KR101858717B1 - 췌장암 진단용 조성물 및 이를 이용한 췌장암 진단방법 - Google Patents

췌장암 진단용 조성물 및 이를 이용한 췌장암 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 췌장암의 발병 가능성 여부의 판단을 위해 사용될 수 있는, 단백질 또는 이의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물, 키트, 이를 사용한 췌장암 진단방법에 관한 것으로서, 본 발명은 췌장암의 진단 마커를 제공함으로써, 췌장암 또는 췌장암의 전구병변의 발병 가능성, 조기 진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있으며, 췌장암의 종양형성 연구에 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 진단방법은 비침습적으로 혈액 등으로부터 간단하게 췌장암을 조기 진단할 수 있다.

Description

췌장암 진단용 조성물 및 이를 이용한 췌장암 진단방법{COMPOSITION FOR DIAGNOSING PANCREATIC CANCER AND METHOD FOR DIAGNOSING PANCREATIC CANCER USING THE SAME}
본 발명은 췌장암의 발병 또는 발병 가능성의 판단에 사용될 수 있는, 특정 마커 유전자의 단백질 발현 수준 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물과 키트, 및 이를 이용한 췌장암 진단방법에 관한 것이다.
현대인의 주요 질환 중에서, 암의 치료방법과 진단방법에 관한 연구는 발병빈도가 높은 폐암, 간암, 위암 등을 중심으로 비교적 활발히 진행되고 있다. 그러나, 발병빈도가 낮은 식도암, 대장암, 췌장암 등에 대한 연구는 상대적으로 저조한 실정이다.
특히, 췌장암은 초기에는 별로 증세를 느끼지 않으며, 이미 전신전이가 일어난 후에 통증과 체중감소 등의 증세가 나타나는 것이 보통이어서, 더욱 치유율이 낮은 편이므로 정기적인 진단이 매우 중요하다. 임상증세는 대부분이 서서히 발병하고, 허약해지기 쉬우며, 식욕감퇴, 체중감소는 가장 흔한 증세이다. 췌장암은 5년 생존율이 1-4%, 중앙생존기간 5개월에 이르는 치명적인 암으로 인체의 암 중에서 가장 불량한 예후를 보이고 있다. 또한, 80-90% 환자에서 진단시 완치를 기대하는 근치적 절제가 불가능한 상태에서 발견되기 때문에 예후가 불량하고 치료는 주로 항암요법에 의존하고 있으므로, 그 어떤 인체 암보다도 조기 진단법 개발이 절실히 요망되고 있다.
현재까지 췌장암에 효과가 있다고 알려진 5-플루오로유라실, 젬시타빈(gemcitabine), 타르세바(tarceva)를 포함한 몇 가지 항암제의 치료 효과는 지극히 저조하며, 항암치료에 대한 반응율은 15% 내외에 불과하고 이러한 사실은 췌장암 환자의 예후를 향상시키기 위해서는 보다 효과적인 조기 진단법 및 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있음을 시사한다. 치명적인 췌장암으로 진행되기 전단계인 췌장암의 전구병변에 대한 적절한 진단과 치료가 췌장암 치료 성적 향상에 매우 중요하다.
췌장암 또는 췌장암 전구병변의 진단은 혈액검사(CA19-9), 위, 십이지장의 X선 조영검사, 피부 및 간을 통한 담도촬영(膽道撮影)과 역행성 내시경 담도촬영술 사용되고 있다. 이들 방법에 의해 질병의 병변을 발견하였으나, 최근에 초음파촬영 및 전산화 단층촬영이 가장 많이 사용된다. 보다 정밀한 조직검사를 수행하여 비교적 정확한 검사결과를 얻을 수도 있다. 그러나, 상기 진단방법은 정확도가 떨어지거나, 환자에게 고통이 따르는 등 그 수행방법이 매우 불편하여 피검자들이 이를 꺼려하는 실정이다. 따라서, 간편하고 신속하게 췌장암 또는 췌장암 전구병변을 진단할 수 있는 검사방법의 개발이 요구되어 왔다.
최근 건강 검진이나 췌장 외 다른 질환의 진단을 위하여 복부 초음파(abdominal ultrasound, US), 복부 전산화 단층 촬영(computed tomography, CT), 자기공명 영상진단(magnetic resonance imaging, MRI) 등의 영상진단 검사들이 많이 시행 되면서 췌장의 악성 병변이 빈번하게 발견된다. 영상진단에서 낭성 병변의 형태를 보이는 병변들은 병리 소견으로는 양성 병변으로부터 전암 병변(premalignant lesion)과 악성 병변에 이르기까지 다양한 질환을 포함하고 있으므로 임상적으로 중요하다.
그러나 CT, MRI와 같은 영상진단 검사의 발전에도 불구 하고 양성 병변으로부터 전암, 낭성 병변까지 다양한 병리 소견을 가지는 췌장의 낭성 병변을 수술 전에 정확히 감별 하는 것은 아직도 어려운 실정이다. 따라서 임상적으로는 췌장의 낭성 병변이 악성화할 가능성이 있는 종양 병변인지 아닌지 그리고 악성화 가능성이 있다면 아직 전암 단계의 병변인지 혹은 이미 악성 병변을 동반하고 있는지 감별하는 것이 중요하다.
대한민국 특허 제 10-0819122호 및 대한민국 공개특허 제 2012-0082372호에는, 마트릴린(matrilin), 트랜스티레틴(transthyretin), 스트라티핀(stratifin) 등을 포함하는 다양한 췌장암 마커를 이용한 기술을 개시하고 있다. 또한, 대한민국 공개특허 제2009-0003308호는 개체의 혈액 시료에서 REG4 단백질의 발현량을 검출하여 췌장암을 진단하는 방법을 개시하고 있으며, 대한민국 출원공개 제2012-0009781호는 개체의 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체로부터 분리한 암 조직 중 XIST RNA의 발현량을 측정하는 분석방법을, 대한민국 출원공개 제2007-0119250호는 정상 인간의 췌장 조직과 비교하여 인간 췌장암 조직에서 다르게 발현된 신규 유전자 LBFL313 패밀리를 개시하고 있고, 미국 출원공개 제2011/0294136호는 케라틴 8 단백질 등의 바이오 마커들을 이용한 췌장암 진단방법을 개시하고 있다. 하지만, 마커마다 그 진단 효율 및 정확성에서 큰 차이를 나타내므로, 효과가 더 우수한 마커를 발굴하고 이를 이용한 진단방법을 개발할 필요성이 있다.
본 발명의 목적은 췌장암의 발병, 발병 가능성 또는 위험도를 간편하게 조기 진단할 수 있는 췌장암 진단 마커를 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 췌장암의 발병, 발병 가능성 또는 위험도를 간편하게 조기 진단할 수 있는 췌장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 췌장 암을 진단하는 방법 또는 췌장암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 상기 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여, 탐지 대상에서 췌장암의 존부 또는 악성도를 결정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 췌장암의 발병, 발병 가능성 또는 위험도를 간편하게 조기 진단할 수 있는 췌장암 진단 마커의 췌장암 진단 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 췌장암 진단용 마커 유전자의 단백질의 발현 수준 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 또는 전구병변의 진단용 조성물로서, 상기 진단용 조성물을 포함하는 췌장암의 진단용 키트, 및 췌장암을 갖거나 의심되는 대상에서 췌장암의 존부를 결정하는 방법 또는 악성도를 결정하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 췌장암 진단용 조성물 또는 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 추가 성분, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에서, 상기 췌장암 진단은, 정상군과 구별하여 췌장암을 선별적으로 검출하거나, 다양한 암중에서 췌장암을 선별적으로 검출하거나, CA19-9의 수치가 37 U/㎖ 미만인 췌장암을 검출할 수 있다. 구체적으로, 상기 췌장암 진단용 조성물 또는 키트는 정상군과 췌장암 환자군을 구별하여 췌장암 군을 검출 또는 진단할 뿐만 아니라, 비교적 초기 진단이 어려운 1기 및 2기의 췌장암(PDAC)을 구별하여 검출 또는 진단할 수 있으며, 암이외의 다양한 췌장 관련 질환, 예를 들면 췌장염 및 담낭염과 구별하여 췌장암을 선별할 수 있고, 다른 종류의 암, 예를 들면 유방암, 대장암 및/또는 갑상선암 등과 구별하여 췌장암을 선별적으로 검출 또는 진단할 수 있으며, 알려진 췌장암 진단 마커, 예를 들면 CA19-9의 수치가 37 U/㎖ 미만인 췌장암을 CA19-9의 수치가 37 U/㎖ 미만인 정상, 췌장염 및 담낭염 등이 췌장 관련 질환과 구별되게 검출할 수 있다.
상기 마커 유전자는 적어도 세 가지 종류 또는 그 이상의 마커 유전자의 조합으로서, 구체적으로
(a) CA19-9(carbohydrate antigen 19-9);
(b)LRG1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1, LRG1); 및
(c) TTR(Transthyretin, ATTR, Prealbumin, TBPA), C1R(Complement C1r subcomponent precursor), CLU(Clusterin preproprotein) 및 KLKB1(Plasma Kallikrein protein)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자를
포함하는 췌장암 진단용 마커들을 포함한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 췌장암 진단용 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계;
상기 시료로부터 적어도 세 가지 종류 또는 그 이상의 마커 유전자의 조합으로서, 구체적으로 (a) CA19-9; (b)LRG1; 및 (c) TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마커 유전자를 포함하는 췌장암 마커들의 단백질의 발현 수준 또는 mRNA 발현 수준을 각각 측정하는 단계;
상기 대상으로부터 얻어진 마커 유전자들의 발현 수준을 각각 정상 대조군 시료에서의 발현 수준을 비교하여, 상기 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서 췌장암 또는 발병 가능성이 높은 대상군으로 결정하는 단계를 포함하는, 췌장암의 진단방법 또는 췌장암 진단의 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
상기 결정하는 단계에서, 마커 유전자의 발현 수준 비교결과, 대상에서의 CA19-9의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높고, LRG1의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높으며, TTR 단백질의 발현 수준 또는 TTR 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮거나, C1R 단백질의 발현 수준 또는 C1R 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높거나, CLU 단백질의 발현 수준 또는 CLU 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮거나, KLKB1 단백질의 발현 수준 또는 KLKB1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮은 경우 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정하는 단계를 포함하는, 췌장암의 진단방법 또는 췌장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 일예는, LRG1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1, LRG1)를 포함하는 췌관내 점액성 유두종양(Intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN) 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 고위험군 IPMN의 선별 진단용 조성물에 관한 것이다. 상기 IPMN 마커는 CA19-9(carbohydrate antigen 19-9), TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 IPMN 마커는 TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 마커와 LRG1을 포함하는 마커들이거나, TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종의 마커와 LRG1을 포함하는 조합 마커일 수 있다.
본 발명의 추가 일예는, CLU(Clusterin preproprotein); 및
LRG1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1, LRG1), CA19-9(carbohydrate antigen 19-9), TTR(Transthyretin, ATTR, Prealbumin, TBPA), C1R(Complement C1r subcomponent precursor) 및 KLKB1(Plasma Kallikrein protein;)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함하는 IPMN 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 고위험군 IPMN의 선별 진단용 조성물에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 IPMN 마커는 LRG1, CA19-9, TTR, C1R 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 마커와 CLU를 포함하는 조합 마커, 또는 LRG1, CA19-9, TTR, C1R 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종의 마커와 LRG1을 포함하는 조합 마커일 수 있다.
본 발명에 따른 일예는, 대상의 시료에 대해, 상기 IPMN 마커 단백질들의 발현 수준 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 각각 측정하는 단계,
상기 측정된 마커의 발현 수준을, 대조군 마커의 발현 수준과 비교하는 단계, 및
상기 마커 발현 수준의 비교 결과를 이용하여 상기 대상의 고위험 IPMN 여부를 결정하는 단계를 포함하는,
고위험군 IPMN을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 췌장암의 진단 마커를 제공함으로써, 췌장암의 발병 가능성, 조기 진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있으며, 췌장암의 종양형성 연구에 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 진단방법은 비침습적으로 혈액 등으로부터 간단하게 췌장암을 조기 진단할 수 있다.
도 1은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의한 대조군 및 췌장암 환자군에서의 CA19-9 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 MRM 정량 분석에 의한 대조군 및 췌장 도관 선암종 환자군의 LRG1 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 MRM 정량 분석에 의한 대조군 및 췌장 도관 선암종 환자군의 TTR 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 MRM 정량 분석에 의한 대조군 및 췌장 도관 선암종 환자군의 C1R 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 MRM 정량 분석에 의한 대조군 및 췌장 도관 선암종 환자군의 CLU 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 MRM 정량 분석에 의한 대조군 및 췌장 도관 선암종 환자군의 KLKB1 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 ELISA 정량 분석에 의한 대조군 및 췌장 도관 선암종 환자군의 LRG1 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 ELISA 정량 분석에 의한 대조군 및 췌장 도관 선암종 환자군의 TTR 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 ELISA 정량 분석에 의한 대조군 및 췌장 도관 선암종 환자군의 CLU 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 면역비탁법(immunoturbidimetric assay)에 의한 대조군 및 췌장 도관 선암종 환자군의 TTR 단백질의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 CA19-9, LRG1 및 TTR 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 12는 CA19-9, LRG1 및 TTR 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 초기 병기 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 13은 CA19-9, LRG1 및 TTR 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암과 기타 암의 구분을 위한 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 14는 CA19-9의 수치가 37 U/㎖ 이하인 실험군을 대상으로, CA19-9, LRG1 및 TTR 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 15는 CA19-9, LRG1 및 TTR 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 ELISA 방법에 의해 측정되었다.
도 16은 CA19-9, LRG1 및 TTR 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 초기 병기 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 ELISA 방법에 의해 측정되었다.
도 17은 CA19-9, LRG1 및 TTR 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암과 기타 암의 구분을 위한 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 ELISA 방법에 의해 측정되었다.
도 18은 CA19-9의 수치가 37 U/㎖ 이하인 실험군을 대상으로, CA19-9, LRG1 및 TTR 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 ELISA 방법에 의해 측정되었다.
도 19는 CA19-9, LRG1 및 TTR 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 단백질은 ELISA 방법에 의해, TTR 단백질은 면역비탁법에 의해 측정되었다.
도 20은 CA19-9, LRG1 및 TTR 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 초기 병기 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 단백질은 ELISA 방법에 의해, TTR 단백질은 면역비탁법에 의해 측정되었다.
도 21은 CA19-9, LRG1 및 TTR 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암과 기타 암의 구분을 위한 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 단백질은 ELISA 방법에 의해, TTR 단백질은 면역비탁법에 의해 측정되었다.
도 22는 CA19-9의 수치가 37 U/㎖ 이하인 실험군을 대상으로, CA19-9, LRG1 및 TTR 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 단백질은 ELISA 방법에 의해, TTR 단백질은 면역비탁법에 의해 측정되었다.
도 23은 CA19-9, LRG1 및 C1R 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 C1R 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 24는 CA19-9, LRG1 및 C1R 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 초기 병기 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 C1R 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 25는 CA19-9, LRG1 및 C1R 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암과 기타 암의 구분을 위한 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 C1R 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 26은 CA19-9의 수치가 37 U/㎖ 이하인 실험군을 대상으로, CA19-9, LRG1 및 C1R 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 C1R 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 27은 CA19-9, LRG1 및 CLU 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 28은 CA19-9, LRG1 및 CLU 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 초기 병기 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 29는 CA19-9, LRG1 및 CLU 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암과 기타 암의 구분을 위한 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 30은 CA19-9의 수치가 37 U/㎖ 이하인 실험군을 대상으로, CA19-9, LRG1 및 CLU 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 31은 CA19-9, LRG1 및 CLU 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 ELISA 방법에 의해 측정되었다.
도 32는 CA19-9, LRG1 및 CLU 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 초기 병기 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 ELISA 방법에 의해 측정되었다.
도 33은 CA19-9, LRG1 및 CLU 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암과 기타 암의 구분을 위한 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 ELISA 방법에 의해 측정되었다.
도 34는 CA19-9의 수치가 37 U/㎖ 이하인 실험군을 대상으로, CA19-9, LRG1 및 CLU 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 ELISA 방법에 의해 측정되었다.
도 35는 CA19-9, LRG1 및 KLKB1 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 36은 CA19-9, LRG1 및 KLKB1 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 초기 병기 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 37은 CA19-9, LRG1 및 KLKB1 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암과 기타 암의 구분을 위한 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 38은 CA19-9의 수치가 37 U/㎖ 이하인 실험군을 대상으로, CA19-9, LRG1 및 KLKB1 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용과 CA19-9와 TTR의 2가지 마커의 조합 사용시의 췌장암 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 39은 LRG1 단백질을 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 40 내지 도 44는 (LRG1 + CA19-9), (LRG1 + TTR), (LRG1 + CLU), (LRG1 + C1R), 또는 (LRG1 + KLKB1)의 두 가지 조합 단백질을 동시에 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1, TTR, CLU, C1R 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 45 내지 도 48은 (LRG1+CA19-9+TTR), (LRG1+CA19-9+CLU), (LRG1+CA19-9+C1R) 및 (LRG1+CA19-9+KLKB1)의 세 가지 조합 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1, TTR, CLU, C1R 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 49 내지 도 54는 (LRG1+TTR+CLU), (LRG1+TTR+C1R), (LRG1+TTR+KLKB1), (LRG1+CLU+C1R), (LRG1+CLU+KLKB1), 및 (LRG1+C1R+KLKB1)의 세 가지 조합 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1, TTR, CLU, C1R 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 55 내지 도 57은 (CLU + CA19-9), (CLU + TTR) 및 (CLU + KLKB1) 의 두 가지 조합 단백질을 동시에 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, TTR, CLU 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 58 내지 도 63는 (CLU+CA19-9+TTR), (CLU+CA19-9+C1R), (CLU+CA19-9+KLKB1), (CLU+TTR+C1R), (CLU+TTR+KLKB1), 및 (CLU+C1R+KLKB1)의 세 가지 조합 단백질을 동시에 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1, TTR, CLU, C1R 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 64는 LRG1 단백질을 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 저위험군 IPMN과 구별되는 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 65 내지 도 69는 (LRG1 + CA19-9), (LRG1 + TTR), (LRG1 + CLU), (LRG1 + C1R), 및 (LRG1 + KLKB1) 2가지 조합 마커 단백질을 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 저위험군 IPMN과 구별되는 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1, TTR, CLU, C1R 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 70 내지 도 73은 (CA19-9+LRG1+TTR), (CA19-9+LRG1+C1R), (CA19-9+LRG1+CLU), 및 (CA19-9+LRG1+KLKB1) 3가지 조합 마커 단백질을 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 저위험군 IPMN과 구별되는 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1, TTR, CLU, C1R 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 74 내지 도 79는 (LRG1+TTR+CLU), (LRG1+TTR+C1R), (LRG1+TTR+KLKB1), (LRG1+CLU+C1R), (LRG1+CLU+KLKB1) 및 (LRG1+C1R+KLKB1)의 3가지 조합 마커 단백질을 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 저위험군 IPMN과 구별되는 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1, TTR, CLU, C1R 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 80 내지 도 83은 (CLU + CA19-9), (CLU + TTR), (CLU + C1R) 및 (CLU + KLKB1)의 2 가지 조합 마커 단백질을 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 저위험군 IPMN과 구별되는 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1, TTR, CLU, C1R 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 84 내지 도 89은 (CLU+CA19-9+TTR), (CLU+CA19-9+C1R), (CLU+CA19-9+KLKB1), (CLU+TTR+C1R), (CLU+TTR+KLKB1) 및 (CLU+C1R+KLKB1) 의 3 가지 조합 마커 단백질을 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 저위험군 IPMN과 구별되는 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1, TTR, CLU, C1R 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다.
도 90은 LRG1 단백질을 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 저위험군 IPMN과 구별되는 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 단백질은 ELISA 분석에 의해 측정되었다.
도 91 내지 도 93는 (LRG1 + CA19-9), (LRG1 + TTR) 및 (LRG1 + CLU) 2가지 조합 마커 단백질을 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 저위험군 IPMN과 구별되는 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1, TTR, CLU, C1R 및 KLKB1 단백질은 ELISA 분석에 의해 측정되었다.
도 94 내지 도 97은 (LRG1+CA19-9+TTR), (LRG1+CA19-9+CLU), (LRG1+CA19-9+TTR+CLU) 및 (LRG1+TTR+CLU)의 조합 마커 단백질을 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 저위험군 IPMN과 구별되는 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1, TTR, CLU, C1R 및 KLKB1 단백질은 ELISA 분석에 의해 측정되었다.
도 98 내지 도 100은 (CLU + CA19-9), (CLU + TTR) 및 (CLU+CA19-9+TTR)의 조합 마커 단백질을 사용했을 때와 CA19-9 단백질을 단독 사용시의 저위험군 IPMN과 구별되는 고위험군 IPMN의 진단 성능(AUC 및 검출 민감도)을 비교한 것이다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1, TTR, CLU, C1R 및 KLKB1 단백질은 ELISA 분석에 의해 측정되었다.
본 발명에서 용어 "췌장암(pancreatic cancer)"이란 췌장 세포에서 기원하는 암(암종) 또는 종양을 의미한다. 췌장암에는 여러 가지 종류가 있으며, 수술적 절제로 치료 가능한 양성 종양에서부터 예후가 매우 좋지 않은 악성 종양에 이르기 까지 다양한 종류를 포함하며, 양성 종양, 악성 종양 그리고 양성이나 악성으로 변화하는 경우 등을 포함한다. 예를 들면, 췌장암의 악성 종양으로는 췌관세포에서 발생한 췌관 선암종(Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)이 췌장암의 약 90% 정도를 차지하고 있어 일반적으로 췌장암이라고 하면 췌관 선암종을 의미하는 좁은 의미로 사용되는 경우도 있으나, 그 외에 다양한 종류의 췌장암, 예를 들면 신경내분비 종양(neuroendocrine tumor) 및 선방 세포 암종(acinar cell tumor)을 포함한다. 또 다른 예로서, 대표적인 낭성 종양으로서 장액성 낭성 종양, 점액성 낭성 종양, 췌관내 유두상 점액성 종양(Intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN), 고형 가유두상 종양 등을 포함한다.
바람직하게는, 상기 췌장암은 췌관 선암종 또는 IPMN일 수 있으며, 상기 췌관 선암종은 다양한 원인에 의해서 발생할 수 있으며, 예를 들면 IPMN에서 유래된 췌관 선암종이거나 IPMN과 무관하게 발생할 수도 있으며, 또는 IPMN-유래 췌관 선암종을 제외할 수도 있다.
WHO의 종양 분류에서는 IPMN을 주 췌관 또는 그 주요 분지에서 발생하는 종양으로 상피가 내강 내로 유두상으로 성장하며 다양한 정도로 점액을 분비하고 췌관이 낭성으로 확장하는 것이 특징인 종양으로 정의하고 있다.
IPMN은 형태학적으로 주췌관의 미만성 확장, 점액이나 종 괴에 의한 비정형의 음영 결손, 부췌관의 낭성확장, 유두 개구부의 확대 및 다량의 점액이 유두 개구부에서 배출되는 소견 등으로 특징지어 지며, 조직학적으로는 췌관 내에 점액을 분비하는 세포들의 유두상 성장을 특징으로 하며 양성부터 악성까지 다양한 스펙트럼을 가지는 질환이다. IPMN은 종양이 발생하는 위치와 병변의 범위에 따라 주췌관형 (main duct type), 분지췌관형(branch duct type), 혼합형(mixed type)으로 나눌 수 있다.
IPMN의 예후를 결정하는 인자는 침습성, 임파절 전이, 혈관 침습, 조직학적 소견, 절제연의 조직학적 소견 등이며 이 중에서 가장 중요한 것은 침습성이다. 침습성 암이 발생 하기 전의 IPMN은 치유 가능한 질환이지만 침습성 암이 발생한 후의 IPMN은 잔존 췌장이 나 췌장외 조직에 재발이 50-90%에서 발생한다. IPMN은 치유적 절제 후에도 잔존 췌장에 재발이 가능하기 때문에 장기적으로 추적 관찰이 필요하며 생존률을 높이기 위해서는 적절한 조취가 필요하다.
따라서, IPMN의 악성도 평가는 이후 예후관찰 및 처치방법의 선택에 있어서 매우 중요하며, 통상 IPMN의 악성도는 수술후 현미경적 조직검사를 통해 구분되며 Low, Intermediate, High grade dysplasia, IPMN associated with an invasive carcinoma로 나뉘며 나열한 순서대로 악성도가 높아진다. 주변 stroma의 침윤이 있는 invasive carcinoma의 부분은 췌장암에서 가장 흔한 형태의 암종인 ductal adenocarcinoma의 형태나 mucinous noncystic carcinoma (colloid carcinoma)의 형태를 보일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 IPMN의 악성도 및/또는 침윤성에 따라 High grade dysplasia와 invasive type을 malignant subtype 또는 고위험(High risk) IPMN으로 정의하고, Low 및 Intermediate grade dysplasia을 저위험(low risk) IPMN으로 구분하여 이들 악성도를 구분하는 방법 및 조성물, 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 췌장암 관련 마커들은 저위험군 IPMN와 구별하여 고위험군 IPMN을 선별할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 췌장암 진단용 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 바람직하게는, 본 명세서에서 진단은 췌장암 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "마커", "바이오 마커" 또는 "진단용 마커"란 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료반응을 예측할 수 있고 객관적으로 측정할 수 있는 표지자를 의미한다. 특히, 본 발명에서 췌장암과 관련해서는, 정상 대조군(췌장암이 아닌 개체)에 비해 췌장암을 갖거나 췌장암 발병 가능성(위험성)이 있는 개체에서 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준이 유의적으로 증가하거나 감소하는 양상을 보이는, 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 의미한다.
본 발명은 (a) CA19-9(carbohydrate antigen 19-9)의 발현 수준을 측정하는 제제, (2) LRG1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1) 의 발현 수준을 측정하는 제제, 및 (3) TTR(Transthyretin, ATTR, Prealbumin, TBPA); C1R(Complement C1r subcomponent precursor), CLU(Clusterin preproprotein) 및 KLKB1(Plasma Kallikrein protein) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마커 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 췌장암 진단 마커들의 단백질 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 적어도 3가지 종류 이상의 마커들의 조합, 예를 들면 (a)CA19-9; (b)LRG1; 및 (c)TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나와의 조합된 마커 유전자들을 활용함으로써 대상으로부터 췌장암의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 효과적으로 진단하는 할 수 있다.
본 발명에서 췌장암 진단용 마커로 사용되는 CA19-9 단백질은 종래 사용되고 있는 췌장암 마커로서 소화기계의 암의 예후 판정을 위한 종양표지자 검사에 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용한 다른 췌장암 진단용 마커인 LRG1 단백질은 혈관형성에 관여하며 자궁내막암, 폐암 등과 관련이 있다. LRG1는 NCBI Accession #NP_443204.1일 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 췌장암 진단용 마커는 TTR, C1R, CLU 및 KLKB1로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. TTR 단백질은 127개의 아미노산 잔기로 구성된 소단위가 혈액 중에서 4합체를 형성하는 혈장 단백질의 하나로서 갑상선 호르몬을 뇌로 운반하는 역할을 하며, 알츠하이머, 유방암, 난소암, 위암 등과 관련이 있다. C1R 단백질은 보체(complement) 시스템 중 가장 먼저 발견된 것으로, 체내 면역 작용과 관련이 있으며, 알츠하이머 및 신장암과 관련이 있다. CLU 단백질은 혈액 내 단백질의 응고를 막는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 알츠하이머, 폐암 등과 관련이 있다. KLKB1 단백질은 혈액응고에 관여하며, 고혈압 및 폐암과 관련이 있다.
구체적인 예로서, TTR는 NCBI Accession #NP_000362.1이고, C1R는 NCBI Accession #NP_001724.3이고, CLU는 NCBI Accession #NP_001822.3이고, KLKB1는 NCBI Accession #NP_000883.2일 수 있다.
본 발명자들은 췌장 도관 선암종 (Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC) 환자, 췌관내 점액성 유두종양(Intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN) 환자, 및 만성 담낭염(chronic cholecystitis) 환자 개체의 혈장 시료를 분석하여, 아래 표 1과 같은 방법으로 CA19-9 및 LRG1과 TTR, C1R, CLU, KLKB1 중 하나로 구성되는 3종류의 마커 유전자의 조합을 이용하여, 상기 질병이 없는 개체인 정상 대조군의 혈장 시료를 분석하여 상기 바이오 마커 조합의 유효성을 확립하였다.
Figure 112015126360312-pat00001
본 발명에 사용된 용어, "단백질의 발현 수준 측정"이란 췌장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 췌장암 진단용 마커(단백질) 또는 이를 암호화하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 의미한다.
상기 단백질의 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량 분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 췌장암 진단용 조성물에서, CA19-9 단백질, LRG1 단백질, TTR 단백질, C1R 단백질, CLU 단백질 또는 KLKB1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 CA19-9 단백질, LRG1 단백질, TTR 단백질, C1R 단백질, CLU 단백질 또는 KLKB1 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 CA19-9 단백질, LRG1 단백질, TTR 단백질, C1R 단백질, CLU 단백질 또는 KLKB1 단백질에 대해 각각 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 췌장암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 사용된 용어 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-500]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에 사용된 용어 "mRNA의 발현 수준 측정"이란 췌장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 췌장암 진단용 단백질을 암호화하는 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 것을 의미한다.
이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 췌장암 진단용 조성물에서, CA19-9, LRG1, TTR, C1R, CLU 또는 KLKB1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 CA19-9, LRG1, TTR, C1R, CLU 또는 KLKB1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 각각 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1, TTR, C1R, CLU 및 KLKB1 단백질의 정보는 UniProt 등에 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 각각 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 췌장암 진단용 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다. 예를 들면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
본 발명에 따른 췌장암 진단용 조성물 또는 이를 포함하는 진단용 키트는, CA19-9과 LRG1 그리고 TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마커를 포함하는 췌장암 마커들을 사용함으로써, CA19-9의 단독 마커를 사용하는 조성물 또는 키트나 CA19-9와 LRG1의 2개의 마커를 사용하는 조성물 또는 키트에 비해 진단 성능이 매우 우수하다.
상기 췌장암 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 암호화하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 췌장암 진단용 조성물 또는 이를 포함하는 진단용 키트는 췌장암 환자와 정상인을 구분하는 용도 외에도, 췌장암 초기 병기(1기 또는 2기)의 환자와 정상인을 구분하는 용도로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 (a) CA19-9의 발현 수준을 측정하는 제제, (b) LRG1의 발현 수준을 측정하는 제제, 및 (c) TTR, C1R, CLU 및 KLKB1로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 췌장암 초기 병기, 예컨대 1기 또는 2기 병기의 췌장암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 췌장암 진단용 조성물 또는 이를 포함하는 진단용 키트는 췌장암 환자와 정상인을 구분하는 용도 외에도, 기타 암 환자로부터 췌장암 환자를 선별적으로 검출하는 용도로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 (a) CA19-9의 발현 수준을 측정하는 제제, (b) LRG1의 발현 수준을 측정하는 제제, 및 (c) TTR, C1R, CLU 및 KLKB1로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암과 기타 암을 구분하기 위한 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 췌장암 진단용 조성물 또는 상기 췌장암 진단용 키트를 이용하여 대상의 췌장암 진단하는 방법 또는 췌장암 진단의 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 진단방법은 하기의 단계를 포함한다:
췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계;
상기 대상 시료로부터 (a)CA19-9, (b) LRG1 및 (c) TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마커를 포함하는 췌장암 마커들의 단백질 발현 수준 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 대상 시료의 (a)CA19-9, (b) LRG1 및 (c) TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마커를 포함하는 췌장암 마커들의 발현 수준을, 각각 상응하는 정상 대조군 시료의 마커의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 상기 마커의 발현 수준 비교결과를 이용하여 대상의 췌장암 여부를 결정하는 단계.
본 발명에 따른 대상의 췌장암 진단하는 방법 또는 췌장암 진단의 정보를 제공하는 방법에 적용되는 상기 "대상"은 췌장암의 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로서 환자, 환자 의심군 또는 정상군을 포함하며, 예를 들면 암진단을 받지 않은 건강인으로서 건강 검진에서 PDAC를 조기 진단하고자 하는 대상이거나, 췌장암 환자 중 수술로 암이 제거된 환자의 동종 암 재발을 진단하기 위한 정기적인 검사를 위한 대상을 포함한다. 일 실시예에서는 상기 대상은 포유류를, 또 다른 실시예에서는 인간을 의미할 수 있다.
상기 마커의 발현 수준 비교결과를 이용하여 대상의 췌장암 여부를 결정하는 단계는, 구체적으로 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높고, LRG1 단백질의 발현 수준 또는 LRG1 단백질을 암호화하는 유전자의 mNRA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높으며, TTR 단백질의 발현 수준 또는 TTR 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮거나, C1R 단백질의 발현 수준 또는 C1R 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높거나, CLU 단백질의 발현 수준 또는 CLU 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮거나, KLKB1 단백질의 발현 수준 또는 KLKB1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮은 경우 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정할 수 있다.
상기 방법에서 "시료"란 생물학적 시료(biological sample)로서 췌장암 발병에 의해 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈장을 의미한다.
상기 CA19-9 및 LRG1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA는 췌장암 환자에서의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준과 비교하여 증가하고, TTR, CLU 및 KLKB1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA는 췌장암 환자에서의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준과 비교하여 감소하며, C1R 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA는 췌장암 환자에서의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준과 비교하여 증가하므로, 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 상기 (a)CA19-9, (b) LRG1 및 (c)TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 마커들의 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 췌장암 발병 가능성을 판정할 수 있다.
예를 들어, CA19-9 및 LRG1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 췌장암 환자에서의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준과 비교하여 증가하고, TTR 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 췌장암 환자에서의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준과 비교하여 감소하는 경우 상기 대상은 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정할 수 있다.
상기 '췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높다'는 것은 다양한 방법에 의해 측정될 때 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 1.0배를 초과, 1.5배를 초과, 2배를 초과, 3배를 초과, 5배를 초과 또는 10배를 초과하는 것을 의미한다. 상기 표현은 LRG1 또는 C1R 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 지칭할 때 동일하게 적용된다.
또한, 상기 '췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 TTR 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮다'는 것은 다양한 방법에 의해 측정될 때 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 TTR 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 0.1배 미만, 0.2배 미만, 0.3배 미만, 0.5배 미만 또는 1배 미만인 것을 의미한다. 상기 표현은 CLU 또는 KLKB1 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 지칭할 때 동일하게 적용된다.
하나의 구현예에서, 상기 '췌장암 발병 가능성이 높다고 판정하는 것'은 췌장암 진단 함수를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 췌장암 진단 함수의 예로는 하기 함수식 1을 들 수 있다:
＜함수식 1＞
Figure 112015126360312-pat00002
상기 식에서,
x 는 췌장암 진단용 마커들의 발현 수준 측정값,
αi는 SVM에서의 라그랑주 승수,
yi는 정상군/췌장암군의 구분자,
xi는 기준 측정값을, 그리고
b 는 보정치를 의미한다.
상기 함수는 SVM(Support Vector Machine)으로부터 도출된다. SVM은 라그랑주 최적화 이론(Lagrangian optimization theory)에 기반하여 주어진 조건을 만족하는 함수를 추정하는 알고리즘으로, 이 중에서 최대 마진 분류자(Maximum margin classifier)를 사용하는 분류분석 방법을 적용하는 경우를 서포트 벡터 분류(Support Vector Classification, SVC)라 한다. 상기 함수에 CA19-9 및 LRG1과, TTR, C1R, CLU 및 KLKB1 중 어느 하나의 MRM 상대 측정값을 대입하였을 때, 함수 값이 1이면 췌장암 발병 가능성이 높은 것으로 진단하고, 함수 값이 -1이면 정상으로 진단한다.
본 발명의 방법은 췌장암 발병 가능성을 CA19-9 및 LRG1과, TTR, C1R, CLU 및 KLKB1 중 어느 하나의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수치를 췌장암 진단 함수에 대입하여 그 결과로 췌장암 발병 가능성을 즉각적으로 판정할 수 있는바, 의사의 임상학적 판단이 필요하지 않다.
본 연구에서는 진단 함수를 SVM으로 구축하였으나, 이는 용도에 따라 Neural Network, Random Forest 등의 여러 기계학습법(Machine Learning)을 비롯한 여러 종류의 판별함수 구축법(Discriminant Analysis)으로 구현될 수 있다.
또한, (a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료로부터 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준, 및 LRG1 단백질의 발현 수준 또는 LRG1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; (c) 상기 시료로부터 TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 (b) 및 (c)에서 측정된 수치를 하기 함수식 1에 대입하여 췌장암 발병 가능성을 판정하는 단계를 포함하는, 췌장암의 진단방법을 제공한다:
＜함수식 1＞
Figure 112015126360312-pat00003
상기 식에서, x 는 CA19-9 및 LRG1과, TTR, C1R, CLU 및 KLKB1 중 어느 하나의 단백질의 신규 측정값을, αi는 SVM에서의 라그랑주 승수를, yi는 정상군/췌장암군의 구분자를, xi는 기준 측정값을, 그리고 b 는 보정치를 의미한다.
본 발명의 방법에서, 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.
본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 유전자의 존재 또는 부존재를 확인하기 위한 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, CA19-9, LRG1, C1R, CLU 및 KLKB1 단백질 각각의 발현 수준 자체를 측정 및 비교하기 위해서, LC-MRM 방법이 사용될 수 있다.
구체적으로 생물학적 시료 중의 단백질을 부피% 기준으로 95% 증류슈, 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산의 용액과 5% 증류수, 95% 아세토니트릴 및 0.1% 포름산의 용액을 50분간 95:5 내지 15:85의 부피 비율로 농도구배를 가하면서 LC 분석 컬럼을 통과시켜 분리할 수 있다. 용액 혼합 비율에 따라 특정 물질에 대한 분해능이 달라질 수 있기 때문에 농도 구배를 실시하며, 상기 범위는 다양한 단백질들을 동시에 분리하기 위한 최적 범위이다. 우선 컬럼을 Sol A(95% 증류슈, 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)으로 10분간 평형화한 후 Sol B(5% 증류수, 95% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)로 50분간 5%에서 85%까지, 5분간 85%의 농도 구배를 통해 펩타이드를 용출하였다.
질량 분석에서는 MS/MS 모드인 MRM(Multiple reaction monitoring)으로 정량을 실시할 수 있다. SIM(Selected Ion Monitoring)이 질량분석기의 소스 부분에서 한 번 충돌하여 생긴 이온을 이용하는 방법인 반면, MRM은 한 번 깨진 이온 중에서 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 또 다른 MS의 소스를 한 번 더 통과시켜 충돌시킨 후 이 중에서 얻은 이온들을 이용하는 방법이다. SIM에서는 선택한 정량이온이 혈장에서도 검출되는 이온인 경우에 정량에 방해가 될 수 있다는 문제점이 있다. 반면, MRM을 이용하는 경우, 같은 질량을 가진 이온이라도 한 번 더 깨지면 분자구조가 달라지면서 차별화된 경향을 나타내므로, 이를 정량이온으로 사용하게 되면 백그라운드에서 방해되는 피크가 제거되어 한 층 더 깨끗한 베이스 라인을 얻을 수 있다. 더불어 Stable isotope standard(SIS) 펩타이드를 합성해 측정하고 이를 표적 펩타이드의 측정치와 비교함으로써 보다 우수한 분석 감도에서 정확하게 원하는 물질들을 동시에 분석할 수 있다.
상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 단백질 발현 수준과 췌장암 개체에서의 단백질 발현 수준을 비교할 수 있고, 췌장암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 췌장암 발병 가능성 여부를 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에서, CA19-9, LRG1, C1R, CLU 및 KLKB1 단백질을 암호화하는 각각의 유전자의 mRNA 발현 수준의 측정 또는 비교는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 췌장암 발병 가능성 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.
한편, 본 발명은 췌장암 진단방법을 위한 정보를 제공하기 위하여, (a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료로부터 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준, 및 LRG1 단백질의 발현 수준 또는 LRG1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 각각 측정하는 단계; (c) 상기 시료로부터 TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; (d) 상기 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준, 및 상기 LRG1 단백질의 발현 수준 또는 LRG1 단백질을 암호화하는 유전자의 mNRA 발현 수준을 각각 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (e) 상기 TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 각각 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 췌장암 마커의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 췌장암 진단용 마커, 조성물, 키트 및 진단방법에 있어서, 상기 췌장암은 IPMN일 수 있으며, 구체적으로는 고위험군 IPMN일 수 있다. 상기 조성물은 저위험군 IPMN와 구별하여 고위험군 IPMN을 선별하는 것이거나, 정상군, IPMN과 췌관 선종암을 제외한 췌장 질환을 갖는 환자, 또는 저위험 IPMN을 갖는 대상인 대조군과 구별하여, 고위험군 IPMN을 선별적으로 진단할 수 있다. 고위험군 IPMN은 High grade dysplasia와 invasive type IPMN을 포함할 수 있으며, 상기 고위험 IPMN는 IPMN 유래 췌관 선종암을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 일예에서, LRG1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1, LRG1)를 포함하는 췌관내 점액성 유두종양(Intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN) 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 고위험군 IPMN의 선별 진단용 조성물에 관한 것이다. 상기 IPMN 마커는 CA19-9(carbohydrate antigen 19-9), TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 IPMN 마커는 TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 마커와 LRG1을 포함하는 마커들, 또는 TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종의 마커와 LRG1을 포함하는 조합 마커일 수 있다.
본 다른 일예는, CLU(Clusterin preproprotein); 및
LRG1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1, LRG1), CA19-9(carbohydrate antigen 19-9), TTR(Transthyretin, ATTR, Prealbumin, TBPA), C1R(Complement C1r subcomponent precursor) 및 KLKB1(Plasma Kallikrein protein;)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함하는 IPMN 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 고위험군 IPMN의 선별 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일예는 대상의 시료에 대해, 상기 IPMN 마커 단백질들의 발현 수준 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 각각 측정하는 단계,
상기 측정된 마커의 발현 수준을, 대조군 마커의 발현 수준과 비교하는 단계, 및
상기 마커 발현 수준의 비교 결과를 이용하여 상기 대상의 고위험 IPMN 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 고위험군 IPMN을 진단하는 방법에 관한 것이다.
상기 마커의 발현 수준을 측정하는 단계 이전에, 대상이 IPMN을 갖는 것인지 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 확인하는 단계는 영상진단법, 조직검사법 또는 유전자 마커를 이용한 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들면 복부 초음파 검사, 복부 전산화 단층 촬영 (Computed tomography, CT), 내시경 역행성 췌담관 조영술 (endoscopic retrograde cholangiopancreatography, ERCP), 자기공명 췌담도 조영술(magnetic resonance cholangiopancreatography, MRCP), 초음파 내시경 검사(Endoscopic ultrasonography, EUS) 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 바이오 마커를 이용한 진단은 알려진 췌장암 진단 마커인 CA-19-9등을 이용하여 수행할 수 있다. 조직검사법은 FNA(fine needle aspiration) biopsy 등을 들 수 있다.
상기 대조군은 정상군, IPMN과 췌관 선종암을 제외한 췌장 질환을 갖는 환자, 또는 저위험 IPMN을 갖는 대상인 경우, 상기 IPMN 마커를 활용하여 정상인 및 다양한 췌장질환과 구별되게 고위험군 IPMN을 진단할 수 있으며, 또한 대조군이 저위험군 IPMN 환자인 경우, 저위험군 IPMN과 구별되게 고위험군 IPMN을 선별적으로 진단할 수 있다.
상기 방법은, 대상의 고위험 IPMN으로 결정된 경우, 외과적 절제술, 약물 투여 등의 처치방법을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은, 대상의 저위험 IPMN으로 결정된 경우, 약물 투여, 또는 예후의 모니터링 등의 처리를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
기타, 상기 IPMN 마커, 발현수준 측정, 및 결정하는 단계 등은 상술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험을 위한 샘플의 준비
췌장암을 효과적으로 진단하기 위한 단백질 조합을 발굴하기 위해, 하기 표 2 및 표 3에서와 같이 5개 병원의 환자의 동의 하에 췌장암, 기타 암, 췌장염 및 담낭염 환자군(표 2) 과 정상군(표 3)을 구성하였다.
시험 1은 PDAC 구분 시험을 위한 샘플군으로서, 대조군은 정상, 췌장염 및 담낭염 군으로 구성되었고, 실험군은 췌장암(PDAC) 군으로 구성되었다.
시험 2는 PDAC 초기 병기 구분 시험을 위한 샘플군으로서, 대조군은 정상, 췌장염 및 담낭염 군으로 구성되었고, 실험군은 췌장암(PDAC) 1기 및 2기 군으로 구성되었다.
시험 3은 암/췌장암 선택성 시험을 위한 샘플군으로서, 대조군은 기타 암군으로 구성되었고, 실험군은 췌장암 군으로 구성되었다. 기타암은 유방암 52례, 대장암 45례, 갑상선암 52례이다.
시험 4는 CA19-9가 임상적으로 성능을 발휘하지 못하는 상태에서의 PDAC 구분 시험을 위한 샘플군으로서, 대조군은 CA19-9의 수치가 37 U/㎖ 미만인 정상, 췌장염 및 담낭염 군으로 구성되었고, 실험군은 CA19-9의 수치가 37 U/㎖ 미만인 췌장암(PDAC) 군으로 구성되었다.
Figure 112015126360312-pat00004
Figure 112015126360312-pat00005
실시예 2: MRM-MS 방법에 의한 췌장암 진단 마커 조합의 발굴 및 성능 분석
＜2-1＞ 혈액 시료 전처리
각 혈액 시료 40 ㎕를 depletion column에 통과시켜 혈액에서 가장 많은 비율을 차지하고 있는 7개의 단백질을 결실시키고, 3 kDa 필터로 농축한 후, BCA 정량을 수행하여 이중 200 ㎍에 해당하는 혈장을 취해 6 M 우레아(urea)로 변성시키고, 20 mM DTT 및 50 mM 이오도아세트산(iodoacetic acid)을 사용하여 환원 및 알킬화시켰다. 여기에 트립신을 50:1(단백질:트립신, w/w)의 비율로 37℃에서 16시간 동안 처리하여 단백질을 펩타이드로 만든 후, 상기 펩타이드를 C18 OASIS 컬럼(Waters, USA)을 사용하여 탈염하고 동결건조하였다. 상기 동결건조된 펩타이드를 용액 A(98% 증류수, 2% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)에 녹이고, 이에 대하여 MRM 분석을 수행하였다.
＜2-2＞ 트랜지션 선정
MRM 분석을 수행하기 위해, 특정 단백질의 특징적인 전하 대 질량비(m/z)를 가지는 펩타이드를 선정하고(Q1), 이 펩타이드를 전기적인 충격으로 단편화시켰을 때 발생하는 여러 절편 이온 중 해당 펩타이드에 대해 특징적인 m/z를 가지는 단편 이온을 선정하였다(Q3). 이 Q1과 Q3의 조합은 특정 단백질에 특이적인 이온들의 조합으로서 이를 트랜지션이라 명칭하며, 고분해능(triple quadrupole) 질량 분광 분석기에서 이 특징적인 Q1과 Q3으로 이온들을 순차적으로 통과시켰을 때 얻어지는 신호를 정량적 정보로 환산하여 정량 분석을 수행하였다. 미국 워싱턴 대학교의 MacCoss 연구팀에서 개발한 스카이라인(SKYLine)이라는 공개 소프트웨어를 이용하여 NIST(National Institute of Standards and Technology)라이브러리의 펩타이드 탠덤 질량 스펙트럼(peptide tandem mass spectra)을 기반으로 ms/ms 데이터가 존재하는 펩타이드에 대해, 총 강도가 높은 순으로 1개의 단백질당 최대 10개의 펩타이드를 선정하였다. 펩타이드의 길이는 아미노산 최소 7개부터 최대 24개로 선정하였다.
단, 트립신에 의해 절단되어 생성될 수 있는 전체 펩타이드 중에서 아래에 해당되는 아미노산을 포함하거나 특정 모티프(motif)를 갖고 있는 펩타이드는 다음과 같이 신호 값이 좋지 않다고 알려져 있어서 제외하였다:
ⓐ 해당 펩타이드 내에 메티오닌이 존재할 경우, 생체 내 ROS(reactive oxygen species)에 의해 산화가 발생하여 질량 값이 32Da 증가;
ⓑ 해당 펩타이드 내에 히스티딘이 존재할 경우, R-그룹의 양전하로 인해 해당 펩타이드의 전하 상태가 바뀜;
ⓒ 해당 펩타이드 내에 NxS/T 모티프가 존재할 경우, N-당화가 발생하여 질량 값이 이동(shift)함;
ⓓ 해당 펩타이드 내에 트립신에 의해 잘릴 수 있는 R이나 K 다음에 프롤린이 존재하는 경우, 미절단(missed cleavage)이 발생할 수 있음.
전구체(precursor) 전하는 +2가 전하를 갖는 펩타이드를 선정하고, 이온 전하는 +1가 전하, 이온 타입은 y-이온을 사용하였다. 단백질 블라스트(Protein Blast) P 및 스카이라인(Skyline) 프로그램을 이용하여 독특한 트랜지션 및 펩타이드를 선별하고, 최종 선별된 트랜지션은 예측하는 정체 시간(Retention time, RT) 범위 내에 속한 것들만 사용하였다. RT 예측을 위해, 600개의 SIS 펩타이드 MRM 분석을 진행하고, 이를 통하여 소수성 도표(hydrophobicity scale)과 RT 크로마토그램에 기초한 검량선(calibration curve)을 계산하였다.
＜2-3＞ LC 및 MRM
LC는 애질런트사의 1260-모세관 LC를 사용하고, 펩타이드의 분리를 위해 모세관 RR 0.5 x 150 3.5 um의 컬럼을 사용하였다. 시료는 5 ㎕를 주입하였고, 유속은 20 ㎕/분으로 설정하였다. 우선 컬럼을 Sol A(부피 기준으로 95% 증류슈, 5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)으로 10분간 평형화한 후 Sol A와 Sol B(부피 기준으로 5% 증류수, 95% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)를 50분간 95:5에서 15:85까지, 5분간 15:85의 부피 비율로 농도 구배를 가하여 펩타이드를 용출하였다.
질량분석기(Mass spectrometer)로서 애질런트사의 triple quadrupole 6490-QQQ 장비를 이용하여 선정 단백질들에 대한 트랜지션에 대해 MRM 모드로 모니터링하였다. 배치(Batch) 간 편차를 보정하기 위해 각 시료에 스파이킹(spiking)된 5 fmol 베타-갈락토시다아제 펩타이드(GDFQFNISR[C13N15], 547.3/646.4)도 동시에 모니터링하였다.
＜2-4＞ 데이터 정량 분석
정량성을 확인하기 위해, 내부 표준 펩타이드인 베타-갈락토시다아제 펩타이드(GDFQFNISR[C13N15], 547.3/646.4 m/z)를 0.09, 0.27, 0.82, 2.5, 7.4, 22.2, 66.7 및 200 fmol로 각각 희석한 다음, 여기에 표적 펩타이드 분석 조건과 동일하게 혈장 10 ug을 매트릭스로 넣어서 분석을 진행하였다. 또한 내인성(endogenous) 신호를 확인할 목적으로 내부 표준 펩타이드를 넣지 않은 경우도 분석에 포함시켰으며, 모든 9개의 농도 점에서 3회 반복하여 MRM 정량하여 표준 곡선(standard curve)을 결정하였다.
각 개인별 MRM 결과는 스카이라인(MacCoss Lab, ver1.4.1)을 사용하여 해당 MRM 트랜지션의 이온 추출 크로마토그래피(XIC, Extract ion chromatography)를 생성하였으며, 각 트랜지션의 피크 면적을 계산하고 이를 다시 시간 경과에 따라 도식화하였다. 더불어 각 표적 펩타이드에 대한 SIS(Stable isotope standard) 펩타이드를 합성하여 측정하고, 해당 표적 펩타이드 측정치와의 비율을 계산하여 혈액 내의 양을 각 단백질 별로 정량 분석하였다.
상기 MRM 정량 분석 결과를 이용하여 표 1의 방법으로 도출한 4개의 조합 마커에 포함된 단백질들의 췌장암 환자군에서의 발현 양상은 다음과 같다.
도 1 및 2에서 보는 바와 같이 CA19-9 및 LRG1 단백질의 발현이 정상군에 비해 췌장암 환자군에서 특이적으로 증가됨을 확인할 수 있었고, 상기 CA19-9 및 LRG1을 췌장암 진단용 마커로 선발하였다.
도 3 내지 6에서 보는 바와 같이, TTR, CLU 및 KLKB1 단백질의 발현이 정상군에 비해 췌장암 환자군에서 특이적으로 감소됨을 확인할 수 있었고, C1R 단백질의 발현이 정상군에 비해 췌장암 환자군에서 특이적으로 증가됨을 확인할 수 있었다.
실시예 3: ELISA 방법에 의한 췌장암 진단용 단백질 조합의 발굴 및 성능 분석
췌장암 환자군 및 정상군을 대상으로 LRG1, TTR 및 CLU 단백질의 발현량을 ELISA 법에 의해 측정하였다. LRG1의 경우 IBL사의 hLRG1 ELISA 키트를 이용하였고, TTR의 경우 AssayPro사의 프리알부민 ELISA 키트를 이용하였으며, CLU의 경우 R＆D Systems사의 Human Clusterin Quantikine 키트를 이용하였고, 각 ELISA 측정은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
구체적으로, 실험하기 전에 ELISA 키트와 분석할 검체를 실온에 놓아둔 다음, 검체를 전용 희석액으로 희석(LRG1: 1,000배; TTR: 80,000배; CLU: 2,091배)하였다. 각 웰에 표준, 대조군 및 검체를 각각 50㎕씩 분주하였다. 각 웰에 커버 실러를 덮고 2시간 동안 실온에 둔 다음, 각 웰에 있는 용액을 버리고 증류수로 세척하는 과정을 4회 반복하였다. 이후, 200㎕의 컨주게이트를 각 웰에 분주하였다. 각 웰에 새로운 커버 실러로 덮고 2시간 동안 실온에 둔 다음, 증류수로 세척하는 과정을 4회 반복하였다. 이후, 200㎕의 기질 용액을 각 웰에 분주한 다음 실온에 30분간 두었다. 그리고 나서, 50㎕의 정지 용액을 각 웰에 분주한 다음, 540nm 또는 570nm에서 흡광도를 측정하고, 농도값을 계산하여 결과를 정리하였다.
상기 ELISA 정량 분석 결과, 도 7 내지 9에서 보는 바와 같이, LRG1 단백질의 발현이 정상군에 비해 췌장암 환자군에서 특이적으로 증가하였고, TTR 단백질의 발현이 정상군에 비해 췌장암 환자군에서 특이적으로 감소하였으며, CLU 단백질의 발현이 정상군에 비해 췌장암 환자군에서 특이적으로 감소되는 것으로 확인되었고, 이는 실시예 2의 MRM-MS 결과와 동일하였다.
실시예 4: 면역비탁법(immunoturbidimetric assay)에 의한 췌장암 진단용 마커의 발굴 및 성능 분석
췌장암 환자군 및 정상군을 대상으로 TTR 단백질의 발현량을 면역비탁법(immunoturbidimetric assay)에 의해 측정하였다. 상기 측정은 Roche Diagnostics사의 COBAS INTEGRA 800 Prealbumin을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
구체적으로, 실험하기 전에 기기와 분석할 검체를 실온에 놓아둔 다음, 검체를 50㎕씩 분주하였다. 분주한 검체를 전용 희석액으로 4배 희석하였다. 상기 희석한 검체 200㎕을 기기에 투입하고, 기기에서 출력하는 농도값으로 결과를 정리하였다.
상기 면역비탁법에 의한 정량 분석 결과, 도 10에서 보는 바와 같이, TTR 단백질의 발현이 정상군에 비해 췌장암 환자군에서 특이적으로 감소되는 것으로 확인되었고, 이는 실시예 2 및 3의 MRM-MS 및 ELISA 결과와 동일하였다.
실시예 5: MRM-MS 방법에 의한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 진단 성능
＜5-1＞ PDAC 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 Roche Diagnostics社 COBAS Elecsys CA 19-9 기기를 이용한 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다.
췌장암 진단 함수를 사용한 경우 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합의 췌장암 진단 마커로서의 성능을 ROC 그래프의 AUC와 Sn|Sp=0.9로 나타내었다. ROC 그래프는 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면 상에 표현한 것인데, ROC 그래프 아래의 면적(AUC; 0 ≤ AUC ≤ 1)이 넓을수록 정확하다고 판단할 수 있다. Sn|Sp=0.9는 특이도(specificity)가 0.9일 때의 민감도(sensitivity) 값으로, 검출 민감도를 나타내는 수치이며, 그 값이 클수록 정확하다고 판단할 수 있다.
상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 4 및 도 11에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00006
상기 표 4 및 도 11에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 AUC가 0.9312이고, Sn|Sp =0.9가 0.8250으로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 CA19-9, LRG1 및 TTR을 각각 단독 사용 또는 2개씩 조합하여 사용할 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜5-2＞ PDAC 초기 병기 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 췌장암 초기 병기 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 5 및 도 12에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00007
상기 표 5 및 도 12에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 AUC가 0.9070이고, Sn|Sp=0.9가 0.7600으로서 췌장암 초기 병기 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 췌장암 초기 병기 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜5-3＞ 암/췌장암 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 암 및 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 5 및 도 13에 나타내었다.
상기 표 5 및 도 13에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 AUC가 0.8994이고, Sn|Sp=0.9가 0.8250으로서 암과 췌장암 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 암/췌장암 구분 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜5-4＞ CA19-9 ＜ 37 U/㎖인 실험군을 대상으로 한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 PDAC 구분 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 CA19-9 ＜ 37 U/㎖인 실험군을 대상으로 분석하였다. 주로 임상에서는 측정자의 CA19-9 측정치가 37 U/㎖ 이상일 때 췌장암으로 판단한다. 따라서 CA19-9 ＜ 37 U/㎖인 실험군에서는 CA19-9가 췌장암 진단 마커로서의 성능을 발휘할 수 없다. 상기 CA19-9 단백질은 Roche Diagnostics社 COBAS Elecsys CA 19-9 기기를 이용한 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다.
췌장암 진단 함수를 사용한 경우 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합의 췌장암 진단 마커로서의 성능을 ROC 그래프의 AUC와 Sn|Sp=0.9로 나타내었다. ROC 그래프는 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면 상에 표현한 것인데, ROC 그래프 아래의 면적(AUC; 0 ≤ AUC ≤ 1)이 넓을수록 정확하다고 판단할 수 있다. Sn|Sp=0.9는 특이도(specificity)가 0.9일 때의 민감도(sensitivity) 값으로, 검출 민감도를 나타내는 수치이며, 그 값이 클수록 정확하다고 판단할 수 있다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 5 및 도 14에 나타내었다.
상기 표 5 및 도 14에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 AUC가 0.8295이고, Sn|Sp=0.9가 0.5172로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 6: ELISA 방법에 의한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 진단 성능
실시예 5에서 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석했던 것을 ELISA 방법으로 성능 재현 여부를 확인하였으며, ELISA 방법에서도 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 췌장암 진단 성능이 우수함을 확인할 수 있었다.
＜6-1＞ PDAC 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 진단 성능
실시예 3의 ELISA 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 ELISA 방법에 의해 측정하였다.
상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 6 및 도 15에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00008
상기 표 6 및 도 15에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 AUC가 0.9315이고, Sn|Sp=0.9가 0.8250으로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜6-2＞ PDAC 초기 병기 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 진단 성능
실시예 3의 ELISA 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 췌장암 초기 병기 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 ELISA 방법에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 6 및 도 16에 나타내었다.
상기 표 6 및 도 16에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 AUC가 0.9144이고, Sn|Sp=0.9가 0.7800으로서 췌장암 초기 병기 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 췌장암 초기 병기 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜6-3＞ 암/췌장암 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 진단 성능
실시예 3의 ELISA 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 암 및 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 ELISA 방법에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 6 및 도 17에 나타내었다.
상기 표 6 및 도 17에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 AUC가 0.8981이고, Sn|Sp=0.9가 0.8250으로서 암과 췌장암 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 암/췌장암 구분 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜6-4＞ CA19-9 ＜ 37 U/㎖인 실험군을 대상으로 한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 PDAC 구분 진단 성능
실시예 3의 ELISA 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 CA19-9 ＜ 37 U/㎖인 실험군을 대상으로 분석하였다. 주로 임상에서는 측정자의 CA19-9 측정치가 37 U/㎖ 이상일 때 췌장암으로 판단한다. 따라서 CA19-9 ＜ 37 U/㎖인 실험군에서는 CA19-9가 췌장암 진단 마커로서의 성능을 발휘할 수 없다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 ELISA 방법에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 6 및 도 18에 나타내었다.
상기 표 6 및 도 18에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 AUC가 0.8287이고, Sn|Sp=0.9가 0.5172로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 면역비탁법에 의한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 진단 성능
실시예 5에서 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석했던 것을 면역비탁법으로 성능 재현 여부를 확인하였으며, 면역비탁법에서도 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 췌장암 진단 성능이 우수함을 확인할 수 있었다.
＜7-1＞ PDAC 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 진단 성능
실시예 4의 면역비탁법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 단백질은 ELISA 방법에 의해, TTR 단백질은 면역비탁법에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 7 및 도 19에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00009
상기 표 7 및 도 19에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 AUC가 0.9402이고, Sn|Sp=0.9가 0.8250으로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜7-2＞ PDAC 초기 병기 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 진단 성능
실시예 4의 면역비탁법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 췌장암 초기 병기 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 단백질은 ELISA 방법에 의해, TTR 단백질은 면역비탁법에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 7 및 도 20에 나타내었다.
상기 표 7 및 도 20에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 AUC가 0.9146이고, Sn|Sp=0.9가 0.7600으로서 췌장암 초기 병기 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 췌장암 초기 병기 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜7-3＞ 암/췌장암 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 진단 성능
실시예 4의 면역비탁법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 암 및 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 단백질은 ELISA 방법에 의해, TTR 단백질은 면역비탁법에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 7 및 도 21에 나타내었다.
상기 표 7 및 도 21에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 AUC가 0.8965이고, Sn|Sp=0.9가 0.8250으로서 암과 췌장암 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 암/췌장암 구분 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜7-4＞ CA19-9 ＜ 37 U/㎖인 실험군을 대상으로 한 CA19-9, LRG1 및 TTR 조합 마커의 PDAC 구분 진단 성능
실시예 4의 면역비탁법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 CA19-9 ＜ 37 U/㎖인 실험군을 대상으로 분석하였다. 주로 임상에서는 측정자의 CA19-9 측정치가 37 U/㎖ 이상일 때 췌장암으로 판단한다. 따라서 CA19-9 ＜ 37 U/㎖인 실험군에서는 CA19-9가 췌장암 진단 마커로서의 성능을 발휘할 수 없다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 단백질은 ELISA 방법에 의해, TTR 단백질은 면역비탁법에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 7 및 도 22에 나타내었다.
상기 표 7 및 도 22에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 AUC가 0.8439이고, Sn|Sp=0.9가 0.5172로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용할 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 8: MRM-MS 방법에 의한 CA19-9, LRG1 및 C1R 조합 마커의 진단 성능
＜8-1＞ PDAC 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 C1R 조합 마커의 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 C1R의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 C1R 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 8 및 도 23에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00010
상기 표 8 및 도 23에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 C1R의 조합은 AUC가 0.9296이고, Sn|Sp=0.9가 0.8375로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 C1R의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9을 단독으로 사용할 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜8-2＞ PDAC 초기 병기 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 C1R 조합 마커의 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 C1R의 조합 마커의 췌장암 초기 병기 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 C1R 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 9 및 도 24에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00011
상기 표 9 및 도 24에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 C1R의 조합은 AUC가 0.9097이고, Sn|Sp=0.9가 0.7800으로서 췌장암 초기 병기 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 C1R의 조합은 CA19-9, LRG1 및 C1R을 각각 단독 또는 2개씩 조합하여 사용할 때보다 췌장암 초기 병기 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜8-3＞ 암/췌장암 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 C1R 조합 마커의 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 C1R의 조합 마커의 암 및 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 C1R 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 10 및 도 25에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00012
상기 표 10 및 도 25에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 C1R의 조합은 AUC가 0.9088이고, Sn|Sp=0.9가 0.8375로서 암과 췌장암 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 C1R의 조합은 상용 췌장암 마커인 CA19-9을 단독으로 사용할 때보다 암/췌장암 구분 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜8-4＞ CA19-9 ＜ 37 U/㎖인 실험군을 대상으로 한 CA19-9, LRG1 및 C1R 조합 마커의 PDAC 구분 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 C1R의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 C1R 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 10 및 도 26에 나타내었다.
상기 표 10 및 도 26에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 C1R의 조합은 AUC가 0.8160이고, Sn|Sp=0.9가 0.5517로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 C1R의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 9: MRM-MS 방법에 의한 CA19-9, LRG1 및 CLU 조합 마커의 진단 성능
＜9-1＞ PDAC 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 CLU 조합 마커의 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 11 및 도 27에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00013
상기 표 11 및 도 27에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 AUC가 0.9338이고, Sn|Sp=0.9가 0.8500으로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 CA19-9, LRG1 및 CLU를 각각 단독 또는 2개씩 조합하여 사용할 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜9-2＞ PDAC 초기 병기 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 CLU 조합 마커의 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합 마커의 췌장암 초기 병기 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 12 및 도 28에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00014
상기 표 12 및 도 28에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 AUC가 0.9027이고, Sn|Sp=0.9가 0.7800으로서 췌장암 초기 병기 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히 본, 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9을 단독으로 사용할 때보다 췌장암 초기 병기를 진단하는 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜9-3＞ 암/췌장암 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 CLU 조합 마커의 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합 마커의 암 및 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 12 및 도 29에 나타내었다.
상기 표 12 및 도 29에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 AUC가 0.9093이고, Sn|Sp=0.9가 0.8500으로서 암과 췌장암 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 상용 췌장암 마커인 CA19-9을 단독으로 사용할 때보다 암/췌장암 구분 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜9-4＞ CA19-9 ＜ 37 U/㎖인 실험군을 대상으로 한 CA19-9, LRG1 및 CLU 조합 마커의 PDAC 구분 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 12 및 도 30에 나타내었다.
상기 표 12 및 도 30에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 AUC가 0.8384이고, Sn|Sp=0.9가 0.5862로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 10: ELISA 방법에 의한 CA19-9, LRG1 및 CLU 조합 마커의 진단 성능
실시예 9에서 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석했던 것을 ELISA 방법으로 성능 재현 여부를 확인하였으며, ELISA 방법에서도 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 췌장암 진단 성능이 우수함을 확인할 수 있었다.
＜10-1＞ PDAC 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 CLU 조합 마커의 진단 성능
실시예 3의 ELISA 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 ELISA 정량 분석에 의해 측정되었다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 13 및 도 31에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00015
상기 표 13 및 도 31에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 AUC가 0.9399이고, Sn|Sp=0.9가 0.8000으로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 CA19-9, LRG1 및 CLU를 각각 단독 또는 2개씩 조합하여 사용할 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜10-2＞ PDAC 초기 병기 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 CLU 조합 마커의 진단 성능
실시예 3의 ELISA 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합 마커의 췌장암 초기 병기 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 ELISA 정량 분석에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 14 및 도 32에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00016
상기 표 14 및 도 32에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 AUC가 0.9193이고, Sn|Sp=0.9가 0.6400으로서 췌장암 초기 병기 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히 본, 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9을 단독으로 사용할 때보다 췌장암 초기 병기를 진단하는 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜10-3＞ 암/췌장암 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 CLU 조합 마커의 진단 성능
실시예 3의 ELISA 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합 마커의 암 및 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 ELISA 정량 분석에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 14 및 도 33에 나타내었다.
상기 표 14 및 도 33에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 AUC가 0.9079이고, Sn|Sp=0.9가 0.8000으로서 암과 췌장암 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 상용 췌장암 마커인 CA19-9을 단독으로 사용할 때보다 암/췌장암 구분 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜10-4＞ CA19-9 ＜ 37 U/㎖인 실험군을 대상으로 한 CA19-9, LRG1 및 CLU 조합 마커의 PDAC 구분 진단 성능
실시예 3의 ELISA 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 CLU 단백질은 ELISA 정량 분석에 의해 측정되었다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 14 및 도 34에 나타내었다.
상기 표 14 및 도 34에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 AUC가 0.8435이고, Sn|Sp=0.9가 0.4828로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 CLU의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 11: MRM-MS 방법에 의한 CA19-9, LRG1 및 KLKB1 조합 마커의 진단 성능
＜11-1＞ PDAC 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 KLKB1 조합 마커의 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 KLKB1의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 15 및 도 35에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00017
상기 표 15 및 도 35에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 KLKB1의 조합은 AUC가 0.9382이고, Sn|Sp=0.9가 0.8625로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 KLKB1의 조합은 CA19-9, LRG1 및 KLKB1을 각각 단독 또는 2개씩 조합하여 사용할 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜11-2＞ PDAC 초기 병기 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 KLKB1 조합 마커의 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 KLKB1의 조합 마커의 췌장암 초기 병기 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정되었다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 16 및 도 36에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00018
상기 표 16 및 도 36에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 KLKB1의 조합은 AUC가 0.9148이고, Sn|Sp=0.9가 0.8000으로서 췌장암 초기 병기 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 KLKB1의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9을 단독으로 사용할 때보다 췌장암 초기 병기 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜11-3＞ 암/췌장암 구분을 위한 CA19-9, LRG1 및 KLKB1 조합 마커의 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 KLKB1의 조합 마커의 암 및 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 16 및 도 37에 나타내었다.
상기 표 16 및 도 37에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 KLKB1의 조합은 AUC가 0.8924이고, Sn|Sp=0.9가 0.8625로서 암과 췌장암 구분을 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 KLKB1의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 암/췌장암 구분 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
＜11-4＞ CA19-9 ＜ 37 U/㎖인 실험군을 대상으로 한 CA19-9, LRG1 및 KLKB1 조합 마커의 PDAC 구분 진단 성능
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, CA19-9, LRG1 및 KLKB1의 조합 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 KLKB1 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 16 및 도 38에 나타내었다.
상기 표 16 및 도 38에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 KLKB1의 조합은 AUC가 0.8349이고, Sn|Sp=0.9가 0.6207로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 CA19-9, LRG1 및 KLKB1의 조합은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 12: 췌장암 진단 - 데이터 통계 분석
＜12-1＞ CA19-9 + LRG1 + TTR
통계 분석을 위해서 SVM(Support Vector Machine)을 이용하였다. SVM은 라그랑주 최적화 이론(Lagrangian optimization theory)에 기반하여 주어진 조건을 만족하는 함수를 추정하는 알고리즘으로, 이 중에 최대 마진 분류기(Maximum margin classifier)를 사용하는 분류 분석방법을 사용하는 경우를 서포트 벡터 분류(Support Vector Classification, SVC)라고 한다. 본 실시예에서는 두 샘플군 중 한 샘플군을 사용하여, 해당 샘플군 내의 두 집단(정상 집단과 암환자 집단) 간 차이를 최대로 하는 SVC를 기계학습을 통해 도출하여 아래와 같은 췌장암 진단 함수를 구성하였다.
Figure 112015126360312-pat00019
x 는 췌장암 진단용 마커들의 발현 수준 측정값,
αi는 SVM에서의 라그랑주 승수,
yi는 정상군/췌장암군의 구분자,
xi는 기준 측정값을, 그리고
b 는 보정치를 의미한다.
상기 식에서, 함수 값이 1이면 췌장암으로, -1이면 정상으로 판단한다. 상기 함수를 이용하여 췌장암 여부를 판단하였다.
구체적으로, 3명의 정상 대조군으로부터 CA19-9 측정치, TTR 및 LRG1의 MRM 정량값으로서 각각 (7.4, 1.451, 3.2359), (6.3, 1.0718, 2.136) 및 (26.1, 1.2053, 3.1797)을 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f(7.4, 1.451, 3.2359) = -1, f(6.3, 1.0718, 2.136) = -1, f(26.1, 1.2053, 3.1797) = -1로 계산되어 상기 대상을 정상으로 판별할 수 있었다.
또한, 3명의 췌장암 환자로부터 CA19-9 측정치, TTR및 LRG1의 MRM 정량값으로서 각각 (45318, 4.898, 1.2514), (145, 2.4608, 1.6616)과 (889, 2.5153, 1.5474)을 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f(45318, 4.898, 1.2514) = 1, f(145, 2.4608, 1.6616) = 1, f(889, 2.5153, 1.5474) = 1로 계산되어 상기 대상을 췌장암으로 판별할 수 있었다.
＜12-2＞ CA19-9 + LRG1 + C1R
통계 분석을 위해서 SVM(Support Vector Machine)에 기초한 함수식 1을 이용하여 췌장암 여부를 판단하였다.
3명의 정상 대조군으로부터 CA19-9 측정치, LRG1 및 C1R의 MRM 정량값으로서 각각 (7.4, 1.451, 1.0748), (6.3, 1.0718, 0.4531) 및 (26.1, 1.2053, 1.0929)을 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 (7.4, 1.451, 1.0748) = -1, f(6.3, 1.0718, 0.4531) = -1, f(26.1, 1.2053, 1.0929) = -1로 계산되어 상기 대상을 정상으로 판별할 수 있었다.
또한, 3명의 췌장암 환자로부터 CA19-9 측정치, LRG1 및 C1R의 MRM 정량값으로서 각각 (45318, 4.893, 1.3742), (145, 2.4608, 1.483)과 (889, 2.5153, 1.474)을 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f(45318, 4.893, 1.3742) = 1, f(145, 2.4608, 1.483) = 1, f(889, 2.5153, 1.474) = 1로 계산되어 상기 대상을 췌장암으로 판별할 수 있었다.
＜12-3＞ CA19-9 + LRG1 + CLU
통계 분석을 위해서 SVM(Support Vector Machine) 에 기초한 함수식 1을 이용하여 췌장암 여부를 판단하였다. 3명의 정상 대조군으로부터 CA19-9 측정치, LRG1 및 CLU의 MRM 정량값으로서 각각 (7.4, 1.451, 3.3803), (6.3, 1.0718, 3.1325) 및 (26.1, 1.2053, 2.8642)을 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f(7.4, 1.451, 3.3803) = -1, f(6.3, 1.0718, 3.1325) = -1, f(26.1, 1.2053, 2.8642) = -1로 계산되어 상기 대상을 정상으로 판별할 수 있었다.
또한, 3명의 췌장암 환자로부터 CA19-9 측정치, LRG1 및 CLU의 MRM 정량값으로서 각각 (45318, 4.893, 1.6821), (145, 2.4608, 2.545)과 (889, 2.5153, 1.5101)을 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f(45318, 4.893, 1.6821) = 1, f(145, 2.4608, 2.545) = 1, f(889, 2.5153, 1.5101) = 1로 계산되어 상기 대상을 췌장암으로 판별할 수 있었다.
＜12-4＞ CA19-9 + LRG1 + KLKB1
통계 분석을 위해서 SVM(Support Vector Machine) 에 기초한 함수식 1을 이용하여 췌장암 여부를 판단하였다. 3명의 정상 대조군으로부터 CA19-9 측정치, LRG1 및 KLKB1의 MRM 정량값으로서 각각 (7.4, 1.451, 1.2801), (6.3, 1.0718, 0.961) 및 (26.1, 1.2053, 1.5657)을 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f(7.4, 1.451, 1.2801) = -1, f(6.3, 1.0718, 0.961) = -1, f(26.1, 1.2053, 1.5657) = -1로 계산되어 상기 대상을 정상으로 판별할 수 있었다.
또한, 3명의 췌장암 환자로부터 CA19-9 측정치, LRG1 및 KLKB1의 MRM 정량값으로서 각각 (45318, 4.893, 0.555), (145, 2.4608, 0.5347)과 (889, 2.5153, 0.8084)을 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f(45318, 4.893, 0.555) = 1, f(145, 2.4608, 0.5347) = 1, f(889, 2.5153, 0.8084) = 1로 계산되어 상기 대상을 췌장암으로 판별할 수 있었다.
실시예 13: 췌장암 초기 병기 진단 - 데이터 통계 분석
통계 분석을 위해서 SVM(Support Vector Machine) 에 기초한 함수식 1을 이용하여 췌장암 초기 병기 여부를 판단하였다. 3명의 정상 대조군으로부터 CA19-9 측정치, LRG1 및 KLKB1의 MRM 정량값으로서 각각 (7.4, 1.451, 1.2801), (6.3, 1.0718, 0.961) 및 (26.1, 1.2053, 1.5657)을 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f(7.4, 1.451, 1.2801) = -1, f(6.3, 1.0718, 0.961) = -1, f(26.1, 1.2053, 1.5657) = -1로 계산되어 상기 대상을 정상으로 판별할 수 있었다.
또한, 3명의 췌장암 초기 병기 환자로부터 CA19-9 측정치, LRG1 및 KLKB1의 MRM 정량값으로서 각각 (154.52, 4.0994, 1.2722), (190.16, 4.5008, 0.7645)과 (1052.8, 3.5696, 0.6775)을 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f(154.52, 4.0994, 1.2722) = 1, f(190.16, 4.5008, 0.7645) = 1, f(1052.8, 3.5696, 0.6775) = 1로 계산되어 상기 대상을 췌장암 초기 병기 환자로 판별할 수 있었다.
실시예 14: 췌장암과 기타 암의 구분 진단 - 데이터 통계 분석
통계 분석을 위해서 SVM(Support Vector Machine) 에 기초한 함수식 1을 이용하여 췌장암 초기 병기 여부를 판단하였다. 3명의 기타 암환자로부터 CA19-9 측정치, LRG1 및 KLKB1의 MRM 정량값으로서 각각 (8, 1.3985, 0.7085), (10.68, 0.9864, 0.776) 및 (7.32, 1.1431, 0.9214)을 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f(8, 1.3985, 0.7085) = -1, f(10.68, 0.9864, 0.776) = -1, f(7.32, 1.1431, 0.9214) = -1로 계산되어 상기 대상을 기타 암 환자로 판별할 수 있었다.
또한, 3명의 췌장암 환자로부터 CA19-9 측정치, LRG1 및 KLKB1의 MRM 정량값으로서 각각 (280.72, 4.0849, 0.9165), (4000, 5.7558, 0.7216)과 (120.32, 6.2917, 0.555)을 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f(154.52, 4.0994, 1.2722) = 1, f(190.16, 4.5008, 0.7645) = 1, f(1052.8, 3.5696, 0.6775) = 1로 계산되어 상기 대상을 췌장암 환자로 판별할 수 있었다.
실시예 15: 실험을 위한 샘플의 준비
malignant subtype의 IPMN을 효과적으로 탐지하기 위하여, 하기 표 17에서와 같이 서울대학교 병원의 환자의 동의 하에 정상군과 실험군(고위험군)으로 구분하였다.
시험 5는 High grade dysplasia와 invasive type을 고위험(malignant) subtype IPMN 실험군과, low dysplasia IPMN, intermediate dysplasia IPMN, 정상군 및 양성 염증 동반 질환자로서 담석증 환자를 대조군으로 구성하였다.
시험 6는 MMS 분석방법에 따라 고위험군과 저위험군을 선별 탐지하는 지 여부를 확인하고자, High grade dysplasia와 invasive type을 고위험(malignant) subtype IPMN 실험군을 low dysplasia IPMN 및 intermediate dysplasia IPMN과 선별 탐지를 위한 실험군으로 구성되었다.
시험 7는 ELISA 분석방법에 따라 고위험군과 저위험군을 선별 탐지하는 지 여부를 확인하고자, High grade dysplasia와 invasive type을 고위험(malignant) subtype IPMN 실험군을 low dysplasia IPMN 및 intermediate dysplasia IPMN과 선별 탐지를 위한 실험군으로 구성되었다.
Figure 112015126360312-pat00020
실시예 16: MRM-MS 방법에 의한 고위험 IPMN의 탐지
실시예 2의 MRM-MS 방법을 이용하여, 하기 표 32의 마커의 고위험 IPMN에 대한 진단 성능을 분석하였다. 상기 CA19-9 단백질은 Roche Diagnostics社 COBAS Elecsys CA 19-9 기기를 이용한 화학발광 효소 면역 분석법(CLEIA)에 의해, LRG1 및 TTR 단백질은 MRM 정량 분석에 의해 측정하였다.
췌장암 진단 함수와 같은 방법으로 진단함수를 사용한 경우 CA19-9, LRG1 및 TTR의 조합의 진단 마커로서의 성능을 ROC 그래프의 AUC와 Sn|Sp=0.9로 나타내었다. ROC 그래프는 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면 상에 표현한 것인데, ROC 그래프 아래의 면적(AUC; 0 ≤ AUC ≤ 1)이 넓을수록 정확하다고 판단할 수 있다. Sn|Sp=0.9는 특이도(specificity)가 0.9일 때의 민감도(sensitivity) 값으로, 검출 민감도를 나타내는 수치이며, 그 값이 클수록 정확하다고 판단할 수 있다.
상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 18 및 도 39 내지 도 63에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00021
상기 표 18 및 도 39 내지 도 63에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 마커 또는 2이상의 마커 조합은 대조군과 구별되게 고위험군 IPMN을 선별적으로 탐지하기 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 조합 마커들은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 고위험군 IPMN 탐지 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 17: MRM-MS 방법에 의한 저위험 IPMN와 고위험 IPMN의 선별 탐지
저위험 IPMN와 고위험 IPMN의 구별하여 탐지하기 위하여, 실시예 15의 시료 시험 6에 대해서, 실시예 16의 MMS 분석법과 실질적으로 동일한 방법으로 하기 표 33에 나타낸 시험을 수행하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 19 및 도 64 내지 도 89에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00022
상기 표 19 및 도 64 내지 도 89에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 마커 또는 2이상의 마커 조합은 저위험군 IPMN와 구별되게 고위험군 IPMN을 선별적으로 탐지하기 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 조합 마커들은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 고위험군 IPMN 탐지 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 18: ELISA 방법에 의한 저위험 IPMN와 고위험 IPMN의 선별탐지
실시예 17에서 MRM-MS 방법을 이용하여 마커의 췌장암 구분에 대한 진단 성능을 분석했던 것을 ELISA 방법으로 성능 재현 여부를 확인하였으며, ELISA 방법에서도 표 20의 마커 조합은 고위험 IPMN의 구별 진단 성능이 우수함을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 저위험 IPMN와 고위험 IPMN의 구별하여 탐지하기 위하여, 실시예 15의 시험 7에 대해서, 실시예 6의 ELISA 분석법과 실질적으로 동일한 방법으로 하기 표 20에 나타낸 시험을 수행하였다. 상기 AUC 및 Sn|Sp=0.9의 측정 결과를 표 34 및 도 90 내지 도 100에 나타내었다.
Figure 112015126360312-pat00023
상기 표 20 및 도 90 내지 도 100에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 마커 또는 2이상의 마커 조합은 저위험군 IPMN와 구별되게 고위험군 IPMN을 선별적으로 탐지하기 위한 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에 따른 마커들은 상용 췌장암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용했을 때보다 고위험군 IPMN 탐지 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다.

Claims (27)

  1. LRG1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1, LRG1)를 포함하는 췌관내 점액성 유두종양(Intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN) 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는,
    고위험군 IPMN의 선별 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 저위험군 IPMN와 구별하여 고위험군 IPMN을 선별하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 IPMN 마커는 CA19-9(carbohydrate antigen 19-9), TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 마커를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 IPMN 마커는 TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 마커와 LRG1을 포함하는 마커들인 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 IPMN 마커는 TTR, C1R, CLU 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종의 마커와 LRG1을 포함하는 조합 마커인 조성물.
  6. CLU(Clusterin preproprotein); 및
    LRG1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1, LRG1), CA19-9(carbohydrate antigen 19-9), TTR(Transthyretin, ATTR, Prealbumin, TBPA), C1R(Complement C1r subcomponent precursor) 및 KLKB1(Plasma Kallikrein protein)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함하는 IPMN 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 고위험군 IPMN의 선별 진단용 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 IPMN 마커는 LRG1, CA19-9, TTR, C1R 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 마커와 CLU를 포함하는 조합 마커인 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 IPMN 마커는 LRG1, CA19-9, TTR, C1R 및 KLKB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종의 마커와 CLU을 포함하는 조합 마커인 조성물.
  9. 제4항 내지 제8항중 어느 한 항에 에 있어서, 상기 LRG1 단백질은 NCBI Accession No: NP_443204.1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 TTR 단백질은 NCBI Accession No: NP_000362.1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 C1R 단백질은 NCBI Accession No: NP_001724.3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 CLU 단백질은 NCBI Accession No: NP_001822.3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 KLKB1 단백질은 NCBI Accession No: NP_000883.2 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  10. 제1항 또는 제6항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제가, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)를 포함하는 조성물.
  11. 제1항 또는 제6항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제가 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  12. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 고위험군 IPMN의 선별 진단용 키트.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 키트가 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 고위험군 IPMN의 선별 진단용 키트.
  14. 대상의 시료에 대해, 제4항 내지 제8항중 어느 한항에 따른 고위험군 IPMN의 선별 진단용 조성물에 따른 췌관내 점액성 유두종양(Intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN) 마커 단백질들의 발현 수준 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 각각 측정하는 단계,
    상기 측정된 마커의 발현 수준을, 대조군 마커의 발현 수준과 비교하는 단계, 및
    상기 마커 발현 수준의 비교 결과를 이용하여 상기 대상의 고위험군 IPMN 여부를 결정하는 단계를 포함하는,
    고위험군 IPMN 진단의 정보를 제공하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 마커의 발현 수준을 측정하는 단계 이전에, 대상이 IPMN을 갖는 것인지 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 확인하는 단계는 영상진단법, 조직검사법 또는 유전자 마커를 이용한 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 대상은 외과적 절제술로 IPMN 조직이 제거된 환자인 방법.
  18. 제 14 항에 있어서, 상기 대조군은 정상군, IPMN과 췌관 선암종을 제외한 췌장 질환을 갖는 환자, 또는 저위험군 IPMN을 갖는 대상인 방법.
  19. 제 14 항에 있어서, 상기 고위험군 IPMN은 고도 이형성증(High grade dysplasia)와 침윤성 IPMN(invasive type IPMN)을 포함하는 것인 방법.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 제 14 항에 있어서, 상기 고위험군 IPMN의 결정 단계는,
    상기 마커들의 발현 수준을 비교한 결과, 측정대상의 시료에서 (a)CA19-9 및 (b)LRG1 발현 수준이 대조군에서의 발현 수준보다 높으며, 측정대상의 시료에서 (c) TTR, CLU, 및 KLKB1 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮거나, 측정대상의 시료에서 C1R의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높은 경우, 대상의 고위험군 IPMN으로 결정하는 것인 방법.
  23. 제 14 항에 있어서, 상기 고위험군 IPMN는 IPMN 유래 췌관 선암종을 포함하는 것인 방법.
  24. 제 14 항에 있어서, 상기 시료가 혈액, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는, 방법.
  25. 제 14 항에 있어서, 상기 마커의 발현 수준 측정이 해당 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 14 항에 있어서, 상기 마커의 발현 수준 측정 또는 비교가,
    단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 14 항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준 측정이 역전사효소 중합효소 반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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