KR101834588B1 - 가교 히알루론산 조성물 및 자기 가교 히알루론산 입자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 평형 팽윤 배율이 3 내지 10배인 자기 가교 히알루론산의 입자와, 수계 용매를 함유하는 가교 히알루론산 조성물이며, 가교 히알루론산 조성물의 전체 부피에 대한 자기 가교 히알루론산의 입자의 건조 중량은 3 내지 8w/v%인 가교 히알루론산 조성물을 제공한다. 본 발명의 가교 히알루론산 조성물에서는, 평형 팽윤 배율이 상기 소정 범위 내인 자기 가교 히알루론산의 입자를 이용함으로써, 고농도로 해도 점도가 급격히 상승하지 않으므로, 가교 히알루론산 조성물을 주사제에 적용한 경우에, 적은 투여 횟수로도 충분한 변형성 무릎 관절증의 치료 효과를 얻을 수 있다.
Description
본 발명은 가교 히알루론산 조성물 및 그것에 이용되는 자기 가교 히알루론산 입자 및 해당 가교 히알루론산 조성물을 함유하는 주사제 및 그것을 수용하는 프리필드 시린지(prefilled syringe) 제제에 관한 것이다.
히알루론산은, β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 교대로 결합한 직쇄상의 고분자 다당이다. 히알루론산은, 우수한 생체 적합성 및 점탄성을 나타내는 점에서, 의용 분야로의 전개가 진행되고 있다. 그 하나로서, 변형성 무릎 관절증을 위한 점성 보충제로서 가교된 히알루론산을 이용하는 것이 특허문헌 1에 개시되어 있다.
그러나, 변형성 무릎 관절증의 질환 관절 부위에 히알루론산을 주입하는 경우에는, 유효한 치료 효과를 얻기 위해 수회 내지 10회 정도의 투여 횟수가 필요해서, 환자에게 큰 부담이 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은, 종래보다 투여 횟수를 적게 한 경우에도, 변형성 무릎 관절증에 대해 충분한 치료 효과를 얻을 수 있는 가교 히알루론산 조성물 및 그것에 이용하는 자기 가교 히알루론산 입자를 제공하는 데에 있다.
본 발명은 평형 팽윤 배율이 3 내지 10배인 자기 가교 히알루론산의 입자와, 수계 용매를 함유하는 가교 히알루론산 조성물이며, 가교 히알루론산 조성물의 전체 부피에 대한 자기 가교 히알루론산 입자의 건조 중량은 3 내지 8w/v%인, 가교 히알루론산 조성물을 제공한다.
종래부터 알려져 있는 히알루론산 또는 가교 히알루론산을 이용하여 변형성 무릎 관절증의 주사제를 제조함에 있어서, 투여 횟수를 줄이고자 고농도(예를 들면 건조 중량으로 3 내지 8w/v%)로 하면, 점도가 급격히 상승하여 주사기(시린지)로 환부에 주입하는 것이 매우 곤란하였다. 한편, 주사기로부터의 주입을 용이하게 하고자 한다면, 히알루론산 또는 가교 히알루론산의 분자량이나 농도를 저하시켜야만 해서, 적은 투여 횟수로는 충분한 변형성 무릎 관절증의 치료 효과를 얻을 수 없었다.
본 발명에서는, 평형 팽윤 배율이 상기 소정 범위 내인 자기 가교 히알루론산의 입자를 이용함으로써, 고농도로 해도 점도가 급격히 상승하지 않으므로, 가교 히알루론산 조성물을 주사제에 적용한 경우에, 적은 투여 횟수로도 충분한 변형성 무릎 관절증의 치료 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 가교 히알루론산 조성물에 있어서, 자기 가교 히알루론산의 입자는, 평균 부피 입경이 10 내지 100㎛인 것이 바람직하다. 평균 부피 입경과 평형 팽윤 배율이 상기 소정 범위 내인 자기 가교 히알루론산의 입자를 이용함으로써, 고농도로 해도 점도가 급격히 상승하지 않으므로, 가교 히알루론산 조성물을 주사제에 적용한 경우에, 적은 투여 횟수로도 충분한 변형성 무릎 관절증의 치료 효과를 얻을 수 있다.
평균 부피 입경과 평형 팽윤 배율이 상기 소정 범위 내인 본 발명의 가교 히알루론산 조성물에서는, 자기 가교 히알루론산의 입자는 자기 가교 에스테르화도가 0.05 내지 0.50mol%인 것이 바람직하다. 또한, 자기 가교 히알루론산 입자는 생체 내의 조건에서 용이하게 가수분해하는 에스테르 결합에 의해 가교한 자기 가교 히알루론산으로 이루어져 있다. 에스테르 결합이 가수분해되면 분자상의 히알루론산이 생성된다. 가수분해되어 생성하는 히알루론산의 분자량(1차 분자량이라 정의하고, 점도 평균 분자량으로 표시됨)은, 그 치료 효과로부터 80만 이상인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 가교 히알루론산 조성물에서는, 자기 가교 히알루론산의 입자는 에틸에스테르량이 0.05mol% 이하이고, 자기 가교 에스테르화도가 0.05 내지 0.50mol%인 것이 바람직하다. 에틸에스테르량, 자기 가교 에스테르화도 및 평형 팽윤 배율이 상기 소정 범위 내인 자기 가교 히알루론산의 입자를 이용함으로써, 고농도로 해도 점도가 급격히 상승하지 않으므로, 가교 히알루론산 조성물을 주사제에 적용한 경우에, 적은 투여 횟수로도 충분한 변형성 무릎 관절증의 치료 효과를 얻을 수 있다.
에틸에스테르량, 자기 가교 에스테르화도 및 평형 팽윤 배율이 상기 소정 범위 내인 본 발명의 가교 히알루론산 조성물에 있어서, 자기 가교 히알루론산 입자는 생체 내의 조건에서 용이하게 가수분해하는 에스테르 결합에 의해 가교한 자기 가교 히알루론산으로 이루어져 있다. 에스테르 결합이 가수분해되면 분자상의 히알루론산이 생성된다. 가수분해되어 생성하는 히알루론산의 분자량(1차 분자량이라 정의하고, 점도 평균 분자량으로 표시됨)은 그 치료 효과로부터 80만 이상인 것이 바람직하다.
자기 가교 히알루론산의 입자로서, 평균 부피 입경 10 내지 100㎛, 평형 팽윤 배율 3 내지 10배, 1차 분자량 80만 이상, 자기 가교 에스테르화도가 0.05 내지 0.50mol%인 것을 이용함으로써, 또는 자기 가교 히알루론산의 입자로서, 에틸에스테르량 0.05mol% 이하, 자기 가교 에스테르화도 0.05 내지 0.50mol%, 평형 팽윤 배율 3 내지 10배, 1차 분자량이 80만 이상인 것을 이용함으로써, 투여 횟수의 감소 및 변형성 무릎 관절증의 치료 효과가 보다 현저해진다. 예를 들면, pH7.0±0.5, 온도 36.0±2.0℃의 10mM 인산 완충화 생리적 식염수 중에 침지함으로써, 30일 이내로 가교 히알루론산을 전량 용해할 수 있으며, 이때 충분히 고분자량인 히알루론산을 생성시킬 수 있어, 이에 따라 높은 치료 효과를 얻을 수 있다. 또한, 콘 플레이트를 사용하는 회전 점도 측정법에 의해, 25±2℃, 전단 속도 50S-1에서 측정한 점도를 300mPa·s 이하로 할 수 있기 때문에, 주사제로서의 주입이 용이해진다.
본 발명은 상기한 가교 히알루론산 조성물을 함유하는 주사제를 제공한다. 종래의 히알루론산 베이스의 주사제에서는, 상술한 바와 같이 히알루론산을 3 내지 8w/v%의 고농도로 하면, 점도가 급격히 상승하여 주사기(시린지)로 환부에 주입하는 것이 매우 곤란하였다. 그러나, 본 발명에 따른 주사제는, 상기 소정의 물성을 구비한 자기 가교 히알루론산의 입자를 포함하는 가교 히알루론산 조성물을 이용하기 때문에, 적은 투여 횟수로도 충분한 변형성 무릎 관절증의 치료 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 1회당 1.25mg/kg(체중) 이상의 상기 자기 가교 히알루론산이 투여되도록 이용되는 주사제, 또는 1회당 75mg 이상의 상기 자기 가교 히알루론산이 투여되도록 이용되는 주사제를 제공한다. 종래의 히알루론산 베이스의 주사제에서는, 상술한 바와 같이 히알루론산이 고농도에서는 점도가 상승하여 시린지로부터 환부로의 주입이 곤란하였다. 그 때문에, 충분한 치료 효과를 발생시키는 양의 히알루론산을 1회에 투여할 수 없었다. 그러나, 본 발명에 따른 주사제는, 상기한 물성을 구비한 자기 가교 히알루론산의 입자를 포함하는 가교 히알루론산 조성물을 이용하기 때문에, 1회당 1.25mg/kg(체중) 이상 또는 1회당 75mg 이상의 자기 가교 히알루론산이 투여되도록 이용될 수 있어, 단회 투여로도 충분한 변형성 무릎 관절증의 치료 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 상기 주사제를 수용한 프리필드 시린지 제제를 제공한다. 종래의 히알루론산 베이스의 주사제를 수용한 프리필드 시린지 제제는, 상술한 바와 같이 히알루론산을 고농도(예를 들면 3 내지 8w/v%)로 하면, 점도가 매우 높아지기 때문에, 시린지로 주사제를 환부에 주입하는 것이 곤란하였다. 그러나, 본 발명에 따른 프리필드 시린지 제제는, 상기 소정의 물성을 구비한 자기 가교 히알루론산의 입자를 포함하는 가교 히알루론산 조성물을 주사제로서 주사통 내부에 수용하고 있기 때문에, 적은 투여 횟수로도 충분한 변형성 무릎 관절증의 치료 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 평균 부피 입경이 10 내지 100㎛이고, 평형 팽윤 배율이 3 내지 10배인 자기 가교 히알루론산 입자를 제공한다. 상기 소정의 물성을 구비한 자기 가교 히알루론산 입자는, 그것을 함유하는 가교 히알루론산 조성물이 주사제에 적용된 경우에 3 내지 8w/v%의 고농도로 해도 점도가 급격히 상승하지 않기 때문에, 적은 투여 횟수로도 충분한 변형성 무릎 관절증의 치료 효과를 얻을 수 있다.
평균 부피 입경과 평형 팽윤 배율이 상기 소정 범위 내인 본 발명의 자기 가교 히알루론산 입자는, 1차 분자량이 80만 이상이고, 자기 가교 에스테르화도가 0.05 내지 0.50mol%인 것이 바람직하다. 이러한 자기 가교 히알루론산 입자를 이용함으로써, 투여 횟수의 감소 및 변형성 무릎 관절증의 치료 효과가 보다 현저해진다.
또한, 본 발명은 에틸에스테르량 0.05mol% 이하, 자기 가교 에스테르화도 0.05 내지 0.50mol%, 평형 팽윤 배율 3 내지 10배인 자기 가교 히알루론산 입자를 제공한다. 상기 소정의 물성을 구비한 자기 가교 히알루론산 입자는, 그것을 함유하는 가교 히알루론산 조성물이 주사제에 적용된 경우에, 3 내지 8w/v%의 고농도로 해도 점도가 급격히 상승하지 않기 때문에, 적은 투여 횟수로도 충분한 변형성 무릎 관절증의 치료 효과를 얻을 수 있다.
에틸에스테르량, 자기 가교 에스테르화도 및 평형 팽윤 배율이 상기 소정 범위 내인 본 발명의 자기 가교 히알루론산 입자는, 1차 분자량이 80만 이상인 것이 바람직하다. 이러한 자기 가교 히알루론산 입자를 이용함으로써, 투여 횟수의 감소 및 변형성 무릎 관절증의 치료 효과가 보다 현저해진다.
본 발명에 따르면, 종래보다 투여 횟수를 적게 한 경우에도, 변형성 무릎 관절증에 대해 충분한 치료 효과를 얻을 수 있는 가교 히알루론산 조성물 및 그것에 이용하는 자기 가교 히알루론산 입자를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 제조에 이용되는 고속 회전 장치의 개략 구성도이다.
도 2는 본 발명의 제1 실시 형태에 따른 가교 히알루론산 조성물과, 참고예인 히알루론산 제제의 주사 바늘을 꽂은 시린지로부터의 토출압을 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 제1 실시 형태에 따른 가교 히알루론산 조성물과, 참고예인 히알루론산 제제의 동통 억제 효과를 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 4는 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가열 시간에 대한 반감기, 1차 분자량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가열 시간에 대한 평형 팽윤 배율의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가열 시간에 대한 가교도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가교도에 대한 평형 팽윤 배율, 반감기의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 반감기에 대한 겔 분율 도달 일수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가교도에 대한 겔 분율 도달 일수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 제2 실시 형태에 따른 가교 히알루론산 조성물과, 참고예인 히알루론산 제제의 주사 바늘을 꽂은 시린지로부터의 토출압을 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 제2 실시 형태에 따른 가교 히알루론산 조성물과, 참고예인 히알루론산 제제의 동통 억제 효과를 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 12는 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가열 시간에 대한 반감기, 1차 분자량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 13은 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가열 시간에 대한 평형 팽윤 배율의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 14는 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가열 시간에 대한 가교도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 15는 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가교도에 대한 평형 팽윤 배율, 반감기의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 16은 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 반감기에 대한 겔 분율 도달 일수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 17은 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가교도에 대한 겔 분율 도달 일수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 제1 실시 형태에 따른 가교 히알루론산 조성물과, 참고예인 히알루론산 제제의 주사 바늘을 꽂은 시린지로부터의 토출압을 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 제1 실시 형태에 따른 가교 히알루론산 조성물과, 참고예인 히알루론산 제제의 동통 억제 효과를 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 4는 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가열 시간에 대한 반감기, 1차 분자량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가열 시간에 대한 평형 팽윤 배율의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가열 시간에 대한 가교도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가교도에 대한 평형 팽윤 배율, 반감기의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 반감기에 대한 겔 분율 도달 일수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가교도에 대한 겔 분율 도달 일수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 제2 실시 형태에 따른 가교 히알루론산 조성물과, 참고예인 히알루론산 제제의 주사 바늘을 꽂은 시린지로부터의 토출압을 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 제2 실시 형태에 따른 가교 히알루론산 조성물과, 참고예인 히알루론산 제제의 동통 억제 효과를 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 12는 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가열 시간에 대한 반감기, 1차 분자량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 13은 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가열 시간에 대한 평형 팽윤 배율의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 14는 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가열 시간에 대한 가교도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 15는 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가교도에 대한 평형 팽윤 배율, 반감기의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 16은 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 반감기에 대한 겔 분율 도달 일수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 17은 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 가교도에 대한 겔 분율 도달 일수의 변화를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 형태에 대해서 설명한다.
본 발명의 제1 실시 형태에 따른 가교 히알루론산 조성물은, 평균 부피 입경이 10 내지 100㎛이고, 평형 팽윤 배율이 3 내지 10배인 자기 가교 히알루론산 입자를 함유한다.
또한, 본 발명의 제2 실시 형태에 따른 가교 히알루론산 조성물은, 에틸에스테르량이 0.05mol% 이하고, 자기 가교 에스테르화도가 0.05 내지 0.50mol%이고, 평형 팽윤 배율이 3 내지 10배인 자기 가교 히알루론산 입자를 함유한다.
본 발명에서 자기 가교 히알루론산 입자란, 자기 가교 히알루론산이 입자화된 것이다. 여기서, 자기 가교 히알루론산이란, 가교 구조를 갖는 히알루론산을 말하며, 히알루론산 분자 중의 일부 카르복실기가 동일 및/또는 별도의 히알루론산 분자의 수산기와 자기 에스테르 결합함으로써, 3차원 메쉬 구조를 형성한 것이고, 화학적 가교제나 화학적 수식제 등을 사용한 것은 포함하지 않는다.
자기 가교 히알루론산 입자에서의 자기 가교 에스테르화도는, 히알루론산의 주쇄 구조에서 유래되는 화학적 이동의 피크의 적분치에 대한, 가교 에스테르에서 유래되는 화학적 이동의 피크의 적분치의 비율을 몰%로 나타낸 것이다.
본 발명의 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자에서의 자기 가교 에스테르화도는 0.05 내지 0.50mol%가 바람직하다. 보다 바람직하게는 0.08 내지 0.30mol%이다. 또한, 본 발명의 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자에서의 자기 가교 에스테르화도는 0.05 내지 0.50mol%이다. 바람직하게는 0.08 내지 0.30mol%이다.
자기 가교 에스테르화도의 측정은, 미리 히알루론산의 주쇄 구조를 가수분해하여 저분자량화할 필요가 있다. 여기서, 자기 가교 에스테르 결합의 가수분해를 억제할 필요가 있기 때문에, 자기 가교 히알루론산의 주쇄 구조만을 선택적으로 가수분해하는 히알루론산 가수분해 효소에 의한 가수분해 처리를 행하여, 양성자핵 자기 공명법(NMR)에 의해 화학적 이동의 피크의 적분치를 측정한다. 구체적으로는, 아세틸메틸기(2.05ppm) 상당의 피크에 대한 에스테르 가교 부분(4.18ppm) 상당의 피크와의 면적 비율을 자기 가교 에스테르화도로서 산출한다.
본 발명의 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자에서의 에틸에스테르량은, 0.05mol% 이하인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자에서의 에틸에스테르량은 0.05mol% 이하다. 에틸에스테르량은, 자기 가교 히알루론산 입자에 포함되는 에틸에스테르의 함유량이고, 잔류 용매로서 히알루론산 원료에 포함되는 에탄올이 에틸에스테르화한 것이라고 생각된다.
그러나, 에틸에스테르는 자기 에스테르화를 저해하는 것으로 생각되므로, 히알루론산 원료에 포함되는 에탄올을 동결 진공 건조, 80℃ 통풍, 아세톤 세정 또는 실온 통풍을 2 내지 3일 행하여 제거함으로써, 자기 가교 히알루론산 입자에서의 에틸에스테르량을 0.05mol% 이하로 할 수 있다. 히알루론산 원료에 포함되는 에탄올의 함유율은, 가스 크로마토그래피/질량 분석계(GC-MS)를 이용하여 아세토니트릴에 의해 추출하여 측정할 수 있다.
자기 가교 히알루론산 입자에서의 에틸에스테르량은 0.03mol% 이하가 보다 바람직하다. 에틸에스테르량은 자기 가교 에스테르화도와 마찬가지로 NMR에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에서, 히알루론산은 동물 조직으로부터 추출한 것이든 발효법으로 제조한 것이든 그 기원에 상관없이 사용할 수 있다.
발효법에서 사용하는 균주는 자연계에서 분리되는 스트렙토코커스속 등의 히알루론산 생산능을 갖는 미생물, 또는 일본 특허 공개 (소)63-123392호 공보에 기재한 스트렙토코커스·이퀴 FM-100(미공연균기 제9027호), 일본 특허 공개 (평)2-234689호 공보에 기재한 스트렙토코커스·이퀴 FM-300(미공연균기 제2319호)과 같은 고수율이고 안정적으로 히알루론산을 생산하는 변이주가 바람직하다. 상기한 변이주를 이용하여 배양, 정제된 것이 이용된다.
또한, 히알루론산은, 그의 알칼리염, 예를 들면 나트륨이나 칼륨, 리튬의 염도 포함하는 개념으로 사용된다.
자기 가교 히알루론산은 히알루론산과, 히알루론산 농도 5질량% 이상으로 하는 물, 및 히알루론산의 카르복실기와 등몰 이상의 산 성분을 공존시켜, 상기 공존 상태를 저온에서 유지함으로써 얻어진다.
히알루론산과 공존시키는 산은 특별히 한정은 되지 않고, 공지된 어떠한 산도 사용할 수 있지만, 히알루론산보다 강한 산인 것이 바람직하고, 무기산인 것이 보다 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 염산, 질산, 황산이고, 그 중에서도 핸들링 등이 우수한 질산이 특히 바람직하다.
공존시키는 산의 양은 특별히 한정되지 않지만, 히알루론산의 카르복실기와 등몰 이상의 산 성분의 양으로 할 수 있다.
히알루론산과 공존시키는 산이란, 히알루론산이 전체의 15질량% 이상, 바람직하게는 20질량% 이상, 40질량% 이하로 포함되는 양으로 유지하는 것이 바람직하다. 이 유지는, -30℃ 내지 25℃의 사이의 온도에서 1시간 내지 20일간 중 어느 기간으로도 행할 수 있다. 특히 바람직하게는, -25℃ 내지 -5℃의 사이의 온도에서 1일 내지 15일 동안에 행할 수 있다. 히알루론산과 공존시키는 산과의 혼합은, 공존시키는 산에 히알루론산을 전체의 15질량% 이상, 바람직하게는 20질량% 이상이 되도록 혼련하여, 공존시키는 산을 균일한 상태로 할 수 있다. 또한 히알루론산에 공존시키는 산을 전체의 15질량% 이상, 바람직하게는 20질량% 이상이 되도록 함침할 수 있다. 또한 저농도로 조정한 히알루론산의 산성 수용액을 히알루론산이 전체의 15질량% 이상, 바람직하게는 20질량% 이상으로 포함되도록 농축할 수 있다.
본 발명의 제1 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 평균 부피 입경은 10 내지 100㎛이고, 바람직하게는 20 내지 80㎛이고, 보다 바람직하게는 40 내지 70㎛이다. 또한, 본 발명의 제2 실시 형태에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 평균 부피 입경은, 10 내지 100㎛인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20 내지 80㎛이고, 더욱 바람직하게는 40 내지 70㎛이다. 자기 가교 히알루론산 입자의 평균 부피 입경이 팽윤시에 상기 범위에 있고, 평형 팽윤 배율이 3 내지 10배이면, 가교 히알루론산 조성물을 고농도로 해도 점도가 급격히 상승하지 않아, 히알루론산을 보다 많이 생체 내에 주입하는 것이 가능해진다.
자기 가교 히알루론산 입자는, 다양한 형상이나 크기의 입자의 집합체이므로, 평균 부피 입경은 예를 들면, 입자의 촬영시에 투영되는 입자상과 동일한 면적을 갖는 원의 직경을 원 상당 직경으로서 구한다. 예를 들면, 약 10,000개의 입자상을 해석해서, 원 상당 직경을 직경으로 하는 구형 입자의 부피를 산출하여, 부피가 작은 것부터 가산해 나갔을 때에, 10,000개의 입자 부피 총합의 50%에 달한 점의 입자의 원 상당 직경을, 평균 부피 입경으로서 채용할 수 있다. 구체적인 측정은, 예를 들면, 입도·형상 분포 측정기 PITA-1(상품명, 세이신기업 제조)을 사용할 수 있다.
자기 가교 히알루론산 입자는, 자기 가교 히알루론산과 수계 용매의 혼합액을, 50℃ 미만에서, 전단력을 부여하면서 슬릿을 통과시켜 미립자화시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, 전단력을 부여하면서 슬릿을 통과시켜 미립자화시키는 고속 회전 장치를 이용하여 자기 가교 히알루론산을 파쇄함으로써, 평균 부피 입경이 10 내지 100㎛가 되도록 미립화할 수 있다. 또한, 파쇄시에 50℃ 미만으로 냉각 온도 제어하는 것은, 제조되는 자기 가교 히알루론산 및 자기 가교 히알루론산으로부터 용출하는 히알루론산의 분자량을 높게 유지할 수 있으므로 바람직하다.
도 1은, 본 발명에 따른 자기 가교 히알루론산 입자의 제조에 이용되는 고속 회전 장치의 개략 구성도이다. 고속 회전 장치(10)는, 로터(1)와 스크린(2)을 구비하고, 로터(1)와 스크린(2)이 역방향으로 회전하여, 스크린(2)의 슬릿(3)을 자기 가교 히알루론산이 통과함으로써, 자기 가교 히알루론산 입자로서 미립화한다. 이와 같이, 로터(1)와 스크린(2)이 역방향으로 회전함으로써, 큰 전단력이 얻어져 미립화된 자기 가교 히알루론산 입자를 얻을 수 있다. 또한, 상기 고속 회전 장치(10)에서 자기 가교 히알루론산을 미립화할 때에, 미립자를 구성하는 히알루론산의 주쇄를 랜덤하게 절단하지 않고 효율적으로 파쇄할 수 있기 위해서, 고분자량이면서 저점성을 갖는 자기 가교 히알루론산 입자를 얻을 수 있을 것으로 추정된다.
이러한 고속 회전 장치로는, 예를 들면, 구레아 믹스 더블 모션(상품명, M테크닉(주) 제조)이 바람직하다. 본 장치는, 고속 회전하는 로터와 그것을 둘러싸도록 배치된 스크린으로 구성되고, 고속 회전하는 로터 표면 근방에서의 큰 속도 경사에 의해, 스크린의 통액 구멍(슬릿)을 통과하는 자기 가교 히알루론산의 큰 입자는 전단력을 받아 미립화된다.
고속 회전 장치에 의한 미립화의 정도는, 로터와 스크린의 회전 속도와 처리 시간에 따라서 표 1과 같이 규정된다. 로터의 회전 속도에 대한 스크린의 회전 속도의 비율은 5 내지 10할이 바람직하고, 특히 9할이 바람직하다.
고압형 파쇄 장치로는, 예를 들면, 나노마이저(상품명, 나노마이저(주) 제조)가 있는데, 고압·고속화된 시료가 고온으로 되기 쉬워 자기 가교 히알루론산의 물성 열화 정도가 큰 점에서, 본 발명에 따른 자기 가교 히알루론산 입자를 위한 미립화 처리에 이용하는 것은 바람직하지 않다. 또한, 고속 회전 장치라도, 예를 들면 T. K. 호모믹(상품명, 플라이 믹스(주) 제조)과 같이, 입자의 평균 부피 입경을 200㎛ 이하로 미립화할 수 없는 장치는, 본 발명에 따른 자기 가교 히알루론산 입자를 위한 미립화 처리에 이용하는 것은 바람직하지 않다.
여기서, 물성 열화란, 파쇄 전의 자기 가교 히알루론산의 60℃ 용해성 반감기나 1차 분자량 등의 물성이, 파쇄 등의 입자화(미립화)에 의해 파쇄 전의 초기치보다 떨어지는 것을 말한다. 미립화 처리에 의한 자기 가교 히알루론산 입자의 물성은, 가능한 한 열화되지 않는 것이 바람직하다.
또한, 60℃ 용해성 반감기란, 60℃, pH7.4의 조건하에서 자기 가교 히알루론산의 가열을 행했을 때에, 개시시 100%로 한 겔 분율이 50%로 될 때까지의 시간을 말한다. 예를 들면, 60℃ 용해성 반감기가, 입자화 전의 초기치는 25시간인 데 반해 입자화 후의 반감기가 20시간인 경우에는, 초기치의 유지율은 80%가 되어, 입자화에 의해 20%의 물성 열화가 생긴 것이 된다.
겔 분율이란, 가교 히알루론산 조성물 중의 전체 히알루론산량 중, 자기 가교 히알루론산 입자로서 침전하는 히알루론산량의 비율을 백분율로 나타낸 값이며, 하기 식 (1)과 같이, 에스테르 가교가 가수분해되어 히알루론산으로서 용매 중에 유리·용해된 히알루론산량을 전체 히알루론산량에서 빼어 산출할 수 있다.
겔 분율(%)=(1-(용해 히알루론산량/전체 히알루론산량))×100 …(1)
본 발명의 자기 가교 히알루론산 입자의 1차 분자량은, 자기 가교 히알루론산 입자의 에스테르 결합이 가수분해되어 생성하는 히알루론산의 분자량이며, 80만 이상인 것이 바람직하고, 80만 이상 300만까지의 범위 내인 것이 보다 바람직하다. 상기 범위 내의 1차 분자량의 것이라면, 고분자량인 것에서부터 가수분해 처리 등을 하여 얻은 저분자량인 것까지 마찬가지로 바람직하게 사용할 수 있다.
상기 1차 분자량은, 점도 평균 분자량으로서 나타내지며, 자기 가교 히알루론산의 가교점을 절단하여 용해시켜 히알루론산으로 한 후, GPC에 검출기로서 시차 굴절률계를 사용하여, 분자량 분포의 피크톱의 보유 타임으로부터 산출할 수 있다. 보유 타임으로부터의 점도 평균 분자량의 산출에는, 점도 평균 분자량이 기지인 히알루론산의 분자량 분포의 피크톱의 보유 타임을 이용하여 작성한 검량선을 이용한다. 검량선 작성에 이용하는 히알루론산의 점도 평균 분자량은, 히알루론산을 0.2M 염화나트륨 용액으로 용해하고, 우벨로데형 점도계를 사용해서 30℃에서의 유하 시간을 측정하여, 얻어진 환원 점도로부터 극한 점도를 산출하고, 로랑(Laurent)의 식[η]=0.00036×M0 .78([η]: 극한 점도, M: 점도 평균 분자량)을 이용하여 산출한다.
자기 가교 히알루론산 입자의 평형 팽윤 배율은, 가교 히알루론산 조성물의 수계 용매(완충액)를 여과에 의해 제거했을 때의 자기 가교 히알루론산 입자의 부피와, 상기 자기 가교 히알루론산 입자를 더 건조시켰을 때의 배율에 의해 나타내진다.
상기 평형 팽윤 배율은, 여과에 의해 가교 히알루론산 조성물의 수계 용매(완충액)를 제거했을 때의 자기 가교 히알루론산 입자의 습윤 중량과, 더 건조시켰을 때의 자기 가교 히알루론산 입자의 중량의 비(Qw)와 밀도를 이용하여, 하기 식 (2)에 의해 산출할 수 있다.
평형 팽윤 배율=1+(ρ/ρ0)×(Qw-1) … (2)
(ρ: 자기 가교 히알루론산 입자의 밀도, ρ0: 수계 용매(완충액)의 밀도)
평형 팽윤 배율은, 용매의 염 농도나 pH, 온도, 팽윤 시간 등에 영향을 받지만, 본 발명에서는, 예를 들면 10mM 인산 완충 생리 식염수(pH6.0)로, NaCl 농도는 0.9중량%인 것을 사용할 수 있으며, 5℃에서 1일간 팽윤시켜, 평형 팽윤 상태에 도달한 후에 측정할 수 있다.
여과에 의해 가교 히알루론산 조성물의 용매를 제거하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 원심식 필터 유닛을 이용한 원심 여과 방법, 멤브레인 필터를 이용한 감압 여과 방법 등을 적절하게 사용할 수 있다.
본 발명의 자기 가교 히알루론산 입자의 평형 팽윤 배율은, 3 내지 10배이고, 바람직하게는 4 내지 8배이다. 자기 가교 히알루론산 입자의 평형 팽윤 배율이 상기 범위임으로써, 가교 히알루론산 조성물에 함유되었을 때에 지나치게 팽창되어 주사기로부터 토출할 수 없다는 문제점이 생기지 않아, 고농도의 히알루론산을 생체 내에 주입하는 것이 가능해진다.
본 발명의 가교 히알루론산 조성물에 있어서, 가교 히알루론산 조성물의 전체 부피에 대한 자기 가교 히알루론산 입자의 건조 중량은 3 내지 8w/v%이다. 예를 들면 3w/v%는, 가교 히알루론산 조성물에서의 자기 가교 히알루론산 입자의 농도를 나타내고, 가교 히알루론산 조성물 1ml를 -20℃, 200mTorr 이하, 20시간 이상의 조건에서 건조하면, 건조 중량으로서 자기 가교 히알루론산의 입자 30mg이 얻어지는 것을 의미한다. 가교 히알루론산 조성물의 전체 부피에 대한 자기 가교 히알루론산 입자의 건조 중량은, 바람직하게는 3 내지 7w/v%이다.
자기 가교 히알루론산의 입자의 농도는, 예를 들면, 이하와 같이 정량할 수 있다. 우선 가교 히알루론산 현탁액을 증류수로 희석하고 수산화나트륨 용액을 첨가하여 실온에서 정치함으로써 자기 가교 히알루론산의 에스테르 가교를 가수분해하여, 자기 가교 히알루론산을 용해한다. 다음으로, 이 용액에 염산을 첨가하여 중화한 후, 카르바졸 황산법에 의해 글루쿠론산 농도를 정량한다. 이 글루쿠론산 농도와, 기지 농도의 히알루론산을 표준 물질로 하여, 자기 가교 히알루론산 입자의 농도를 산출할 수 있다.
본 발명의 가교 히알루론산 조성물에 있어서, pH7.0±0.5, 온도 36.0±2.0℃의 10mM 인산 완충 생리 식염수 중에 침지하면, 30일 이내에 자기 가교 히알루론산이 전량 용해하여, 점도 평균 분자량이 80만 이상인 히알루론산이 생성된다. 이러한 히알루론산의 생성 조건은, 전형적으로는 pH7.4, 온도 37.0℃의 10mM 인산 완충화 생리적 식염수 중에서의 침지이다.
가교 히알루론산 조성물에 함유되는 수계 용매는, 가교 히알루론산 조성물의 전체 부피에 대한 자기 가교 히알루론산의 입자의 건조 중량이 3 내지 8w/v%가 되도록, 가교 히알루론산 조성물 중에 함유되는 용매이다. 수계 용매로는, 생리적으로 수용인 수성 매질을 갖는 수용액이면 좋다. 생리적으로 수용이란, 관절 치료제가 관절강 내에 주입되었을 때, 수성 매질 자신이 바람직하지 않은 작용 또는 부작용, 예를 들면, 조직의 팽윤 또는 수축, 염증 등의 원인이 되지 않는 것을 의미한다. 생리적으로 수용인 수성 매질은, 통상 알칼리 또는 알칼리토류 금속의 염화물, 황산염, 인산염 또는 중탄산염과 같은 무기염류, 예를 들면 염화나트륨, 황산나트륨, 염화마그네슘, 및 대응하는 칼륨, 칼슘염, 락트산나트륨, 아세트산나트륨과 같은 유기산의 염, 또는 글루코오스, 만노오스, 다가 알코올과 같은 중성 유기 물질, 예를 들면 글리세린, 만니톨 등에서 선택되는 1개 이상의 저분자량 물질의 수용액이다.
제제는, 그 제형에 따라서 제제학적으로 공지된 수법에 의해 적절한 부형제; 등장화제; 방부제; 유화제; 분산제; 안정화제; 용해 보조제; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량(약 10 잔기 미만의) 폴리펩티드(예를 들면, 폴리아르기닌 또는 트리펩티드); 단백질(예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린); 친수성 중합체(예를 들면, 폴리비닐피롤리돈); 아미노산(예를 들면, 글리신, 글루탐산, 아스파라긴산 또는 아르기닌); 킬레이트제(예를 들면, EDTA); 상대 이온(예를 들면, 나트륨) 및/또는 비이온성 계면 활성제(예를 들면, 폴리소르베이트, 폴록사머) 등의 의약품 첨가물, 히알루론산 등과 적절하게 혼합함으로써 조제할 수 있다. 등장성 및 화학적 안정성을 증강시키는 이러한 물질은, 사용된 투약량 및 농도에 있어서 수용자에 대해 비독성이다.
본 발명에 따른 가교 히알루론산 조성물의 보존 안정성을 나타내는 지표로서, 겔 분율 도달 일수를 사용할 수 있다. 겔 분율 도달 일수란, 가교 히알루론산 조성물을 일정한 측정 조건하에서 정치한 경우에, 서서히 히알루론산이 유리하여 겔 분율이 기준치로 저하될 때까지의 일수이다. 예를 들면, 자기 가교 히알루론산에 수계 용매를 가하고, 일정 농도로 조정한 가교 히알루론산 현탁액을 일정 환경하에서 가열하여, 소정의 겔 분율(예를 들면 97% 겔 분율이나 95% 겔 분율)에 도달할 때까지의 시간을 겔 분율 도달 일수로서 구할 수 있다.
평형 침강 농도란, 가교 히알루론산 현탁액을 정치하여 완전히 자기 가교 히알루론산 입자를 침강시켰을 때의, 침전 중에 포함되는 히알루론산 농도이다. 가교 히알루론산 현탁액에 있어서 외력을 가하지 않는 평형 상태에서는, 평형 침강 농도가 히알루론산 농도의 상한이라고 간주할 수 있다. 즉, 히알루론산 농도가 평형 침강 농도와 동일한 가교 히알루론산 현탁액이란, 현탁액 전체가 침전이고 상청이 없어, 더 이상 히알루론산 농도를 증가시킬 수가 없음을 나타낸다.
평형 침강 농도는, 현탁상의 가교 히알루론산 조성물의 히알루론산 농도[C], 부피[V0] 및 침전의 부피[V]를 측정해서, 하기 식 (3)을 이용하여 구할 수 있다.
평형 침강 농도=C×(V0/V) … (3)
가교 히알루론산 조성물의 점도는, 25±2℃, 전단 속도 50S-1에서 300mPa·s 이하가 바람직하다. 가교 히알루론산 조성물의 점도가 300mPa·s 이하임으로써, 주사제로서 주사기를 이용하여 생체 내에 투입될 때에 용이하게 주사할 수 있어, 환자의 부담이 경감된다.
가교 히알루론산 조성물의 점도는, 예를 들면, 회전 점도 측정법을 이용함으로써 측정할 수 있다. 회전 점도 측정법은, 콘 플레이트 1.009°(D=49.938mm)를 이용하고, 전단 속도 50S-1, 25℃에서 행할 수 있다.
가교 히알루론산 조성물의 토출압은, 내경 0.40mm, 바늘의 길이 25mm인 23G의 주사 바늘을 꽂은 내경 0.45cm의 주사기를 이용하고, 온도 25℃, 주입 속도 50mm/분에서, 0.8N 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.2 내지 0.8N이고, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 0.6N이다. 토출압이 상기 범위인 가교 히알루론산 조성물은, 주사제로서 주사기(시린지)를 이용하여 생체 내에 투입될 때에 용이하게 주사할 수 있어, 환자의 부담이 경감된다.
가교 히알루론산 조성물의 토출압은, 가교 히알루론산 조성물을 주사기에 충전하고, 주사 바늘을 꽂아, 소정의 속도에 의해 주사기(시린지)로부터 압출할 때에 걸리는 토출압을 압출압 측정기에 의해 측정할 수 있다. 압출압 측정기로는, 일반적인 재료 시험에서 이용되는 정적 압축 시험기를 사용할 수 있다.
본 발명의 주사제는 상술한 가교 히알루론산 조성물을 함유한다. 본 가교 히알루론산 조성물을 이용한 주사제는 점도 및 토출압이 낮으므로, 생체 내에 투입할 때에 주입하기 쉬워진다.
본 발명의 주사제는, 1회당 1.25mg/kg(체중) 이상, 또는 1회당 75mg 이상의 상기 자기 가교 히알루론산이 투여되도록 이용되는 것이 바람직하다. 종래부터 이용되고 있는 히알루론산 관절 제제는, 히알루론산 농도가 1w/v% 정도이고, 1회당의 투여량은 약 25mg이지만, 본 발명에 따른 주사제는, 상기 소정의 물성을 구비한 자기 가교 히알루론산의 입자를 포함하는 가교 히알루론산 조성물을 이용하기 때문에, 3w/v% 이상의 농도로 할 수 있으므로, 1회당 75mg 이상의 자기 가교 히알루론산이 투여되도록 이용될 수 있다. 또한, 인간의 평균적인 체중을 60kg으로 하면, 1회당 1.25mg/kg(체중) 이상의 자기 가교 히알루론산이 투여되도록 이용될 수 있다.
상기 주사제는, 바람직하게는 1회당 1.7mg/kg(체중) 이상, 또는 1회당 100mg 이상의 상기 자기 가교 히알루론산이 투여되도록 이용되고, 보다 바람직하게는 1회당 2.0mg/kg(체중) 이상, 또는 1회당 120mg 이상의 상기 자기 가교 히알루론산이 투여되도록 이용된다. 또한, 상한치로는, 1회당 4.2mg/kg(체중) 이하, 또는 1회당 250mg 이하의 상기 자기 가교 히알루론산이 투여되도록 이용되고, 보다 바람직하게는 1회당 3.3mg/kg(체중) 이하, 또는 1회당 200mg 이하의 상기 자기 가교 히알루론산이 투여되도록 이용된다.
본 발명의 프리필드 시린지 제제는, 주사통 내부에 상기 주사제를 수용하고 있으며, 상술한 바와 같이 본 가교 히알루론산 조성물을 이용한 주사제는, 점도 및 토출압이 낮으므로, 고분자량의 자기 가교 히알루론산을 용이하게 생체 내에 주입할 수 있다.
본 발명의 가교 히알루론산 조성물은, 임의의 적당한 투여 경로로 생체에 투여될 수 있다. 비경구로 이루어지는 것이 바람직하고, 주사제로서 제조되는 것이 바람직하다. 본 발명에 의한 가교 히알루론산 조성물을 토끼의 관절에 주사제로서 투여하면, 생체 내에서 점도 평균 분자량이 80만 이상인 히알루론산을 생성하는 것이 확인되어, 본 발명에 의한 자기 가교 히알루론산은, 생체 내의 pH나 온도에 의해 가교점이 절단되어, 관절 내에 히알루론산이 생성되는 것으로 생각된다.
본 발명의 가교 히알루론산 조성물의 투여는, 비경구로 이루어지는 경우, 근육 내, 피하 등에도 행할 수 있으며, 특히 바람직하게는 관절강 내 등의 조직에 직접 행할 수 있다.
처방 및 투여를 위한 기술은, 예를 들면, 일본 약전의 최신판 및 최신 추보, "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES"(Maack Publishing C0., Easton, PA)의 최종판에 기재되어 있다.
본 발명의 가교 히알루론산 조성물은, 히알루론산이 의도하는 목적을 달성하는 데 유효한 양으로 함유되는 약제로 할 수 있으며, "치료적 유효량" 또는 "약리학적 유효량"은 당업자에게 충분히 인식되고, 약리학적 결과를 발생시키기 위해 유효한 약제의 양을 말한다. 치료적 유효 용량의 결정은 충분히 당업자에게 알려져 있다.
치료적 유효량이란, 투여에 의해 질환의 상태를 경감시키는 약제의 양을 말한다. 치료 효과 및 독성은, 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 용량은, 바람직하게는, 독성을 거의 또는 전혀 수반하지 않는 LD50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 이 용량은, 사용되는 투여 형태, 환자의 감수성, 및 투여 경로에 의존하여 범위 내에서 변화한다. 일례로서, 복합체의 투여량은, 연령 그 밖의 환자의 조건, 질환의 종류, 사용하는 복합체의 종류 등에 따라 적절하게 선택된다.
본 발명의 자기 가교 히알루론산 입자, 가교 히알루론산 조성물은, 변형성 무릎 관절증 이외에도, 일반적인 생체내 분해성 의용 재료 및 히알루론산이 이용되는 분야이면 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리 활성 물질의 담체, 창상 피복제, 조직 치환형 생체 조직 수복제, 유착 방지제, 지혈제, 인공 세포외 매트릭스, 진단·치료에 이용하는 의료 기구·의료 용구 등의 생물 의학적 제품 또는 의약 조성물에 대한 사용을 들 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 설명하는데, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1(제1 실시 형태))
<자기 가교 히알루론산의 합성>
2N의 질산 75g을 자공전형 혼련 장치(플라이 믹스 제조)에 넣고 -10℃로 냉각하여 셔벗 상의 질산 동결물을 얻었다. 질산 동결물에 점도 평균 분자량 220만의 히알루론산나트륨의 분말 22.5g(수분 함량 10%)을 투입하여, -10℃, 100rpm으로 균일한 고무 형상이 될 때까지 1시간 혼련했다(히알루론산나트륨 20.8질량%).
이 히알루론산과 질산의 혼합물을 -20℃로 설정한 냉동고에 넣었다. 10일 후, 5℃의 순수 1L에 투입하여, 1시간 간격으로 순수를 교환하는 것을 2회 반복하였다. 또한 5℃, 50mM의 인산 완충액 1L에 투입하여, 1시간 간격으로 50mM의 인산 완충액을 교환하는 것을 5회 반복하고, 질산이 완전히 없어질 때까지 중화 세정을 행하여, 자기 가교 히알루론산을 얻었다.
<자기 가교 히알루론산의 입자화>
상기한 바와 같이 해서 얻어진 자기 가교 히알루론산을 중화한 후 30분간 정치하여, 상청을 데칸테이션으로 제거하고, 침강된 자기 가교 히알루론산에 대하여 9배의 중량의 50mM 인산 완충액을 가하였다. 다음으로, 이 가교 히알루론산 현탁액을 고속 회전 장치(제품명: 구레아 믹스 더블 모션, M테크닉(주) 제조)에 투입하여, 장치의 로터를 순방향 20,000rpm, 스크린을 역방향으로 18,000rpm으로 회전시켜, 50℃ 미만이 되도록 냉각하면서 15분간 미립화했다. 로터는 후퇴 각도 0도 로터를 사용하고, 스크린상에 존재하는 슬릿의 폭이 1.0mm인 것을 사용하였다.
얻어진 자기 가교 히알루론산 입자의 입경에 대해서, 입도·형상 분포 측정기 PITA-1(세이신기업 제조)을 이용하여 정량하였다. 전처리로서 자기 가교 히알루론산을 메틸렌 블루에 의해 염색(염색액 농도: 1w/v%, 염색 시간: 1분 이상)하였다. PITA-1의 측정 조건으로는, 캐리어액은 증류수를 이용하고, 측정 입자수는 10,000개, 대물렌즈 4배로 측정하였다. 그 결과, 얻어진 자기 가교 히알루론산 입자의 평균 부피 입경은 65㎛였다.
(실시예 2)
실시예 1과 마찬가지로 자기 가교 히알루론산을 합성하여, 얻어진 자기 가교 히알루론산에 대해 처리시간을 30분으로 한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 입자화시켰다. 그 결과, 얻어진 자기 가교 히알루론산 입자의 평균 부피 입경은 52㎛였다.
(실시예 3)
실시예 1과 마찬가지로 자기 가교 히알루론산을 합성하여, 얻어진 자기 가교 히알루론산에 대해 처리 시간을 120분으로 한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 입자화시켰다. 그 결과, 얻어진 자기 가교 히알루론산 입자의 평균 부피 입경은 41㎛였다.
(비교예 1)
실시예 1에서 얻은 자기 가교 히알루론산 입자를, 고압형 파쇄 장치(제품명: 나노마이저, 나노마이저(주) 제조)를 이용하여 파쇄하였다. 장치 파쇄부에는 φ100㎛의 충돌형 제너레이터를 부착하여, 자기 가교 히알루론산 입자가 즉시 실온 이하가 되도록 냉각하면서, 200MPa로 3회 처리하였다. 이 자기 가교 히알루론산 입자의 입경을, 레이저 회절·산란식 입도 분포계(제품명: SALD-7000, 시마즈 세이사꾸쇼 제조)를 이용하여 측정하였다. 측정 조건으로서, 시료의 굴절률을 1.300으로 하고, 분산매에는 10mM 인산 완충 생리 식염수를 사용하였다. 그 결과, 얻어진 자기 가교 히알루론산 입자의 평균 부피 입경은 5㎛였지만, 수율이 매우 낮아 실용적이지 못했다.
(비교예 2)
또한, 상술한 자기 가교 히알루론산의 합성 방법에 따라 제조한 자기 가교 히알루론산을 이용해서, 중화 후 30분간 정치하여, 상청을 데칸테이션으로 제거하고, 침강된 자기 가교 히알루론산에 대해 9배의 중량의 50mM 인산 완충액을 가하였다. 다음으로, 가교 히알루론산 현탁액을 고속 파쇄 장치(제품명: T. K. 호모믹스, 플라이 믹스 (주) 제조)에 투입하고, 로터를 16,000rpm으로 하여, 50℃ 미만이 되도록 냉각하면서 60분간 파쇄하였다. 이 자기 가교 히알루론산 입자의 입경에 대해, 입도·형상 분포 측정기 PITA-1(세이신기업 제조)을 이용하여 정량했지만, 대입자 혼재 때문에 측정할 수 없었다. 그 때문에, 체 눈이 0.2mm인 체를 이용하여 등급 분류한 결과, 중량 베이스로 90% 이상 체 상에 잔류했기 때문에, 평균 부피 입경은 200㎛ 이상으로 하였다.
<용해성 반감기의 측정>
상기에서 얻어진 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 2의 자기 가교 히알루론산 입자에 대해서, 용해성 반감기를 측정하였다. pH7.4의 인산 완충액을 이용하여, 60℃ 환경에서 가열을 행하고, 5시간 간격으로 샘플 채취하였다. 채취한 샘플을 희석하고, 원심 분리에 의해 상청과 침전부로 나눠, 각각의 부분의 히알루론산 농도를 측정하여 겔 분율을 산출하였다. 가열 시간에 대한 겔 분율의 거동을 판독하여, 겔 분율 50%에 도달하는 가열 시간을 구하였다.
<점도 평균 분자량>
생리적 식염수에 10mM 농도로 인산 완충 성분을 가하고, pH7.4의 인산 완충화 식염수를 조정하였다. 이 인산 완충화 생리적 식염수 100ml에 대하여 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 2의 자기 가교 히알루론산 입자를 첨가하고, 자기 가교 히알루론산이 완전히 용해할 때까지 30일간, 37.0℃에서 침지하였다.
인산 완충화 생리적 식염수 중에 용출한 히알루론산의 점도 평균 분자량은, 상청을 0.2㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, GPC 장치에 0.1ml 주입하여 측정하였다. 히알루론산의 점도 평균 분자량은, GPC 장치의 검출기로서 시차 굴절률계를 사용하여, 분자량 분포의 피크톱의 보유 타임으로부터 산출하였다. GPC 장치는, GPC 칼럼으로서 쇼와 덴꼬사 제조 SB806HQ를 1개, 시차 굴절률 검출기로서 쇼덱스(Shodex)사 제조 RI-71S를 사용하고, 용매 질산나트륨의 0.2M 수용액, 측정 온도 40℃, 유속 0.3ml/분으로 측정하였다. 보유 타임으로부터의 점도 평균 분자량의 산출에는, 점도 평균 분자량이 기지인 히알루론산의 분자량 분포의 피크톱의 보유 타임을 이용하여 작성한 검량선을 이용하였다. 검량선 작성에 이용하는 히알루론산의 점도 평균 분자량은, 히알루론산을 0.2M 염화나트륨 용액으로 용해해서, 우벨로데형 점도계를 사용하여 30℃에서의 0.2M 염화나트륨 용액의 유하 시간(t0) 및 시료 용액의 유하 시간(t)을 측정하고, t0, t로부터 얻어진 환원 점도ηred로부터 시간 0에서의 극한 점도를 산출하고, 로랑의 식[η]=0.00036×M0 .78([η]: 극한 점도, M: 점도 평균 분자량)을 이용하여 산출하였다.
실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 2의 측정 결과를 표 2에 나타낸다.
실시예 1의 자기 가교 히알루론산 입자는, 처리 후의 용해성 반감기가 25시간, 점도 평균 분자량이 170만이고, 처리 전부터의 유지율이 각각 100%로, 입자화에 의한 물성 열화가 발생하지 않았다. 또한, 실시예 2 및 3의 자기 가교 히알루론산 입자도, 입자화에 의한 물성 열화는 거의 발생하지 않았다. 한편, 비교예 1의 자기 가교 히알루론산 입자는, 입자화 후의 용해성 반감기가 18시간, 점도 평균 분자량이 130만이고, 입자화 전부터의 유지율이 69%, 76%로, 입자화에 의한 물성 열화가 발생하였고, 또한 수율이 매우 낮아 실용적이지 못했다.
<가교 히알루론산 조성물의 제조>
(실시예 4)
실시예 1에서 얻어진 자기 가교 히알루론산 입자를, 5℃, pH7.0의 10mM 인산 완충 생리 식염수에 투입하여, 1시간 간격으로 10mM 인산 완충 생리 식염수를 교환하는 것을 2회 반복하였다. 이 가교 히알루론산 조성물의 전체 부피에 대한, 자기 가교 히알루론산 입자의 건조 중량(농도)이 6w/v%가 되도록 이하와 같이 조정하였다.
자기 가교 히알루론산의 농도의 정량은, 가교 히알루론산 조성물 50mg을 증류수 1.55ml로 희석하고, 거기에 1N 수산화나트륨 용액을 0.2ml 첨가하여, 실온에서 30분 정치함으로써, 자기 가교 히알루론산의 에스테르 가교를 가수분해하여, 자기 가교 히알루론산을 용해하였다. 또한 1N 염산 0.2ml를 첨가하고 중화한 후, 카르바졸 황산법에 의해, 기지 농도의 히알루론산(점도 평균 분자량 190만)을 표준 물질로 해서, 자기 가교 히알루론산의 농도를 계산하였다. 이 정량 결과를 기초로, 자기 가교 히알루론산 입자의 농도가 6w/v%가 되도록 조정하여, 가교 히알루론산 조성물을 얻었다.
(실시예 5)
가교 히알루론산 조성물의 전체 부피에 대한 자기 가교 히알루론산 입자의 건조 중량이 3w/v%가 되도록 pH7.0의 10mM 인산 완충 생리 식염수에 투입하여 조정한 것 이외에는, 실시예 4와 마찬가지로 하여 가교 히알루론산 조성물을 제조하였다.
(비교예 3)
자기 가교 히알루론산의 입자화에 고속 회전 장치(제품명: 구레아 믹스 싱글 모션, M테크닉(주) 제조)를 사용하고, 장치의 로터를 순방향으로 10,000rpm 회전시켜, 가교 히알루론산이 30℃ 미만이 되도록 냉각하면서 6분간 미립화한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 하여 평균 부피 입경이 300㎛인 자기 가교 히알루론산 입자를 제조하였다. 또한, 실시예 4와 마찬가지로 하여 자기 가교 히알루론산 입자의 농도가 6w/v%인 가교 히알루론산 조성물을 제조하였다.
(비교예 4)
자기 가교 히알루론산의 입자화에 고속 회전 장치(제품명: 구레아 믹스 싱글 모션, M테크닉(주) 제조)를 사용하고, 장치의 로터를 순방향으로 20,000rpm으로 회전시켜, 가교 히알루론산이 30℃ 미만이 되도록 냉각하면서 4분간 미립화한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 하여 평균 부피 입경이 153㎛인 자기 가교 히알루론산 입자를 제조하였다. 또한, 실시예 4와 마찬가지로 하여 자기 가교 히알루론산 입자의 농도가 6w/v%인 가교 히알루론산 조성물을 제조하였다.
(비교예 5)
자기 가교 히알루론산의 입자화에 고속 회전 장치(제품명: 구레아 믹스 싱글 모션, M테크닉(주) 제조)를 사용하여, 장치의 로터를 순방향으로 20,000rpm으로 회전시켜, 자기 가교 히알루론산의 냉각을 행하지 않고 20분간 미립화하여, 평균 부피 입경 100㎛인 자기 가교 히알루론산 입자를 제조하였다. 이때, 자기 가교 히알루론산의 온도는 85℃까지 상승하였다. 또한, 실시예 4와 마찬가지로 하여 자기 가교 히알루론산 입자의 농도가 6w/v%인 가교 히알루론산 조성물을 제조하였다.
(참고예 1)
히알루론산 관절 제제 "수베닐"(상품명, 주가이제약(주) 제조)
(점도 평균 분자량 200만, 히알루론산 농도 1w/v%)
(참고예 2)
히알루론산 관절 제제 "아르츠"(상품명, 세이가가꾸 고교(주) 제조)
(점도 평균 분자량 80만, 히알루론산 농도 1w/v%)
(참고예 3)
히알루론산 관절 제제 "신비스크(Synvisc)"(상품명, 젠자임 코포레이션사 제조)
(히알루론산 농도 0.8w/v%)
(참고예 4)
히알루론산 관절 제제 "듀로레인(Durolane)"(상품명, Q-MED사 제조)
(히알루론산 농도 2.0w/v%)
(참고예 5)
생리 식염수 "오쯔카 생식주"(상품명, 오쯔카제약(주) 제조)
실시예 4 및 5 및 비교예 3 내지 5에서 얻어진 가교 히알루론산 조성물의 특성을, 참고예 1 내지 5와 함께, 이하와 같이 측정 및 평가하였다.
<가교 히알루론산 조성물의 점도 측정>
점도 측정 장치인 레오미터로서, MCR300(상품명, 피지카(Physica) 제조)을 사용하였다. 콘 플레이트는 콘각 1.009°(D=49.938mm)를 이용하고, 전단 속도 50S-1, 25℃에서 측정하였다. 실시예 4 및 5 및 비교예 3의 가교 히알루론산 조성물, 참고예 1 내지 5의 점도 비교를 행하였다. 표 3에 점도의 측정 결과를 나타낸다.
표 3과 같이, 특히 실시예 4의 가교 히알루론산 조성물은 6w/v%로 고농도의 자기 가교 히알루론산 입자를 함유함에도 불구하고, 참고예 1의 점도 평균 분자량 80만, 1w/v%의 히알루론산과 비교하여, 점도가 1/6 이하로 되었다.
<가교 히알루론산 조성물의 토출압 측정 (1)>
가교 히알루론산 조성물 1ml를 내경 0.45cm인 주사기 데루모 시린지 SS-01T(상품명, 데루모사 제조)에 채우고, 내경 0.40mm, 바늘의 길이 25mm인 주사 바늘 23G(데루모사 제조)를 꽂았다. 압출압 측정기 EZ-TEST(상품명, 시마즈 세이사꾸쇼(주) 제조)를 이용하고, 온도 25℃에서 속도 50mm/분의 토출 조건에서, 실시예 4, 비교예 3 및 비교예 4의 가교 히알루론산 조성물, 참고예 1 내지 5의 상기 시린지에 걸리는 압력을 측정하였다. 표 4에 측정 결과를 나타낸다.
표 4와 같이, 특히 실시예 4의 가교 히알루론산 조성물은, 6w/v%로 참고예 1의 6배인 고농도의 히알루론산을 함유함에도 불구하고, 토출압을 낮게 억제할 수 있었다.
<가교 히알루론산 조성물의 토출압 측정 (2)>
토출압 측정 (1)에서 사용한 "주사 바늘 23G(내경 0.40mm)보다 가는 24G, 25G 및 27G의 주사 바늘을 사용하여, 실시예 4 및 참고예 1 내지 5의 샘플 1ml를 주사 바늘이 꽂힌 시린지(데루모사 제조)에 채워, 토출압 측정 (1)과 마찬가지로 하여 시린지에 걸리는 압력을 측정하였다. 그 결과를 이하의 표 5 및 도 2에 나타낸다.
표 5 및 도 2와 같이, 특히 실시예 4의 가교 히알루론산 조성물은, 6w/v%로 참고예 1의 6배인 고농도의 히알루론산을 함유함에도 불구하고 토출압을 낮게 억제할 수 있고, 또한 가는 바늘이 사용 가능한 점에서 주사시의 환자의 동통을 경감할 수 있음이 시사되었다.
<가교 히알루론산의 1차 분자량 측정>
실시예 4 및 5 및 비교예 5의 샘플에 대해, 자기 가교 히알루론산으로 환산하여 10mg분을 0.1N 수산화나트륨 용액 1ml에 투입하고, 0℃에서 30분간 정치하여 자기 가교 히알루론산을 용해하였다. 이 용해액에 0.1N 염산 1ml를 첨가하여 중화하고, GPC 용매로 농도를 0.01 질량%가 되도록 희석 제조하여 0.2㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, GPC 장치에 0.1ml 주입하여 1차 분자량으로서 점도 평균 분자량의 측정을 행하였다.
히알루론산의 점도 평균 분자량은, GPC 장치의 검출기로서 시차 굴절률계를 사용하여 분자량 분포의 피크톱의 보유 타임으로부터 산출하였다. GPC 장치는, GPC 칼럼으로서 쇼와 덴꼬사 제조 SB806HQ를 1개, 시차 굴절률 검출기로서 쇼덱스사 제조 RI-71S를 사용하여, 용매 질산나트륨의 0.2M 수용액, 측정 온도 40℃, 유속 0.3ml/분으로 측정하였다. 보유 타임으로부터의 점도 평균 분자량의 산출에는, 점도 평균 분자량이 기지인 히알루론산의 분자량 분포의 피크톱의 보유 타임을 이용하여 작성한 검량선을 이용하였다. 검량선 작성에 이용하는 히알루론산의 점도 평균 분자량은, 히알루론산을 0.2M 염화나트륨 용액으로 용해하고, 우벨로데형 점도계를 사용해서 30℃에서의 0.2M 염화나트륨 용액의 유하 시간(t0) 및 시료 용액의 유하 시간(t)을 측정하고, t0, t로부터 얻어진 환원 점도ηred로부터 시간 0에서의 극한 점도를 산출하여, 로랑의 식[η]=0.00036×M0 .78([η]: 극한 점도, M: 점도 평균 분자량)을 이용해서 산출하였다.
<가교 히알루론산으로부터 용출한 히알루론산의 점도 평균 분자량 측정>
생리적 식염수에 10mM 농도로 인산 완충 성분을 가하여, pH7.4의 인산 완충화 식염수를 조정하였다. 이 인산 완충화 생리적 식염수 100ml에 대하여 실시예 4 및 5 및 비교예 5의 샘플 0.5ml를 첨가하여, 자기 가교 히알루론산이 완전히 용해할 때까지 30일간, 37.0℃에서 침지하였다. 인산 완충화 생리적 식염수 중에 용출한 히알루론산의 점도 평균 분자량은, 상기 가교 히알루론산의 점도 평균 분자량 측정과 마찬가지로 행하였다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 냉각 온도 제어를 행하지 않은 비교예 5는 파쇄시에 자기 가교 히알루론산의 1차 분자량이 저하되어, 자기 가교 히알루론산으로부터 용출하는 히알루론산의 점도 평균 분자량도 70만으로 낮아졌다. 그에 반해 파쇄시에 50℃ 미만으로 냉각 온도 제어한 실시예 4 및 5는, 자기 가교 히알루론산으로부터 용출하는 히알루론산의 점도 평균 분자량이 170만으로 높게 유지될 수 있었다.
<관절 중에서 자기 가교 히알루론산으로부터 용출한 히알루론산의 점도 평균 분자량 측정>
토끼(일본 백색종 수컷), 중량 약 3kg을 마취(마취 조성: 케타민(4ml)+자일라진(3ml)+생리 식염수(5ml))하고, 뒷다리 양 무릎에 실시예 4 및 5, 비교예 3 및 5, 및 참고예 1 및 3의 샘플을 내경 0.45cm의 시린지에 23G 주사 바늘을 이용하여 투여량 0.1ml/kg으로 주입하였다.
주입 7일 후, 마취하에서 안락사시켜 무릎을 잘라내어, 관절액을 고점성용 피펫으로 회수하였다. 관절액은, 증류수로 정확하게 100배 희석하고, 4℃, 15,000rpm, 10분간으로 원심 분리하였다. 그 상청을 0.2㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, GPC 장치에 0.1ml 주입하여 점도 평균 분자량의 측정을 행하였다. 측정 결과를 표 7에 나타낸다.
표 7에 나타내는 바와 같이, 비교예 5, 참고예 1 및 3은, 샘플 비투여와 마찬가지로 관절액량 30μl, 관절액의 점도 평균 분자량 170만 이상, 히알루론산 농도 0.3질량%였다. 이에 반해, 실시예 4 및 5의 관절액량은 200 및 300μl, 관절액의 점도 평균 분자량 170만 이상, 히알루론산 농도는 0.6중량%가 되었다. 또한 비교예 3은, 바늘 막힘이 발생하여 관절로의 주입이 곤란하였다. 실시예 4 및 5의 관절액의 증량과 관절액 내의 히알루론산 농도의 상승은 본 발명의 가교 히알루론산 조성물에서 유래되는 것으로 생각되며, 본 발명의 가교 히알루론산 조성물을 주사제로서 이용하면, 주사하고 7일 후라도 점도 평균 분자량 170만 이상의 히알루론산이 관절액 내에 유지됨을 알았다.
<자기 가교 히알루론산에 의한 동통 억제 효과의 측정>
실시예 4 및 5 및 참고예 1 및 5의 관절강 내 주사가 동통에 미치는 작용을 토끼의 무릎 관절 반월판 부분 절제에 의한 실험적 변형성 관절증을 이용하여 측정하였다.
<사용 동물 및 사육 방법>
동물로는, 13주령의 Kbl: JW(SPF)계 토끼(수컷)를 실시예·참고예마다 8마리씩 이용하기 위해 총 32마리를 준비하였다. 동물을 입하 후 3 내지 8일간 매일, 평가 장치에 대한 훈화로서 소동물용 진통 평가 장치 인캐패시턴스 테스터(Incapacitance Tester)(린턴 인스트루먼트(Linton Instrument) 제조)의 본체 용기(홀더)에 넣어 5초간 정지시키는 조작을 행하였다.
동물은, 가동식 래크에 장착한 브래킷식 금속제 철망 상 케이지(350W×500D×350H mm)에 개별로 수용하고, 온도 20±3℃, 습도 50±20%, 환기 횟수 12 내지 18회/시간, 조명 시간 8:00 내지 20:00(명 12시간, 암 12시간)의 환경하에서 사육하였다. 사료는, 스테인리스제 급사기에 의해, 실험 동물용 고형 사료 RC4(오리엔탈효모 공업사 제조)를 150g/일의 제한 급여로서 제공하고, 음료수는 폴리프로필렌제 급수병(선관 스테인리스제)에 의해 수돗물을 자유롭게 제공하였다. 동물의 개체 식별은 귓바퀴에 매직 잉크로 개체 식별 번호를 기입해서 식별하고, 케이지에는 군 나눔 전에는 성별 및 개체 식별 번호를 기입한 카드를, 군 나눔 후에는 시험 번호, 투여군, 성별, 동물 번호, 수술일, 투여일, 부검일 및 개체 식별 번호를 기입한 카드를 붙였다.
<동물의 선택 및 군 나눔 >
반월판 부분 절제 수술일 전일에 군 나눔을 행하였다. 군 나눔 일에, 전체 예의 체중과 양 뒷다리 중량 배분을 측정하였다. 측정한 양 뒷다리 중량 배분으로부터 좌측 뒷다리 중량 배분비((좌측 하중/양측 합계 하중)×100(%))를 산출하였다. 좌측 뒷다리 중량 배분비를 기준으로 하여, 개체치가 평균치에 가까운 순으로 선택하였다. 선택한 동물은, 좌측 뒷다리 중량 배분비에 의한 층별 연속 무작위화법을 이용하여 각 군에 할당하였다. 좌측 뒷다리 중량 배분비의 평균치가 각 군에서 같은 값을 나타내고, 군 간에 차가 없음을 확인한 후, 체중에 대해서도 평균치가 각 군에서 같은 값을 나타내고, 군 간에 차가 없음을 확인하였다.
<변형성 관절증 모델의 제작(반월판 부분 절제)>
반월판 부분 절제 수술은 군 나눔일의 다음날에 행하고, 반월판 부분 절제 수술일을 수술 후 0일이라 정의하였다. 14 내지 15주령의 동물을 이용하여, 참고 문헌 1 내지 3에 기재된 방법을 참고로 해서, 반월판 부분 절제 변형성 관절증 모델을 제작하였다.
여기서, 상기 문헌 중, 예를 들면 참고 문헌 1에는 KBL: JW 집토끼(13주령, 암컷) 32마리를 준비하여, 케타민 및 자일라진 마취하에서 좌측 무릎 관절의 외측 측부 인대 및 종자골 인대를 잘라내고 반월판을 3.0 내지 4.0mm 부분 절제하여, 26G의 주사 바늘을 이용해서 무릎 관절 내에 2주간에 5회의 비율로 A 및 B군의 각 8마리에는 고분자량 HA 용액을 주입하고, 대조의 C군 8마리에는 생리적 식염수를 주입하고, C군 및 D군에는 록소닌을 매일 경구 투여하여, 동통 억제 효과 및 연골 변성 방지 효과를 평가하는 것이 기재되어 있다. 또한 참고 문헌 2에는, 뉴질랜드 백색 집토끼(체중 2 내지 3kg) 72마리를 준비하여, 마취하에서, 좌측 무릎 관절의 인대를 잘라내고, 반월판을 3 내지 4mm 부분 절제하여, 무릎 관절 내에 주 2회의 비율로 기간 2 및 4주간 동안, A군의 48마리에는 분자량 190만의 1 내지 0.01% HA 용액을 주입하고, B군의 12마리에는 분자량 80만의 1 내지 0.01% HA 용액을 주입하고, C군의 12마리에는 생리적 식염수를 주입하여, 도살 후 무릎 관절을 채취해서 약효를 평가하는 것이 기재되어 있다. 또한 참고 문헌 3에는, 일본 백색 집토끼(암컷, 2.5kg) 15마리를 펜토바르비탈나트륨 마취하에서, 좌측 무릎 관절의 외측 측부 인대 및 종자골 인대를 잘라내고, 반월판을 3.0 내지 4.0mm 부분 절제하여, 25G의 주사 바늘을 이용해서 무릎 관절 내에 주 2회의 비율로 주입하고, 대조로서 생리 식염수를 동량 주입하여, 도살 후 무릎 관절을 채취해서 약효를 평가하는 것이 기재되어 있다.
참고 문헌 1: M. Mihara, S. Higo, Y. Uchiyama, K. Tanabe, K. Saito: Different effects of high molecular weighit sodium hyaluronate and NSAID on the progression of the cartilage degeneration in rabbit OA model, Osteoarthritis and Cartilage, Vol.15, No.5, pp.543-549(2007)
참고 문헌 2: T. Kikuchi, H. Yamada and M. Shimmei: Effect of high molecular weight hyaluronan on cartilage degeneration in a rabbit model of osteoarthritis, Osteoarthritis and Cartilage, Vol.4, No.2, pp.99-110(1996)
참고 문헌 3: 기쿠치 토시유키, 야마다 하루모토, 호리타 히로무, 다테다 토모아키, 고마쓰 슈이치, 니이나 마사요시: 집토끼 변형성 관절증 모델에서의 고분자 히알루로난의 연골 변성 억제 작용, 관절 외과, Vol.15, No.11, 92-98(1996)
참고 문헌 4: 다테다 토모아키, 나가미네 하루요, 이와다테 요시하루, 나카무라 토오루: 토끼의 실험적 변형성 관절증(OA) 모델 및 고정 관절 구축(PS) 모델에서의 히알루론산나트륨 제제(ME3710)의 약효 약리 시험, 약리와 치료, 23, 833-841(1995)
참고 문헌 5: 노지 히로미, 야기 나오미, 오다 야스히로, 이와다테 요시하루, 타모토 코이치, 세키가와 아키라: 실온 보존 가능한 신규 고분자 히알루론산나트륨 제제의 생물학적 동등성 시험, 약리와 치료, 33, 303-312(2005)
참고 문헌 6: 와타나베 코지, 나미키 오사무, 도시마 히로미치, 쿠스노키 타케오: 고정 관절에 대한 고분자 히알루론산의 영향, 정형 외과 기초 과학, Vol.9, 77-79(1982)
참고 문헌 7: 미야자키 쿄스케, 나가노 키요시, 스즈끼 케타로, 고토 유키코, 야마구치 토시지로, 나미키 오사무: 토끼 고정 관절에 대한 히알루론산나트륨의 영향, 정형 외과 기초 과학, Vol.11, 125-127(1984)
참고 문헌 8: T. kawano, H. Miura, T. Mawatari, T. Moro-Oka, Y. Nakanishi, H. Higashi and Y. Iwamoto: Mechanical Effects of the Intraarticular Administration of High Molecular Weight Hyaluronic Acid Plus Phospholipid on Synovial Joint Lubrication and Prevention of Articular Cartilage Degeneration in Experimental Osteoarthritis, Arthritis & Rheumatism, Vol.48, No.7, pp.1923-1929 (2003)
구체적으로는, 염산 케타민(제품명: 케타랄 근육 주사용 500mg, 산쿄에일약품사 제조) 및 자일라진(제품명: 스킬펜, 2% 주사액, 인터베트사 제조)의 병용 마취하(대퇴부 근육내 주사)에서 토끼의 좌측 무릎 관절부를 제모하고, 북도(北島)식 고정기(나쓰메세이사꾸쇼사 제조)에 배위 고정하였다. 무균적으로 슬개의 외측 바로 아래 피부에 약 2cm의 절개를 가하여, 외측 측부 인대를 노출시킨 후, 이 인대를 절제하였다. 또한, 슬와근 기시부의 건을 절제함으로써 외측 반월판을 노출시키고, 반월판의 거의 중앙부를 3.0 내지 4.0mm에 걸쳐 절제하였다. 그 후, 피하근층과 피부를 각각 결절 봉합하고, 암피실린(제품명: 빅실린졸-15%, 메이지 세이카사 제조) 약 0.2ml를 대퇴부 근육내에 주사하였다.
<관절강 내에 주입하는 군의 구성>
참고 문헌 1 내지 8에 기재된 방법을 참고로 하여, 실시예 4 및 5 및 참고예 1 및 5의 주사제를 0.1mL/kg 관절강 내에 주입하는 4군을, 표 8과 같이 설정하였다.
전체 군의 전체 예에 대해서, 수술 후 4일(동통 발병일)의 양 뒷다리 중량 배분 측정 후에 1회, 실시예 4 및 5 및 참고예 1 및 5의 주사제 0.1ml/kg을 수술측(좌측) 슬관절강 내에 1ml 주사통(데루모 시린지 1ml 투베르쿨린용, (주)데루모) 및 23G 주사 바늘(데루모 주사 바늘 23G, (주)데루모)을 이용하여 투여하였다. 투여액량은 투여일에 측정한 체중에 기초한 액량 환산에 의해 개별적으로 산출하였다.
<동통 억제 효과의 측정 방법>
양 뒷다리 중량 배분의 측정에는 소동물용 진통 평가 장치 인캐패시턴스 테스터(영국 린턴 인스트루먼트사 제조)를 이용하였다. 본 장치는, 본체 용기에 넣은 동물의 좌우 다리에 대한 중량 배분을, 용기 저면에 설치한 듀얼 채널의 센서 패드에 의해 좌우 각각의 중량을 그램 단위로 정확하게 검출하여, 그 값을 시험자가 설정한 시간으로 평균화하였다. 본체 용기는 토끼용의 것을 사용하였다. 측정 설정 시간은 동물의 정지 상태에서 5초로 하였다.
동물을 토끼용 본체 용기(홀더) 안으로 이동시켜 동물의 정지 상태에서 측정하고(1번째), 다음으로 동물을 홀더로부터 꺼내고 다시 넣어 정지 상태에서 측정하고(2번째), 이 조작을 다시 반복하였다(3번째). 3회 측정한 양 뒷다리 중량 배분의 각각에 대하여 좌우 중량(하중)으로부터 좌측 뒷다리 중량 배분비(%)를 하기 식 (4)에 의해 산출하였다.
좌측 뒷다리 중량 배분비(%)={좌측 하중(g)/(우측 하중(g)+좌측 하중(g))×100} … (4)
3회 산출한 좌측 뒷다리 중량 배분비(%)의 평균치를 측정 1회당의 좌측 뒷다리 중량 배분비(%)라고 정의하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 4 및 5의 자기 가교 히알루론산은 참고예 1보다 동통 억제 효과가 향상되었음을 알았다. 또한, 도 3에서, *, **는 참고예 5인 음성 대조(생리적 식염수 투여)와 비교하여 유의차가 있음을 나타낸다. (*: p<0.05, **: p<0.01(t 검정))
<각종 자기 가교 에스테르화도의 자기 가교 히알루론산의 제조>
실시예 1에서 얻어진 자기 가교 히알루론산을 50mM 인산 완충 생리 식염수(pH7.4)의 용매로 교환하여, 6중량%의 현탁상의 가교 히알루론산 조성물을 제조하였다. 얻어진 가교 히알루론산 조성물 7ml를 채취하여, 용기에 옮겨 밀폐하였다. 마찬가지의 가교 히알루론산 조성물 채취를 반복하여, 5개의 시험 샘플을 얻었다.
상기 5개의 시험 샘플을 60℃로 설정한 항온 환경 시험기(에스펙 제조)에 넣어, 소정 시간 가열하였다. 가열 시간은 5개의 시험 샘플에서 서로 다른 시간으로 하였다. 즉 가열 개시로부터 0, 2, 4, 6, 10시간 후의 각 시점에서 시험 샘플 1개씩 취출하였다. 이상의 공정에 의해, 5 종류의 가교 히알루론산 조성물을 얻었다. 이들을 상기 가열 시간이 짧은 순으로, 실시예 6 내지 9 및 비교예 6으로 하였다.
<평형 팽윤 배율의 측정>
가교 히알루론산 조성물 0.4ml를, 원심식 필터 유닛(0.45마이크로미터 공경, 밀리포어사 제조)을 이용하여 5℃, 2,000rpm, 30분간 원심 분리해서 용매를 제거하고, 또한 원심식 필터 유닛마다 20시간 건조함으로써, 용매 제거한 자기 가교 히알루론산 중량과 건조한 자기 가교 히알루론산 중량을 구하여, 평형 팽윤 배율을 산출하였다. 용매는, 10mM 인산 완충 생리 식염수(pH6.0)이고, NaCl 농도는 0.9중량%이고, 5℃에서 1일간 팽윤시켜, 평형 팽윤 상태에 도달한 후에 측정하였다.
<60℃ 용해성 반감기의 측정>
실시예 6 내지 9 및 비교예 6의 가교 히알루론산 조성물에 대해서, 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 2에서의 측정 방법과 마찬가지로, 60℃ 용해성 반감기를 측정하였다.
<1차 분자량의 측정>
실시예 6 내지 9 및 비교예 6의 가교 히알루론산 조성물의 1차 분자량으로서, 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 2에서의 측정 방법과 마찬가지로, 점도 평균 분자량을 측정하였다.
<가교도(자기 가교 에스테르화도)의 측정>
자기 가교 히알루론산 중의 가교도(자기 가교 에스테르화도)는 양성자핵 자기 공명법(NMR)에 의한 화학적 이동 강도(피크 면적치)에 의해 구하였다. 측정을 위해서는 미리 히알루론산 구조를 가수분해하여 저분자량화할 필요가 있었기 때문에, 자기 가교 히알루론산의 주쇄 구조만을 선택적으로 가수분해하는 히알루론산 가수분해 효소에 의한 가수분해 처리를 행하였다. 히알루론산 가수분해 효소는, 양의 고환 타입 V로부터의 히알루로니다아제 (동결건조 분말, 활성도: >1,500 units/mg(고체))(시그마알드리치사 제조)를 이용하여 불순물을 제거하기 때문에, 양이온 교환 칼럼 Mono S 5/50GL(GE 헬스케어사 제조)을 이용하여 정제하였다. 정제는, 상기한 효소를 0.1g/mL 농도가 되도록 10mM, pH5.0 아세트산 완충액에 용해하고, 이 용액 0.1mL를 동일 완충액으로 평형화한 상기한 칼럼에 통액하여, NaCl 농도 0.05 내지 0.15mol/L로 용출되어 오는 정제 분획의 효소 용액 0.8mL를 얻었다. 가수분해 처리는, 가교 히알루론산을 10mM, pH5.0 아세트산 완충 생리 식염수 1.0mL에 농도 3중량%가 되도록 조정하고, 상기한 정제 효소 용액 0.2mL를 첨가하여, 37℃ 160rpm 진탕 조건하에서 24시간 반응시키고, 그 후, 효소 용액 0.2mL를 가하여 동일 조건하에서 24시간 더 반응시켰다. 반응 후의 용액은 -30℃에서 동결하고, 그 후 18시간 동결 건조시킨 후, NMR 측정 시료로 하였다.
또한, 측정 조건을 이하와 같이 하였다. 기기: AVANCEIII 500, 관측 폭: 500.232MHz, 펄스 폭: 10.5μs(90°), 측정 모드: 13C 디커플-1H 논디커플법, 적산 횟수: 7600회, 측정 온도: 30℃.
측정으로 얻어진 스펙트럼도로부터, 가교 에스테르기에 상당하는 화학적 이동(Ha: 4.18ppm) 및 아세틸메틸기에 상당하는 화학적 이동(Hb: 2.05ppm)의 적분치를 구하여, 이하의 식 (5)로부터 가교도를 산출하였다.
가교도=100×([Ha]×2)/([Hb]/3) … (5)
실시예 6 내지 9 및 비교예 6의 가교 히알루론산 조성물의 측정 결과를 표 9 및 도 4 내지 7에 나타내었다.
표 9 및 도 4 내지 7과 같이, 가열 시간을 증가시킴으로써 가교도를 작게 했던 가교 히알루론산 조성물은, 60℃ 용해성 반감기도 작아져 이차 함수적인 상관을 나타내었다. 한편, 평형 팽윤 배율은 가교도를 작게 했던 가교 히알루론산 조성물일수록 커져, 플로리·리너(Flory-Rehner)식에 상이(相以)한 상관을 나타내었다.
<보존 안정성의 평가>
실시예 6 내지 9 및 비교예 6의 가교 히알루론산 조성물의 용매를, 10mM 인산 완충화 생리 식염수(pH6.0)로 교환하여, 자기 가교 히알루론산의 농도가 6w/v%가 되도록 조정하였다. 60℃ 환경에서의 가열 중 적당한 간격으로 샘플 채취를 행하여, 유리된 히알루론산량을 측정해서 겔 분율을 측정하였다. 가열 시간에 대한 겔 분율의 거동을 판독하여, 겔 분율 97%에 도달하는 가열 시간을 구하였다. 또한, 겔 분율 95%에 도달하는 가열 시간도 상기와 마찬가지로 구하였다. 그 측정 결과를 이하의 표 10 및 도 8 내지 9에 나타낸다.
표 10과 같이, 가열 시간의 증가에 따라서, 겔 분율 도달 일수가 짧아졌다. 특히, 비교예 6에서는, 겔 분율 97%에 도달하는 가열 시간이 0.7일 겔 분율 95%에 도달하는 가열 시간이 1.1일로 짧아졌다. 또한, 반감기 및 가교도가 적어질수록 겔 분율 도달 일수도 짧아져서, 이들 물성치와 보존 안정성이 상관함을 나타냈다(도 8 및 도 9).
(평균 침강 농도의 측정)
또한, 실시예 6 내지 9 및 비교예 6의 가교 히알루론산 현탁액에 대해서, 평균 침강 농도의 측정을 행하였다. 평형 침강 농도는, 현탁액의 히알루론산 농도[C], 현탁액의 부피[V0] 및 침전의 부피[V]를 측정하여, 하기 식 (6)과 같이 구하였다.
평형 침강 농도=C×(V0/V) … (6)
그 측정 결과를 이하의 표 11에 나타낸다.
표 11과 같이, 설정 가능한 농도 상한인 평형 침강 농도가 가열 시간과 상관하였다. 특히, 비교예 6은 평균 침강 농도가 5.2중량%로 낮아, 실시예 6 내지 9와 비교하여 농도를 높게 할 수 없음을 나타내었다.
(실시예 10(제2 실시 형태))
<히알루론산 원료 중의 에탄올 제거 전 처리>
점도 평균 분자량 220만의 히알루론산나트륨의 분말을 통기 필터가 달린 용기에 넣고, 실온하에서 펌프에 의해 흡인하고 3일간 통기하여 에탄올을 제거하였다.
<자기 가교 히알루론산의 합성>
2N의 질산 75g을 자공전형 혼련 장치(플라이 믹스 제조)에 넣고, -10℃로 냉각하여 셔벗 상의 질산 동결물을 얻었다. 질산 동결물에 상기 처리를 실시한 히알루론산나트륨의 분말 22.5g(수분 함량 10%)을 투입하고, -10℃, 100rpm으로 균일한 고무 형상이 될 때까지 1시간 혼련했다(히알루론산나트륨 20.8질량%).
이 히알루론산과 질산의 혼합물을 -20℃로 설정한 냉동고에 넣었다. 10일 후, 5℃의 순수 1L에 투입하고, 1시간 간격으로 순수를 교환하는 것을 2회 반복하였다. 또한 5℃, 50mM의 인산 완충액 1L에 투입하고, 1시간 간격으로 50mM의 인산 완충액을 교환하는 것을 5회 반복하고, 질산이 완전히 없어질 때까지 중화 세정을 행하여, 자기 가교 히알루론산을 얻었다.
<자기 가교 히알루론산의 입자화>
상기한 바와 같이 얻어진 자기 가교 히알루론산을 중화한 후 30분간 정치하여, 상청을 데칸테이션으로 제거하고, 침강된 자기 가교 히알루론산에 대해 9배 중량의 50mM 인산 완충액을 가하였다. 다음으로, 이 가교 히알루론산 현탁액을 고속 회전 장치(제품명: 구레아 믹스 더블 모션, M테크닉(주) 제조)에 투입하고, 장치의 로터를 순방향 20,000rpm, 스크린을 역방향으로 18,000rpm으로 회전시켜, 50℃ 미만이 되도록 냉각하면서 15분간 미립화했다. 로터는 후퇴 각도 0도 로터를 사용하고, 스크린상에 존재하는 슬릿의 폭이 1.0mm인 것을 사용하였다.
(실시예 11)
1000ppm의 에탄올을 함유하도록 조정한 히알루론산 원료를 이용하여, 실시예 10과 마찬가지로 해서 자기 가교 히알루론산 입자를 얻었다.
(비교예 7)
31000ppm의 에탄올을 함유하도록 조정한 히알루론산 원료를 이용하여, 실시예 10과 마찬가지로 해서 자기 가교 히알루론산 입자를 얻었다.
(비교예 8)
116000ppm의 에탄올을 함유하도록 조정한 히알루론산 원료를 이용하여, 실시예 10과 마찬가지로 해서 자기 가교 히알루론산 입자를 얻었다.
<자기 가교 에스테르화도(가교도)의 측정>
자기 가교 히알루론산 중의 자기 가교 에스테르화도(가교도)는 양성자핵 자기 공명법(NMR)에 의한 화학적 이동 강도(피크 면적치)에 의해 구하였다. 측정을 위해서는 미리 히알루론산 구조를 가수분해하여 저분자량화할 필요가 있었기 때문에, 자기 가교 히알루론산의 주쇄 구조만을 선택적으로 가수분해하는 히알루론산 가수분해 효소에 의한 가수분해 처리를 행하였다. 히알루론산 가수분해 효소는, 양의 고환 타입 V로부터의 히알루로니다아제 (동결건조 분말, 활성도: >1,500 units/mg(고체))(시그마알드리치사 제조)를 이용하여 불순물을 제거하기 때문에, 양이온 교환 칼럼 Mono S 5/50GL(GE 헬스케어사제조)을 이용하여 정제하였다. 정제는, 상기한 효소를 0.1g/mL 농도가 되도록 10mM, pH5.0 아세트산 완충액에 용해하고, 이 용액 0.1mL를 동일 완충액으로 평형화한 상기한 칼럼에 통액하여, NaCl 농도 0.05 내지 0.15mol/L로 용출되어 오는 정제 분획의 효소 용액 0.8mL를 얻었다. 가수분해 처리는, 가교 히알루론산을 10mM, pH5.0 아세트산 완충 생리 식염수 1.0mL에 농도 3중량%가 되도록 조정하고, 상기한 정제 효소 용액 0.2mL를 첨가하여, 37℃ 160rpm 진탕 조건하에서 24시간 반응시키고, 그 후, 효소 용액 0.2mL를 가하여 동일 조건하에서 24시간 더 반응시켰다. 반응 후의 용액은 -30℃에서 동결하고, 그 후 18시간 동결 건조시킨 후, NMR 측정 시료로 하였다.
측정으로 얻어진 스펙트럼도로부터, 가교 에스테르기에 상당하는 화학적 이동(Ha: 4.18ppm) 및 아세틸메틸기에 상당하는 화학적 이동(Hb: 2.05ppm)의 적분치를 구하여, 이하의 식 (4)로부터 가교도를 산출하였다.
가교도=100×([Ha]×2)/([Hb]/3) … (4)
<에틸에스테르량의 측정>
상기에서 얻어진 실시예 10 내지 11 및 비교예 7 내지 8의 자기 가교 히알루론산 입자에 대해서, 에틸에스테르량을 NMR에 의해 측정하였다.
측정으로 얻어진 스펙트럼도로부터, 히알루론산의 에틸에스테르기에 상당하는 피크(Ha: 4.27 내지 4.33ppm) 및 히알루론산의 아세틸메틸기에 상당하는 피크(Hb: 2.05ppm)의 적분치를 구하여, 이하의 식 (5)로부터 히알루론산의 에틸에스테르를 정량하였다.
히알루론산의 에틸에스테르량(몰%)=100×([Ha]/2)/([Hb]/3) … (5)
<용해성 반감기의 측정>
상기에서 얻어진 실시예 10 내지 11 및 비교예 7 내지 8의 자기 가교 히알루론산 입자에 대해서, 용해성 반감기를 측정하였다. pH7.4의 인산 완충액을 이용하여 60℃ 환경에서 가열을 행하고, 5시간 간격으로 샘플 채취하였다. 채취한 샘플을 희석하고, 원심 분리에 의해 상청과 침전부로 나눠, 각각의 부분의 히알루론산 농도를 측정하여, 겔 분율을 산출하였다. 가열 시간에 대한 겔 분율의 거동을 판독하여, 겔 분율 50%에 도달하는 가열 시간을 구하였다.
<점도 평균 분자량>
생리적 식염수에 10mM 농도로 인산 완충 성분을 가하여, pH7.4의 인산 완충화 식염수를 조정하였다. 이 인산 완충화 생리적 식염수 100ml에 대해 실시예 10 내지 11 및 비교예 7 내지 8의 자기 가교 히알루론산 입자를 첨가하여, 자기 가교 히알루론산이 완전히 용해할 때까지 30일간, 37.0℃에서 침지하였다.
인산 완충화 생리적 식염수 중에 용출한 히알루론산의 점도 평균 분자량은, 상청을 0.2㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, GPC 장치에 0.1ml 주입하여 측정하였다. 히알루론산의 점도 평균 분자량은, GPC 장치의 검출기로서 시차 굴절률계를 사용하여, 분자량 분포의 피크톱의 보유 타임으로부터 산출하였다. GPC 장치는, GPC 칼럼으로서 쇼와 덴꼬사 제조 SB806HQ를 1개, 시차 굴절률 검출기로서 쇼덱스사 제조 RI-71S를 사용하여, 용매 질산나트륨의 0.2M 수용액, 측정 온도 40℃, 유속 0.3ml/분으로 측정하였다. 보유 타임으로부터의 점도 평균 분자량의 산출에는, 점도 평균 분자량이 기지인 히알루론산의 분자량 분포의 피크톱의 보유 타임을 이용하여 작성한 검량선을 이용하였다. 검량선 작성에 이용하는 히알루론산의 점도 평균 분자량은, 히알루론산을 0.2M 염화나트륨 용액으로 용해하고, 우벨로데형 점도계를 사용하여 30℃에서의 0.2M 염화나트륨 용액의 유하 시간(t0) 및 시료 용액의 유하 시간(t)을 측정하고, t0, t로부터 얻어진 환원 점도ηred로부터 시간 0에서의 극한 점도를 산출하여, 로랑의 식[η]=0.00036×M0 .78([η]: 극한 점도, M: 점도 평균 분자량)을 이용하여 산출하였다.
실시예 10 내지 11 및 비교예 7 내지 8의 측정 결과를 표 12에 나타낸다.
표 12와 같이, 실시예 10 내지 11의 자기 가교 히알루론산 입자는 에탄올 함량이 적고, 에틸에스테르량도 적었으며, 용해성 반감기 및 1차 분자량의 저하는 보이지 않았다. 한편, 에탄올 함량 및 에틸에스테르량이 많은 비교예 7 내지 8의 자기 가교 히알루론산 입자는, 실시예 10 내지 11과 비교하여, 용해성 반감기 및 1차 분자량의 값이 낮아, 물성 열화가 발생하였다. 또한, 비교예 7 내지 8의 자기 가교 에스테르화도는 실시예 10 내지 11과 비교하여 낮아져 있는 점에서, 에틸에스테르화가 자기 에스테르화를 저해하고 있음을 확인하였다.
<평균 부피 입경>
실시예 10에서 얻어진 자기 가교 히알루론산 입자의 입경에 대해, 입도·형상 분포 측정기 PITA-1(세이신기업 제조)을 이용하여 정량하였다. 전처리로서 자기 가교 히알루론산을 메틸렌 블루에 의해 염색(염색액 농도: 1w/v%, 염색 시간: 1분 이상)하였다. PITA-1의 측정 조건으로는, 캐리어액은 증류수를 이용하고, 측정 입자수는 10,000개, 대물렌즈 4배로 측정하였다. 그 결과, 얻어진 자기 가교 히알루론산 입자의 평균 부피 입경은 65㎛였다.
<가교 히알루론산 조성물의 제조>
(실시예 12)
실시예 10에서 얻어진 자기 가교 히알루론산 입자를, 5℃, pH7.0의 10mM 인산 완충 생리 식염수에 투입하고, 1시간 간격으로 10mM 인산 완충 생리 식염수를 교환하는 것을 2회 반복하였다. 이 가교 히알루론산 조성물의 전체 부피에 대한 자기 가교 히알루론산 입자의 건조 중량(농도)이 6w/v%가 되도록 이하와 같이 조정하였다.
자기 가교 히알루론산의 농도의 정량은, 가교 히알루론산 조성물 50mg을 증류수 1.55ml로 희석하고, 거기에 1N 수산화나트륨 용액을 0.2ml 첨가하여, 실온에서 30분 정치함으로써, 자기 가교 히알루론산의 에스테르 가교를 가수분해하여, 자기 가교 히알루론산을 용해하였다. 또한 1N 염산 0.2ml를 첨가하여 중화한 후, 카르바졸 황산법에 의해 기지 농도의 히알루론산(점도 평균 분자량 190만)을 표준 물질로 해서, 자기 가교 히알루론산의 농도를 계산하였다. 이 정량 결과를 기초로, 자기 가교 히알루론산 입자의 농도가 6w/v%가 되도록 조정하여, 가교 히알루론산 조성물을 얻었다.
(실시예 13)
가교 히알루론산 조성물의 전체 부피에 대한 자기 가교 히알루론산 입자의 건조 중량이 3w/v%가 되도록, pH7.0의 10mM 인산 완충 생리 식염수에 투입하여 조정한 것 이외에는, 실시예 12와 마찬가지로 하여 가교 히알루론산 조성물을 제조하였다.
(비교예 9)
자기 가교 히알루론산의 입자화에 고속 회전 장치(제품명: 구레아 믹스 싱글 모션, M테크닉(주) 제조)를 사용하여, 장치의 로터를 순방향으로 10,000rpm으로 회전시키고, 가교 히알루론산이 30℃ 미만이 되도록 냉각하면서 6분간 미립화한 것 이외에는, 실시예 10과 동일하게 하여 평균 부피 입경이 300㎛인 자기 가교 히알루론산 입자를 제조하였다. 또한, 실시예 12와 마찬가지로 하여 자기 가교 히알루론산 입자의 농도가 6w/v%인 가교 히알루론산 조성물을 제조하였다.
(비교예 10)
자기 가교 히알루론산의 입자화에 고속 회전 장치(제품명: 구레아 믹스 싱글 모션, M테크닉(주) 제조)를 사용하여, 장치의 로터를 순방향으로 20,000rpm으로 회전시키고, 가교 히알루론산이 30℃ 미만이 되도록 냉각하면서 4분간 미립화한 것 이외에는, 실시예 10과 마찬가지로 하여 평균 부피 입경이 153㎛인 자기 가교 히알루론산 입자를 제조하였다. 또한, 실시예 12와 마찬가지로 하여 자기 가교 히알루론산 입자의 농도가 6w/v%인 가교 히알루론산 조성물을 제조하였다.
(비교예 11)
자기 가교 히알루론산의 입자화에 고속 회전 장치(제품명: 구레아 믹스 싱글 모션, M테크닉(주) 제조)를 사용하여, 장치의 로터를 순방향으로 20,000rpm으로 회전시키고, 자기 가교 히알루론산의 냉각을 행하지 않고서 20분간 미립화하여, 평균 부피 입경 100㎛인 자기 가교 히알루론산 입자를 제조하였다. 이때, 자기 가교 히알루론산의 온도는 85℃까지 상승하였다. 또한, 실시예 12와 마찬가지로 하여 자기 가교 히알루론산 입자의 농도가 6w/v%인 가교 히알루론산 조성물을 제조하였다.
(참고예 1)
히알루론산 관절 제제 "수베닐"(상품명, 주가이제약(주) 제조)
(점도 평균 분자량 200만, 히알루론산 농도 1w/v%)
(참고예 2)
히알루론산 관절 제제 "아르츠"(상품명, 세이가가꾸 고교(주) 제조)
(점도 평균 분자량 80만, 히알루론산 농도 1w/v%)
(참고예 3)
히알루론산 관절 제제 "신비스크"(상품명, 젠자임 코포레이션사 제조)
(히알루론산 농도 0.8w/v%)
(참고예 4)
히알루론산 관절 제제 "듀로레인"(상품명, Q-MED사 제조)
(히알루론산 농도 2.0w/v%)
(참고예 5)
생리 식염수 "오쯔카 생식주"(상품명, 오쯔카제약(주) 제조)
실시예 12 내지 13 및 비교예 9 내지 11에서 얻어진 가교 히알루론산 조성물의 특성을, 참고예 1 내지 5와 함께, 이하와 같이 측정 및 평가하였다.
<가교 히알루론산 조성물의 점도 측정>
점도 측정 장치인 레오미터로서, MCR300(상품명, 피지카 제조)을 사용하였다. 콘 플레이트는 콘각 1.009°(D=49.938mm)를 이용하고, 전단 속도 50S-1, 25℃에서 측정하였다. 실시예 12 내지 13 및 비교예 9의 가교 히알루론산 조성물, 참고예 1 내지 5의 점도 비교를 행하였다. 표 13에 점도의 측정 결과를 나타낸다.
표 13과 같이, 특히 실시예 12의 가교 히알루론산 조성물은 6w/v%로 고농도의 자기 가교 히알루론산 입자를 함유함에도 불구하고, 참고예 1의 점도 평균 분자량 80만, 1w/v%의 히알루론산에 비해 점도가 1/6 이하로 되었다.
<가교 히알루론산 조성물의 토출압 측정 (1)>
가교 히알루론산 조성물 1ml를 내경 0.45cm의 주사기 데루모 시린지 SS-01T(상품명, 데루모사 제조)에 채우고, 내경 0.40mm, 바늘의 길이 25mm의 주사 바늘 23G(데루모사 제조)를 꽂았다. 압출압 측정기 EZ-TEST(상품명, 시마즈 세이사꾸쇼(주) 제조)를 이용하여, 온도 25℃에서 속도 50mm/분의 토출 조건에서, 실시예 12 및 비교예 9 내지 10의 가교 히알루론산 조성물, 참고예 1 내지 5의 상기 시린지에 걸리는 압력을 측정하였다. 표 14에 측정 결과를 나타낸다.
표 14와 같이, 특히 실시예 12의 가교 히알루론산 조성물은 6w/v%로 참고예 1의 6배인 고농도의 히알루론산을 함유함에도 불구하고, 토출압을 낮게 억제할 수 있었다.
<가교 히알루론산 조성물의 토출압 측정 (2)>
토출압 측정 (1)에서 사용한 "주사 바늘 23G(내경 0.40mm)보다 가는 24G, 25G 및 27G의 주사 바늘을 사용하여, 실시예 12 및 참고예 1 내지 5의 샘플 1ml를 주사 바늘이 꽂힌 시린지(데루모사 제조)에 채워, 토출압 측정 (1)과 마찬가지로 하여 시린지에 걸리는 압력을 측정하였다. 그 결과를 이하의 표 15 및 도 10에 나타낸다.
표 15 및 도 10과 같이, 특히 실시예 12의 가교 히알루론산 조성물은 6w/v%로 참고예 1의 6배인 고농도의 히알루론산을 함유함에도 불구하고, 토출압을 낮게 억제할 수 있으며 가는 바늘이 사용 가능한 점에서, 주사시 환자의 동통을 경감할 수 있음이 시사되었다.
<가교 히알루론산의 1차 분자량 측정>
실시예 12 및 13 및 비교예 11의 샘플에 대해, 자기 가교 히알루론산으로 환산하여 10mg분을 0.1N 수산화나트륨 용액 1ml에 투입하고, 0℃에서 30분간 정치하여, 자기 가교 히알루론산을 용해하였다. 이 용해액에 0.1N 염산 1ml를 첨가하여 중화하고, GPC 용매로 농도를 0.01질량%가 되도록 희석 제조하여, 0.2㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, GPC 장치에 0.1ml 주입하여, 실시예 10 내지 11 및 비교예 7 내지 8과 마찬가지로, 1차 분자량으로서 점도 평균 분자량의 측정을 행하였다. 측정 결과를 표 16에 나타낸다.
<가교 히알루론산으로부터 용출한 히알루론산의 점도 평균 분자량 측정>
생리적 식염수에 10mM 농도로 인산 완충 성분을 가하여, pH7.4의 인산 완충화 식염수를 조정하였다. 이 인산 완충화 생리적 식염수 100ml에 대하여 실시예 12 및 13 및 비교예 11의 샘플 0.5ml를 첨가하고, 자기 가교 히알루론산이 완전히 용해할 때까지 30일간, 37.0℃에서 침지하여, 실시예 10 내지 11 및 비교예 7 내지 8과 마찬가지로, 점도 평균 분자량의 측정을 행하였다. 측정 결과를 표 16에 나타낸다.
표 16에 나타낸 바와 같이, 냉각 온도 제어를 행하지 않은 비교예 11은 파쇄시에 자기 가교 히알루론산의 1차 분자량이 저하되어, 자기 가교 히알루론산으로부터 용출하는 히알루론산의 점도 평균 분자량도 70만으로 낮아졌다. 그에 반해 파쇄시에 50℃ 미만으로 냉각 온도 제어한 실시예 12 및 13은, 자기 가교 히알루론산으로부터 용출하는 히알루론산의 점도 평균 분자량을 170만으로 높게 유지할 수 있었다.
<관절 중에서 자기 가교 히알루론산으로부터 용출한 히알루론산의 점도 평균 분자량 측정>
토끼(일본 백색종 수컷), 중량 약 3kg을 마취(마취 조성: 케타민(4ml)+자일라진(3ml)+생리 식염수(5ml))하고, 뒷다리 양 무릎에 실시예 12 및 13, 비교예 9 및 11, 및 참고예 1 및 3의 샘플을, 내경 0.45cm의 시린지에 23G 주사 바늘을 이용하여 투여량 0.1ml/kg으로 주입하였다.
주입 7일 후, 마취하에서 안락사시키고, 무릎을 잘라내어 관절액을 고점성용 피펫으로 회수하였다. 관절액은 증류수로 정확하게 100배 희석하여, 4℃, 15,000rpm, 10분간 원심 분리하였다. 그 상청을 0.2㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, GPC 장치에 0.1ml 주입하여 점도 평균 분자량의 측정을 행하였다. 측정 결과를 표 17에 나타낸다.
표 17에 나타내는 바와 같이, 비교예 11, 참고예 1 및 3은, 샘플 비투여와 마찬가지로 관절액량 30μl, 관절액의 점도 평균 분자량 170만 이상, 히알루론산 농도 0.3질량%였다. 이에 반해, 실시예 12 및 13의 관절액량은, 200 및 300μl, 관절액의 점도 평균 분자량 170만 이상, 히알루론산 농도는 0.6중량%가 되었다. 또한 비교예 9는, 바늘 막힘이 발생하여 관절로의 주입이 곤란하였다. 실시예 12 및 13의 관절액의 증량과 관절액 내의 히알루론산 농도의 상승은 본 발명의 가교 히알루론산 조성물에서 유래되는 것으로 생각되며, 본 발명의 가교 히알루론산 조성물을 주사제로서 이용하면, 주사해서 7일 후에도 점도 평균 분자량 170만 이상의 히알루론산이 관절액 내에 유지됨을 알았다.
<자기 가교 히알루론산에 의한 동통 억제 효과의 측정>
실시예 12 및 13 및 참고예 1 및 5의 관절강 내 주사가 동통에 미치는 작용을 토끼의 무릎 관절 반월판 부분 절제에 의한 실험적 변형성 관절증을 이용하여 측정하였다.
<사용 동물 및 사육 방법>
동물로는, 13주령의 Kbl: JW(SPF)계 토끼를 실시예·참고예마다 8마리씩 이용하기 위해 총 32마리를 준비하였다. 동물을 입하한 후 3 내지 8일 동안 매일, 평가 장치에 대한 훈화로서 동물을 소동물용 진통 평가 장치 인캐패시턴스 테스터(린턴 인스트루먼트 제조)의 본체 용기(홀더)에 넣어 5초간 정지시키는 조작을 행하였다.
동물은, 가동식 래크에 장착한 브래킷식 금속제 철망상 케이지(350W×500D×350H mm)에 개별로 수용하고, 온도 20±3℃, 습도 50±20%, 환기 횟수 12 내지 18회/시간, 조명 시간 8:00 내지 20:00(명 12시간, 암 12시간)의 환경하에서 사육하였다. 사료는, 스테인리스제 급사기에 의해, 실험 동물용 고형 사료 RC4(오리엔탈 효모 공업사 제조)를 150g/일의 급여로서 제공하고, 음료수는 폴리프로필렌제 급수병(선관 스테인리스제)에 의해 수돗물을 자유롭게 제공하였다. 동물의 개체 식별은 귓바퀴에 매직 잉크로 개체 식별 번호를 기입하여 식별하고, 케이지에는 군 나눔 전에는 성별 및 개체 식별 번호를 기입한 카드를, 군 나눔 후에는 시험 번호, 투여군, 성별, 동물 번호, 수술일, 투여일, 부검일 및 개체 식별 번호를 기입한 카드를 붙였다.
<동물의 선택 및 군 나눔>
반월판 부분 절제 수술일 전일에 군 나눔을 행하였다. 군 나눔 일에, 전체 예의 체중과 양 뒷다리 중량 배분을 측정하였다. 측정한 양 뒷다리 중량 배분으로부터 좌측 뒷다리 중량 배분비((좌측 하중/양측 합계 하중)×100(%))를 산출하였다. 좌측 뒷다리 중량 배분비를 기준으로 해서 개체치가 평균치에 가까운 순으로 선택하였다. 선택한 동물은 좌측 뒷다리 중량 배분비에 의한 층별 연속 무작위화법을 이용하여 각 군에 할당하였다. 좌측 뒷다리 중량 배분비의 평균치가 각 군에서 마찬가지의 값을 나타내어, 군 간에 차가 없는 것을 확인한 후, 체중에 대해서도 평균치가 각 군에서 마찬가지의 값을 나타내어, 군 간에 차가 없음을 확인하였다.
<변형성 관절증 모델의 제작(반월판 부분 절제)>
반월판 부분 절제 수술은 군 나눔 일의 다음날에 행하여, 반월판 부분 절제 수술일을 수술 후 0일이라 정의하였다. 14 내지 15주령의 동물을 이용하여, 상술한 참고 문헌 1 내지 3에 기재된 방법을 참고로 해서, 반월판 부분 절제 변형성 관절증 모델을 제작하였다.
구체적으로는, 염산 케타민(제품명: 케타랄 근육 주사용 500mg, 산쿄에일약품사 제조) 및 자일라진(제품명: 스킬펜 2%주사액, 인터베트사 제조)의 병용 마취하(대퇴부 근육내 주사)에서 토끼의 좌측 무릎 관절부를 제모하고, 북도식 고정기(나쓰메세이사꾸쇼사 제조)에 배위 고정하였다. 무균적으로 슬개의 외측 바로 아래 피부에 약 2cm의 절개를 가하여, 외측 측부 인대를 노출시킨 후, 이 인대를 절제하였다. 또한, 슬와근 기시부의 건을 절제함으로써 외측 반월판을 노출시키고, 반월판의 거의 중앙부를 3.0 내지 4.0mm에 걸쳐 절제하였다. 그 후, 피하근층과 피부를 각각 결절 봉합하고, 암피실린(제품명: 빅실린졸-15%, 메이지 세이카사 제조) 약 0.2ml를 대퇴부 근육내에 주사하였다.
<관절강 내에 주입하는 군의 구성>
상술한 참고 문헌 1 내지 8에 기재된 방법을 참고로 하여, 실시예 12 및 13 및 참고예 1 및 5의 주사제를 0.1mL/kg 관절강 내에 주입하는 4군을, 표 18과 같이 설정하였다.
전체 군의 전체 예에 대해서, 수술 후 4일(동통 발병일)의 양 뒷다리 중량 배분 측정 후에 1회, 실시예 12 및 13 및 참고예 1 및 5의 주사제 0.1ml/kg을 수술측(좌측) 슬관절강 내에 1ml 주사통(데루모 시린지 1ml 투베르쿨린용, (주)데루모) 및 23G 주사 바늘(데루모 주사 바늘 23G, (주)데루모)을 이용하여 투여하였다. 투여액량은 투여일에 측정한 체중에 기초한 액량 환산에 의해 개별적으로 산출하였다.
<동통 억제 효과의 측정 방법>
양 뒷다리 중량 배분의 측정에는 소동물용 진통 평가 장치 인캐패시턴스 테스터(영국 린턴 인스트루먼트사 제조)를 이용하였다. 본 장치는, 본체 용기에 넣은 동물의 좌우 다리에 대한 중량 배분을, 용기 저면에 설치한 듀얼 채널의 센서 패드에 의해 좌우 각각의 중량을 그램 단위로 정확하게 검출하여, 그 값을 시험자가 설정한 시간으로 평균화하였다. 본체 용기는 토끼용의 것을 사용하였다. 측정 설정 시간은 동물의 정지 상태에서 5초로 하였다.
동물을 토끼용 본체 용기(홀더) 내로 이동시켜 동물의 정지 상태에서 측정하고(1번째), 다음으로 동물을 홀더로부터 꺼내고 다시 넣어 정지 상태에서 측정하고(2번째), 이 조작을 다시 반복하였다(3번째). 3회 측정한 양 뒷다리 중량 배분의 각각에 대하여 좌우 중량(하중)으로부터 좌측 뒷다리 중량 배분비(%)를 하기 식 (6)에 의해 산출하였다.
좌측 뒷다리 중량 배분비(%)={좌측 하중(g)/(우측 하중(g)+좌측 하중(g))×100} … (6)
3회 산출한 좌측 뒷다리 중량 배분비(%)의 평균치를, 측정 1회당의 좌측 뒷다리 중량 배분비(%)라 정의하였다. 그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 실시예 12 및 13의 자기 가교 히알루론산은 참고예 1보다 동통 억제 효과가 향상되었음을 알았다. 또한, 도 11에서, *, **는 참고예 5인 음성 대조군(생리적 식염수 투여)과 비교하여 유의차가 있음을 나타낸다.(*: p<0.05, **: p<0.01(t검정))
<각종 자기 가교 에스테르화도의 자기 가교 히알루론산의 제조>
실시예 10에서 얻어진 자기 가교 히알루론산을 50mM 인산 완충 생리 식염수(pH7.4)의 용매로 교환하여, 6중량%의 현탁상의 가교 히알루론산 조성물을 제조하였다. 얻어진 가교 히알루론산 조성물 7ml를 채취하여, 용기에 옮겨 밀폐하였다. 마찬가지의 가교 히알루론산 조성물 채취를 반복하여, 5개의 시험 샘플을 얻었다.
상기 5개의 시험 샘플을 60℃로 설정한 항온 환경 시험기(에스펙 제조)에 넣어 소정 시간 가열하였다. 가열 시간은 5개의 시험 샘플에서 서로 다른 시간으로 하였다. 즉 가열 개시부터 0, 2, 4, 6, 10시간 후의 각 시점에서 시험 샘플 1개씩 취출하였다. 이상의 공정에 의해, 5 종류의 가교 히알루론산 조성물을 얻었다. 이들을 상기 가열 시간이 짧은 순으로, 실시예 14 내지 17 및 비교예 12로 하였다.
<평형 팽윤 배율의 측정>
가교 히알루론산 조성물 0.4ml를 원심식 필터 유닛(0.45마이크로미터 공경, 밀리포어사 제조)을 이용하여 5℃, 2,000rpm, 30분간 원심 분리해서 용매를 제거하고, 또한 원심식 필터 유닛마다 20시간 건조함으로써, 용매 제거한 자기 가교 히알루론산 중량과 건조한 자기 가교 히알루론산 중량을 구하여, 평형 팽윤 배율을 산출하였다. 용매는, 10mM 인산 완충 생리 식염수(pH6.0)이고, NaCl 농도는 0.9중량%이고, 5℃에서 1일간 팽윤시켜 평형 팽윤 상태에 도달한 후에 측정하였다.
<60℃ 용해성 반감기의 측정>
실시예 14 내지 17 및 비교예 12의 가교 히알루론산 조성물에 대해서, 실시예 10 내지 11 및 비교예 7 내지 8에서의 측정 방법과 마찬가지로, 60℃ 용해성 반감기를 측정하였다.
<1차 분자량의 측정>
실시예 14 내지 17 및 비교예 12의 가교 히알루론산 조성물의 1차 분자량으로서, 실시예 10 내지 11 및 비교예 7 내지 8에서의 측정 방법과 마찬가지로, 점도 평균 분자량을 측정하였다.
<가교도(자기 가교 에스테르화도)의 측정>
실시예 14 내지 17 및 비교예 12의 가교 히알루론산 조성물에 대해서, 실시예 10 내지 11 및 비교예 7 내지 8에서의 측정 방법과 마찬가지로, 가교도(자기 가교 에스테르화도)를 측정하였다. 또한, 측정 조건을 이하와 같이 하였다. 기기: AVANCEIII 500, 관측 폭: 500.232MHz, 펄스 폭: 10.5μs(90°), 측정 모드: 13C 디커플-1H 논디커플법, 적산 횟수: 7600회, 측정 온도: 30℃.
실시예 14 내지 17 및 비교예 12의 가교 히알루론산 조성물의 측정 결과를 표 19 및 도 12 내지 15에 나타내었다.
표 19 및 도 12 내지 15와 같이, 가열 시간을 증가시킴으로써 가교도를 작게 했던 가교 히알루론산 조성물은, 60℃ 용해성 반감기도 작아져 이차 함수적인 상관을 나타내었다. 한편, 평형 팽윤 배율은, 가교도를 작게 했던 가교 히알루론산 조성물일수록 커져 플로리·리너식에 상이한 상관을 나타내었다.
<보존 안정성의 평가>
실시예 14 내지 17 및 비교예 12의 가교 히알루론산 조성물의 용매를, 10mM 인산 완충화 생리 식염수(pH6.0)로 교환하여, 자기 가교 히알루론산의 농도가 6w/v%가 되도록 조정하였다. 60℃ 환경에서의 가열 중, 적당한 간격으로 샘플 채취를 행하여, 유리된 히알루론산량을 측정해서 겔 분율을 측정하였다. 가열 시간에 대한 겔 분율의 거동을 판독하여, 겔 분율 97%에 도달하는 가열 시간을 구하였다. 또한, 겔 분율 95%에 도달하는 가열 시간도 상기와 마찬가지로 구하였다. 그 측정 결과를 이하의 표 20 및 도 16 내지 17에 나타낸다.
표 20과 같이, 가열 시간의 증가에 따라서 겔 분율 도달 일수가 짧아졌다. 특히, 비교예 12에서는 겔 분율 97%에 도달하는 가열 시간이 0.7일 겔 분율 95%에 도달하는 가열 시간이 1.1일로 짧아졌다. 또한, 반감기 및 가교도가 적어질수록 겔 분율 도달 일수도 짧아져서, 이들 물성치와 보존 안정성이 상관함을 나타내었다(도 16 및 도 17).
(평균 침강 농도의 측정)
또한, 실시예 14 내지 17 및 비교예 12의 가교 히알루론산 현탁액에 대해서 평균 침강 농도의 측정을 행하였다. 평형 침강 농도는, 현탁액의 히알루론산 농도[C], 현탁액의 부피[V0] 및 침전의 부피[V]를 측정하여, 하기 식 (7)과 같이 구하였다.
평형 침강 농도=C×(V0/V) … (7)
그 측정 결과를 이하의 표 21에 나타낸다.
표 21과 같이, 설정 가능한 농도 상한인 평형 침강 농도가 가열 시간과 상관하였다. 특히, 비교예 12는 평균 침강 농도가 5.2중량%로 낮아, 실시예 14 내지 17에 비해 농도를 높게 할 수 없음을 나타내었다.
본 발명에 따르면, 종래보다 투여 횟수를 적게 한 경우에도, 변형성 무릎 관절증에 대해 충분한 치료 효과를 얻을 수 있는 가교 히알루론산 조성물 및 그것에 이용하는 자기 가교 히알루론산 입자를 제공할 수 있다.
1 : 로터 2 : 스크린
3 : 슬릿 10 : 회전 장치
3 : 슬릿 10 : 회전 장치
Claims (13)
- 평균 부피 입경이 10 내지 100㎛이고, 평형 팽윤 배율이 3 내지 10배이고, 1차 분자량이 80만 이상이고, 자기 가교 에스테르화도가 0.05 내지 0.50mol%인 자기 가교 히알루론산의 입자와, 수계 용매를 함유하는 가교 히알루론산 조성물이며,
상기 가교 히알루론산 조성물의 전체 부피에 대한 상기 자기 가교 히알루론산의 입자의 건조 중량은 3 내지 8w/v%인 가교 히알루론산 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 자기 가교 히알루론산의 입자는 에틸에스테르량이 0.05mol% 이하인 가교 히알루론산 조성물.
- 삭제
- 제1항 또는 제4항의 가교 히알루론산 조성물을 함유하는 주사제.
- 제6항에 있어서, 1회당 1.25mg/kg(체중) 이상의 상기 자기 가교 히알루론산이 투여되도록 이용되는 주사제.
- 제6항에 있어서, 1회당 75mg 이상의 상기 자기 가교 히알루론산이 투여되도록 이용되는 주사제.
- 제6항의 주사제를 수용한 프리필드 시린지(prefilled syringe) 제제.
- 평균 부피 입경이 10 내지 100㎛이고, 평형 팽윤 배율이 3 내지 10배이고, 1차 분자량이 80만 이상이고, 자기 가교 에스테르화도가 0.05 내지 0.50mol%인 자기 가교 히알루론산 입자.
- 삭제
- 제10항에 있어서, 에틸에스테르량이 0.05mol% 이하인 자기 가교 히알루론산 입자.
- 삭제
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