO2(C1-C4　알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C4　할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4　알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C4　알킬), -NHSO2(페닐) 및 -NHSO2(C1-C4　할로알킬)로부터 선택되고;
R5는 H 또는 F이며;
R6은 H, CH3, F, Cl, CN, OCH3, OH, 또는 OH, OCH3 또는 하나 이상의 할로 기로 치환된 메틸이고;
R7은 H, CH3, F, Cl, CN 또는 OCH3이며;
R8은 H, CH3, CF3, F, Cl, CN 또는 OCH3이고;
각각의 R9는 독립적으로 C1-C3 알킬이며;
각각의 R10은 독립적으로 H 또는 CH3이다.
화학식 I의 화합물의 예시적인 실시 형태는 R2가 H 또는 CH3인 것을 포함한다.
화학식 I의 화합물의 예시적인 실시 형태는 R3이
Figure 112013027357114-pct00004
이며, 여기서 물결선은 부착 부위를 나타내는 것을 포함한다.
화학식 I의 화합물의 예시적인 실시 형태는 R3이 사이클로프로필, 아제티디닐, 아제티디닐메틸, 피페리디닐, 옥소피페리디닐, 피페라지닐 및 옥소피페라지닐(이들은 F, CH3 또는 COCH3로 임의로 치환됨)로부터 선택되는 것을 포함한다.
화학식 I의 화합물의 예시적인 실시 형태는 R4가 H, t-부틸, N-피롤리디닐, N-피페리디닐, N-아제파닐, 2-하이드록시-2-메틸프로필, 프로프-1-엔-2-일, -N(CH3)Et, i-프로필, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 3-메틸부탄-2-일, -N(CH3)(i-Pr), 또는 -NH(사이클로프로필)인 것을 포함한다.
화학식 I의 화합물의 예시적인 실시 형태는 R5가 H 또는 F인 것을 포함한다.
화학식 I의 화합물의 예시적인 실시 형태는 R6이 H, CH3, F, 또는 CH2OH인 것을 포함한다.
화학식 I의 화합물의 예시적인 실시 형태는 R7이 H 또는 F인 것을 포함한다.
화학식 I의 화합물의 예시적인 실시 형태는 B가 피라졸로[1,5-a]피라진-2-일, 피라졸-3-일, 피리미딘-4-일, 또는 피리딘-2-일인 것을 포함한다.
화학식 I의 화합물의 예시적인 실시 형태는
Figure 112013027357114-pct00005
이
하기 구조:
Figure 112013027357114-pct00006
Figure 112013027357114-pct00007
로부터 선택되며, 여기서 물결선은 부착 부위를 나타내는 것을 포함한다.
화학식 I의 화합물의 예시적인 실시 형태는 화학식 Ia의 구조를 갖는 화합물을 포함한다.
[화학식 Ia]
Figure 112013027357114-pct00008
화학식 I의 화합물의 예시적인 실시 형태는 화학식 Ib의 구조를 갖는 화합물을 포함한다.
[화학식 Ib]
Figure 112013027357114-pct00009
화학식 I의 화합물의 예시적인 실시 형태는 화학식 Ic의 구조를 갖는 화합물을 포함한다.
[화학식 Ic]
Figure 112013027357114-pct00010
화학식 I의 화합물의 예시적인 실시 형태는 표 1 및 표 2로부터의 화합물을 포함한다.
본 발명의 화학식 I의 화합물은 비대칭 또는 키랄 중심을 함유할 수 있으며, 따라서 상이한 입체이성체 형태로 존재할 수 있다. 부분입체 이성체, 거울상 이성체 및 아트로프이성체뿐만 아니라 이들의 혼합물, 예를 들어 라세미 혼합물을 포함하지만 이로 한정되지 않는 본 발명의 화합물의 모든 입체이성체 형태는 본 발명의 일부를 형성하는 것으로 의도된다.
추가로, 본 발명은 시스-트랜스(기하) 및 입체형태 이성체를 포함한 모든 부분입체 이성체를 포함한다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물이 이중 결합 또는 융합 고리를 포함할 경우, 시스-형태 및 트랜스-형태뿐만 아니라 이들의 혼합물도 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본 명세서에 나타낸 구조에서, 임의의 특정 키랄 원자의 입체화학이 명시되어 있지 않은 경우에, 모든 입체이성체는 본 발명의 화합물로서 고려되고 포함된다. 입체화학이 특정 배치를 나타내는 속이 찬 쐐기 모양 또는 파선에 의해 명시된 경우에, 그 입체이성체는 그렇게 명시되고 정의된다.
본 발명의 화합물은 비용매화된 형태로뿐만 아니라, 물, 에탄올 등과 같은 약제학적으로 허용되는 용매와의 용매화된 형태로도 존재할 수 있으며, 본 발명은 용매화된 형태 및 비용매화된 형태 둘 모두를 포함하고자 한다.
본 발명의 화합물은 또한 상이한 호변이성체 형태로 존재할 수 있으며, 모든 그러한 형태는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 용어 "호변이성체" 또는 "호변이성체 형태"는 낮은 에너지 장벽을 통해 상호변환가능한 상이한 에너지의 구조 이성체를 말한다. 예를 들어, 양성자 호변이성체(또한 양성자성 호변이성체로도 알려짐)는 양성자의 이동을 통한 상호변환, 예를 들어 케토-엔올 및 이민-엔아민 이성체화를 포함한다. 원자가 호변이성체는 결합 전자 중 일부의 재편성에 의한 상호변환을 포함한다.
생물학적 평가
효소 활성(또는 기타 다른 생물학적 활성)의 억제제로서 화학식 I의 화합물들의 상대 효능은 각각의 화합물이 소정의 정도까지 활성을 억제하는 농도를 결정하고 나서 그 결과를 비교함으로써 확립될 수 있다. 통상적으로, 바람직한 결정은 생화학적 검정에서 활성의 50%를 억제하는 농도, 즉 50% 억제 농도 또는 "IC50"이다. IC50 값의 결정은 당업계에 공지된 종래의 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 일반적으로, IC50은 일정 범위의 농도의 연구 중인 억제제의 존재 하에, 제공된 효소의 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이어서, 실험적으로 얻어진 효소 활성 값을 사용된 억제제 농도에 대해 그래프를 그린다. (임의의 억제제의 부재 하에서의 활성과 비교하여) 50% 효소 활성을 나타내는 억제제의 농도가 IC50 값으로 취해진다. 유사하게, 기타 다른 억제 농도는 활성의 적절한 결정을 통해 정의될 수 있다. 예를 들어, 일부 설정에서는 90% 억제 농도, 즉 IC90 등을 확립하는 것이 바람직할 수 있다.
화학식 I의 화합물을 표준 생화학적 Btk 키나제 검정에 의해 시험하였다(실시예 901).
화학식 I의 화합물을 시험하는 데 사용될 수 있는 표준 세포 Btk 키나제 검정을 위한 일반적 절차는 라모스(Ramos) 세포 Btk 검정이다(실시예 902).
Balb/c 마우스의 비장으로부터 정제된 B-세포를 사용하여 화학식 I의 화합물을 시험하기 위해 표준 세포 B-세포 증식 검정을 사용할 수 있다(실시예 903).
Balb/c 마우스의 비장으로부터 정제된 T-세포를 사용하여 화학식 I의 화합물을 시험하기 위해 표준 T 세포 증식 검정을 사용할 수 있다(실시예 904).
8주령 내지 16주령의 Balb/c 마우스의 비장으로부터 정제된 전 마우스 비장세포(total mouse splenocyte)를 사용하여 B 세포 활성의 억제에 있어서 화학식 I의 화합물에 대해 CD86 억제 검정을 수행할 수 있다(실시예 905).
배양 중인 생존가능한 B-ALL 세포의 개수를 측정하기 위해 화학식 I의 화합물에 대해 B-ALL 세포 생존 검정을 수행할 수 있다(실시예 906).
표면 IgM을 염소 F(ab')2 항-인간 IgM과 가교결합시킴으로써 활성화된 인간 전혈에서의 B 림프구에 의한 CD69의 생산을 화합물이 억제하는 능력을 결정하기 위해 화학식 I의 화합물에 대해 CD69 전혈 검정을 수행할 수 있다(실시예 907).
본 발명의 방법에 따라 표 1 및 표 2의 예시적인 화학식 I의 화합물을 제조하고, 특성화하며, Btk의 억제에 대해 시험하였고, 이들은 하기의 구조 및 상응하는 명칭을 갖는다(ChemDraw Ultra, 버전 9.0.1, 및 ChemBioDraw, 버전 11.0, CambridgeSoft Corp., 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재). 하나 초과의 명칭이 화학식 I의 화합물 또는 중간체와 관련될 경우, 화학 구조가 그 화합물을 정의할 것이다.
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표 2의 실시예는 실시예 101 내지 실시예 126에 대한 것과 유사한 절차를 사용하여 제조하였다.
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화학식 I의 화합물의 투여
본 발명의 화합물은 치료될 병태에 적절한 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 적합한 경로에는 경구, 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 진피내, 척수강내 및 경막외를 포함함), 경피, 직장내, 비강, 국소(구강 및 설하를 포함함), 질내, 복강내, 폐내 및 비강내가 포함된다. 국소 면역억제 치료의 경우, 화합물은 병변내 투여에 의해 투여될 수 있는데, 이러한 병변내 투여에는 이식 전에 이식편을 억제제로 관류시키거나 아니면 억제제와 접촉시키는 것이 포함된다. 바람직한 경로는, 예를 들어 수용자의 병태에 따라 달라질 수 있음이 이해될 것이다. 화합물이 경구 투여될 경우, 이는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 환제, 캡슐, 정제 등으로 제형화될 수 있다. 화합물이 비경구 투여될 경우, 이는 하기에 상세히 기술된 바와 같이 약제학적으로 허용되는 비경구 비히클을 사용하여 단위 투약량 주사용 형태로 제형화될 수 있다.
인간 환자를 치료하기 위한 용량은 약 10mg 내지 약 1000mg의 화학식 I의 화합물의 범위일 수 있다. 통상적인 용량은 약 100mg 내지 약 300mg의 화합물일 수 있다. 용량은 특정 화합물의 흡수, 분포, 대사 및 배출을 포함한 약동학적 및 약력학적 특성에 따라 일일 1회(QID), 일일 2회(BID), 또는 더 자주 투여될 수 있다. 추가로, 독성 인자가 투약량 및 투여 요법(regimen)에 영향을 줄 수 있다. 경구 투여될 때, 환제, 캡슐 또는 정제가 명시된 기간 동안 매일 또는 덜 자주 섭취될 수 있다. 요법은 치료의 다수회의 사이클 동안 반복될 수 있다.
화학식 I의 화합물에 의한 치료 방법
본 발명의 화학식 I의 화합물은 Btk 키나제와 관련된 비정상적인 세포 성장, 기능 또는 거동으로부터 생기는 질환 또는 장애, 예를 들어 면역 장애, 심혈관 질환, 바이러스 감염, 염증, 대사/내분비 장애 또는 신경학적 장애를 앓고 있는 인간 또는 동물 환자를 치료하기에 유용하며, 따라서 이들 환자는 상기에 정의된 본 발명의 화합물을 이들에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 의해 치료될 수 있다. 암을 앓고 있는 인간 또는 동물 환자가 또한 상기에 정의된 본 발명의 화합물을 이들에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 의해 치료될 수 있다. 그럼으로써 환자의 병태는 향상되거나 개선될 수 있다.
화학식 I의 화합물은 포유류 세포, 유기체 또는 관련 병리학적 병태, 예를 들어 전신성 및 국소성 염증, 면역-염증성 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 면역 억제, 기관 이식 거부, 알러지, 궤양성 결장염, 크론병, 피부염, 천식, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 경피증/전신성 경화증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 항호중구 세포질 항체(ANCA) 혈관염, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 건선의 시험관내, 동일계내 및 생체내 진단 또는 치료에, 그리고 일반적인 관절 보호 효과에 유용할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 관절염 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 단일관절성 관절염, 골관절염, 통풍성 관절염, 척추염; 베체트병; 폐혈증, 폐혈성 쇼크, 내독소성 쇼크, 그램 음성 패혈증, 그램 양성 패혈증 및 독성 쇼크 증후군; 패혈증, 외상, 또는 출혈에 속발하는 다발성 기관 상해 증후군; 안과 장애, 예컨대 알러지성 결막염, 춘계 결막염, 포도막염 및 갑상선 관련 안병증; 호산구성 육아종; 폐 또는 호흡 장애, 예컨대 천식, 만성 기관지염, 알러지성 비염, ARDS, 만성 폐 염증성 질환(예: 만성 폐색성 폐질환), 규폐증, 폐 사르코이드증, 흉막염, 폐포염, 혈관염, 폐기종, 폐렴, 기관지확장증 및 폐 산소 독성; 심근, 뇌, 또는 사지의 재관류 상해; 섬유증, 예컨대 낭성 섬유증; 켈로이드 형성 또는 흉터 조직 형성; 죽상경화증; 자가면역 질환, 예컨대 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 자가면역 갑상선염, 다발성 경화증, 몇 가지 형태의 당뇨병 및 레이노 증후군(Reynaud's syndrome); 및 이식 거부 장애, 예컨대 GVHD 및 동종이식 거부; 만성 사구체신염; 염증성 장질환, 예컨대 만성 염증성 장질환(CIBD), 크론병, 궤양성 결장염 및 괴사성 소장결장염; 염증성 피부병, 예컨대 접촉 피부염, 아토피성 피부염, 건선, 또는 두드러기; 감염으로 인한 열 및 근육통; 중추 또는 말초 신경계 염증성 장애, 예컨대 수막염, 뇌염, 및 경도의 외상으로 인한 뇌 또는 척수 상해; 쇼그렌 증후군; 백혈구 누출을 수반하는 질환; 알코올성 간염; 세균성 폐렴; 항원-항체 복합체 매개 질환; 저혈량 쇼크; 제I형 진성 당뇨병; 급성 및 지연형 과민증; 백혈구 이혼화증 및 전이로 인한 질환 상태; 열 상해; 과립구 수혈 관련 증후군; 및 사이토카인 유도 독성과 같은 질환을 치료하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 유방암, 난소암, 경부암, 전립선암, 고환암, 비뇨생식기암, 식도암, 후두암, 교모세포종, 신경모세포종, 위(stomach)암, 피부암, 각질극세포종, 폐암, 표피양 암종, 대세포 암종, 비소세포성 폐암종(NSCLC), 소세포성 암종, 폐 선암종, 골암, 결장암, 선종, 췌장암, 선암종, 갑상선암, 소포 암종, 미분화 암종, 유두 암종, 정상피종, 흑색종, 육종, 방광 암종, 간 암종 및 담도암, 신장 암종, 췌장암, 골수 장애, 림프종, 모발상 세포암, 협강암, 비인두암, 인두암, 구순암, 설암, 구강(mouth)암, 소장암, 결장-직장암, 대장암, 직장암, 뇌 및 중추 신경계 암, 호지킨 림프종, 백혈병, 기관지암, 갑상선암, 간 및 간내 담도암, 간세포암, 위(gastric)암, 교종/교모세포종, 자궁내막암, 흑색종, 신장 및 신우암, 방광암, 자궁 체부암, 자궁 경부암, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 구강(oral cavity) 및 인두암, 비호지킨 림프종, 흑색종 및 융모성 결장 선종으로부터 선택된 암을 치료하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 재관류 상해, 즉 조직 또는 기관이 일정 기간의 허혈 후에 재관류를 겪는 상황으로부터 생기는 상해를 받거나 이를 받을 수 있는 대상을 치료하는 데 있어서 유용성을 가질 수 있다. 용어 "허혈"은 동맥혈의 유입의 폐색으로 인한 국소화된 조직 빈혈을 말한다. 일시적 허혈 후의 재관류는 특징적으로 호중구 활성화 및 이환 부위의 혈관의 내피를 통한 이행(transmigration)을 가져온다. 활성화된 호중구의 축적은 결국 반응성 산소 대사물질의 생성을 가져오는데, 이러한 반응성 산소 대사물질은 관련된 조직 또는 기관의 구성요소를 손상시킨다. "재관류 상해"의 이러한 현상은 일반적으로 혈관 발작(전역적 및 국소적 허혈을 포함함), 출혈성 쇼크, 심근 허혈 또는 경색, 기관 이식 및 뇌 혈관연축과 같은 병태와 관련된다. 예시를 위하여, 재관류 상해는 심장 우회 시술의 종료시에 일어나거나, 일단 혈액을 받아들이지 못하게 된 심장이 재관류되기 시작할 때 심장 정지 동안 일어난다. Btk 활성의 억제가 그러한 상황에서 재관류 상해의 양을 감소시킬 수 있을 것으로 예측된다.
약제학적 제형
인간을 포함한 포유류의 치료학적 치료에 있어서 본 발명의 화합물을 사용하기 위하여, 이는 표준 약제 실무에 따라 약제학적 조성물로서 통상적으로 제형화된다. 본 발명의 이 태양에 따르면, 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 회합된 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
통상적인 제형은 본 발명의 화합물과 담체, 희석제 또는 부형제를 혼합함으로써 제조된다. 적합한 담체, 희석제 및 부형제는 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 탄수화물, 왁스, 수용성 및/또는 팽윤성 중합체, 친수성 또는 소수성 재료, 젤라틴, 오일, 용매, 물 등과 같은 재료를 포함한다. 사용되는 특정 담체, 희석제 또는 부형제는 본 발명의 화합물이 적용되는 수단 및 목적에 따라 좌우될 것이다. 용매는 일반적으로 당업자에 의해 포유류에게 투여하기에 안전한 것으로 인식되는(GRAS) 용매에 기초하여 선택된다. 일반적으로, 안전한 용매는 물과 같은 비독성 수성 용매 및 물 중에 용해성 또는 혼화성인 기타 다른 비독성 용매이다. 적합한 수성 용매에는 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜(예: PEG 400, PEG 300) 등 및 이들의 혼합물이 포함된다. 제형은 또한 하나 이상의 완충제, 안정제, 계면활성제, 습윤제, 윤활제, 유화제, 현탁화제, 방부제, 산화방지제, 불투명화제, 활택제, 가공 보조제, 착색제, 감미제, 향료제, 향미제 및 약물(즉, 본 발명의 화합물 또는 그의 약제학적 조성물)의 미관(elegant presentation)을 제공하거나 약제학적 제품(즉, 약제)의 제조를 돕기 위한 기타 다른 공지된 첨가제를 포함할 수 있다.
제형은 종래의 용해 및 혼합 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 벌크 약물 물질(즉, 본 발명의 화합물 또는 그 화합물의 안정화된 형태(예를 들어, 사이클로덱스트린 유도체 또는 기타 다른 공지된 복합체화제(complexation agent)와의 복합체))이 상기에 기재된 부형제 중 하나 이상의 존재 하에 적합한 용매 중에 용해된다. 본 발명의 화합물은 약물의 용이하게 제어가능한 용량을 제공하기 위하여, 그리고 처방 요법에 대한 환자 준수(patient compliance)를 가능하게 하기 위하여 통상적으로 약제학적 투여형으로 제형화된다.
적용을 위한 약제학적 조성물(또는 제형)은 약물을 투여하는 데 사용되는 방법에 따라 다양한 방법으로 포장될 수 있다. 일반적으로, 유통용 용품은 적절한 형태의 약제학적 제형이 안에 담긴 용기를 포함한다. 적합한 용기는 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 병(플라스틱 및 유리), 사셰(sachet), 앰풀, 비닐 봉지, 금속 실린더 등과 같은 재료를 포함한다. 용기는 또한 포장의 내용물에 대한 무분별한 접근을 방지하기 위하여 부정개봉방지 조립체(tamper-proof assemblage)를 포함할 수 있다. 추가로, 용기는 용기의 내용물을 설명하는 라벨이 그 위에 부착되어 있다. 라벨은 또한 적절한 경고를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물의 약제학적 제형은 다양한 투여 경로 및 투여 유형을 위하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 원하는 정도의 순도를 갖는 화학식 I의 화합물이 동결건조 제형, 분쇄 분말, 또는 수용액의 형태로 임의로 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합될 수 있다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.]). 제형화는 적절한 pH에서 주위 온도에서, 그리고 원하는 정도의 순도에서 생리학적으로 허용되는 담체, 즉 사용된 용량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성인 담체와 혼합함으로써 수행될 수 있다. 제형의 pH는 화합물의 특정 용도 및 농도에 따라 주로 좌우되지만, 약 3 내지 약 8의 범위일 수 있다. pH 5에서의 아세테이트 완충제 중의 제형이 적합한 실시 형태이다.
화합물은 통상적으로 고체 조성물, 동결건조 제형으로서 또는 수용액으로서 저장될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 투여의 양, 농도, 일정, 과정, 비히클 및 경로가 우수한 의료 실무와 일치되는 방식으로 제형화되고, 용량화되고 투여될 것이다. 이 문맥에서 고려되는 인자에는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유류, 개별 환자의 임상 병태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의료 실무자에게 알려진 기타 다른 인자가 포함된다. 투여될 화합물의 "치료학적 유효량"은 그러한 고려사항에 의해 좌우될 것이며, 과증식성 장애를 개선 또는 치료하는 데 필요한 최소량이다.
일반적 제안으로서, 용량당 비경구로 투여되는 억제제의 초기 약제학적 유효량은 1일당 약 0.01mg/kg 내지 100mg/kg, 즉 1일당 약 0.1mg/kg 내지 20mg/kg 환자 체중의 범위일 것이며, 사용되는 화합물의 통상적인 초기 범위는 1일당 0.3mg/kg 내지 15mg/kg이다.
허용되는 희석제, 담체, 부형제 및 안정제는 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이며, 완충제, 예를 들어 인산염, 시트르산염 및 기타 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 기타 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예: Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 활성 약제학적 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 그러한 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
화학식 I의 화합물의 지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예에는 화학식 I의 화합물을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이 매트릭스는 형상화된 용품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐 알코올)), 폴리락타이드(미국 특허 제3773919호), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOTTM 락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구체) 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다.
제형은 본 명세서에 상세히 기술된 투여 경로에 적합한 것들을 포함한다. 제형은 편리하게 단위 투여형으로 제공될 수 있으며, 약제 기술분야에 익히 공지된 방법 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 기술 및 제형은 일반적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., 미국 펜실베이니아주 이스턴 소재)]에서 확인된다. 그러한 방법들은 활성 성분을 하나 이상의 부속 성분을 구성하는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하게 그리고 친밀하게 회합시키고 나서, 필요하다면, 생성물을 형상화함으로써 제조된다.
경구 투여에 적합한 화학식 I의 화합물의 제형은, 각각이 소정량의 화학식 I의 화합물을 함유하는 환제, 캡슐, 샤세제 또는 정제와 같은 개별 단위로 제조될 수 있다. 압축 정제는 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 표면 활성제 또는 분산제와 임의로 혼합된 분말 또는 과립과 같은 자유 유동 형태의 활성 성분을 적합한 기계에서 압축함으로써 제조될 수 있다. 성형 정제는 불활성 액체 희석제로 보습된 분말형 활성 성분의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제는 그로부터의 활성 성분의 느린 또는 제어 방출을 제공하도록 임의로 코팅 또는 스코링될 수 있고 임의로 제형화된다. 정제, 트로키제(troche), 로젠지제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐, 시럽 또는 엘릭서제가 경구 사용을 위해 제조될 수 있다. 경구 사용을 위해 의도된 화학식 I의 화합물의 제형은 약제학적 조성물의 제조를 위한 기술에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그러한 조성물은 먹기 좋은 제제를 제공하기 위하여 감미제, 향미제, 착색제 및 방부제를 포함한 하나 이상의 제제를 함유할 수 있다. 정제의 제조에 적합한 비독성의 약제학적으로 허용되는 부형제와의 혼합물 형태로 활성 성분을 함유하는 정제가 허용가능하다. 이들 부형제는, 예를 들어, 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘 또는 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예컨대 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 정제는 코팅되지 않을 수 있거나 위장관에서의 붕해 및 흡착을 지연시키고, 그럼으로써 더 오랜 기간에 걸쳐 지속 작용을 제공하기 위하여 마이크로캡슐화를 포함한 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 재료가 단독으로 또는 왁스와 함께 사용될 수 있다.
눈 또는 기타 다른 외부 조직, 예를 들어 입 및 피부의 치료를 위하여, 제형은 바람직하게, 예를 들어 0.075% w/w 내지 20% w/w의 양으로 활성 성분(들)을 함유하는 국소 연고 또는 크림으로서 적용된다. 연고 형태로 제형화될 때, 활성 성분은 파라핀계 연고 베이스 또는 수혼화성 연고 베이스와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 수중유 크림 베이스를 사용하여 크림 형태로 제형화될 수 있다. 원한다면, 크림 베이스의 수성 상은 다가 알코올(즉, 2개 이상의 하이드록실 기를 갖는 알코올), 예컨대 프로필렌 글리콜, 부탄 1,3-디올, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG 400을 포함함) 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 국소 제형은 바람직하게 피부 또는 기타 다른 이환 부위를 통한 활성 성분의 흡수 또는 침투를 향상시키는 화합물을 포함할 수 있다. 그러한 진피 침투 향상제의 예에는 디메틸 설폭사이드 및 관련 유사체가 포함된다. 본 발명의 에멀젼의 유성 상은 공지된 방법으로 공지된 성분으로부터 구성될 수 있다. 그 상은 단지 유화제만을 포함할 수 있지만, 이는 바람직하게 적어도 하나의 유화제와 지방 또는 오일이나 지방 및 오일 둘 모두의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 친수성 유화제가 안정제로서 작용하는 친유성 유화제와 함께 포함된다. 오일 및 지방 둘 모두를 포함하는 것이 또한 바람직하다. 이와 함께, 유화제(들)는 안정제(들)와 함께 또는 안정제 없이 이른바 유화 왁스를 구성하며, 이 왁스는 오일 및 지방과 함께 크림 제형의 유성 분산 상을 형성하는 이른바 유화 연고 베이스를 구성한다. 본 발명의 제형에 사용하기에 적합한 유화제 및 에멀젼 안정제에는 Tween® 60, Span® 80, 세토스테아릴 알코올, 벤질 알코올, 미리스틸 알코올, 글리세릴 모노-스테아레이트 및 나트륨 라우릴 설페이트가 포함된다.
화학식 I의 화합물의 수성 현탁액은 수성 현탁액을 제조하기에 적합한 부형제와의 혼합물 형태로 활성 재료를 함유한다. 그러한 부형제에는 현탁화제, 예컨대 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 크로스카르멜로스, 포비돈, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 검 트래거캔스 및 검 아카시아, 및 분산제 또는 습윤제, 예컨대 천연 발생 포스파타이드(예: 레시틴), 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물(예: 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물(예: 헵타데카에틸렌옥시세탄올), 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물(예: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)이 포함된다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 방부제, 예컨대 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제 및 하나 이상의 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.
화학식 I의 화합물의 약제학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액와 같은 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 상기에 언급된 바 있는 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 비독성인 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액, 예컨대 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있거나, 또는 동결건조 분말로서 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 추가로, 멸균 고정 오일(sterile fixed oil)이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 포함한 임의의 블랜드 고정 오일이 사용될 수 있다. 추가로, 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조시에 마찬가지로 사용될 수 있다.
단일 투여형을 제조하기 위하여 담체 재료와 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 인간에 대한 경구 투여를 위해 의도된 시간 방출(time-release) 제형은 총 조성물의 약 5% 내지 약 95%(중량:중량)로 달라질 수 있는 적절하고 편리한 양의 담체 재료와 배합된 대략 1mg 내지 1000mg의 활성 재료를 함유할 수 있다. 약제학적 조성물은 투여하기에 용이하게 측정가능한 양을 제공하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 정맥내 주입을 위해 의도된 수용액은 약 30mL/hr 속도의 적합한 부피의 주입이 일어날 수 있도록 하기 위하여 용액 1 밀리리터당 약 3μg 내지 500μg의 활성 성분을 함유할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형에는 제형이 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질, 정균제(bacteriostat), 완충제 및 산화방지제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 포함된다.
눈에 대한 국소 투여에 적합한 제형은 또한 점안제를 포함하는데, 여기서는 활성 성분이 적합한 담체, 특히 활성 성분을 위한 수성 용매 중에 용해 또는 현탁된다. 활성 성분은 바람직하게 약 0.5% w/w 내지 20% w/w, 예를 들어 약 0.5% w/w 내지 10% w/w, 예를 들어 약 1.5% w/w의 농도로 그러한 제형 내에 존재한다.
입 안에서의 국소 투여에 적합한 제형에는 향미된 기재, 통상적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔스 중에 활성 성분을 포함하는 로젠지제; 불활성 기재, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 중에 활성 성분을 포함하는 향정; 및 적합한 액체 담체 중에 활성 성분을 포함하는 구강세척제가 포함된다.
직장내 투여를 위한 제형은, 예를 들어 코코아 버터 또는 살리실레이트를 포함하는 적합한 베이스와 함께 좌제로서 제공될 수 있다.
폐내 또는 비강 투여에 적합한 제형은 입자 크기가, 예를 들어 0.1마이크로미터 내지 500마이크로미터의 범위(0.5마이크로미터, 1마이크로미터, 30마이크로미터, 35마이크로미터 등과 같은 증분 마이크로미터로 0.1마이크로미터 내지 500마이크로미터 범위의 입자 크기를 포함함)이며, 이는 폐포낭에 도달하도록 비도(nasal passage)를 통한 급속 흡입에 의해 또는 입을 통한 흡입에 의해 투여된다. 적합한 제형에는 활성 성분의 수용액 또는 유성 용액이 포함된다. 에어로졸 또는 건조 분말 투여에 적합한 제형은 종래의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 하기에 기재된 바와 같은 장애의 치료 또는 예방에 이전까지 사용된 화합물과 같은 기타 다른 치료제와 함께 전달될 수 있다.
질내 투여에 적합한 제형은 활성 성분에 더하여 적절한 것으로 당업계에 공지된 담체를 함유하는 페서리(pessary), 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포말 또는 스프레이 제형으로서 제공될 수 있다.
제형은 단위 용량 또는 다중 용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰풀 및 바이알 내에 포장될 수 있으며, 사용 직전에 주사하기 위하여 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 물의 첨가만을 필요로 하는 냉동 건조된(동결건조된) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액이 앞서 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조된다. 바람직한 단위 투약 제형은 활성 성분을 본 명세서에서 상기에 기재된 바와 같은 일일 용량 또는 단위 일일 하위용량, 또는 그의 적절한 소부분으로 함유하는 것들이다.
본 발명은 수의용 조성물을 추가로 제공하는데, 이는 그에 따른 수의용 담체와 함께 상기에 정의된 적어도 하나의 활성 성분을 포함한다. 수의용 담체는 조성물을 투여하려는 목적에 유용한 재료이며, 달리 수의학 기술에서 불활성이거나 허용되고 활성 성분과 상용성인 고체, 액체 또는 기체 재료일 수 있다. 이들 수의용 조성물은 비경구, 경구로 또는 임의의 기타 다른 원하는 경로에 의해 투여될 수 있다.
병용 치료
화학식 I의 화합물은 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애, 예를 들어 염증 또는 과증식성 장애(예: 암)의 치료를 위하여 단독으로 또는 기타 다른 치료제와 병용하여 사용될 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 화학식 I의 화합물은 항염증 또는 항과증식 특성을 갖거나 염증, 면역 반응 장애, 또는 과증식성 장애(예: 암)를 치료하기에 유용한 제2 치료 화합물과, 병용 치료로서 약제학적 병용 제형 또는 투약 요법(dosing regimen)으로 병용된다. 제2 치료제는 NSAID 항염증제일 수 있다. 제2 치료제는 화학치료제일 수 있다. 약제학적 병용 제형 또는 투약 요법의 제2 화합물은 바람직하게 화학식 I의 화합물에 대해 상보적 활성을 가져서 이들이 서로 악영향을 주지 않도록 한다. 그러한 화합물은 적합하게 의도된 목적에 유효한 양으로 병용하여 존재한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 NSAID와 같은 치료제와 병용하여 화학식 I의 화합물, 또는 그의 입체이성체, 호변이성체, 용매화물, 대사물질, 또는 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물을 포함한다.
병용 치료는 동시 또는 순차적 요법으로서 투여될 수 있다. 순차적으로 투여될 때, 병용은 2회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 병용 투여에는 별개의 제형 또는 단일 약제학적 제형을 사용하는 동시투여(coadministration), 및 어느 순서로든 연속 투여(consecutive administration)가 포함되는데, 연속 투여에서는 바람직하게 둘 모두의 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 나타내는 기간이 있다.
상기 동시투여 제제 중 임의의 것에 대한 적합한 투약량은 현재 사용되는 투약량이며, 새롭게 확인된 제제 및 기타 다른 치료제 또는 치료법의 조합 작용(상승효과(synergy))으로 인해 낮출 수 있다.
병용 치료는 "상승효과"를 제공할 수 있고, "상승적(synergistic)"임을 입증할 수 있는데, 즉 활성 성분들이 함께 사용될 때 달성되는 효과가 이들 화합물을 별개로 사용하는 것으로부터 생기는 효과의 합보다 더 크다. 활성 성분들이 (1) 병용된 단위 투약량 제형으로 동시 제형화되고 투여되거나 동시에 전달될 때; (2) 별개의 제형으로서 교대로 또는 병행하여 전달될 때; 또는 (3) 일부 기타 다른 요법에 의해 상승적 효과가 얻어질 수 있다. 교대 치료로 전달될 때에는, 화합물이 순차적으로, 예를 들어 별개의 주사기로의 상이한 주사, 별개의 환제 또는 캡슐, 또는 별개의 주입에 의해 투여되거나 전달될 때 상승적 효과가 얻어질 수 있다. 일반적으로, 교대 치료 동안에는, 각각의 활성 성분의 유효 투약량이 순차적으로, 즉 연속적으로 투여되며, 한편 병용 치료에서는, 둘 이상의 활성 성분의 유효 투약량이 함께 투여된다.
치료의 특정 실시 형태에서, 화학식 I의 화합물, 또는 그의 입체이성체, 호변이성체, 용매화물, 대사물질, 또는 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물은 본 명세서에 기재된 것들과 같은 기타 다른 치료제, 호르몬 제제 또는 항체 제제와 병용될 수 있을 뿐만 아니라, 외과적 치료 및 방사선 치료와 병용될 수도 있다. 따라서, 본 발명에 따른 병용 치료는 적어도 하나의 화학식 I의 화합물, 또는 그의 입체이성체, 호변이성체, 용매화물, 대사물질, 또는 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물의 투여, 및 적어도 하나의 기타 다른 암 치료 방법의 사용을 포함한다. 화학식 I의 화합물(들) 및 나머지 다른 치료학적으로 활성인 치료제(들)의 양 및 투여의 상대 시기(timing)는 원하는 조합된 치료적 효과를 달성하도록 선택될 것이다.
화학식 I의 화합물의 대사물질
본 발명의 범주 내에 또한 속하는 것이 본 명세서에 기재된 화학식 I의 생체내 대사 산물이다. 그러한 산물은, 예를 들어 투여된 화합물의 산화, 환원, 가수분해, 아미드화, 탈아미드화, 에스테르화, 탈에스테르화, 효소 절단 등으로부터 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 화학식 I의 화합물의 대사물질을 포함하며, 이러한 대사물질에는 본 발명의 화합물을 그의 대사 산물을 수득하기에 충분한 기간 동안 포유류와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 생성된 화합물이 포함된다.
대사 산물은 본 발명의 화합물의 방사성 표지(예: 14C 또는 3H) 동위원소를 제조하는 단계, 이를 동물, 예컨대 래트, 마우스, 기니아 피그, 원숭이 또는 사람에게 검출가능한 용량(예: 약 0.5mg/kg 초과)으로 비경구 투여하는 단계, 대사가 일어나기에 충분한 시간(통상적으로 약 30초 내지 30시간)을 허용하는 단계, 및 요소, 혈액 또는 기타 다른 생물학적 샘플로부터 그의 전환 산물을 단리하는 단계에 의해 통상적으로 확인된다. 이들 산물은 표지되어 있기 때문에 용이하게 단리된다(기타 다른 것들은 대사물질 내에 생존하는 에피토프를 결합시킬 수 있는 항체의 사용에 의해 단리된다). 대사물질 구조는 종래의 방식으로, 예를 들어 MS, LC/MS 또는 NMR 분석에 의해 결정된다. 일반적으로, 대사물질의 분석은 당업자에게 익히 공지된 종래의 약물 대사 연구와 동일한 방법으로 행해진다. 대사 산물은, 달리 생체내에서 발견되지 않는 한, 본 발명의 화합물의 치료학적 용량을 위한 진단 검정에 유용하다.
제조 용품
본 발명의 다른 실시 형태에서, 상기에 기재된 질환 및 장애를 치료하기에 유용한 재료를 수용하는 제조 용품, 또는 "키트"가 제공된다. 일 실시 형태에서, 키트는 화학식 I의 화합물, 또는 그의 입체이성체, 호변이성체, 용매화물, 대사물질, 또는 약제학적으로 허용되는 염 또는 전구약물을 포함하는 용기를 포함한다. 키트는 용기 상의 또는 이와 관련된 라벨 또는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 시판 포장 내에 관례적으로 포함되는 설명서를 말하는 데 사용되는데, 이러한 설명서는 그러한 치료 제품의 사용에 관한 지시, 용법, 투약량, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 수록한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기, 블리스터 팩 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 병태를 치료하기에 유효한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제형을 수용할 수 있으며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하주사 바늘에 의해 천공가능한 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 화학식 I의 화합물이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 병태(condition of choice), 예컨대 암을 치료하는 데 사용됨을 지시한다. 추가로, 라벨 또는 포장 삽입물은 치료될 환자가 과증식성 장애, 신경변성, 심장 비대, 통증, 편두통 또는 신경외상성 질환 또는 사건과 같은 장애를 갖는 자임을 지시할 수 있다. 일 실시 형태에서, 라벨 또는 포장 삽입물은 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물이 비정상적인 세포 성장으로부터 생긴 장애를 치료하는 데 사용될 수 있음을 지시한다. 라벨 또는 포장 삽입물은 또한 조성물이 기타 다른 장애를 치료하는 데 사용될 수 있음을 지시할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제조 용품은 약제학적으로 허용되는 완충제, 예컨대 주사용 정균성 주사용수(bacteriostatic water for injection, BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 다른 재료를 추가로 포함할 수 있는데, 이러한 재료에는 기타 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기가 포함된다.
키트는 화학식 I의 화합물 및, 존재한다면 제2 약제학적 제형의 투여를 위한 지시사항을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트가 화학식 I의 화합물을 포함하는 제1 조성물 및 제2 약제학적 제형을 포함할 경우, 키트는 이를 필요로 하는 환자에게의 제1 및 제2 약제학적 조성물의 동시, 순차 또는 개별 투여에 대한 지시사항을 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 키트는 화학식 I의 화합물의 고체 경구 형태, 예컨대 정제 또는 캡슐의 전달에 적합하다. 그러한 키트는 바람직하게 다수의 단위 투약량을 포함한다. 그러한 키트는 이들 투약량이 의도된 용도의 순서대로 배향된 카드를 포함할 수 있다. 그러한 키트의 한 예가 "블리스터 팩"이다. 블리스터 팩은 포장 산업에서 익히 공지되어 있으며, 약제학적 단위 투여형을 포장하는 데 널리 사용된다. 원한다면, 기억 보조수단(memory aid)이 제공될 수 있는데, 예를 들어 숫자, 문자, 또는 기타 다른 표시의 형태로 제공되거나, 또는 투약량이 투여될 수 있는 치료 일정에 있는 날짜를 지정하는 달력 삽입물과 함께 제공될 수 있다.
일 실시 형태에 따르면, 키트는 (a) 화학식 I의 화합물이 안에 수용된 제1 용기; 및 임의로 (b) 제2 약제학적 제형이 안에 수용된 제2 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 제2 약제학적 제형은 항과증식 활성을 갖는 제2 화합물을 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 키트는 약제학적으로 허용되는 완충제, 예컨대 정균성 주사용수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제3 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 다른 재료를 추가로 포함할 수 있는데, 이러한 재료에는 기타 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기가 포함된다.
키트가 화학식 I의 조성물 및 제2 치료제를 포함하는 임의의 다른 실시 형태에서, 키트는 이들 별개의 조성물을 수용하기 위한 용기, 예컨대 분할된 병 또는 분할된 포일 패킷을 포함할 수 있지만, 이들 별개의 조성물은 또한 분할되지 않은 단일 용기 내에 수용될 수도 있다. 통상적으로, 키트는 별개의 성분들의 투여에 대한 지시사항을 포함한다. 키트 형태는 별개의 성분들이 바람직하게는 상이한 투여형(예: 경구 및 비경구)으로 투여되거나, 상이한 투약 간격으로 투여될 때, 또는 병용물의 개별 성분들의 적정(titration)이 처방 의사에 의해 요구될 때 특히 유리하다.
화학식 I의 화합물의 제조
화학식 I의 화합물은 당해 화학 기술 분야에서 익히 공지된 것들과 유사한 공정을 포함하는 합성 경로에 의해, 특히 본 명세서에 기재된 설명에 비추어 합성될 수 있고, 기타 다른 헤테로사이클에 대해서는 문헌[Comprehensive Heterocyclic Chemistry II, Editors Katritzky and Rees, Elsevier, 1997, e.g. Volume 3]; [Liebigs Annalen der Chemie, (9):1910-16, (1985)]; [Helvetica Chimica Acta, 41:1052-60, (1958)]; [Arzneimittel-Forschung, 40(12):1328-31, (1990)]에 기재된 것들과 유사한 공정을 포함하는 합성 경로에 의해 합성될 수 있으며, 이들 각각의 문헌은 명확히 참조로 포함된다. 출발 재료는 일반적으로 Aldrich Chemicals(미국 위스콘신주 밀워키 소재)와 같은 상업적 공급원으로부터 입수가능하거나, 또는 당업자에게 익히 공지된 방법을 사용하여 용이하게 제조된다(예를 들어, 문헌[Louis F. Fieser and Mary Fieser, Reagents for Organic Synthesis, v. 1-23, Wiley, N.Y. (1967-2006 ed.)], 또는 문헌[Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin(부록 포함)(또한 Beilstein 온라인 데이터베이스를 통해서도 이용가능함)]에 전반적으로 기재된 방법에 의해 제조된다).
화학식 I의 화합물 및 필요한 시약 및 중간체를 합성하는 데 유용한 합성 화학 변환 및 보호기 방법(보호 및 탈보호)은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989)]; [T. W. Greene 및 P. G .M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley and Sons (1999)]; 및 [L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)] 및 이들의 후속판에 기재된 것들을 포함한다.
화학식 I의 화합물은 단독으로 제조되거나, 또는 적어도 2개, 예를 들어 5개 내지 1,000개의 화합물, 또는 10개 내지 100개의 화합물을 포함하는 화합물 라이브러리로서 제조될 수 있다. 화학식 I의 화합물의 라이브러리는 조합적 '분할 및 혼합(split and mix)' 접근법으로 제조하거나, 또는 용액상 또는 고상 화학을 이용하는 다중 평행 합성(multiple parallel synthesis) 또는 당업자에게 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 태양에 따르면, 적어도 2개의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 화합물 라이브러리가 제공된다.
도면 및 실시예는 화학식 I의 화합물을 제조하기 위한 예시적 방법을 제공한다. 당업자는 기타 다른 합성 경로가 화학식 I의 화합물을 합성하는 데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 출발 재료 및 시약이 도면 및 실시예에 도시되고 논의되어 있지만, 다양한 유도체 및/또는 반응 조건을 제공하기 위해 기타 다른 출발 재료 및 시약이 용이하게 대체될 수 있다. 추가로, 기술된 방법에 의해 제조된 예시적 화합물 중 다수는 당업자에게 익히 공지된 종래의 화학 변화를 이용하여 본 개시내용에 비추어 추가로 개질될 수 있다.
화학식 I의 화합물을 제조하는 데 있어서, 중간체의 원위(remote) 작용기(예: 1차 또는 2차 아민)를 보호할 필요가 있을 수 있다. 그러한 보호의 필요는 원위 작용기의 성질 및 제조 방법의 조건에 따라 달라질 것이다. 적합한 아미노 보호기에는 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카보닐(BOC), 벤질옥시카보닐(CBz) 및 9-플루오레닐 메틸렌옥시카보닐(Fmoc)이 포함된다. 그러한 보호의 필요는 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 보호기 및 그의 사용에 대한 전반적인 설명에 대해서는, 문헌[T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991]을 참조한다.
일반적 절차 A 스즈키 커플링
Figure 112013027357114-pct00022
스즈키형 커플링 반응은 탄소-탄소 결합을 형성하여 화학식 I의 화합물 및 중간체, 예컨대 A-3의 고리를 부착시키는 데 유용하다(문헌[Suzuki (1991) Pure Appl. Chem. 63:419-422]; [Miyaura 및 Suzuki (1979) Chem. Reviews 95(7):2457-2483]; [Suzuki (1999) J. Organometal. Chem. 576:147-168]). 스즈키 커플링은 아릴할라이드, 예컨대 B-2 또는 B-5와 보론산, 예컨대 A-1 또는 A-2의 팔라듐 매개 크로스 커플링 반응이다. 예를 들어, B-2를 약 1.5당량의 4,4,4',4',5,5,5',5'-옥타메틸-2,2'-바이(1,3,2-디옥사보롤란)과 배합시키고, 물 중 1M(몰농도) 용액으로서의 약 3당량의 탄산나트륨 및 등부피의 아세토니트릴 중에 용해시킬 수 있다. 촉매량 또는 그 이상의 저원자가(low valent) 팔라듐 시약, 예컨대 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 디클로라이드를 첨가한다. 일부 경우에, 탄산나트륨 대신 아세트산칼륨을 사용하여 수성 층의 pH를 조정한다. 이어서, 반응물을 10분 내지 30분 동안 마이크로파 반응기, 예컨대 Biotage Optimizer(Biotage, Inc.) 내에서 가압 하에서 약 140℃ 내지 150℃로 가열한다. 내용물을 에틸 아세테이트 또는 다른 유기 용매로 추출한다. 유기 층을 증발시킨 후, 보론 에스테르 A-1을 실리카 상에서 또는 역상 HPLC에 의해 정제할 수 있다. 치환체 Y1, Y2, R5 및 R6은 정의된 바와 같거나, 그의 보호된 형태 또는 전구체이다. 마찬가지로, 브로마이드 중간체 B-5를 보론화(boronylated)하여 A-2를 제공할 수 있다. 치환체 Y1, Y2, R1, R2, R3, R4, Z1, Z2, Z3, Z4 및 X는 정의된 바와 같거나, 그의 보호된 형태 또는 전구체이다.
B-2와 A-2 또는 A-1과 B-5의 스즈키 커플링은 화학식 I의 화합물 또는 중간체 A-3을 제공한다. 보론산 에스테르(또는 보론산)(1.5당량) A-1 또는 A-2, 및 팔라듐 촉매, 예컨대 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드(0.05당량)를 아세토니트릴 및 1M 탄산나트륨 수용액(아세토니트릴과 동일한 부피) 중 할로 중간체(1당량) B-2 또는 B-5의 혼합물에 첨가한다. 반응 혼합물을 약 15분 동안 마이크로파 내에서 약 150℃로 가열한다. LC/MS가 반응이 완료되는 시점을 나타낸다. 물을 혼합물에 첨가하고, 침전된 생성물을 여과하며 HPLC에 의해 정제하여 생성물 A-3을 수득한다. 치환체 R1', R2', R4'는 정의된 바와 같은 R1, R2, R4일 수 있거나, 그의 보호된 형태 또는 전구체일 수 있다.
다양한 팔라듐 촉매가 스즈키 커플링 단계 동안 사용될 수 있다. 다양한 저원자가인 Pd(II) 및 Pd(0) 촉매가 스즈키 커플링 반응에 사용될 수 있는데, 이러한 촉매에는 PdCl2(PPh3)2, Pd(t-Bu)3, PdCl2 dppf CH2Cl2, Pd(PPh3)4, Pd(OAc)/PPh3, Cl2Pd[(Pet3)]2, Pd(DIPHOS)2, Cl2Pd(Bipy), [PdCl(Ph2PCH2PPh2)]2, Cl2Pd[P(o-tol)3]2, Pd2(dba)3/P(o-tol)3, Pd2(dba)/P(푸릴)3, Cl2Pd[P(푸릴)3]2, Cl2Pd(PMePh2)2, Cl2Pd[P(4-F-Ph)3]2, Cl2Pd[P(C6F6)3]2, Cl2Pd[P(2-COOH-Ph)(Ph)2]2, Cl2Pd[P(4-COOH-Ph)(Ph)2]2, 및 캡슐화된 촉매 Pd EnCatTM 30, Pd EnCatTM TPP30, 및 Pd(II)EnCatTM BINAP30(미국 특허 출원 제2004/0254066호)이 포함된다.
일반적 절차 B 부흐발트 반응
Figure 112013027357114-pct00023
부흐발트 반응은 6-브로모 중간체 B-1을 아미노화하기에 유용하다(문헌[Wolf 및 Buchwald (2004) Org. Synth Coll. Vol. 10:423]; [Paul et al (1994) Jour. Amer. Chem. Soc. 116:5969-5970]). DMF 중 할로 중간체 B-1의 용액에 적절한 아민 R5-NH2(200몰%), Cs2CO3(50몰%), Pd2(dba)3(5몰%), 및 XANTPHOS(10몰%)를 첨가한다. 반응물을 약 30분 동안 Biotage 옵티마이저 마이크로파 반응기 내에서 가압 하에서 약 110℃로 가열한다. 생성된 용액을 진공 중에서 농축시켜 B-2를 제공한다. 기타 다른 팔라듐 촉매 및 포스핀 리간드가 유용할 수 있다.
Figure 112013027357114-pct00024
N-아릴 아미드 중간체 B-5가 또한 사이클릭 아미드 중간체 B-3 및 아릴 브로마이드 B-4를 사용하여 브흐발트 조건 하에서 제조될 수 있다.
도 1은 화학식 I의 화합물(8)을 제조하기 위한 예시적인 합성 경로를 나타내는데, 이 경로는 바이사이클릭 피롤론(4)을 메틸 또는 하이드록시메틸 벤젠(5)과 커플링시켜 중간체(6)를 수득하기 위한 부흐발트 반응에 이어, 보로네이트(7)를 제조하고 이를 브로모-피리돈 또는 브로모-피라지논(2)과 커플링시키기 위한 연속적인 스즈키 반응, 또는 (6)을 피리돈-보로네이트 또는 피라지논-보로네이트(3)와 커플링시키기 위한 단일 스즈키 반응을 수반한다. 브로모-피리돈 또는 브로모-피라지논(2)은 헤테로사이클릭 아민 또는 아닐린과의 디브로모-피리돈 또는 디브로모-피라지논의 부흐발트 반응에 의해 제조될 수 있다. 피리돈-보로네이트 또는 피라지논-보로네이트(3)는 디보로네이트와 (2)의 스즈키 반응에 의해 제조될 수 있다.
도 2는 화학식 I의 화합물(8)을 제조하기 위한 예시적인 합성 경로를 나타내는데, 이 경로는 바이사이클릭 피롤론을 브로모아닐린 유도체 상에 어셈블링하여 도 I에 상세히 기술된 역할에서 사용될 수 있는 브로마이드를 제공하는 것을 수반한다.
도 3은 화학식 I의 화합물(8)을 제조하기 위한 예시적인 합성 경로를 나타내는데, 이 경로는 바이사이클릭 피롤론을 이 분자의 나머지의 아미노 유도체(12) 상에 어셈블링하는 것을 수반한다.
실시예
실시예 101
실시예 101a 메틸 3-메틸티오펜-2-카복실레이트 101a
Figure 112013027357114-pct00025
30mL의 메트올 중 3-메틸티오펜-2-카보닐 클로라이드(1)(10mL, 18mmol)를 18시간 동안 환류 하에서 비등되게 가열하고 나서, 진공 중에서 농축시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르와 물 사이에 분배시켰다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고 농축시켜, 투명 오일로서 101a(12.12g, 100%)를 제공하였으며, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
실시예 101b 메틸 5-tert-부틸-3-메틸티오펜-2-카복실레이트 101b
Figure 112013027357114-pct00026
AlCl3(15.60g, 117mMol)를 CH2Cl2(18mL) 중에 현탁시키고, 혼합물을 -78℃로 냉각시켰다. CH2Cl2(9mL) 중 12.28g(78mMol)의 101a의 용액을 5분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 이어서, CH2Cl2(9mL) 중 8.9mL(82mMol)의 2-클로로-2-메틸프로판의 용액을 45분에 걸쳐 첨가하고, 생성된 혼합물을 1시간 동안 -78℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 점진적으로 가온하고 24시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 얼음에 붓고 CH2Cl2로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고 오일로 농축시켜, 이 오일을 헥산 중 CH2Cl2의 구배(0% 내지 10%)로 용리하는 실리카 상에서 정제하여 9.94g(60%)의 101b를 제공하였다.
실시예 101c 메틸 3-(브로모메틸)-5-tert-부틸티오펜-2-카복실레이트 101c
Figure 112013027357114-pct00027
40mL의 사염화탄소 중 3.15g(14.8mMol)의 101b, 3.17g(17.8mMol)의 N-브로모-석신이미드, 및 0.122g(0.742mmol)의 2,2'-아조비스이소부티로니트릴의 혼합물을 밤새 85℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여과하였다. 여과액을 진공 중에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 실리카(ISCO 40g 컬럼, 헥산 중 0% 내지 20% CH2Cl2) 상에서 정제하였다. 3.0g(70%)의 101c를 단리하였다.
실시예 101d 메틸 3-((3-브로모-2-메틸페닐아미노)메틸)-5-tert-부틸티오펜-2-카복실레이트 101d
Figure 112013027357114-pct00028
자기 교반기를 구비한 250mL 1구 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, 101c(1.09g, 4.68mmol), 3-브로모-2-메틸-아닐린(2.61g, 14.0mmol) 및 아세토니트릴(25mL)로 충전하였다. 탄산세슘(1.67g, 5.15mmol)을 첨가하고 나서, 혼합물을 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 황색 오일로서 70% 수율(1.30g)의 101d를 제공하였다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6.92 (m, 2H), 6.85 (s, 1H), 6.57 (dd, 1H, J = 4.8, 2.1 Hz), 4.60 (s, 2H), 3.86 (s, 3H), 2.29 (s, 3H), 1.37 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 396.2 (M+H).
실시예 101e 3-((3-브로모-2-메틸페닐아미노)메틸)-5-tert-부틸티오펜-2-카복실산 101e
Figure 112013027357114-pct00029
자기 교반기를 구비한 50mL 1구 둥근바닥 플라스크를 101d(1.30g, 3.28mmol), THF(5.0mL), 메탄올(5.0mL) 및 물(5.0mL)로 충전하였다. 수산화리튬(1.38g, 32.8mmol)을 첨가하고, 혼합물을 40℃ 유조(oil bath) 내에 넣었다. 16시간 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 휘발성 물질을 감압 하에서 제거하였다. 생성된 수용액을 2N 염산을 사용하여 pH 4로 산성화하였다. 생성된 고체를 여과하고 40℃에서 진공 오븐 내에서 건조시켜 백색 고체로서, 정량적인 수율(1.25g)의 101e를 제공하였다: mp 150℃~152℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 6.85 (t, 1H, J = 7.8 Hz), 6.75-6.67 (m, 3H), 4.35 (s, 2H), 2.18 (s, 3H), 1.26 (s, 9H); MS (APCI-) m/z 380.2 (M-H).
실시예 101f 5-(3-브로모-2-메틸페닐)-2-tert-부틸-4H-티에노[3,2-c]피롤-6(5H)-온 101f
Figure 112013027357114-pct00030
자기 교반기를 구비한 250mL 1구 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, 101e(1.12g, 2.93mmol) 및 무수 메틸렌 클로라이드(50mL)로 충전하였다. 티오닐 클로라이드(1.25g, 10.5mmol)를 첨가하고, 반응물을 주위 온도에서 교반하였다. 16시간 후, 반응물을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 백색 고체로서 65% 수율(757mg)의 101f를 제공하였다: mp 185℃~186℃; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.56 (dd, 1H, J = 6.6, 1.2 Hz), 7.20 (dd, 1H, J = 6.3, 1.5 Hz), 7.11 (t, 1H, 7.8 Hz), 6.87 (s, 1H), 4.56 (s, 2H), 2.33 (s, 3H), 1.45 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 364.2 (M+H).
실시예 101g 2-tert-부틸-5-(2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)-4H-티에노[3,2-c]피롤-6(5H)-온 101g
Figure 112013027357114-pct00031
자기 교반기를 구비한 100mL 1구 둥근바닥 플라스크를 (7)(757mg, 2.08mmol), 비스(피나콜레이토)디보론(554mg, 2.18mmol, 비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐(191mg, 0.21mmol), 디사이클로헥실(2',4',6'-트리이소프로필바이페닐-2-일)포스핀(X-Phos)(198mg, 0.42mmol), 아세트산칼륨(306mg, 3.12mmol) 및 무수 디옥산(10mL)으로 충전하였다. 이어서, 플라스크를 밀봉하고, 3회 플라스크를 소기하고 질소로 재충전함으로써 혼합물을 탈기하였다. 이어서, 반응물을 80℃ 유조 내에 넣었다. 16시간 후, 이어서 반응물을 실온으로 냉각시키고, 감압 하에서 농축시켜 잔류물로 하였다. 이어서, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트(300mL)로 희석시키고 물(120mL)로 세척하였다. 이어서, 유기 층을 분리하고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 진공 여과에 의해 제거하였으며, 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 황색 포말로서 63% 수율(541mg)의 (8)을 제공하였다: mp 101℃~104℃; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.79 (dd, 1H, J = 5.4, 1.8 Hz), 7.29 (m, 1H), 7.23 (m, 1H), 6.86 (s, 1H), 4.53 (s, 2H), 2.45 (s, 3H), 1.41 (s, 9H), 1.27 (s, 12H); MS (APCI+) m/z 411.2 (M).
실시예 101h (3-니트로-1H-피라졸-5-일)메탄올 101h
Figure 112013027357114-pct00032
기계적 교반기, 첨가 깔때기 및 질소 주입구를 구비한 3L 3구 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, 3-니트로피라졸-5-카복실산(28.0g, 178mmol) 및 THF(420mL)로 충전시키며 얼음/아세톤 조를 사용하여 -5℃로 냉각시켰다. 보란-THF 착체 용액(1.0M, 535mL, 535mmol)을 내부 반응 온도를 5℃ 미만으로 유지하는 속도로 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 냉각조를 제거하고, 반응물을 18시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 시간 후, 반응물을 얼음/아세톤 조를 사용하여 -5℃로 냉각시키고, 물(70mL) 및 4N 염산(70mL)을 첨가하며, 피라졸과의 보란 착체를 파괴하기 위하여 반응물을 1시간 동안 환류에서 교반하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 대략 30mL의 부피로 감압 하에서 농축시켰다. 에틸 아세테이트(175mL)를 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 수성 층을 분리하고, 에틸 아세테이트(4 × 200mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 포화 수성 중탄산나트륨(2 × 50mL), 염수(50mL)로 세척하고 황산나트륨 상에서 건조시키며, 건조제를 여과에 의해 제거하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켜, 담황색 고체로서 94% 수율(24.0g)의 (3-니트로-1H-피라졸-5-일)메탄올 101h를 제공하였다: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 13.90 (br s, 1H), 6.87 (s, 1H), 5.58 (t, 1H, J = 5.4 Hz), 4.53(d, 2H, J = 5.1 Hz); MS (ESI+) m/z 144.0 (M+H).
실시예 101i (1-(2-브로모에틸)-3-니트로-1H-피라졸-5-일)메탄올 101i
Figure 112013027357114-pct00033
기계적 교반기 및 온도조절기를 구비한 1L 3구 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, (3-니트로-1H-피라졸-5-일)메탄올 101h(25.0g, 175mmol), DMF(250mL), 및 탄산세슘(70.0g, 215mmol)을 충전하며, 5분 동안 104℃에서 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 얼음/아세톤 조를 사용하여 0℃로 냉각시키고, 디브로모에탄(329g, 1.75mol)을 분획으로 첨가하였다(발열 없음). 반응물을 1 동안 0℃에서 교반하고 나서, 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 시간 후, 물(400mL) 중 KH2PO4(40g)의 용액을 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. 에틸 아세테이트(450mL)를 첨가하고, 수성 층을 분리하며, 에틸 아세테이트(2 × 100mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 물(200mL), 염수(200mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키며, 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시켜, 오렌지색 오일로서 86% 수율(37.5g)의 조 물질(crude)(1-(2-브로모에틸)-3-니트로-1H-피라졸-5-일)메탄올(101i)을 제공하였다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6.85 (s, 1H), 4.82 (d, 2H, J = 5.4 Hz), 4.66 (t, 2H, J = 6.3 Hz), 3.83 (t, 2H, J = 6.3 Hz); MS (ESI+) m/z 249.9 (M+H). 이 물질을 다음 단계에 직접 사용하였다.
실시예 101j 1-(2-브로모에틸)-5-(브로모메틸)-3-니트로-1H-피라졸 101j
Figure 112013027357114-pct00034
자기 교반기, 질소 주입구 및 환류 응축기를 구비한 500mL 3구 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, (1-(2-브로모에틸)-3-니트로-1H-피라졸-5-일)메탄올 101j(37.0g, 148mmol) 및 클로로포름(160mL)으로 충전하였다. 반응물을 얼음/아세톤 조를 사용하여 -5℃로 냉각시키고, 삼브롬화인(40.0g, 148mmol)을 분획으로 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 반응물을 2시간 동안 환류에서 교반하였다. 이 시간 후, 반응물을 -5℃로 냉각시키고, pH 8.5에 도달할 때까지 포화 수성 중탄산나트륨(250mL)을 첨가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(3 × 150mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 포화 수성 탄산나트륨(2 × 50mL), 염수(75mL)로 세척하며, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시켜 황색 잔류물을 제공하였으며, 이를 온화하게 가열하면서 메틸렌 클로라이드(60mL) 중에 용해시켰다. 헥산(대략 20mL)을 첨가하였으며 용액은 흐려졌다. 혼합물을 고체 침전물이 형성될 때까지 가열하고, 메틸렌 클로라이드(9mL)를 첨가하였으며 용액은 투명해졌다. 이 용액을 실온으로 냉각되게 방치하였으며, 4시간 후 생성된 결정을 진공 여과에 의해 수집하였다. 여과 케이크를 빙랭된 메틸렌 클로라이드:헥산의 1:2 혼합물(2 × 20mL)로 세척하여 1-(2-브로모에틸)-5-(브로모메틸)-3-니트로-1H-피라졸(101j)(19.7g)을 제공하였다. 합한 여과액을 증발시키고, 이 절차를 다시 수행하여 추가 9.70g의 1-(2-브로모에틸)-5-(브로모메틸)-3-니트로-1H-피라졸을 제공하였다. 고체를 합하고 18시간 동안 고진공 하에서 건조시켜, 백색 결정으로서 57% 수율(26.0g)의 1-(2-브로모에틸)-5-(브로모메틸)-3-니트로-1H-피라졸을 제공하였다: mp 95℃~97℃; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6.93 (s, 1H), 4.63 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 4.54 (s, 2H), 3.86 (t, 2H, J = 6.0 Hz).
실시예 101k 5-메틸-2-니트로-4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진 101k
Figure 112013027357114-pct00035
자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 1L 1구 둥근바닥 플라스크를 THF(350mL), 1-(2-브로모에틸)-5-(브로모메틸)-3-니트로-1H-피라졸 101j(10.0g, 32.2mmol), THF 중 2M 메틸아민 용액(113mL, 225mmol)으로 충전하고, 72시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 시간 후, 반응물을 감압 하에서 농축 건조시키고, 생성된 고체를 에틸 아세테이트(75mL) 및 10% 수성 탄산칼륨(75mL)의 혼합물과 함께 교반하였다. 수성 층을 분리하고, 에틸 아세테이트(2 × 75mL)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 10% 수성 탄산칼륨(75mL)에 이어 염수(50mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켜, 황색 고체로서 97% 수율(5.70g)의 5-메틸-2-니트로-4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진 101k를 제공하였다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d 6.62 (s, 1H), 4.28 (t, 2H, J = 5.4 Hz), 3.67 (s, 2H), 2.95 (t, 2H, J = 5.4 Hz), 2.52 (s, 3H); MS (ESI+) m/z 183.0 (M+H).
실시예 101l 5-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진-2-아민 101l
Figure 112013027357114-pct00036
500mL 파르 반응병을 질소로 퍼징하고, 탄소 상의 10% 팔라듐(50% 습윤, 800mg 건조 중량) 및 에탄올(160mL) 중 5-메틸-2-니트로-4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진 101k(4.00g, 2.20mmol)의 용액으로 충전하였다. 이 병을 파르 수소화 장치에 부착하고, 소기하며, 수소 가스로 45psi의 압력까지 충전하고, 2시간 동안 진탕하였다. 이 시간 후, 수소를 소기하고, 질소를 병 내로 충전하였다. Celite 521(1.0g)을 첨가하고, 혼합물을 Celite 521의 패드를 통해 여과하였다. 여과 케이크를 에탄올(2 × 75mL)로 세척하고, 합한 여과액을 감압 하에서 농축 건조시켜, 오렌지색 고체로서 99% 수율의 5-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진-2-아민(101l)(3.31g)을 제공하였다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.34 (s, 1H), 3.98 (t, 2H, J = 5.4 Hz), 3.52 (s, 3H), 2.84 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 2.45 (s, 3H); MS (ESI+) m/z 153.1 (M+H).
실시예 101m 6-클로로-4-(5-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진-2-일아미노)피리다진-3(2H)-온 101m
Figure 112013027357114-pct00037
자기 교반기, 환류 응축기 및 질소 주입구를 구비한 50mL 1구 둥근바닥 플라스크를 1,4-디옥산(5.0mL), 5-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진-2-아민 101l(152mg, 1.00mmol), 4-브로모-6-클로로피리다진-3(2H)-온(209mg, 1.00mmol) 및 LiHMDS의 1M THF 용액(5.0mL, 5.00mmol)으로 충전하였다. 생성된 용액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, Xantphos(49mg, 0.05mmol) 및 트리스(디벤질리덴아세톤) 디팔라듐(0)(59mg, 0.085mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 3시간 동안 환류에서 가열하였다. 이 시간 후, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 물(10mL)을 첨가하였다. 2N 염산을 사용하여 pH를 6.5로 조정하였다. 생성된 침전물을 진공 여과에 의해 수집하고, 물(2 × 25mL)로 세척하며, 실리카 겔 상에 흡수키시고, 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 담갈색 고체로서 74% 수율(210mg)의 6-클로로-4-(5-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진-2-일아미노)피리다진-3(2H)-온 101m을 제공하였다: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 12.94 (s, 1H), 9.55 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 5.96 (s, 1H), 4.04 (t, 1H, J = 5.7 Hz), 3.53 (s, 2H), 2.82 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 2.36 (s, 3H); MS (ESI+) m/z 281.1 (M+H).
실시예 101 6-(3-{2-tert-부틸-6-옥소-4H,5H,6H-티에노[2,3-c]피롤-5-일}-2-메틸페닐)-4-({5-메틸-4H,5H,6H,7H-피라졸로[1,5-a]피라진-2-일}아미노)-2,3-디하이드로피리다진-3-온 101
건조된 압력 플라스크 내에 0.968mmol의 101m, 1.065mmol의 101g, 및 56mg(5몰%)의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)을 넣었다. 이 플라스크를 진공 하에서 소기하고 나서, 질소로 충전하였다. 이 절차를 2회 더 반복하고 나서, 8mL의 무수 디옥산 및 2.4mL(2.5당량)의 1M 탄산나트륨 수용액을 첨가하고, 혼합물을 18시간 동안 100o에서 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 나서, 에틸 아세테이트로 희석시키고, 포화 NaCl 수용액으로 4회 세척하며, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, Biotage 25M KP NH 컬럼 상에서 크로마토그래피로 정제하여 101을 제공하였다: 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.96 (s, 1H), 9.19 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.54 - 7.32 (m, 3H), 7.15 (s, 1H), 5.97 (s, 1H), 4.78 (s, 2H), 3.97 (t, J = 5.3, 2H), 3.52 (s, 2H), 2.80 (t, J = 5.4, 2H), 2.36 (s, 3H), 2.11 (d, J = 12.1, 3H), 1.42 (s, 9H). ESIMS m/z = 530.2 (M+1).
실시예 102
실시예 102a 4-tert-부틸-N,N-디에틸-2-포르밀벤즈아미드 102a
Figure 112013027357114-pct00038
자기 교반기 및 환류 응축기를 구비한 1L 3구 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, TMEDA(11.6g, 100mmol) 및 THF(160mL)로 충전하였다. 반응물을 -70℃로 냉각시키고, s-BuLi(헥산 중 1.4M, 69mL, 96.7mmol)를 적가하고, 반응물을 25분 동안 -70℃에서 교반하였다. 질소 하에서 자기 교반기를 구비한 별개의 100mL 3구 둥근바닥 플라스크를 4-tert-부틸-N,N-디에틸벤즈아미드(18.6g, 79.8mmol) 및 THF(50mL)로 충전하였다. 이 용액을 -70℃로 냉각시키고, -75℃ 내지 -70℃의 온도를 유지하면서 8분에 걸쳐 TMEDA/s-BuLi의 차가운(-75℃) 용액 내로 캐뉼러로 주입하였다. 첨가가 완료된 후, 반응물을 20분 동안 -70℃에서 교반하였다. 이 시간 후, DMF(17.9g, 245mmol)를 -70℃ 미만으로 온도를 유지하면서 2분에 걸쳐 적가하였다. 70분 동안 -70℃에서 교반한 후, 냉각조를 제거하고, 반응물을 20분에 걸쳐 -30℃로 가온되게 하였다. 이 시점에서, 4M 염산(80mL, 320mmol)을 첨가하였다(용액 pH 6.5). 30분 동안 교반한 후, 유기 층을 분리하고 감압 하에서 농축 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 헥산(200mL)과 물(200mL) 사이에 분배시켰다. 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키며 여과하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 황색 오일로서 88% 수율(18.3g)의 102a를 제공하였다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10.0 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.71 (d, 1H, J = 6.3 Hz), 7.28 (d, 1H, J = 6.4 Hz), 3.62 (m, 2H), 3.18 (m, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.31 (t, 3H, J = 7.2 Hz), 1.07 (t, 3H, J = 7.1 Hz).
실시예 102b 메틸 5-tert-부틸-2-(디에틸카바모일)벤질카바메이트 102b
Figure 112013027357114-pct00039
자기 교반기를 구비한 25mL 마이크로파 바이알을 102a(1.00g, 3.83mmol), 메틸 카바메이트(575mg, 7.66mmol), 트리플루오로아세트산(871mg, 7.66mmol), 트리에틸실란(888mg, 7.66mmol) 및 아세토니트릴(10mL)로 충전하였다. 바이알을 Biotage 마이크로파 내에 넣고, 1.5시간 동안 130℃에서 가열하였다. 이 시간 후, 이 용액을 진공 중에서 농축시켰다. 생성된 잔류물을 메틸렌 클로라이드(100mL)와 포화 수성 중탄산나트륨(30mL) 사이에 분배시켰다. 수성 층을 메틸렌 클로라이드(3 × 20mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(30mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키며, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카, 0% 내지 60% 에틸 아세테이트/헥산)로 정제하여, 무색 오일로서 71% 수율(858mg)의 102b를 제공하였다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.42 (s, 1H), 7.29 (m, 1H), 7.12 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 5.60 (br s, 1H), 4.27 (br s, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.57 (q, 2H, J = 6.8 Hz), 3.20 (q, 2H, J = 6.7 Hz), 1.31 (s, 9H), 1.26 (t, 3H, J = 6.7 Hz), 1.09 (t, 3H, J = 6.8 Hz); MS (ESI+) m/z 321.2 (M+H).
실시예 102c 5-tert-부틸이소인돌린-1-온 102c
Figure 112013027357114-pct00040
자기 교반기를 구비한 25mL 마이크로파 바이알을 102b(858mg, 2.68mmol), 테트라하이드로푸란(5mL), 메탄올(5mL) 및 2M 수성 수산화리튬(5mL)으로 충전하였다. 바이알을 Biotage 마이크로파 내에 넣고, 2.5시간 동안 110℃에서 가열하였다. 이 시간 후, 이 용액을 2M 염산을 사용하여 pH 7로 중화시키고, 진공 중에서 농축시켰다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트(150mL)와 물(30mL) 사이에 분배시켰다. 수성 층을 에틸 아세테이트(3 × 20mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(30mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키며, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카, 50% 에틸 아세테이트 내지 100% 에틸 아세테이트/헥산)로 정제하여, 황백색 고체로서 56% 수율(285mg)의 102c를 제공하였다: mp = 132℃~134℃; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.80 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.52 (m, 2H), 6.71 (br s, 1H), 4.44 (s, 2H), 1.37 (s, 9H), MS (ESI+) m/z 190.1 (M+H).
실시예 102d 2,6-디브로모벤질 아세테이트 (2d 1,3-디브로모-2-(브로모메틸)벤젠 102d
Figure 112013027357114-pct00041
자기 교반기, 환류 응축기 및 질소 주입구를 구비한 250mL 1구 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, 2,6-디브로모톨루엔(2.50g, 10.0mmol), N-브로모석신이미드(1.78g, 10.0mmol) 및 사염화탄소(40mL)로 충전하였다. 이 용액을 80℃(유조 온도)로 가열하고, 2,2'-아조비스이소부티로니트릴(164mg, 1.00mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 14시간 동안 환류하였다. 이 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 여과 케이크를 사염화탄소(2 × 20mL)로 세척하였다. 여과액을 에틸 아세테이트(200mL)로 희석시키고, 물(40mL), 포화 수성 중탄산나트륨(40mL) 및 염수(40mL)로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 황색 고체로서, 정량적인 수율(3.28g)의 1,3-디브로모-2-(브로모메틸)벤젠을 제공하였다: mp 77℃~78℃; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.55 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.07 (t, 1H, J = 8.1 Hz), 4.83 (s, 2H). 자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 250mL 1구 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, 이 잔류물(3.28g, 10.0mmol), 아세트산칼륨(3.93g, 40.0mmol) 및 DMF(100mL)로 충전하였다. 이 용액을 14시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 시간 후, 반응 혼합물을 물(900mL)로 희석시키고, 에틸 아세테이트(3 × 200mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(100mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키며, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 황백색 고체로서 88% 수율(2.70g)의 102d를 제공하였다: mp 62℃~65℃; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.57 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.07 (t, 1H, J = 7.9 Hz), 5.42 (s, 2H), 2.11 (s, 3H); MS (ESI+) m/z 306.9 (M+H).
실시예 102e 2-브로모-6-(5-tert-부틸-1-옥소이소인돌린-2-일)벤질 아세테이트 102e
Figure 112013027357114-pct00042
환류 응축기, 자기 교반기를 구비한 100mL 3구 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, 102c(570mg, 3.02mmol), 102d(1.85g, 6.04mmol), 탄산세슘(1.96g, 6.04mmol), N, N'-디메틸-에틸렌디아민(266mg, 3.02mmol), 및 1,4-디옥산(27mL)으로 충전하였다. 생성된 현탁액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, 요오드화구리(287mg, 1.51mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 14시간 동안 105℃(유조 온도)에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 여과액을 에틸 아세테이트(150mL) 및 물(30mL)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 에틸 아세테이트(3 × 50mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카, 0% 내지 50% 에틸 아세테이트/헥산)로 정제하여, 황백색 고체로서 41% 수율(555mg)의 102e를 제공하였다: mp 176℃~178℃; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.86 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.66 (dd, 1H, J = 7.9, 1.5 Hz), 7.59 (dd, 1H, J = 8.1, 1.5 Hz), 7.52 (s, 1H), 7.29 (m, 2H), 5.20 (s, 2H), 4.77 (s, 2H), 1.99 (s, 3H), 1.40 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 416.1 (M+H).
실시예 102f 2-(5-tert-부틸-1-옥소이소인돌린-2-일)-6-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질 아세테이트 102f
Figure 112013027357114-pct00043
환류 응축기, 자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 100mL 3구 둥근바닥 플라스크를 102e(555mg, 1.34mmol), 4,4,4',4',5,5,5',5'-옥타메틸-2,2'-바이(1,3,2-디옥사보롤란)(1.36g, 5.35mmol), 아세트산칼륨(527mg, 5.35mmol) 및 1,4-디옥산(20mL)으로 충전하였다. 생성된 현탁액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, XPhos(128mg, 0.268mmol) 및 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(123mg, 0.134mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 14시간 동안 105℃(유조 온도)에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 여과 케이크를 에틸 아세테이트(3 × 20mL)로 세척하였다. 여과액을 에틸 아세테이트(150mL) 및 물(40mL)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 에틸 아세테이트(3 × 50mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜, 황색 오일로서 74% 수율(444mg)의 조 물질 102f를 제공하였다. 이 물질을 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
실시예 102g 6-클로로-4-(1-에틸-1H-피라졸-3-일아미노)-2-메틸피리다진-3(2H)-온 102g
Figure 112013027357114-pct00044
101m의 제조에 대해 기재된 바와 동일한 일반적 절차를 사용하여, 1-에틸-3-아미노-1H -피라졸(500mg, 4.50mmol)을 4-브로모-6-클로로피리다진-3(2H)-온(1.00g, 4.50mmol)과 반응시켜, 무정형 황색 고체로서 94% 수율(1.07g)의 102g를 제공하였다: mp 173℃~175℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 9.61 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.64 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.19 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.10 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.65 (s, 3H), 1.37 (t, J = 7.2 Hz, 3H); MS (ESI+) m/z 254.0 (M+H).
실시예 102 5-tert-부틸-2-(3-(5-(1-에틸-1H-피라졸-3-일아미노)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리다진-3-일)-2-(하이드록시메틸)페닐)이소인돌린-1-온 102
자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 100mL 1구 둥근바닥 플라스크를 102g(548mg, 1.18mmol), 102f(215mg, 0.848mmol), 탄산나트륨(306mg, 2.88mmol), DMF(2mL), 물(2mL) 및 1,4-디옥산(10mL)으로 충전하였다. 생성된 현탁액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(222mg, 0.192mmol)을 첨가하였다. 환류 응축기를 플라스크에 부착하고, 반응 혼합물을 14시간 동안 100℃에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 90:10 메틸렌 클로라이드/메탄올(100mL) 및 물(75mL)로 희석시키고, 이들 층을 분리하였다. 수성 층을 90:10 메틸렌 클로라이드/메탄올(2 × 30mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 염수(100mL)로 세척하며, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 THF(5mL), 물(5mL) 및 메탄올(5mL) 중에 용해시켰다. 수산화리튬 1수화물(202mg, 4.81mmol)을 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 시간 후, 혼합물을 90:10 메틸렌 클로라이드/메탄올(150mL) 및 물(100mL)로 희석시키고, 이들 층을 분리하였다. 수성 층을 90:10 메틸렌 클로라이드/메탄올(2 × 100mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 염수(100mL)로 세척하며, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카, 90:10 메틸렌 클로라이드/메탄올)로 정제하여, 무정형 백색 고체로서 31% 수율(136mg)의 102를 제공하였다: mp 174℃~176℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.18 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.73 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.62-7.60 (m, 2H), 7.52 (t, J = 3.0 Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.46-7.44 (m, 1H), 6.19 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 4.92 (s, 2H), 4.66 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.43 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 4.04 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.76 (s, 3H), 1.36 (s, 9H), 1.33 (t, J = 7.0 Hz, 3H); MS (ESI+) m/z 513.3 (M+H).
실시예 103
실시예 103a 4-브로모-6-클로로-2-메틸피리다진-3(2H)-온 103a
Figure 112013027357114-pct00045
자기 교반기를 구비한 250mL 1구 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, 4-브로모-6-클로로피리다진-3(2H)-온(1.00g, 4.77mmol) 및 DMF(15mL)로 충전하였다. 수소화나트륨(오일 중 60중량%, 229mg, 5.73mmol)을 한꺼번에 첨가하였다. 10분 동안 실온에서 교반한 후, 요오도메탄(1.02g, 7.16mmol)을 첨가하고, 반응물을 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 반응물을 수성 포화 중탄산나트륨(10mL)으로 켄칭하고, 생성된 용액을 물(150mL)에 부었다. 이어서, 혼합물을 에틸 아세테이트(250mL)로 추출하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 이어서, 건조제를 여과에 의해 제거하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켜 잔류물로 하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 백색 고체로서 68% 수율(722mg)의 103a를 제공하였다: mp 107℃~108℃; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.62 (s, 1H), 3.81 (s, 3H).
실시예 103b 6-클로로-2-메틸-4-(피리미딘-4-일아미노)피리다진-3(2H)-온 103b
Figure 112013027357114-pct00046
101m의 제조에 대해 기재된 바와 동일한 일반적 절차를 사용하여, 2-아미노피리미딘(450mg, 4.74mmol)을 103a(1.06g, 4.74mmol)와 반응시켜, 무정형 황색 고체로서 69% 수율(745mg)의 103b를 제공하였다: mp 233℃~235℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 10.05 (s, 1H), 8.92 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 8.54 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 8.45 (s, 1H), 7.58 (dd, J = 6.0, 1.0 Hz, 1H), 3.70 (s, 3H); MS (ESI+) m/z 238.0 (M+H).
실시예 103 5-tert-부틸-2-(2-(하이드록시메틸)-3-(1-메틸-6-옥소-5-(피리미딘-4-일아미노)-1,6-디하이드로피리다진-3-일)페닐)이소인돌린-1-온 103
Figure 112013027357114-pct00047
102의 제조에 대해 기재된 바와 동일한 일반적 절차를 사용하여, 103b(192mg, 0.810mmol)를 102f(413mg, 0.891mmol)와 반응시켜, 무정형 황백색 고체로서 49% 수율(196mg)의 103을 제공하였다: mp 236℃~238℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.87 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.49 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.62 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.55-7.53 (m, 3H), 7.52-7.47 (m, 1H), 4.93 (s, 2H), 4.73 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 1.36 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 497.2 (M+H).
실시예 104
실시예 104a 6-클로로-2-메틸-4-(피리딘-2-일아미노)피리다진-3(2H)-온 104a
Figure 112013027357114-pct00048
환류 응축기, 자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 250mL 3구 둥근바닥 플라스크를 2-아미노피리딘(500mg, 5.31mmol), 103a(1.19g, 5.31mmol), 탄산세슘(5.19g, 15.9mmol), 및 1,4-디옥산(75mL)으로 충전하였다. 생성된 현탁액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, Xantphos(261mg, 0.451mmol) 및 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(243mg, 0.266mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 3시간 동안 환류에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트(350mL) 및 물(40mL)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 메틸렌 클로라이드 중 메탄올의 20%(v/v) 용액(3 × 100mL)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 메탄올(30mL)과 함께 분쇄하여, 황백색 고체로서 92% 수율(1.16g)의 104a를 제공하였다: mp 201℃~202℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 9.64 (s, 1H), 8.38 (m, 2H), 7.75 (m, 1H), 7.54 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.03 (m, 1H), 3.67 (s, 3H); MS (ESI+) m/z 237.0 (M+H).
실시예 104 5-tert-부틸-2-(2-(하이드록시메틸)-3-(1-메틸-6-옥소-5-(피리딘-2-일아미노)-1,6-디하이드로피리다진-3-일)페닐)이소인돌린-1-온 104
환류 응축기, 자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 50mL 3구 둥근바닥 플라스크를 104a(236mg, 1.00mmol), 102f(536mg, 1.20mmol), 탄산나트륨(318mg, 3.00mmol), DMF(5mL), 물(2.5mL) 및 1,4-디옥산(8mL)으로 충전하였다. 생성된 현탁액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(116mg, 0.100mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 14시간 동안 환류에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트(150mL) 및 물(30mL)로 희석시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 에틸 아세테이트(3 × 50mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 THF(8mL), 메탄올(4mL) 및 물(4mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 생성된 용액에 수산화리튬 1수화물(420mg, 10.0mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하고 나서, 진공 중에서 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(150mL)와 물(30mL) 사이에 분배시켰다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 에틸 아세테이트(3 × 50mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카, 0% 내지 10% 메탄올/메틸렌 클로라이드)로 정제하여, 황백색 고체로서 38% 수율(187mg)의 104를 제공하였다: mp 236℃~237℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.40 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.28 (dd, 1H, J = 5.0, 1.6 Hz), 7.71 (m, 3H), 7.61 (dd, 1H, J = 7.9, 1.5 Hz), 7.50 (m, 4H), 6.96 (m, 1H), 4.93 (s, 2H), 4.68 (t, 1H, J = 4.9 Hz), 4.42 (d, 2H, J = 5.0 Hz), 3.79 (s, 3H), 1.36 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 496.2 (M+H).
실시예 105
실시예 105a tert-부틸 3-(3-니트로-1H-피라졸-1-일)아제티딘-1-카복실레이트 105a
Figure 112013027357114-pct00049
자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 100mL 1구 둥근바닥 플라스크를 DMF(20mL), 3-니트로-1H-피라졸(1.00g, 8.84mmol), N- tert-부톡시카보닐-3-요오도아제티딘(3.00g, 10.6mmol) 및 탄산칼륨(2.45g, 17.7mmol)으로 충전하고, 반응 혼합물을 16시간 동안 60℃에서 교반하였다. 이 시간 후, 반응물을 감압 하에서 농축 건조시키고, 생성된 잔류물을 메틸렌 클로라이드(15mL) 및 물(15mL)과 혼합하였다. 수성 층을 분리하고, 메틸렌 클로라이드(2 × 15mL)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 황색 오일로서 80% 수율(1.92g)의 105a를 제공하였다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.64 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 5.13 (m, 1H), 4.44 (m, 2H), 4.33 (m, 2H), 1.47 (s, 9H).
실시예 105b tert-부틸 3-(3-아미노-1H-피라졸-1-일)아제티딘-1-카복실레이트 105b
Figure 112013027357114-pct00050
500mL 파르 반응병을 질소로 퍼징하고, 탄소 상의 10% 팔라듐(50% 습윤, 100mg 건조 중량) 및 에탄올(25mL) 중 105a(1.91g, 7.23mmol)의 용액으로 충전하였다. 이 병을 파르 수소화 장치에 부착하고, 소기하며, 수소 가스로 50psi의 압력까지 충전하고, 4시간 동안 진탕하였다. 이 시간 후, 수소를 소기하고, 질소를 병 내로 충전하였다. Celite 521(5g)을 첨가하고, 혼합물을 Celite 521의 패드를 통해 여과하였다. 여과 케이크를 에탄올(2 × 25mL)로 세척하고, 합한 여과액을 감압 하에서 농축 건조시켜, 담황색 오일로서 100% 수율의 105b(1.76g)를 제공하였다: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.22 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 5.61 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 4.80 (quant, 1H, J = 7.0 Hz), 4.25 (d, 4H, J = 7.0 Hz), 3.77 (br s, 2H), 1.41 (s, 9H).
실시예 105c tert-부틸 3-(3-(6-클로로-2-메틸-3-옥소-2,3-디하이드로피리다진-4-일아미노)-1H-피라졸-1-일)아제티딘-1-카복실레이트 105c
Figure 112013027357114-pct00051
자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 100mL 1구 둥근바닥 플라스크를 105b(677mg, 2.84mmol), 103a(635mg, 2.84mmol), 탄산세슘(1.85g, 5.68mmol) 및 1,4-디옥산(14mL)으로 충전하였다. 생성된 현탁액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, Xantphos(246mg, 0.426mmol) 및 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(260mg, 0.284mmol)을 첨가하였다. 환류 응축기를 플라스크에 부착하고, 반응 혼합물을 2.5시간 동안 환류에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 에틸 아세테이트(200mL) 및 물(75mL)로 희석시키며, 이들 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(50mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카, 95:5 메틸렌 클로라이드/메탄올)로 정제하여, 무정형 백색 고체로서 73% 수율의 105c(794mg)를 제공하였다: mp 154℃~156℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.95 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.43 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.01 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 5.00-4.95 (m, 1H), 4.39-4.32 (m, 4H), 3.79 (s, 3H), 1.48 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 403.1 (M+Na).
실시예 105d tert-부틸 3-(3-(6-(3-(5-tert-부틸-1-옥소이소인돌린-2-일)-2-(하이드록시-메틸)페닐)-2-메틸-3-옥소-2,3-디하이드로피리다진-4-일아미노)-1H-피라졸-1-일)-아제티딘-1-카복실레이트 105d
Figure 112013027357114-pct00052
103의 제조에 대해 기재된 바와 동일한 일반적 절차를 사용하여, 105c(150mg, 0.394mmol)를 102f(201mg, 0.433mmol)와 반응시켜 조 생성물 105d를 제공하였으며, 이를 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
실시예 105 2-(3-(5-(1-(아제티딘-3-일)-1H-피라졸-3-일아미노)-1-메틸-6-옥소-1,6-디하이드로피리다진-3-일)-2-(하이드록시메틸)페닐)-5-tert-부틸이소인돌린-1-온 105
자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 100mL 1구 둥근바닥 플라스크를 상기에서 제조된 조 물질 105d(0.394mmol, 정량적인 수율로 추정), 무수 메틸렌 클로라이드(5mL) 및 트리플루오로아세트산(5mL)으로 충전하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 시간 후, 혼합물을 농축 건조시키고, 잔류물을 물(50mL)로 희석시키며, 포화 수성 중탄산나트륨을 사용하여 이 용액의 pH를 8.0으로 조정하였다. 혼합물을 10% 메탄올/메틸렌 클로라이드(100mL)로 희석시키고, 이들 층을 분리하였다. 수성 층을 10% 메탄올/메틸렌 클로라이드(2 × 50mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카, 80:20 메틸렌 클로라이드/메탄올)로 정제하여, 무정형 황백색 고체로서 9% 수율(18mg)의 105를 제공하였다: mp 202℃~204℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.29 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.72-7.69 (m, 3H), 7.63 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.53-7.48 (m, 3H), 6.23 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.09-5.06 (m, 1H), 4.94 (s, 2H), 4.79 (s, 1H), 4.52 (s, 2H), 3.92 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.64 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.36 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 540.3 (M+H).
실시예 106
실시예 106a 메틸 2-시아노-4-플루오로벤조에이트 106a
Figure 112013027357114-pct00053
자기 교반기를 구비한 100mL 1구 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, 메틸 2-클로로-4-플루오로벤조에이트(10.0g, 53.0mmol), 시안화구리(I)(5.22g, 58.3mmol) 및 2-메틸피롤리디논(30mL)으로 충전하였다. 1.5시간 동안 195℃에서 가열한 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물(600mL)에 부었다. 생성된 현탁액을 여과하고, 여과 케이크를 물(100mL)로 세척하였다. 이어서, 수득된 고체에 물(110mL) 중 시안화나트륨(3.00g, 61.2mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 50분 동안 실온에서 교반하였다. 이 시간 후, 에틸 아세테이트(500mL)를 첨가하고, 이들 층을 분리하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트(2 × 10mL)로 추출하고, 유기 추출물을 합하며, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하며, 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 백색 고체로서 73% 수율(6.99g)의 106a를 제공하였다: mp 92℃~93℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.18 (dd, 1H, J = 9.0, 5.5 Hz), 7.50 (dd, 1H, J = 8.0, 2.5 Hz), 7.38 (m, 1H), 4.01 (s, 3H).
실시예 106b 5-플루오로이소인돌린-1-온 106b
Figure 112013027357114-pct00054
250mL 파르 반응병을 질소로 퍼징하고, 라니 니켈(4.00g) 및 에탄올(20mL) 중 106a(2.00g, 11.2mmol)의 용액을 충전하였다. 이 병을 파르 수소화 장치에 부착하고, 소기하며, 수소 가스로 50psi의 압력까지 충전하고, 16시간 동안 진탕하였다. 이 시간 후, 수소를 소기하고, 질소를 병 내로 충전하였다. Celite 521(5.00g)을 첨가하고, 혼합물을 Celite 521의 패드를 통해 여과하였다. 여과 케이크를 에탄올(2 × 75mL)로 세척하고, 합한 여과액을 감압 하에서 농축 건조시켜, 무색 오일로서 76% 수율의 106b(1.29g)를 제공하였다: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.85 (dd, 1H, J = 8.5, 5.5 Hz), 7.21-7.16 (m, 2H), 7.05 (br s, 1H), 4.56 (s, 2H).
실시예 106c 5-(에틸(메틸)아미노)이소인돌린-1-온 106c
Figure 112013027357114-pct00055
500mL 고압 봄베 반응기를 106b(539mg, 3.57mmol), 에탄올(30mL) 및 과량의 N,N-에틸메틸아민(50mL)으로 충전하였다. 혼합물을 36시간 동안 165℃에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 농축시키고, 생성된 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카, 98:2 에틸 아세테이트/트리에틸-아민)로 정제하여, 황색 고체로서 59% 수율(397mg)의 106c를 제공하였다: mp 127℃~129℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 7.93 (s, 1H), 7.42 (dd, J = 7.0, 2.5 Hz, 1H), 6.77-6.75 (m, 2H), 4.23 (s, 2H), 3.46 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.94 (s, 3H), 1.06 (t, J = 7.0 Hz, 3H); MS (ESI+) m/z 191.1 (M+H).
실시예 106d 2-브로모-6-(5-(에틸(메틸)아미노)-1-옥소이소인돌린-2-일)벤질 아세테이트 106d
Figure 112013027357114-pct00056
자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 100mL 1구 둥근바닥 플라스크를 106c(390mg, 2.05mmol), 102d(1.26g, 4.10mmol), 탄산세슘(1.34g, 4.10mmol), N,N'-디메틸에틸렌디아민(181mg, 2.05mmol) 및 1,4-디옥산(12mL)으로 충전하였다. 생성된 현탁액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, 요오드화구리(195mg, 1.03mmol)를 첨가하였다. 환류 응축기를 플라스크에 부착하고, 반응 혼합물을 16시간 동안 105℃에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 여과액을 에틸 아세테이트(150mL) 및 물(75mL)로 희석시키고, 이들 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(2 × 50mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 염수(100mL)로 세척하며, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카, 70:30 헥산/에틸 아세테이트)로 정제하여, 백색 고체로서 50% 수율(427mg)의 106d를 제공하였다: mp 97℃~99℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.74 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.63 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.30-7.25 (m, 2H), 6.80 (dd, J = 8.5, 2.0 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 4.69 (s, 2H), 3.51 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.21 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.19 (t, J = 7.0 Hz, 3H); MS (ESI+) m/z 417.1 (M+H).
실시예 106e 2-(5-(에틸(메틸)아미노)-1-옥소이소인돌린-2-일)-6-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)벤질 아세테이트 106e
Figure 112013027357114-pct00057
자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 100mL 1구 둥근바닥 플라스크를 106d(425mg, 1.02mmol), 4,4,4',4',5,5,5',5'-옥타메틸-2,2'-바이(1,3,2-디옥사보롤란)(777mg, 3.06mmol), 아세트산칼륨(400mg, 4.08mmol) 및 1,4-디옥산(15mL)으로 충전하였다. 생성된 현탁액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, XPhos(112mg, 0.235mmol) 및 트리스(디벤질리덴아세톤)-디팔라듐(0)(215mg, 0.235mmol)을 첨가하였다. 환류 응축기를 플라스크에 부착하고, 반응 혼합물을 3시간 동안 환류에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 에틸 아세테이트(100mL) 및 물(75mL)로 희석시키고, 이들 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(50mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 염수(50mL)로 세척하며, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카, 50:50 헥산/에틸 아세테이트)로 정제하여, 황색 오일로서 77% 수율(366mg)의 106e를 제공하였다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.75 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.54-7.51 (m, 1H), 7.39-7.35 (m, 2H), 6.80 (dd, J = 8.7, 2.1 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 5.13 (s, 2H), 4.72 (s, 2H), 3.51 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.02 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.34 (s, 12H), 1.19 (t, J = 7.2 Hz, 3H); MS (ESI+) m/z 465.2 (M+H).
실시예 106f 6-클로로-2-메틸-4-(5-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진-2-일아미노)피리다진-3(2H)-온 106f
Figure 112013027357114-pct00058
환류 응축기, 자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 250mL 3구 둥근바닥 플라스크를 103a(1.90g, 8.53mmol), 101l(1.18g, 7.75mmol) 및 1,4-디옥산(40mL)으로 충전하였다. 플라스크를 질소로 퍼징하고, 0℃로 냉각시켰다. THF 중 리튬 헥사메틸디실라자이드의 1M 용액(39mL, 39.0mmol)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, Xantphos(381mg, 0.659mmol) 및 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(355mg, 0.388mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 환류에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물(10mL)로 희석하였다. 2N 염산을 사용하여 이 용액의 pH를 7.6으로 조정하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 에틸 아세테이트(3 × 40mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 황백색 고체로서 76% 수율(1.74g)의 106f를 제공하였다: mp 184℃~186℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 9.62 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 6.00 (s, 1H), 4.04 (t, 2H, J = 5.1 Hz), 3.65 (s, 3H), 3.53 (s, 2H), 2.82 (t, 2H, J = 5.1 Hz), 2.37 (s, 3H); MS (ESI+) m/z 295.1 (M+H).
실시예 106 5-(에틸(메틸)아미노)-2-(2-(하이드록시메틸)-3-(1-메틸-5-(5-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진-2-일아미노)-6-옥소-1,6-디하이드로피리다진-3-일)페닐)이소인돌린-1-온 106
자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 250mL 1구 둥근바닥 플라스크를 106e(366mg, 0.788mmol), 106f(194mg, 0.656mmol), 탄산나트륨(348mg, 3.28mmol), DMF(2mL), 물(2mL) 및 1,4-디옥산(10mL)으로 충전하였다. 생성된 현탁액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, 테트라키스(트리-페닐포스핀)팔라듐(0)(152mg, 0.131mmol)을 첨가하였다. 환류 응축기를 플라스크에 부착하고, 반응 혼합물을 16시간 동안 환류에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 에틸 아세테이트(150mL) 및 물(100mL)로 희석시키고, 이들 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(2 × 100mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 염수(100mL)로 세척하며, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 THF(2mL), 물(2mL) 및 메탄올(2mL) 중에 용해시켰다. 수산화리튬 1수화물(138mg, 3.28mmol)을 첨가하고, 혼합물을 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 시간 후, 혼합물을 에틸 아세테이트(150mL) 및 물(100mL)로 희석시키고, 이들 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(2 × 100mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 염수(100mL)로 세척하며, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카, 90:10 메틸렌 클로라이드/메탄올)로 정제하여, 무정형 황백색 고체로서 14% 수율(51mg)의 106을 제공하였다: mp 145℃~147℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.20 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.55 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.49-7.47 (m, 2H), 7.41 (dd, J = 7.0, 2.0 Hz, 1H), 6.87-6.84 (m, 2H), 5.99 (s, 1H), 4.82 (s, 2H), 4.62 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 3.96 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.52-3.50 (m, 4H), 2.98 (s, 3H), 2.79 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H), 1.09 (t, J = 7.0 Hz, 3H); MS (ESI+) m/z 555.3 (M+H).
실시예 107
실시예 107a 3-(4-tert-부틸벤질)-1,1-디메틸우레아 107a
Figure 112013027357114-pct00059
자기 교반기를 구비한 250mL 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, 4-tert-부틸벤질(9.77g, 59.9mmol) 및 디클로로메탄(100mL)으로 충전하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(11.5g, 88.9mmol) 및 N,N-디메틸카바모일 클로라이드(6.08g, 56.6mmol)를 첨가한 데 이어 DMAP(730mg)를 첨가하였다. 밤새 주위 온도에서 교반한 후, 반응물을 물(100mL) 및 시트르산의 10% 수용액(2 × 100mL)으로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키며 여과하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 잔류물을 메틸 t-부틸 에테르(50mL) 및 헵탄(200mL)의 혼합물 중에 용해시키고 나서, 감압 하에서 농축시켜, 황색 고체로서 97% 수율의 107a(12.8g)를 제공하였다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.35 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 4.60 (br s, 1H), 4.39 (d, 2H, J = 5.4 Hz), 2.91 (s, 6H), 1.31 (s, 9H).
실시예 107b 5-tert-부틸-2-((3,3-디메틸우레이도)메틸)벤조산 107b
Figure 112013027357114-pct00060
자기 교반기, 첨가 깔때기 및 열전대를 구비한 500mL 3구 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, 107a(9.36g, 40.0mmol) 및 THF(120mL)로 충전하였다. 반응물을 -70℃로 냉각시키고, t-부틸리튬(펜탄 중 1.7M, 56mL, 95.2mmol)을 적가하였다. 반응물을 0.5시간 동안 -45℃ 내지 -35℃로 가온되게 하고 나서, -78℃로 다시 냉각시켰다. 이어서, 반응물을 질소의 유동 하에서 약 100g 내지 200g의 드라이 아이스로 충전된 1L 3구 둥근바닥 플라스크 내로 캐뉼러로 주입하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 나서, 감압 하에서 농축 건조시켰다. 물(250mL) 및 헥산(250mL)을 첨가하고, 이 용액을 진탕하였다. 수성 층을 분리하고, 메틸 t-부틸 에테르(150mL)로 추출하였다. 수성 층을 분리하고 나서, Cellpure P65를 통해 여과하여 이를 투명하게 하였다. 수성 여과액을 20mL의 12.1M 염산으로 산성화하고, 밤새 주위 온도에서 교반하였다. 이 시간 후, 수용액을 기울어 따라내고, 남아 있는 고체를 진공 하에서 밤새 건조시켜, 황갈색 고체로서 80% 수율의 107b(8.91g)를 제공하였다: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 12.97 (br s, 1H), 7.80 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 7.56 (dd, 1H, J = 6.0, 2.1 Hz), 7.32 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.78 (t, 1H, J = 5.7 Hz), 4.46 (d, 2H, J = 5.7 Hz), 2.82 (s, 6H), 1.28 (s, 9H).
실시예 107c 6-tert-부틸이소인돌린-1-온 107c
Figure 112013027357114-pct00061
자기 교반기 및 환류 응축기를 구비한 500mL 둥근바닥 플라스크를 107b(3.97g, 14.2mmol) 및 12.1N 염산(100mL)으로 충전하고, 가열 환류하였다. 트리플루오로아세트산(40mL)을 첨가하고, 반응물을 밤새 환류하였다. 이 시간 후, 혼합물을 탄산칼륨(대략 67g)을 사용하여 조심스럽게 pH 7.5로 중화시키고 나서, 메틸 t-부틸 에테르(100mL) 및 에틸 아세테이트(3 × 50mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키며 여과하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 백색 고체로서 29% 수율(788mg)의 107c를 제공하였다: mp 142℃~144℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.92 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.64 (dd, J = 8.5, 2.0 Hz, 1H), 7.42 (dd, J = 8.0, 0.5 Hz, 1H), 6.58 (s, 1H), 4.42 (s, 2H), 1.37 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 190.1 (M+H).
실시예 107d 2-(3-브로모-2-메틸페닐)-6-tert-부틸이소인돌린-1-온 107d
Figure 112013027357114-pct00062
자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 250mL 1구 둥근바닥 플라스크를 107c(775mg, 4.10mmol), 2,6-디브로모톨루엔(2.05g, 8.19mmol), 탄산세슘(2.67g, 8.19mmol), N, N' -디메틸에틸렌디아민(361mg, 4.10mmol) 및 1,4-디옥산(15mL)으로 충전하였다. 생성된 현탁액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, 요오드화구리(390mg, 2.05mmol)를 첨가하였다. 환류 응축기를 플라스크에 부착하고, 반응 혼합물을 16시간 동안 105℃에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 여과액을 에틸 아세테이트(100mL) 및 물(50mL)로 희석시키고, 이들 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(50mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 염수(50mL)로 세척하며, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카, 80:20 헥산/에틸 아세테이트)로 정제하여, 무정형 황백색 고체로서 66% 수율(972mg)의 107d를 제공하였다: mp 120℃~122℃; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.99 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.60 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.46 (dd, J = 8.0, 0.5 Hz, 1H), 7.22 (dd, J = 8.0, 1.0 Hz, 1H), 7.14 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.67 (s, 2H), 2.31 (s, 3H), 1.40 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 358.1 (M+H).
실시예 107e 6-tert-부틸-2-(2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)이소인돌린-1-온 107e
Figure 112013027357114-pct00063
자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 250mL 1구 둥근바닥 플라스크를 107d(968mg, 2.70mmol), 4,4,4',4',5,5,5',5'-옥타메틸-2,2'-바이(1,3,2-디옥사보롤란)(2.06g, 8.11mmol), 아세트산칼륨(1.06g, 10.8mmol) 및 1,4-디옥산(20mL)으로 충전하였다. 생성된 현탁액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, XPhos(296mg, 0.621mmol) 및 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(569mg, 0.621mmol)을 첨가하였다. 환류 응축기를 플라스크에 부착하고, 반응 혼합물을 3시간 동안 105℃에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 에틸 아세테이트(100mL) 및 물(50mL)로 희석시키고, 이들 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(50mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 염수(50mL)로 세척하며, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카, 70:30 헥산/에틸 아세테이트)로 정제하여, 황색 오일로서 81% 수율(900mg)의 107e를 제공하였다: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.99 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.81 (dd, J = 7.0, 1.5 Hz, 1H), 7.67-7.65 (m, 2H), 7.45-7.43 (m, 2H), 4.64 (s, 2H), 2.42 (s, 3H), 1.39 (s, 12H), 1.35 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 406.2 (M+H).
실시예 107 6-tert-부틸-2-(2-메틸-3-(5-(5-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진-2-일아미노)-6-옥소-1,6-디하이드로피리다진-3-일)페닐)이소인돌린-1-온 107
자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 250mL 1구 둥근바닥 플라스크를 107e(890mg, 2.20mmol), 101m(441mg, 1.57mmol), 탄산나트륨(832mg, 7.85mmol), DMF(5mL), 물(5mL) 및 1,4-디옥산(15mL)으로 충전하였다. 생성된 현탁액을 통해 30분 동안 질소를 버블링시킨 후, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(363mg, 0.314mmol)을 첨가하였다. 환류 응축기를 플라스크에 부착하고, 반응 혼합물을 16시간 동안 환류에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 에틸 아세테이트(100mL) 및 물(50mL)로 희석시키고, 이들 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트(2 × 100mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 염수(100mL)로 세척하며, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시키고, 생성된 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카, 95:5 메틸렌 클로라이드/메탄올)로 정제하여, 무정형 백색 고체로서 27% 수율(222mg)의 107을 제공하였다: mp 208℃~210℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 12.97 (s, 1H), 9.21 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.75-7.73 (m, 1H), 7.60 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.48 (dd, J = 7.5, 2.0 Hz, 1H), 7.40-7.38 (m, 2H), 5.96 (s, 1H), 4.84 (s, 2H), 3.97 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.51 (s, 2H), 2.79 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.36 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 524.3 (M+H).
실시예 108
실시예 108a 2-tert-부틸-5-(3-(1-(하이드록시메틸)-5-(5-메틸-4,5,6,7-테트라-하이드로피라졸로[1,5-a]피라진-2-일아미노)-6-옥소-1,6-디하이드로피리다진-3-일)-2-메틸페닐)-4H-티에노[2,3-c]피롤-6(5H)-온 108a
Figure 112013027357114-pct00064
자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 250mL 1구 둥근바닥 플라스크를 101(2.50g, 4.72mmol), 메탄올(30mL) 및 메탄올 중 포름알데하이드의 37% 용액(30mL, 100mmol)으로 충전하였다. 환류 응축기를 플라스크에 부착하고, 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 3시간 동안 60℃에서 가열하였다. 이 시간 후, 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하고, 부흐너 깔때기를 통해 여과하였다. 여과 케이크를 메탄올(3 × 5mL)로 세척하고, 12시간 동안 40℃에서 진공 하에서 건조시켜, 백색 고체로서 93% 수율(2.45g)의 108a를 제공하였다: mp 185℃~187℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.33 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.47 (m, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.77 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.43 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 4.78 (s, 2H), 3.97 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.51 (s, 2H), 2.79 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 1.41 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 530.2 (M+H).
실시예 108b (3-(3-(2-tert-부틸-6-옥소-4H-티에노[2,3-c]피롤-5(6H)-일)-2-메틸페닐)-5-(5-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진-2-일아미노)-6-옥소피리다진-1(6H)-일)메틸 비스(2-시아노에틸) 포스페이트 108b
Figure 112013027357114-pct00065
자기 교반기 및 질소 주입구를 구비한 100mL 1구 둥근바닥 플라스크를 108a(2.45g, 4.38mmol), 테트라졸(1.22g, 17.5mmol) 및 메틸렌 클로라이드(20mL)로 충전하였다. 메틸렌 클로라이드(2mL) 중 5c(2.37g, 8.76mmol)의 용액을 실온에서 첨가하고, 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 12시간 동안 교반하였다. 이 시간 후, 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 데칸 중 tert-부틸 하이드로퍼옥사이드의 5.5M 용액(4.8mL, 26.4mmol)을 적가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 메틸렌 클로라이드(200mL)로 희석시켰다. 유기 상을 포화 티오황산나트륨 용액(20mL) 및 포화 중탄산나트륨 용액(20mL)으로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 진공 여과에 의해 제거하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 백색 고체로서 36% 수율(1.20g)의 108b를 제공하였다: mp 208℃~210℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.55 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.49 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 5.9 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 5.97 (s, 1H), 4.78 (s, 2H), 4.22 (q, J = 6.0 Hz, 4H), 3.97 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.52 (s, 2H), 2.92 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 2.79 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 1.41 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 746.3 (M+H).
실시예 108 나트륨 (3-(3-(2-tert-부틸-6-옥소-4H-티에노[2,3-c]피롤-5(6H)-일)-2-메틸페닐)-5-(5-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진-2-일아미노)-6-옥소피리다진-1(6H)-일)메틸 포스페이트 108
자기 교반기를 구비한 25mL 1구 둥근바닥 플라스크를 108b(400mg, 0.356mmol), 아세토니트릴(5mL), 트리에틸아민(2.5mL), 및 N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(2.5mL)로 충전하였다. 생성된 혼합물을 12시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 감압 하에서 농축 건조시켰다. 포화 중탄산나트륨 용액(5mL)을 잔류물에 첨가하고, 생성된 백색 침전물을 여과에 의해 수집하였다. 여과 케이크를 메탄올(5mL)과 함께 분쇄하여, 담황색 고체로서 35% 수율(130mg)의 108을 제공하였다: mp 240℃~242℃; 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.71 (s, 1H), 7.40 (m, 3H), 7.07 (s, 1H), 5.90 (s, 1H), 5.84 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.72 (d, J = 10.0 Hz, 2H), 4.06 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.62 (s, 2H), 2.92 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 2.46 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 1.45 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 684.2 (M+H).
실시예 109
실시예 109a 메틸 3-메틸티오펜-2-카복실레이트 109a
Figure 112013027357114-pct00066
100mL 1구 둥근바닥 플라스크를 메탄올(30mL) 중 4-메틸티아졸-5-카보닐 클로라이드(13.1g, 10.0mmol)로 충전하였다. 혼합물을 밤새 환류하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 농축시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르(50mL)와 물(50mL) 사이에 분배시켰다. 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시켜, 무색 오일로서 메틸 3-메틸티오펜-2-카복실레이트(101a)(12.8g, 95%)를 제공하였으며, 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
실시예 109b 메틸 5-tert-부틸-3-메틸티오펜-2-카복실레이트 109b
Figure 112013027357114-pct00067
무수 CH2Cl2(30mL) 중 메틸 3-메틸티오펜-2-카복실레이트 109a(33g, 0.211mol)의 용액을 질소 하에서 -78℃에서 염화알루미늄(40g, 0.297mol) 및 무수 CH2Cl2(200mL)의 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 -78℃에서 교반하고, 무수 CH2Cl2(30mL) 중 tert-부틸 클로라이드(23mL, 0.211mol)의 용액을 -78℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 -78℃에서 교반하고, 실온으로 점진적으로 가온되게 하며, 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 이를 얼음에 붓고, CH2Cl2(2 x 200mL)로 추출하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공 하에서 증발시켰다. 수득된 잔류물을 분별 증류에 의해 정제하여, 담황색 액체로서 메틸 5-tert-부틸-3-메틸티오펜-2-카복실레이트 109b(19g, 43%)를 수득하였다.
실시예 109c 메틸 3-(브로모메틸)-5-tert-부틸티오펜-2-카복실레이트 109c
Figure 112013027357114-pct00068
N-브로모석신이미드(18.5g, 0.103mol)를 CCl4(200mL) 중 메틸 5-tert-부틸-3-메틸티오펜-2-카복실레이트(109b)(20g, 0.09mol) 및 AIBN(0.774g, 0.0047mol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 환류하고, 실온으로 냉각시키며, 여과하였다. 여과액을 진공 하에서 농축시키고, 수득된 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(실리카, 95:5 헥산-/디클로로메탄)로 정제하여, 담황색 액체로서 메틸 3-(브로모메틸)-5-tert-부틸티오펜-2-카복실레이트(109c)(11g, 40%)를 제공하였다.
실시예 109d 메틸 2-tert-부틸-4-((2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2디옥사-보롤란-2-일)페닐아미노)메틸)티아졸-5-카복실레이트 109d
Figure 112013027357114-pct00069
2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)아닐린(466.2mg, 2.0mmol) 및 탄산세슘(782.0mg, 2.4mmol)을 무수 아세토니트릴(20mL) 중에 현탁시키고, 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 이어서, 메틸 3-(브로모메틸)-5-tert-부틸티오펜-2-카복실레이트(109c)(584.4mg, 2.0mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 점진적으로 가온되게 하고 나서, 밤새 40℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 Celite®를 통해 여과하고, 여과액을 농축시켰다. 잔류물을 헵탄 중 0% 내지 10% 에틸 아세테이트의 구배로 용리되는 실리카 상에서 정제하여, 메틸 2-tert-부틸-4-((2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐아미노)메틸)티아졸-5-카복실레이트(109d)(501.6mg, 56%)를 제공하였다.
실시예 109e 2-tert-부틸-4-((2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐아미노)메틸)티아졸-5-카복실산 109e
Figure 112013027357114-pct00070
이소프로필 알코올(15mL) 및 물(15mL, 830mmol) 중 메틸 2-tert-부틸-4-((2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐아미노)메틸)티아졸-5-카복실레이트 109d(1.80g, 4.05mmol) 및 수산화리튬(970.0mg, 40.50mmol)의 혼합물을 밤새 40℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 원래 부피의 약 50%로 농축시키고, 진한 염산을 사용하여 약 pH 2로 산성화하며, 9:1 이소프로필 아세테이트/이소프로필 알코올로 추출하였다. 추출물을 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시켜 2-tert-부틸-4-((2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐아미노)메틸)티아졸-5-카복실산 109e(1.74g, 92%)를 제공하였으며, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
실시예 109f 2-tert-부틸-5-(2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 109f
Figure 112013027357114-pct00071
메틸렌 클로라이드(10mL) 중 2-tert-부틸-4-((2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐아미노)메틸)티아졸-5-카복실산 109e(430.37mg, 0.0010000mol)의 혼합물에 N,N-디이소프로필에틸아민(870.91uL, 5.0mmol) 및 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우라늄 헥사플루오로포스페이트(1.1407g, 0.0030000mol)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 헵탄 중 0% 내지 20% 에틸 아세테이트의 구배로 용리되는 실리카 상에서 정제하여, 2-tert-부틸-5-(2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 109f(163mg, 40%)를 제공하였다.
실시예 109g 6-클로로-4-(1-메틸-1H-피라졸-3-일아미노)피리다진-3(2H)-온 109g
Figure 112013027357114-pct00072
1,4-디옥산(12mL) 중 4-브로모-6-클로로피리다진-3(2H)-온(838mg, 4.0mmol), 1-메틸-1H-피라졸-3-아민(427mg, 4.4mmol), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(91.6mg, 0.1mmol), 및 2-디-tert-부틸포스피노-2',4',6'-트리이소프로필바이페닐(97%; 170mg, 0.4mmol)의 혼합물에 나트륨 tert-부톡사이드(845.7mg, 8.8mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 질소로 퍼징하고, 압력관 내에 밀봉하였다. 반응 혼합물을 밤새 100℃에서 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, Celite®를 통해 여과하였다. 여과액을 농축시켰다. 잔류물을 1% 수산화암모늄을 갖는 메틸렌 클로라이드 중 0% 내지 3.5% 메탄올의 구배로 용리되는 실리카 상에서 정제하여, 6-클로로-4-(1-메틸-1H-피라졸-3-일아미노)피리다진-3(2H)-온(109g)(230mg, 25%)을 제공하였다.
실시예 109 2-tert-부틸-5-(2-메틸-3-(5-(1-메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-6-옥소-1,6-디하이드로피리다진-3-일)페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 109
5mL 압력관을 6-클로로-4-(1-메틸-1H-피라졸-3-일아미노)피리다진-3(2H)-온 109g(20.0mg, 0.089mmol), 2-tert-부틸-5-(2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 109f(43.9mg, 0.11mmol), 물 중 1.27M의 인산칼륨(0.15mL, 0.20mmol), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(4.1mg, 0.0044mmol), S-Phos(4.4mg, 0.011mmol), 및 1,4-디옥산(1.4mL)으로 충전하였다. 혼합물을 질소로 퍼징하고, 밀봉하며, 밤새 110℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, Celite®를 통해 여과하였다. 여과 케이크를 메틸렌 클로라이드/메탄올(약 9:1)로 세척하였다. 여과액을 농축시켰다. 잔류물을 메틸렌 클로라이드 중 0% 내지 3.5% 메탄올의 구배로 용리되는 실리카 상에서 정제하였다. 수득된 물질을 20분에 걸쳐 0.05% 트리플루오로아세트산을 갖는 물 중 0% 내지 80% 아세토니트릴의 구배로 용리되는 역상 HPLC(C-18 컬럼)에 의해 추가로 정제하여, 2-tert-부틸-5-(2-메틸-3-(5-(1-메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-6-옥소-1,6-디하이드로피리다진-3-일)페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온(109)(13mg, 31%)을 제공하였다: M+1 476.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.92 (s, 1H), 9.17 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.48 (d, J = 2.2, 1H), 7.44 (dd, J = 5.3, 3.9, 1H), 7.32 (dd, J = 6.5, 2.7, 2H), 6.08 (d, J = 2.3, 1H), 4.91 (s, 2H), 3.67 (s, 3H), 2.07 (s, 3H).
실시예 110
실시예 110a 4-브로모-6-클로로-2-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)피리다진-3(2H)-온 110a
Figure 112013027357114-pct00073
자기 교반기를 구비한 500mL 1구 둥근바닥 플라스크를 질소로 퍼징하고, 무수 DMF(150mL) 및 4-브로모-6-클로로-피리다진-3(2H)-온(10.0g, 47.8mmol)으로 충전하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 수소화나트륨을 첨가하였다. 반응물을 20분 동안 0℃에서 교반하였다. 이 시간 후, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸 클로라이드(11.9g, 71.6mmol)를 첨가하고, 냉각조를 제거하며, 반응물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 반응물을 포화 수성 중탄산나트륨(30mL)으로 켄칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(2 × 300mL)로 추출하였다. 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하며, 감압 하에서 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 황색 오일로서 56% 수율(9.00g)의 110a를 제공하였다: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.02 (s, 1H), 5.42 (s, 2H), 3.79 (t, 2H, J = 5.4 Hz), 0.96 (t, 2H, J = 5.4 Hz), 0.01 (s, 9H).
실시예 110b 6-클로로-4-(1,5-디메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-2-((2-(트리메틸-실릴)에톡시)메틸)피리다진-3(2H)-온 110b
Figure 112013027357114-pct00074
100mL 1구 둥근바닥 플라스크 내의 1,4-디옥산(20mL) 중 4-브로모-6-클로로-2-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)피리다진-3(2H)-온 110a (1.19g, 3.50mmol), 1,5-디메틸-1H-피라졸-3-아민(409mg, 3.68mmol)의 혼합물에 탄산세슘(3.42g, 10.5mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 질소로 퍼징하였다. 이어서, 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(321mg, 0.350mmol) 및 4,5-비스(디페닐-포스피노)-9,9-디메틸잔텐(344mg, 0.596mmol)을 첨가하였다. 이 플라스크를 질소 퍼징된 응축기에 연결하고, 혼합물을 18시간 동안 질소 하에서 환류하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 여과 케이크를 에틸 아세테이트(30mL) 및 물(10mL) 중에 현탁시키고, Celite®를 통해 여과하였다. 이들 층을 분리하였다. 합한 유기 층을 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 헵탄 중 0% 내지 50% 에틸 아세테이트의 구배로 용리되는 실리카 상에서 정제하여, 황색 고체로서 6-클로로-4-(1,5-디메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-2-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)피리다진-3(2H)-온 110b를 제공하였다(928mg, 72%).
실시예 110c 2-tert-부틸-5-(3-(5-(1,5-디메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-6-옥소-1-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,6-디하이드로피리다진-3-일)-2-메틸페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 110c
Figure 112013027357114-pct00075
실시예 109에 따라, 247.2mg(0.6mmol)의 2-tert-부틸-5-(2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 109f, 185mg(0.5mmol)의 6-클로로-4-(1,5-디메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-2-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)피리다진-3(2H)-온 110b, 45.8mg(0.05mmol)의 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0), 49.3mg(0.12mmol)의 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸잔텐(0.596mmol), 0.67mL(0.85mmol)의 물 중 1.27M 인산칼륨, 및 10mL의 1,4-디옥산을 반응시켜, 186mg(60%)의 2-tert-부틸-5-(3-(5-(1,5-디메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-6-옥소-1-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,6-디하이드로피리다진-3-일)-2-메틸페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 110c를 제공하였다.
실시예 110 2-tert-부틸-5-(3-(5-(1,5-디메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-6-옥소-1,6-디하이드로피리다진-3-일)-2-메틸페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 110
염화수소 가스를 5분 동안 0℃에서 메탄올(20mL) 중 2-tert-부틸-5-(3-(5-(1,5-디메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-6-옥소-1-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,6-디하이드로피리다진-3-일)-2-메틸페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 110c(186mg, 0.30mmol) 및 아니솔(0.163mL, 1.50mmol) 내로 버블링시켰다. 생성된 혼합물을 실온으로 가온되게 하고, 16시간 동안 계속 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 14분에 걸쳐 1% 수산화암모늄을 갖는 물 중 20% 내지 60% 아세토니트릴로 용리되는 역상 HPLC(C-18 컬럼)에 의해 정제하여, 2-tert-부틸-5-(3-(5-(1,5-디메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-6-옥소-1,6-디하이드로피리다진-3-일)-2-메틸페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 110(40mg, 30%)을 제공하였다: M+1 490.1. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.95 (s, 1H), 9.09 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.50 (dd, J = 5.6, 3.6, 1H), 7.41 - 7.32 (m, 2H), 5.97 (s, 1H), 4.97 (s, 2H), 3.62 (s, 3H), 2.17 (d, J = 19.6, 6H), 1.47 (s, 9H).
실시예 111
실시예 111a 6-클로로-4-(5-사이클로프로필-1H-피라졸-3-일아미노)-2-((2-(트리메틸-실릴)에톡시)메틸)피리다진-3(2H)-온 111a
Figure 112013027357114-pct00076
100mL 1구 둥근바닥 플라스크 내의 1,4-디옥산(40mL) 중 110a(2.38g, 7.00mmol), 5-사이클로프로필-1H-피라졸-3-아민(905mg, 7.35mmol)의 혼합물에 탄산세슘(6.84g, 21.0mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 질소로 퍼징하였다. 이어서, 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(641mg, 0.700mmol) 및 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸잔텐(688mg, 1.19mmol)을 첨가하였다. 이 플라스크를 질소 퍼징된 응축기에 연결하고, 혼합물을 6시간 동안 질소 하에서 환류하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 여과 케이크를 에틸 아세테이트(30mL) 및 물(10mL) 중에 현탁시키고, Celite®를 통해 여과하였다. 이들 층을 분리하였다. 합한 유기 층을 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 헵탄 중 0% 내지 50% 에틸 아세테이트의 구배로 용리되는 실리카 상에서 정제하여, 6-클로로-4-(5-사이클로프로필-1H-피라졸-3-일아미노)-2-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)피리다진-3(2H)-온(111a)(1.58g, 59%)을 제공하였다.
실시예 111b 2-tert-부틸-5-(3-(5-(5-사이클로프로필-1H-피라졸-3-일아미노)-6-옥소-1-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,6-디하이드로피리다진-3-일)-2-메틸페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 111b
Figure 112013027357114-pct00077
실시예 109의 절차에 따라, 148.4mg(0.36mmol)의 2-tert-부틸-5-(2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 109f, 114.6mg(0.3mmol)의 6-클로로-4-(5-사이클로프로필-1H-피라졸-3-일아미노)-2-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)피리다진-3(2H)-온 111a, 27.5mg(0.03mmol)의 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0), 29.6mg(0.072mmol)의 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸잔텐(0.596mmol), 0.71mL(0.9mmol)의 물 중 1.27M 인산칼륨, 및 10mL의 1,4-디옥산을 반응시켜, 129mg(68%)의 2-tert-부틸-5-(3-(5-(5-사이클로프로필-1H-피라졸-3-일아미노)-6-옥소-1-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,6-디하이드로피리다진-3-일)-2-메틸페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 111b를 제공하였다.
실시예 111 2-tert-부틸-5-(3-(5-(5-사이클로프로필-1H-피라졸-3-일아미노)-6-옥소-1,6-디하이드로피리다진-3-일)-2-메틸페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 111
디클로로메탄(5mL) 및 트리플루오로-아세트산(5mL) 중 2-tert-부틸-5-(3-(5-(5-사이클로프로필-1H-피라졸-3-일아미노)-6-옥소-1-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,6-디하이드로피리다진-3-일)-2-메틸페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 111b의 혼합물에 아니솔(0.11mL, 1.0mmol) 및 트리플루오로메탄설폰산(0.054mL, 0.61mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 1% 수산화암모늄을 갖는 물 중 20% 내지 60% 아세토니트릴로 용리되는 역상 HPLC(C-18 컬럼)에 의해 정제하여, 2-tert-부틸-5-(3-(5-(5-사이클로프로필-1H-피라졸-3-일아미노)-6-옥소-1,6-디하이드로피리다진-3-일)-2-메틸페닐)-4H-피롤로[3,4-d]티아졸-6(5H)-온 111(50mg, 50%)을 제공하였다: M+1 502.2. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.94 (s, 1H), 12.02 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.50 (dd, J = 5.8, 3.5, 1H), 7.38 (dd, J = 8.0, 5.6, 2H), 5.87 (d, J = 2.0, 1H), 4.96 (s, 2H), 2.13 (s, 3H), 1.84 (td, J = 8.4, 4.2, 1H), 1.47 (s, 9H), 0.98 - 0.82 (m, 2H), 0.71 - 0.59 (m, 2H).
실시예 901 생화학적 Btk 검정
화학식 I의 화합물을 시험하는 데 사용될 수 있는 표준 생화학적 Btk 키나제 검정을 위한 일반화된 절차는 하기와 같다. 1X 세포 신호전달 키나제 완충제(25mM Tris-HCl, pH 7.5, 5mM 베타-글리세로인산, 2mM 디티오트레이톨, 0.1mM Na3VO4, 10mM MgCl2), 0.5μM Promega PTK 비오틴화 펩타이드 기질 2, 및 0.01% BSA를 함유하는, Btk 효소 무함유 마스터 믹스(master mix)를 제조한다. 1X 세포 신호전달 키나제 완충제, 0.5μM PTK 비오틴화 펩타이드 기질 2, 0.01% BSA, 및 100ng/웰(0.06mU/웰) Btk 효소를 함유하는, Btk 효소 함유 마스터 믹스를 제조한다. Btk 효소는 하기와 같이 제조한다: C-말단 V5 및 6x His 태그를 갖는 전장 인간 야생형 Btk(기탁 번호 NM-000061)를, 이 에피토프가 태그된 Btk를 갖는 배큘로바이러스를 제조하기 위한 pFastBac 벡터 내로 서브클로닝하였다. 인비트로겐(Invitrogen)의 간행 프로토콜인 "Bac-to-Bac Baculovirus Expression Systems"(카탈로그 번호 10359-016 및 10608-016)에 상세히 기술된 인비트로겐의 지시사항에 기초하여 배큘로바이러스의 생성을 행한다. 계대 3의 바이러스를 사용하여 Sf9 세포를 감염시켜 재조합 Btk 단백질을 과발현시킨다. 이어서, Ni-NTA 컬럼을 사용하여 Btk 단백질을 균질 정제한다. 최종 단백질 제제의 순도는 민감성 사이프로-루비(Sypro-Ruby) 염색에 기초하여 95% 초과이다. 200μM ATP 용액을 물에서 제조하고, 1N NaOH를 사용하여 pH 7.4로 조정한다. 5% DMSO 중 1.25μL의 양의 화합물을 96웰 1/2 면적 코스타(Costar) 폴리스티렌 플레이트로 옮긴다. 화합물을 하나씩 11 포인트 용량-반응 곡선(출발 농도는 10μM 임; 1:2 희석)을 이용하여 시험한다. 효소 무함유 마스터 믹스(음성 대조군으로서) 및 효소 함유 마스터 믹스 18.75μL의 양을 96웰 1/2 면적 코스타 폴리스티렌 플레이트 내의 적절한 웰로 옮긴다. 40μM의 최종 ATP 농도를 위하여, 96웰 1/2 면적 코스타 폴리스티렌 플레이트 내의 이 혼합물에 200μM ATP 5μL를 첨가한다. 이 반응물을 실온에서 1시간 동안 항온처리한다. 30mM EDTA, 20nM SA-APC, 및 1nM PT66 Ab를 함유하는 Perkin Elmer 1X 검출 완충제를 사용하여 반응을 중지시킨다. 330nm의 여기 필터, 665nm의 방출 필터, 및 615nm의 제2 방출 필터를 사용하는 Perkin Elmer Envision을 이용한 시간 분해 형광(time-resolved fluorescence)을 이용하여 플레이트를 판독한다. 이어서, IC50 값을 계산한다. 대안적으로, 란타스크린(Lanthascreen) 검정을 이용하여, Btk의 인산화 펩타이드 생성물의 정량화를 통해 Btk 활성을 평가할 수 있다. 펩타이드 생성물 상의 플루오레세인과 검출 항체 상의 테르븀 사이에서 일어나는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer, 형광 공명 에너지 전달)는 펩타이드의 인산화를 감소시키는 Btk의 억제제를 첨가함에 따라 감소한다. 25uL의 최종 반응 부피에서, Btk(h)(0.1ng/25ul 반응물)를 50mM Hepes pH 7.5, 10mM MgCl2, 2mM MnCl2, 2mM DTT, 0.2mM NaVO4, 0.01% BSA, 및 0.4uM 플루오레세인 폴리-GAT와 함께 항온처리한다. ATP를 25uM(ATP의 Km)까지 첨가하여 반응을 개시한다. 실온에서 60분 동안 항온처리한 후, 실온에서 30분 동안 60mM EDTA 중 2nM Tb-PY20 검출 항체(최종 농도)를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 340nM 여기 및 495nm 및 520nm에서의 방출을 갖는 Perkin Elmer Envision 상에서 검출을 측정한다. 예시적인 Btk 억제 IC50 값이 표 및 2에 있다.
실시예 902 라모스 세포 Btk 검정
화학식 I의 화합물을 시험하는 데 이용될 수 있는 표준 세포 Btk 키나제 검정을 위한 다른 일반화된 절차는 하기와 같다. 라모스 세포를 37℃에서 1시간 동안 시험 화합물의 존재 하에 0.5 x 107세포수/ml의 밀도로 항온배양한다. 이어서, 세포를 37℃에서 5분 동안 10μg/ml의 항-인간 IgM F(ab)2와 함께 항온배양함으로써 자극한다. 세포를 펠릿화하고, 용균시키며, 투명해진 용균물에 대해 단백질 검정을 수행한다. 각각의 샘플의 동일한 단백질 양에, Btk 자가인산화를 평가하기 위한 항-포스포Btk(Tyr223) 항체(Cell Signaling Technology #3531; Epitomics, cat. #2207-1) 또는 포스포Btk(Tyr551) 항체(BD Transduction Labs #558034), 또는 각각의 용균물 내의 Btk의 총량을 제어하기 위한 항-Btk 항체(BD Transduction Labs #611116)를 사용하여 웨스턴 블로팅(western blotting) 및 SDS-PAGE를 수행한다.
실시예 903 B-세포 증식 검정
화학식 I의 화합물을 시험하는 데 이용될 수 있는 표준 세포 B-세포 증식 검정을 위한 다른 일반화된 절차는 하기와 같다. B-세포 단리 키트(Miltenyi Biotech, Cat # 130-090-862)를 사용하여 8주령 내지 16주령의 Balb/c 마우스의 비장으로부터 B-세포를 정제한다. 시험 화합물을 0.25% DMSO 중에 희석시키고, 2.5 x 105개의 정제된 마우스 비장 B-세포와 함께 30분 동안 항온배양한 후, 10μg/ml의 항-마우스 IgM 항체(Southern Biotechnology Associates, Cat # 1022-01)를 100μl의 최종 부피로 첨가한다. 24시간 항온배양한 후, 1μCi 3H-티미딘을 첨가하고, 플레이트를 추가 36시간 항온배양한 후, SPA[3H] 티미딘 흡수 검정 시스템(Amersham Biosciences # RPNQ 0130)에 대한 제조업체의 프로토콜을 이용하여 수거한다. SPA-비드에 기초한 형광을 마이크로베타 계수기(Wallace Triplex 1450, Perkin Elmer)에서 계수한다.
실시예 904 T 세포 증식 검정
화학식 I의 화합물을 시험하는 데 이용될 수 있는 표준 T 세포 증식 검정을 위한 일반화된 절차는 하기와 같다. Pan T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotech, Cat # 130-090-861)를 사용하여 8주령 내지 16주령의 Balb/c 마우스의 비장으로부터 T 세포를 정제한다. 시험 화합물을 0.25% DMSO 중에 희석시키고, 각각 10μg/ml의 항-CD3(BD # 553057) 및 항-CD28(BD # 553294) 항체로 37℃에서 90분 동안 예비코팅된 편평한 투명 바닥 플레이트 내에서 2.5 x 105개의 정제된 마우스 비장 T 세포와 함께 최종 부피 100μl로 항온배양한다. 24시간 항온배양한 후, 1μCi 3H-티미딘을 첨가하고, 플레이트를 추가 36시간 항온배양한 후, SPA[3H] 티미딘 흡수 검정 시스템(Amersham Biosciences, # RPNQ 0130)에 대한 제조업체의 프로토콜을 이용하여 수거한다. SPA-비드에 기초한 형광을 마이크로베타 계수기(Wallace Triplex 1450, Perkin Elmer)에서 계수하였다.
실시예 905 CD86 억제 검정
화학식 I의 화합물을 시험하는 데 이용될 수 있는 B 세포 활성의 억제에 대한 표준 검정을 위한 일반화된 절차는 하기와 같다. 전 마우스 비장세포를 적혈구 용균(BD Pharmingen #555899)에 의해 8주령 내지 16주령의 Balb/c 마우스의 비장으로부터 정제한다. 시험 화합물을 0.5% DMSO로 희석시키고, 37℃에서 60분 동안 편평한 투명 바닥 플레이트(Falcon 353072) 내에서 1.25 x 106개의 비장세포와 함께 최종 부피 200μl로 항온배양한다. 이어서, 15μg/ml의 IgM(Jackson ImmunoResearch 115-006-020)을 첨가하여 세포를 자극하고, 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 항온배양한다. 24시간 항온배양한 후, 세포를 원추형 바닥의 투명한 96웰 플레이트로 옮기고, 1200 x g x 5분으로 원심분리하여 펠릿화한다. CD16/CD32(BD Pharmingen #553142)로 세포를 예비블록킹한 데 이어, CD19-FITC(BD Pharmingen #553785), CD86-PE(BD Pharmingen #553692), 및 7AAD(BD Pharmingen #51-68981E)로 삼중 염색한다. 세포를 BD FACSCalibur 상에서 분류하고, CD19+/7AAD- 집단에 대해 게이팅한다. 게이팅된 집단에 대한 CD86 표면 발현의 수준을 시험 화합물 농도에 대해 측정한다. 예시적인 결과가 표 3에 있다.
화합물 CD86 억제
EC50(μM)
101 0.192
119 0.352
120 0.189
122 0.211
124 1.1
127 0.178
131 0.139
132 0.113
134 0.206
136 0.704
142 1.2
실시예 906 B-ALL 세포 생존 검정
생존 세포의 개수를 측정하기 위한, XTT 판독을 이용한 표준 B-ALL(acute lymphoblastic leukemia, 급성 림프모구성 백혈병) 세포 생존 연구에 대한 절차는 하기와 같다. 이 검정을 이용하여, 배양 중인 B-ALL 세포의 생존을 억제하는 능력에 대해 화학식 I의 화합물을 시험할 수 있다. 사용될 수 있는 인간 B-세포 급성 림프모구성 백혈병 세포주 중 하나는, ATCC로부터 입수가능한 인간 프리(Pre)-B-세포 ALL 세포주인 SUP-B15이다.
SUP-B15 프리-B-ALL 세포를 5 x 105세포수/ml의 농도로 100 ?의 Iscove 배지 + 20% FBS 중 다중 96웰 마이크로타이터 플레이트 내에서 평판 배양한다. 이어서, 시험 화합물을 최종 농도 0.4%의 DMSO와 함께 첨가한다. 최대 3일 동안 5% CO2와 함께 37℃에서 세포를 항온배양한다. 3일 후, 시험 화합물을 함유하는 새로운 96웰 플레이트 내로 세포를 1:3 분할하여 넣고, 최대 추가 3일까지 성장되게 한다. 각각 24시간의 기간 후에, XTT 용액 50ul를 복제(replicate) 96웰 플레이트 중 하나에 첨가하고, 제조업체의 지시사항에 따라 2시간, 4시간 및 20시간째에 흡광도 판독값을 취한다. 이어서, 검정의 선형 범위(0.5 내지 1.5) 내에서 DMSO만으로 처리된 세포에 대한 OD와 함께 판독값을 취하고, 화합물로 처리된 웰 내의 생존 세포의 백분율을 DMSO만으로 처리된 세포와 대비하여 측정한다.
실시예 907 CD69 전혈 검정
1주간 약물을 복용하지 않은 비흡연자라는 제한조건을 가진 건강한 지원자로부터 인간 혈액을 얻는다:. 나트륨 헤파린을 갖는 Vacutainer®(Becton, Dickinson and Co.) 관 내로 정맥천자에 의해 혈액(8개의 화합물을 시험하기 위해 대략 20ml)을 수집한다.
DMSO 중 10mM의 화학식 I의 화합물의 용액을 100% DMSO 중에 1:10으로 희석시키고 나서, 10 포인트 용량-반응 곡선을 위하여 100% DMSO 중에 3배의 연속 희석액으로 희석시킨다. 이들 화합물을 PBS 중에 1:10으로 추가로 희석시키고 나서, 각각의 화합물의 5.5μl의 분취량을 2세트로 하여 2ml 96웰 플레이트에 첨가하고, PBS 중 5.5μl의 10% DMSO를 대조군 및 비자극 웰로서 첨가한다. 인간 전혈(HWB)(100μl)을 각각의 웰에 첨가한다. 혼합한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2, 100% 습도에서 30분 동안 항온처리한다. 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(10μl의 500μg/ml 용액, 50μg/ml 최종)을 혼합하면서 (비자극 웰을 제외한) 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 추가 20시간 동안 항온배양한다. 20시간의 항온처리의 종료시에, 샘플을 37℃, 5% CO2, 100% 습도에서 30분 동안 형광 표지 항체와 함께 항온처리한다. 보상 조정 및 초기 전압 설정을 위한 단일 염색물, 비염색물 및 유도된 대조군을 포함한다. 이어서, 샘플을 제조업체의 지시사항에 따라 PharM Lyse™(BD Biosciences Pharmingen)로 용균시킨다. 이어서, 샘플을 LSRII 기계 상의 BD Biosciences HTS 96웰 시스템 상에서 실시하기에 적합한 96웰 플레이트로 옮긴다. 획득된 데이터 및 평균 형광 강도 값을 BD Biosciences DIVA 소프트웨어를 사용하여 얻었다. 결과를 FACS 분석 소프트웨어(Flow Jo)에 의해 초기에 분석한다. 시험 화합물에 대한 IC50은, 또한 항-IgM에 의해 자극되는 CD20 양성이기도 한 CD69 세포의 백분율 양성(비자극 백그라운드에 대한 8개의 웰의 평균을 뺀 후의 8개의 대조군 웰의 평균)을 50%만큼 감소시키는 농도로서 정의한다. IC50 값은 비선형 회귀 곡선 적합을 이용하여 Prism 버전 5에 의해 계산한다.
CD69 전혈 검정에서 표 1 및 표 2로부터 선택된 화합물의 예시적인 IC50 값은 하기를 포함한다:
화합물 번호 IC50 (마이크로몰)
107 0.461
113 0.213
116 2.5
122 0.101
128 0.568
133 0.147
142 0.41
145 0.091

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  11. 화학식 Ib의 구조를 갖는 화합물.
    [화학식 Ib]
    Figure 112018027967240-pct00110

    (상기 화학식 Ib에서,
    R4는 OH, CN, NRbRc, C1-C6 알킬 또는 C1-C4 할로알킬로 치환되거나 비치환된 C3-C6 사이클로알킬, 및 OH 또는 OC1-C4 알킬로 치환되거나 비치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
    R2는 H, CH3 또는 CF3이며;
    고리 B는 페닐, 적어도 하나의 질소 고리 원자를 갖는 5원 내지 6원 헤테로아릴, 및 적어도 하나의 질소 고리 원자를 갖는 8원 내지 11원 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
    R3은 독립적으로 H, -Ra, -ORb, -SRb, -NRbRc, 할로, 시아노, 니트로, -CORb, -CO2Rb, -CONRbRc, -OCORb, -OCO2Ra, -OCONRbRc, -NRcCORb, -NRcCO2Ra, -NRcCONRbRc, -CO2Rb, -CONRbRc, -NRcCORb, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRbRc 및 -NRcSO2Ra로부터 선택되거나, 또는 2개의 인접한 R3 기는 함께, O, S 또는 N으로부터 선택된 0개 내지 2개의 헤테로원자를 갖는 5원 내지 6원 고리를 형성하며, 여기서 상기 5원 내지 6원 고리는 고리 B에 융합되고;
    Ra는 C1-C6　알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 여기서 Ra의 각각의 구성원은 1개 내지 3개의 R11 기로 치환되거나 비치환되고;
    Rb는 H, C1-C6　알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 여기서 H를 제외한 Rb의 각각의 구성원은 1개 내지 3개의 R11 기로 치환되거나 비치환되고;
    Rc는 H, 또는 1개 내지 3개의 R11 기로 치환되거나 비치환된 C1-C4　알킬이거나, 또는 Rb 및 Rc와 이들이 부착되어 있는 질소가 헤테로사이클로알킬 기를 형성하며;
    각각의 R11은 독립적으로 C1-C4　알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴-C1-C4　알킬-, 헤테로아릴-C1-C4　알킬-, 사이클로알킬-C1-C4　알킬-, 헤테로사이클로알킬-C1-C4　알킬-, C1-C4　할로알킬-, -OC1-C4　알킬, -O-헤테로사이클로알킬, -OC1-C4　알킬페닐, -C1-C4　알킬-OH, -OC1-C4　할로알킬, 할로, -OH, -NH2, -C1-C4　알킬-NH2, -NH(C1-C4　알킬), -N(C1-C4　알킬)(C1-C4　알킬), -N(C1-C4　알킬)(C1-C4　알킬페닐), -NH(C1-C4　알킬페닐), 시아노, 니트로, 옥소, -CO2H, -C(O)OC1-C4　알킬, -CON(C1-C4　알킬)(C1-C4　알킬), -CONH(C1-C4　알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C4　알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C4　알킬)C(O)(C1-C4　알킬), -N(C1-C4　알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C4　알킬, -C(O)C1-C4　할로알킬, -OC(O)C1-C4　알킬, -SO2(C1-C4　알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C4　할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4　알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C4　알킬), -NHSO2(페닐) 및 -NHSO2(C1-C4　할로알킬)로부터 선택되고;
    이때, 상기 Ra, Rb 및 R11에서 정의된 사이클로알킬 기는 독립적으로, 단독으로 또는 다른 기의 일부로서, C3-C7 모노사이클릭 포화 고리이고, 상기 Ra, Rb, Rc 및 R11에서 정의된 헤테로사이클로알킬 기는 독립적으로, 단독으로 또는 다른 기의 일부로서, 3개 내지 7개의 고리 구성원을 갖는 질소-함유 모노사이클릭 포화 헤테로고리이며;
    R6은 H, CH3, F, Cl, CN, OCH3, OH, 또는 OH, OCH3 또는 하나 이상의 할로 기로 치환된 메틸이고;
    R7은 H, CH3, F, Cl, CN 또는 OCH3이며;
    R8은 H, CH3, CF3, F, Cl, CN 또는 OCH3임)
  12. 화학식 Ic의 구조를 갖는 화합물.
    [화학식 Ic]
    Figure 112018027967240-pct00111

    (상기 화학식 Ic에서,
    R4는 OH, CN, NRbRc, C1-C6 알킬 또는 C1-C4 할로알킬로 치환되거나 비치환된 C3-C6 사이클로알킬, 및 OH 또는 OC1-C4 알킬로 치환되거나 비치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
    R2는 H, CH3 또는 CF3이며;
    고리 B는 페닐, 적어도 하나의 질소 고리 원자를 갖는 5원 내지 6원 헤테로아릴, 및 적어도 하나의 질소 고리 원자를 갖는 8원 내지 11원 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
    R3은 독립적으로 H, -Ra, -ORb, -SRb, -NRbRc, 할로, 시아노, 니트로, -CORb, -CO2Rb, -CONRbRc, -OCORb, -OCO2Ra, -OCONRbRc, -NRcCORb, -NRcCO2Ra, -NRcCONRbRc, -CO2Rb, -CONRbRc, -NRcCORb, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRbRc 및 -NRcSO2Ra로부터 선택되거나, 또는 2개의 인접한 R3 기는 함께, O, S 또는 N으로부터 선택된 0개 내지 2개의 헤테로원자를 갖는 5원 내지 6원 고리를 형성하며, 여기서 상기 5원 내지 6원 고리는 고리 B에 융합되고;
    Ra는 C1-C6　알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 여기서 Ra의 각각의 구성원은 1개 내지 3개의 R11 기로 치환되거나 비치환되고;
    Rb는 H, C1-C6　알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 여기서 H를 제외한 Rb의 각각의 구성원은 1개 내지 3개의 R11 기로 치환되거나 비치환되고;
    Rc는 H, 또는 1개 내지 3개의 R11 기로 치환되거나 비치환된 C1-C4　알킬이거나, 또는 Rb 및 Rc와 이들이 부착되어 있는 질소가 헤테로사이클로알킬 기를 형성하며;
    각각의 R11은 독립적으로 C1-C4　알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴-C1-C4　알킬-, 헤테로아릴-C1-C4　알킬-, 사이클로알킬-C1-C4　알킬-, 헤테로사이클로알킬-C1-C4　알킬-, C1-C4　할로알킬-, -OC1-C4　알킬, -O-헤테로사이클로알킬, -OC1-C4　알킬페닐, -C1-C4　알킬-OH, -OC1-C4　할로알킬, 할로, -OH, -NH2, -C1-C4　알킬-NH2, -NH(C1-C4　알킬), -N(C1-C4　알킬)(C1-C4　알킬), -N(C1-C4　알킬)(C1-C4　알킬페닐), -NH(C1-C4　알킬페닐), 시아노, 니트로, 옥소, -CO2H, -C(O)OC1-C4　알킬, -CON(C1-C4　알킬)(C1-C4　알킬), -CONH(C1-C4　알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C4　알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C4　알킬)C(O)(C1-C4　알킬), -N(C1-C4　알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C4　알킬, -C(O)C1-C4　할로알킬, -OC(O)C1-C4　알킬, -SO2(C1-C4　알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C4　할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4　알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C4　알킬), -NHSO2(페닐) 및 -NHSO2(C1-C4　할로알킬)로부터 선택되고;
    이때, 상기 Ra, Rb 및 R11에서 정의된 사이클로알킬 기는 독립적으로, 단독으로 또는 다른 기의 일부로서, C3-C7 모노사이클릭 포화 고리이고, 상기 Ra, Rb, Rc 및 R11에서 정의된 헤테로사이클로알킬 기는 독립적으로, 단독으로 또는 다른 기의 일부로서, 3개 내지 7개의 고리 구성원을 갖는 질소-함유 모노사이클릭 포화 헤테로고리이며;
    R6은 H, CH3, F, Cl, CN, OCH3, OH, 또는 OH, OCH3 또는 하나 이상의 할로 기로 치환된 메틸이고;
    R7은 H, CH3, F, Cl, CN 또는 OCH3이며;
    R8은 H, CH3, CF3, F, Cl, CN 또는 OCH3임)
  13. 하기로부터 선택되는 화합물.
    Figure 112018027967240-pct00112
  14. 하기로부터 선택되는 화합물.
    Figure 112018027967240-pct00113

    Figure 112018027967240-pct00114

    Figure 112018027967240-pct00115

    Figure 112018027967240-pct00116

    Figure 112018027967240-pct00117

    Figure 112018027967240-pct00118

    Figure 112018027967240-pct00119

    Figure 112018027967240-pct00120
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