KR101861168B1 - 작은 부피의 말초 혈액으로부터의 유도된 만능 줄기 세포의 생성 - Google Patents

작은 부피의 말초 혈액으로부터의 유도된 만능 줄기 세포의 생성 Download PDF

Info

Publication number
KR101861168B1
KR101861168B1 KR1020137000892A KR20137000892A KR101861168B1 KR 101861168 B1 KR101861168 B1 KR 101861168B1 KR 1020137000892 A KR1020137000892 A KR 1020137000892A KR 20137000892 A KR20137000892 A KR 20137000892A KR 101861168 B1 KR101861168 B1 KR 101861168B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
hematopoietic progenitor
progenitor cells
reprogramming
Prior art date
Application number
KR1020137000892A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130087009A (ko
Inventor
아만다 맥
Original Assignee
후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45348816&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR101861168(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드 filed Critical 후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드
Publication of KR20130087009A publication Critical patent/KR20130087009A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101861168B1 publication Critical patent/KR101861168B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/98—Xeno-free medium and culture conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/605—Nanog
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/608—Lin28
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

유도된 만능 줄기 세포(iPS 세포)의 생성과 관련된 방법 및 조성물이 개시된다. 예를 들어, 유도된 만능 줄기 세포는 에피솜 리프로그래밍 및 피더가 없거나 이종성분이 없는 조건을 사용하여 말초 혈액 세포, 예컨대 인간 혈액 전구 세포로부터 생성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 적은 개수의 혈액 전구 세포를 사용하여 전반적인 리프로그램 효율을 향상시키는 신규한 방법을 제공한다.

Description

작은 부피의 말초 혈액으로부터의 유도된 만능 줄기 세포의 생성{GENERATION OF INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS FROM SMALL VOLUMES OF PERIPHERAL BLOOD}
본 출원은 미국 특허 출원 제61/355,046호(출원일: 2010년 6월 15일) 및 미국 특허 출원 제61/388,949호(출원일: 2010년 10월 1일)에 대한 우선권을 주장하며, 그들 전체 개시내용은 본 명세서에 구체적으로 포기 없이 그들 전문이 참고로 포함된다. 또한, 본 출원은 미국 특허 출원 제61/184,546호(출원일: 2009년 6월 5일), 미국 특허 출원 제61/240,116호(출원일: 2009년 9월 4일) 및 PCT 출원 제PCT/US10/37376호(출원일: 2010년 6월 4일)에 관한 것이며, 그들 전체 개시내용은 본 명세서에 구체적으로 포기 없이 그들 전문이 참고로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 줄기 세포의 분야에 관한 것이다. 더욱 자세하게, 본 발명은 체세포, 특히 조혈 전구 세포(progenitor cell)의 리프로그래밍(reprogramming)에 관한 것이다.
일반적으로, 줄기 세포는 일련의 성숙한 기능성 세포가 될 수 있는 미분화 세포이다. 예를 들어, 조혈모 세포는 최종 분화된 혈액 세포의 상이한 유형 중 어느 것으로 될 수 있다. 배아 줄기(ES) 세포는 배아로부터 유래되며 만능이므로 임의의 기관 또는 조직 유형 또는 적어도 잠재적으로 완전한 배아로 발전할 수 있는 능력을 보유한다.
흔히 iPS 세포 또는 iPSC로 약칭되는 유도된 만능 줄기 세포는 비-만능 세포, 전형적으로 성체 체세포로부터 인위적으로 유래된 만능 줄기 세포의 한 유형이다. 유도된 만능 줄기 세포는 많은 관점에서, 예를 들면 특정 줄기 세포 유전자 및 단백질의 발현, 염색질 메틸화 패턴, 배가 시간, 배상체(embryoid body) 형성, 기형종 형성, 생존가능한 키메라 형성 및 효능과 분화능의 측면에서, 배아 줄기 세포와 같은 천연 만능 줄기 세포와 동일한 것으로 여겨지지만, 이들 유도된 만능 줄기 세포의 천연 만능 줄기 세포와의 전체적인 관련 정도는 여전히 평가되고 있다.
iPS 세포는 2006년에 마우스 세포로부터(문헌[Takahashi et al., 2006]), 2007년에 인간 세포로부터(문헌[Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007]) 처음으로 생성되었다. 이것은, 논란이 있는 배아의 사용 없이, 연구자들이 연구에 중요하며 잠재적으로 치료 용도를 갖는 만능 줄기 세포를 수득할 수 있기 때문에, 줄기 세포 연구에서 중요한 도약으로 인용되었다.
인간의 경우, iPS 세포는 흔히 피부 섬유아세포로부터 생성된다. 그러나, iPS 세포는 피부 생검을 해야 하는 선행 요건과 섬유아세포를 수 회의 시험관내 계대를 통해 증식시켜야 하는 선행 요건으로 인해 환자-특이적 줄기 세포를 생성하는데 다루기 힘든 공급원이다. 게다가, 인간 체세포를 리프로그래밍하는 기존 방법은 체세포를 인간 대상체로부터 직접 수득할 필요가 있거나 체세포를 노동-집약적인 세포 배양 시스템에서 유지할 필요가 있기 때문에 불편하다.
따라서, 간단하고 간편하며 쉽게 이용가능한 다른 공급원로부터 만능 줄기 세포를 유도하는 방법을 개발할 필요가 있다. 본 발명을 개발함에 있어 본 발명자들은 혈액을 환자 또는 건강한 개체로부터 채혈하거나, 저장하거나, 또는 예를 들면 중앙 분배 유닛으로부터 하나 이상의 먼 장소로 전달할 수 있기 때문에 혈액 세포가 이러한 공급원일 수 있음을 고려하였다. 그러나, 혈액 세포, 특히 말초 혈액 세포를 리프로그래밍하기 위한 더욱 효율적인 방법을 개발할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명의 태양은 리프로그래밍 말초 혈액 세포의 전반적인 과정 효율(혈액 세포의 투입 개수 대 iPS 라인의 생성 개수의 전환 효율)을 증가시키고, 예를 들어, 표준 혈액 시료(약 8 내지 10㎖의 부피)로부터 합당한 수의 iPS 콜로니(예컨대, 적어도 5개)를 수득하는데 필요한 투입 혈액 부피를 감소시키고자 한다. 본 발명의 특정 실시형태는 말초 혈액으로부터 많은 CD34+ 출발 세포를 증식시키는 능력을 사용하여, 비-동원된 말초 혈액으로부터 얻을 수 있는 소수의 CD34+ 출발 세포 제한을 극복하는 것이 신규하다. 당업자는 또한 선천적으로 CD34+ 세포를 분화되게 하여, CD34+ 세포를 증식하는 것이 세포를 리프로그래밍에 덜 감수성이게 만들 수 있다고 생각할 수 있다. 본 발명의 실시예에 의해, 증식된 세포가 리프로그래밍에 충분한 개수를 제공하며, 증식을 사용하지 않는 본질적으로 동일한 조건에서보다 훨씬 더 높은, 예기치 않게 우수한 전반적인 과정 효율을 달성함이 증명되었다. 이러한 진전과 함께, 본 발명의 특정 태양은 작은 부피의 말초 혈액, 특히 비-동원된 대상체로부터의 iPS 세포의 생성을 가능하게 한다.
반면, 본 발명의 특정 태양은 정의된 세포외 기질 상에서 말초 혈액 세포로부터 iPS 세포를 생성하여, 정의되지 않은 피더 세포(feeder cell)로부터의 잠재적인 이종발생 오염 및 문제점을 방지하는 이점을 갖는다. 추가의 태양에서, 본 발명은 또한 리프로그래밍을 위한 통합 벡터를 사용하는 것의 문제점을 극복한다.
따라서, 제1 실시형태에서, a) 조혈 전구 세포를 포함하는 인간 말초 혈액 세포의 세포 집단을 제공하는 단계; b) 상기 집단을 조혈 전구 세포의 증식을 촉진시키는 조건 하에서 배양하는 단계; c) iPS 리프로그래밍 인자를 발현하는 외인성 에피솜 유전 요소 또는 외인성 RNA 유전 요소를 증식된 조혈 전구 세포에 도입하는 단계; 및 d) 본질적으로 피더 세포 또는 피더 세포-조정된 배지가 없는 배양물, 또는 이종성분이 없는(xeno-free) 배양물에서 에피솜을 함유하는 증식된 조혈 전구 세포를 배양함으로써, 조혈 전구 세포로부터 인간 iPS 세포를 생성하는 단계 중 하나 이상을 포함하는 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 생성 방법이 제공된다. 특정 태양에서, iPS 세포는 상술된 하나 이상의 단계를 사용하여, 작은 부피의 혈액 시료, 예컨대 최대 10㎖로부터 생성될 수 있다. 증식 단계는 항상 필요한 것이 아닐 수 있으나, 예기치 않은 방식으로, 특히 혈액 부피가 작은 상황에서 리프로그래밍 효율을 크게 증가시킨다.
특정 태양에서, 세포 집단의 공급원은 세포가 외적으로 적용된 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식구 콜로니-자극 인자(GM-CSF)로 동원되지 않은 1명 이상의 대상체로부터의 것이다. 세포 집단의 공급원은 혈액 시료 또는 혈액 구성성분일 수 있다. 혈액 시료의 적절한 부피는 약 1 내지 약 5㎖, 약 1 내지 10㎖, 약 1 내지 15㎖, 또는 더욱 구체적으로, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50㎖ 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위일 수 있다. 세포 집단은 동결보존된 혈액 시료로부터 수득될 수 있거나, 세포 집단의 공급원 또는 세포 집단은 동결보존될 수 있다.
예를 들어, 세포 집단은 적어도, 약, 또는 최대 1×103, 2×103, 3×103, 4×103, 5×103, 6×103, 7×103, 8×103, 9×103, 1×104, 2×104, 3×104, 4×103, 5×104, 6×104, 7×104, 8×104, 9×104, 1×105, 2×105, 3×105, 4×105, 5×105, 6×105, 7×105, 8×105, 9×105, 1×106, 2×106개 조혈 전구 세포 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 특정 태양에서, 증식 또는 리프로그래밍 전의 출발 세포는 적어도 또는 약 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013개의 세포 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 출발 세포 집단은 씨딩 밀도가 적어도 또는 약 10, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108개 세포/㎖ 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위일 수 있다. 8 내지 10㎖의 표준 혈액 시료는 6 내지 12,000개 CD34+ 세포를 가질 수 있으며, 보통 iPS 세포 콜로니를 제공하기 위한 리프로그래밍에 충분하지 않을 것이다. 그러나, 본 발명의 일부 태양은 전구 세포를 충분한 개수로 증식시키고, 증식된 세포를 리프로그래밍하여, 성공적인 iPS 세포의 생성을 달성하는 방법을 제공한다. 특정 태양에서, 세포 집단은 본질적으로, T 세포 또는 B 세포와 같은 임의의 최종 분화된 혈액 세포가 없을 수 있으며, 이에 따라, 이로부터 유래되는 iPS 세포는 유전자 재배열 없이 완전한 게놈을 가질 수 있다.
조혈 전구 세포의 분리에 유용한 임의의 방법은 본 발명의 방법의 단계 a)에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 분리는 표면 마커 발현을 기반으로 할 수 있으며, 이는 CD34 발현의 양성의 선택 및/또는 계통-특이적 마커 발현의 음성 선택을 포함할 수 있다. 선택 방법은 자기 활성화 세포 분류(MACS(등록상표)) 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS(상표명), 즉, 유세포분석법)를 포함할 수 있다.
조혈 전구 세포의 증식 또는 조기 회복 단계에서의 리프로그래밍된 조혈 전구 세포의 배양을 위하여, 세포를 줄기 세포 인자(SCF), Flt-3 리간드(Flt3L), 트롬보포이에틴(TPO), 인터류킨 3(IL-3) 또는 인터류킨 6(IL-6)을 포함하는 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 증식 배지를 포함하는 조건 하에서 배양할 수 있다. 증식 조건은 노치(Notch)-1 리간드, 예컨대 조작된 동원 노치 리간드(델타1ext-IgG; 문헌[Delaney et al., 2010])를 추가로 포함하거나 또는 노치-1 리간드가 목적에 부수적인 것으로 나타나는 경우, 이러한 노치-1 리간드를 포함하지 않을 수 있다. 세포를 리프로그래밍 단계 전에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25일 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위 동안 증식시킬 수 있다. 예를 들어, 리프로그래밍 요소를 약 3, 4, 5 또는 6일의 증식 단계에 세포에 도입시킬 수 있다.
조혈 전구 세포를 위한 증식 조건은 본질적으로 임의의 기질 성분이 없거나, 대안적으로 정의되거나 이종성분이 없는 세포외 기질, 예컨대 레트로넥틴(Retronectin)(등록상표)과 같은 인간 피브로넥틴 단편을 포함할 수 있다.
조혈 전구 세포의 생체내 미세환경을 모방함으로써, 조혈 전구 세포의 시험관내 증식을 용이하게 하기 위하여, 조혈 전구 세포의 증식 또는 조기 회복 단계에서의 리프로그래밍된 조혈 전구 세포의 배양을 위한 조건은 저산소 조건, 예컨대 약 1 내지 7% 산소 분압, 특히 약 2 내지 5% 산소일 수 있다.
본 발명의 추가의 태양에서, 외인성 유전 요소를 세포에 도입하기 위한 임의의 방법, 예컨대 전기천공법 또는 지질-매개의 유전자 전달이 사용될 수 있다.
특정 태양에서, 에피솜 유전 요소는 복제 원점 및 리프로그래밍 인자의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 이러한 하나 이상의 발현 카세트는 복제 원점에 결합하여 염색체-외 주형을 복제하는 트랜스-작용성(trans-acting) 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 말초 혈액 세포는 이러한 트랜스-작용성 인자를 발현할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 복제 원점은 림프구 친화성 헤르페스 바이러스 또는 감마 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, SV40, 소유두종 바이러스 또는 효모의 복제 원점, 예컨대 EBV의 oriP에 상응하는 림프구 친화성 헤르페스 바이러스 또는 감마 헤르페스 바이러스의 복제 원점일 수 있다. 추가의 태양에서, 림프구 친화성 헤르페스 바이러스는 엡스테인 바 바이러스(EBV), 카포시육종 헤르페스 바이러스(KSHV), 헤르페스 바이러스 사이미리(HS) 또는 마렉병 바이러스(MDV)일 수 있다.
외인성 에피솜 유전 요소의 복제 및 일시적인 유지를 위하여, 트랜스-작용성 인자는 바람직하게는 EBV의 OriP에 상응하는 복제 원점의 존재 하의, EBV의 EBNA-1(EBV 핵 항원 1)의 야생형 단백질에 상응하는 폴리펩티드 또는 그의 유도체일 수 있다. 유도체는 야생형 EBNA-1과 비교시 통합된 주형으로부터의 전사를 활성화시키는 능력이 감소되며, 이에 따라 종양형성 형질전환을 야기하도록 염색체 유전자를 이소적으로(ectopically) 활성화시킬 기회가 감소된다. 한편, 유도체는 유도체가 복제 원점에 결합한 후에, 염색체-외 주형으로부터 상응하는 야생형 단백질의 적어도 5%만큼 전사를 활성화시킬 수 있다.
조혈 전구 세포의 리프로그래밍을 위하여, 본 발명의 방법의 특정 태양은 Sox, Oct, Nanog, Lin-28, Klf4 및 C-myc 또는 L-myc 중 어느 하나 또는 그들의 조합, 예컨대, Sox, Oct, Nanog 및 임의로 Lin-28의 세트, Sox, Oct, Klf4 및 임의로 C-myc 또는 L-myc의 세트, 또는 그들 6개의 인자의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있는 리프로그래밍 인자를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 특정 태양에서, C-myc 발현의 가능한 독성 효과를 감소시키기 위하여, SV40 대형(large) T 유전자(SV40LT)가 C-myc와 함께 포함될 수 있다. 특정 태양에서, DNA 또는 RNA 중 어느 하나인 외인성 요소는 동일한 전사 조절 요소 하에 하나 이상의 폴리시스트론성 카세트(polycistronic cassette), 예컨대 둘 이상의 리프로그래밍 인자 유전자를 포함할 수 있다.
일부 추가의 태양에서, 외인성 리프로그래밍 인자가 도입되는 조혈 전구 세포는 이종성분이 없는 세포외 기질의 존재 하에서 배양할 수 있다. 인간 세포에 대하여, 이종성분이 없는 기질은 본질적으로 인간이 아닌 동물 성분이 없는 세포외 기질로 정의된다. 특정 태양에서, 기질은 예컨대 단일 유형의 세포외 기질 펩티드, 예컨대 인간 피브로넥틴 단편, 예컨대, 레트로넥틴(등록상표)을 갖는 것으로 정의될 수 있다.
추가로, 리프로그래밍을 위한 외인성 유전 요소의 도입 후의 단계 d)에서, 세포는 한가지 초과의 별개의 조건 하에서 배양할 수 있다. 리프로그래밍 요소의 도입 직후의 제1 하위-단계에서, 세포는 상술된 바와 같은 조혈 전구 세포 증식 배지 또는 리프로그래밍 배지, 그들의 조합 또는 등가물 중에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 세포는 조혈 전구 세포의 회복을 위하여 줄기 세포 인자(SCF), Flt-3 리간드(Flt3L), 트롬보포이에틴(TPO), 인터류킨 3(IL-3) 또는 인터류킨 6(IL-6)을 포함하는 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 배지를 포함하는 조건 하에서 배양할 수 있다. 이러한 하위-단계는 약, 적어도 또는 최대 2, 4, 8, 12, 16, 24, 32, 48, 96시간 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위로 지속될 수 있다. 이러한 하위-단계에서, 기질 성분은 임의적일 수 있다. 이러한 하위-단계 후에, 세포가 이미 기질 위에 있지 않다면 세포는 기질로 전이될 수 있다.
세포를 증식 배지; 리프로그래밍 효율을 증가시키기 위한 리프로그래밍 배지, 예컨대 GSK-3 억제제, MEK 억제제, TGF-β 수용체 억제제, 미오신 II ATPase 억제제, 및/또는 Rho-관련 키나제(ROCK) 신호전달 억제제를 포함하는 배지; 그들의 조합 또는 그들의 등가물을 포함하는 조건 하에서 추가로 배양하고, 100% 리프로그래밍 배지로의 전이로 이어질 수 있다. 예를 들어, GSK-3 억제제는 CHIR99021일 수 있으며; MEK 억제제는 PD0325901일 수 있고; TGF-β 수용체 억제제는 A-83-01일 수 있으며; 미오신 II ATPase 억제제는 블레비스타틴일 수 있고; ROCK 억제제는 HA-100 또는 H1152일 수 있다. 이러한 하위-단계는 약, 적어도 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위로 지속될 수 있다. 일부 태양에서, 리프로그래밍 배지는 화학적으로 정의되거나 또는 TeSR 배지, 인간 배아 세포 배양 배지 또는 N2B27 배지를 기반으로 할 수 있다. 추가의 태양에서, 세포를 바람직하게는 점차, 외적으로 적용되는 신호전달 억제제, 예컨대 GSK-3 억제제, MEK 억제제, 미오신 II ATPase 억제제 및 TGF-β 수용체 억제제가 본질적으로 없는 배지로 전이시킬 수 있다. 이러한 배지는 TeSR2 또는 다른 줄기 세포 배지일 수 있으며, 바람직하게는 화학적으로 정의될 수 있다.
단계 또는 하위-단계 중 임의의 것 또는 전체 과정을 위한 임의의 배지, 배양물 또는 기질은 이종성분이 없거나 정의될 수 있다. 배지는 화학적으로 정의될 수 있으며, 예컨대 TeSR(상표명) 배지가 있다.
특정 태양에서, 상기 방법은 예컨대 하나 이상의 배아 세포 특징, 예컨대 ES 세포-유사 형태학에 기초하여, iPS 세포를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 태양에서, 상기 방법은 GSK-3 억제제, MEK 억제제, 미오신 II ATPase 억제제, TGF-β 수용체 억제제, Rho-관련 키나제(ROCK) 신호전달 억제제, 임의로 백혈병 억제 인자(LIF) 또는 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 iPS 세포 증식 배지에서 선택된 iPS 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
상기 방법에 따라 생성되는 iPS 세포의 집단이 또한 제공될 수 있다.
또한, 조혈 전구 세포 및 그의 자손 세포를 포함하는 인간 말초 혈액 세포의 세포 집단, 이종성분이 없는 세포외 기질 및 배지를 포함하는 세포 배양 조성물이 제공될 수 있으며, 여기서, 조혈 전구 세포는 리프로그래밍 인자를 발현하는 하나 이상의 외인성 에피솜 또는 RNA 유전 요소를 포함한다. 특히, 기질은 정의될 수 있다. 예를 들어, 기질은 단일 유형의 세포외 기질 펩티드, 예컨대 재조합 피브로넥틴 단편을 가질 수 있다. 재조합 피브로넥틴 단편은 레트로넥틴(등록상표)일 수 있다. 추가의 태양에서, 세포 배양 조성물은 이종성분이 없거나 정의될 수 있다. 배양 조성물에 포함되는 배지는 이종성분이 없거나 화학적으로 정의될 수 있다. 이러한 배지는 리프로그래밍된 조혈 전구 세포의 조기 단계를 위한 줄기 세포 인자(SCF), Flt-3 리간드(Flt3L), 트롬보포이에틴(TPO), 인터류킨 3(IL-3) 또는 인터류킨 6(IL-6)을 포함하는 하나 이상의 사이토카인을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 배양 조성물은 노치-1 리간드, 예컨대 조작된 동원 노치 리간드를 포함할 수 있다(델타l ext-IgG; 문헌[Delaney et al., 2010]). 리프로그래밍 효율을 증가시키기 위하여, 배지는 GSK-3 억제제, MEK 억제제, TGF-β 수용체 억제제, 미오신 II ATPase 억제제 및/또는 Rho-관련 키나제(ROCK) 신호전달 억제제를 포함할 수 있다.
세포 배양 조성물에서, 인간 말초 혈액 세포의 세포 집단은 세포가 외적으로 적용된 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식구 콜로니-자극 인자(GM-CSF)로 동원되지 않은 1명 이상의 대상체로부터의 것일 수 있다. 조혈 전구 세포는 예를 들어, 줄기 세포 인자(SCF), Flt-3 리간드(Flt3L), 트롬보포이에틴(TPO), 인터류킨 3(IL-3) 또는 인터류킨 6(IL-6)을 포함하는 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에서 시험관내에서 증식될 수 있다. 증식 배양은 현탁 세포 배양일 수 있으며, 상술된 바와 같은 임의의 물질 또는 기질을 사용할 필요가 없을 수 있다. 세포 집단의 공급원은 혈액 시료 또는 혈액 성분일 수 있다. 혈액 시료의 적절한 부피는 약 1 내지 약 5㎖, 약 1 내지 10㎖, 약 1 내지 15㎖, 또는 더욱 구체적으로, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10㎖ 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위일 수 있다. 세포 집단은 동결보존된 혈액 시료로부터 수득되거나, 세포 집단의 공급원 또는 세포 집단은 동결보존될 수 있다.
본 발명의 방법 및/또는 조성물의 문맥에서 논의되는 실시형태는 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대하여 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 방법 또는 조성물에 관계된 실시형태는 또한 본 발명의 다른 방법 및 조성물에 적용될 수 있다.
핵산과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "암호화한다" 또는 " 암호화하는"은 숙련자가 본 발명을 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해 사용된 것이나, 이들 용어는 각각 "포함한다" 또는 "포함하는"과 상호교환하여 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 단수 표현은 하나 이상을 의미할 수 있다. 특허청구범위에서 단어 "포함하는"과 병행하여 사용되는 단수 표현은 하나보다는 하나 이상을 의미할 수 있다.
특허청구범위에서 사용된 용어 "또는"은 비록 본 명세서가 단지 대안 및 "및/또는"만을 가리키는 정의를 지지할지라도, 단지 대안만을 가리키기 위해 특별히 언급되지 않았거나 대안이 상호 배척하지 않는 한, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본 명세서에 사용된 "다른"은 적어도 제2의 또는 그 이상의 것을 의미할 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "약"은 해당 값에 이 값을 결정하기 위해 사용된 장치의 오류 및 방법의 고유 편차 또는 연구 대상체 사이에 존재하는 편차가 포함되어 있음을 지칭한다.
본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 아래의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다. 그러나, 이러한 상세한 설명으로부터 본 발명의 목적 및 범위 내에 있는 다양한 변화 및 변형은 본 상세한 설명으로부터 해당 분야의 전문가에게 자명한 것이기 때문에, 본 명세서의 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내기 위한 것으로서 단지 예시적인 목적으로 제시되고 있음을 이해해야 한다.
아래 도면은 본 명세서의 일부를 구성하며 본 발명의 특정 관점을 추가로 증명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 특정 실시형태에 대한 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 보다 더 잘 이해될 수 있다.
도 1 - 예시적인 리프로그래밍 과정의 개략도, 표준 방식에서, 8㎖ 전혈 바이얼(vial)을 처리하여, PBMC를 수득하고, 이를 동결시키거나 새로 정제하여 CD34-발현 세포를 농축한다. 그 다음, 이들 세포를 증식 기간 동안 씨딩하여, 트랜스펙션에 최적의 수의 세포를 수득한다. 그 다음, 트랜스펙션된 세포를 소분자와 복합화된 리프로그래밍 배지와 조합되거나 100%의 새로운 증식 배지 중에 재현탁화시킨다. 적어도 48시간 내에, 세포를 정의된, 피더가 없는 기질로 옮기고, 소분자와 복합화된 100% 리프로그래밍 배지를 격일로 공급한다. 트랜스펙션 후 대략 9 내지 14일 후(dpt)에, 배양물에 소분자가 없는 정의된 만능 줄기 세포 배지(즉, TeSR2)를 공급한다. 그 다음, Tral-81을 사용하여 트랜스펙션 후 18 내지 25일 후까지 콜로니를 염색하여, iPS 콜로니를 확인한다.
도 2a 내지 도 2e - 조혈 전구 세포(HP)는 비-동원 혈액 공여자로부터 증식할 수 있다. 도 2a는 3가지 시험 조건을 사용한, 단일의, 비-동원 혈액 공여자로부터의 HP의 증식을 보여준다. 각 조건은 사이토카인-풍부 배지에 좌우되나, 기질은 기질-미함유, 피브로넥틴-코팅(노치-) 및 피브로넥틴/DLL-1 코팅(노치+)으로 달라진다. 도 2b는 더욱 분화된 세포 유형을 향한 전구세포 이동으로 발생하는 CD34 발현의 자연적인 감소를 보여준다. CD45 발현은 일반적으로 조혈 세포의 지표이다. 증식 동안 10일에 시료링한 동일한 공여자로부터의 세포는 자연 상에서 우세적으로 골수성이었던 발현 프로파일을 나타내었으며(도 2c), B, T 및 NK 마커의 발현은 거의 없는 것 내지 미발현이었다(데이터 미도시). 또한, 증식이 다수의 공여자에서 일관적이지만, 증식의 규모가 환자 시료 간에 달라지는 것이 본 명세서에서 밝혀졌다(도 2d). 5명의 공여자의 푸울(pool)을 생성하여, 수행될 다수의 리프로그래밍 실험을 위한 다수의 세포를 확립하였다. 이러한 푸울의 증식능을 2회 측정하였다(반복 1 및 2, R1 및 R2)(도 2e).
도 3 - 조혈 전구 세포(HP)의 트랜스펙션을 위한 벡터. 세포를 성공적으로 리프로그래밍시키기 위하여, HP를 전기천공법에 의해, GFP-발현 대조군 플라스미드 또는 리프로그래밍을 위한 인자를 발현하는 플라스미드의 조합 중 어느 하나로 트랜스펙션시킨다. 성공적으로 사용되어온 리프로그래밍 인자의 다양한 조합을 발현하기 위해 사용될 수 있는 다수의 플라스미드의 교체가 존재하며, 이러한 플라스미드의 예는 본 명세서에 나타나 있다. 각 플라스미드는 oriP, 및 트랜스펙션된 세포 내에서의 플라스미드의 보유를 보장하기 위한 EBNA1을 발현하는 카세트를 함유한다.
도 4 - 폴리시스트론성 벡터에 대한 벡터 맵 - 세트 1 및 세트 2.
도 5a 내지 도 5f - 리프로그래밍을 위한 투입 세포 개수 및 트랜스펙션 효율의 최적화. 도 5a. 공여자 FF(류코팩(leukopak) 공급원)로부터 유래된 PBMC로부터의 정제된 세포를 6일 동알 증식시켰다. 다양한 세포 개수를 대조군, GFP를 발현하는 oriP/EBNA1-기반의 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 유세포분석법에 의해 검출되는 GFP를 발현하는 생세포의 백분율을 계산함으로써 트랜스펙션 효율을 결정하였다. 도 5b. PBMC(공여자 A2389)로부터의 정제된 세포를 3일 또는 6일 동안 증식시키고, 6×104 내지 1×1O5개의 세포를 대조군, GFP-발현 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 그래프는 GFP-양성인 전체 집단의 백분율 및 총 세포의 절대 개수를 도시하고 있다. 도 5c. 이러한 그래프는 증식 3 또는 6일에 트랜스펙션되는 경우 GFP 및 CD34를 공동-발현하는 b에서의 세포의 분율을 나타낸다. 도 5d. 트랜스펙션을 위한 조합 플라스미드 세트 2를 사용한 새로 채취한 혈액(공여자 3002)으로부터의 대표적인 리프로그래밍 시험. 알칼리성 포스파타제 활성에 대하여 양성으로 염색된 콜로니를 함유하는 6 웰 플레이트로부터의 단일의 웰을 나타내었다(i). 백색 화살촉은 패널 ii에서 확대되며, 또한 패널 iii에서 Tral-81 발현에 대하여 양성으로 염색된 콜로니를 강조표시한다. 도 5e. 6일 동안 증식한 다양한 투입 세포 개수에서 플라스미드 세트 2를 사용한 리프로그래밍 시험을 수행하였다(공여자 GG). 도 5f. 4명의 상이한 공여자로부터 정제된 CD34-발현 세포를 6일 동안 증식시키고, 비교를 위하여 C-myc(세트 1) 또는 L-myc(세트 2)를 발현하는 플라스미드 조합을 사용하여 트랜스펙션시키고, 총 iPSC의 개수를 비교하였다.
도 6 - iPSC의 생성은 BSA-함유 보충물 B27의 부재 하에서 발생한다.
도 7a 및 도 7b - CD34-발현의 양을 리프로그래밍 효율과 상호관련시킨다. 도 7a. 정제 후에 CD34 양성(i) 및 음성(ii) 분획 둘 모두를 리프로그래밍에 사용하는 대표적인 리프로그래밍 시험. 패널 (i)은 알칼리성 포스파타제를 발현하는 그들의 능력에 기초하여 공여자 2939로부터 성공적으로 리프로그래밍된 콜로니를 함유하는 6 웰 플레이트 중 하나의 웰을 보여준다(AP 염색, 청색). 공여자 2939로부터의 CD34-제거된 분획은 정제된 집단 패널, ii와 병행하여 수행되는 경우, AP 염색의 결여에 의해 나타나는 바와 같이 콜로니를 형성할 수 없었다. 패널 iii 및 iv는 백색 화살촉에 의해 표시된 패널 (i)에서의 콜로니를 확대한 것이며, Tral-81(녹색)의 발현을 나타낸다. 도 7b. 4가지 상이한 혈액 공여자로부터 정제된 세포를 3, 6, 9 또는 13일 동안 증식시켰다. 모든 시간 또는 하위집단의 시간으로부터의 세포 집단을 L-myc 발현 플라스미드 DNA 조합 세트 2를 사용하여 피더가 없는 리프로그래밍 프로토콜로 시험하였다. ES 세포의 특징적인 형태적 특징 및 Tral-81에 대하여 양성으로 염색되는 능력을 나타내는 iPSC의 총 개수를 트랜스펙션에 사용된 세포의 총 개수로 나눈 것으로서 리프로그래밍의 효율을 계산하였다. 검은색 사각형은 지정된 시점에서의 CD34 발현 집단의 백분율을 도시한다.
도 8a 및 도 8b - 완전히 정의된 시약(동물 성분이 없는)을 사용하는 혈액 세포-유래의 iPSC. 도 8a. 증식 6일 후에, 표준(n=13) 및 완전히 정의된 동물 성분이 없는 배지(n=2)에서의 다수의 공여자로부터 풀링된 CD34-발현 세포의 증식 배수. 증식 배수를 정제일 후의 세포 개수로 나눈 6일의 총 세포 개수로부터 계산하였다. 백분율은 전체 집단에서 CD34를 발현하는 세포의 분획을 나타낸다. 도 8b. 이미지는 완전히 정의된, 동물 성분이 없는 시약을 사용하여 CD34-발현에 대하여 농축시킨 증식된 세포의 리프로그래밍 후에 알칼리성 포스파타제에 대하여 양성으로 염색된 콜로니를 함유하는 6 웰 플레이트 중 하나의 웰을 나타낸다.
I. 도입
본 발명은 말초 혈액 세포의 리프로그래밍의 전반적인 과정 효율을 향상시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이러한 리프로그래밍은 이종성분이 없거나 또는 정의된 조건 하에서 이루어질 수 있으며, 본질적으로 외인성 레트로바이러스 유전 요소가 없어, 이에 따라, 임상적으로 더욱 적절한 iPS 세포를 만들 수 있다.
iPS 세포의 임상적 적절성의 철저한 평가는 염색체 통합에 의존하는 바이러스-기반의 방법을 포함하는 불량 정의된(ill-defined) 시스템 및 방법을 사용하는 그들의 유도에 의해 제한된다. 예를 들어, 마우스 배아 섬유아세포(MEF)는 MEF의 존재 하에 조절되는 리프로그래밍 배지와 함께 iPS 발생을 촉진시키기 위한 지지층으로 종종 사용되어 왔다. 본 발명자는 리프로그래밍의 효율이 부분적으로 배치(batch) 간에 달라질 수 있는 사용되는 MEF의 양에 의해 영향을 받는 것을 관찰하였다. 따라서, 가변성을 조절하고 정량화하는 것이 어려운데, 이는 리프로그래밍에 부여하는 MEF의 기여가 불량하게 정의되어 있기 때문이다. 따라서, 조작되기 쉬운 MEF와 독립적인 더욱 정의된 시스템을 확립하는 것이 바람직하며, 이에 따라, 결과는 더욱 예측가능하다. 다수의 실험실에서는 매트리겔(Matrigel)(상표명)(마우스 기원) 또는 그의 유도체와 같은 피더가 없는 기질을 사용하여 iPS 세포를 생성하는 것을 성공하였으나(문헌[Aasen and Belmonte, 2010; Sun et al., 2009]), 이중 어느 것도 말초 혈액 세포 또는 이종성분이 없는 기질을 사용하지 않는다.
추가로, 바이러스-기반의 리프로그래밍 방법은 현재까지 비-통합 방법보다 더 효율적인 것으로 입증되어 있으며, 이에 따라 iPS 세포를 생성하기 위하여 더욱 지속적으로 사용되어 왔다. 불행히도, 공지된 종양유전자, 예컨대 C-myc 및 T-항원을 암호화하는 통합된 DNA를 지니는 발현 카세트의 존재는 적어도 2가지의 이유로 허용될 수 없다. 이들의 존재는 제한적인 임상 응용의 기준 내에서 용인될 수 없는 유전자의 재활성화 및 발현의 위험을 항상 지닌다. 바이러스-기반의 방법에 의해 발생되는 통합은 또한 다수의, 그리고 종종 예측하지 못한 위치에서 발생하여, 다운스트림 분석 내의 이들 세포 성능의 생존력을 초래하는 중요한 세포 과정 또는 증식을 조절하는데 결정적일 수 있는 숙주 DNA 내에 존재하는 내인성 유전자의 발현을 방해할 수 있다. 따라서, 정의된 조건을 사용하여 iPS 세포를 생성하기 위한 비-통합 전략은 이러한 강력한 가변성을 완화시킬 것이다.
임상 응용에 요구되는 기준을 만족시키는 환자 특이적 세포를 제공하기 위하여, iPS 클론은 높은 분율의 표적 세포를 함유하거나 적어도 쉽게 증식되는 다루기 쉬운 공급원 물질로부터 생성되거나, 피더가 없는 조건 또는 화학적으로 정의된 조건으로부터 생성되거나, 수백 개의 시료에 걸쳐 확장할 수 있는 과정을 통하여 리프로그래밍될 수 있어야 한다. 혈액은 전세계의 환자로부터 통상적으로 추출한 매우 다루기 쉬운 조직 공급원이며, 동원된 혈액 공여자 및 동원되지 않은 혈액 공여자로부터의 세포는 바이러스 벡터를 통합시킴으로써 성공적으로 리프로그래밍되었다(문헌[Loh et al., 2009; Ye et al., 2009](PloS, 인쇄 예정). 특히, CD34 발현에 대하여 농축된 세포는 섬유아세포보다 더 효율적으로 리프로그래밍되는 것으로 나타났다.
그러나, CD34+ 세포를 리프로그래밍시키는 현행의 방법은 임상 응용에 필요한 엄격한, 이종성분이 없는 기준을 만족시키지 못한다. 먼저, CD34+ 세포는 오직 적은 분율(0.1%)의 비-동원 말초 혈액만을 구성한다(혈액 ㎖당 오직 1000개의 세포). 두번째로, 조사자는 염색체 DNA 내로의 통합을 필요로 하는 바이러스-기반의 방법에 의존한다. 세번째로, 공개된 방법은 MEF 및 조정된 배지를 포함하며, 이에 따라, 불량하게 정의되며, 이종 오염줄질을 함유한다.
본 발명은 부분적으로 말초 혈액으로부터 iPS 세포를 생성하기 위한 완전히 정의된 과정의 발견을 기반으로 한다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 10ml 미만의 혈액으로부터 CD34 발현 세포의 집단을 증식하고, 통합이 없는, 결국 염색체외 DNA의 피더가 없는 조건 하에서 iPS 세포를 생성하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 실시형태 및 이점은 후술된다.
II . 정의
"리프로그래밍"은 세포가 리프로그래밍만 없는 동일한 조건하에서 갖고 있는 것에 비하여 세포가 배양물에서 또는 생체내에서 적어도 하나의 새로운 세포 유형의 자손을 형성하는 능력을 측정가능하게 증가된 정도로 제공하는 과정이다. 보다 구체적으로, 리프로그래밍은 체세포에 만능성을 부여하는 과정이다. 이것은 새로운 세포 유형의 표현형 특징을 갖는 자손이, 비록 리프로그래밍 이전에는 본질적으로 그러한 자손이 형성될 수 없지만, 충분한 증식 후 측정가능한 비율로 형성할 수 있음을 의미하고; 다시 말해서, 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 비율은 리프로그래밍 이전보다 측정가능할 정도로 더 높다. 특정 조건 하에서 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 자손의 비율은 적어도 약 1%, 5%, 25% 또는 그 이상일 수 있으며, 비율이 높을수록 바람직하다.
배지, 세포외 기질 또는 배양 조건에 관하여 사용되는 용어 "이종성분이 없는(XF)" 또는 "동물 성분이 없는(ACF)" 또는 "동물성분이 없는"은 본질적으로 이종 동물-유래의 성분이 없는 배지, 세포외 기질 또는 배양 조건을 말한다. 인간 세포의 배양에 있어서, 비-인간 동물, 예컨대 마우스의 임의의 단백질은 이종 성분일 것이다. 특정 태양에서, 이종성분이 없는 기질은 본질적으로 임의의 비-인간 동물-유래의 성분이 없을 수 있으며, 이에 따라, 마우스 피더 세포 또는 매트리겔(상표명)을 배제한다. 매트리겔(상표명)은 엔젤브레스-홀름-스웜(Engelbreth-Holm-Swarm, EHS) 마우스 육종, 라미닌(주성분)을 포함하는 세포외 기질 단백질이 풍부한 종양, IV형 콜라겐, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 엔탁틴/니도겐으로부터 추출한 용해화된 기저막 제제이다.
배지, 세포외 기질 또는 배양 조건에 관하여 사용되는 용어 "정의된"은 거의 모든 성분의 성질 및 양이 알려져 있는 배지, 세포외 기질 또는 배양 조건을 말한다.
"화학적으로 정의된 배지"는 거의 모든 성분의 화학적 성질 및 그들의 양이 알려져 있는 배지를 말한다. 이들 배지는 또한 합성 배지로 지칭된다. 화학적으로 정의된 배지의 예는 TeSR(상표명)을 포함한다.
세포는 이들이 10% 미만의 요소(들)를 갖는 경우 본 명세서에서 사용되는 외인성 유전 요소 또는 벡터 요소가 "실질적으로 없으며", 이들이 1% 미만의 요소(들)를 갖는 경우 외인성 유전 요소 또는 벡터 요소가 "본질적으로 없다". 그러나, 전체 세포 집단의 0.5% 미만 또는 0.1% 미만이 외인성 유전 요소 또는 벡터 요소를 포함하는 세포 집단이 더더욱 바람직하다.
배양물, 기질 또는 배지는 배양물, 기질 또는 배지가 각각 당업자에게 알려져 있는 통상적인 검출 방법을 사용하여 검출가능한 수준보다 더 낮은 수준의 이들 시약을 갖거나, 이들 작용제(agent)가 배양물, 기질 또는 배지에 외적으로 첨가된 적이 없는 경우에 특정 시약, 예컨대 신호전달 억제제, 동물 성분 또는 피더 세포가 "본질적으로 없다".
"말초 혈액 세포"는 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 포함하는 혈액의 세포 성분을 말하며, 이는 순환하는 혈액의 푸울에서 관찰된다.
"조혈 전구 세포"는 조혈 계통에 수임되지만 추가로 조혈 분화를 할 수 있는 세포를 나타내고, 조혈모 세포, 다능성 조혈모 세포(혈구모세포), 골수계 전구세포, 거핵세포 전구세포, 적혈구 전구세포 및 림프계 전구세포를 포함한다. 조혈모 세포(HSC)는 골수계 계통(단핵구 및 대식구, 호중구, 호염구, 호산구, 적혈구, 거핵세포/혈소판, 수지상 세포) 및 림프계 계통(T-세포, B-세포, NK-세포)을 포함한 모든 혈액 세포 유형으로 이어지는 다능성 줄기 세포이다. 조혈 전구 세포는 CD34를 발현하거나 발현하지 않을 수 있다. 조혈 전구 세포는 CD133을 동시 발현할 수 있으며 CD38 발현에 대해 음성일 수 있다. 특정 실시형태에서, 특정 인간 조혈 전구 세포는 CD34를 발현하지 않지만 그럼에도 불구하고 본 명세서에 기술된 방법을 통해 iPS 세포로 전이될 수 있다. 조혈 전구 세포는 CD34+/CD45+ 조혈 전구 세포 및 CD34+/CD43+/CD45+ 조혈 전구 세포를 포함한다. CD34+/CD43+/CD45+ 조혈 전구 세포는 골수계 전구 세포에 대해 고도로 농축될 수 있다. CD34+/CD43+/CD45+ 조혈 전구 세포와 같은 조혈 전구 세포의 다양한 계통이 본 명세서에 기술된 방법을 통해 iPS 세포로 전이될 수 있다. 조혈 전구 세포는 또한 하기를 포함하는 원시 조혈 세포의여러 가지 하위집단을 포함한다: CD34-/CD133+/CD38-(원시 조혈 전구 세포), CD43(+)CD235a(+)CD41a(±)(적혈구-거핵세포형성), lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(-)(다능성) 및 lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(+)(골수계-편중) 세포, CD133+/ALDH+(알데하이드데하이드로게나제)(예를 들어, 문헌[Hess et al., 2004; Christ et al., 2007]). 이들 원시 조혈 세포 유형 또는 조혈 전구 세포의 어떠한 것도 본 명세서에 기술된 바와 같이 iPS 세포로 전이될 수 있을 것으로 예상된다.
"벡터" 또는 "작제물"(때때로 유전자 전달 또는 유전자 전달 "비히클"로도 언급됨)은 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포에 전달될 폴리뉴클레오티드를 포함한 거대분자 또는 분자들의 복합체를 지칭한다. 벡터는 선형 또는 원형 분자일 수 있다.
벡터의 흔한 유형인 "플라스미드"는 염색체 DNA와 분리되어 있고 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는 염색체외 DNA 분자이다. 특정한 경우로서 플라스미드는 원형이고 이중 가닥이다.
"발현 작제물" 또는 "발현 카세트"는 전사를 유도할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현 작제물은 적어도 프로모터 또는 이와 기능적으로 동등한 구조를 포함한다. 추가로, 인핸서 및/또는 전사 종결 신호와 같은 요소도 또한 포함될 수 있다.
용어 "외인성"는 세포 또는 유기체 내의 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드와 연관되어 사용될 경우 인위적 수단에 의해 세포 또는 유기체내로 도입된 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 가리키며, 세포와 관련하여 사용된 경우엔 분리되고 이어서 인위적 수단에 의해 다른 세포로 또는 유기체로 도입된 세포를 지칭한다. 외인성 핵산은 상이한 유기체 또는 세포로부터 유래한 것일 수 있거나 그 유기체 또는 세포에 자연적으로 발생하는 핵산의 하나 이상의 추가적인 카피일 수 있다. 외인성 세포는 상이한 유기체로부터 유래된 것일 수 있거나 동일한 유기체로부터 유래된 것일 수 있다. 비제한적인 실시예에서, 외인성 핵산은 천연 세포의 것과 상이한 염색체상의 위치에 존재하거나 자연에서 발견되는 것과 상이한 핵산 서열에 인접되어 있다.
본 명세서에서 용어 "에 상응하는"은 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부와 상동성(즉, 동일하고, 엄밀하게 진화적으로 관련이 없음)이거나 폴리펩티드 서열이 참조 폴리펩티드 서열과 동일함을 의미하기 위해 사용된다. 대비하여, 본 명세서에서 용어 "에 상보적인"은 상보적인 서열이 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부와 상동성임을 의미하기 위해 사용된다. 구체적으로 설명하면, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 참조 서열 "TATAC"에 상응하며 참조 서열 "GTATA"에 상보적이다.
특정 단백질을 "암호화하는" "유전자", "폴리뉴클레오티드", "암호화 영역", "서열", "세그먼트", "단편" 또는 "트랜스유전자(transgene)"는 적절한 조절 서열의 제어 하에 배치되는 경우 시험관내 또는 생체내에서 전사되고, 또한 임의로 유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩티드로 번역되는 핵산 분자이다. 암호화 영역은 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 형태 중 어느 하나로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재할 경우, 핵산 분자는 단일 가닥(즉, 센스 가닥) 또는 이중 가닥일 수 있다. 암호화 영역의 경계는 5'(아미노) 말단의 개시 코돈과 3'(카르복시) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 유전자는 이로써 한정되는 것은 아니지만 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 원핵 또는 진핵 DNA로부터의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 전사 종결 서열은 보통 유전자 서열의 3'에 위치할 것이다.
본 명세서에서 용어 "세포"는 해당 분야에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 다세포 유기체의 조직의 구조 단위이고 자신을 외부로부터 격리해 주는 막 구조에 의해 둘러싸여 있으며 자가 복제능을 갖고 있고 유전 정보와 이를 발현하는 메커니즘을 보유하고 있는 생명체를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 세포는 천연 세포이거나 인위적으로 변형된 세포(예를 들어, 융합 세포, 유전적으로 변형된 세포 등)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "줄기 세포"는 자가 복제할 수 있으며 만능성을 갖는 세포를 말한다. 전형적으로, 줄기 세포는 손상된 조직을 재생할 수 있다. 본 명세서에서 줄기 세포는 이들로 한정하는 것은 아니지만 배아 줄기(ES) 세포 또는 조직 줄기 세포(또한 조직-특이적 줄기 세포 또는 체세포 줄기 세포라고도 한다)일 수 있다. 상기된 능력을 가질 수 있는 어떠한 인위적으로 생성된 세포(예를 들어, 융합 세포, 리프로그래밍된 세포, 본 명세서에 사용된 것 등)도 줄기 세포일 수 있다.
"배아 줄기(ES) 세포"는 초기 배아로부터 유래된 만능 줄기 세포이다. ES 세포는 1981년에 최초로 확립되었고 1989년 이후로 녹아웃(knockout) 마우스의 생산에 적용되어 왔다. 1998년에 인간 ES 세포가 확립되었으며 현재 재생 의학에 이용되고 있다.
ES 세포와 다르게, 조직 줄기 세포는 한정된 분화능을 갖는다. 조직 줄기 세포는 조직의 특정 부위에 존재하며 미분화된 세포내 구조를 갖는다. 따라서, 조직 줄기 세포의 만능성은 전형적으로 낮다. 조직 줄기 세포는 더 큰 핵/세포질 비율을 가지며 세포 내 세포소기관을 거의 갖지 않는다. 대부분의 조직 줄기 세포는 낮은 만능성, 긴 세포 주기 및 개인의 평생에 걸친 증식능을 갖는다. 조직 줄기 세포는 세포가 유래되는 부위, 예를 들어, 피부 계통, 소화기 계통, 골수 계통, 신경 계통 등을 기초로 하여 범주로 분류된다. 피부 계통의 조직 줄기 세포는 상피 줄기 세포, 모낭 줄기 세포 등을 포함한다. 소화기 계통의 조직 줄기 세포는 췌장(보통) 줄기 세포, 간 줄기 세포 등을 포함한다. 골수 계통의 조직 줄기 세포는 조혈모 세포, 간엽 줄기 세포 등을 포함한다. 신경 계통의 조직 줄기 세포는 신경 줄기 세포, 망막 줄기 세포 등을 포함한다.
"유도된 만능 줄기 세포"는 흔히 iPS 세포 또는 iPSC로 약칭되며, 리프로그래밍 인자로 지칭되는 특정 인자를 도입함으로써 비만능 세포, 전형적으로 성체 체세포 또는 최종 분화 세포, 예를 들어, 섬유아세포, 조혈세포, 근세포, 신경세포, 진피세포 등으로부터 인위적으로 제조된 만능 줄기 세포의 한 유형을 지칭한다.
"만능성"은 하나 이상의 조직 또는 기관 또는 특히 세 가지 배엽층, 즉 내배엽(위내벽, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기) 또는 외배엽(진피 조직 및 신경계) 중 임의의 것을 구성하는 모든 세포로 분화하는 잠재성을 갖는 줄기 세포를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "만능 줄기 세포"는 세 가지 배엽층 중 임의의 것으로부터 유래된 세포로 분화할 수 있는 세포, 예를 들어, 전능 세포의 직접적인 자손 또는 유도된 만능 세포를 지칭한다.
핵산 분자와 관련하여 "작동가능하게 연결된"은 둘 이상의 핵산 분자(예를 들어, 전사될 핵산 분자, 프로모터 및 인핸서 요소)가 핵산 분자의 전사를 허용하는 방식으로 연결되어 있음을 의미한다. 펩티드 및/또는 폴리펩티드 분자와 관련하여 "작동가능하게 연결된"은 둘 이상의 펩티드 및/또는 폴리펩티드 분자가 융합된 각각의 펩티드 및/또는 폴리펩티드의 적어도 하나의 특성을 갖는 단일 폴리펩티드 쇄, 즉 융합 폴리펩티드를 생성하도록 하는 방식으로 연결되어 있음을 의미한다. 융합 폴리펩티드는 특히 키메라이며, 다시 말해서 이종 분자로 구성된다.
III . 혈액 세포의 리프로그래밍
현재의 기술에서 통상적으로 사용되는 피부 섬유아세포에 더하여 대안적인 공급원으로부터 iPS 세포를 제공하기 위하여, 말초 혈액 세포를 포함하는 세포 집단의 리프로그래밍 방법이 제공될 수 있다. 또한, 용이하게 입수할 수 있으며, 환경의 돌연변이원에 덜 노출된 혈액 세포를 리프로그래밍하는 것이 매우 바람직하다. 예를 들어, 혈액 은행에서 수집하고 보관한 말초 혈액 세포는 자가유래 또는 동종이계이나 조직적합성이 있는 iPS 세포주 중 어느 하나의 공급원으로 사용될 수 있다. 더욱 결정적으로, 혈액 세포의 리프로그래밍 능력은 그들의 발병과정을 조사하기 위하여 후천성 혈액 장애에서만 관찰되고 혈액 세포에 제한된 체세포 돌연변이를 함유하는 iPS 세포를 생성하고자 한다면 필수적이다. 특정 실시형태에서, 말초 혈액 세포 집단에서의 조혈 전구 세포를 증식시켜, 리프로그래밍에 유의미한 수의 출발 세포를 제공한다. 따라서, 본 발명의 인간 혈액 세포로부터의 리프로그래밍은 배양에서 조작 시간을 거의 필요로 하지 않는 공여자 세포로부터의 iPS 세포의 신규한 확립 방법을 나타낸다. 인간 혈액으로부터의 세포의 리프로그래밍 능력은 환자-특이적 줄기 세포를 생성하기 위한 신뢰성 있는 방법의 개발을 용이하게 할 것이다.
A. 조혈 전구 세포
조혈모 세포 및 조혈 전구 세포의 중대한 의학적 잠재성으로 인해, 배아 줄기 세포로부터 조혈 전구 세포를 분화하기 위한 방법을 개선하려는 실질적인 연구가 진행되어 왔다. 성인의 경우, 골수에 주로 존재하는 조혈모 세포는 혈액 계통의 모든 세포로 분화하고 활발하게 분열하는 조혈(CD34+) 전구 세포의 이종 집단을 생성한다. CD34+ 내피 세포가 iPS 세포로 전이될 수 있을 것으로 예상되는 한편, 특정 실시형태에서 내피 세포가 아닌 조혈 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있고; 예를 들어, 일부 경우에서 CD31 또는 VE-카드헤린을 발현하지 않는 조혈 전구 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, CD43 및/또는 CD45 마커와 같은 다른 마커들이 조혈 전구 세포를 동정하는 것을 돕기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kadaja-Saarepuu et al., 2008; Vodyanik et al., 2006]). 조혈 전구 세포는 CD43(+)CD235a(+)CD41a(±)(적혈구-거핵세포 형성), lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(-)(다능성) 및 lin(-)CD34(+)CD43(+)CD45(+)(골수계-편중) 세포를 포함한 원시 조혈 세포의 다양한 하위집단을 포함한다. 성인의 경우, 조혈 전구 세포는 매일 증식하고 분화하여 수천억의 성숙 혈액 세포를 생성한다. 또한, 조혈 전구 세포는 제대혈에 존재한다. 시험관내에서, 인간 배아 줄기 세포는 조혈 전구 세포로 분화할 수 있다. 또한, 조혈 전구 세포는 후술되는 말초 혈액 시료로부터 증식 또는 농축될 수 있다. 조혈 세포는 기원이 인간, 뮤린(murine) 또는 임의의 다른 포유류 종일 수 있다.
조혈 전구 세포의 분리는 세포 분류기, 항체-코팅된 자성 비드를 사용하는 자성 분리, 패킹된 컬럼; 친화성 크로마토그래피; 보체 및 세포독소를 포함하나 이에 한정되지 않는 모노클로널 항체와 결합되거나, 모노클로널 항체와 병용되는 세포독성제; 및 고체 기재, 예컨대 플레이트에 부착된 항체를 사용한 "패닝(panning)" 또는 임의의 다른 통상의 기법을 포함하는 임의의 선택 방법을 포함한다.
분리 또는 단리 기법의 사용은 물리적 차이(밀도 기울기 원심분리 및 역류 원심분리 일루트리에이션(counter-flow centrifugal elutriation)), 세포 표면의 차이(렉틴 및 항체 친화성) 및 필수 염색 특성의 차이(미토콘드리아-결합 염료 rhol23 및 DNA-결합 염료 Hoechst 33342)를 기반으로 하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 정확한 분리를 제공하는 기법은 FACS(형광-활성화 세포 분류) 또는 MACS(자성-활성화 세포 분류)를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이는 다양한 정밀도(degrees of sophistication), 예를 들어, 복수의 컬러 채널, 저-각도의 둔각 광 분산 검출 채널, 임피던스 채널 등을 가질 수 있다.
상기 기법 또는 세포 유형 순도를 평가하기 위해 사용된 기법(예컨대, 유세포분석)에 사용되는 항체는 효소, 자성 비드, 콜로이드성 자성 비드, 합텐, 형광색소, 금속 화합물, 방사성 화합물, 약물 또는 합텐을 포함하나 이에 한정되지 않는 식별가능한 제제에 컨쥬게이트될 수 있다. 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 효소는 알칼리성 포스파타제, 과산화효소, 우레아제 및 β-갈락토시다제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 형광색소는 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민 아이소티오시아네이트, 피코에리트린, 알로피코시아닌 및 텍사스 레드(Texas Red)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 추가의 형광색소를 위하여, 문헌[Haugland, Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992-1994)]을 참조한다. 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 금속 화합물은 페리틴, 콜로이드성 금 및 특히, 콜로이드성 초상자성 비드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 합텐은 비오틴, 디곡시게닌, 옥사잘론 및 나이트로페놀을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체에 컨쥬게이트되거나 혼입될 수 있는 방사능 화합물은 해당 분야에 잘 알려져 있으며, 테크네튬 99m(99TC), 125I, 및 14C, 3H 및 35S를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 방사성핵종을 포함하는 아미노산을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
정확한 분리를 가능하게 하는 양성 선택을 위한 다른 기법, 예컨대 친화성 컬럼 등이 사용될 수 있다. 상기 방법은 제거에 의해 잔류량이 비-표적 세포 집단의 약 20% 미만, 바람직하게는 약 5% 미만이 되게 해야 한다.
세포는 광산란 특성뿐 아니라 그들의 다양한 세포 표면 항원의 발현에 기초하여 선택될 수 있다. 정제된 줄기 세포는 FACS 분석에 의해 낮은 측방산란을 가지며, 저 내지 중등의 전방 산란 프로파일을 갖는다. 사이토스핀(cytospin) 제제는 농축된 줄기 세포가 성숙 림프구 및 성숙 과립구 사이의 소정의 크기를 갖는 것을 보여준다.
또한, 예를 들어, 문헌[Sutherland et al. (1992)]의 방법 및 미국 특허 제4,714,680호에 기재된 방법을 사용하여, 배양 전에 CD34+ 세포에 대하여 접종 집단을 농축하는 것이 가능하다. 예를 들어, 세포는 계통 특이적 마커를 발현하는 세포를 제거하기 위한 음성 선택으로 처리한다. 예시적인 실시형태에서, 세포 집단은 비-CD34+ 조혈 세포 및/또는 특정 조혈 세포 하위집단의 제거를 위한 음성 선택으로 처리할 수 있다. 음성 선택은 T 세포 마커, 예컨대 CD2, CD4 및 CD8; B 세포 마커, 예컨대 CD10, CD19 및 CD20; 단핵구 마커 CD14; NK 세포 마커 CD2, CD16 및 CD56 또는 임의의 계통 특이적 마커를 포함하는 다양한 분자의 세포 표면 발현에 기초하여 수행될 수 있다. 음성 선택은 다양한 분자, 예컨대 항체의 칵테일(cocktail)(예컨대, CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123 및 CD235a)의 세포 표면 발현에 기초하여 수행될 수 있으며, 이는 예를 들어, MACS 또는 컬럼 분리를 통하여 다른 세포 유형의 분리를 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 계통-음성(LIN-)은 계통 수임된 세포와 관련된 적어도 하나의 마커, 예컨대 T 세포(예컨대, CD2, 3, 4 및 8), B 세포(예컨대, CD10, 19 및 20), 골수성 세포(예컨대, CD14, 15, 16 및 33), 자연 살해("NK") 세포(예컨대, CD2, 16 및 56), RBC(예컨대, 글리코포린 A), 거핵세포(CD41), 비만 세포, 호산구 또는 호염기구와 관련된 마커, 또는 다른 마커, 예컨대 CD38, CD71 및 HLA-DR이 결여된 세포를 말한다. 바람직하게는 계통 특이적 마커는 CD2, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD33, CD38, HLA-DR 및 CD71 중 적어도 하나를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 더욱 바람직하게는 LIN-는 적어도 CD14 및 CD15를 포함할 것이다. 추가의 정제는 예를 들어 c-kit+ 또는 Thy-1+에 대한 양성 선택에 의하여 달성될 수 있다. 추가의 농축은 당업계에 공지되어 있는 방법에 의하여, 미토콘드리아 결합 염료 로다민 123의 사용 및 로다민+ 세포에 대한 선택에 의해 수득될 수 있다. 고도로 농축된 조성물은 CD34+, 바람직하게는 CD34+LIN-, 가장 바람직하게는 CD34+Thy-1+LIN-인 세포의 선택적 분리에 의해 수득될 수 있다. 줄기 세포에서 고도로 농축된 집단 및 이들을 수득하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, PCT/US94/09760호; PCT/US94/08574호 및 PCT/US94/10501호에 기재된 방법을 참고한다.
지정된 계통의 세포를 조기에 제거함으로써 세포를 분리하는 다양한 기법이 사용될 수 있다. 모노클로널 항체는 특정 세포 계통 및/또는 분화 단계와 관련된 마커를 식별하는데 특히 유용하다. 항체는 고체 지지체에 부착되어, 미정제 분리를 가능하게 할 수 있다. 사용된 분리 기법은 수집될 분획의 생존력의 보유를 최대화시켜야 한다. 다양한 상이한 효능의 기법을 사용하여, "상대적으로 미정제인" 분리를 수득할 수 있다. 이러한 분리에서, 존재하는 전체 세포의 최대 10%, 보통 약 5% 이하, 바람직하게는 약 1% 이하가 보유될 세포 집단과 함께 남아있는 원치않는 세포이다. 사용되는 특정 기법은 분리의 효율, 관련된 세포독성, 운영의 용이성 및 속도 및 정교한 장비 및/또는 전문적 기술에 대한 필요에 좌우될 것이다.
조혈 전구 세포의 선택은 단독으로 세포에 특이적인 마커를 사용하여 달성할 필요는 없다. 음성 선택과 양성 선택의 조합을 사용함으로써, 농축된 세포 집단이 수득될 수 있다.
B. 혈액 세포의 공급원
조혈모 세포(HSC)는 정상적으로 골수에 내재하지만, 혈액으로 강제 이송될 수 있는데, 이 과정을 동원이라고 하며 말초 혈액에서 다수의 HSC를 채취하기 위해 임상적으로 사용된다. 한 가지 선택할 수 있는 동원제는 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF)이다.
말초 혈액에서 순환하는 CD34+ 조혈모 세포 또는 조혈 전구 세포는 무동요 상태에서 또는 G-CSF와 같은 조혈 성장 인자의 외부 투여에 따른 동원 후 성분채집(leukopheresis) 기법에 의해 수집될 수 있다. 동원 후에 수집된 줄기 세포 또는 전구 세포의 수는 무동요 상태에서 성분채집 후에 수득된 것보다 더 많다. 본 발명의 특정 관점에서, 세포 집단의 공급원은 조혈모 세포 또는 전구 세포를 생체내에서 농축할 필요가 없기 때문에 외적으로 적용된 인자에 의해 세포가 동원되지 않은 대상체이다.
본 명세서에 기술된 방법에 사용하기 위한 세포 집단은 인간 세포, 비-인간 영장류 세포, 설치류 세포(예를 들어, 마우스 또는 랫트), 소 세포, 양 세포, 돼지 세포, 말 세포, 양 세포, 개 세포 및 고양이 세포와 같은 포유류 세포 또는 그들의 혼합물일 수 있다. 비-인간 영장류 세포는 레서스(rhesus) 원숭이 세포를 포함한다. 세포는 동물, 예를 들어, 인간 환자로부터 수득되거나 세포주로부터 수득될 수 있다. 세포가 동물로부터 수득되는 경우, 이들 세포는 예를 들면 비분리된 세포(즉, 혼합된 집단)로 사용될 수 있고; 이들 세포는 예를 들면 형질전환에 의해 일차로 배양에서 확립될 수 있거나; 예비 정제 방법에 적용될 수 있다. 예를 들면, 세포 집단은 세포 표면 마커의 발현을 기초로 하여 양성 또는 음성 선택에 의해 처리되거나; 시험관내 또는 생체내에서 하나 이상의 항원으로 자극받거나; 시험관내 또는 생체내에서 하나 이상의 생물학적 조절제로 처리되거나; 이들의 조합에 의해 처리될 수 있다.
세포 집단은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 혼합된 집단을 함유한 전혈 또는 그의 분획, 비장 세포, 골수 세포, 종양 침윤성 림프구, 백혈구성분채집에 의해 수득된 세포, 생검 조직, 림프절, 예를 들어, 종양으로부터 유출한 림프절을 포함한다. 적합한 공여자는 면역화된 공여자, 비면역화된(미경험) 공여자, 처리된 또는 미처리된 공여자를 포함한다. "처리된" 공여자는 하나 이상의 생물학적 조절제에 노출된 공여자이다. "미처리된" 공여자는 하나 이상의 생물학적 조절제에 노출된 적이 없다.
예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 해당 분야에 알려진 방법에 따라 기술된 바와 같이 수득할 수 있다. 이러한 방법의 예는 문헌[Kim et al.(1992); Biswas et al.(1990); Biswas et al.(1991)]에 의해 논의된다.
세포 집단으로부터 조혈 전구 세포를 수득하는 방법도 해당 분야에 잘 알려져 있다. 조혈 전구 세포는 hSCF, hFLT3 및/또는 IL-3과 같은 여러 가지 사이토카인을 사용하여 증식할 수 있거나(문헌[Akkina et al., 1996]), CD34+ 세포는 MACS 또는 FACS를 사용하여 농축할 수 있다. 상기된 바와 같이 음성 선택 기술을 사용하여 CD34+ 세포를 농축할 수도 있다.
또한, 대상체로부터 세포 시료를 수득한 다음 시료를 목적하는 세포 유형에 대해 농축하는 것이 가능하다. 예를 들면, PBMC 및/또는 CD34+ 조혈 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같이 혈액으로부터 분리할 수 있다. 또한, 목적하는 세포 유형의 세포 표면상의 에피토프와 결합하는 항체를 사용한 분리 및/또는 활성화와 같은 다양한 기술을 사용하여 세포를 다른 세포로부터 분리할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 세포 표면 마커에 대한 항체를 사용하여 수용체 진입에 의한 세포의 활성화 없이 특이적 세포 유형을 선택적으로 농축하는 음성 선택을 포함한다.
골수 세포는 장골능, 대퇴골, 경골, 척추, 늑골 또는 기타 골수 공간으로부터 수득할 수 있다. 골수는 환자로부터 채취하여 여러 분리 및 세척 절차를 통해 분리할 수 있다. 골수 세포를 분리하는 예시적인 방법은 다음의 단계를 포함한다: a) 3개 분획으로 골수 현탁액의 원심분리 및 중간 분획 또는 버피코트(buffycoat)의 수집; b) 단계 a)로부터의 버피코트 분획의 분리액, 흔히 피콜(파머시아 파인 케미칼즈 AB(Pharmacia Fine Chemicals AB)의 상표)에서의 1회 이상 원심분리 및 골수 세포를 함유한 중간 분획의 수집; c) 재수혈가능한 골수 세포의 회수를 위한 단계 b)로부터 수집된 분획의 세척.
IV . 배양 조건
인간 만능 줄기 세포 연구는 현대 생물학에서 가장 역동적인 분야 중 하나이다. 인간 ES 세포와 같은 인간 iPS 세포는 대부분 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 피더 층 하에서 유래되고 배양되어 왔다. 예를 들어, 인간 만능 줄기 세포의 치료능은 단일 세포 유형의 소실 또는 무-기능으로부터 야기되는 파킨슨병 및 당뇨병과 같은 장애를 위한 분화된 세포 유형의 이식에 존재한다. 그러나, 이들 임상적 응용은 현재 시험관내 유래 및 증식 단계 동안의 이종-오염물질에 의해 제한된다. 통상적으로 사용되는 바와 같은 마우스 피더 또는 조절된 배지는 장래에 이식을 배제할 것인 비-인간 병원체를 도입하는 위험을 갖는다. 따라서, 연구 모델과 임상적 응용 간의 차이를 메우는 것은 이종성분이 없는 과정의 설계 및 이행을 필요로 한다. 따라서, 이종성분이 없는(XF; 또는 동물 성분이 없는, ACF; 또는 동물성분이 없는) 배양 조건, 예컨대 이종성분이 없는 배지 및 이종성분이 없는 세포외 기질은 인간 내의 이식이 필요한 재생 줄기 세포 치료법의 개발에 필수 요소이다. 또한, 리프로그래밍의 효율은 사용되는 MEF 피더 세포의 가변성 또는 임의의 동물-유래의 산물에 의해 영향을 받을 수 있다.
말초 혈액 내의 조혈 전구 세포로부터 전반적인 리프로그래밍 효율을 향상시키고, 가변성을 감소시키기 위하여, 다양한 피더가 없는, 이종성분이 없는 또는 정의된 배양 조건, 조혈 전구 세포의 증식을 위한 기질 또는 배지뿐 아니라 이러한 세포의 리프로그래밍이 제공될 수 있다.
A. 조혈 전구 세포 증식 조건
본 발명의 증식 방법은 세포 밀도가 배지 ℓ당 적어도 약 5,000개, 바람직하게는 7,000개 내지 약 200,000개 세포, 더욱 바람직하게는 배지 ℓ당 약 10,000개 내지 약 150,000개 세포가 되게 하는 적절한 배지의 부피 및 약 1 내지 20%, 바람직하게는 8% 미만의 조기 산소 농도에서 실질적으로 조혈 전구 세포가 풍부하고 실질적으로 기질 세포가 없는 세포의 집단을 증식 용기 내로 접종하는 것을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 조기 산소 농도는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7%, 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위 내에 있다.
일 태양에서, 세포의 집단을 접종하는 것은 성인 골수로부터 유래되며, 약 7,000개 세포/㎖ 내지 약 20,000개 세포/㎖, 바람직하게는 약 20,000개 세포/㎖이다. 별개의 태양에서, 세포의 접종 집단은 동원된 말초 혈액으로부터 유래되며, 약 20,000개 세포/㎖ 내지 약 50,000개 세포/㎖, 바람직하게는 50,000개 세포/㎖이다. 다른 태양에서, 세포의 접종 집단은 비-동원된 말초 혈액으로부터 유래되며, 약 7,000개 세포/㎖ 내지 약 50,000개 세포/㎖, 바람직하게는 약 20,000개 세포/㎖이다.
임의의 적절한 증식 용기, 플라스크 또는 적절한 튜브, 예컨대 24 웰 플레이트, 12.5㎠ T 플라스크 또는 기체 투과성 백이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 배양-용기는 팔콘(Falcon), 코닝(Corning) 또는 코스타(Costar)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "증식 용기"는 독립되어 있거나 증식 장치, 예컨대 본 명세서에 기재된 생물반응기 내로 도입되는지 아닌지 간에 세포를 증식시키기 위한 임의의 챔버 또는 용기를 포함하고자 한다. 일 실시형태에서, 증식 용기는 남아있는 세포 지지체 표면을 지향하는 면 및 함몰 표면에 의해 형성되는 챔버의 감소된 부피 공간이다.
다양한 배지가 조혈 전구 세포의 증식에 사용될 수 있다. 예시적인 배지에는 다양한 상이한 영양소, 성장 인자, 사이토카인 등이 보충될 수 있는 둘베코스(Dulbecco's) MEM, IMDM 및 RPMI-1640이 포함된다. 배지는 혈청이 없거나, 또는 적절한 양의 혈청, 예컨대 우태아 혈청 또는 자가 혈청이 보충될 수 있다. 바람직하게는, 인간 치료법에 사용되기 위하여, 배지는 혈청이 없거나, 또는 자가 혈청이 보충될 수 있다. 하나의 적절한 배지는 IMDM, 펩톤, 프로테아제 억제제 및 뇌하수체 추출물 중 적어도 하나의 유효량 및 인간 혈청 알부민 또는 혈장 단백질 분획, 헤파린, 환원제, 인슐린, 트랜스페린 및 에탄올아민 중 적어도 하나의 유효량을 함유하는 것이다. 추가의 실시형태에서, 적절한 증식 배지는 적어도 IMDM 및 1-15% 우태아혈청을 함유한다. 다른 적절한 배지 제제는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,728,581호를 참조한다.
임의의 주어진 조혈 전구 세포 증식에 사용되는 특정 배지와 상관없이, 사용되는 배지는 바람직하게는 약 0.1ng/㎖ 내지 약 500ng/㎖, 더욱 통상적으로 10ng/㎖ 내지 100ng/㎖의 농도의 적어도 하나의 사이토카인이 보충된다. 적절한 사이토카인에는 c-kit 리간드(KL)(스틸(steel) 인자(StI), 비만 세포 성장 인자(MGF) 및 줄기 세포 인자(SCF)로도 지칭됨), IL-6, G-CSF, IL-3, GM-CSF, IL-1α, IL-11, MIP-1α, LIF, c-mpl 리간드/TPO 및 flk2/flk3 리간드(Flt2L 또는 Flt3L)가 포함되나 이에 한정되지 않는다(문헌[Nicola et al., 1979; Golde et al., 1980; Lusis, 1981; Abboud et al., 1981; Okabe, 1982; Fauser et al., 1981]). 특히, 배양물은 SCF, Flt3L 및 TPO 중 적어도 하나를 포함할 것이다. 더욱 자세하게, 배양물은 SCF, Flt3L 및 TPO를 포함할 것이다.
일 실시형태에서, 사이토카인은 배지에 함유되며, 배지 관류에 의해 보충된다. 대안적으로, 생물반응기 시스템을 사용하는 경우, 사이토카인은 별개의 주입 포트를 통해 농축액으로서 배지 관류 없이 따로 첨가될 수 있다. 사이토카인이 관류 없이 첨가되는 경우, 이들은 전형적으로 생물반응기 내의 부피의 1/10 내지 1/100과 동일한 양의 1O× 내지 100× 용액으로 첨가될 것이며, 새로운 사이토카인은 대략 매 2 내지 4일마다 첨가될 것이다. 또한, 추가로, 새로운 농축된 사이토카인은 관류된 배지 내의 사이토카인에 더하여 따로 첨가될 수 있다.
그 다음, 세포에 배지를 조절하도록 적절한 조건 하에서 세포를 배양할 수 있다. 정제된 조혈 전구 세포의 증식 개선은 배양 배지가 변경되지 않는 경우에, 예컨대 처음 배양 수일 후까지 관류를 시작하지 않는 경우에 달성될 수 있다.
특정 태양에서, 적절한 조건은 33 내지 39, 바람직하게는 약 37℃에서, (초기 산소 농도는 바람직하게는 4 내지 8%, 가장 바람직하게는 약 5%) 적어도 6일 동안, 바람직하게는 약 7일 내지 약 10일 동안 배양하여, 조혈 전구 세포 증식을 실질적으로 억제하기 위한 충분한 노폐물의 분비 없이 세포로부터의 자기분비 인자의 분비를 가능하게 하는 것을 포함한다. 상기의 시간 후에, 총 10일 내지 28일 동안일 수 있는 나머지 배양 기간에 걸쳐 단계적으로 또는 점차, 산소 농도를 약 20% 증가시킬 수 있다. 골수 줄기 세포, 동원 말초 혈액 세포 또는 비-동원 말초 혈액 세포는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25일 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위 동안 성장시킬 수 있다.
배지 교환이 없는 초기 배양 기간 후에, 배양 배지를 조혈 전구 세포의 증식을 가능하게 하는 비로 교환할 수 있다. 비가변적인 부피가 사용되는 시스템에서, 배지는 7일(동원 말초 혈액 줄기 세포에 대하여) 또는 10일(골수 세포에 대하여)에 교환할 수 있다. 관류 시스템에서의 새로운 배지의 교환은 예를 들어, 층류일 수 있다. 이러한 균일한, 난류가 아닌 유동은 세포의 패치가 배지에 노출되지 않는 "정체 공간"의 형성을 방지한다. 배지는 약 0.10/일 내지 0.50/일 또는 1/10 내지 ½ 부피 교환/일의 비로 교환할 수 있다. 예를 들어, 관류비는 약 0.25/일 내지 0.40/일일 수 있다. 가장 바람직하게는, 골수 줄기 세포에 대하여, 관류는 약 14일에 시작하여 0.27/일의 비일 수 있으며, 동원 또는 비동원 말초 혈액 세포에 대하여, 관류는 대략 10일에 0.25/일에 시작하고, 대략 12일에 0.40/일로 증가한다.
특히, 세포 농도는 증식 내내 최적으로 유지할 수 있다. 예를 들어, 전구 세포는 오직 약 10 내지 20배만 증식하는 단핵 세포(MNC) 집단에 비하여 최대 약 1500배로 증식될 수 있다. 전구 세포는 예를 들어, 시스템이 전체 세포 증식을 위한 충분한 부피를 제공해야 하는 폐쇄된 시스템에서 배양이 수행되는 경우 증식 능력이 크다. 그러나, 전구 세포는 또한 상대적으로 높은 접종 밀도를 가질 수 있다. 최적의 접종 밀도 및 증식 조건은 세포를 미국 특허 제5,728,581호에 기재된 것과 같은 생물반응기에서 성장시킴으로써 달성될 수 있다. 세포를 함몰부에 적절한 세포 밀도로 씨딩할 수 있으며, 적절한 세포 밀도가 달성되는 경우 추가의 배지를 첨가한다. 장치의 형상은 세포로의 산소 전달 효율을 실질적으로 감소시키지 않고 배지 부피를 최대 3배 증가시킬 수 있다.
B. 리프로그래밍 동안 및 그 후의 배양 조건
출발 세포(리프로그래밍될 증식된 조혈 전구 세포를 의미) 및 마지막에는 리프로그래밍된 세포는 일반적으로 배양 배지 및 조건에 대한 상이한 요구를 갖는다. 세포의 리프로그래밍이 발생되게 하면서 이를 가능하게 하기 위하여, 하나 이상의 과도적인 배양 조건이 필요할 수 있다. 리프로그래밍 과정을 개시하기 위하여, 증식된 조혈 전구 세포를 씨딩 후 적어도, 약 또는 최대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9일에, 더욱 자세하게는 씨딩 후 3, 4, 5 또는 6일에, 예시적인 실시형태에서는 씨딩 후 6일에 트랜스펙션시킬 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 증식 단계는 항상 필요하지 않을 수 있다. 예를 들어, 충분한 조혈 전구 세포가 비-동원 말초 혈액으로부터의 정제로부터 직접 수득된다면, 리프로그래밍은 증식 단계 없이 개시될 수 있다. 그러나, 작은 부피, 예컨대 최대 10㎖ 부피의 말초 혈액으로 처리되는 경우, 증식 단계를 사용하여 조혈 전구 세포의 수를 증가시켜, 리프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있다.
트랜스펙션 직후에, 그리고 트랜스펙션 후 세포를 안정화시키는 수단으로서, 세포를 상술된 바와 같은 조혈 전구 세포 증식 배지 또는 하나 이상의 사이토카인 및 리프로그래밍된 세포의 배양을 조력하는 신호전달 억제제를 포함하는 배지 또는 2가지 유형의 조건(동일하거나 다르게)의 배합물에서 배양할 수 있으며, 이들 모두는 최적으로 이종성분이 없을 것이다. 사용되는 배지와 상관 없이, 조건은 임의의 기질 성분이 본질적으로 없을 수 있거나, 이는 바람직하게는 피브로넥틴 단편과 같은 이종성분이 없는 기질 단백질일 기질을 포함할 수 있다. 이러한 배양 조건은 적어도, 약 또는 최대, 트랜스펙션 후 처음 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24시간 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위의 기간일 수 있다. 그 다음, 세포가 이미 기질 위에 있지 않다면, 기질로 전이될 수 있으며, 상술된 바와 같은 조혈 전구 세포 증식 배지 또는 세포의 리프로그래밍을 조력하는 배지 또는 2가지 유형의 조건(동일하거나 다르게)의 배합물에서 배양하며, 이들 모두는 최적으로 이종성분이 없을 것이다. 사용되는 배지와 상관 없이, 세포는 1일 또는 2일에 걸쳐 점차 전달될 것이며, 각 배지는 100 퍼센트 리프로그래밍 배지로 회복될 것이며, 이러한 리프로그래밍 조건은 트랜스펙션 안정화 인큐베이션 후 적어도, 약 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15일의 기간 동안 지속될 수 있다.
리프로그래밍 인자를 개시된 방법을 사용하여 세포에 도입하고, 상술된 바와 같이 배양한 후에, 생성된 세포를 세포의 만능성을 유지하기에 충분한 배지, 예컨대 TeSR2에 전달할 수 있다. 이러한 조건은 바람직하게는 TeSR2(또는 유사한 만능 세포 배양 배지)를 배지 제거 없이 리프로그래밍 배지에 첨가하고 완전한 대체로 이어져, 세포가 100% 만능 세포 배양 배지에서 배양되게 함으로써, 리프로그래밍 조건의 후반부에 점차 수득할 수 있다. 점진적인 전이 기간을 포함하는 만능 세포 배양 배지에서의 세포의 배양은 100% 리프로그래밍 조건 후, 적어도, 약 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일의 기간 동안 계속될 수 있다. 이러한 만능 세포 배양 조건은 세포외 기질을 포함할 수 있는데, 이는 만능 줄기 세포가 부착 세포이기 때문이다.
통상적으로, MEF 피더 상의 혈청-함유 배지가 사용되어 왔다. 특정 태양에서, 본 발명은 혈청 또는 MEF 피더 세포에 대한 필요를 없애며, 세포의 리프로그래밍을 위한 정의된 과정 및 조건을 제공한다.
본 발명에서 생성되는 유도된 만능 줄기(iPS) 세포의 배양은 미국 특허 출원 제20070238170호 및 미국 특허 출원 제20030211603호에 기재된 바와 같이, 영장류 만능 줄기 세포, 더욱 구체적으로는 배아 줄기 세포를 배양하기 위하여 개발된 다양한 배지 및 기법을 사용할 수 있다. 인간 만능 줄기 세포의 배양 및 유지를 위한 추가의 방법이 당업자에게 공지된 바와 같이, 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있음이 인식된다.
바람직하게는, 정의되지 않은 조건이 사용되지 않을 수 있으며; 예를 들어, 리프로그래밍된 세포는 섬유아세포 피더 세포 상에서, 또는 섬유아세포 피더 세포, 특히 마우스 피더 세포에 노출된 배지 상에서 배양되지 않을 수 있다. 예를 들어, 만능 세포는 정의된, 피더-독립적 배양 시스템, 예컨대 TeSR 배지를 사용하여 본질적으로 분화되지 않은 상태로 배양되고 유지될 수 있다(문헌[Ludwig et al., 2006; Ludwig et al., 2006]). 피더-독립적 배양 시스템 및 배지를 사용하여 리프로그래밍된 세포를 배양할 수 있다. 이들 방법은 리프로그래밍된 세포가 마우스 섬유아세포 "피더 층"의 필요 없이, 본질적으로 분화되지 않은 상태로 성장되게 한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 다양한 변형을 이들 방법에 행하여, 필요에 따라 비용을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 특정 태양에 따른 배지는 기본 배지로서 동물 세포 배양에 사용되는 배지, 예컨대 TeSR, BME, BGJb, CMRL 1066, Glasgow MEM, 개량된 MEM 아연 옵션, IMDM, 배지 199, 이글(Eagle) MEM, αMEM, DMEM, Ham, RPMI 1640 및 피셔 배지(Fischer's media)뿐만 아니라 이들의 임의의 조합물 중 임의의 것을 사용하여 제조될 수 있지만, 배지는 동물 세포를 배양하는데 사용될 수 있는 한 상기 예로 특정적으로 한정되지 않는다. 특히, 배지는 이종성분이 없거나 또는 화학적으로 정의될 수 있다.
본 발명에 따른 배지는 혈청 함유 배지이거나 무혈청 배지일 수 있다. 무혈청 배지는 미가공된 또는 비정제된 혈청이 없는 배지를 가리키며, 이에 따라 정제된 혈액 유래 성분 또는 동물 조직 유래 성분(예를 들어, 성장 인자)을 갖는 배지를 포함할 수 있다. 이종 동물 유래 성분에 의해 오염을 예방하는 태양에서, 혈청은 줄기 세포(들)의 것과 동일한 동물로부터 유래될 수 있다.
본 발명에 따른 배지는 임의의 혈청 대체물을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 혈청 대체물은 알부민(예를 들어, 지질-풍부 알부민, 재조합 알부민과 같은 알부민 대용물, 식물 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해물), 트랜스페린(또는 다른 철 운반체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티오글리세롤 또는 이들의 등가물을 적절하게 함유하는 물질을 포함할 수 있다. 혈청 대체물은 예를 들어 국제특허공개 제98/30679호에 기술된 방법에 의해 제조할 수 있다. 다른 방안으로는 보다 편리하게 상업적으로 입수할 수 있는 임의의 물질을 사용할 수 있다. 상업적으로 입수할 수 있는 물질로는 녹아웃 혈청 대체제(KSR), 화학적으로 정의된 지질 농축제(기브코(Gibco)) 및 글루타맥스(기브코)가 포함된다.
또한 본 발명의 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산(예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민(들), 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-머캅토에탄올, 피루브산, 완충제 및 무기염을 함유할 수 있다. 2-머캅토에탄올의 농도는 예를 들어 약 0.05 내지 1.0 mM, 특히 약 0.1 내지 0.5 mM일 수 있지만, 상기 농도는 줄기 세포(들)를 배양하는데 적정하다면 이로써 특정적으로 한정되는 것이 아니다.
세포(들)를 배양하는데 사용되는 배양 용기는 이로써 한정하는 것은 아니지만 줄기 세포를 배양할 수 있는 한 플라스크, 조직배양용 플라스크, 접시, 페트리접시, 조직배양용 접시, 멀티접시, 마이크로평판, 마이크로웰 평판, 멀티 평판, 멀티웰 평판, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, 셀스택(CellSTACK)(등록상표) 챔버, 배양 백 및 회전병을 포함할 수 있다. 세포는 배양의 필요에 따라 적어도 또는 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50㎖, 100㎖, 150㎖, 200㎖, 250㎖, 300㎖, 350㎖, 400㎖, 450㎖, 500㎖, 550㎖, 600㎖, 800㎖, 1000㎖, 1500㎖ 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위의 용량으로 배양될 수 있다. 특정 실시형태에서, 배양 용기는 생물반응기일 수 있으며, 이것은 생물학적으로 활성인 환경을 지지하는 임의의 장치 또는 시스템을 지칭할 수 있다. 생물반응기는 적어도 또는 약 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 리터, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 제곱미터 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위의 용량을 가질 수 있다.
배양 용기는 세포 부착성이거나 비부착성일 수 있고 목적에 맞춰 선택한다. 세포 부착성 배양 용기는 용기 표면에 세포의 부착성을 증대시키기 위해 세포외 기질(ECM)과 같은 세포 부착용 기재 중 임의의 것으로 코팅시킬 수 있다. 세포 부착용 기재는 세포를 부착시키는 임의의 물질일 수 있다. 세포 부착용 기재는 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 라미닌 및 피브로넥틴, 그들의 단편 또는 혼합물을 포함한다.
다른 배양 조건들이 적절하게 정의될 수 있다. 예를 들면, 배양 온도는 약 30 내지 40℃, 예를 들어 적어도 또는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39℃일 수 있으나 이로써 특정적으로 한정되는 것은 아니다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들어 약 2 내지 5%이거나 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위일 수 있다. 산소 분압은 적어도, 최대 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. 8, 9, 10, 20% 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위일 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 담체 상의 현탁 배양(문헌[Fernandes et al., 2004]) 또는 겔/바이오폴리머 캡슐화(미국 특허 공개 2007/0116680호)를 포함한 리프로그래밍된 세포 또는 줄기 세포와 같은 세포의 현탁 배양을 위해 사용될 수 있다. 용어 세포의 현탁 배양은 세포가 배양 용기 또는 배지 중의 피더 세포(사용되는 경우)와 관련하여 비-부착 조건하에서 배양되는 것을 의미한다. 세포의 현탁 배양은 세포의 분리 배양 및 세포의 응집 현탁 배양을 포함한다. 용어 세포의 분리 배양은 현탁된 줄기 세포가 배양되어 줄기 세포의 분리 배양액이 단일 세포의 배양액을 포함하거나 다수의 세포(예를 들어, 약 2 내지 400개 세포)로 구성된 작은 세포 응집체의 배양액을 포함함을 의미한다. 상기된 분리 배양이 계속 진행되는 경우, 배양된 분리 줄기 세포는 세포의 더 큰 세포 응집체를 형성하며, 이후에는 응집 현탁 배양을 수행할 수 있다. 응집 현탁 배양은 배상체 배양 방법(문헌[Keller et al., 1995] 참조) 및 SFEB 방법(문헌[Watanabe et al., 2005]; 국제 특허 공개 제2005/123902호 참조)을 포함한다.
C. 기질 성분
부착 세포 배양을 위한 기재로 소용되는 다양한 정의된 기질 성분은 말초 혈액 세포를 리프로그래밍하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 그 전문이 참고로 포함되는 문헌[Ludwig et al. (2006a; 2006b)]에 기재된 바와 같이, 조합물 중의 재조합 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌 및 비트로넥틴을 사용하여, 만능 세포 성장을 위한 고체 지지체를 제공하는 수단으로서 배양 표면을 코팅할 수 있다.
기질 조성물은 세포에 대한 지지체를 제공하기 위하여 표면상에 동원될 수 있다. 기질 조성물은 하나 이상의 세포외 기질(ECM) 단백질 및 수성 용매를 포함할 수 있다. 용매 "세포외 기질"은 당업계에 알려져 있으며, 그의 성분에는 하기의 단백질 중 하나 이상이 포함된다: 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 테나신, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 젤라틴, 콜라겐, 피브릴린, 메로신, 안코린, 콘드로넥틴, 린크(link) 단백질, 뼈 시알로프로테인(bone sialoprotein), 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 에피넥틴, 히알루로넥틴, 운둘린, 에필리그린 및 칼리닌. 다른 세포외 기질 단백질은 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Kleinman et al., (1993)]에 기재되어 있다. 용어 "세포외 기질"은 현재에는 알려져 있지 않으나 장래에 발견될 수 있는 세포외 기질을 포함하고자 하는데, 이는 그의 세포외 기질로서의 특성화가 당업자에게 용이하게 결정될 것이기 때문이다.
일부 태양에서, 기질 조성물 중의 총 단백질 농도는 약 1ng/㎖ 내지 약 1mg/㎖일 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 기질 조성물 중의 총 단백질 농도는 약 1㎍/㎖ 내지 약 300㎍/㎖이다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 기질 조성물 중의 총 단백질 농도는 약 5㎍/㎖ 내지 약 200㎍/㎖이다.
세포외 기질(ECM) 단백질은 천연 기원의 것일 수 있으며, 인간 또는 동물 조직으로부터 정제될 수 있다. 대안적으로, ECM 단백질은 유전자 조작된(genetically engineered) 재조합 단백질이거나 성질이 합성일 수 있다. ECM 단백질은 전체 단백질이거나, 천연의 또는 조작된 펩티드 단편의 형태일 수 있다. 세포 배양을 위한 기질에 유용할 수 있는 ECM 단백질의 예에는 라미닌, I형 콜라겐, IV형 콜라겐, 피브로넥틴 및 비트로넥틴이 포함된다. 일부 실시형태에서, 기질 조성물은 재조합 피브로넥틴 또는 피브로넥틴의 합성으로 생성된 펩티드 단편을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 기질 조성물은 적어도 피브로넥틴 및 비트로넥틴의 혼합물을 포함한다.
일부 다른 실시형태에서, 기질 조성물은 바람직하게는 라미닌을 포함한다.
기질 조성물은 바람직하게는 단일 유형의 세포외 기질 단백질을 포함한다. 바람직한 일부 실시형태에서, 기질 조성물은 특히 리프로그래밍된 세포 또는 조혈 전구 세포의 배양에 사용하기 위한 피브로넥틴을 포함한다. 예를 들어, 적절한 기질 조성물은 미국 뉴저지주의 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤, 딕킨슨 앤드 컴퍼니(Becton, Dickinson & Co.)(BD)(카달로그 번호 354008)에 의해 판매되는 인간 피브로넥틴과 같은 인간 피브로넥틴을 둘베코스 인산염 완충된 염수(DPBS) 중에 희석함으로써 5㎍/㎖ 내지 약 200㎍/㎖의 단백질 농도로 제조할 수 있다. 특정 예에서, 기질 조성물은 피브로넥틴 단편, 예컨대 레트로넥틴(등록상표)을 포함한다. 레트로넥틴(등록상표)은 중심 세포-결합 도메인(III형 반복, 8,9,10), 고 친화성 헤파린-결합 도메인 II(III형 반복, 12,13,14) 및 대안적으로 스플라이싱된 인간 피브로넥틴의 IIICS 영역 내의 CS1 부위를 함유하는 (574개 아미노산)의 약 63kDa 단백질이다.
다른 일부 실시형태에서, 기질 조성물은 바람직하게는 라미닌을 포함한다. 예를 들어, 적절한 기질 조성물은 라미닌(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재); 카달로그 번호 L6274 및 L2020)을 둘베코스 인산염 완충된 염수(DPBS) 중에 5㎍/㎖ 내지 약 200㎍/㎖의 단백질 농도로 희석시킴으로써 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 기질 조성물은 기질 또는 그의 성분 단백질이 오직 인간 기원의 것이라는 점에서 이종성분이 없다. 이는 특정 연구 응용에 필요할 수 있다. 예를 들어, 인간 세포를 배양하기 위한 이종성분이 없는 기질에서, 인간 기원의 기질 성분이 사용될 수 있으며, 여기서, 임의의 비-인간 동물 성분이 배제될 수 있다. 특정 태양에서, 매트리겔(상표명)이 인간 iPS 세포로의 리프로그래밍을 위한 기재로서 배제될 수 있다. 매트리겔(상표명)은 마우스 종양 세포에 의해 분비되는 젤라틴성 단백질 혼합물이며, BD 바이오사이언스즈(BD Biosciences)(미국 뉴저지주 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 이러한 혼합물은 많은 조직에서 관찰되는 복잡한 세포외 환경과 유사하며, 세포 배양을 위한 기재로서 세포 생물학자에 의해 빈번하게 사용되나, 이는 원치않는 이종 항원 또는 오염물질을 도입시킬 수 있다.
D. 리프로그래밍을 위한 신호전달 억제제
본 발명의 특정 태양에서, 리프로그래밍 과정의 적어도 일부 동안에, 세포는 신호전달 캐스케이드에 연루된 신호 변환체를 억제하는 하나 이상의 신호전달 억제제의 존재 또는 부재하에서, 예를 들면 MEK 억제제, GSK3 억제제, TGF-β 수용체 억제제 및/또는 미오신 II ATPase 억제제 또는 이들 동일한 경로 내의 다른 신호 변환체의 억제제의 존재하에서 유지될 수 있다. 특정 태양에서, ROCK 억제제, 예를 들어, HA-100 또는 H1152가 리프로그래밍된 세포 및 생성된 iPS 세포의 클론 증식을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 조정된 인간 ES 세포 배양 배지 또는 무혈청 N2B27 배지와 같은 특정 리프로그래밍 배지와 조합하여 고농도의 FGF를 사용하여 리프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있다. 바람직한 태양에서, 배지는 정의되거나 이종성분이 없다.
특정 실시형태에서, 외인성 에피솜 유전 요소에 의해 세포에 하나 이상의 리프로그래밍 인자(예를 들어, 본 명세서에 기술된 2가지, 3가지 또는 그 이상)를 도입하는 것에 추가하여, 세포를 MEK 억제제, TGF-β 수용체 억제제, GSK3 억제제, 미오신 II ATPase 억제제 및/또는 LIF를 포함하는 리프로그래밍 배지를 처리하여 리프로그래밍 효율 및 역학을 증대시키고 1차 리프로그래밍 배양에서 iPS 세포의 동정을 용이하게 함으로써 iPS 세포 클론성을 보조하는 이점을 갖는다.
이러한 태양 및 실시형태에 있어서, 동일한 신호전달 경로(예를 들어, ERK1 또는 ERK2 캐스케이드)의 신호전달 성분을 억제하는 다른 신호전달 억제제가 필요에 따라 MEK 억제제를 대체할 수 있는 것이 이해될 것이다. 이것은 특히 FGF 수용체를 통한 MAPK 경로의 상류 자극의 억제를 포함할 수 있다(문헌[Ying, 2008]). 마찬가지로, GSK3 억제제는 필요에 따라 GSK3-연관된 신호전달 경로, 예를 들어, 인슐린 합성 및 Wnt/β-카테닌 신호전달의 다른 억제제를 대체할 수 있다. LIF는 필요에 따라 Stat3 또는 gp130 신호전달의 다른 활성화제를 대체할 수 있다.
이와 같은 신호전달 억제제, 예를 들어, MEK 억제제, GSK3 억제제, TGF-β 수용체 억제제는 적어도 또는 약 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 500 내지 1000μM 또는 그 안에서 유래될 수 있는 임의의 범위의 유효 농도로 사용될 수 있다.
억제제는 해당 분야의 전문가에 의해 통상적인 수단 또는 통상적인 공급처로부터 제공받거나 수득할 수 있다(참조: 국제 특허 공개 WO2007113505호).
1. 글리코겐 신타제 키나제 3 억제제
글리코겐 신타제 키나제 3(GSK-3)은 특정 세포 기질내의 특정 세린 및 트레오닌 아미노산에 포스페이트 분자의 첨가를 매개하는 세린/트레오닌 단백질 키나제이다. GSK-3에 의한 이러한 다른 단백질의 인산화는 보통 표적 단백질(또한 "기질"이라고 한다)을 억제한다. 언급된 바와 같이 GSK-3은 글리코겐 신타제를 인산화하여 불활성화시키는 것으로 알려져 있다. 또한, GSK-3은 손상된 DNA에 대한 세포반응 및 Wnt 신호전달의 조절에 연루되어 있다. 또한, GSK-3은 Hedgehog(Hh) 경로에서 Ci를 인산화하고 Ci가 불활성 형태로 단백질분해되도록 Ci를 표적화한다. 글리코겐 신타제 이외에, GSK-3은 많은 다른 기질을 갖는다. 그러나, GSK-3은 보통 기질을 우선 인산화하기 위해 "프라이밍(priming) 키나제"를 필요로 한다는 점에서 키나제 중에서 독특하다.
GSK-3 인산화의 결과는 보통 기질의 억제이다. 예를 들어, GSK-3이 이의 다른 기질인 NFAT 패밀리의 전사 인자를 인산화할 때 이들 전사 인자들은 핵으로 전위할 수 없음에 따라 억제된다. 발생 동안에 조직의 패턴화를 확립하는데 필요한 Wnt 신호전달 경로에서의 그의 중요한 역할 이외에, GSK-3은 또한 골격근 비대와 같은 세팅에서 유도되는 단백질 합성에서도 중요하다. NFAT 키나제로서의 그의의 역할은 또한 그것이 분화와 세포 증식 모두의 핵심적인 조절인자임을 제시한다.
GSK3 억제는 하나 이상의 GSK3 효소의 억제를 지칭할 수 있다. GSK3 효소의 패밀리는 잘 알려져 있으며 많은 변이체들이 공개되었다(예를 들어, 문헌[Schaffer et al., 2003] 참조). 특정 실시형태에서, GSK3-β가 억제된다. 또한 GSK3-α 억제제도 적합하며, 특정 태양에서 본 발명에 사용하기 위한 억제제는 GSK3-α와 GSK3-β 둘 다를 억제한다.
GSK3의 억제제는 GSK3에 결합하는 항체, GSK3의 우성 음성 변이체 및 GSK3을 표적으로 하는 siRNA 및 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. GSK3 억제제의 예는 문헌[Bennett et al. (2002)] 및 문헌[Ring et al. (2003)]에 기술되어 있다.
GSK3 억제제의 특정 예는 이로써 한정되는 것은 아니지만 켄파울론(Kenpaullone), 1-아자켄파울론, CHIR99021, CHIR98014, AR-A014418(예를 들어, 문헌[Gould et al., 2004] 참조), CT 99021(예를 들어, 문헌[Wagman, 2004] 참조), CT 20026(예를 들어, 상기 문헌[Wagman] 참조), SB415286, SB216763(예를 들어, 문헌[Martin et al., 2005] 참조), AR-A014418(예를 들어, 문헌[Noble et al., 2005] 참조), 리튬(예를 들어, 문헌[Gould et al., 2003] 참조), SB415286(예를 들어, 문헌[Frame et al., 2001] 참조) 및 TDZD-8(예를 들어, 문헌[Chin et al., 2005] 참조)을 포함한다. 칼바이오켐(Calbiochem)으로부터 입수가능한 GSK3 억제제의 추가예(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 달톤(Dalton) 등의 WO2008/094597호 참조)는 이로써 한정되는 것은 아니지만 BIO(2'Z,3'￡)-6-브로몸디루븜-3'-옥심(GSK3 억제제 IX); BIO-아세톡심(2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-아세톡심(GSK3 억제제 X); (5-메틸-1H-피라졸-3-일)-(2-페닐퀴나졸린-4-일)아민(GSK3-억제제 XIII); 피리도카바졸-사이클로펜아디에닐루테늄 복합체(GSK3 억제제 XV); TDZD-8,4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-다이온(GSK3베타 억제제 I); 2-티오(3-요오도벤질)-5-(1-피리딜)-[1,3,4]-옥사다이아졸(GSK3베타 억제제 II); OTDZT 2,4-다이벤질-5-옥소티아디아졸리딘-3-티온(GSK3베타 억제제 III); 알파-4-다이브로모아세토페논(GSK3베타 억제제 VII); AR-AO 14418 N-(4-메톡시벤질)-N'-(5-나이트로-1,3-티아졸-2-일)우레아(GSK3베타 억제제 VIII); 3-(1-(3-하이드록시프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-디온(GSK-3베타 억제제 XI); TWSl 19 피롤로피리미딘 화합물(GSK3베타 억제제 XII); L803 H-KEAPP APPQSpP-NH2 또는 이의 미리스토일화 형태(GSK3베타 억제제 XIII); 2-클로로-1-4,5-다이브로모-티오펜-2-일)-에탄온(GSK3베타 억제제 VI); AR-AO144-18; SB216763; 및 SB415286을 포함한다.
GSK3 억제제는 예를 들면 Wnt/β-카테닌 경로를 활성화시킬 수 있다. β-카테닌 하류 유전자중 많은 것들은 만능 유전자 네트워크를 동시-조절한다. 예를 들면, GSK 억제제는 cMyc 발현을 활성화시킬 뿐만 아니라 cMyc 단백질 안정성 및 전사 활성을 증가시킨다. 따라서, 일부 실시형태에서, GSK3 억제제는 세포 내에서 내인성 Myc 폴리펩티드 발현을 자극하고 그럼으로써 만능성을 유도하는데 Myc 발현의 필요성을 제거하기 위하여 사용될 수 있다.
추가로, GSK3-β의 활성 부위의 구조가 특성화되었고 특이적 및 비특이적 억제제와 상호작용하는 핵심 잔기가 동정되었다(문헌[Bertrand et al., 2003]). 이러한 구조적 특성화는 추가의 GSK 억제제를 용이하게 동정할 수 있도록 해준다.
본 명세서에 사용된 억제제는 바람직하게는 표적 대상인 키나제에 대해 특이적이다. 특정 실시형태의 억제제는 GSK3-β 및 GSK3-α에 대해 특이적이며, 실질적으로 erk2 및 cdc2를 억제하지 않는다. 억제제는 마우스 erk2 및/또는 인간 cdc2에 비해 인간 GSK3에 대해 IC50 값의 비율로 측정시 바람직하게는 적어도 100배, 더욱 바람직하게는 적어도 200배, 매우 바람직하게는 적어도 400배 선택성을 가지며; 여기서, GSK3 IC50 값에 대한 참조는 인간 GSK3-β와 GSK3-α에 대한 평균값을 지칭한다. GSK3에 대해 특이적인 CHIR99021로 양호한 결과를 수득하였다. CHIR99021의 사용을 위해 적합한 농도는 0.01 내지 100, 바람직하게는 0.1 내지 20, 더욱 바람직하게는 0.3 내지 10 마이크로몰 범위이다.
2. MEK 억제제
미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제(MAPK/ERK 키나제 또는 MEK) 또는 MAPK 캐스케이드와 같은 그와 연관된 신호전달 경로의 억제제를 포함하는 MEK 억제제가 본 발명의 특정 태양에서 사용될 수 있다. 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제(sic)는 미토겐-활성화된 단백질 키나제를 인산화하는 키나제 효소이다. 이것은 또한 MAP2K로도 알려져 있다. 세포외 자극은 MAP 키나제, MAP 키나제 키나제(MEK, MKK, MEKK 또는 MAP2K) 및 MAP 키나제 키나제 키나제(MKKK 또는 MAP3K)로 구성된 신호전달 캐스케이드("MAPK 캐스케이드")를 통한 MAP 키나제의 활성화를 유도한다.
본 명세서에서 MEK 억제제는 일반적인 MEK 억제제를 지칭한다. 따라서, MEK 억제제는 MEK1, MEK2 및 MEK5를 포함한 단백질 키나제의 MEK 패밀리의 구성원의 임의의 억제제를 지칭한다. 또한, MEK1, MEK2 및 MEK5 억제제도 포함된다. 이미 해당 분야에 알려져 있는 것으로 적합한 MEK 억제제의 예는 MEK1 억제제 PD184352 및 PD98059, MEK1 및 MEK2의 억제제 U0126 및 SL327 및 문헌[Davies et al. (2000)]에 기술된 것을 포함한다.
특히, PD184352 및 PD0325901이 다른 공지된 MEK 억제제와 비교했을 때 고도의 특이성 및 효능을 갖는 것으로 밝혀졌다(문헌[Bain et al., 2007]). 다른 MEK 억제제 및 MEK 억제제의 부류가 문헌[Zhang et al.(2000)]에 기술되어 있다.
MEK의 억제제는 MEK에 대한 항체, MEK의 우성 음성 변이체 및 MEK의 발현을 억제하는 siRNA 및 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. MEK 억제제의 특정 예는 이로써 한정하는 것은 아니지만 PD0325901(예를 들어, 문헌[Rinehart et al., 2004] 참조), PD98059(예를 들어 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)로부터 구입), U0126(예를 들어 셀 시그널링 테크놀로지로부터 구입), SL327(예를 들어 시그마-알드리치로부터 구입), ARRY-162(예를 들어 어레이 바이오파마(Array Biopharma)로부터 구입), PD184161(예를 들어, 문헌[Klein et al., 2006] 참조), PD184352(CI-1040)(예를 들어, 문헌[Mattingly et al., 2006] 참조), 수니티니브(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 Voss 등의 US2008004287호 참조), 소라페니브(상기 Voss의 문헌 참조), 반데타니브(상기 Voss의 문헌 참조), 파조파니브(상기 Voss의 문헌 참조), 악시티니브(상기 Voss의 문헌 참조) 및 PTK787(상기 Voss의 문헌 참조)을 포함한다.
현재 몇 가지 MEK 억제제가 임상 시험 평가 중에 있다. CI-1040은 암에 대한 임상 시험의 I상 및 II상으로 평가 중에 있다(예를 들어, 문헌[Rinehart et al., 2004]). 임상 시험에서 평가 중에 있는 다른 MEK 억제제로는 PD184352(예를 들어, 문헌[English et al., 2002] 참조), BAY 43-9006(예를 들어, 문헌[Chow et al., 2001] 참조), PD-325901(또한, PD0325901), GSK1 120212, ARRY-438162, RDEA1 19, AZD6244(또한, ARRY-142886 또는 ARRY-886), RO5126766, XL518 및 AZD8330(또한 ARRY-704)이 포함된다.
MEK의 억제는 또한 RNA-매개의 간섭(RNAi)을 이용하여 간편하게 달성할 수 있다. 전형적으로, MEK 유전자의 전체 또는 일부에 상보적인 이중가닥 RNA 분자가 만능세포 내로 도입되어 MEK-암호화 mRNA 분자의 특이적 분해를 촉진한다. 이와 같은 전사 후 메커니즘은 표적 MEK 유전자의 발현의 감소 또는 제거를 야기한다. RNAi를 이용하여 MEK 억제를 달성하는데 적합한 기술 및 프로토콜은 공지되어 있다.
GSK3 억제제 및 MEK 억제제를 포함한 키나제 억제제를 동정하는 많은 검정법이 공지되어 있다. 예를 들어, 다비스(Davis) 등(2000)은 키나제를 펩티드 기질과 방사능표지된 ATP의 존재하에 인큐베이션시키는 키나제 검정법을 기술하였다. 키나제에 의한 기질의 인산화는 기질내로 표지의 혼입을 유도한다. 각 반응물의 분액을 포스포셀룰로스 페이퍼 상에 고정시키고 인산으로 세척하여 미고정 ATP를 제거한다. 이어서 인큐베이션 후 기질의 활성을 측정하고 키나제 활성의 지표를 제공한다. 후보 키나제 억제제의 유무에 따른 상대적 키나제 활성은 그러한 검정법을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다. 다우니(Downey) 등(1996)도 키나제 억제제를 동정하는데 사용할 수 있는 키나제 활성의 검정법을 기술하였다.
3. TGF -β 수용체 억제제
TGF-β 수용체 억제제는 일반적인 TGF 신호전달의 임의의 억제제 또는 TGF-β 수용체(예를 들어, ALK5) 억제제에 특이적인 억제제를 포함할 수 있으며, 후자의 경우 TGF 베타 수용체(예를 들어, ALK5)에 대한 항체, TGF 베타 수용체의 우성 음성 변이체 및 TGF 베타 수용체의 발현을 억제하는 siRNA 및 안티센스 핵산이 포함될 수 있다. TGFβ 수용체/ALK5 억제제의 예로는 이로써 한정하는 것은 아니지만 SB431542(예를 들어, 문헌[Inman et al., 2002] 참조), 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카르보티오아미드로도 알려져 있는 A-83-01(예를 들어, 문헌[Tojo et al., 2005]을 참조하며, 예를 들어 토이크리스 바이오사이언스(Toicris Bioscience)로부터 구입), 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1, 5-나프티리딘, Wnt3a/BIO(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 달톤 등의 WO2008/094597호 참조), BMP4(예를 들어, 상기 달톤의 문헌 참조), GW788388(- (4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]피리딘-2-일}-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)벤즈아미드)(예를 들어, 문헌[Gellibert et al., 2006] 참조), SM16(예를 들어, 문헌[Suzuki et al., 2007] 참조), IN-1130(3-((5-(6-메틸피리딘-2-일)-4-(퀴녹살린-6-일)-1H-이미다졸-2-일)메틸)벤즈아미드)(예를 들어, 문헌[Kim et al., 2008] 참조), GW6604(2-페닐-4-(3-피리딘-2-일-1H-피라졸-4-일)피리딘)(예를 들어, 문헌[de Gouville et al., 2006] 참조), SB-505124(2-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-tert-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드)(예를 들어, 문헌[DaCosta et al., 2004] 참조) 및 피리미딘 유도체(본 명세서에 참고로 포함되는 스티플(Stiefl) 등의 WO2008/006583호에 수록된 것 참조)가 포함된다.
또한, "ALK5 억제제"가 비특이적 키나제 억제제를 포함하고자 하는 것은 아니지만, "ALK5 억제제"는 ALK5에 더하여 ALK4 및/또는 ALK7을 억제하는 억제제, 예를 들면 SB-431542(예를 들어, 문헌[Inman et al., 2002] 참조)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위를 한정하려는 의도 없이, ALK5 억제제는 중간엽에서 상피로의 전환/전이(MET) 과정에 영향을 미치는 것으로 확신된다. TGFβ/액티빈 경로는 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)의 동인이다. 본 발명자들은 TGFβ/액티빈 경로를 억제하는 것이 MET(즉, 리프로그래밍) 과정을 촉진할 수 있음을 주시하였다.
TGFβ/액티빈 경로의 억제는 유사한 효과를 나타낼 것으로 여겨진다. 따라서, TGFβ/액티빈 경로의 어떠한 억제제도(예를 들어, 상류 또는 하류) 본 명세서에 기재된 바와 같이 TGFβ/ALK5 억제제와 조합하여 또는 이를 대신하여 사용될 수 있다. TGFβ/액티빈 경로 억제제의 예로는 이로써 한정하는 것은 아니지만 TGFβ 수용체 억제제, SMAD 2/3 인산화의 억제제, SMAD 2/3과 SMAD 4의 상호작용의 억제제 및 SMAD 6과 SMAD 7의 활성화제/효능제가 포함된다. 또한, 본 명세서에 기술된 분류는 단순히 구성상의 목적에 의해 이루어진 것이며 당업자는 화합물들이 경로 내의 여러 지점에 영향을 미칠 수 있고 이에 따라 화합물은 정의된 카테고리중 하나 이상에서 작용할 수 있음을 이해할 것이다.
TGF 베타 수용체 억제제는 TGF 베타 수용체 대한 항체, TGF 베타 수용체의 우성 음성 변이체 및 TGF 베타 수용체를 표적으로 하는 siRNA 또는 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. 억제제의 특정 예는 이로써 한정하는 것은 아니지만 SU5416; 2-(5-벤조[1,3]-다이옥솔-5-일-2-tert-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드(SB-505124); 레르델리뭄브(CAT-152); 메텔리무마브(CAT-192); GC-1008; ID1 1; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; Ki26894; SB-203580; SD-093; 글리벡(Gleevec); 3,5,7,2',4'-펜타하이드록시피아본(Morin); 액티빈-M108A; P144; 가용성 TBR2-Fc; 및 TGF 베타 수용체를 표적으로 하는 안티센스 트랜스펙션된 종양 세포를 포함한다(예를 들어, 문헌[Wrzesinski et al., 2007; Kaminska et al., 2005; Chang et al., 2007] 참조).
4. ROCK 억제제
만능 줄기 세포, 특히 인간 ES 세포 및 iPS 세포는 세포 분리 및 이탈시 세포자멸사되기 쉬우며, 이는 클론 분리 또는 증식 및 분화 유도에 중요하다. 최근에, 분리된 만능 줄기 세포의 클론 효율 및 생존을 증가시켜 주는 소 부류의 분자가 발견되었으며, 예로는 ROCK-연관된 신호전달 경로의 억제제인 Rho-연관된 키나제(ROCK) 억제제, 예를 들어, Rho-특이적 억제제, ROCK-특이적 억제제 또는 미오신 II-특이적 억제제를 들 수 있다. 본 발명의 특정 태양에서, ROCK 억제제는 만능 줄기 세포의 배양 및 계대 및/또는 줄기 세포의 분화를 위해 사용될 수 있다. 따라서, ROCK 억제제는 만능 줄기 세포가 성장하고, 분리되며, 응집체를 형성하거나 분화를 유도하는 임의의 세포 배양 배지, 예를 들어, 부착 배양 또는 현탁 배양에 존재할 수 있다.
ROCK 신호전달 경로는 Rho 패밀리 GTPase; Rho의 하류 주요 이펙터 키나제인 ROCK; ROCK의 하류 우성 이펙터인 미오신 II(문헌[Harb et al., 2008]); 및 임의의 중간, 상류 또는 하류 신호 프로세서를 포함할 수 있다. ROCK는 미오신 조절 경쇄(MRLC)의 탈인산화를 통해 미오신 기능을 음성적으로 조절하는 ROCK의 주요 하류 표적중 하나인 미오신 포스페이트 표적 서브유닛 1(MYPT1)을 인산화시키고 불활성화시킬 수 있다.
ROCK는 Rho(3가지 아이소형이 존재한다-RhoA, RhoB 및 RhoC)에 대한 표적 단백질로서 작용을 하는 세린/트레오닌 키나제이다. 이들 키나제는 처음에 RhoA-유도된 스트레스 섬유 및 초점착역의 형성 매개자로서 특성화되었다. 두 ROCK 아이소형, 즉 ROCK1(p160ROCK, 또한 ROCKβ라 칭함) 및 ROCK2(ROCKα)는 N-말단 키나제 도메인 및 후속하여 이중나선 도메인으로 구성되며, 후자는 Rho-결합 도메인 및 플렉스트린-상동성 도메인(PH)를 함유한다. 두 ROCK는 세포골격 조절인자로서 스트레스 섬유 형성, 평활근 수축, 세포 부착, 세포막 러플링(ruffling) 및 세포 이동에 미치는 RhoA의 영향을 매개한다. ROCK는 미오신 II, 미오신 경쇄(MLC), MLC 포스파타제(MLCP) 및 포스파타제 및 텐신 상동체(PTEN)와 같은 하류 분자를 표적으로 하여 생물학적 활성을 발휘할 수 있다.
ROCK 억제제의 비한정적 예는 HA-100, Y-27632, H-1152, 파수딜(Fasudil)(또한 HA1077이라고도 한다), Y-30141(미국 특허 제5,478,838호에 기재됨), Wf-536, HA-1077, 하이드록실-HA-1077, GSK269962A, SB-772077-B 및 이들의 유도체 및 ROCK에 대한 안티센스 핵산, RNA 간섭 유도 핵산(예를 들어, siRNA), 경쟁 펩티드, 길항 펩티드, 억제 항체, 항-ScFV 단편, 우성 음성 변이체 및 이들의 발현 벡터를 포함한다. 또한, 다른 저분자 화합물들이 ROCK 억제제로서 알려져 있기 때문에, 이러한 화합물 또는 이의 유도체가 또한 실시형태에서 사용될 수 있다(본 명세서에서 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제20050209261호, 제20050192304호, 제20040014755호, 제20040002508호, 제20040002507호, 제20030125344호 및 제20030087919호 및 국제특허공개 제2003/062227호, 제2003/059913호, 제2003/062225호, 제2002/076976호 및 제2004/039796호 참조). 본 발명의 특정 태양에서, 또한 ROCK 억제제 중 하나 또는 둘 또는 그 이상의 조합물이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 특정 태양에서, 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum) C3 세포외효소 및/또는 미오신 II-특이적 억제제와 같은 Rho-특이적 억제제가 ROCK 억제제로서 사용될 수 있다.
E. 저산소 조건
낮은 산소는 전구 세포-유사 상태의 유지를 선호하는 리프로그래밍 및 아마도 적어도 일부의 리프로그래밍 단계 전에, 전체 증식 단계 동안 사용될 수 있다. 먼저, 세포가 증식함에 따라, 이들은 더욱 전구세포-유사 상태로부터 더욱 분화된 상태(즉, CD34 발현 수준은 시간이 지남에 따라 감소)로 이동하는 경향이 있다. 낮은 산소 조건은 조혈 전구 세포(HP)의 전형적인 미세환경과 유사하며, 전구 세포의 분화를 늦추는 것으로 보인다(문헌[Eliasson and Jonsson, 2010]). 본 명세서에서 사용되는 낮은 산소는 약 2%의 수준 또는 약 1-7%의 범위 내일 수 있다. 추가의 태양에서, 낮은 02는 또한 리프로그래밍 단계 동안에 사용되어, iPS 형성을 조장할 수 있다(문헌[Yoshida et al., 2009]).
V. 에피솜 유전 요소
본 발명의 특정 태양에서, 리프로그래밍 인자는 하나 이상의 외인성 에피솜 유전 요소에 포함되는 발현 카세트로부터 발현된다(본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2010/0003757호 및 미국 특허 출원 제61/258,120호 참조).
인간 체세포로부터의 만능 줄기 세포의 유도는 리프로그래밍 유전자의 이소성 발현을 위한 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 달성되어 왔다. 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스와 같은 재조합 레트로바이러스는 안정한 방식으로 숙주 게놈 내로 통합되는 능력을 지니고 있다. 이들 바이러스는 숙주 게놈 내로 삽입되도록 해 주는 역전사효소를 함유한다. 렌티바이러스는 레트로바이러스의 하위부류이다. 이들 바이러스는 비분열 세포뿐만 아니라 분열 세포의 게놈 내로 통합되는 능력 덕택에 벡터로서 폭 넓게 응용되고 있다. RNA 형태의 바이러스 게놈은 이 바이러스가 세포 내로 들어가 역전사하여 DNA를 생성한 다음 바이러스 인테그라제 효소에 의해 임의의 위치에서 게놈 내로 삽입된다. 따라서, 현재의 성공적인 리프로그래밍 기법은 통합-기반 바이러스 방식에 의존적이다.
그러나, 본 발명의 기법을 사용하여, 표적화된 통합은 여전히 통상적이지 않으며(문헌[Bode et al, 2000]), 대안적인 통상의 무작위 통합은 유도된 만능 줄기 세포에서 예상할 수 없는 결과를 갖는 삽입 돌연변이생성을 야기할 수 있다. 같은 이유로, 트랜스유전자의 발현은 조절될 수 없는데, 이는 트랜스유전자의 발현이 통합 부위의 염색질 상황에 좌우되기 때문이다(문헌[Baer et al., 2000]). 높은 수준의 발현은 바람직한 게놈 유전자좌에서만 달성될 수 있으나, 고도로 발현되는 부위 내로의 통합이 유도된 만능 줄기 세포의 중추적인 세포 기능을 방해할 위험이 존재한다.
또한, DNA 메틸화를 수반하는 과정에서 트랜스유전자를 하류-조절함으로써 작동하는 외래 DNA에 대한 세포 방어 메커니즘의 존재에 관한 증거들이 증가하고 있다(문헌[Bingham, 1997], 문헌[Garrick et al., 1998]). 게다가, 바이러스 성분은 다른 인자와 함께 작용하여 세포를 형질전환시킬 수 있다. 세포 내에 바이러스 게놈의 적어도 일부가 존속하는 것은 많은 바이러스 유전자들로부터 연속적인 발현을 동반하며 세포의 형질전환을 일으킬 수 있다. 이들 유전자는 세포의 신호전달 경로를 방해하여 세포의 관찰되는 표현형 변화를 일으킬 수 있으며, 결국 바이러스에 이로운 세포 분열의 증가를 보이는 형질전환 세포를 형성한다.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명은 종래의 방법에서 사용된 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 요소와 같은 외인성 유전 요소가 본질적으로 없는 유도 만능 줄기 세포를 제조하는 신규한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 이들 방법은 염색체외 복제 벡터 또는 에피솜으로 복제할 수 있는 벡터(본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 제12/478,154호 참조)를 이용하며, 이와 조합적으로 세포 신호전달 억제제의 존재하에 리프로그래밍된 세포를 배양하여 최적의 리프로그래밍 효율과 역학을 달성한다.
많은 DNA 바이러스, 예를 들면 아데노바이러스, 원숭이 액포형성 바이러스 40(SV40), 소 유두종 바이러스(BPV) 또는 출아효모 ARS(자가 복제 서열)-함유 플라스미드는 포유류 세포에서 염색체외 복제한다. 이러한 에피솜 플라스미드는 통합 벡터와 연관된 이들의 모든 단점으로부터 본질적으로 자유롭다(문헌[Bode et al., 2001]). 엡스테인 바 바이러스(EBV)를 포함한 림프구 친화성 헤르페스 바이러스-기반 시스템이 또한 염색체외 복제할 수 있으며 체세포로의 리프로그래밍 유전자의 전달을 조력할 수 있다.
예를 들면, 본 발명에서 사용된 에피솜 벡터-기반 방법은 아래에 상세히 기술된 바와 같이 임상 세팅에서 시스템의 취급용이성을 저해하지 않으면서 EBV 요소-기반 시스템의 성공적인 복제 및 유지에 필요한 강력한 요소만 을 응용한다. 유용한 EBV 요소는 OriP 및 EBNA-1 또는 이들의 변이체 또는 기능상 등가물이다. 이 시스템의 추가적인 장점은 이들 외인성 요소들이 세포 내로 도입된 후 시간이 경과하면서 제거되어 이들 요소가 본질적으로 없고 자가-지속하는 iPS 세포를 유도한다는 것이다.
A. 에피솜 벡터
이들 리프로그래밍 방법은 외인성 벡터 또는 바이러스 요소가 iPS 세포에 본질적으로 없도록 에피솜 복제능을 갖는 벡터인 염색체외 복제 벡터(즉, 에피솜 벡터)를 이용할 수 있다(본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 제61/058,858호; 문헌[Yu et al., 2009] 참조). 많은 DNA 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 원숭이 액포형성 바이러스 40(SV40) 또는 소 유두종 바이러스(BPV) 또는 출아 효모 ARS(자가 복제 서열)-함유 플라스미드는 포유류 세포에서 염색체 외적으로 또는 에피솜 복제한다. 이들 에피솜 플라스미드는 통합 벡터와 연관된 모든 단점(문헌[Bode et al., 2001])이 본질적으로 없다. 예를 들어, 상술된 바와 같은 엡스테인 바 바이러스(EBV)를 포함한 림프구 친화성 헤르페스 바이러스-기반의 것 또는 엡스테인 바 바이러스(EBV)는 염색체외에서 복제하고 리프로그래밍 유전자가 체세포로 전달하는 것을 보조할 수 있다.
예를 들면, 본 발명에 사용된 플라스미드-기반의 방법은 EBV 요소-기반의 시스템의 성공적인 복제 및 유지를 위해 필요한 강력한 요소를, 아래에 상세히 기술된 바와 같이 임상 세팅에서 그 시스템의 편의성을 저해하지 않으면서, 추출할 수 있다. 본질적인 EBV 요소는 OriP와 EBNA-1 또는 그들의 변이체 또는 기능적 등가물이다. 이 시스템의 추가적인 장점은 이들 외인성 요소가 세포 내로 도입된 후 시간이 경과하면서 소실되어 외인성 요소가 본질적으로 없는 자가-지속되는 iPS 세포가 생성된다는 것이다.
플라스미드- 또는 리포좀-기반의 염색체외 벡터, 예를 들어, oriP-기반의 벡터 및/또는 EBNA-1의 유도체를 암호화하는 벡터의 사용은 거대 DNA 단편이 세포로 도입되고, 염색체 외로 유지되며, 세포주기당 1회 복제하고, 딸세포로 효율적으로 분배되도록 해 주며 실질적으로 면역 반응을 나타내지 않는다. 특히, oriP-기반의 발현 벡터의 복제에 필요한 유일한 바이러스 단백질인 EBNA-1은 MHC 부류 I 분자상에 항원의 제시를 위해 필요한 과정을 우회하기에 효율적인 메커니즘을 개발해 왔기 때문에 세포성 면역 반응을 나타내지 않는다(문헌[Levitskaya et al., 1997]). 또한, EBNA-1은 트랜스로 작용하여 클로닝된 유전자의 발현을 증가시킬 수 있으며, 일부 세포주에서 클로닝된 유전자의 발현을 100배까지 유도한다(문헌[Langle-Rouault et al., 1998; Evans et al., 1997]). 마지막으로, 그러한 oriP-기반의 발현 벡터의 제조는 저렴하다.
다른 염색체외 벡터는 다른 림프구 친화성 헤르페스 바이러스-기반의 벡터를 포함한다. 림프구 친화성 헤르페스 바이러스는 림프아구(예를 들어, 인간 B 림프아구)에서 복제하는 헤르페스 바이러스이며 자연 생활 사이클의 일부를 위한 플라스미드가 된다. 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)는 "림프구 친화성" 헤르페스 바이러스가 아니다. 림프구 친화성 헤르페스 바이러스의 예는 이들로 한정되는 것은 아니지만 EBV, 카포시육종 헤르페스 바이러스(KSHV); 헤르페스 바이러스 사이미리(HS) 및 마렉병 바이러스(MDV)를 포함한다. 또한, 에피솜-기반의 벡터의 다른 공급원, 예컨대 효모 ARS, 아데노바이러스, SV40 또는 BPV도 고려된다.
B. 엡스타인-바 바이러스
인간 헤르페스바이러스 4(HHV-4)라고도 하는 엡스타인-바 바이러스(EBV)는 (헤르페스 심플렉스 바이러스 및 사이토메갈로바이러스를 포함하는) 헤르페스 패밀리의 바이러스이며 인간에게 가장 흔한 바이러스중 하나이다. EBV는 이의 게놈을 염색체외에서 유지하며 효율적인 복제 및 유지를 위해 숙주 세포의 기작을 빌어서 작용하고(문헌[Lindner and Sugden, 2007]) 세포 분열 동안에 복제 및 유지를 위해 두 가지 필수적인 특징에만 의존한다(문헌[Yates et al. 1985; Yates et al. 1984]). 흔히 oriP라고 지칭되는 하나의 요소는 시스로 존재하고 복제 원점으로서 역할을 한다. 다른 요소 EBNA-1은 oriP내의 서열과 결합하여 트랜스로 기능하여 플라스미드 DNA의 복제 및 유지를 촉진한다. 비한정적인 예로서, 본 발명의 특정 태양은 상기 두 가지 특징만을 응용하며 이들 특징을 체세포 리프로그래밍에 필요한 유전자를 포함한 셔틀벡터에 적용하여 통상적인 플라스미드에 비하여 이들 유전자의 복제 및 지속적인 발현을 촉진시킨다.
C. 복제 원점
특정 태양에서, EBV의 복제 원점인 OriP가 사용될 수 있다. OriP는 DNA 복제가 개시되는 부위 또는 그 근처이며 반복서열 패밀리(FR) 및 2회 대칭(DS)으로 공지된 약 1 kb쌍 떨어진 2개의 시스-작용성 서열로 구성된다.
FR은 30bp 반복서열의 21개 불완전 카피로 구성되고 20개의 고친화성 EBNA-1 결합 부위를 함유한다. FR에 EBNA-1이 결합할 때 FR은 최대 10 kb 떨어진 시스의 프로모터의 전사 인핸서로서 역할을 하고(문헌[Reisman and Sugden, 1986; Yates, 1988; Sugden and Warren, 1989; Wysokenski and Yates, 1989; Gahn and Sugden, 1995; Kennedy and Sugden, 2003; Altmann et al., 2006]), FR 함유 플라스미드의 핵 잔류 및 확실한 유지에 기여한다(문헌[Langle-Rouault et al., 1998; Kirchmaier and Sugden, 1995; Wang et al., 2006; Nanbo and Sugden, 2007]). oriP 플로스미드의 효율적인 분할 또한 FR에 기인한다. 바이러스가 FR내의 20개 EBNA-1-결합 부위를 유지하는 방향으로 진화한 한편, 효율적인 플라스미드 유지는 이들 부위 중 단지 7개만을 필요로 하며 총 12개의 EBNA-1-결합 부위를 갖는 DS의 3개 카피의 폴리머로 재구성될 수 있다(문헌[Wysokenski and Yates, 1989]).
2회 대칭 요소(DS)는 EBNA-1의 존재하에 DNA 합성의 개시를 위해 충분하며(문헌[Aiyar et al., 1998; Yates et al., 2000]) 개시는 DS에서 또는 그 근처에서 일어난다(문헌[Gahn and Schildkraut, 1989; Niller et al., 1995]). 바이러스 DNA 합성의 종료는 FR에서 일어나는 것으로 생각되고, 그 이유는 FR에 EBNA-1이 결합할 때 FR은 2D 겔 전기영동에 의해 관찰된 바와 같이 복제분기점 장벽으로서 작용한다(문헌[Gahn and Schildkraut, 1989; Ermakova et al., 1996; Wang et al., 2006]). DS로부터 DNA 합성의 개시는 세포주기 당 1회로 허용되며(문헌[Adams, 1987; Yates and Guan, 1991]) 세포 복제시스템의 성분에 의해 조절된다(문헌[Chaudhuri et al., 2001; Ritzi et al., 2003; Dhar et al., 2001; Schepers et al., 2001; Zhou et al., 2005; Julien et al., 2004]). DS는 비록 FR에서 발견된 것보다 친화성이 낮지만 4개의 EBNA-1 결합 부위를 함유한다(문헌[Reisman et al., 1985]). DS의 토폴로지는 4개의 결합 부위가 2개의 쌍의 부위로 배열되어 있고 각 쌍 사이에 21bp 중심-대-중심 간격이 존재하며 쌍을 이루지 못한 2개의 내부 결합 부위 사이에 33bp 중심-대-중심 간격이 존재한다(문헌[Baer et al., 1984; Rawlins et al., 1985)].
DS 내 요소들의 기능상 역할은 EBV 게놈의 다른 영역의 연구에 의해 검증되었고, 이 영역은 Rep*라고 하며 DS를 비효율적으로 대체할 수 있는 요소로 동정되었다(문헌[Kirchamier and Sugden, 1998]). Rep*의 8회 중합은 복제의 지원에서 DS만큼 효율적인 요소를 생성하였다(문헌[Wang et al., 2006]). Rep*의 생화학적 분석 결과, 복제 기능에 중요한 21bp 중심-대-중심 간격을 포함한 한 쌍의 EBNA-1 결합 부위가 동정되었다(상기 문헌). Rep*의 최소 리플리케이터(replicator)는 EBNA-1-결합 부위의 쌍인 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 그 폴리머 내의 모든 인접 서열들이 람다 파지로부터 유래된 서열로 대체된 후조차 복제 기능이 유지되었기 때문이다. DS와 Rep*를 비교했을 때 공통적인 메커니즘이 드러났다: 이들 리플리케이터는 EBNA-1에 의해 구부러지고 결합된 한 쌍의 적당한 공간 부위를 통해 세포의 복제 기작을 구성함으로써 DNA 합성의 개시를 지원한다.
EBV와 무관하며 일부 방식에서 EBV의 Raji 스트레인내 개시 구역과 유사한 것으로 보이는, 포유류 세포에서 복제하는 다른 염색체외 허용된 플라스미드가 있다. 한스 립스(Hans Lipps) 및 그의 동료들은 "핵 스캐폴드/매트릭스 부착 영역"(S/MAR) 및 강력한 전사 단위를 함유하는 플라스미드를 개발하고 연구하였다(문헌[Piechaczek et al., 1999; Jenke et al., 2004]). S/MAR은 인간 인터페론-베타 유전자로부터 유도된 것이며, A/T가 풍부하고, 이를 작동적으로 규정한다면 핵 매트릭스와 결합하고 낮은 이온강도에서나 초나선 DNA에 함입된 경우 먼저 풀리지 않는다는 것이다(문헌[Bode et al., 1992]). 이들 플라스미드는 반보존적으로 복제되고, ORC 단백질과 결합하며, 이들의 DNA 전체에 걸쳐 효과적이고 무작위적으로 DNA 합성의 개시를 조력한다(문헌[Schaarschmidt et al., 2004]). 이들은 약물 선별없이 증식하는 햄스터 및 인간 세포에서 효율적으로 유지되며 돼지 배아 내로 도입되었을 때 태아 동물의 대부분 조직에서 GFP의 발현을 지원할 수 있다(문헌[Manzini et al., 2006]).
D. 트랜스-작용성 인자
트랜스-작용성 인자의 특정 예는 엡스테인 바 핵 항원 1(EBNA-1)일 수 있고, 이 인자는 oriP의 FR과 DS 또는 Rep*와 결합하는 DNA-결합 단백질로서 각 세포 분열동안에 세포 염색체와 독립적이지만 조화를 이루어 EBV-기반의 벡터의 복제 및 딸세포로의 확실한 분할을 촉진한다.
EBNA-1의 641개 아미노산(AA)이 돌연변이 및 결실 분석에 의해 다양한 기능과 연관된 도메인별로 분류되었다. AA40-89와 AA329-378의 두 영역은 이에 EBNA-1이 결합되었을 때 시스 또는 트랜스로 두 DNA 요소를 연결할 수 있고 이에 따라서 연결 영역 1 및 연결 영역 2(LR1, LR2)라고 한다(문헌[Middleton and Sugden, 1992; Frappier and O'Donnell, 1991; Su et al., 1991; Mackey et al., 1995]). EBNA-1의 이들 도메인을 GFP에 융합시키면 GFP는 유사분열 염색체로 향한다(문헌[Marechal et al., 1999; Kanda et al., 2001]). LR1 및 LR2는 기능상 복제에 대하여 중복적이며; 어느 하나의 결실은 DNA 복제를 지탱할 수 있는 EBNA-1의 유도체를 생성한다(문헌[Mackey and Sugden, 1999; Sears et al., 2004]). LR1 및 LR2는 아르기닌 및 글리신 잔기가 풍부하고 A/T 풍부 DNA와 결합하는 AT-후크(hook) 모티프와 유사하다(문헌[Aravind and Landsman, 1998])(문헌[Sears et al., 2004]). EBNA-1의 LR1 및 LR2의 시험관내 분석으로 A/T 풍부 DNA와 결합하는 그들의 능력이 입증되었다(문헌[Sears et al., 2004]). AT-후크 1개를 함유한 LR1은 EBNA-1의 DNA-결합 및 이합체화 도메인에 융합되는 경우 비록 야생형 EBNA-1보다 덜 효율적이지만 oriP 플라스미드의 DNA 복제를 위해 충분한 것으로 밝혀졌다(상기 문헌).
그러나, LR1과 LR2는 상이하다. LR1의 C-말단 절반은 N-말단 절반의 반복된 Arg-Gly이외의 다른 아미노산으로 구성되며 독특한 영역 1(UR1)이라고 한다. UR1은 EBNA-1이 FR을 함유하는 트랜스펙션되고 통합된 리포터 DNA로부터 전사를 효율적으로 활성화하는데 필요하다(문헌[Wu et al., 2002; Kennedy and Sugden, 2003; Altmann et al., 2006]). UR1은 또한 EBV에 의해 감염된 B-세포의 효율적인 트랜스펙션을 위해 필수적이다. 이러한 도메인이 결여된 EBNA-1의 유도체가 완전한 바이러스에서 야생형 단백질을 대체하는 경우, 이러한 변이체 바이러스는 야생형 바이러스의 0.1%의 형질전환 능력을 갖는다(문헌[Altmann et al., 2006]).
LR2는 oriP 복제를 위한 EBNA-1의 지원에 필요하지 않다(문헌[Shire et al., 1999; Mackey and Sugden, 1999; Sears et al., 2004]). 추가로, EBNA-1의 N-말단 절반은 HMGA1a와 같은 AT-후크 모티프 함유 세포 단백질로 대체될 수 있으며 복제 기능을 계속 유지한다(문헌[Hung et al., 2001; Sears et al., 2003; Altmann et al., 2006]). 이러한 발견은 인간 세포에서 oriP의 유지를 위해 필요한 것은 LR1 및 LR2의 AT-후크 활성임을 나타낸다.
EBNA-1의 잔기 중 3분의 1(아미노산 91-328)은 글리신-글리신-알라닌(GGA) 반복서열로 이루어져 있으며, 이것은 프로테아솜 분해 및 제시를 억제함으로써 숙주 면역 반응을 회피하는 EBNA-1의 능력에 연루되어 있다(문헌[Levitskaya et al., 1995; Levitskaya et al., 1997]). 또한 이들 반복서열은 시험관내 및 생체내에서 EBVN-1의 번역을 억제하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Yin et al., 2003]). 그러나, 이 도메인 중 많은 부분의 결실은 세포 배양에서 EBNA-1의 기능에 전혀 효과가 없으며, 이것은 이 도메인이 담당하는 역할을 규명하기 어렵게 한다.
핵 위치 신호(NLS)는 아미노산 379-386에 의해 암호화되며 이것은 또한 세포의 핵수송 기작과 연관이 있다(문헌[Kim et al., 1997; Fischer et al., 1997]). LR1 및 LR2의 Arg-Gly 풍부 영역내 서열은 또한 이들의 고 염기성 함량 때문에 NLS로 작용할 수 있다.
마지막으로, C-말단(아미노산 458-607)은 EBNA-1의 중복된 DNA-결합 및 이합체화 도메인을 암호화한다. DNA에 결합된 이들 도메인의 구조는 X-선 결정학에 의해 밝혀졌으며 유두종바이러스의 E2 단백질의 DNA-결합 도메인과 유사한 것으로 나타났다(문헌[Hegde et al., 1992; Kim et al., 2000; Bochkarev et al., 1996]).
본 발명의 특정 실시형태에서, 리프로그래밍 벡터는 oriP와 세포 분열 동안에 플라스미드 복제와 이의 적절한 유지를 조력하는데 적격인 EBNA-1의 형태를 암호화하는 단축 서열을 모두 함유한다. 야생형 EBNA-1의 아미노-말단 3분의 1 내의 고도로 반복적인 서열과 다양한 세포에서 독성이 입증된 25 아미노산 영역의 제거는 oriP와 연관된 EBNA-1의 트랜스-작용 기능을 위해 불필요하다(문헌[Yates et al., 1985; Kennedy et al., 2003]). 따라서, 델타UR1로 알려진 EBNA-1의 단축 형태는 하나의 실시형태에서 이와 같은 에피솜 벡터-기반의 시스템내에서 oriP와 함께 사용될 수 있다.
특정 태양에서, 본 발명에서 사용될 수 있는 EBNA-1의 유도체는 상응하는 야생형 폴리펩티드에 비해 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 변형은 EBNA-1 내 LR1(잔기 약 40 내지 약 89)의 독특한 영역(잔기 약 65 내지 약 89)에 상응하는 영역에서 적어도 하나의 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하며, 생성된 유도체가 목적하는 특성을 보유하는 한, 예를 들어 oriP에 상응하는 ori를 함유하는 DNA와 이합체를 형성하고 결합하고, 핵으로 국소화하며, 세포독성을 나타내지 않고, 염색체 외로부터 전사를 활성화하지만 통합된 주형으로부터의 전사가 실질적으로 활성적이지 않는 한, EBNA-1의 다른 잔기에 상응하는 영역에서 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들면, 약 잔기 1 내지 약 잔기 40, 잔기 약 90 내지 약 328("Gly-Gly-Ala" 반복서열 영역), 잔기 약 329 내지 약 377(LR2), 잔기 약 379 내지 약 386(NLS), 잔기 약 451 내지 약 608(DNA 결합 및 이합체화) 또는 잔기 약 609 내지 약 641의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함할 수 있다.
E. 무잔기 특징
중요한 것은 oriP-기반의 에피솜 벡터의 복제 및 유지는 불완전하고 세포 내로 도입된 후 처음 2주 내에 세포로부터 급격히 소실되지만(세포분열 당 25%); 해당 플라스미드를 보유한 세포들은 소실 빈도가 줄어든다는 것이다(세포분열 당 3%)(문헌[Leight and Sugden, 2001; Nanbo and Sugden, 2007]). 일단 해당 플라스미드를 보유한 세포에 대한 선별이 제거되면, 모든 플라스미드가 생성된 딸세포 내에 이전의 존재에 대한 흔적을 남기지 않고 시간이 경과하면서 완전히 제거될 때까지 각 세포분열 동안에 플라스미드는 소실될 것이다. 본 발명의 특정 태양은 iPS 세포를 생성하기 위해 유전자를 전달하는 현재의 바이러스-연관된 방법의 대안으로서 oriP-기반의 시스템의 무흔적 특징을 이용한다. 또한 다른 염색체외 벡터도 숙주 세포의 복제 및 증식 동안에 소실될 것이며 마찬가지로 본 발명에 사용될 수 있다. 특정 태양에서, 외인성 에피솜 벡터 요소의 제거 또는 본질적으로 외인성 유전 요소가 없는 iPS 세포의 선택 방법을 사용할 수 있다.
VI . 벡터 작제 및 전달
특정 실시형태에서, 리프로그래밍 벡터는 세포 내의 상술된 바와 같은 리프로그래밍 인자를 암호화하는 핵산 서열에 더하여 추가의 요소를 포함하도록 작제할 수 있다. 이들 벡터의 성분 및 전달 방법의 상세사항은 하기 논의된다.
A. 벡터
해당 분야의 전문가는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 용이하게 작제할 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Maniatis et al., 1988; 및 Ausubel et al., 1994] 참조).
또한, 벡터는 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나 표적 세포에 유익한 성질을 제공하는 다른 성분 또는 작용성을 포함할 수 있다. 이러한 다른 성분은 예를 들면 세포에 결합하거나 세포를 표적화하는 것에 영향을 미치는 성분(세포 유형 또는 조직 특이적 결합을 매개하는 성분을 포함함); 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수에 영향을 미치는 성분; 흡수 후 세포 내 폴리뉴클레오티드의 위치에 영향을 미치는 성분(예를 들어, 핵 국소화를 매개하는 작용제); 및 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미치는 성분을 포함한다.
이러한 성분은 또한 벡터에 의해 전달된 핵산을 흡수하고 발현하는 세포를 검출 또는 선택하는데 사용될 수 있는 검출 마커 및/또는 선택 마커와 같은 마커를 포함할 수 있다. 이러한 성분은 벡터의 자연적 특징(예를 들어, 결합 및 흡수를 매개하는 성분 또는 작용성을 갖는 특정 바이러스 벡터의 이용)으로서 제공될 수 있거나, 벡터는 그러한 작용성을 제공하도록 변형될 수 있다. 이러한 벡터들은 아주 다양하게 해당 분야에 알려져 있으며 일반적으로 이용가능하다. 벡터가 숙주 세포 내에서 유지될 때, 이 벡터는 숙주 세포의 게놈 내에 혼입된 자율적 구조로서 유사분열 동안에 세포에 의해 안정하게 복제될 수 있거나 숙주 세포의 핵 또는 세포질에서 유지될 수 있다.
B. 조절 요소
벡터에 포함된 진핵 발현 카세트는 특히 단백질-암호화 서열에 작동가능하게 연결된 진핵 전사 프로모터, 개재 서열을 포함한 스플라이스 신호 및 전사 종결/폴리아데닐화 서열을(5'에서 3' 방향으로) 함유한다.
i. 프로모터/ 인핸서
"프로모터"는 전사 개시 및 전사 속도를 조절하는 핵산 서열의 영역이다. 프로모터는 RNA 중합효소 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합하여 핵산 서열의 특이적인 전사를 개시할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. 용어 "작동적으로 위치한", "작동가능하게 연결된", "조절하에" 및 "전사 조절하에"는 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 작용상 정확하게 위치 및/또는 배향되어 그 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절한다는 것을 의미한다.
본 발명의 EBNA 1-암호화 벡터에 사용하기에 적합한 프로모터는 EBNA 1 단백질을 암호화하는 발현 카세트의 발현을 지시하여 충분히 항상 상태 수준의 EBNA 1 단백질을 생성하여 EBV oriP-함유 벡터를 안정하게 유지하는 것이다. 또한, 프로모터는 리프로그래밍 인자를 암호화하는 발현 카세트의 효율적인 발현을 위해 사용된다.
프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 개시 부위의 위치를 잡아 주는 작용을 하는 서열을 포함한다. 이러한 서열로 가장 잘 알려진 예는 TATA 박스(box)이지만, 일부 프로모터, 예를 들면 포유류 말단 데옥시뉴클레오티딜 트로스퍼라제 유전자의 프로모터 및 SV40 후기 유전자의 프로모터의 경우 TATA 박스가 없고, 특별한 요소가 출발 부위에 중첩하여 개시 장소가 고정되도록 협력한다. 추가의 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 비록 많은 프로모터들이 출발 부위로부터 하류 위치에 작용 요소를 함유하는 것으로 밝혀졌지만, 전형적으로, 이들 요소는 출발 부위로부터 30-110 bp 상류 영역에 위치한다. 암호 서열을 프로모터의 "조절 하에" 두기 위해, 선택된 프로모터의 "하류"에(즉, 3'에) 전사 번역 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단이 위치한다. "상류" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진한다.
프로모터 요소 사이의 공간은 흔히 유동적이므로 프로모터 기능은 요소들이 서로 역위되거나 상대적으로 이동될 때 보존된다. tk 프로모터의 경우, 프로모터 요소 사이의 공간은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50 bp까지 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개개 요소는 상호협력하여 또는 독립적으로 작용하여 전사를 활성화할 수 있는 것으로 나타난다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 연루된 시스-작용성 조절 서열을 가리키는 "인핸서"와 협력하여 사용될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
프로모터는 암호화 세그먼트 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-암호화 서열을 분리함으로써 수득할 수 있는 것처럼 핵산 서열과 천연적으로 회합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"이라고 언급될 수 있다. 마찬가지로, 인핸서는 핵산 서열의 하류 또는 상류에 위치하여 그 핵산 서열과 천연적으로 회합된 것일 수 있다. 다르게는, 암호화 핵산 세그먼트를 재조합 또는 이종 프로모터의 조절하에 배치함으로써 특정한 이점을 얻을 수 있고, 그러한 프로모터는 이의 천연 환경에서 핵산 서열과 보통 회합되어 있지 않은 프로모터를 말한다. 재조합 또는 이종 인핸서 또한 이의 천연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 회합되지 않은 인핸서를 지칭한다. 이와 같은 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자들의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 바이러스 또는 원핵 또는 진핵 세포로부터 분리된 프로모터 또는 인핸서 및 "천연적으로 발생"하지 않는, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현에 변경을 주는 돌연변이를 함유한 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 작제에서 가장 흔히 사용되는 프로모터는 β-락타마제(페니실리나제), 락토스 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템을 포함한다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 제조하는 것에 더하여, 이들 서열은 본 명세서에 기술된 조성과 관련하여, 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술(PCR(상표명)을 포함)을 사용하여 생성할 수 있다(본 명세서에 각각 참고로 포함되는 미국 특허 제4,683,202호 및 제5,928,906호 참조). 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 세포소기관내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 조절 서열이 사용될 수 있음이 고려된다.
당연히, 발현을 위해 선택된 세포소기관, 세포 유형, 조직, 기관 또는 유기체에서 DNA 세그먼트의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것은 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 전문가는 일반적으로 단백질의 발현을 위해 조합적으로 프로모터, 인핸서 및 세포 유형을 사용하는 것에 대해 알고 있다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Sambrook et al., 1989] 참조). 사용된 프로모터는 도입된 DNA 세그먼트의 고 수준 발현을 지시하기에 적절한 조건하에서 구성적, 조직-특이적, 유도적이고/이거나 유용할 수 있으며, 예를 들면 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 대량 생성에 유리하다. 프로모터는 이종 또는 내인성일 수 있다.
추가로, 임의의 프로모터/인핸서 조합(예를 들어, www.epd.isb-sib.ch/을 통한 진핵세포 프로모터 데이터 베이스 EPDB에 따라)은 발현을 가동하기 위해 사용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른 가능한 실시형태이다. 진핵세포는 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전자 발현 작제물로서 적절한 박테리아 중합효소가 제공되는 경우 특정 박테리아 프로모터로부터 세포질 전사를 진행할 수 있다.
프로모터의 비한정적인 예는 조기 또는 후기 바이러스 프로모터, 예를 들어, SV40 조기 또는 후기 프로모터, 사이토메갈로 바이러스(CMV) 즉시 조기 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 초기 프로모터; 진핵세포 프로모터, 예를 들어, 베타 액틴 프로모터(문헌[Ng, 1989; Quitsche et al., 1989]), GADPH 프로모터(문헌[Alexander et al., 1988; Ercolani et al., 1988]), 메탈로티오네인 프로모터(문헌[Karin et al., 1989; Richards et al., 1984]); 및 연쇄적 반응 요소 프로모터, 예를 들어, 사이클릭 AMP 반응 요소 프모모터(cre), 혈청 반응 요소 프로모터(sre), 포르볼 에스테르 프로모터(TPA) 및 최소 TATA 박스에 근접한 반응 요소 프로모터(tre)를 포함한다. 또한, 인간 성장 호르몬 프로모터 서열(예를 들어, Genbank 수탁 번호 X05244에서 기술된 인간 성장 호르몬 최소 프로모터, 뉴클레오티드 283-341) 또는 마우스 유방 종양 프로모터(ATCC 카달로그 번호 45007로서 ATCC로부터 입수가능함)를 사용하는 것도 가능하다. 특정 예는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터일 수 있다.
ii . 프로테아제 절단 부위/자가-절단 펩티드 및 내부 리보솜 결합 부위
특정 태양에서, 본 발명에 따라 마커 또는 리프로그래밍 단백질을 암호화하는 유전자가 프로테아제 절단 부위(즉, 프로테아제의 인식 부위를 포함한 서열) 또는 적어도 하나의 자가-절단 펩티드를 암호화하는 서열(하나 이상일 수 있다)에 의해 서로 연결될 수 있다. 예를 들어, 적어도 2개의 리프로그래밍 인자 유전자를 포함하는 폴리시스트론성 메시지는 본 발명의 특정 태양에 사용될 수 있다(예컨대, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제12/539,366호 참조).
본 발명의 특정 실시형태에 따라, 폴리시스트론성 메시지를 구성하는 유전자를 연결하는 서열(들)에 의해 암호화된 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 특히, 프로테아제(들)를 암호화하는 유전자(들)는 폴리시스트론성 메시지 중 적어도 하나의 일부이다.
적합한 프로테아제 절단 부위 및 자가-절단 펩티드는 전문가에게 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Ryan et al., 1997; Scymczak et al., 2004] 참조). 프로테아제 절단 부위의 바람직한 예는 포티바이러스 NIa 프로테아제(예를 들어, 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus) 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1(P35) 프로테아제, 바이오바이러스 Nla 프로테아제, 바이오바이러스 RNA-2-암호화된 프로테아제, 아프토바이러스 L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 피코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스 24K 프로테아제, RTSV(벼 퉁그로 구형 바이러스) 3C-유사 프로테아제, PY＼IF(파스닙 옐로우 플렉 바이러스) 3C-유사 프로테아제, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나제의 절단 부위이다. TEV(담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 부위는 이의 높은 절단 엄격성으로 인해 사용될 수 있다.
예시적인 자가-절단 펩티드(또한, "시스-작용성 가수분해 요소"(CHYSEL)라고도 한다: 문헌[deFelipe (2002)] 참조)는 포티바이러스 및 카디오바이러스 2A 펩티드로부터 유도된다. 특정 자가-절단 펩티드는 FMDV(구제역 바이러스), A형 말 비염 바이러스, 토세아 아사인아(Thosea asigna) 바이러스 및 돼지 테스코바이러스로부터 유도된 2A 펩티드 중에서 선택될 수 있다.
특정 개시 신호는 또한 폴리시스트론성 메시지에서 암호 서열의 효율적인 번역을 위해 사용될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 번역 조절 신호가 제공될 필요가 있을 수 있다. 해당 분야에 통상의 지식을 가진 자는 이것을 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있다. 개시 코돈은 목적하는 암호화 서열의 판독 프레임과 함께 이 전체 삽입체의 번역을 보장할 수 있도록 "프레임내"에 있어야 하는 것은 잘 알려져 있다. 외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소의 포함에 의해 증가될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 요소를 사용하여 다유전자 또는 폴리시스트론성 메시지를 생성한다. IRES 요소는 5' 메틸화 Cap 의존성 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서 번역을 개시할 수 있다(문헌[Pelletier and Sonenberg, 1988]). 피코르나바이러스 패밀리의 2개의 구성원(폴리오 및 뇌심근염)으로부터의 IRES 요소(문헌[Pelletier and Sonenberg, 1988])뿐만 아니라 포유류 메시지로부터의 IRES(문헌[Macejak and Sarnow, 1991])가 공개되어 있다. IRES 요소는 이종 개방 판독 프레임에 연결될 수 있다. 복수의 개방 판독 프레임은 각각 IRES에 의해 격리되어 있으면서 함께 전사되어 폴리시스트론성 메시지를 생성할 수 있다. IRES 요소로 인해, 각 개방 판독 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근이 용이하다. 다수의 유전자들은 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 단일 메시지를 전사하여 효율적으로 발현될 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호 참조).
iii . 다중 클로닝 부위
벡터는 다수의 제한 효소 부위를 함유한 핵산 영역인 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있고, 그들 중 어떠한 것도 표준 재조합 기술과 함께 사용하여 그 벡터를 분해할 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Carbonelli et al., 1999; Levenson et al., 1998; 및 Cocea, 1997] 참조). "제한 효소 분해"는 핵산 분자의 특정 위치에서만 작용하는 효소에 의한 핵산 분자의 촉매적 절단을 지칭한다. 이들 제한 효소 중 많은 것들이 시판되고 있다. 이러한 효소의 사용은 해당 분야의 전문가에게 널리 이해되고 있다. 흔히, 벡터는 외인성 서열이 이 벡터에 라이게이션되도록 MCS내에서 절단하는 제한 효소를 사용하여 직선형으로 되거나 단편된다. "라이게이션"은 서로 인접할 수 있거나 인접하지 않을 수 있는 두 핵산 단편 사이의 포스포다이에스테르 결합을 형성하는 과정을 지칭한다. 제한 효소 및 라이게이션 반응과 관련된 기술은 재조합 기술의 분야에 속하는 전문가에게 잘 알려져 있다.
iv . 스플라이싱 부위
대부분의 전사된 진핵세포 RNA 분자는 RNA 스플라이싱이 진행되어 일차 전사물로부터 인트론이 제거될 것이다. 게놈 진핵 서열을 함유한 벡터는 단백질 발현을 위해 적절한 전사물 프로세싱을 보장하기 위해 공여 및/또는 수용 스플라이싱 부위를 필요로 할 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Chandler et al., 1997] 참조).
v. 종결 신호
본 발명의 벡터 또는 작제물은 일반적으로 하나 이상의 종결 신호를 포함한다. "종결 신호" 또는 "터미네이터"는 RNA 중합효소에 의한 RNA 전사물의 특이적 종결에 연루된 DNA 서열로 구성된다. 따라서, 특정 실시형태에서, RNA 전사물의 생성을 종결시키는 종결 신호가 고려된다. 터미네이터는 원하는 메시지 수준을 달성하기 위해 생체내에서 필요할 수 있다.
진핵세포 시스템에서, 터미네이터 영역은 또한 폴리아데닐화 부위가 노출되도록 새로운 전사물의 부위-특정 절단을 허용하는 특이적 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이것은 특화된 내인성 중합효소에 신호를 전달하여 전사물의 3' 말단에 약 200개 A 잔기의 연쇄(폴리 A)를 부가한다. 이 폴리A 꼬리로 변형된 RNA 분자는 보다 안정화하고 더욱 효율적으로 번역된다. 따라서, 진핵세포와 연관된 다른 실시형태에서, 터미네이터는 RNA의 절단을 위한 신호를 포함하는 것이 바람직하며, 터미네이터 신호가 메시지의 폴리아데닐화를 촉진하는 것이 더욱 바람직하다. 터미네이터 및/또는 폴리아데닐화 부위 요소는 메시지 수준을 증가시키고 카세트로부터 다른 서열로의 판독을 최소화하는 역할을 할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위해 고려되는 터미네이터는 본 명세서에 기술되어 있거나 해당 분야의 전문가에게 알려진 모든 터미네이터를 포함하며, 이들로 한정되는 것은 아니지만 예로는 소 성장 호르몬 터미네이터와 같은 유전자의 종결 서열 또는 SV40 터미네이터와 같은 바이러스 종결 서열을 들 수 있다. 특정 실시형태에서, 종결 신호는 예를 들어 서열 절단으로 인해 전사가능한 서열 또는 번역가능한 서열이 결손될 수 있다.
vi . 폴리아데닐화 신호
발현, 특히 진핵세포 발현에서, 전형적으로 전사물의 적절한 폴리아데닐화를 유도하는 폴리아데닐화 신호가 포함된다. 폴리아데닐화 신호의 성질은 본 발명의 성공적인 실시를 위해 중요한 것은 아니며, 어떠한 그러한 서열도 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태는 다양한 표적 세포에서 편리하고 잘 작용하는 것으로 알려진 SV40 폴리아데닐화 신호 또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리아데닐화는 전사물의 안정성을 증가시킬 수 있거나 세포질 이송을 촉진할 수 있다.
vii . 복제 원점
벡터를 숙주 세포에서 증식시키기 위해, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 하나 이상의 복제 원점 부위(흔히 "ori"라고 한다), 예를 들어 상기된 EBV의 oriP에 상응하는 핵산 서열 또는 유전자조작되어 분화 프로그래밍에서 유사하거나 향상된 기능을 갖는 oriP가 벡터에 함유될 수 있다. 대안으로서, 상기된 염색체외 복제 바이러스 또는 자가 복제 서열(ARS)의 복제 원점이 사용될 수 있다.
viii . 선택 및 선별 마커
본 발명의 특정 실시형태에서, 본 발명의 핵산 작제물을 함유한 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시킴으로써 시험관내에서 또는 생체내에서 동정할 수 있다. 이러한 마커는 세포에 동정가능한 변화를 부여하여 발현 벡터를 함유한 세포의 간편한 동정을 가능케 한다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 가능케 하는 성질을 부여하는 것이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 허용하는 것인 반면, 음성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 억제하는 것이다. 양성 선택 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
보통 약물 선택 마커의 삽입은 형질전환체의 클로닝 및 동정을 보조하며, 예로서 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대해 내성을 부여하는 유전자가 유용한 선택 마커이다. 조건의 이행을 기초로 한 형질전환체의 분별을 허용하는 표현형을 부여하는 마커이외에, 색도 분석을 기초로 하는 GFP와 같은 선별 마커를 포함한 다른 유형의 마커들도 고려된다. 다르게는, 음성 선택 마커로서 선별 효소, 예를 들어 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)가 사용될 수 있다. 해당 분야의 전문가는 또한 면역학적 마커를 가능한 FACS 분석과 함께 사용하는 방법을 알고 있다. 사용된 마커는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요한 것은 아니다. 선택 및 선별 마커의 추가적인 예는 해당 분야의 전문가에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 한 가지 특징은 선택 및 선별 마커를 사용하여, 분화 프로그래밍 인자가 세포에서 목적하는 변화된 분화 상태에 영향을 미친 후, 무벡터 세포를 선택하는 것을 포함한다.
C. 벡터 전달
본 발명에 따른 체세포 내로의 리프로그래밍 벡터의 도입은, 본 명세서에 기술된 바와 같은 또는 해당 분야에 통상의 지식을 가진자에게 알려져 있는 바와 같이, 세포의 형질전환을 위해 핵산을 전달하는데 적합한 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 이러한 방법은 이들로 한정되는 것은 아니지만 생체외 트랜스펙션(문헌[Wilson et al., 1989; Nabel et al., 1989])에 의한, 미세주입(본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Harland and Weinstraub, 1985], 미국 특허 제5,789,215호)을 포함한 주입(본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호)에 의한; 전기천공(본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,384,253호; 문헌[Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984])에 의한; 인산칼슘 침전(문헌[Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990])에 의한; DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜(문헌[Gopal, 1985])을 사용함으로써; 직접적인 음파 부하(문헌[Fechheimer et al., 1987])에 의한; 리포좀 매개의 트랜스펙션(문헌[Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991]) 및 수용체-매개의 트랜스펙션(문헌[Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988])에 의한; 미세입자투사(본 명세서에 참고로 포함되는 PCT 특허 공개 WO 94/09699호 및 WO 95/06128; 미국 특허 제5,610,042호, 제5,322,783호, 제5,563,055호, 제5,550,318호, 제5,538,877호 및 제5,538,880호)에 의한; 탄화규소 섬유와의 교반(본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Kaeppler et al., 1990]; 미국 특허 5,302,523호 및 5,464,765호)에 의한; 아그로박테리움-매개의 형질전환(본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,591,616호 및 제5,563,055호)에 의한; 원형질체의 PEG-매개의 형질전환(본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Omirulleh et al., 1993]; 미국 특허 제4,684,611호 및 제4,952,500호)에 의한; 건조/억제-매개의 DNA 흡수(문헌[Potrykus et al., 1985])에 의한 및 상기 방법의 조합에 의한 DNA의 직접적인 전달을 포함한다. 이와 같은 기술의 응용을 통해, 세포소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)는 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
i. 리포솜-매개의 트랜스펙션
본 발명의 특정 실시형태에서, 핵산은 예를 들어 리포솜과 같은 지질 복합체내에 포획될 수 있다. 리포솜은 인지질 이중막과 내부의 수성 매질로 특징되는 액포 구조일 수 있다. 다층 리포솜은 수성 매질로 격리된 다중 지질층을 갖는다. 이들은 인지질이 다량의 수용액 중에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 밀폐 구조의 형성 전에 자가-재배열을 이루고 물과 용해된 용질을 지질 2층 사이에 포획한다(문헌[Ghosh and Bachhawat, 1991]). 또한, 리포펙타민(Lipofectamine)(집코 BRL) 또는 슈퍼펙트(Superfect)(퀴아젠(Qiagen))와의 핵산 복합체가 고려된다. 리포솜의 사용량은 리포솜의 성질뿐만 아니라 사용된 세포에 따라 다양할 수 있으며, 예를 들어 세포 1개 내지 천만개 당 약 5 내지 약 20㎍의 벡터 DNA가 고려될 수 있다.
시험관내 외인성 DNA의 리포솜-매개의 핵산 전달 및 발현은 아주 성공적이었다(문헌[Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987]). 또한, 배양된 닭 배아, HeLa 및 간암 세포에서 외인성 DNA의 리포솜-조절된 전달 및 발현의 가능성이 입증되었다(문헌[Wong et al., 1980]).
본 발명의 특정 실시형태에서, 리포솜이 혈구응집 바이러스(HVJ)와 복합체를 형성할 수 있다. 이것은 세포막과의 융합을 촉진하고 리포솜-캡슐화된 DNA의 세포 유입을 증강시키는 것으로 제시되었다(문헌[Kaneda et al., 1989]). 다른 실시형태로서, 리포솜은 핵 비-히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 복합체를 형성하거나 그와 함께 사용될 수 있다(문헌[Kato et al., 1991]). 추가의 실시형태로서, 리포솜은 HVJ와 HMG-1 모두와 복합체를 형성하거나 이들과 함께 사용될 수 있다. 다른 실시형태로서, 전달 비히클은 리간드 및 리포솜을 포함할 수 있다.
ii . 전기천공
본 발명의 특정 실시형태에서, 전기천공을 통해 핵산이 세포 내로 도입된다. 천기천공은 고전압 방전에의 세포와 DNA의 현탁액의 노출을 포함한다. 수용체 세포는 기계적 손상에 의한 형질전환에 더 민감해 질 수 있다. 또한, 벡터의 사용량은 사용된 세포의 성질에 따라 다양할 수 있으며, 예를 들어 세포 1개 내지 천만개 당 약 5 내지 약 20㎍의 벡터 DNA가 고려될 수 있다.
전기천공을 이용한 진핵 세포의 트랜스펙션은 아주 성공적이었다. 이 방법으로, 마우스 전-B 림프구가 인간 카파-면역글로불린 유전자로 트랜스펙션되었고(문헌[Potter et al., 1984]), 랫트 간세포가 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자로 트랜스펙션되었다(문헌[Tur-Kaspa et al., 1986]).
iii . 인산칼슘
본 발명의 다른 실시형태로서, 인산칼슘 침전을 이용하여 핵산을 세포로 도입한다. 이 기술을 사용하여 인간 KB 세포가 아데노바이러스 5 DNA로 트랜스펙션되었다(문헌[Graham and Van Der Eb, 1973]). 또한, 이 방법으로, 마우스 L(A9), 마우스 C127, CHO, CV-1, BHK, NIH3T3 및 HeLa 세포가 네오마이신 마커 유전자로 트랜스펙션되었고(문헌[Chen and Okayama, 1987]), 랫트 간세포가 여러 가지 마커 유전자로 트랜스펙션되었다(문헌[Rippe et al., 1990]).
iv . DEAE - 덱스트란
다른 실시형태에서, DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 핵산을 세포 내로 전달하였다. 이 방법으로, 리포터 플라스미드가 마우스 골수종 및 적백혈병 세포 내로 도입되었다(문헌[Gopal, 1985]).
VII . 리프로그래밍 인자
iPS 세포의 생성에 있어서 유도를 위해 사용되는 재프그래밍 인자는 결정적이다. 본 발명에 기술된 방법에서 다음의 인자 또는 이들의 배합이 사용될 수 있었다. 특정 태양에서, Sox 및 Oct(특히 Oct3/4)를 암호화한 핵산이 리프로그래밍 벡터 내로 포함된다. 예를 들어, 하나 이상의 리프로그래밍 벡터는 Sox2, Oct4, Nanog 및 임의로 Lin28를 암호화한 발현 카세트 또는 Sox2, Oct4, Klf4 및 임의로 C-myc 또는 L-myc를 암호화한 발현 카세트 또는 Sox2, Oct4 및 임의로 Esrrb를 암호화한 발현 카세트 또는 Sox2, Oct4, Nanog, Lin28, Klf4, C-myc 또는 L-myc 중 어느 하나 및 임의로 SV40 거대 T 항원을 암호화한 발현 카세트를 포함할 수 있다. 이들 리프로그래밍 인자를 암호화한 핵산은 동일한 발현 카세트, 상이한 발현 카세트, 동일한 리프로그래밍 벡터 또는 상이한 리프로그래밍 벡터 내에 포함될 수 있다.
Oct4 및 Sox 유전자 패밀리의 특정 구성원(Sox1, Sox2, Sox3 및 Sox15)은 유도 과정에 연루된 결정적인 전사 조절 인자로 동정되었고, 이들이 존재하지 않는 경우 유도가 불가능하다. 그러나, Klf 패밀리의 특정 구성원(Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5), Myc 패밀리의 특정 구성원(c-Myc, L-Myc 및 N-Myc), Nanog 및 Lin28을 포함한 추가의 유전자들이 유도 효율을 증가시켜 주는 것으로 동정되었다.
Oct4(Pou5fl)는 옥타머("Oct") 전사 인자의 패밀리 중 하나이며 만능성을 유지하는데 결정적인 역할을 한다. 할구 및 배아 줄기 세포와 같은 Oct4+ 세포에서 Oct4의 부재는 자발적인 영양막 분화를 유도하며, 따라서 Oct4의 존재는 배아 줄기 세포의 만능성 및 분화 잠재성을 생기게 한다. Oct4의 가까운 동족인 Oct1 및 Oct6을 포함한 "Oct" 계통의 여러 가지 다른 유전자는 유도를 발휘하지 못하며, 이 결과는 유도 과정에 Oct-4의 유일성을 증명한다.
Sox 유전자 패밀리는, 비록 이것이 만능성 줄기 세포에서 유일하게 발현되는 Oct4와 대조적으로 다능성 및 단일분화성 줄기 세포와 연관되어 있지만, Oct4와 유사하게 만능성을 유지하는데 관련이 있다. Sox2는 리프로그래밍 유도를 위해 사용된 최초 유전자인 한편, Sox 계통의 다른 유전자들이 또한 유도 과정에서 작용하는 것으로 밝혀졌다. Sox1은 Sox2와 유사한 효율로 iPS 세포를 생성하며, 유전자 Sox3, Sox15 및 Sox18은 비록 효율이 떨어지긴 하지만 iPS 세포를 생성한다.
배아 줄기 세포에서 Nanog는 Oct4 및 Sox2와 함께 만능성을 촉진하는데 필요하다. 따라서, 야마나카(Yamanaka) 등이 Nanog는 비록 톰슨(Thomson) 등이 인자들 중 하나인 Nanog로 iPS 세포를 생성하는 것이 가능하다고 발표했지만 유도를 위해 불필요했다고 발표했을 때 놀라운 것이었다.
Lin28은 분화 및 증식과 연관된 배아 줄기 세포 및 배아 암 세포에서 발현된 mRNA 결합 단백질이다. 톰슨 등은 Lin28이 비록 불필요하지만 iPS 생성에 연루된 인자임을 증명하였다.
Klf 패밀리 유전자 중 Klf4는 마우스 iPS 세포의 생성을 위한 인자로서 야마나카 등에 의해 최초로 동정되고 야니쉬(Jaenisch) 등에 의해 검증되었으며, 인간 iPS 세포의 생성을 위한 인자로서 야마나카 등에 의해 증명되었다. 그러나, 톰슨 등은 Klf4가 인간 iPS 세포의 생성을 위해 불필요하였다고 발표하였고, 실제로 인간 iPS 세포를 생성하는데 실패하였다. Klf2 및 Klf4는 iPS 세포를 생성할 수 있는 인자인 것으로 밝혀졌으며, 연관된 유전자 Klf1 및 Klf5는 비록 효율이 떨어지지만 마찬가지로 iPS 세포를 생성하였다.
Myc 패밀리 유전자는 암에 연루된 원암 유전자이다. 야마나카 등 및 야니쉬 등은 c-Myc가 마우스 iPS 세포의 생성에 연루된 인자임을 증명하였고, 야마나카 등은 c-Myc가 인간 iPS 세포의 생성에 연루된 인자임을 입증하였다. 그러나, 톰슨 등 및 야마나카 등은 c-Myc가 인간 iPS 세포의 생성을 위해 불필요하였음을 발표하였다. iPS 세포의 유도에 "Myc" 패밀리 유전자를 사용하는 것은, c-Myc-유도된 iPS 세포가 이식된 마우스의 25%가 치명적인 기형종을 발생하였기 때문에, 임상 치료제로서 iPS 세포의 예측 불허 사태로 인해 곤란하다. N-Myc 및 L-Myc가 유사한 효율로 c-Myc 대신에 유도하는 것으로 동정되었다.
SV40 거대 항원이 c-Myc가 발현될 때 일어날 수 있는 세포독성을 경감시키거나 예방하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 리프로그래밍 단백질은 거의 동일한 리프로그래밍 기능을 갖는 단백질 상동체로 대체될 수 있다. 또한, 이러한 상동체를 암호화한 핵산이 리프로그래밍을 위해 사용될 수 있다. 보존적 아미노산 치환이 바람직하다: 즉, 예를 들면, 극성 산성 아미노산으로서 아스파르트산-글루탐산; 극성 염기성 아미노산으로서 리신/아르기닌/히스티딘; 비극성 또는 소수성 아미노산으로서 류신/이소류신/메티오닌/발린/알라닌/글리신/프롤린; 극성 또는 비하전된 친수성 아미노산으로서 세린/트레오닌. 보존적 아미노산 치환은 또한 측쇄를 기초로 하여 분류된 그룹을 포함한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 예를 들면, 류신을 아이소류신 또는 발린으로, 아스파테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로의 치환 또는 아미노산을 구조적으로 연관된 아미노산으로의 유사한 치환은 생성된 폴리펩티드의 성질에 중요한 영향을 갖지 않을 것으로 기대하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능성 폴리펩티드를 생성하는가의 여부는 그 폴리펩티드의 특이적 활성을 검정함으로써 쉽게 결정될 수 있다.
VIII . iPS 세포의 선택 및 분화
본 발명의 특정 태양에서, 리프로그래밍 인자가 조혈 전구 세포 내로 도입된 후, 세포는 상술된 바와 같이 배양될 것이다(임의로 양성 선택 또는 선택 마커와 같은 벡터 요소의 존재에 대해 선택하여 트랜스펙션된 세포를 농축한다). 리프로그래밍 벡터는 이들 세포에서 리프로그래밍 인자를 발현하고 세포 분열에 따라 복제하고 분배할 수 있다. 대안으로서, 리프로그래밍 단백질을 함유한 배지를 보충함으로써 리프로그래밍 단백질이 이들 세포 및 자손내로 유입될 수 있다. 이들 리프로그래밍 인자는 보충적인 리프로그래밍 단백질을 첨가할 필요 없이, 체세포 게놈을 리프로그래밍하여 자가-지속적인 만능 상태를 설정하고, 벡터의 존재에 대한 양성 선택의 제거 내내 또는 후에 외인성 유전 요소가 점차 소실될 것이다.
이들 유도된 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포 특징을 기초로 하여 그들 말초 혈액 세포로부터 유도된 자손으로부터 선택될 수 있고, 그 이유는 이들 유도 세포는 만능 배아 줄기 세포와 실질적으로 동일할 것으로 예상되기 때문이다. 또한, 리프로그래밍 벡터 DNA의 부재를 시험하거나 리포터와 같은 선택 마커를 사용함으로써 추가적인 음성 선택 단계를 사용하여 외인성 유전 요소가 실질적으로 없는 iPS 세포의 선택을 가속화하거나 보조할 수 있다.
A. 배아 줄기 세포 특징에 대한 선택
이전 연구로부터 성공적으로 생성된 iPSC는 아래의 관점에서 천연-분리된 만능 줄기 세포(예를 들어, 각각 마우스 배아 줄기 세포(mESC) 및 인간 배아 줄기 세포(hESC))와 상당히 유사하였고, 이에 따라 천연-분리된 만능 줄기 세포에 대한 iPSC의 아이덴티티, 진정성 및 만능성을 검증하였다. 따라서, 본 발명에 기술된 방법으로부터 생성된 유도 만능 줄기 세포는 아래의 배아 줄기 세포 특징 중 하나 이상을 기초로 하여 선택할 수 있다.
i. 세포생물학적 성질
형태학: iPSC는 형태학적으로 ESC와 유사하다. 각 세포는 둥근 모양을 갖고, 이중 핵 또는 거대 핵을 갖고, 세포질이 빈 상태일 수 있다. 또한, iPSC의 콜로니가 ESC의 콜로니와 유사하다. 인간 iPSC는 hESC와 유사하게 가장자리가 예리하고, 편평하며, 조밀하게 다져진 콜로니를 형성하고, 마우스 iPSC는 mESC와 유사하게 hESC의 것보다 덜 편평하고 더 응집된 콜로니를 형성한다.
성장 특성: 줄기 세포는 이들을 정의하는 일부분으로서 자기-재생해야하기 때문에, 배가 시간 및 유사분열 활성은 ESC의 초석이 된다. iPSC는 ESC와 동일한 속도로 유사분열, 자기-재생, 증식 및 분열이 활발하다.
줄기 세포 마커: iPSC는 ESC 상에서 발현된 세포 표면 항원 마커를 발현할 수 있다. 인간 iPSC는 hESC에 특이적인 마커를 발현하였고, 이들로 한정하는 것은 아니지만 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E 및 Nanog를 포함한다. 마우스 iPSC는 mESC와 유사하게 SSEA-1을 발현하였지만 SSEA-3과 SSEA-4는 발현하지 않았다.
줄기 세포 유전자: iPSC는 미분화된 ESC에 발현된 유전자를 발현할 수 있으며 Oct4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 및 hTERT를 포함한다.
텔로머라제 활성: 텔로머라제는 약 50회 세포 분열의 헤이플릭(Hayflick) 분열한계로 제한된 세포 분열을 지속시키는데 필요하다. hESC는 고도의 텔로머라제 활성을 발현하여 자기-재생 및 증식을 지속하며, iPSC 또한 고도의 텔로머라제 활성을 증명하고 텔로머라제 단백질 복합체에 필요한 성분인 hTERT(인간 텔로머라제 역전사효소)를 발현한다.
만능성: iPSC는 ESC와 유사한 태양으로 완전히 분화된 조직으로 분화할 수 있다.
신경세포 분화: iPSC는 신경세포로 분화할 수 있고, βIII-튜불린, 티로신 하이드록실라제, AADC, DAT, ChAT, LMX1B 및 MAP2를 발현한다. 카테콜아민-연관된 효소의 존재는 iPSC가 hESC 처럼 도파민성 신경세포로 분화할 수 있음을 지칭한다. 줄기 세포-연관된 유전자는 분화 후 하향조절될 것이다.
심장 분화: iPSC는 자발적으로 박동하기 시작하는 심근세포로 분화할 수 있다. 심근세포는 cTnT, MEF2C, MYL2A, MYHCβ 및 NKX2.5를 발현한다. 줄기 세포-연관된 유전자는 분화 후 하향조절될 것이다.
기형종 형성: 면역결핍 마우스 내로 주사된 iPSC는 특정 시간, 예를 들어, 9주 후에 자발적으로 기형종을 형성할 수 있다. 기형종은 3가지 배엽층, 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로부터 유도된 조직을 함유한 다중 계통의 종양이고; 이것은 전형적으로 단지 하나의 세포 유형인 다른 종양과 다르다. 기형종 형성은 만능성을 위한 표지 시험이다.
배아유사체: 배양중의 hESC는 활발히 유사분열하고 분화하는 hESC의 중심과 3가지 모든 배엽층으로부터 완전히 분화된 세포의 주변으로 구성된 "배아 유사체"라고 하는 공-유사, 배아-유사 구조를 자발적으로 형성한다. iPSC 또한 배아유사체를 형성할 수 있으며 말초 분화 세포를 갖는다.
배반포 주사: hESC는 배반포의 내부 세포 덩어리(배아모체)에 내재하고 배아로 분화하는 한편 배반포의 외막(영양막)은 배외조직으로 분화한다. 공동 영양막은 살아있는 배아를 형성할 수 없으며 따라서 배아모체내의 배아 줄기 세포가 분화하여 배아를 형성하는 것이 필요하다. 수혜 암컷에 전달된 배반포를 발생하기 위해 영양막 내로 마이크로피펫에 의해 주사된 iPSC는 살아있는 키메라 마우스 새끼로 나타날 수 있다: iPSC 유도체가 10%-90 및 키메리즘으로 몸체 전반에 걸쳐 혼입된 마우스.
ii . 후생적 리프로그래밍
프로모터 탈메틸화: 메틸화는 DNA 염기에 메틸기의 전달, 전형적으로 CpG 부위(인접한 시토신/구아닌 서열)에서 시토신 분자에의 메틸기의 전달이다. 유전자의 광범위한 메틸화는 발현 단백질의 활성을 억제함으로써 또는 발현을 차단하는 효소를 모집함으로써 발현을 차단한다. 따라서, 유전자의 메틸화는 전사를 억제함으로써 유전자를 효과적으로 발현 억제시킨다. Oct4, Rex1 및 Nanog를 포함한 만능성-연관된 유전자의 프로모터가 iPSC에서 탈메틸화될 수 있으며, iPSC에서 그들 유전자의 프로모터 활성 및 만능성-연관된 유전자의 활발한 작동 및 발현을 보여준다.
히스톤 탈메틸화: 히스톤은 다양한 염색질-관련된 변형을 통해 히스톤 단백질의 활성에 영향을 미칠 수 있는 DNA 서열과 구조적으로 결합되어 있는 조밀한 단백질이다. Oct/4, Sox2 및 Nanog와 연관된 H3 히스톤을 탈메틸화하여 Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현을 활성화할 수 있다.
B. 무잔기 특징에 대한 선택
본 발명에서 oriP-기반의 백터와 같은 리프로그래밍 벡터는 염색체외에서 복제할 수 있고 세대에 걸쳐 숙주 세포에서 소실될 수 있다. 그러나, 외인성 벡터 요소를 필수적으로 함유하지 않는 자손 세포에 대한 추가적인 선별 단계는 위 과정을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 자손 세포의 시료를 해당 분야에 공지된 바와 같이(문헌[Leight and Sugden, 2001]) 추출하여 외인성 벡터 요소의 존재 또는 소실을 검사할 수 있다.
리프로그래밍 벡터는 추가로 선별 마커, 보다 특정적으로는 음성 선별 마커(예, 선별 마커를 필수적으로 함유하지 않는 자손 세포를 선별하기 위한 티미딘 키나제 암호화 유전자)를 포함할 수 있다. 인간 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 1형 유전자(HSVtk)는 포유류 세포에서 조건적 치사 마커로서 작용한다. HSVtk-암호화된 효소는 특정 뉴클레오사이드 유사체(항헤르페스바이러스 약물인 겐사이클로비어)를 인산화할 수 있으며, 이에 따라 이들 유사체를 독성 DNA 복제 억제제로 전환시킨다. 대안적 방법 또는 보완적 방법은 RTPCR, PCR, FISH(형광동소혼성화), 유전자 어레이 또는 혼성화(예를 들어, 써던 블롯)와 같은 통상적인 방법을 이용하여 후손 세포 내 외인성 유전적 요소의 부재를 검사하는 것이다.
C. iPS 세포의 분화
본 발명에서 다양한 방법을 사용하여 iPS 세포를 이들로 한정되는 것은 아니지만 조혈 세포, 근세포(예를 들어, 심근 세포), 신경세포, 섬유아세포 및 상피세포를 포함한 세포 계통 및 이로부터 유도된 조직 또는 기관으로 분화시킬 수 있다. iPS 세포의 조혈 분화의 예시적인 방법은 예를 들어 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 제61/088,054호 및 제61/156,304호에 기술된 방법 또는 배아유사체(EB)-기반의 방법(문헌[Chadwick et al., 2003; Ng et al., 2005])을 포함할 수 있다. 또한, 문헌[Wang et al., 2007]에 예시된 바와 같이 피브로넥틴 분화 방법이 혈액 계통 분화를 위해 사용될 수 있다. iPS 세포의 심장 분화의 예시적인 방법은 배아유사체(EB) 방법(문헌[Zhang, et al., 2009]), OP9 간질 세포 방법(문헌[Narazaki, et al., 2008]) 또는 성장 인자/화학적 방법(전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 공개 제20080038820호, 제20080226558호, 제20080254003호 및 제20090047739호 참조)을 포함할 수 있다.
IX . 실시예
하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 증명하기 위해 포함된다. 해당 분야의 전문가라면 아래 실시예를 통해 공개된 기술이 본 발명자에 의해 개발된 기술을 대표하여 본 발명을 실시하는데 잘 기능할 수 있음에 따라 본 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있음은 인정할 것이다. 그러나, 본 분의 전문가는 본 명세서에 기술된 내용의 측면에서 기술된 특정 실시형태에서 많은 변화가 이루어질 수 있으며 이러한 변화는 본 발명의 목적 및 범위를 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 제공할 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 1
조혈 전구 세포로부터의 iPS 세포의 생성
도 1에 예시된 바와 같이, 환자로부터의 보통의 비-동원 말초 혈액을 처리하여 PBMC를 수집하고, 정제하여 CD34를 발현하는 세포에 대하여 농축하였다. 그 다음, 그 세포를 씨딩하여, 증식되게 하고, 대략 씨딩 1주 내에 트랜스펙션시켰다. 그 다음, 그들에게 트랜스펙션-후 1일의 인큐베이션 기간에 이은 대략 1 내지 2일의 회복 기간을 허용하였으며, 100% 리프로그래밍 배지로 전이시켰다. 세포가 부착되고 성긴 콜로니가 분명히 나타나게 됨에 따라, 배지를 점차 TESR2로 전이시켜, iPS 세포의 형성을 지원하였다.
인간 전혈을 진공채혈관(vacutainer)(여기에 포함되는 1-50㎖ 범위의 부피)에서 수집하였다.
PBMC를 인간 전혈로부터 분리하고, 동결시키거나 또는 바로 처리하여 CD34 세포를 분리하였다.
CD34에 대하여 지정된 항체를 말초 혈액으로부터 처리하고 수동으로 또는 자동으로 분리한 PBMC에 적용하였다.
유세포분석(미국 미시간주 앤아버 소재의 아큐리(Accuri))에 의해 순도를 측정하여, CD34 및 더욱 일반적인 마커인 C45를 발현하는 세포의 백분율을 검출하여, 모든 조혈 전구 세포를 검출하였다. 분리된 분획의 순도는 CD34 발현에 대하여 20-96% 양성의 범위였다.
CD34 발현에 대하여 농축된 세포를 동결시키거나, 바로 DNAseI(20U/㎖)과 함께 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이러한 단계는 세포가 해동, 정제 등에 의해 조성되는 응력으로부터 용해되는 경우 방출되는 DNA의 제거를 가능하게 하며, 세포 엉김을 제한한다. 세포를 회전 침강시키고, DNAse를 함유하는 상층액을 제거하였다. 그 다음, 세포가 하룻밤 회복되게 놔두었다.
CD34 발현 세포는 사이토카인-풍부 배지를 사용하여 증식할 수 있다. 본 실시예에서, 단독의 사이토카인-풍부 배지가 적어도 3가지의 독립적인 경우에서 총 세포 개수를 증식시키는데 충분한 것이 관찰되었다.
사이토카인-풍부 배지: 각각 트롬보포이에틴(TPO), Flt3 및 줄기 세포 인자(SCF)의 300ng/㎖. 인터류킨 6(IL6)의 100ng/㎖ 및 인터류킨 3(IL3)의 10ng/㎖. 기초 배지는 소 혈청 알부민(BSA), 재조합 인간 인슐린, 철-포화 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 이소코브스(Iscove's) MDM 및 추가의 보충물(도 2a 내지 도 2c에 기질이 없는 것으로 정의됨)로 이루어져 있다. 바람직한 실시형태에서, BSA는 완전히 생략될 수 있다. 추가로, 완전히 정의된 성분을 이러한 배지에서 사용한다. 대안적으로, 상술된 농도의 동물 성분이 없는 TPO, Flt3, SCF, IL6 및 IL3이 보충된 스템스팬(StemSpan) H3000(스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies), 카달로그 번호 9850)을 사용할 수 있다.
CD34 발현 세포는 피브로넥틴 단편과 결합된 사이토카인-풍부 배지를 사용하여 증식할 수 있다. 본 실시예에서 CD34+ 세포가 피브로넥틴의 재조합 인간 단편의 존재 하에서 추가로 증식될 수 있음이 관찰되었다. 이는 574개 아미노산(63 kDa)이며, 중심의 세포-결합 도메인(III형 반복, 8, 9, 10), 고친화성 헤파린-결합 도메인 II(III형 반복 12, 13, 14) 및 인간 피브로넥틴의 대안적으로 스플라이싱된 IIICS 영역 내의 CS1 부위(타카라(Takara), 레트로넥틴(등록상표)으로부터 입수할 수 있음)를 함유한다. 피브로넥틴 단편은 5㎍/㎖로 PBS와 혼합하고, 미처리 조직 배양 플레이트 상에 배치하였다(도 2a 내지 도 2c에서 노치-로 정의).
C34 발현 세포는 동원된 조작 Ntch - 1 리간드 (델타 1 ext - IgG , DLL1 ) 및 피브로넥틴 단편과 결합된 사이토카인-풍부 배지를 사용하여 증식할 수 있다. 델라니(Delaney) 등은 노치-1 리간드를 사용한 제대혈로부터 100배 초과의 CD34+ 세포의 증식을 증명하였다(문헌[Delaney et al., 2010]). 본 실시예에서, 말초 혈액으로부터 유래된 CD34+ 세포가 또한 유사한 방법을 사용하여 노치-1 리간드의 존재 하에서 증식될 수 있음이 관찰되었다(도 2a 내지 도 2c에서 노치+로 정의). 리간드는 면역글로불린 G의 Fc 부분에 C-말단에서 융합된 재조합 델타-유사 단백질 1(DLL1; 아미노산 1-545)의 세포외 도메인을 나타내는 인간 펩티드이다.
기질 또는 노치-1 리간드 없이 CD34 + 세포의 증식. 본질적으로 웰 당 6×103개(24 웰 플레이트) 또는 웰 당 1×105개(6 웰 플레이트)로 씨딩하고, 이후 4일 동안 공급하고, 증식 후 6일에 트랜스펙션시켰다. 도 2a 내지 도 2c는 시간에 따른 증식 배수, 전체 집단의 성장 속도 및 기간 동안의 CD34 발현의 자연적인 감소를 나타낸다.
증식 6일 후에, 세포를 기질이 없는 조건으로부터 수집하고, oriP-레플리콘을 함유하는 플라스미드의 조합물로 트랜스펙션시켰다. 이들 플라스미드로부터 발현된 리프로그래밍 인자는 하기 것의 임의의 조합을 포함할 수 있다: Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, C-myc or L-myc, klf4, 및 SV40 대형 T-항원(도 3). 단일 큐벳 트랜스펙션을 위한 론자 뉴클레오펙터 디바이스(Lonza Nucleofector device) 또는 96 웰 셔틀(shuttle) 버전을 사용하여 2.5×104 내지 1.5×106개 세포를 트랜스펙션시켰다. 하기의 표 1은 CD34+ 세포를 포함하는 혈액-유래의 조혈 전구 세포 상에서 eGFP를 암호화하는 oriP-기반의 플라스미드를 사용한 트랜스펙션 후의 대표적인 결과를 보여준다. 표는 말초 혈액으로부터 증식된 투입 HP의 개수 증가를 사용한 시료 트랜스펙션으로부터의 결과를 반영한다. 세포를 리프로그래밍 인자에 대한 발현 카세트가 결여된 대조군 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 효율(GFP+%)은 프로피디움 요오드화물(PI)에 대하여 양성으로 염색되지 않은 집단의 백분율을 계산함으로써 결정하였다.
Figure 112013003320220-pct00001
트랜스펙션 후에, 세포를 증식에 사용한 것과 동일한 사이토카인-풍부 배지에서 재현탁화시키고 회복을 위해 하룻밤 인큐베이션시켰다. 다음날, 세포를 회전 침강시키고, 배지를 사이토카인-풍부 배지로 보충하고, 수용 플레이트를 준비하였다.
수용 리프로그래밍 플레이트 준비. 트랜스펙션 후 24시간에, 미처리된 6 웰 플레이트를 레트로넥틴(등록상표)(10㎍/웰)으로 코팅하였다.
트랜스펙션 후 48시간에, 플레이트를 PBS로 세척하고, 2% BSA로 블로킹하고, 다시 세척하였다. 임의로, 2% BSA 블로킹 단계를 동물 성분이 없는 배양 조건에 대해서 생략할 수 있다. 트랜스펙션된 세포를 리프로그래밍 배지(표 2)를 사용하여 2㎖의 세포가 웰 당 3×104 내지 3×105개 세포 범위의 밀도를 사용하여 준비된 수용 플레이트에 씨딩되게 하는 부피가 되게 하였다.
Figure 112013003320220-pct00002
리프로그래밍 배지의 공급. 세포에 격일로 공급하였다. 처음의 공급을 위하여, 2㎖의 배지를 각 웰에 첨가하고, 배지를 제거하지 않았다. 이후의 공급을 위하여, 2㎖을 각 웰로부터 서서히 제거하고, 새로운 배지를 보충하였다. 세포는 플레이팅-후 24시간에 부착되기 시작하며, 성긴 콜로니가 1주에 형성되기 시작하였다. 배양을 대략 7 내지 10일에 소분자가 없는 TESR2(스템셀 테크놀로지즈)로 전이시켰다. 이는 점진적인 이동을 나타낼 것인데, 이는 2㎖의 이전 배지가 남아있을 것이기 때문이다. 충분한 신선한 콜로니가 형성된다면, 더 많은 배지를 웰로부터 제거하여, 존재하는 대부분의 배지가 신선하게 하였다. 리프로그래밍되지 않고, 분화된 세포에 의해 둘러싸인 둥근 iPSC 콜로니는 트랜스펙션-후 대략 20일에 출현하였다. iPSC 콜로니를 둘러싸는 세포는 기질에 부착된 혈액 세포 또는 분화하기 시작하는 부분적으로 리프로그래밍된 세포를 나타낸다. 소분자 신호전달 억제제를 사용하여, 실제 iPSC 콜로니(Tral-81 양성)가 종종 더 성긴 비-iPSC 영역 내에 또는 더욱 분화된 세포 아래에 자리잡았다.
실시예 2
폴리시스트론성 리프로그래밍 벡터를 사용하여 조혈 전구 세포로부터의 iPS 세포의 생성의 최적화
폴리시스트론성 메시지를 함유하는 OriP-기반의 리프로그래밍 플라스미드의 개략적인 맵이 도 4에 나타나 있다(조합 세트 1 및 세트 2). PBMC로부터 정제된 세포를 3 또는 6일 동안 증식시켰다. 다양한 투입 세포 개수를 대조군인, GFP를 발현하는 oriP/EBNAl-기반의 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 공여자 GG로부터 3일 및 6일 증식된 PBMC를 상술된 바와 같은 리프로그래밍 플라스미드로 트랜스펙션시켰다.
성분채집에 의해 수집된 PBMC로부터 유래된 더 낮은 개수의 CD34-풍부 세포의 트랜스펙션 효율은 유세포분석에 의해 검출되는 GFP를 발현하는 생존가능한 세포의 백분율을 계산함으로써 평가하였다. 또한, 생존가능성은 총 투입 세포 개수로 나눈 트랜스펙션 다음날의 트립판 블루(trypan blue)-음성 세포의 분율을 확인함으로써 결정하였으며, 1×104 내지 1×105 투입 세포(데이터 미도시)의 범위 내에서 대략 30%였다. 트랜스펙션 효율은 투입 세포 개수가 1×104 내지 3×104개 범위인 경우 30%였으며, 6×104 내지 1×105개 세포 범위인 경우 대략 40%였다(도 5a). PBMC로부터의 정제된 세포를 3 또는 6일 동안 증식시켰고, 6×104 내지 1×1O5개 세포를 대조군인, GFP-발현 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 효율은 트랜스펙션을 CD34의 발현이 더 높았던 6일보다는 3일 동안 증식한 세포에서 수행하는 경우 2배 더 높았다(도 5b). 추가로, 트랜스펙션 3일째의 90%가 넘는 세포는 GFP 및 CD34를 공동-발현하는 한편, 트랜스펙션 6일째의 오직 18% 집단만이 둘 모두의 마커를 공동-발현하였다(도 5c). 그러나, 증식 6일에 트랜스펙션을 위한 전반적인 세포 개수가 증가하지 않았다. 이들 결과는 이러한 프로토콜을 위해 선택된 조건이 집단 내의 다른 세포 유형보다는 CD34-발현 세포의 트랜스펙션을 선호한다는 개념을 뒷받침한다.
인간 피브로넥틴(레트로넥틴) 또는 비트로넥틴의 활성 도메인을 함유하는 재조합 단백질 단편은 지속적으로 시험한 다른 것들보다 더 나은 iPSC 형성을 지지하였다. 레트로넥틴-코팅된 플레이트 상의 콜로니 형성의 효율은 스템스팬 SFEM 배지, N2, B27 및 PD0325901, CHIR99021, A-83-01 및 HA-100을 포함하는 소분자의 칵테일과 병용하는 경우 유의미하게 향상되었다(도 5d). 알칼리성 포스파타제 활성에 대하여 양성으로 염색되는 콜로니를 함유하는 6 웰 플레이트로부터의 단일의 웰을 나타내었다(도 5d, 패널 i). 백색 화살촉은 패널 ii에서 확대하고, 패널 iii에서 Tral-81 발현에 대하여 양성으로 염색되었던 콜로니를 강조표시한 것이다.
투입 세포 개수를 최적화하기 위하여, 리프로그래밍 시험을 6일 동안 증식된 소정의 범위의 투입 세포(공여자 GG) 개수에서 플라스미드 세트 2를 사용하여 수행하였다(도 5e).
L-myc는 잠재적으로 더 높은 리프로그래밍 효율을 갖는 C-myc 대신에 사용할 수 있다. 도 5f에 나타낸 바와 같이, 4명의 상이한 공여자로부터 정제한 C34-발현 세포를 6일 동안 증식시키고, C-myc(세트 1) 또는 비교로서의 L-myc(세트 2)를 발현하는 플라스미드 조합을 사용하여 트랜스펙션시키고, 각각으로부터 야기된 총 iPSC 개수를 비교하였다.
B-27 보충물질 중의 동물 성분의 필요가 없는 이종성분이 없는 배양을 달성하기 위하여, B-27 보충물질은 도 6에 따른 리프로그래밍 배지에서 완전히 생략될 수 있는 것으로 증명되었다.
CD34-발현의 양은 리프로그래밍 효율과 상호관련이 있는 것으로 나타났다(도 7a 및 도 7b). PBMC로부터의 CD34-발현 세포의 분리에 의해 과정에 추가의 단계가 생기며; 이에 따라, 본 명세서에 상술된 방법을 사용하여 CD34-발현 및 리프로그래밍 효율 간에 실제로 상호관계가 존재하는지를 결정하는 것이 중요하였다. 하기의 실험 세트에 의하여 이러한 상호관계를 확인하였다. 먼저, 숙주 세포 집단은 CD3, CD 19 및 CD56을 표적으로 하는 항체를 사용한 유세포분석에 의하여 증식 3일 및 6일에 검출가능한 수준의 T, B, 및 NK 세포가 없는 것으로 간주하였다(n=9, 데이터 미도시). 두번째로, 45% CD3, 10% CD19, 20% CD56으로 이루어진 CD34-제거 세포 집단은 본 명세서의 피더를 사용하지 않는 프로토콜을 사용하여 iPSC를 생성할 수 없었지만(도 7a, ii), CD34-발현에 대하여 정제한 대응물은 대조적으로 iPSC를 생성하였다(n=3, 도 7a, i). 세번째로, CD34-발현 세포를 추가의 공여자로부터 정제하고, 감소된 CD34 발현 수준과 일치하는 상이한 증식일에 트랜스펙션시키고, 리프로그래밍시켰다. 리프로그래밍의 효율은 모든 4명의 공여자에 대하여 감소된 CD34-발현의 백분율만큼 더 낮았다(도 7b). 예를 들어, 공여자 3096은 3일의 증식 후에 트랜스펙션되는 경우 1×105개 투입 세포당 90개 초과의 iPSC를 나타내었으며, 이는 CD34 발현 수준이 1/3 이상 더 낮았던 때인 추가 10일 동안 증식되는 경우, 1×105개당 1개의 iPSC를 나타낸 것과 비교된다. 이러한 결과는 6일의 증식에 비하여 CD34의 백분율이 더 높은 3일에 더 높은 트랜스펙션 효율을 나타내는 본 명세서의 이전의 관찰을 확증하는 것이다. 요약하면, 이들 데이터는 조혈 세포의 집단 내의 CD34-발현량이 본 명세서에 상술된 피더를 사용하지 않는 방법을 사용하여, 그들이 리프로그래밍하는 능력과 상호관계가 있다는 개념을 뒷받침한다.
표준 조건 또는 완전히 정의된 조건 중 어느 하나의 조건 하에서 배양된 CD34-발현 세포의 증식 배수는 도 8a에 상세히 표시하였다. 완전히 정의된 리프로그래밍 방법을 사용하여 iPSC를 생성하는 능력은 추가로 변이를 최소화할 것이며, 임상-등급의 iPSC의 생성을 용이하게 할 것이다. CD34-발현 세포의 큰 푸울을 다중의 공여자로부터 정제하고 혼합하여, 다중의 시험에 필요한 세포 개수를 보장하였다. 정제된 세포를 증식 6일 후에 표준 조건에서의 세포에 대한 83 ± 32배에 비하여, 113 ± 11배의 크기로 완전 정의 배지에서 성공적으로 증식시켰다. CD34를 발현하는 세포의 절대 개수는 2가지 조건 사이의 30배 차이에도 불구하고, 유세포분석에 의하여 C34를 발현하는 집단의 백분율을 곱하는 경우, 2개의 집단이 유사하다. 예를 들어, 표준 조건에서 증식된 집단의 42 ± 13%가 CD34를 발현하였으며, 완전 정의 조건을 사용해서는 26 ± 16%가 CD34를 발현하였다. 도 8b의 이미지는 완전 정의된, 동물 성분이 없는 시약을 사용한 CD34-발현에 대하여 농축된 증식된 세포의 리프로그래밍 후에 알칼리성 포스파타제에 대하여 양성으로 염색된 콜로니를 함유하는 6 웰 플레이트 중 하나의 웰을 나타낸다.
다중의 iPS 클론을 본 명세서에 상세히 설명된 방법을 사용하여 26명의 공여자로부터 증식시키고, 클론의 하위세트를 추가의 특성화를 위해 선택하였다. 클론은 정상의 핵형을 나타내었으며, 일부를 다중의 계대에서 평가하여, 시간에 따른 그들의 유전적 무결성을 확인하였다. 또한, 클론은 유세포 분석으로 결정시 공통의 세포 표면 마커 Tral-81 및 SSEA-4뿐 아니라 DNT3B, REX1, TERT, UTF1, Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, Klf4 및 C-myc를 포함하는 만능성의 지표인 내인성 유전자를 발현하였다. 또한, 클론에 염색체외 플라스미드 DNA 및 통합가 없는 것을 확인하였다. oriP-트랜스펙션된 플라스미드의 점진적인 소실을 다양한 계대수에서 iPSC를 수집함으로써 확인하고, 세포당 1 카피의 검출 제한과 함께 PCR로 스크리닝하였으며, 소실은 평균 7 내지 10 계대수 범위 내에 검출할 수 있었다. 흥미롭게도, oriP의 소실은 iPSC를 디스파제보다는 EDTA로 분열시키는 경우 10 계대수보다 더 후의 계대에 명백하게 나타났다. 추가로, 시험한 iPSC의 시료 세트에서 PCR에 의한 분석 후에, T 세포 수용체 재배열 또는 면역글로불린 중쇄(IgH) 유전자를 나타내는 유전자 세그먼트의 증폭이 없었다. 이러한 재배열의 결여는 숙주 세포가 조혈 전구 세포로부터 유래되며, 프로토콜은 선택적으로 더욱 분화된 B 또는 T 세포 유형보다 조혈 전구 세포로부터의 iPSC의 생성을 선호한다는 주장을 뒷받침한다. 1명의 공여자로부터의 몇몇 iPSC 클론을 뉴런을 형성하는 역량에 대하여 시험하였다. 추가로, 3명의 상이한 공여자로부터의 5개의 iPS 클론은 또한 면역결핍(SCID) 마우스로의 주사 후에 기형종을 형성하였다. 흥미롭게도, 잔류의 트랜스펙션된 DNA의 존재는 기형종을 형성하는 능력을 방해하는 것으로 보이지 않았는데, 이는 2명의 공여자로부터의 클론이 기형종 연구를 위한 마우스로의 주사 후에 각각 계대수 15 및 18까지 플라스미드 DNA를 잃지 않았기 때문이다.
본 명세서에 기술되고 청구된 모든 방법은 상세한 설명에 비추어 과중한 실험적 부담없이 이루어지고 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시형태의 관점에서 기술된 한편, 본 명세서에 기재된 방법, 방법의 단계 또는 단계의 순서에 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 변형이 적용될 수 있음이 해당 분야의 전문가에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적으로 및 생리학적으로 관련이 있는 특정 물질이 본 명세서에 기술된 물질을 대신하여 사용될 수 있으면서 동일하거나 유사한 결과를 달성할 수 있음은 명백하다. 해당 분야의 전문가에게 명백한 것으로서 그와 같이 유사한 모든 치환 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 취지, 범위 및 개념에 속하는 것이다.
참조 문헌
하기 참조 문헌은 예시 절차 또는 다른 상세 사항을 제공하는 정도로 본 발명에 나타나 있고, 구체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
미국 특허 제4,714,680호
미국 특허 제5,478,838호
미국 특허 제5,728,581호
미국 특허 제4,683,202호
미국 특허 제4,684,611호
미국 특허 제4,952,500호
미국 특허 제5,302,523호
미국 특허 제5,322,783호
미국 특허 제5,384,253호
미국 특허 제5,464,765호
미국 특허 제5,538,877호
미국 특허 제5,538,880호
미국 특허 제5,550,318호
미국 특허 제5,563,055호
미국 특허 제5,563,055호
미국 특허 제5,580,859호
미국 특허 제5,589,466호
미국 특허 제5,591,616호
미국 특허 제5,610,042호
미국 특허 제5,656,610호
미국 특허 제5,702,932호
미국 특허 제5,736,524호
미국 특허 제5,780,448호
미국 특허 제5,789,215호
미국 특허 제5,925,565호
미국 특허 제5,928,906호
미국 특허 제5,935,819호
미국 특허 제5,945,100호
미국 특허 제5,981,274호
미국 특허 제5,994,624호
미국 특허 출원 제12/478,154호
미국 특허 출원 제61/058,858호
미국 특허 출원 제61/088,054호
미국 특허 출원 제61/156,304호
미국 특허 출원 제61/258,120호
미국 특허 출원 공개 제20030211603호
미국 특허 출원 공개 제20070238170호
미국 특허 출원 공개 제20080038820호
미국 특허 출원 공개 제20080226558호
미국 특허 출원 공개 제20080254003호
미국 특허 출원 공개 제20090047739호
미국 특허 출원 공개 제2002/0076976호
미국 특허 출원 공개 제2003/0059913호
미국 특허 출원 공개 제2003/0087919호
미국 특허 출원 공개 제2004/0002507호
미국 특허 출원 공개 제2004/0002508호
미국 특허 출원 공개 제2004/0014755호
미국 특허 출원 공개 제2004/0039796호
미국 특허 출원 공개 제2005/0192304호
미국 특허 출원 공개 제2005/0209261호
미국 특허 출원 공개 제2008/004287호
미국 특허 출원 공개 제2007/0116680호
Figure 112013003320220-pct00003
Figure 112013003320220-pct00004
Figure 112013003320220-pct00005
Figure 112013003320220-pct00006
Figure 112013003320220-pct00007
Figure 112013003320220-pct00008
Figure 112013003320220-pct00009

Claims (24)

  1. 조혈 전구 세포로부터 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법으로서,
    a) 조혈 전구 세포를 포함하는 인간 말초 혈액 세포의 세포 집단을 제공하는 단계;
    b) 상기 집단을 배양하는 단계;
    c) iPS 리프로그래밍(reprogramming) 인자를 발현하는 복제 원점 함유 염색체외 복제 에피솜 유전 요소 또는 외인성 RNA 유전 요소를 상기 증식된 조혈 전구 세포 내로 도입시키는 단계; 및
    d) 상기 증식된 조혈 전구 세포를 화학적으로 정의되고 이종성분이 없는(xeno-free) 배양물에서 배양하여, 상기 조혈 전구 세포로부터 인간 iPS 세포를 생성하는 단계를 포함하며,
    상기 리프로그래밍 인자가 Sox, Oct, Nanog, Lin-28, Klf4, C-myc(또는 L-myc), SV40 대형 T-항원(SV40 large T-antigen), 또는 그들의 조합으로부터 선택되고, 상기 세포 집단이 하나 이상의 대상체로부터의 것이며, 상기 대상체의 세포는 외적으로 적용되는 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식구 콜로니-자극 인자(GM-CSF)로 동원된 적이 없는 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포 집단은 부피가 최대 10㎖인 혈액 시료에 포함되는 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 배양 공정이 상기 조혈 전구 세포의 증식을 촉진시키는 증식 조건 하에서 수행되며, 상기 증식 조건은 줄기 세포 인자(SCF), Flt-3 리간드(Flt3L), 트롬보포이에틴(TPO), 인터류킨 3(IL-3) 또는 인터류킨 6(IL-6)을 포함하는 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 증식 배지를 포함하는 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 증식 조건이 노치-1 리간드를 포함하지 않는 것인. 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 단계 b)의 증식 조건이 정의된 세포외 기질을 포함하는 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 단계 b)의 증식 조건이 기질을 포함하지 않는 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 단계 b)의 조건 또는 상기 단계 d)의 배양물이 최대 7% 산소 분압을 갖는 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 외인성 에피솜 유전 요소 또는 외인성 RNA 유전 요소가 하나 이상의 폴리시스트론성 카세트(polycistronic cassette)를 갖는 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  11. 제1항에 있어서, 단계 c)가 증식 단계 b)의 3, 4, 5 또는 6일에 발생하는 것인. 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  12. 제1항에 있어서, 단계 c)에서 증식된 조혈 전구 세포의 출발 개수가 104 내지 105개인 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  13. 제1항에 있어서, 단계 d)의 배양물이 정의된 세포외 기질을 포함하는 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  14. 제6항 또는 제13항에 있어서, 상기 정의된 세포외 기질이 단일 유형의 세포외 기질 펩티드를 갖는 것인. 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  15. 제6항 또는 제13항에 있어서, 상기 정의된 세포외 기질이 인간 피브로넥틴 단편인 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단계에서의 배지가 화학적으로 정의된 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  17. 제1항에 있어서, e) iPS 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 복제 원점이 엡스테인 바 바이러스(EBV)의 OriP인 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 iPS 세포가 벡터 또는 RNA 유전 요소를 제거하도록 배양됨으로써 벡터가 없는 iPS 세포를 제공하는 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  20. 말초 혈액 시료로부터 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법으로서,
    a) 조혈 전구 세포를 포함하며 부피가 최대 10㎖인 말초 혈액 시료를 제공하는 단계;
    b) iPS 리프로그래밍 인자를 발현하는 OriP 복제 원점 함유 염색체외 복제 에피솜 유전 요소 또는 외인성 RNA 유전 요소를 상기 조혈 전구 세포 내로 도입시키는 단계; 및
    c) 상기 조혈 전구 세포를 화학적으로 정의되고 이종성분이 없는 배양물에서 배양하여, 상기 말초 혈액 시료로부터 인간 iPS 세포를 생성하는 단계를 포함하며,
    상기 리프로그래밍 인자가 Sox, Oct, Nanog, Lin-28, Klf4, C-myc(또는 L-myc), SV40 대형 T-항원(SV40 large T-antigen), 또는 그들의 조합으로부터 선택되고, 상기 세포 집단이 하나 이상의 대상체로부터의 것이며, 상기 대상체의 세포는 외적으로 적용되는 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식구 콜로니-자극 인자(GM-CSF)로 동원된 적이 없는 것인, 말초 혈액 시료로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 단계 b) 이전에, 상기 조혈 전구 세포를 상기 조혈 전구 세포의 증식을 촉진시키는 증식 조건 하에서 배양하는 단계를 추가로 포함하며,
    상기 증식 조건은 줄기 세포 인자(SCF), Flt-3 리간드(Flt3L), 트롬보포이에틴(TPO), 인터류킨 3(IL-3) 또는 인터류킨 6(IL-6)을 포함하는 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 증식 배지를 포함하는 것인, 말초 혈액 시료로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 복제 원점이 엡스테인 바 바이러스(EBV)의 OriP인 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 iPS 세포가 벡터 또는 RNA 유전 요소를 제거하도록 배양됨으로써 벡터가 없는 iPS 세포를 제공하는 것인, 조혈 전구 세포로부터의 인간 iPS 세포의 시험관내 생성 방법.
  24. 조혈 전구 세포 및 그의 자손 세포를 포함하는 인간 말초 혈액 세포의 세포 집단, 이종성분이 없는 세포외 기질, 및 화학적으로 정의되고 이종성분이 없는 배지를 포함하되, 상기 조혈 전구 세포가 리프로그래밍 인자를 발현하는 하나 이상의 복제 원점 함유 염색체외 복제 에피솜 유전 요소 또는 외인성 RNA 유전 요소를 포함하며,
    상기 리프로그래밍 인자가 Sox, Oct, Nanog, Lin-28, Klf4, C-myc(또는 L-myc), SV40 대형 T-항원(SV40 large T-antigen), 또는 그들의 조합으로부터 선택되고, 상기 세포 집단이 하나 이상의 대상체로부터의 것이며, 상기 대상체의 세포는 외적으로 적용되는 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식구 콜로니-자극 인자(GM-CSF)로 동원된 적이 없는 것인, 시험관내 세포 배양 조성물.
KR1020137000892A 2010-06-15 2011-06-14 작은 부피의 말초 혈액으로부터의 유도된 만능 줄기 세포의 생성 KR101861168B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35504610P 2010-06-15 2010-06-15
US61/355,046 2010-06-15
US38894910P 2010-10-01 2010-10-01
US61/388,949 2010-10-01
PCT/US2011/040323 WO2011159684A2 (en) 2010-06-15 2011-06-14 Generation of induced pluripotent stem cells from small volumes of peripheral blood

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130087009A KR20130087009A (ko) 2013-08-05
KR101861168B1 true KR101861168B1 (ko) 2018-05-31

Family

ID=45348816

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137000892A KR101861168B1 (ko) 2010-06-15 2011-06-14 작은 부피의 말초 혈액으로부터의 유도된 만능 줄기 세포의 생성

Country Status (11)

Country Link
US (3) US8691574B2 (ko)
EP (2) EP3382008A1 (ko)
JP (4) JP5984217B2 (ko)
KR (1) KR101861168B1 (ko)
CN (1) CN103003416B (ko)
AU (1) AU2011267849B2 (ko)
CA (1) CA2802249A1 (ko)
DK (1) DK2582794T3 (ko)
ES (1) ES2670842T3 (ko)
IL (1) IL223527B (ko)
WO (1) WO2011159684A2 (ko)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8741648B2 (en) 2009-06-05 2014-06-03 Cellular Dynamics International, Inc. Reprogramming T cells and hematopoietic cells
AU2011267849B2 (en) * 2010-06-15 2015-02-05 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generation of induced pluripotent stem cells from small volumes of peripheral blood
CN103380212B (zh) * 2010-12-22 2017-04-05 菲特治疗公司 用于单细胞分选与增强ipsc重新编程的细胞培养平台
WO2013177228A1 (en) * 2012-05-22 2013-11-28 Loma Linda University Generation of integration/transgene-free stem cells
KR102596302B1 (ko) * 2012-11-01 2023-11-01 팩터 바이오사이언스 인크. 세포에서 단백질을 발현시키는 방법들과 생성물들
JP2015534830A (ja) * 2012-11-02 2015-12-07 ロンザ ウォーカーズビル マイクロｒｎａ及び細胞リプログラミング
CN103088065B (zh) * 2013-01-25 2014-12-10 北京银杏德济生物技术有限公司 一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法
ES2491491B1 (es) * 2013-03-05 2015-06-16 Vodafone España, S.A.U. Método para asociar de manera anónima mediciones de un dispositivo de monitorización sanitaria con un ID de usuario
CA2908443A1 (en) * 2013-04-16 2014-10-23 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Blastoid, cell line based artificial blastocyst
WO2014201154A1 (en) * 2013-06-14 2014-12-18 Microstem, Inc. Matrix combinations support hematopoietic stem cell in vitro culturing
WO2015006725A2 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Cedars-Sinai Medical Center Generation of induced pluripotent stem cells from normal human mammary epithelial cells
KR101655383B1 (ko) 2013-07-27 2016-09-08 고려대학교 산학협력단 소분자 화합물을 포함하는 만능성 줄기세포의 염색체 안정성 유지용 조성물
WO2015134652A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 Bahram Valamehr Improved reprogramming methods and cell culture platforms
EP3116991B1 (en) * 2014-03-11 2019-01-23 Agency For Science, Technology And Research Method for inducing pluripotency in a hematopoietic cell
US10023879B2 (en) 2014-06-04 2018-07-17 Fate Therapeutics, Inc. Minimal volume reprogramming of mononuclear cells
EP3786285A1 (en) * 2014-06-05 2021-03-03 Cedars-Sinai Medical Center A novel and efficient method for reprogramming immortalized lymphoblastoid cell lines to induced pluripotent stem cells
SG10202101358XA (en) 2015-01-26 2021-03-30 Fate Therapeutics Inc Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
WO2016162747A2 (en) * 2015-04-09 2016-10-13 Biolamina Ab Methods and compositions for producing stem cell derived dopaminergic cells for use in treatment of neurodegenerative diseases
EP3347457B1 (en) 2015-09-08 2021-10-27 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Macs-based purification of stem cell-derived retinal pigment epithelium
WO2017044483A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method for reproducible differentiation of clinical-grade retinal pigment epithelium cells
US9450944B1 (en) 2015-10-14 2016-09-20 FullArmor Corporation System and method for pass-through authentication
US9509684B1 (en) * 2015-10-14 2016-11-29 FullArmor Corporation System and method for resource access with identity impersonation
US9762563B2 (en) 2015-10-14 2017-09-12 FullArmor Corporation Resource access system and method
SG10202111851YA (en) 2015-10-16 2021-12-30 Fate Therapeutics Inc Platform for the Induction & Maintenance of Ground State Pluripotency
WO2017070337A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for directed differentiation of pluripotent stem cells to immune cells
CN115806940A (zh) 2015-11-04 2023-03-17 菲特治疗公司 多能细胞的基因组工程改造
KR20180066263A (ko) 2015-11-04 2018-06-18 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 조혈 세포 분화를 유도하기 위한 방법 및 조성물
US10221395B2 (en) 2016-06-16 2019-03-05 Cedars-Sinai Medical Center Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells
US11572545B2 (en) 2016-06-16 2023-02-07 Cedars-Sinai Medical Center Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells
WO2018005975A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Research Development Foundation Elimination of proliferating cells from stem cell-derived grafts
EP3510145A4 (en) * 2016-09-06 2020-03-25 The Children's Medical Center Corporation IMMUNCELLS FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS
US10961505B2 (en) 2016-10-05 2021-03-30 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generating mature lineages from induced pluripotent stem cells with MECP2 disruption
JP7068305B2 (ja) 2016-12-05 2022-05-16 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 結腸オルガノイドならびにその作製方法および使用方法
EP3609997A4 (en) * 2017-04-14 2021-03-03 Children's Hospital Medical Center MULTIDONOR STEM CELL COMPOSITIONS AND METHOD FOR MANUFACTURING THEM
CN110891967A (zh) 2017-04-18 2020-03-17 富士胶片细胞动力公司 抗原特异性免疫效应细胞
WO2018217567A1 (en) * 2017-05-22 2018-11-29 Transfusion Health, Llc Compositions and methods of making expanded hematopoietic stem cells using pten inhibitors
GB201708554D0 (en) * 2017-05-30 2017-07-12 Queens Univ Of Belfast A method for the generation of induced pluirpotent stem cells
CN107245474A (zh) * 2017-06-07 2017-10-13 北京呈诺医学科技有限公司 一种无饲养层无血清的人类诱导性多能干细胞分离培养方法
US11572544B2 (en) 2017-06-14 2023-02-07 The Children's Medical Center Corporation Hematopoietic stem and progenitor cells derived from hemogenic endothelial cells by episomal plasmid gene transfer
AU2018354418A1 (en) 2017-10-27 2020-05-14 Immunebridge Inc. Compositions and methods of making expanded hematopoietic stem cells using derivatives of fluorene
CA3121027A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Multiplex genome editing of immune cells to enhance functionality and resistance to suppressive environment
KR20210096648A (ko) 2018-11-29 2021-08-05 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 자연 살해 세포의 생체외 확장을 위한 방법 및 이의 용도
JP7273141B2 (ja) * 2019-03-29 2023-05-12 富士フイルム株式会社 特定細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞の製造方法およびその応用
WO2020223303A1 (en) * 2019-04-29 2020-11-05 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for increasing megakaryocyte production
JPWO2021085033A1 (ko) 2019-10-28 2021-05-06
JPWO2021085034A1 (ko) 2019-10-28 2021-05-06
CN110669732B (zh) * 2019-11-05 2021-05-04 清华大学 组合物在将造血祖细胞重编程为造血干细胞中的用途
JPWO2021145402A1 (ko) 2020-01-16 2021-07-22
MX2022008648A (es) 2020-01-23 2022-12-15 The Children´S Medical Center Corp Diferenciacion de celulas t sin estroma a partir de celulas madre pluripotentes humanas.
US11091524B1 (en) 2020-04-22 2021-08-17 Houston Gene Therapeutics Llc Compositions for treatment of vascular disease
JPWO2021256078A1 (ko) 2020-06-19 2021-12-23
EP4172319A1 (en) * 2020-06-23 2023-05-03 Tithon Biotech, Inc. Peripheral blood derived small pluripotent cells
CN116348477A (zh) 2020-07-20 2023-06-27 英安塔制药有限公司 作为抗病毒剂的功能化肽
WO2022104109A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Catamaran Bio, Inc. Genetically modified natural killer cells and methods of use thereof
EP4247387A1 (en) 2020-11-23 2023-09-27 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Novel spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11352363B1 (en) 2020-11-23 2022-06-07 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11384090B2 (en) 2020-11-23 2022-07-12 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
EP4251645A1 (en) 2020-11-25 2023-10-04 Catamaran Bio, Inc. Cellular therapeutics engineered with signal modulators and methods of use thereof
US11319325B1 (en) 2021-05-11 2022-05-03 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Macrocyclic spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11339170B1 (en) 2021-07-23 2022-05-24 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11325916B1 (en) 2021-07-29 2022-05-10 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
KR20240056604A (ko) 2021-09-13 2024-04-30 후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드 수임 심장 전구세포의 제조 방법
WO2023053220A1 (ja) 2021-09-28 2023-04-06 公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団 多能性幹細胞の製造方法
US11912714B2 (en) 2021-11-12 2024-02-27 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
WO2023086350A1 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Alkyne-containing antiviral agents
US11919910B2 (en) 2021-11-12 2024-03-05 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
WO2023172514A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Catamaran Bio, Inc. Engineered immune cell therapeutics targeted to her2 and methods of use thereof
CN114958771B (zh) * 2022-06-27 2023-12-05 广东康盾创新产业集团股份公司 一种ipsc-car-nk细胞的制备方法
WO2024073776A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of cardiac fibroblasts

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8200523A (nl) 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
US4714680B1 (en) 1984-02-06 1995-06-27 Univ Johns Hopkins Human stem cells
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4952500A (en) 1988-02-01 1990-08-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning systems for Rhodococcus and related bacteria
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
WO1993005021A1 (en) 1991-09-06 1993-03-18 Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. 4-amino(alkyl)cyclohexane-1-carboxamide compound and use thereof
US5610042A (en) 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat
DK0604662T3 (da) 1992-07-07 2008-10-20 Japan Tobacco Inc Fremgangsmåde til transformering af monocotyledon
US5702932A (en) 1992-07-20 1997-12-30 University Of Florida Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA
HUT70467A (en) 1992-07-27 1995-10-30 Pioneer Hi Bred Int An improved method of agrobactenium-mediated transformation of cultvred soyhean cells
DE4228457A1 (de) 1992-08-27 1994-04-28 Beiersdorf Ag Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen
GB9222888D0 (en) 1992-10-30 1992-12-16 British Tech Group Tomography
GB9223084D0 (en) 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
JPH09502167A (ja) 1993-07-29 1997-03-04 システミックス，インコーポレイテッド 新規な幹細胞マーカー
EP0722331A4 (en) 1993-08-25 1997-10-01 Systemix Inc METHOD FOR PRODUCING A POPULATION OF HIGHLY ENRICHED HEMATOPOIETIC STEM CELLS
EP0736169A4 (en) 1993-09-17 1998-06-10 Systemix Inc PROCESS FOR PRODUCING CELL POPULATION ENRICHED IN STEM CELLS AND COMPOSITIONS DERIVED THEREFROM
US5656610A (en) 1994-06-21 1997-08-12 University Of Southern California Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue
FR2722208B1 (fr) 1994-07-05 1996-10-04 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau site interne d'entree des ribosomes, vecteur le contenant et utilisation therapeutique
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
DE69518437T2 (de) 1994-11-29 2001-02-08 Takara Shuzo Co Verfahren zur herstellung transformierter zellen
US5728581A (en) 1995-06-07 1998-03-17 Systemix, Inc. Method of expanding hematopoietic stem cells, reagents and bioreactors for use therein
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
US20030059913A1 (en) 1995-11-20 2003-03-27 Walter Weyler Novel Microorganisms with ability to degrade indole and novel enzymes therefrom
GB9807935D0 (en) 1998-04-14 1998-06-10 Univ Edinburgh Lineage specific cells and progenitor cells
ATE245424T1 (de) * 1996-03-14 2003-08-15 Univ Alberta Verwendung von hyaluronsäure zur zellmobilisierung
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
US5945100A (en) 1996-07-31 1999-08-31 Fbp Corporation Tumor delivery vehicles
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
CA2277278A1 (en) 1997-01-10 1998-07-16 Life Technologies, Inc. Embryonic stem cell serum replacement
US5994624A (en) 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
CA2307807C (en) 1997-10-23 2008-09-02 Andrea G. Bodnar Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
WO2000070022A2 (en) 1999-05-14 2000-11-23 City Of Hope Ex vivo expansion of mammalian hematopoietic stem cells
JP2002184539A (ja) 2000-12-14 2002-06-28 Auto Network Gijutsu Kenkyusho:Kk コネクタ
PE20021011A1 (es) 2001-03-23 2003-02-01 Bayer Corp Derivados quinazolinicos como inhibidores de la rho-quinasa
JP4320705B2 (ja) 2001-03-23 2009-08-26 バイエル コーポレイション Ｒｈｏキナーゼ阻害剤
WO2002100889A1 (en) 2001-06-08 2002-12-19 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Novel epitope of human papilloma virus e7 antigen and cd4-positive t cells activated by the epitope
US20030211603A1 (en) 2001-08-14 2003-11-13 Earp David J. Reprogramming cells for enhanced differentiation capacity using pluripotent stem cells
US20040014755A1 (en) 2002-01-10 2004-01-22 Dhanapalan Nagarathnam Rho-kinase inhibitors
JP4423043B2 (ja) 2002-01-23 2010-03-03 バイエル ファーマセチカル コーポレーション Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤
US6924290B2 (en) 2002-01-23 2005-08-02 Bayer Pharmaceuticals Corporation Rho-kinase inhibitors
US7763466B2 (en) 2002-05-17 2010-07-27 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Mesoderm and definitive endoderm cell populations
US20040039796A1 (en) 2002-08-08 2004-02-26 Virtual Radio, Inc. Personalized cyber disk jockey and Internet radio advertising
CA2503646C (en) 2002-10-28 2011-09-27 Bayer Healthcare Ag Heteroaryloxy-substituted phenylaminopyrimidines as rho-kinase inhibitors
US7986994B2 (en) 2002-12-04 2011-07-26 Medtronic, Inc. Method and apparatus for detecting change in intrathoracic electrical impedance
US20050123902A1 (en) 2003-05-21 2005-06-09 President And Fellows Of Harvard College Human papillomavirus inhibitors
US20090155218A1 (en) 2004-03-10 2009-06-18 Alberto Hayek Compositions and methods for growth of embryonic stem cells
US7452718B2 (en) 2004-03-26 2008-11-18 Geron Corporation Direct differentiation method for making cardiomyocytes from human embryonic stem cells
WO2005123902A1 (ja) 2004-06-18 2005-12-29 Riken 無血清浮遊培養による胚性幹細胞の神経分化誘導法
US20080038820A1 (en) 2004-06-22 2008-02-14 Rudy-Reil Diane E Induction of pluripotent stem cells into mesodermal lineages
WO2006029198A2 (en) 2004-09-08 2006-03-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Culturing human embryonic stem cells
JP2008523823A (ja) 2004-12-22 2008-07-10 イーエス・セル・インターナショナル・プライヴェート・リミテッド ヒト胚性幹細胞の分化ならびにそれに由来する心筋細胞および心筋前駆細胞
US7606580B2 (en) 2005-05-11 2009-10-20 Aol Llc Personalized location information for mobile devices
US7599295B2 (en) 2005-09-20 2009-10-06 Futurewei Technologies, Inc. System for passive alarm propagation and suppression for packet based networks
US20070116680A1 (en) 2005-11-18 2007-05-24 Rensselaer Polytechnic Institute Stem cells within gel microenvironments
AU2007232393A1 (en) 2006-03-30 2007-10-11 The University Court Of The University Of Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitors. and uses thereof
KR20090042779A (ko) 2006-06-30 2009-04-30 쉐링 코포레이션 Ｐ53 활성을 증가시키는 치환된 피페리딘 및 이의 사용
PT2044056E (pt) 2006-07-14 2012-12-05 Novartis Ag Derivados de pirimidina como inibidores de alk-5
CA2676044C (en) 2007-01-30 2019-10-22 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Early mesoderm cells, a stable population of mesendoderm cells that has utility for generation of endoderm and mesoderm lineages and multipotent migratory cells (mmc)
EP3399025A1 (en) 2007-03-23 2018-11-07 Wisconsin Alumini Research Foundation Somatic cell reprogramming
CN101100655B (zh) * 2007-06-15 2011-08-03 中国人民解放军第二军医大学 胚胎源性多能干细胞向心脏起搏细胞定向诱导分化的方法
WO2009032456A2 (en) 2007-08-01 2009-03-12 Primegen Biotech Llc Non-viral delivery of transcription factors that reprogram human somatic cells into a stem cell-like state
US9206439B2 (en) 2008-01-14 2015-12-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Efficient oriP/EBNA-1 plasmid vector
JP2011160661A (ja) † 2008-06-02 2011-08-25 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 血球細胞の初期化法
EP3447128A1 (en) † 2008-06-04 2019-02-27 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of ips cells using non-viral approach
DE102008040322A1 (de) 2008-07-10 2010-09-16 Dilo Trading Ag Energiespeicher-Kreislaufsystem unter Verwendung von Lithium-Ionen-Zellen
US8288513B2 (en) 2008-07-25 2012-10-16 Becton, Dickinson And Company Defined cell culturing surfaces and methods of use
KR101685209B1 (ko) † 2008-07-30 2016-12-09 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 유도된 다능성 줄기 세포의 효율적인 확립 방법
KR101773345B1 (ko) 2008-08-12 2017-08-31 셀룰러 다이내믹스 인터내셔널, 인코포레이티드 ｉＰＳ 세포의 생산 방법
JP2012506702A (ja) † 2008-10-24 2012-03-22 ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 非ウイルス性再プログラムによる多能性幹細胞
AU2010217739B2 (en) 2009-02-27 2015-09-03 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Differentiation of pluripotent cells
WO2010134526A1 (ja) 2009-05-18 2010-11-25 独立行政法人産業技術総合研究所 多能性幹細胞作成用ベクター材料及びこれを用いた多能性幹細胞作成方法
US8496941B2 (en) 2009-06-03 2013-07-30 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Vectors for generating pluripotent stem cells and methods of producing pluripotent stem cells using the same
US8741648B2 (en) * 2009-06-05 2014-06-03 Cellular Dynamics International, Inc. Reprogramming T cells and hematopoietic cells
SG178197A1 (en) † 2009-08-07 2012-03-29 Univ Kyoto Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
US20120301438A1 (en) 2009-09-14 2012-11-29 The Johns Hopkins University Reprogramming Blood Cells to Pluripotent and Multipotent Stem Cells
EP2496689B1 (en) 2009-11-04 2015-05-20 Cellular Dynamics International, Inc. Episomal reprogramming with chemicals
US8048675B1 (en) 2010-05-12 2011-11-01 Ipierian, Inc. Integration-free human induced pluripotent stem cells from blood
AU2011267849B2 (en) * 2010-06-15 2015-02-05 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generation of induced pluripotent stem cells from small volumes of peripheral blood
US9409760B1 (en) 2013-12-05 2016-08-09 Paul Lichtefeld, Sr. Fluid dispenser
US9410501B2 (en) 2014-04-25 2016-08-09 Rohr, Inc. Translating sleeve actuation system and apparatus

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Blood. 113(22):5476-9 (2009.05.28.)*
Nat Methods. 7(3):197-9 (2010.03.)*
PLoS One. 5(4):e10246 (2010.04.19.)*

Also Published As

Publication number Publication date
US20120009676A1 (en) 2012-01-12
WO2011159684A3 (en) 2012-04-19
AU2011267849B2 (en) 2015-02-05
CN103003416A (zh) 2013-03-27
US20140234973A1 (en) 2014-08-21
AU2011267849A1 (en) 2013-01-10
CA2802249A1 (en) 2011-12-22
DK2582794T3 (en) 2018-05-22
CN103003416B (zh) 2016-11-16
EP2582794B1 (en) 2018-03-07
JP2021035399A (ja) 2021-03-04
EP2582794A2 (en) 2013-04-24
JP5984217B2 (ja) 2016-09-06
US9447382B2 (en) 2016-09-20
ES2670842T3 (es) 2018-06-01
IL223527B (en) 2018-05-31
KR20130087009A (ko) 2013-08-05
US20170088818A1 (en) 2017-03-30
EP3382008A1 (en) 2018-10-03
EP2582794B2 (en) 2024-04-24
JP2015211695A (ja) 2015-11-26
JP2013528397A (ja) 2013-07-11
JP2018019725A (ja) 2018-02-08
US8691574B2 (en) 2014-04-08
WO2011159684A2 (en) 2011-12-22
EP2582794A4 (en) 2013-12-11
US10260048B2 (en) 2019-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101861168B1 (ko) 작은 부피의 말초 혈액으로부터의 유도된 만능 줄기 세포의 생성
EP2601289B1 (en) Reprogramming immortalized b cells
KR101775926B1 (ko) 화학 물질을 이용한 에피솜 재프로그래밍
EP2732029B1 (en) Methods for cell reprogramming and genome engineering

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant