KR101863433B1

KR101863433B1 - Krt19의 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101863433B1
Application number: KR1020160041407A
Authority: KR
Inventors: 조쌍구; 쿠마 사하 수보로토
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2016-04-05
Filing date: 2016-04-05
Publication date: 2018-06-01
Also published as: KR20170114479A

Abstract

본 발명은 KRT19의 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. KRT19가 넉다운된 유방암 세포에서 증식, 전이, 침윤, 약물 내성 및 구형성능이 높아짐을 확인하였고, KRT19가 β-catenin/RAC1 복합체와 반응하여 β-catenin의 안정성 및 세포 내 위치를 조절하고, 상기 β-catenin은 NUMB 프로모터에 결합하여 NOTCH 신호전달 경로의 활성을 차단할 수 있음을 확인하였다. 또한, KRT19를 과발현시킨 경우, 유방암세포의 세포 증식, 전이, 침습, 약물 내성 및 구형형성을 감소시킴으로써, 이를 암 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

KRT19의 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cancer comprising inducer or activator of KRT19}

본 발명은 KRT19의 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

유방암은 유전자의 돌연변이, 만성 염증, 독성 물질에 노출 및 스트레스 등 다양한 질병의 원인으로 알려진 질병이다. 유방암은 전 세계인 관심을 가지고 있으나 아직 발병 메커니즘은 알려져 있지 않다.

KRT(Keratin) 패밀리의 일부 유전자는 유방암 환자의 림프절, 말초혈액, 골수에 있는 중요한 암 표지자로서 RT-PCR 실험을 통해 확인할 수 있다. KRT는 중간섬유 단백질로서 상피 조직의 마커라는 사실이 알려져 있다. KRT는 키나아제, 수용체, 어댑터 및 이펙터 등과 상호 작용하며, 상기 반응들은 신호전달에 의해 활성화 되며 세포의 이동, 침습, 전이, 세포주기 및 세포사멸 등을 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한, KRT17은 어댑터 단백질과 결합하여 AKT/mTOR 경로를 통해 단백질 합성 및 세포 성장을 상향 조절한다는 점이 알려져 있다. 특히, KRT19 넉다운 마우스에서 유도 골격 근육 병증이 나타나며, KRT19는 AKT 신호전달 활성화를 시킬 수 있다.

그러나, KRT19가 유방암과 관련되어, KRT19의 발현 또는 활성 조절이 유방암을 치료할 수 있다는 사실에 대하여서는 알려진 바 없다. 이에 본 발명의 발명자는 KRT19를 넉다운시킨 유방암 세포에서의 증식, 이주, 침윤, 약물 내성 및 구형성이 높아짐을 확인하고, KRT19가 β-catenin/RAC1 복합체와 반응하여 β-catenin의 안정성 및 위치 전환성을 조절하고, β-catenin은 NUMB 프로모터에 결합하여 유방암 세포의 발현을 촉진하는 것을 확인하고, KRT19을 통한 NUMB 발현 조절이 NOTCH-매게 유방암 및 줄기세포의 특성 신호전달과 관련 있음을 확인함으로써, 본 발명을 확인하였다.

본 발명의 목적은 KRT19(Keratin 19)의 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, KRT19의 발현 또는 활성을 측정하여, 암의 진단의 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, KRT19 또는 이와 관련된 유전자의 발현 또는 활성을 측정하여, 항암물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

KRT19(Keratin 19)의 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 KRT19는 KRT19가 넉다운된 유방암세포에서 세포의 증식, 전이, 침습, 약물 내성 및 구형형성을 증가시키고, KRT19를 과발현시킨 경우, 유방암세포의 세포 증식, 전이, 침습, 약물 내성 및 구형형성을 감소시킴으로써, 이를 암 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 암은 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종 등을 포함하며, 바람직하게는 유방암일 수 있다.

본 발명에서, "KRT19의 발현 또는 활성 촉진제"는 KRT19에 직접 또는 간접적으로 작용하여 KRT19의 발현을 개선, 유도, 자극, 증가시키는 물질을 의미한다. 이런 물질은 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물, 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물 및 복수 화합물의 복합체 등을 포함한다. 상기 물질이 KRT182의 발현 또는 활성을 촉진시키는 기작은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 물질은 전사, 번역 등의 유전자 발현을 증대시키는 것을 말한다.

바람직하게는, KRT19의 발현 또는 활성을 촉진시키는 물질은 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물이다. 핵산 및 단백질 서열이 이미 공지된 KRT19 서열에 대하여 당업자는 촉진제로 작용하는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물 및 복수 화합물의 복합체 등을 당 분야의 기술을 이용하여 제조하거나 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 KRT19 활성 촉진제는 KRT19 단백질 자체일 수 있고, 상기 KRT19 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 KRT19의 발현 촉진제는 유전자 치료 등에 사용되기 위하여 세포내에서 KRT19를 발현할 수 있는 벡터의 형태로 제공될 수 있다.

따라서, 본 발명은 KRT19를 코딩하는 핵산, 바람직하게는 이 핵산을 함유하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 KRT19를 코딩하는 핵산은 서열번호 2의 염기서열로 구성될 수 있다.

KRT19를 코딩하는 핵산 서열은, 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.

본 발명의 벡터는, 리포좀, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 바람직한 벡터는 바이러스 벡터이다.

본 발명에서, 바람직한 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노부속바이러스(adenoassociated virus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 단순포진바이러스(herpes simplex virus), 알파바이러스(alpha virus) 등이 있다. 본 발명에서는 렌티 바이러스 벡터가 특히 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터는 KRT19를 코딩하는 핵산과 이의 전사 또는 해독을 위한 조절서열을 포함할 수 있다. 특히 중요한 조절서열은 프로모터, 인핸서와 같이 전사 개시를 조절하는 것이다. 또한, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 코작(Kozak), 인핸서, 막 표적화 및 분비를 위한 신호서열, IRES(Internal Ribosome Entry Site) 등으로 이루어진 조절서열을 포함할 수 있다. 이러한 조절서열과 KRT19를 코딩하는 핵산은 작동가능하게 연결되어야 할 것이다.

여기서, 사용된 용어 '작동가능하게 연결된'이란 핵산 서열간의 결합이 기능적으로 연관되어 있는 것을 의미한다. 임의의 핵산서열이 작동가능하게 연결된 경우는 임의의 핵산서열이 다른 핵산서열과 기능적으로 관련성을 가지도록 위치해 있는 경우이다. 본 발명에 있어서, 임의의 전사 조절서열이 KRT19를 코딩하는 핵산분자의 전사에 영향을 미치는 경우, 상기 전사 조절서열이 상기 핵산분자와 작동가능하게 연결되어 있다고 말한다.

본 발명의 KRT19의 발현 또는 활성 촉진제는 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 사용할 수 있다. 적합한 담체의 예로는, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀루로오스, 미정질셀루로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 필요에 따라 상기 조성물에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 개체에 투여된 후 유효 성분의 신속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 분말, 환제, 에멀전, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 상기 제형은 1회용 투약 형태가 편리할 것이다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"은 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도; 환자의 연령, 체중, 건강, 성별; 환자의 약물에 대한 민감도; 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율; 치료 기간; 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000/체중 kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000/체중kg/day의 유효량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 KRT19의 발현 촉진제를 포유동물에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 KRT19의 발현 촉진제를 투여하는 경로는 국소 (협측(buccal), 설하, 피부 및 안내의 투여를 포함), 비경구(피하, 피내 근육내, 혈관내 및 관절내의 투여를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 포함한다.

상기 포유동물은 인간, 개, 돼지, 소, 말, 고양이, 양, 염소, 마우스 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 일시예에 따르면,

1)피검개체로부터 분리된 시료로부터 KRT19의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및

2)상기 1)단계의 KRT19의 발현 또는 활성이 정상 대조군에 비해 감소한 경우, 암에 대한 위험성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 진단의 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 1)단계의 시료는 세포, 조직, 혈액, 혈청, 타액 및 소변을 포함한, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 1)의 KRT19의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 방법으로는 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법 및 RT-PCR를 포함한다.

본 발명의 다른 일시예에 따르면,

1)항암 후보 물질을 세포주에 처리하는 단계;

2)상기 세포주에서 a)KRT19의 발현양, b)NUMB의 발현량 및 c)β-catenin와 RAC1의 결합 및 핵 내 위치화 및 d)NOTCH 신호전달 경로의 불활성화로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 측정하는 단계; 및

3) 상기 2)단계의 결과를 대조군으로서 항암 후보 물질을 처리하지 않은 세포주와 비교하여, a)KRT19의 발현량이 증가, b)NUMB의 발현량의 증가, c)β-catenin와 RAC1의 결합 및 핵 내 위치화를 증가 및 d)NOTCH 신호전달 경로를 불활성화 시키는 화합물을 선별하는 단계;를 포함하는, 항암 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 2)단계의 측정하는 단계은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법 및 RT-PCR 중 선택된 1 종 이상의 방법을 이용한 것일 수 있다.

KRT19가 넉다운된 유방암 세포에서 증식, 전이, 침윤, 약물 내성 및 구형성능이 높아짐을 확인하였고, KRT19가 β-catenin/RAC1 복합체와 반응하여 β-catenin의 안정성 및 세포 내 위치를 조절하고, 상기 β-catenin은 NUMB 프로모터에 결합하여 NOTCH 신호전달 경로의 활성을 차단할 수 있음을 확인하였다. 또한, KRT19를 과발현시킨 경우, 유방암세포의 세포 증식, 전이, 침습, 약물 내성 및 구형형성을 감소시킴으로써, 이를 암 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 KRT 패밀리의 유방암 세포에서 발현양상 및 KRT19가 넉다운된 유방암에서 KRT 패밀리의 발현양상을 확인한 도이다.
도 2는 KRT19 넉다운(knockdown) 유방암세포에서 세포증식, 전이, 침습, 약물 내성 및 구형형성(sphere formation)을 확인한 도이다.
도 3은 KRT19 발현을 억제시킨 경우, 유방암 세포의 신호 전달 관련 유전자의 발현 정도를 확인한 도이다.
도 4는 DAPT를 처리한 경우, KRT19이 넉다운된 유방암 세포의 증식, 전이, 침습 및 NOTCH 신호전달 경로에 주는 영향을 확인한 도이다.
도 5는 KRT19가 β-catenin 핵 내 위치화에 주는 영향을 확인한 도이다.
도 6은 KRT19가 β-catenin/RAC1 복합체 형성 및 핵 내 위치화에 주는 영향을 확인한 도이다.
도 7은 유방암 줄기세포에서 KRT19의 역할을 확인한 도이다.
도 8은 KRT19 과발현 또는 NOTCH1 넉다운된 경우, 유방암 줄기세포의 세포 증식, 전이, 약물 내성 및 구형성을 억제하는 것을 확인한 도이다.
도 9은 KRT19 매게 NUMB 유전자 발현 조절의 모식도를 나타낸 도이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제조예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1]유방암에서 KRT family의 발현 수준 확인

1. 세포 배양

인간 유방암 세포주(MDA-MB231, SKBR3, and MCF7), 간암 세포주(HepG2), 신경모세포종양 세포주(SH-SY5Y), 피부 세포주(HaCaT), 배아신장세포주 (HEK293T), 유방암 환자에서 얻은 CD133^high/CXCR4^high/ALDH1^high sphere-forming KU-CSLCs 세포들을 10% FBS high glucose-DMEM, RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. CD133^high/CXCR4^high/ALDH1^high KU-CSLCs은 직접 서울 건국대학교 병원에 있는 유방암 환자 조직에서 분리하여 준비하였고, 상기 실험은 임상 시험 심사위원회(IRB, KUH 1020003)의 규정에 따라 진행하였다.

2. RT- PCR 분석을 통한 유방암에서 KRT 패밀리의 발현 확인.

유방암에서 KRT 패밀리의 발현 양상을 확인하기 위하여, 하기와 같이 RT-PCR을 수행하였다. 제조업체의 방법에 따라 Easy-Blue total RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Republic of Korea)를 사용하여 Total RNA을 추출하였다. 전체 RNA의 농도는 Nanodrop (ND1000) 분광 광도계(Nanodrop Technologies Inc., Wilmington DE, USA)로 측정하였다. Total RNA 2μg 및 M-MLV 역전사효소를 사용하여 cDNA을 합성하였고, PCR 반응은 끝난 후 1% 또는 1.5 % 아가로스 젤에서 분석하였다. qPCR은 SYBR Green 마스터 믹스를 사용하여 분석하였고, mRNA 발현은 GAPDH(House keeping gene)을 기준 값으로 이용하여 계산하였다. 각 유전자에 대한 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 프라이머를 사용하였다. 이의 결과를 도 1의 b 및 c에 나타내었다.

Accession no.	Gene	Forward(5`-3`)	Reverse(5`-3`)
NM_057088.2	KRT3	GAGCGGGAACAGATCAAGAC	TCCACTTGGTCTCCAGGACT
NM_002272.3	KRT4	AGATACCTTGGGCAATGACA	CTTGTTCAGGTAGGCAGCAT
NM_000424.3	KRT5	CACCAAGACTGTGAGGCAGA	CCTTGTTCATGTAGGCAGCA
NM_005556.3	KRT7	CTCCGGAATACCCGGAATGAG	ATCACAGAGATATTCACGGCTCC
NM_153490.2	KRT13	ACGCCAAGATGATTGGTTTC	CGACCAGAGGCATTAGAGGT
NM_000224.2	KRT18	AGATCGAGGCTCTCAAGGAGG	CACGGTCAACCCAGAGCTG
NM_002276.4	KRT19	GCGAGCTAGAGGTGAAGATC	CGGAAGTCATCTGCAGCCA
NM_002046.5	GAPDH	AATCCCATCACCATCTTCCAG	CACGATACCAAAGTTGTCATGG

3. 웨스턴 블롯을 이용한 유방암에서 KRT 패밀리 발현 양상 확인

유방암에서 KRT 패밀리의 발현 양상을 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯을 수행하였다. 세포 분해 완충액 [1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 100mM Tris-HCl (pH 7.5), 10mM NaCl, 10% 글리세롤(Amresco, Solon OH, USA), 50mM sodium fluoride (Sigma-Aldrich), 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF; Sigma-Aldrich), 1 mM p-nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich), 및 1mM sodiumorthovanadate(Sigma-Aldrich)]을 사용하여 용해물을 4℃에서 15분 동안 13,000 rpm으로 원심 분리하였다. 단백질 상등액을 Bradford 단백질 시약으로 정량하였고, 단백질을 다시 SDS PAGE (10% 또는 12%)에 녹였다. 상기 분리한 단백질을 니트로 셀률로오스 막에 옮긴 후, TBS(Tris-buffered saline) 용액에 녹여 있는 5% 탈지분유로 1시간 정도 반응시킨 후, KRT 패밀리에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)를 이용하여 4℃에서 12 내지 18시간 멤브레인에 결합시켰다. 이 후, HRP-tagged anti-mouse, -goat, 또는 -rabbit 항체와 결합시켰다. ECL kit(Amersham Bioscience, Piscataway NJ, USA)을 사용하여 단백질 신호를 측정하였다. 이의 결과를 도 1의 c에 나타내었다.

4. 결론

유전자 발현을 Oncomine사이트에서 확인한 후(도 1의 a), 여러 가지 KRT 패밀리들의 발현수준을 비교하였다. 침윤된 유방암에서 KRT18과 KRT19 발현 양이 높음을 확인하였다. 특히 KRT19는 다른 KRT 패밀리 들보다 유방암과 정상적인 세포의 발현이 현격한 차이가 있음을 확인하여, KRT19은 유방암과 연관성이 크다는 점을 확인하였다.

[ 실시예 2]KRT19 넉다운 (knockdown) 유방암세포에서 세포증식, 전이, 침습, 약물 내성 및 구형형성(sphere formation)확인.

1. KRT19 넉다운(knockdown)세포 제조

암세포에서 KRT19를 넉다운의 효과를 확인하기 위하여, 콘트롤(scerambled), KRT19(shKRT19) shRNA의 BamHI와 EcoRI 제한효소 절단 부위를 이용하였다. 어닐링된 올리고 뉴클레오티드는 pGreenPuro 렌티바이러스 발현 벡터에 삽입하여 KRT19-넉다운 및 KRT19-control 백터를 구성하였다. 이 후, 인산칼슘형질주입 방법에 따라 HEK293T 세포를 특정 렌티 바이러스 벡터 및 바이러스 패키징 플라스미드(RRE, REV)로 형질도입 시키고, 5% CO₂, 37℃에서 72시간에 배양한 후, 바이러스 초 원심 분리기(Optima L-90K, Beckman Coulter Inc., CA, USA)를 사용하여 수집하였다. MDA-MB231, KU-CSLCs 및 MCF7 세포를 scrambled shRNA 또는 shKRT19로 감염시킨 다음, 5% CO₂, 37℃에서 12시간 배양하였다. 12 내지 18시간 후, 새로운 미디어(High-Glucose DMEM/RPMI 1640 with 10% FBS)로 바꿔주고, 렌티 바이러스 감염 효율은 <95 %로 계산되었고, 렌티 바이러스 발현 유무는 RT-PCR 및 웨스턴블럿으로 확인하였다.

2. KRT19가 넉다운된 유방암 세포의 증식 확인

상기 실시예 2.1의 KRT19 넉다운 후, 세포 증식에 대해 분석하기 위해 2× 10⁴ cells/well 세포를 12-well에 준비한 후, 4일동안 배양하면서 각 24시간 마다 세포의 수를 측정하였다.

이의 결과를 도 2의 d에 나타내었다.

3. KRT19가 넉다운된 유방암 세포의 전이능 확인

KRT19가 넉다운된 유방암 세포의 전이능을 확인하기 위하여, 세포 이동 및 상처 치유 실험을 수행하였다. 보다 구체적으로, 1×10⁶ cells/well 세포를 60mm 배양 접시에 준비한 후, 세포의 수가 90% confluence 까지 배양 후 이 세포들을 미토마이신 C (10 μg/ml)를 처리하여 5% CO₂, 37℃에서 2 내지 3 시간 배양한 후 세포 분화를 억제하였다. 그 후 200μl 파이펫 팁(pipette tip)로 세포 단층에 상처를 낸 후, 세포들을 PBS 완충액으로 세 번 씻어 시간별(0, 12, 24 시간)로 사진을 찍어 세포 이동을 확인하였다.

이의 결과를 도 2의 e에 나타내었다.

4. KRT19가 넉다운된 유방암 세포의 침습 확인

세포 침습을 분석하기 위하여, CytoSelect™96-Wells Cell Invasion Assay Kit (Cell Biolabs Inc., CA, USA)를 사용하였다. 1×10⁵ cells/well 세포를 96-well에 준비한 후 제조 업체의 방법에 따라 측정하였다. 이의 결과를 도 2의 f에 나타내었다.

5. KRT19가 넉다운된 유방암 세포의 약물 내성 확인

KRT19가 넉다운된 유방암 세포의 약물 내성 분석을 위하여, 1×10⁵ cells/well 세포를 12-well에 준비 한 후, 5% CO₂, 37℃에서 12 내지 16시간 배양한 후, 0.5μM의 독소루비신을 처리하여 48시간 배양해서 세포의 숫자를 측정하여 생존 세포의 백분율(%)로 표현하였다. 또한, 약물 내성 마커인 ABCG2, ABCC1 및 ABCB5에 대한 RT-PCR을 수행하였다. 이의 결과를 도 2의 g에 나타내었다.

6. KRT19가 넉다운된 유방암 세포의 구형 형성(Sphere formation) 확인

KRT19가 넉다운된 유방암 세포의 구형 형성을 확인하기 위하여, 1×10⁴ 세포를 코팅하지 않은 플레이트에 각각 20ng/ml EGF, 10μg/ml 인슐린, 0.4% BSA을 첨가한 GM[growth medium: DMEM/RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) with 10% FBS], SM[sphere-formation medium: serum-free DMEM/F12 supplemented with B27-supplement (1:50; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)] 배양액에서 배양하였다.

in vitro 구형형성을 위하여, 0.25% trypsin-EDTA를 처리하여 싱글 세포로 해리한 다음, 구형을 얻기 위해 non-coated plate 에 세포를 배양하였다. MDA-MB231, MCF7, 및 KU-CSLCs 세포에 있는 구형을 5일 배양한 다음, 수집하여 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 콜로니 형성 전에 Nikon eclipse TE2000-U microscopy로 사진을 촬영하였다. 이의 결과를 도 2의 h에 나타내었다.

7. 줄기세포 마커 발현확인

줄기세포 마커의 발현을 확인하기 위하여, OCT4, SOX2, NANOG 및 c-MYC 유전자의 발현을 RT-PCR을 이용하여 확인하였다. 이의 결과를 도 2의 i에 나타내었다.

8. 결론

KRT19는 유방암 세포 MDA-MB231와 MCF7에서 높은 발현이 보여 있기 때문에 두 세포에서 KRT19을 감소시킨 결과, shKRT19의 형질도입을 통해서 KRT19의 발현을 80% 감소시킴을 확인하였고, KRT19의 넉다운이 유방암 세포주에 영향을 주는 것을 확인하였다.

특히, 암세포의 증식, 전이, 침윤률, 약물 내성 마커 유전자들 ABCG2, ABCC1, ABCB5의 발현이 증가하는 경향이 나타남을 확인하였고, 구형형성을 증가시킴을 확인하였다.

[ 실시예 3]KRT19 넉다운(knockdown)의 NOTCH 신호 전달 경로에 대한 영향 확인.

1. RT- PCR을 통한 NOTCH 신호 전달 경로 관련 유전자 발현양 확인.

실시예 1에서 실시한 방법과 동일한 방법으로, 하기 표 2의 프라이머 서열을 이용하여, RT-PCR을 수행하여, NOTCH 신호 전달 경로 관련 유전자의 발현양을 확인하였다. 이의 결과를 도 3의 a에 나타내었다.

Accession no.	Gene	Forward(5`-3`)	Reverse(5`-3`)
NM_001005743.1	NUMB	TCCCACCTCTCCTACTTCTG	TGCCTCCCCTTCTACTTCTG
NM_005430.3	WNT1	CTTCGGCCGGGAGTTCGTGG	CACCGTGCATGAGCCGGACA
NM_017617.3	NOTCH1	GGGTACAAGTGCGACTGTGA	CGGCAACGTCGTCAATACAC
NM_014757.4	MAML1	CACCAGCCACCGAGTAACTT	AACAGGGAGTTCTGCTCGTG
NM_005349.3	RBPjK	GAACAAATGGAACGCGATGG	GATGACTTTTATCCGCTTGCTG
NM_005524.3	HES1	GGCTAAGGTGTTTGGAGGCT	GGTGGGTTGGGGAGTTTAGG
NM_001130442.1	HRAS	TTCTACACGTTGGTGCGTGA	CACAAGGGAGGCTGCTGAC
NM_053056.2	CCND1	CACACGGACTACAGGGGAGT	ATGGTTTCCACTTCGCAGCA

2. 웨스턴 블롯을 이용한 NOTCH 신호 전달 경로 관련 유전자 및 세포주기 조절 관련 유전자 발현양 확인

실시예 1에서 실시한 방법과 동일한 방법으로, 웨스턴 블롯을 수행하여, NOTCH 신호 전달 경로 관련 유전자 및 세포주기 조절 관련 유전자의 발현양을 확인하였다. 이의 결과를 도 3의 b에 나타내었다. 도 3의 c에 KRT19, NOTCH1 및 NUMB의 상대 발현 정도를 Oncomine database에서 확인한 결과를 나타내었다.

3. 결론

KRT19을 넉다운 한 후, 세포 내의 신호전달 변화를 조사하였고, 상기 결과는 KRT19가 NOTCH 신호전달에 영향을 주는 것을 확인하였다. 상기 NOTCH 신호가 세포의 운명, 분화 및 증식에 영향을 주는 것을 확인하였다.

상기 결과는 NOTCH1 세포내 도메인(intracellular domain)이 MAML1와 RBPjK와 결합해서 세포핵으로 이동이 일어나는 것을 나타낸다. 또한, NOTCH1의 표적인 HES1, CyclinD1 및 H-Ras의 발현이 증가하는 경향을 확인하였다.

[ 실시예 4]DAPT 처리하는 경우, 유방암 세포 증식, 전이 및 침습 확인

KRT19가 넉다운된 유방암세포에 DAPT[N-[(3,5-Difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glycine-1,1-dimethylethyl ester)를 처리한 후, 상기 유방암 세포의 증식(도 4a), 전이(도 4b) 및 침습(도 4c)을 확인하였다. 이의 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, DAPT를 KRT19 넉다운 세포에 처리하는 경우, KRT19 넉다운으로 발생했던 세포증식 및 NOTCH 신호변화가 모두 회복됨을 확인하였다.

[ 실시예 5]KRT19의 β- catenin의 핵 내 이동 조절확인

1. β- catenin의 핵 내 이동 조절확인.

KRT19와 β-catenin-RAC1 복합체와의 관계를 확인하기 위하여, KRT19 넉다운 세포에서 인산화-AKT, AKT, 인산화-GSK3β 및 GSK3β에 대하여, 웨스턴 블롯(도 5a 및 도 5b)을 수행하였다. 또한, 면역세포화학법(immunocytochemistry)을 이용하여, 세포 내 β-catenin/RAC1의 위치를 확인하였다(도 5의 c). 상기 면역세포화학법은 하기와 같이 수행하였다.

1×10⁴ KRT19가 넉다운된 세포를 준비하여 5% CO₂, 37℃에서 24시간 동안 배양하였고, 상기 세포들을 PBS로 씻어, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하여 10분 동안 0.2% Triton X-100로 침투시켰다. 상기 고정된 세포들을 PBS에서 10% 정상 염소 혈청으로 1시간 동안 코딩하였고, 이 후, 1차 항체와 같이 배양하여 PBS로 희석한 후 4℃에서 하룻밤 배양하였다. PBS로 세 번 세척한 후, 세포들을 1시간 동안 이차 항체와 함께 배양하였다. 세포핵은 TOPRO3 (10μg/㎖)로 추가로 10분 내지 15분동안 염색하였다. 이 후, 세포를 PBS로 세 번 세척하였고, 면역 형광 반응은 Leica TCS SP5 II laser scanning confocal microscope(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)로 모니터하였다. 이의 결과를 도 5(도 5의 a: Phospho(p)-AKT, AKT, p-GSK3β 및 GSK3β의 수준을 확인(웨스턴 블롯); 도 5의 b:핵 또는 세포질 내의 β-catenin 및 RAC1 수준을 확인(웨스턴 블롯); 도 5의 면역세포화학법을 이용하여 β-catenin 및 RAC1의 세포 내 위치 확인)에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 신호 전달 유전자 AKT와 GSK3β의 발현이 거의 큰 차이가 없는 것을 확인하였다. 또한, 전체적으로 β-catenin와 RAC1는 약간 감소하는 경향이 나타났지만 핵 안에 두 가지의 단백질이 유의적으로 감소함을 확인하였다.

2. KRT19 , β- catenin 및 RAC1 복합체의 핵 내 이동 확인.

KRT19가 β-catenin과 RAC1 복합체에 직접 영향을 주는지 확인하기 위하여, 면역침강법(Co-immunoprecipitation)을 수행하였다. 이의 결과를 도 6(도 6의 a: A/G sepharose; KRT19, β-catenin, RAC1에 대한 항체; IgG를 이용한 면역침강법; 도 6의 b:가시화 시킬 수 있는 표지가 부착한 항체를 이용한 면역침강법 수행 결과; 도 6의 c: MG132를 처리한 세포에서 KRT19, β-catenin 및 RAC1의 단백질 발현양 확인; 도 6의 d:MG132 처리 후, 가시화 시킬 수 있는 표지가 부착한 항체를 이용한 면역침강법 수행 결과)에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, KRT19가 직접 β-catenin과 RAC1 복합체에 영향을 주는 것으로 확인하였다. 그러나, KRT19를 넉다운시키면 상기 결합이 억제되는 것을 확인하였고, 프로테오좀(Proteasome) 억제제인 MG132를 처리하면 β-catenin 및 KRT19의 발현이 증가하고 RAC1는 큰 변화가 없음을 확인하였다. 즉, MG132을 처리하면 KRT19, β-catenin 및 RAC1의 발현이 다소 증가하는 반면, KRT19 발현이 억제되면, β-catenin과 RAC1는 극적으로 줄어드는 영향을 나타냄을 확인하였다. 따라서, KRT19는 β-catenin와 RAC1를 조절하는 역할을 하는 것을 확인하였다.

[ 실시예 6] 유방암 줄기세포(KU- CSLCs )에서 KRT19의 역할 확인.

실시예 1 및 2와 동일한 방법으로, 환자 유래 CD133^high/CXCR^high/ALDH1high 유방암 줄기세포(KU-CSLCs; cancer stem-like cell)에서 KRT19, NOTCH1, HES1등의 발현을 확인하였고, 줄기세포 마커 유전자의 발현을 확인하였다. 이의 결과를 도 7에 나타내었다(도 7의 a: MDA-MB231 세포 및 KU-CSLCs 세포에서 KRT19 mRNA 발현양 확인; 도 7의 b: KRT19, NUMB, NOTCH1 및 HES1의 발현 수준 확인(RT-PCR 및 웨스턴 블롯); 도 7의 c 및 d: 구형성능 확인; 도 7의 e: 줄기세포 마커 유전자 발현 확인; 도 7의 f 성장배지 또는 구형성배지에서 MDA-MB231 및 KU-CSLCs 세포에 대한 양적 PCR 수행 결과; 도 7의 g: 면역결핍 마우스(SCID)에 MDA-MB231 또는 KU-CSLCs 세포를 이식한 4주 후, 종양 형성(좌), 상기 마우스에서 떼어낸 종양(우) 확인; 도 7의 h: 상기 세포를 이식한 마우스의 무게 측정; 도 7의 j: DAPT 처리 후, KRT18, NUMB, NOTCH1 및 HES 1 유전자의 발현 양상 확인; 도 7의 I DAPT 처리 후, 암의 전이 또는 침습능 확인)

도 7에 나타난 바와 같이, 유방암 줄기세포(KU-CSLCs)에서 KRT19가 낮은 발현을 보여 주며, NOTCH1과 HES1 또한 낮은 수준으로 나타남을 확인하였다. 또한, KU-CSLCs는 구형성에서 구형성 배지뿐만 아니라 일반 배양액에서 쉽게 형성됨을 확인하였다. 또한, 상기 세포는 줄기세포 마커 유전자의 발현이 높음을 확인하였다.

또한, DAPT를 세포에 처리한 경우, shKRT19 MDA-MB231 및 KU-CSLCs에서 NUMB 발현이 대조군과 차이가 없었으며 DAPT는 세포의 증식 및 전이 등의 특징을 억제하고, 줄기세포 마커 유전자들의 발현을 감소시킴을 확인하였다. 특히, KU-CSLCs에서 상기의 변화가 더 심하게 나타남을 확인하였다.

[ 실시예 7]KRT19을 과발현 또는 NOTCH1 억제 시, 유방암 줄기세포(KU- CSLCs )의 세포증식, 전이, 약물 내성, 및 구형성 억제확인.

1. KRT19 과발현 또는 NOTHCH1 넉다운 세포 제조

NOTCH1 넉다운세포는 실시예 1의 방법에 따라, shNOTCH를 클로닝하여 제조하였다. KRT19의 과발현을 위하여, KRT19의 유전자를 pGEM^ⓡ-T Easy 백터 (Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝 후, pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP lentiviral vector (System Biosciences)에 서브 클로닝하였다. 이를 인산칼슘형질주입 방법에 따라 HEK293T 세포를 특정 렌티 바이러스 벡터 및 바이러스 패키징 플라스미드(RRE, REV)로 형질도입시켰다. 5 % CO₂, 37 ℃에서 72시간에 배양한 후 바이러스 초 원심 분리기(Optima L-90K, Beckman Coulter Inc., CA, USA)를 사용하여 수집하였다. 이 후, MDA-MB231, KU-CSLCs 및 MCF7 세포에 상기 렌티바이러스로 감염시킨 다음, 5% CO₂, 37℃에서 12시간 배양하였고, 12 내지 18시간 후, 새로운 배지(High-Glucose DMEM/RPMI 1640 with 10% FBS)로 바꿔주었다. 렌티 바이러스 감염 효율은 <95 %로 계산되었고, 렌티 바이러스 발현 유무는 RT-PCR 및 웨스턴블럿 분석으로 확인하였다.

2. KRT19을 과발현 또는 NOTCH1 억제 시, 유방암 줄기세포(KU- CSLCs )의 세포증식, 전이, 약물 내성, 및 구형성 억제확인.

KRT19가 NOTCH1 신호를 조절하는 것을 확인하기 위하여, KRT19 과발현 또는 NOTCH1를 감소시키는 실험을 수행하였다. 이의 결과를 도 8(도 8의 a:KRT19를 과발현 또는 NOTCH1 넉다운시킨 경우, KRT19, NUMB, NOTCH1 및 HES1의 발현; 도 8의 b:KRT19를 과발현 또는 NOTCH1 넉다운 시킨 경우, 세포 증식 확인; 도 8의 c:KRT19를 과발현 또는 NOTCH1 넉다운 시킨 경우, 세포의 전이 및 침습능 확인; 도 8의 d:KRT19를 과발현 또는 NOTCH1 넉다운 시킨 경우, 약물 저항능 확인; 도 8의 e:KRT19를 과발현 또는 NOTCH1 넉다운 시킨 경우, 구형성능 확인; 도 8의 f: KRT19를 과발현 또는 NOTCH1 넉다운시킨 경우, 줄기세포 마커 발현 확인)에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 상기 두 실험 결과가 같은 경향을 보임을 확인하였다. 또한, KRT19의 발현이 증가하거나 NOTCH1이 감소하면 KU-CSLCs 세포의 증식, 전이를 억제하며 약물 내성 마커와 줄기세포 마커들의 발현이 감소됨을 확인하였다. 상기의 결과는 KRT19가 NUMB를 통해서 NOTCH 신호를 조절하는 것을 나타낸다.

<110> Kunkuk-Industry cooperation foundation <120> Composition for preventing or treating cancer comprising inducer or activator of KRT19 <130> P-1 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> it is KRT19 amino acid sequence <400> 1 Met Thr Ser Tyr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Ala Thr Ser Ser Phe Gly 1 5 10 15 Gly Leu Gly Gly Gly Ser Val Arg Phe Gly Pro Gly Val Ala Phe Arg 20 25 30 Ala Pro Ser Ile His Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Val Ser Val Ser 35 40 45 Ser Ala Arg Phe Val Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Tyr Gly Gly Gly 50 55 60 Tyr Gly Gly Val Leu Thr Ala Ser Asp Gly Leu Leu Ala Gly Asn Glu 65 70 75 80 Lys Leu Thr Met Gln Asn Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp 85 90 95 Lys Val Arg Ala Leu Glu Ala Ala Asn Gly Glu Leu Glu Val Lys Ile 100 105 110 Arg Asp Trp Tyr Gln Lys Gln Gly Pro Gly Pro Ser Arg Asp Tyr Ser 115 120 125 His Tyr Tyr Thr Thr Ile Gln Asp Leu Arg Asp Lys Ile Leu Gly Ala 130 135 140 Thr Ile Glu Asn Ser Arg Ile Val Leu Gln Ile Asp Asn Ala Arg Leu 145 150 155 160 Ala Ala Asp Asp Phe Arg Thr Lys Phe Glu Thr Glu Gln Ala Leu Arg 165 170 175 Met Ser Val Glu Ala Asp Ile Asn Gly Leu Arg Arg Val Leu Asp Glu 180 185 190 Leu Thr Leu Ala Arg Thr Asp Leu Glu Met Gln Ile Glu Gly Leu Lys 195 200 205 Glu Glu Leu Ala Tyr Leu Lys Lys Asn His Glu Glu Glu Ile Ser Thr 210 215 220 Leu Arg Gly Gln Val Gly Gly Gln Val Ser Val Glu Val Asp Ser Ala 225 230 235 240 Pro Gly Thr Asp Leu Ala Lys Ile Leu Ser Asp Met Arg Ser Gln Tyr 245 250 255 Glu Val Met Ala Glu Gln Asn Arg Lys Asp Ala Glu Ala Trp Phe Thr 260 265 270 Ser Arg Thr Glu Glu Leu Asn Arg Glu Val Ala Gly His Thr Glu Gln 275 280 285 Leu Gln Met Ser Arg Ser Glu Val Thr Asp Leu Arg Arg Thr Leu Gln 290 295 300 Gly Leu Glu Ile Glu Leu Gln Ser Gln Leu Ser Met Lys Ala Ala Leu 305 310 315 320 Glu Asp Thr Leu Ala Glu Thr Glu Ala Arg Phe Gly Ala Gln Leu Ala 325 330 335 His Ile Gln Ala Leu Ile Ser Gly Ile Glu Ala Gln Leu Gly Asp Val 340 345 350 Arg Ala Asp Ser Glu Arg Gln Asn Gln Glu Tyr Gln Arg Leu Met Asp 355 360 365 Ile Lys Ser Arg Leu Glu Gln Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Ser Leu Leu 370 375 380 Glu Gly Gln Glu Asp His Tyr Asn Asn Leu Ser Ala Ser Lys Val Leu 385 390 395 400 <210> 2 <211> 1203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> it is KRT19 DNA sequence <400> 2 atgacttcct acagctatcg ccagtcgtcg gccacgtcgt ccttcggagg cctgggcggc 60 ggctccgtgc gttttgggcc gggggtcgcc tttcgcgcgc ccagcattca cgggggctcc 120 ggcggccgcg gcgtatccgt gtcctccgcc cgctttgtgt cctcgtcctc ctcgggggcc 180 tacggcggcg gctacggcgg cgtcctgacc gcgtccgacg ggctgctggc gggcaacgag 240 aagctaacca tgcagaacct caacgaccgc ctggcctcct acctggacaa ggtgcgcgcc 300 ctggaggcgg ccaacggcga gctagaggtg aagatccgcg actggtacca gaagcagggg 360 cctgggccct cccgcgacta cagccactac tacacgacca tccaggacct gcgggacaag 420 attcttggtg ccaccattga gaactccagg attgtcctgc agatcgacaa tgcccgtctg 480 gctgcagatg acttccgaac caagtttgag acggaacagg ctctgcgcat gagcgtggag 540 gccgacatca acggcctgcg cagggtgctg gatgagctga ccctggccag gaccgacctg 600 gagatgcaga tcgaaggcct gaaggaagag ctggcctacc tgaagaagaa ccatgaggag 660 gaaatcagta cgctgagggg ccaagtggga ggccaggtca gtgtggaggt ggattccgct 720 ccgggcaccg atctcgccaa gatcctgagt gacatgcgaa gccaatatga ggtcatggcc 780 gagcagaacc ggaaggatgc tgaagcctgg ttcaccagcc ggactgaaga attgaaccgg 840 gaggtcgctg gccacacgga gcagctccag atgagcaggt ccgaggttac tgacctgcgg 900 cgcacccttc agggtcttga gattgagctg cagtcacagc tgagcatgaa agctgccttg 960 gaagacacac tggcagaaac ggaggcgcgc tttggagccc agctggcgca tatccaggcg 1020 ctgatcagcg gtattgaagc ccagctgggc gatgtgcgag ctgatagtga gcggcagaat 1080 caggagtacc agcggctcat ggacatcaag tcgcggctgg agcaggagat tgccacctac 1140 cgcagcctgc tcgagggaca ggaagatcac tacaacaatt tgtctgcctc caaggtcctc 1200 tga 1203

Claims

KRT19(Keratin 19)는 서열번호 1의 아미노산 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되고, 상기 KRT19의 발현 또는 활성 촉진제를 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관(in vitro)내에서 NUMB, β-catenin 및 RAC1의 발현을 증진; 및 NOTCH 발현을 억제시키는 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
1)항유방암 후보 물질을 세포주에 처리하는 단계;
2)상기 세포주에서 a)KRT19의 발현양, b)NUMB의 발현양, c)β-catenin과 RAC1의 결합 및 핵 내 위치화 및 d)NOTCH 신호전달 경로의 활성을 측정하는 단계; 및
3) 상기 2)단계의 결과를 대조군으로서 항유방암 후보 물질을 처리하지 않은 세포주와 비교하여, a)KRT19의 발현량이 증가, b)NUMB의 발현량의 증가, c)β-catenin와 RAC1의 결합 및 핵 내 위치화를 증가시키고, d)NOTCH 신호전달 경로를 불활성화 시키는 화합물을 선별하는 단계;를 포함하는, 항유방암 후보 물질의 스크리닝 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 2)단계의 측정은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴블럿(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법 및 RT-PCR 중 선택된 1 종 이상의 방법을 이용한 것인, 항유방암 후보 물질의 스크리닝 방법.