KR101825647B1 - Cancer marker analysing method by glycan monitoring of glycoprotein through intact molecular weighing - Google Patents

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Abstract

Protein glycosylation is highly sensitive to changes in a body′s internal and external environment. A research study has been conducted to the protein glycosylation in diagnostic systems related to use the direct correlation between the protein glycosylation and various diseases including cancer. A disease diagnosis method using sugar chains is highly efficient but may generate undesirable synthetic compositions and need time and labor for sample pretreatment, mass analysis, and data processing when the separated sugar chain is used for the diagnosis. To minimize the problems, a novel cancer analysis method is developed to analyze the glycosylated proteins in the initial state and apply the analysis to a cancer diagnosis. According to the present invention, the disulfide bond of haptoglobin in a multifactorial structure is cut off to separate alpha and beta chains before measuring the total molecular weight thereof to analyze the glycosylation pattern of the beta chain. Without separating the sugar chain, only the minimum pretreatment of butting the disulfide bond is executed before consuming short mass analyzing time within 10 minutes and quickly processing data to recognize the protein glycosylation pattern, thereby utilizing the method as a precise and quick disease diagnosis method.

Description

당단백질의 전분자량 측정을 통한 당사슬 모니터링에 의한 암 진단마커 분석방법 {Cancer marker analysing method by glycan monitoring of glycoprotein through intact molecular weighing}BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention [0001] The present invention relates to a method for analyzing cancer marker by oligosaccharide monitoring using glycoprotein,

본 발명은 고감도, 고분해능 질량분석기를 이용하여 당단백질의 전분자량을 측정함으로써 온전한 당쇄화 패턴 분석을 통해 위암 진단용 당사슬 빈도 마커 (frequency marker) 및 정량 마커 (abundance marker)를 이용하여 고속으로 암을 탐지하는 방법에 관한 것이다.The present invention uses a high sensitivity and high resolution mass spectrometer to measure the total molecular weight of a glycoprotein, thereby detecting a cancer at a high speed using a frequency marker and an abundance marker for gastric cancer diagnosis through a thorough glycosylation pattern analysis .

암은 세계적으로 제1의 사망원인이며, 이 상황은 국내에도 마찬가지이다. 암은 유전적, 환경적 요인에 의해서 형성, 발전하며 식생활의 변화, 환경오염의 심화, 환경 및 정신적 스트레스의 노출 심화 등으로 인하여 암 발생 및 암으로 인한 사망자가 해마다 증가하는 추세이다. 다른 질병과 비교해 볼 때 암의 특징은 완치가 비교적 어렵다는 것과 치료 후 생존율이 평균적으로 낮다는데 있다. 생존율과 관련하여 암이 갖는 특징은 암의 진행 정도에 따라 환자의 예후와 생존율이 큰 차이를 보인다는 것인데 약 100여 년에 가까운 암치료기술의 발전에도 불구하고 암종마다 약간의 차이는 있지만 말기 암이나 전이가 이루어진 암의 경우는 완치율이 매우 낮다 (Etzioni R. et al., Nature Reviews Cancer 3, 243-252, 2003). 더욱이 암은 초기에 자각증상이 별로 없는 것이 일반적이며 자각증상에 의한 진단의 경우는 이미 치료가 불가능한 말기 상태로 발전한 경우가 많다. 즉, 암의 치료법 개발 필요성과 함께 치료가 가능한 초기에 암을 진단할 수 있는 방법이 암의 효과적인 치료와 생존율 제고라는 목표에 가장 부합하는 전략이라고 할 수 있다. 이러한 목적으로 암의 조기진단을 도울 수 있는 생체인자, 즉 바이오마커의 연구, 개발이 현재 프로테오믹스 기법을 중심으로 해서 세계적으로 활발하게 진행되고 있다.Cancer is the leading cause of death worldwide, and this situation is the same in Korea. Cancer is an increasing trend of cancer and cancer deaths due to genetic and environmental factors, the development of dietary life, the deepening of environmental pollution, the deepening of exposure to environmental and mental stress. Compared to other diseases, the characteristics of cancer are that it is relatively difficult to cure and that the average survival rate after treatment is low. In terms of survival rates, the characteristics of cancer are that the prognosis and survival rate of patients differ greatly depending on the progression of the cancer. Despite the development of the cancer treatment technology that is close to 100 years, Or metastasized tumors (Etzioni R. et al., Nature Reviews Cancer 3, 243-252, 2003). Furthermore, it is common for cancer to have little subjective symptoms at the beginning, and in the case of diagnosis due to subjective symptoms, it often develops into a terminal state that can not be treated. In other words, the need to develop a treatment for cancer and the method to diagnose cancer at the earliest possible stage of treatment are the most appropriate strategies for the effective treatment of cancer and the goal of increasing survival rate. For this purpose, the research and development of a biomarker, that is, a biomarker that can help early diagnosis of cancer, is currently being actively conducted around the world, centered on the proteomics technique.

종양 바이오마커는 다양한 용도가 있는데, 암의 조기진단을 도울 수 있고, 암의 진행시기를 측정하고, 치료에 따른 암의 진행상황을 모니터할 수 있게 하며 수술 후의 예후를 판단할 수 있게 하는 기능도 있다 (Rifai N. et al.,Nature Biotech. 24, 971-983, 2006). 이런 목적과 기능을 가진 바이오마커를 통하여 암의 발견 및 진행상황을 추적하기 위해서는 비파괴적인 방법이 요구되며, 따라서 검사시 위험부담이 적은 혈액 등의 체액이 바이오마커 개발과 연구에 있어 최적의 생체시료로 인식되고 있다. 즉, 소변이나 타액, 혈액 등을 통하여 탐지할 수 있는 바이오마커 개발이 가장 표준화된 방식의 접근법이며, 그 중에서도 혈액은 모든 조직 유래의 단백질이 모이는 가장 포괄적인 생체시료라고 할 수 있다. 또한, 생체물질의 형태로 볼 때 가장 선호되는 종양 바이오마커의 형태는 단백질이라고 할 수 있다.Tumor biomarkers have a variety of uses, which can help early diagnosis of cancer, measure the timing of cancer progression, monitor the progress of cancer through treatment, and determine the prognosis after surgery. (Rifai N. et al., Nature Biotech. 24, 971-983, 2006). A non-destructive method is required to track the discovery and progress of cancer through the biomarker having such a purpose and function. Therefore, body fluid such as blood, which is less risky at the time of examination, . In other words, the development of a biomarker that can be detected through urine, saliva, and blood is the most standardized approach. Among them, blood is the most comprehensive biological sample in which all tissue-derived proteins are collected. In addition, the most preferred type of tumor biomarker in terms of biomaterial is the protein.

국내 암발생률 1위인 위암 환자의 진단을 위한 방법 중 가장 많이 이용되는 검사는 위내시경 검사와 초음파 검사 등이 있다. 그러나, 이러한 위암 진단방법은 고가의 의료장비를 이용하기 때문에 비용이 많이 소요되며, 내시경 검사는 환자의 입장에서 거부감이 있다. 이러한 문제로 인하여 소량의 체액, 특히 혈액을 이용하여 높은 진단율과 짧은 시간, 적은 비용으로 암을 검사할 수 있는 체외 진단 기술에 응용 가능한 종양 바이오마커의 개발이 필요하다. 실제 지금까지는 FDA의 승인을 받은 위암 관련 혈액 유래 바이오마커는 없는 실정이다. The most commonly used diagnostic methods for gastric cancer patients with gastric cancer incidence in Korea are stomach endoscopy and ultrasonography. However, this diagnostic method of gastric cancer is costly because it uses expensive medical equipment, and endoscopy has a feeling of rejection from the viewpoint of the patient. Because of these problems, it is necessary to develop a tumor biomarker that can be applied to in vitro diagnostic techniques that can detect cancer with a small diagnostic value, a short time, and a low cost using a small amount of body fluids, especially blood. In fact, until now, there has been no FDA-approved biomarker derived from blood related to gastric cancer.

체내 단백질의 약 50% 이상은 당쇄화된 단백질인 당단백질로 당쇄화는 가장 널리 알려진 번역 후 변형 (PTM, post-translational modification) 과정으로 단백질의 기능에 크게 관여하고 있다. 혈액, 침, 눈물 등의 체액은 물론 대부분의 생체 조직에도 당단백질이 존재한다. N-당쇄화 (N-Glycosylation)는 펩타이드 골격의 아스파라긴에 올리고당이 부가되는 것이다. 이것은 그 위치와 구조적 다양성을 결정하는 생물학적 원칙에 의해 지배된다. N-당쇄화의 변화는 종양과 같은 질환에서 정상적인 당쇄화 장치에 오류가 생긴 것으로서, N-당쇄를 질병 마커로 사용하려는 시도가 있어왔다. 따라서 당쇄화의 결과물인 당사슬은 체내외의 환경 변화에 매우 민감하여 암을 포함한 여러 종류의 질병에 대한 바이오마커로 활용 가능성이 모색되고 있다. 또한, 바이오 의약품에서 당사슬은 의약품의 체내 지속시간 및 약효에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.More than 50% of the protein in the body is a glycated protein. Glycosylation is the most widely known post-translational modification (PTM) process, and is involved in protein function. Glycoproteins are present in most body tissues as well as body fluids such as blood, saliva, and tears. N-Glycosylation is the addition of oligosaccharides to the asparagine of the peptide backbone. This is governed by the biological principles that determine its location and structural diversity. Changes in N-glycosylation have resulted in errors in normal glycosylation machinery in diseases such as tumors, and attempts have been made to use N-glycans as disease markers. Therefore, oligosaccharides, which are the result of glycosylation, are highly sensitive to changes in the environment outside the body, and thus are being exploited as biomarkers for various diseases including cancer. Also, in biopharmaceuticals, oligosaccharides are known to play an important role in the duration and efficacy of drugs in the body.

당사슬의 한 종류인 N-당사슬은 2개의 N-아세틸글루코사민 (Nacetylglucosamine)과 세 개의 만노스로 이루어진 구조가 기본 코어가 되어 이 코어를 바탕으로 어떤 종류의 단당류가 몇 개 결합하는가에 따라서 크게 세 가지 클래스로 분류된다. 고만노스형 (High mannose) N-당사슬은 코어에 만노스만 더해진 구조이며, 복합형 (complex) N-당사슬은 만노스 외의 단당류들 즉, N-아세틸헥소사민 (N-acetyl hexosamine), 퓨코스, 갈락토스 및 시알산 (sialic acid) 중 1종 이상이 결합한 구조이다. 하이브리드형은 코어를 중심으로 한쪽 가지는 만노스가, 다른 한쪽 가지는 복합형에 해당하는 단당류가 붙어있는 구조를 말한다.N-glycoside, a type of oligosaccharide, is composed of two N-acetylglucosamine and three mannose bases, and based on this core, several types of monosaccharides are bound to three classes . The high mannose N-glycoside is a structure in which only mannose is added to the core, and the complex N-glycoside is a monosaccharide other than mannose, that is, N-acetyl hexosamine, Galactose and sialic acid are bonded to each other. The hybrid type refers to a structure in which monosaccharide corresponding to the complex type is attached to mannose having one side centered on the core.

N-당사슬 분석을 위해서는 단백질에서 당사슬만을 잘라내어 분리하는 당사슬 분리 단계와 분리된 당사슬을 추출 및 농축하는 당사슬 정제의 전처리 과정을 거치게 된다. 또한, 당펩타이드 분석을 통해 각 당자리에 따른 당사슬의 변화를 분석하는 경우 당펩타이드를 생성하고 당펩타이드만을 농축하는 정제과정이 필요하며 데이터 해석에 많은 시간과 기술을 요하게 된다. 본 발명의 전분자량 측정 방법은 전처리 과정 없이 또는 구조에 따라 환원제 처리를 통한 간단한 변성과정만을 거쳐 온전한 당쇄화 패턴을 분석함으로써 정상인과 암환자 간의 당쇄화 변화를 확인할 수 있다. For the N-glycoside analysis, the oligosaccharide separation step of separating and separating only the oligosaccharide from the protein and the purification step of the oligosaccharide to extract and concentrate the separated oligos are performed. In addition, when analyzing the change of oligosaccharide according to each sugar site through analysis of sugar chains, it is necessary to perform purification process of producing sugar peptide and concentrating only sugar peptide, and it takes much time and skill to analyze data. The total molecular weight measurement method of the present invention can confirm the change of sugar chain between a normal person and a cancer patient by analyzing an intact sugar chain pattern only through a simple denaturation process without a pretreatment process or according to a structure.

현재 단백질의 당쇄화 패턴을 이용하여 암을 진단하는 방법은 첫째, 당단백질에서 당사슬을 분리하여 당사슬 진단 마커로 암진단하는 방법, 둘째, 당펩타이드 분석을 통해 각 당자리에 특이적인 당쇄화 패턴을 분석하여 암진단하는 방법 등이 보고되어 있다. 반면, 온전한 단백질의 당쇄화 패턴을 이용하여 암을 진단하는 방법은 보고된 바가 없다. 본 발명은 최소한의 전처리 과정 이후 당쇄화를 모니터함으로써 실제 진단시장에서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다. The present method of diagnosing cancer using the glycosylation pattern of protein is as follows. First, a method of separating oligosaccharide from glycoprotein and diagnosing cancer by oligosaccharide marker. Second, by analyzing glycopeptide, specific sugar chain pattern And a method of diagnosing cancer by analyzing them. On the other hand, there has been no report on a method of diagnosing cancer using the intact protein glycosylation pattern. The present invention can be usefully used in an actual diagnostic market by monitoring glycosylation after a minimal pretreatment process.

본 발명은 민감도와 특이도가 높은 질병 당사슬 마커를 좀 더 간단하고 빠르고 경제적으로 탐지하는 방법을 제공하는 것을 목표로 한다.The present invention aims to provide a method for detecting a disease glycemic marker having high sensitivity and specificity more simply, quickly and economically.

또한, 본 발명은 온전한 단백질을 질량분석하여 질병 당사슬 마커를 탐지하는 방법을 제공하는 것을 목표로 한다.In addition, the present invention aims at providing a method for detecting a disease-causing sugar marker by mass-analyzing an intact protein.

그뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 탐지한 위암의 빈도 마커와 정량 마커를 제공하는 것을 목표로 한다. In addition, the present invention aims to provide frequency markers and quantitative markers of gastric cancer detected using the method of the present invention.

단백질의 당쇄화는 체내·외의 환경변화에 매우 민감하여 암을 포함한 다양한 질병에 직접적으로 관련되어 당사슬 변화를 진단시스템에 활용하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 그중 당사슬을 이용한 질병진단 방법은 매우 효율적인 진단방법이나, 당사슬을 분리하여 진단에 사용할 경우 시료 전처리, 질량분석 및 데이터 처리에 많은 시간과 노력이 요구되며 이는 예상치 못한 인공조성물을 발생시킬 수 있다. 또한, 당펩타이드를 이용한 진단 시스템은 당사슬 분석법에 비해 고민감도 고특이도를 높일 수 있으나 당펩타이드 시료 전처리에 시간이 소요되며, 당펩타이드만의 선택적인 농축과 데이터 처리 및 해석에 많은 시간과 노력이 요구된다. Protein glycosylation is very sensitive to environmental changes in the body and is directly related to various diseases including cancer. Among them, the method for diagnosing diseases using sugar chains is a very efficient diagnostic method. However, when the sugar chain is separated and used for diagnosis, a lot of time and efforts are required for sample preparation, mass analysis and data processing. In addition, the diagnostic system using the glycopeptide can increase the sensitivity and specificity compared to the oligosaccharide analysis method, but it takes a long time for the pretreatment of the glycopeptide sample, and it takes much time and effort to selectively concentrate the glycopeptide, Is required.

이러한 문제점을 최소화하고자 본 발명자들은 당쇄화된 단백질을 있는 그대로 분석하여 암진단에 적용하는 새로운 암진단용 당사슬 분석방법을 개발하였다. In order to minimize such problems, the present inventors have developed a new assay method for cancer diagnostic oligosaccharide, which is applied to cancer diagnosis by analyzing the glycosylated protein as it is.

햅토글로빈은 혈청 내에 풍부한 당단백질 중 하나이며, 염증 및 종양과 같은 다양한 질병 단계에서 증가하는 주요한 급성기 단백질 (acute phase protein)이다. 햅토글로빈은 2개의 소단위로 알파 사슬과 베타 사슬로 나뉘며 베타 사슬의 184, 207, 211 및 241번 아미노산에 4개의 N-당쇄화 자리를 포함하고 있으며, 중합되기 쉬워 다량체를 형성한다. 주로 4량체가 많은 양 형성되며 이량체에서 20량체까지 보고된 바 있다 (ref. Cheng, Tsai-Mu, et al. ‘Unique Assembly Structure Of Human Haptoglobin Phenotypes 1-1, 2-1, And 2-2 And A Predominant Hp1 Allele Hypothesis’. Biophysical Journal, 2009, 96.3:586a). 다양한 암종과 관련한 햅토글로빈 당쇄화의 변화가 종래에 보고되어 왔지만, 위암 환자와 정상인 대조군 간에 구별되는 당사슬 변화를 효율적으로 모니터링할 수 있는 플랫폼은 아직 없는 상황이다.Haptoglobin is one of the glycoproteins abundant in serum and is the major acute phase protein that increases in various disease stages such as inflammation and tumors. Haptoglylobin is divided into two subunits, the alpha chain and the beta chain, which contain four N-sugar chain sites in the amino acids 184, 207, 211 and 241 of the beta chain, and are easily polymerized to form a multimer. (2), (2), and (2), which have been reported to have a large amount of tetramer and have been reported from dimer to 20-mer (ref. Cheng, Tsai-Mu, et al., Unique Assembly Structure of Human Haptoglobin Phenotypes 1-1, And Predominant Hp1 Allele Hypothesis ", Biophysical Journal , 2009, 96.3: 586a). Although changes in the hepatoglobin glycosylation in relation to various carcinomas have been reported in the past, there is not yet a platform for efficiently monitoring the change in oligosaccharide between the gastric cancer patient and the normal control group.

본 발명자들은 전분자량 측정을 통하여 고속으로 당쇄화 패턴을 확인할 수 있는 방법을 발명한 바 있다. 그러나 햅토글로빈의 구조적 특성으로 인해 전분자량 측정이 어렵다. 따라서, 본 발명에서는 다량체 구조 또는 여러 개의 서브유닛 예컨대 알파 사슬, 베타 사슬과 같은 서브유닛으로 이루어진 햅토글로빈의 이황화 결합을 절단하여 최소 서브유닛인 알파 사슬과 베타 사슬로 분리, 정제한 후 전분자량을 측정함으로써 베타 사슬의 당쇄화 패턴을 분석하였다. The inventors of the present invention have invented a method for confirming the sugar chain pattern at a high speed through the measurement of total molecular weight. However, it is difficult to measure total molecular weight due to the structural characteristics of the haptoglobin. Therefore, in the present invention, the disulfide bond of a hepatoglobin composed of a subunit such as a multimer structure or a plurality of subunits such as an alpha chain and a beta chain is cleaved and separated into a minimum subunit alpha chain and a beta chain, The sugar chain pattern of the beta chain was analyzed by measuring the molecular weight.

본 발명은 The present invention

(가) 정상인 대조군 및 암 환자군 피검체 유래 당단백질에 환원제를 처리하고 정제하는 단계;(A) treating and purifying a glycoprotein derived from a subject in a normal control group and a cancer patient group with a reducing agent;

(나) 상기 환원 및 정제된 당단백질을 질량분석하여 전분자량을 측정하는 단계; 및(B) measuring the total molecular weight by mass-analyzing the reduced and purified glycoprotein; And

(다) 정상인 대조군과 암 환자군 간에 상기 측정한 당단백질의 전분자량을 비교하여 유의한 차이가 있는 당단백질을 암 진단마커로 선정하는 단계;를 포함하는 당단백질의 전분자량 측정을 통한 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다.(C) comparing the total molecular weight of the glycoprotein measured between the normal control group and the cancer patient group to select a glycoprotein having a significant difference as a cancer diagnostic marker, and measuring the total molecular weight of the glycoprotein, And a diagnostic marker analysis method.

또한, 본 발명은 In addition,

(가) 정상인 대조군 및 암 환자군 피검체 유래 당단백질에 환원제를 처리하여 최소 단위 서브유닛으로 분리하는 단계;(A) treating a glycoprotein derived from a subject in a normal control group and a cancer patient group with a reducing agent to separate into a minimum unit subunit;

(나) 상기 최소 단위 서브유닛을 정제하는 단계;(B) purifying the minimum unit subunit;

(다) 상기 정제된 최소 단위 서브유닛 중 당단백질의 전분자량을 질량분석하는 단계;(C) mass spectrometry of the total molecular weight of the glycoprotein among the purified minimum unit subunits;

(라) 상기 최소 단위 서브유닛 당단백질의 질량분석 데이터로부터 당사슬 조성을 결정하는 단계; 및(D) determining the oligosaccharide composition from the mass spectrometry data of the protein per the minimum unit subunit; And

(마) 정상인 대조군과 암 환자군 간에 상기 결정된 최소 단위 서브유닛의 당사슬 조성의 발현 빈도와 발현량 중 한 가지 이상을 비교하여 유의한 차이가 있는 당사슬 조성을 암 진단마커로 선정하는 단계;를 포함하는 당단백질의 전분자량 측정 및 당사슬 모니터링을 이용한 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다.(E) comparing the expression frequency and the expression level of the oligosaccharide composition of the determined minimum unit subunit between the normal control group and the cancer patient group to select a cancer glycation marker having a significant difference from the cancer gene diagnostic marker And more particularly, to a method for analyzing high sensitivity cancer diagnostic markers by using total molecular weight measurement and oligosaccharide monitoring of proteins.

또한, 본 발명은 상기 최소 단위 서브유닛이 단량체 또는 단량체를 구성하는 서브유닛임을 특징으로 하는 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다.Further, the present invention relates to a method for analyzing a sensitive sensitivity cancer marker, wherein the minimum unit subunit is a subunit constituting a monomer or a monomer.

또한, 본 발명은 상기 환원제에 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 머캡토에탄올 또는 다이티오트레이톨임을 특징으로 하는 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다. In addition, the present invention relates to a method for analyzing the diagnostic sensitivity marker for cancer, which is characterized by being mercaptoethanol or dithiothreitol, though there is no particular limitation on the reducing agent.

또한, 본 발명은 상기 피검체 유래 당단백질이 햅토글로빈임을 특징으로 하는 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for analyzing a sensitive sensitivity cancer marker, wherein the glycoprotein derived from the subject is a hepatoglobin.

또한, 본 발명은 상기 (마) 단계의 암 진단마커가 전체 피검체 시료 중 80% 이상의 시료에서 관찰되며, 정상인 대조군에 비하여 암 환자군에서 발현량이 10% 이상의 차이를 나타내는 경우 암 정량마커로 선정함을 특징으로 하는 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다.In the present invention, when the cancer diagnosis marker in step (e) is observed in more than 80% of samples of all the test samples, and when the expression level is more than 10% in the cancer patient group compared to the normal control group, the cancer detection marker is selected The present invention relates to a method for analyzing a sensitive sensitivity cancer marker.

또한, 본 발명은 상기 (마) 단계 이후 (바) 상기 (마) 단계에서 선정된 암 정량마커의 발현량이 정상인 대조군과 암 환자군 간에 10% 이상 차이를 나타내는 경우 암일 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다.The present invention further provides a method for diagnosing cancer in a cancer patient, comprising the steps of: (a) determining whether the amount of cancer metastatic marker expressed in step (e) is greater than 10% between a control group and a cancer patient group; To a method for analyzing a sensitive sensitivity cancer marker.

또한, 본 발명은 상기 (마) 단계의 암 진단마커가 정상인 대조군 또는 암 환자군 중 하나 이상의 군의 피검체 시료 중 80% 이상의 시료에서 관찰되며, 정상인 대조군에 비하여 암 환자군에서 빈도가 25% 이상 차이를 나타내도록 발현되는 경우 암 빈도마커로 선정함을 특징으로 하는 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다.In addition, the present invention is observed in a sample of more than 80% of samples of a test group of at least one of the control group or the cancer patient group in which the cancer diagnosis marker in step (e) is normal, and the frequency is more than 25% Cancer marker marker is selected as the cancer marker.

또한, 본 발명은 상기 (마) 단계 이후 (바) 상기 (마) 단계에서 선정된 암 빈도마커의 발현 빈도가 정상인 대조군과 암 환자군 간에 25% 이상 차이를 나타내는 경우 암일 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다.In addition, the present invention is characterized in that it is determined that the possibility of cancer is high when the frequency of occurrence of the cancer marker selected in the step (e) is more than 25% between the normal control group and the cancer patient group ; And a method for analyzing a sensitive sensitivity cancer marker.

또한, 본 발명은 In addition,

(가) 정상인 대조군 및 암 환자군 피검체 유래 햅토글로빈에 이황화결합 환원제를 처리하여 햅토글로빈 다량체를 단량체로 만들고, 알파 사슬과 베타 사슬로 분리하는 단계;(A) treating normal human control and cancer patient-derived human hepatoglobin with a disulfide bonded reducing agent to make a human hepatoglobin multimer as a monomer, and separating into alpha chain and beta chain;

(나) 상기 알파 사슬과 베타 사슬을 정제하는 단계;(B) purifying the alpha chain and the beta chain;

(다) 상기 정제된 베타 사슬을 질량분석하여 전분자량을 얻는 단계; 및(C) subjecting the purified beta chain to mass spectrometry to obtain a total molecular weight; And

(라) 정상인 대조군과 암 환자군 간에 상기 결정된 전분자량의 발현 빈도와 발현량 중 한 가지 이상을 비교하여 유의한 차이가 있는 경우 암 진단마커로 선정하는 단계;를 포함하는 당단백질의 전분자량 측정을 통한 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다.(D) comparing the expression frequency and the expression level of the determined total molecular weight between the normal control group and the cancer patient group, and selecting the marker as a cancer diagnostic marker if there is a significant difference; and The present invention relates to a cancer diagnostic marker analysis method.

또한, 본 발명은 In addition,

(가) 정상인 대조군 및 암 환자군 피검체 유래 햅토글로빈에 이황화결합 환원제를 처리하여 햅토글로빈 다량체를 단량체로 만들고, 알파 사슬과 베타 사슬로 분리하는 단계;(A) treating normal human control and cancer patient-derived human hepatoglobin with a disulfide bonded reducing agent to make a human hepatoglobin multimer as a monomer, and separating into alpha chain and beta chain;

(나) 상기 알파 사슬과 베타 사슬을 정제하는 단계;(B) purifying the alpha chain and the beta chain;

(다) 상기 정제된 베타 사슬의 전분자량을 질량분석하는 단계;(C) mass spectrometry of the total molecular weight of the purified beta chain;

(라) 상기 베타 사슬의 질량분석 데이터로부터 당사슬 조성을 결정하는 단계; 및(D) determining the oligosaccharide composition from the mass analysis data of the beta chain; And

(마) 정상인 대조군과 암 환자군 간에 상기 결정된 당사슬 조성의 발현 빈도와 발현량 중 한 가지 이상을 비교하여 유의한 차이가 있는 경우 암 진단마커로 선정하는 단계;를 포함하는 당단백질의 전분자량 측정 및 당사슬 모니터링을 이용한 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다.(E) comparing the expression frequency and the expression level of the determined oligosaccharide composition between the normal control group and the cancer patient group, and selecting the marker as a cancer diagnostic marker if there is a significant difference; and The present invention relates to a method for analyzing cancer susceptibility cancer markers using oligosaccharide monitoring.

또한, 본 발명은 상기 (가)의 암이 위암이고, 상기 (마) 단계의 암 진단마커는 In the present invention, the cancer of (a) is stomach cancer, and the cancer diagnostic marker of step (e)

이론적 분자량 36309.3 Da, 당사슬 조성 Hex21-HexNAc17-Fuc1-NeuAc7,Theoretical molecular weight 36309.3 Da, oligosaccharide composition Hex21-HexNAc17-Fuc1-NeuAc7,

이론적 분자량 36454.4 Da, 당사슬 조성 Hex21-HexNAc17-NeuAc8, Theoretical molecular weight 36454.4 Da, oligosaccharide composition Hex21-HexNAc17-NeuAc8,

이론적 분자량 36600.6 Da, 당사슬 조성 Hex21-HexNAc17-Fuc1-NeuAc8,Theoretical molecular weight 36600.6 Da, oligosaccharide composition Hex21-HexNAc17-Fuc1-NeuAc8,

이론적 분자량 36819.8 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-NeuAc8,Theoretical molecular weight 36819.8 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-NeuAc8,

이론적 분자량 36891.8 Da, 당사슬 조성 Hex21-HexNAc17-Fuc1-NeuAc9,Theoretical molecular weight 36891.8 Da, oligosaccharide composition Hex21-HexNAc17-Fuc1-NeuAc9,

이론적 분자량 36893.9 Da, 당사슬 조성 Hex23-HexNAc19-NeuAc7,Theoretical molecular weight 36893.9 Da, oligosaccharide composition Hex23-HexNAc19-NeuAc7,

이론적 분자량 36965.9 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-Fuc1-NeuAc8,Theoretical molecular weight 36965.9 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-Fuc1-NeuAc8,

이론적 분자량 37111.0 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-NeuAc9,Theoretical molecular weight 37111.0 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-NeuAc9,

이론적 분자량 37184.9 Da, 당사슬 조성 Hex23-HexNAc19-NeuAc8,Theoretical molecular weight 37184.9 Da, oligosaccharide composition Hex23-HexNAc19-NeuAc8,

이론적 분자량 37257.2 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-Fuc1-NeuAc9,Theoretical molecular weight 37257.2 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-Fuc1-NeuAc9,

이론적 분자량 37259.2 Da, 당사슬 조성 Hex24-HexNAc20-NeuAc7,Theoretical molecular weight 37259.2 Da, oligosaccharide composition Hex24-HexNAc20-NeuAc7,

이론적 분자량 37402.3 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-NeuAc10,Theoretical molecular weight 37402.3 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-NeuAc10,

이론적 분자량 37476.4 Da, 당사슬 조성 Hex23-HexNAc19-NeuAc9,Theoretical molecular weight 37476.4 Da, oligosaccharide composition Hex23-HexNAc19-NeuAc9,

이론적 분자량 37548.4 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-Fuc1-NeuAc10,Theoretical molecular weight 37548.4 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-Fuc1-NeuAc10,

*이론적 분자량 37550.4 Da, 당사슬 조성 Hex24-HexNAc20-NeuAc8,* Theoretical molecular weight 37550.4 Da, oligosaccharide composition Hex24-HexNAc20-NeuAc8,

이론적 분자량 37694.6 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-Fuc2-NeuAc10,Theoretical molecular weight 37694.6 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-Fuc2-NeuAc10,

이론적 분자량 37768.7 Da, 당사슬 조성 Hex23-HexNAc19-Fuc2-NeuAc9,Theoretical molecular weight 37768.7 Da, oligosaccharide composition Hex23-HexNAc19-Fuc2-NeuAc9,

이론적 분자량 37770.7 Da, 당사슬 조성 Hex25-HexNAc21-Fuc1-NeuAc7,Theoretical molecular weight 37770.7 Da, oligosaccharide composition Hex25-HexNAc21-Fuc1-NeuAc7,

이론적 분자량 38424.2 Da, 당사슬 조성 Hex24-HexNAc20-NeuAc11 및Theoretical molecular weight 38424.2 Da, oligosaccharide composition Hex24-HexNAc20-NeuAc11 and

이론적 분자량 38425.3 Da, 당사슬 조성 Hex24-HexNAc20-Fuc2-NeuAc10 중 선택된 한 가지 이상의 정량마커임을 특징으로 하는 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다.Theoretical molecular weight of 38425.3 Da, and the oligosaccharide composition Hex24-HexNAc20-Fuc2-NeuAc10.

*또한, 본 발명은 상기 (가)의 암이 위암이고, 상기 (마) 단계의 암 진단마커는In addition, the present invention provides a cancer diagnosis marker of (a) above, wherein the cancer of (a)

이론적 분자량 35138.4 Da,Theoretical molecular weight 35138.4 Da,

이론적 분자량 35142.4 Da,Theoretical molecular weight 35142.4 Da,

이론적 분자량 36250.4 Da,Theoretical molecular weight 36250.4 Da,

이론적 분자량 36308.5 Da,Theoretical molecular weight 36308.5 Da,

이론적 분자량 36541.3 Da,Theoretical molecular weight 36541.3 Da,

이론적 분자량 37913.3 Da,Theoretical molecular weight 37913.3 Da,

이론적 분자량 37922.4 Da,Theoretical molecular weight 37922.4 Da,

이론적 분자량 38351.1 Da 및Theoretical molecular weight 38351.1 Da and

이론적 분자량 38569.4 Da 중 선택된 한 가지 이상의 빈도마커이며 정상인 대조군 또는 위암 환자군 중 하나 이상의 군의 피검체 시료 중 80% 이상의 시료에서 관찰되며, 정상인 대조군에 비하여 위암 환자군에서 빈도가 25% 이상 높음을 특징으로 하는 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다.Theoretical molecular weight of 38569.4 Da and more than 80% of the samples of the test specimens of normal control group or gastric cancer patient group and the frequency of gastric cancer is more than 25% higher than that of normal control group The present invention relates to a method for analyzing a sensitive sensitivity cancer marker.

또한, 본 발명은 상기 (가)의 암이 위암이고, 상기 (마) 단계의 암 진단마커는In the present invention, the cancer of (a) is stomach cancer, and the cancer diagnostic marker of step (e)

이론적 분자량 37530.2 Da,Theoretical molecular weight 37530.2 Da,

이론적 분자량 37535.7 Da,Theoretical molecular weight 37535.7 Da,

이론적 분자량 37913.9 Da,Theoretical molecular weight 37913.9 Da,

이론적 분자량 37919.4 Da,Theoretical molecular weight 37919.4 Da,

이론적 분자량 37923.5 Da,Theoretical molecular weight 37923.5 Da,

이론적 분자량 37928.4 Da,Theoretical molecular weight 37928.4 Da,

이론적 분자량 37972.6 Da,Theoretical molecular weight 37972.6 Da,

이론적 분자량 37977.6 Da,Theoretical molecular weight 37977.6 Da,

이론적 분자량 39035.3 Da,Theoretical molecular weight 39035.3 Da,

이론적 분자량 39039.5 Da 및Theoretical molecular weight 39039.5 Da and

이론적 분자량 39520.9 Da 중 선택된 한 가지 이상의 빈도마커이며 정상인 대조군 또는 위암 환자군 중 하나 이상의 군의 피검체 시료 중 80% 이상의 시료에서 관찰되며, 정상인 대조군에 비하여 암 환자군에서 빈도가 25% 이상 낮게 나타남을 특징으로 하는 고민감도 암 진단마커 분석방법에 관한 것이다.Theoretical molecular weight of 39520.9 Da and more than 80% of the specimens of at least one of the normal control group or the gastric cancer patient group and the frequency of the cancer group is lower than that of the normal control group by at least 25% Sensitive marker cancer diagnostic marker.

당단백질의 당쇄화 패턴을 확인하기 위해서 현재는 당사슬을 분석하는 방법과 당펩타이드를 분석하는 방법이 사용되고 있다. 첫 번째, 당사슬의 조성 및 정량은 당단백질에 효소처리를 진행하여 N-당사슬을 분리한 후 정제 및 농축하여 분석함으로써 확인한다. 일반적으로 N-당사슬 시료처리는 효소 반응시간 및 당사슬 정제, 추출과정을 고려하여 하루 이상의 시간이 필요하다. 당자리 특이적 당사슬 특성 분석은 당펩타이드 시료 분석을 통해 진행한다. 당사슬의 위치뿐만 아니라 당사슬 다양성까지 다각적으로 확인할 수 있는 분석법이지만, 당펩타이드 생성 및 정제 등 시료 전처리과정에 하루 이상의 시간이 필요하다. 특히 당펩타이드의 데이터 해석을 위해 상당한 시간 및 기술력이 필요하다. Currently, methods for analyzing oligosaccharides and methods for analyzing glycopeptides are used to confirm the glycosylation pattern of glycoproteins. First, the composition and quantification of the oligosaccharide can be confirmed by enzymatic treatment of the glycoprotein to isolate the N-glycoside, followed by purification and concentration analysis. Generally, the treatment of N-glycoside requires more than one day in consideration of the enzyme reaction time, the purification process of the sugar chain, and the extraction process. Specific site-specific characterization of glycosylation proceeds through the analysis of glycopeptide samples. It is a method that can confirm the diversity of oligosaccharide as well as the position of oligosaccharide in various ways. However, it requires more than one day for sample pretreatment process such as glycopeptide production and purification. Especially, it requires a considerable amount of time and technology for data analysis of glycopeptide.

이와 대비하여 본 발명 방법은 단일한 분석과정으로 한 시간 내에 당사슬 특성을 다각적으로 확인할 수 있는 분석법이다. 기존 분석법과 달리, 단백질로부터 각 당사슬을 분리하는 시료 전처리과정 없이 당단백질의 전분자량을 측정할 수 있고, 질량분석기를 이용한 당단백질 측정시간 및 데이터 해석시간을 모두 고려할 경우, 통상 한 시간 안에 당쇄화 패턴 정보를 얻을 수 있다. 본 발명의 분석방법을 이용하면 분석시간이 상당히 단축될 뿐만 아니라, 시료손상 및 손실 없이 당사슬 특성분석이 가능하다 (표 7).In contrast, the method of the present invention is a method capable of variously confirming the characteristics of the oligosaccharide within one hour by a single analysis process. Unlike conventional methods, it is possible to measure the total molecular weight of a glycoprotein without sample pretreatment, which separates each oligosaccharide from a protein. Considering both the time of glycoprotein measurement and data analysis time using a mass spectrometer, Pattern information can be obtained. Using the assay method of the present invention, not only the analysis time is significantly shortened, but also the characteristics of the oligosaccharide can be analyzed without damage or loss of the sample (Table 7).

본 발명의 방법은 당단백질로부터 당사슬을 분리하지 않고 이황화 결합 환원이라는 최소한의 전처리만 수행한 후 10분 이내의 짧은 질량분석시간 소요 및 신속한 데이터 처리를 통해 단백질의 당쇄화 패턴을 인식함으로써 암 등의 질병진단시 빠르고 정확한 진단방법으로 활용할 수 있다.The method of the present invention recognizes the glycosylation pattern of the protein by performing a minimum pretreatment such as disulfide bond reduction without separating the oligosaccharide from the glycoprotein and taking a short time of mass analysis within 10 minutes and rapid data processing, It can be used as a quick and accurate diagnostic method in diagnosis of disease.

도 1은 손상되지 않은 혈액 내 당단백질 (intact glycoprotein)의 질량분석을 통하여 암을 비롯한 질병을 진단하는 방법을 도식화한 개요도이다.
도 2는 본 발명의 방법의 재현성 확인을 위해 표준물질 (Haptoglobin pooled human plasma, Sigma)을 다른 날 총 7회 (1일차 3회, 2일차 4회) 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 방법을 이용하여 비위암 정상인 44인의 햅토글로빈에서 베타 사슬의 당쇄화 패턴을 모니터링한 결과이다.
도 4는 본 발명의 방법을 이용하여 암환자 44인의 햅토글로빈 베타 사슬의 당쇄화 패턴을 모니터링한 결과이다.
도 5는 본 발명의 방법을 이용하여 비위암 대조군과 위암의 베타 사슬 당쇄화를 모니터링한 대표적인 결과이다. 위암과 비위암 대조군 시료의 베타 사슬을 분석한 스펙트럼을 미러 이미지로 나타내었다. 또한, 각 마커를 A~T로 표시하였다.
도 6은 본 발명의 방법으로 분석하여 탐지한 정상인 대조군과 위암 환자군 간에 빈도에서 차이를 보이는 위암 빈도 마커에 대한 민감도 및 특이도 그래프와 빈도마커 A, 빈도마커 B의 빈도를 나타낸 그래프, 그리고 빈도마커 A와 빈도마커 B의 AUC 값을 나타낸 표이다.FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a method for diagnosing cancer and other diseases through mass analysis of intact glycoprotein in uninjured blood. FIG.
FIG. 2 shows the result of analysis of a reference material (Haptoglobin pooled human plasma, Sigma) 7 times (1 day, 3 times, 2 days, 4 times) for the reproducibility confirmation of the method of the present invention.
FIG. 3 shows the result of monitoring the sugar chain pattern of the beta chain in 44 patients with normal gastric cancer using the method of the present invention.
FIG. 4 shows the result of monitoring the glycosylation pattern of the human togoglobin beta chain of 44 cancer patients using the method of the present invention.
Figure 5 is a representative result of monitoring beta-chain glycosylation of non-gastric cancer control and gastric cancer using the method of the present invention. The spectrum of beta-chain analysis of stomach cancer and non-gastric cancer control samples is shown as a mirror image. In addition, markers A to T are shown.
FIG. 6 is a graph showing the sensitivity and specificity graphs of gastric cancer frequency markers showing a frequency difference between the normal control group and the gastric cancer patient group analyzed by the method of the present invention, a graph showing the frequency of frequency marker A and frequency marker B, A and the frequency marker B, respectively.

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 암으로서 위암의 예를 들었고, 당단백질로서 햅토글로빈을 들었으나, 본 발명의 범위는 여타 다른 암에도 적용 가능하고, 당단백질로서도 햅토글로빈이 아닌 다른 당단백질을 선정할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in more detail with reference to specific embodiments. However, it is apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to the description of the embodiments. Particularly, in a specific example of the present invention, gastric cancer was exemplified as cancer, and haptoglobin was used as a glycoprotein. However, the scope of the present invention is applicable to other cancers, It is apparent to those skilled in the art that the protein can be selected.

<인간 혈청으로부터 <From human serum 햅토글로빈Happ Togl Robin 정제> Refining>

항-햅토글로빈 항체를 이용하여 항-햅토글로빈 친화 컬럼을 제조하고 햅토글로빈 정제를 수행하였다. 44명의 위암환자 및 44명의 정상인으로부터 각각 500 ㎕의 혈청을 얻어 4 ㎖의 PBS (phosphate-buffered saline, 10 mM 인산 완충액/2.7 mM KCl/ 137 mM NaCl, pH 7.4)에 희석하여 항-햅토글로빈 친화 컬럼에 적용하고 회전 교반기 상에서 상온으로 두 시간 동안 배양하였다. 결합되지 않은 물질들은 30 ㎖의 PBS로 컬럼을 세척하여 제거하였고, 햅토글로빈은 용출 완충액 (0.1 M 글라이신/ 0.5 M NaCl, pH 2.8)으로 용출한 후 중화 완충액 (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0)을 함유한 튜브에 분획하였다. 용출액은 농축한 후 원심분리 필터 (분자량 한계 10,000, Amicon Ultra, Millipore)로 계면활성제를 제거한 다음 Quant-iT Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 햅토글로빈을 분석하였고, 12.5% SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색을 수행하였다 (도 2A). 시료는 동결건조하여 분석시까지 -80℃에 보관하였다.Anti-haptoglobin-affinity columns were prepared using anti-haptoglobin antibodies and haptoglobin purification was performed. 500 μl of serum was obtained from 44 gastric cancer patients and 44 normal individuals respectively and diluted in 4 ml of PBS (phosphate-buffered saline, 10 mM phosphate buffer / 2.7 mM KCl / 137 mM NaCl, pH 7.4) Affinity column and incubated for 2 hours at room temperature on a rotary agitator. Unbound material was removed by washing the column with 30 ml of PBS, and the haptoglobin was eluted with elution buffer (0.1 M glycine / 0.5 M NaCl, pH 2.8) followed by neutralization buffer (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0 ). &Lt; / RTI &gt; The eluate was concentrated and then the surfactant was removed by centrifugal filter (molecular weight limit 10,000, Amicon Ultra, Millipore). Then, the haptoglobin was analyzed with Quant-iT Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) Coomassie blue staining was performed (Figure 2A). The samples were lyophilized and stored at -80 ° C until analysis.

<< 햅토글로빈의Of Happ Toglobin 알파 사슬과 베타 사슬 분리> Alpha Chain and Beta Chain Separation>

햅토글로빈의 변성과 이황화 결합의 효율적인 분리를 위해 20 ㎍의 햅토글로빈 시료를 50 mM NH4HCO3 100 ㎕에 녹인 후 550 mM DTT (in 50 mM NH4HCO3)를 2 ㎕ 첨가하여 80℃에서 10분 동안 열처리하였다. DTT 반응이 충분히 이루어짐으로써 알파 사슬과 베타 사슬 분리가 효율적으로 이루어지도록 하였다. 반응 완료 후 반응물을 완전히 건조한 다음 완충액 (이동상 A 용액: 3% 아세토나이트릴+0.1% 포름산 수용액)에 재용해하여 분석에 적절한 농도로 희석하였다. 본 실시예에서는 0.05 ㎍/㎕를 사용하였으나 이 농도는 사용하는 장비에 따라 달라질 수 있다.The haptic toggle robin sample of 20 ㎍ for denaturation and efficient separation of the disulfide bond of the haptic toggle Robin 50 mM NH 4 HCO 3 was dissolved in 100 ㎕ 550 mM DTT (in 50 mM NH 4 HCO 3) were added 2 ㎕ to 80 Lt; 0 &gt; C for 10 minutes. DTT reaction was sufficiently carried out so that alpha chain and beta chain separation were efficiently performed. After completion of the reaction, the reaction product was completely dried and then redissolved in a buffer solution (mobile phase A solution: 3% acetonitrile + 0.1% aqueous formic acid solution) and diluted to an appropriate concentration for analysis. In this example, 0.05 μg / μl was used, but this concentration may vary depending on the equipment used.

<질량분석><Mass analysis>

위와 같이 얻어진 당단백질은 UHPLC/Q-TOF MS로 분석을 진행하였다. 좀 더 자세히는 희석된 당단백질이 오토샘플러 (4 ℃로 유지됨), 세관 펌프, 나노펌프, HPLC-Chip/MS 인터페이스 및 6550 Q-TOF MS 탐지기를 갖춘 HPLC Chip/Q-TOF (Chip Quadrupole Time-of-Flight) MS system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 이용하여 분석하였다. 9×0.75㎜ 농축 컬럼 및 43×0.075 ㎜ 분석 컬럼의 정지상 (stationary phase)으로 통합된 나노-ESI 스프레이 팁과 함께 C8 탄소사슬이 패킹된 칩을 사용하였다. 크로마토그래피 방법에 의한 분리는 최적화된 분리 조건에 따라 수행되었다. 간단히 설명하면, 시료를 로딩한 후, 온전한 당단백질 용출 농도구배 용액을 분당 0.3 ㎕씩 흘려주었다. 농도구배 용액은 (A) 99.9% 물 및 0.1% 포름산(v/v) 수액, 및 (B) 99.9% 아세토나이트릴 및 0.1% 포름산(v/v) 수액이고, 각각 아래 시각에 아래 농도로 처리하였다: 3% B, 0~1min; 3~25% B, 1~4min; 25~60% B, 4~8min; 60~80% B, 8~12min; 80~95% B, 12~15min; 95~5% B. 15~20min; 5~3%. 최종적으로 분석 컬럼은 3% B로 5분간 재평형화하였다.The glycoprotein thus obtained was analyzed by UHPLC / Q-TOF MS. More specifically, the diluted glycoprotein was analyzed using HPLC Chip / Q-TOF (Chip Quadrupole Time-Q-TOF) with an autosampler (maintained at 4 ° C), a customs pump, a nanopump, an HPLC-Chip / MS interface and a 6550 Q- of-Flight MS system (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif.). A chip packed with a C8 carbon chain was used with a nano-ESI spray tip integrated into a stationary phase of a 9 x 0.75 mm concentration column and 43 x 0.075 mm analysis column. Separation by the chromatographic method was carried out according to optimized separation conditions. Briefly, after the sample was loaded, a full glycoprotein elution gradient solution was flowed 0.3 μl / min. The concentration gradient solution was (A) 99.9% water and 0.1% formic acid (v / v) sap, and (B) 99.9% acetonitrile and 0.1% formic acid (v / v) 3% B, 0-1 min; 3 to 25% B, 1 to 4 min; 25 to 60% B, 4 to 8 min; 60 to 80% B, 8 to 12 min; 80 to 95% B, 12 to 15 min; 95 to 5% B. 15 to 20 min; 5 to 3%. Finally, the analytical column was re-equilibrated at 3% B for 5 minutes.

질량분석 후, LC/MS의 원래 데이터는 Mass Hunter Qualitative Analysis software (version B.06.00 SP2, Agilent Technologies) & Bioconfirm software (version B.06.00, Agilent Technologies)에 포함된 디콘볼루션 (Deconvolution) 알고리즘 (Maximum Entropy)을 이용하여 처리하였다.After mass analysis, the original data of the LC / MS was analyzed using the deconvolution algorithm (Maximum) of Mass Hunter Qualitative Analysis software (version B.06.00 SP2, Agilent Technologies) & Bioconfirm software (version B.06.00, Entropy).

<결과><Result>

도 1은 햅토글로빈의 베타 사슬 분석을 통한 당쇄화 패턴 분석과정의 일례를 도식화한 것이다. 위암 환자와 정상인으로부터 채취한 혈액시료에서 햅토글로빈 항체를 이용한 면역친화크로마토그래피 방법으로 햅토글로빈을 선택적으로 분리하였다. 정제된 햅토글로빈에 환원제로서 DTT를 처리함으로써 다량체 (multimer) 구조를 분리하여 단량체 구조로 만들고 알파 사슬과 베타 사슬로 분리하였다.FIG. 1 is a diagram illustrating an example of a process of analyzing a sugar chain pattern through beta chain analysis of Happtoglivin. Haptoglobin was selectively isolated from blood samples collected from patients with gastric cancer and normal subjects by immunohistochemistry using a human antibody. The purified haptoglobin was treated with DTT as a reducing agent to separate the multimer structure into a monomer structure and separated into an alpha chain and a beta chain.

고감도 질량분석기를 이용하여 위와 같이 준비한 햅토글로빈의 알파 사슬과 베타 사슬의 전분자량을 측정하였다. 또한, 전분자량 측정 데이터를 통해 베타 사슬에 결합된 당사슬 패턴을 모니터링하였다. The alpha chain and the beta chain total molecular weight of the prepared haptoglobin were measured using a high sensitivity mass spectrometer. In addition, the oligosaccharide pattern bound to the beta chain was monitored through full molecular weight measurement data.

*위암 환자와 정상인 사이의 당사슬 차이를 확인함으로써 위암 진단마커 당사슬을 찾았다. 본 발명을 통하여 찾은 위암 진단 마커를 이용하여 위암의심 환자를 진단하였다. * We identified the glycoconjugate marker oligos by confirming the oligosaccharide difference between gastric cancer patient and normal person. The diagnosis of suspicious gastric cancer was made using the diagnostic marker of gastric cancer found through the present invention.

그러나, 이 방법은 위암에만 한정되는 것이 아니고, 간암, 폐암, 유방암, 난소암, 대장암 등 여타의 종양 진단 등에 이용할 수 있다. However, this method is not limited to gastric cancer, and can be used for diagnosis of liver cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, and other tumors.

도 2는 본 발명의 재현성 확인을 위해 표준물질을 다른 날 총 7회 (1일차 3회, 2일차 4회) 분석한 결과로서, 햅토글로빈 표준품을 구입하여 동일한 방법으로 시료 전처리 및 질량분석을 수행한 후 본 발명의 재현성 및 안전성을 검증한 결과이다. FIG. 2 is a result of analyzing the reference material seven times (three times daily, two times four times) on the other day for the reproducibility confirmation of the present invention, and the sample of the human fetal guinea pig was purchased and subjected to sample pretreatment and mass analysis And then the reproducibility and safety of the present invention are verified.

Group 1은 동일한 날짜에 세 번 분석하였으며 Group 2는 동일한 날짜에 네 번 분석하였고, 이들의 질량 값과 강도를 이용하여 상관관계를 분석한 결과, 상관계수 r = 0940~0.998로 높은 상관계수를 보여 각기 다른 날 분석을 하더라도 높은 재현성을 보임을 확인하였다. Group 1 was analyzed three times on the same day, Group 2 was analyzed four times on the same day, and their correlation coefficients were analyzed using their mass values and intensity. As a result, correlation coefficient r = 0940 ~ 0.998 It was confirmed that the reproducibility was high even with different days analysis.

표 1과 표 2는 본 발명에 사용된 위암 환자와 비위암 혈청시료에 대한 정보이다. 총 88인 (비위암 시료 44인, 위암 44인) 시료를 본 발명에 적용하여 암진단 마커를 발굴하였다. 위암 환자는 진행단계별로 분류하였고, 33세에서 74세까지 다양한 연령대의 시료를 대상으로 하였다. 비위암 시료 역시 31에서 77세까지 44인의 혈청을 대상으로 분석을 진행하였다. "Median Age"는 환자 연령 중간값을 나타내며, "Mean Age(SD)"는 평균연령(표준편차)을 나타낸다. Tables 1 and 2 are information on gastric cancer patients and non-gastric cancer serum samples used in the present invention. A total of 88 samples (44 stomach cancer samples, 44 stomach cancer samples) were applied to the present invention to identify cancer diagnostic markers. Gastric cancer patients were classified according to the stage of progression, and samples from various ages ranged from 33 to 74 years. Non - gastric cancer samples were also analyzed for 44 sera from 31 to 77 years old. "Median Age" refers to the median age of patients, and "Mean Age (SD)" refers to mean age (standard deviation).

도 3은 비위암 정상인 44인의 햅토글로빈에서 베타 사슬의 당쇄화 패턴을 모니터링한 결과이다. 비위암 정상인 44인의 시료에 본 발명 방법을 적용하여 분석한 결과를 오버레이 (overlay)하였다. 혈청시료로부터 햅토글로빈을 농축한 후 DTT를 처리하여 단량체 형태로 만들고 알파 사슬과 베타 사슬로 분리하였다. 고감도 질량분석을 하여 알파 사슬과 베타 사슬의 전분자량을 측정하였으며 특히 당쇄화가 이루어진 베타 사슬의 당쇄화 패턴을 모니터링하였다.FIG. 3 shows the result of monitoring the sugar chain pattern of beta-chain in 44 patients with normal gastric cancer. The results of the analysis of the method of the present invention were overlaid on the samples of 44 normal persons who had gastric cancer. Haptoglobin was concentrated from the serum samples and treated with DTT to form monomers, which were then separated into alpha and beta chains. High sensitivity mass spectrometry was performed to measure the total molecular weight of the alpha and beta chains. In particular, the sugar chain pattern of the sugar chains was monitored.

햅토글로빈 베타 사슬에는 네 개의 N-당쇄화 자리가 있으므로 분석 스펙트럼에서 보이는 질량값은 베타 사슬의 N-당자리 네 개에 모두 당쇄화된 질량값이다. There are four N-sugar chain sites in the human togoglobin beta chain, so the mass value seen in the analytical spectrum is the mass value glycosylated at all four N-sugar sites of the beta chain.

햅토글로빈 베타 사슬 아미노산의 이론적 분자량은 27265.0679 Da이며 질량분석 스펙트럼에서 기본 피크의 질량값은 35797.84 Da이다. 두 질량값 차이 (8532.78 Da)는 네 개의 N-당자리에 결합된 당사슬의 차이이며, 당사슬 조성을 확인한 결과 Hex20HexNAc16NeuAc7임을 확인하였다. The theoretical molecular weight of the haptoglobin beta chain amino acid is 27265.0679 Da, and the mass value of the basic peak in the mass spectrometry spectrum is 35797.84 Da. The difference in the two mass values (8532.78 Da) is the difference in the oligosaccharides bound to the four N-glycosides, and the oligosaccharide composition was confirmed to be Hex20HexNAc16NeuAc7.

위와 같이 기본 피크의 당사슬 조성을 확인한 후 주변 피크와의 질량값 차이를 이용하여 당사슬 연계성을 확인하였다. 즉 피크들 간의 질량값 차이와 단당류의 분자량 162.14 (Hexose), 203.19 (HexNAc), 146.14 (fucose), 및 291.25 (NeuAc) 등을 고려하여 존재하는 당사슬을 추가로 확인하였다. After confirming the oligosaccharide composition of the basic peak as described above, the oligosaccharide linkage was confirmed using the mass value difference with the peripheral peak. That is, the oligosaccharides existing in consideration of the mass value difference between peaks and molecular weights of monosaccharides of 162.14 (Hexose), 203.19 (HexNAc), 146.14 (fucose), and 291.25 (NeuAc) were further confirmed.

도 4는 암환자 44인의 햅토글로빈 베타 사슬의 당쇄화 패턴 모니터링 결과이다. 위암환자 44인 시료에 대해 본 발명법을 적용하여 분석한 결과를 오버레이하였다. 4 shows the result of monitoring the glycosylation pattern of the hepatoglobin beta chain of 44 cancer patients. The results of analysis of 44 samples of patients with gastric cancer by applying the present invention method were overlaid.

질량분석 스펙트럼에서 기본 피크의 질량값은 35797.84 Da이며 햅토글로빈 베타 사슬 아미노산의 이론적 분자량은 27265.0679 Da이다. 두 질량값 차이(8532.78 Da)는 네 개의 N-당자리에 결합된 당사슬의 차이이며, 당사슬 조성을 확인한 결과 Hex20HexNAc16NeuAc7임을 확인하였다. The mass value of the basic peak in the mass spectrometry spectrum is 35797.84 Da and the theoretical molecular weight of the haptoglucose beta chain amino acid is 27265.0679 Da. The difference in the two mass values (8532.78 Da) is the difference in the oligosaccharides bound to the four N-glycosides, and the oligosaccharide composition was confirmed to be Hex20HexNAc16NeuAc7.

기본 피크의 당사슬 조성을 확인한 후, 주변 피크와의 질량값 차이를 이용하여 당사슬 연계성을 확인하였다. 즉 피크들 간의 질량값 차이와 단당류의 분자량 162.14 (Hexose), 203.19 (HexNAc), 146.14 (fucose), 및 291.25 (NeuAc) 등을 고려하여 존재하는 당사슬을 추가로 확인하였다. After confirming the oligosaccharide composition of the basic peak, the oligosaccharide linkage was confirmed by using the mass value difference with the peripheral peak. That is, the oligosaccharides existing in consideration of the mass value difference between peaks and molecular weights of monosaccharides of 162.14 (Hexose), 203.19 (HexNAc), 146.14 (fucose), and 291.25 (NeuAc) were further confirmed.

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도 5는 비위암 대조군과 위암의 베타 사슬 당쇄화를 모니터링한 대표적인 결과이다. 위암과 비위암 대조군 시료의 베타 사슬을 분석한 스펙트럼을 미러 이미지로 나타내었다. 각 스펙트럼에는 본 발명의 방법으로 탐색된 위암환자의 정량 바이오마커, 좀 더 자세히는 A에서 T까지 총 20개의 정량 바이오마커를 표시하였으며 자세한 정보는 표 5에 표시하였다. Figure 5 is a representative result of monitoring beta-chain glycosylation of gastric cancer and non-gastric cancer control. The spectrum of beta-chain analysis of stomach cancer and non-gastric cancer control samples is shown as a mirror image. In each spectrum, a total of 20 quantitative biomarkers from stomach cancer patients discovered by the method of the present invention, more precisely from A to T, are shown, and detailed information is shown in Table 5.

표 3과 표 4는 햅토글로빈 베타 사슬의 당쇄화 모니터링 결과이다 (주: 표 3과 표 4는 원래 하나의 표이지만, 편의상 두 개의 표로 기재하였다). 단백질의 아미노산 서열과 당사슬의 조합을 이용하여 스팩트럼에서 보여지는 질량값의 당사슬 조성을 계산하였다. Table 3 and Table 4 show the results of the monitoring of the glycation of the hepatoglobin beta chain. (Note: Tables 3 and 4 are originally one table, but are shown in two tables for convenience). The oligosaccharide composition of the mass value shown in the spectrum was calculated using a combination of the amino acid sequence of the protein and the oligosaccharide.

이 표에 기재된 것은 햅토글로빈 베타 사슬의 N-당사슬 조성을 나타내며, 네 개의 숫자는 각각 순서대로 헥소스 (Hexose; Hex), N-아세틸헥소사민 (N-acetylhexosamine; HexNAc), 퓨코스(Fucose; Fuc), N-아세틸뉴라민산 (N-acetylneuraminic acid; NeuAc)을 나타낸다. 예를 들어 "20_16_0_6"으로 표시된 것은 헥소스 잔기 20 개, N-아세틸헥소사민 16 개, 퓨코스 0개, N-아세틸뉴라민산 6개로 이루어진 N-당사슬 조성을 의미한다.The table shows the N-glycosylation of the hepatoglobin beta chain, and the four numbers are in order: Hexose (Hex), N-acetylhexosamine (HexNAc), Fucose ; Fuc), and N-acetylneuraminic acid (NeuAc). For example, "20_16_0_6" means an N-glycoside composition consisting of 20 hexose residues, 16 N-acetylhexasamine, 0 fucose, and 6 N-acetylneuraminic acid.

표 5는 본 발명 시스템으로 확인된 인간 위암환자의 정량 바이오마커 목록으로서, 액체 크로마토그래피 질량분석으로 얻은 상대적 정량을 통한 정량마커 (abundance marker) 목록이다. 모든 위암 환자 및 대조군 시료 중 빈도가 80% 이상인 당사슬 조성에서 위암 환자와 정상인 대조군 간의 상대적 함량이 10% 이상 차이가 나는 당사슬을 정량 마커로 선정하였다. 질병을 탐지할 때 바이오마커의 시험 수행을 평가하기 위한 전략적 도구는 ROC (receiver operating characteristic) 커브이다. 일반적으로 AUC (area under thecurve) 값이 0.50-0.75인 ROC 커브는 타당한 구별 (fair discrimination)을 가진 것으로 판단한다. 당사슬 정량마커에 대하여 각각 ROC 커브에서 AUC를 계산하였으며 각 당사슬 정량마커 중 Hex22_HexNAc18 _Fuc2 _NeuAc10에 대응하는 m/z 37694.6은 가장 높은 AUC 값인 0.93을 나타내었다.Table 5 is a list of quantitative biomarkers for human gastric cancer patients identified with the system of the present invention and is a list of abundance markers by relative quantification obtained by liquid chromatography mass spectrometry. The oligosaccharides with a relative content of more than 10% between the stomach cancer patient and the normal control group were selected as the quantitative markers in all the gastric cancer patients and the control group with the frequency of 80% or more. A strategic tool for evaluating the performance of biomarkers when detecting disease is the receiver operating characteristic (ROC) curve. In general, ROC curves with area under the cur- rent (AUC) values of 0.50-0.75 are judged to have fair discrimination. The AUC was calculated for each ROC curve for the quantitative oligosaccharide marker m / z 37694.6 corresponding to Hex 22 _HexNAc 18 _ 2 _ Fuc NeuAc 10 of each oligosaccharide quantitative marker exhibited the highest AUC value of 0.93.

표 6은 본 발명 시스템으로 확인된 인간 위암환자의 빈도 바이오마커 목록으로서, 액체 크로마토그래피 질량분석으로 얻은 인간 위암 빈도마커 (frequency marker) 목록이다. 환자와 정상인 대조군 둘 중 하나의 군에서 80% 이상의 빈도를 나타내며, 환자와 정상인 대조군 간의 빈도가 25% 이상 차이가 나는 당사슬을 이용하여 다중 패널 (multi panel) 형태의 빈도마커를 선정하였다. 빈도마커에 대하여는 각 빈도마커들을 조합하여 다중패널 마커를 확보할 수 있었고, 하나의 ROC 커브는 같은 컷오프 값에 의해 만들어졌다. ROC 커브는 각 빈도마커에 가중치를 부여함으로써 최적화된다. 패널 A는 위암 환자군에서 높은 빈도를 보이며 패널 B는 비위암 정상인 대조군 시료에서 높은 빈도를 보이는 마커이다. 빈도마커 중 질량값 36308.5, 37913.3, 37919.4 는 당사슬 조성이 확인되는 마커이며 다른 마커 패널은 당조성에 다른 PTM (Post-translational modification)이 결합된 질량값을 보인다. Table 6 is a list of frequency biomarkers of human gastric cancer patients identified with the system of the present invention, which is a list of human gastric cancer frequency markers obtained by liquid chromatography mass spectrometry. Multiple panel frequency markers were selected using oligosaccharides with a frequency of more than 80% in both the patient and the normal control group and the difference between the patient and the normal control group by more than 25%. For frequency markers, multiple frequency markers could be combined to obtain multiple panel markers, and one ROC curve was created with the same cutoff value. The ROC curve is optimized by weighting each frequency marker. Panel A shows high frequency in stomach cancer patients and Panel B shows high frequency in control stomach cancer patients. Among the frequency markers, the mass values of 36308.5, 37913.3 and 37919.4 are markers for which sugar chain composition is confirmed, and the other marker panels show mass values combined with other PTM (post-translational modification).

*도 6은 정상인과 암환자간 빈도에서 차이를 보이는 위암 빈도 마커이다. 마커 A는 대조군보다 위암에서 높은 빈도를 보이며 마커 B는 비위암 정상인 시료에서 높은 빈도를 보이는 마커이다. * Fig. 6 is a gastric cancer frequency marker showing a difference in frequency between a normal person and a cancer patient. Marker A shows higher frequency in stomach cancer than control group and marker B shows higher frequency in non - gastric cancer - free samples.

Stage ⅢStage III Stage ⅣStage IV TotalTotal Patient
Number of SubjectPatient
Number of Subject 33 4141 4444 Median AgeMedian Age 7070 5454 55.5 (31-77)55.5 (31-77) Mean Age (SD)Mean Age (SD) 6969 5454 56 (12.5)56 (12.5) Control (Normal)Control (Normal) -- -- 4444

Figure 112017005975266-pat00001
Figure 112017005975266-pat00001

Theor. MassTheor. Mass HexHex HexNAcHexNAc FucFuc NeuAcNeuAc 35506.635506.6 2020 1616 00 66 35797.835797.8 2020 1616 00 77 35944.035944.0 2020 1616 1One 77 36089.136089.1 2020 1616 00 88 36163.236163.2 2121 1717 00 77 36235.236235.2 2020 1616 1One 88 36309.336309.3 2121 1717 1One 77 36454.436454.4 2121 1717 00 88 36528.536528.5 2222 1818 00 77 36600.636600.6 2121 1717 1One 88 36674.736674.7 2222 1818 1One 77 36745.736745.7 2121 1717 00 99 36819.836819.8 2222 1818 00 88 36891.836891.8 2121 1717 1One 99 36893.936893.9 2323 1919 00 77 36965.936965.9 2222 1818 1One 88 37111.037111.0 2222 1818 00 99 37257.237257.2 2222 1818 1One 99 37259.237259.2 2424 2020 00 77 37402.337402.3 2222 1818 00 1010 37476.437476.4 2323 1919 00 99 37548.437548.4 2222 1818 1One 1010 37550.437550.4 2424 2020 00 88 37622.537622.5 2323 1919 1One 99 37624.537624.5 2525 2121 00 77 37694.637694.6 2222 1818 22 1010 37696.637696.6 2424 2020 1One 88 37767.637767.6 2323 1919 00 1010

Theor. MassTheor. Mass HexHex HexNAcHexNAc FucFuc NeuAcNeuAc 37768.737768.7 2323 1919 22 99 37770.737770.7 2525 2121 1One 77 37840.737840.7 2222 1818 33 1010 37842.737842.7 2424 2020 22 88 37913.837913.8 2323 1919 1One 1010 37914.837914.8 2323 1919 33 99 37915.837915.8 2525 2121 00 88 37916.837916.8 2525 2121 22 77 38058.938058.9 2323 1919 00 1111 38059.938059.9 2323 1919 22 1010 38060.938060.9 2323 1919 44 99 38061.938061.9 2525 2121 1One 88 38133.038133.0 2424 2020 00 1010 38134.038134.0 2424 2020 22 99 38136.038136.0 2626 2222 1One 77 38205.038205.0 2323 1919 1One 1111 38206.138206.1 2323 1919 33 1010 38208.138208.1 2525 2121 22 88 38279.138279.1 2424 2020 1One 1010 38281.138281.1 2626 2222 00 88 38424.238424.2 2424 2020 00 1111 38425.338425.3 2424 2020 22 1010 38427.338427.3 2626 2222 1One 88

Theor.MassTheor.Mass HexHex HexNAcHexNAc FucFuc NeuAcNeuAc p-valuep-value AUCAUC AA 36309.336309.3 2121 1717 1One 77 3.2E-053.2E-05 0.830.83 BB 36454.436454.4 2121 1717 00 88 2.0E-062.0E-06 0.780.78 CC 36600.636600.6 2121 1717 1One 88 1.4E-071.4E-07 0.810.81 DD 36819.836819.8 2222 1818 00 88 1.2E-081.2E-08 0.830.83 EE 36891.836891.8 2121 1717 1One 99 9.0E-069.0E-06 0.760.76 FF 36893.936893.9 2323 1919 00 77 9.0E-069.0E-06 0.760.76 GG 36965.936965.9 2222 1818 1One 88 3.6E-073.6E-07 0.840.84 HH 37111.037111.0 2222 1818 00 99 7.6E-097.6E-09 0.850.85 II 37184.937184.9 2323 1919 00 88 5.5E-055.5E-05 0.760.76 JJ 37257.237257.2 2222 1818 1One 99 6.2E-046.2E-04 0.700.70 KK 37259.237259.2 2424 2020 00 77 6.2E-046.2E-04 0.700.70 LL 37402.337402.3 2222 1818 00 1010 2.5E-042.5E-04 0.740.74 MM 37476.437476.4 2323 1919 00 99 1.3E-071.3E-07 0.840.84 NN 37548.437548.4 2222 1818 1One 1010 9.9E-059.9E-05 0.710.71 OO 37550.437550.4 2424 2020 00 88 9.9E-059.9E-05 0.710.71 PP 37694.637694.6 2222 1818 22 1010 3.3E-073.3E-07 0.930.93 QQ 37768.737768.7 2323 1919 22 99 3.0E-043.0E-04 0.780.78 RR 37770.737770.7 2525 2121 1One 77 3.0E-043.0E-04 0.780.78 SS 38424.238424.2 2424 2020 00 1111 1.6E-031.6E-03 0.730.73 TT 38425.338425.3 2424 2020 22 1010 1.6E-031.6E-03 0.730.73

Figure 112017005975266-pat00002
Figure 112017005975266-pat00002

상기 표에서 F(C): 대조군에서의 빈도, F(P): 환자군에서의 빈도, AVE(P): 환자군에서의 평균값, AVE(C): 대조군에서의 평균값, STDEV: 표준편차를 의미한다. In the above table, F (C): frequency in the control group, F (P): frequency in the patient group, AVE (P): mean value in the patient group, AVE (C): mean value in the control group, STDEV: standard deviation .

*는 빈도마커 중 당사슬 조성이 확인되는 마커이며 다른 마커 패널은 당조성에 다른 PTM이 결합된 질량값을 보인다.* Is the marker in which the sugar composition is confirmed in the frequency marker, and the other marker panel shows the mass value of the PTM combined with the sugar composition.

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당사슬Sugar chain 분석 analysis 당펩타이드Glycopeptide 분석 analysis 당단백질 분석Glycoprotein analysis
(본 발명 방법)(Method of the present invention)
기대결과Expected result
N-당사슬 프로파일링
당사슬 다양성 확인
당사슬 구조 확인N-Glycosylation Profiling
Identification of oligosaccharides
Confirmation of sugar chain structure 당자리에 따른 당사슬 프로파일링
당사슬 다양성 확인
당사슬 구조확인
당자리 정보확인Profiling of sugar chains according to position
Identification of oligosaccharides
Confirmation of sugar chain structure
Verify per seat 당쇄화 프로파일링
당사슬 다양성 확인
단백질 자체의 당쇄화 패턴Glycosylation profiling
Identification of oligosaccharides
The glycosylation pattern of the protein itself 특이점Singularity 고민감도, 고특이도
상대적으로 데이터 해석 용이 Sensitivity, high specificity
Relatively easy to interpret data 고민감도, 고특이도
당사슬 분석에 비해 고민감도 고특이도 마커 확보 가능 Sensitivity, high specificity
Compared to the oligosaccharide analysis, it has high sensitivity and high specificity marker. 고민감도, 고특이도
경제성 (전처리 최소화)
한 시간 안에 시료분석부터 데이터 분석까지 완료 가능 Sensitivity, high specificity
Economy (minimization of preprocessing)
Complete sample analysis to data analysis in one hour 진단 용이성Ease of diagnosis 당사슬 시료 전처리, 분석 및 데이터 해석에 많은 시간 및 비용이 소모되어 분석 및 진단 회전률이 낮아 질병 진단에 적용하기 어려움It is difficult to apply to the diagnosis of diseases due to low analytical and diagnostic turnover rate because it consumes much time and expense for pretreatment, analysis and data interpretation 시료 전처리, 분석 및 데이터 해석에 소요되는 비용 및 시간의 최소화로 분석 및 진단 회전률이 높아 질병 진단에 적용하기 적합함It is suitable for diagnosis of diseases due to high analysis and diagnosis turnover rate by minimizing cost and time required for sample preparation, analysis and data analysis

Claims (7)

(가) 정상인 대조군 및 암 환자군 피검체 유래 햅토글로빈에 이황화결합 환원제를 처리하고 열처리하여 햅토글로빈 다량체를 단량체로 만들고, 단백질을 변성하고, 알파 사슬과 베타 사슬로 분리하는 단계;
(나) 상기 변성된 단량체 베타 사슬을 정제하는 단계;
(다) 상기 정제된 베타 사슬을 질량분석 하여 전분자량 프로파일을 얻는 단계; 및
(라) 정상인 대조군과 암 환자군 간에 상기 전분자량 프로파일에 나타난 각 전분자량 피크의 발현 빈도와 발현량 중 한 가지 이상을 비교하여 유의한 차이가 있는 경우 그 전분자량 피크를 암 진단마커로 선정하는 단계;를 포함하는 당단백질의 전분자량 측정을 통한 고민감도 암 진단마커 분석방법.
(A) treating normal human control and cancer patient-derived human hepatoglobin with a disulfide bonded reducing agent and heat-treating the resultant to make a human hepatoglobin multimer as a monomer, denaturing the protein, and separating the protein into an alpha chain and a beta chain;
(B) purifying the denatured monomeric beta chain;
(C) subjecting the purified beta chain to mass spectrometry to obtain a total molecular weight profile; And
(D) comparing the expression frequency and the expression level of each total molecular weight peak in the total molecular weight profile between the normal control group and the cancer patient group, if there is a significant difference, selecting the whole molecular weight peak as a cancer diagnostic marker A method for analyzing cancer susceptibility markers by measuring total molecular weight of a glycoprotein comprising
청구항 1에 있어서,
상기 (다) 단계 이후 (라) 단계 이전
상기 베타 사슬의 전분자량 프로파일로부터 당사슬 조성을 결정하는 단계;를 부가하는 것을 특징으로 하는 고민감도 암 진단마커 분석방법.
The method according to claim 1,
After step (c) and before step (d)
And determining the sugar chain composition from the total molecular weight profile of the beta chain.
피검자 시료에서 분리, 정제한 변성된 단량체 햅토글로빈 베타 사슬을 전분자량 질량분석하여 정상인 대조군에서 분리, 정제한 변성된 단량체 햅토글로빈 베타 사슬의 전분자량 질량분석 결과와 비교하여
이론적 분자량 36309.3 Da,
이론적 분자량 36454.4 Da,
이론적 분자량 36600.6 Da,
이론적 분자량 36819.8 Da,
이론적 분자량 36891.8 Da,
이론적 분자량 36893.9 Da,
이론적 분자량 36965.9 Da,
이론적 분자량 37111.0 Da,
이론적 분자량 37184.9 Da,
이론적 분자량 37257.2 Da,
이론적 분자량 37259.2 Da,
이론적 분자량 37402.3 Da,
이론적 분자량 37476.4 Da,
이론적 분자량 37548.4 Da,
이론적 분자량 37550.4 Da,
이론적 분자량 37694.6 Da,
이론적 분자량 37768.7 Da,
이론적 분자량 37770.7 Da,
이론적 분자량 38424.2 Da 및
이론적 분자량 38425.3 Da 중 선택된 한 가지 이상의 전분자량 피크가 유의한 차이가 있는 경우 위암일 가능성이 큰 것으로 판단함을 특징으로 하는 고민감도 위암 진단마커 분석방법.
Compared with the mass spectrometric analysis of the modified monomeric haptoglobin beta- chain, which was isolated and purified from the normal control group by total molecular weight mass spectrometry of the modified monomer haptoglobin beta chain separated and purified from the sample of the subject
Theoretical molecular weight 36309.3 Da,
Theoretical molecular weight 36454.4 Da,
Theoretical molecular weight 36600.6 Da,
Theoretical molecular weight 36819.8 Da,
Theoretical molecular weight 36891.8 Da,
Theoretical molecular weight 36893.9 Da,
Theoretical molecular weight 36965.9 Da,
Theoretical molecular weight 37111.0 Da,
Theoretical molecular weight 37184.9 Da,
Theoretical molecular weight 37257.2 Da,
Theoretical molecular weight 37259.2 Da,
Theoretical molecular weight 37402.3 Da,
Theoretical molecular weight 37476.4 Da,
Theoretical molecular weight 37548.4 Da,
Theoretical molecular weight 37550.4 Da,
Theoretical molecular weight 37694.6 Da,
Theoretical molecular weight 37768.7 Da,
Theoretical molecular weight 37770.7 Da,
Theoretical molecular weight 38424.2 Da and
And a total molecular weight peak of at least one of the theoretical molecular weights of 38425.3 Da is significantly different from the peak of the total molecular weight of 38425.3 Da.
청구항 3에 있어서,
상기 전분자량 피크는
이론적 분자량 36309.3 Da, 당사슬 조성 Hex21-HexNAc17-Fuc1-NeuAc7,
이론적 분자량 36454.4 Da, 당사슬 조성 Hex21-HexNAc17-NeuAc8,
이론적 분자량 36600.6 Da, 당사슬 조성 Hex21-HexNAc17-Fuc1-NeuAc8,
이론적 분자량 36819.8 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-NeuAc8,
이론적 분자량 36891.8 Da, 당사슬 조성 Hex21-HexNAc17-Fuc1-NeuAc9,
이론적 분자량 36893.9 Da, 당사슬 조성 Hex23-HexNAc19-NeuAc7,
이론적 분자량 36965.9 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-Fuc1-NeuAc8,
이론적 분자량 37111.0 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-NeuAc9,
이론적 분자량 37184.9 Da, 당사슬 조성 Hex23-HexNAc19-NeuAc8,
이론적 분자량 37257.2 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-Fuc1-NeuAc9,
이론적 분자량 37259.2 Da, 당사슬 조성 Hex24-HexNAc20-NeuAc7,
이론적 분자량 37402.3 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-NeuAc10,
이론적 분자량 37476.4 Da, 당사슬 조성 Hex23-HexNAc19-NeuAc9,
이론적 분자량 37548.4 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-Fuc1-NeuAc10,
이론적 분자량 37550.4 Da, 당사슬 조성 Hex24-HexNAc20-NeuAc8,
이론적 분자량 37694.6 Da, 당사슬 조성 Hex22-HexNAc18-Fuc2-NeuAc10,
이론적 분자량 37768.7 Da, 당사슬 조성 Hex23-HexNAc19-Fuc2-NeuAc9,
이론적 분자량 37770.7 Da, 당사슬 조성 Hex25-HexNAc21-Fuc1-NeuAc7,
이론적 분자량 38424.2 Da, 당사슬 조성 Hex24-HexNAc20-NeuAc11 및
이론적 분자량 38425.3 Da, 당사슬 조성 Hex24-HexNAc20-Fuc2-NeuAc10 중 선택된 한 가지 이상임을 특징으로 하는 고민감도 위암 진단마커 분석방법.
The method of claim 3,
The total molecular weight peak
Theoretical molecular weight 36309.3 Da, oligosaccharide composition Hex21-HexNAc17-Fuc1-NeuAc7,
Theoretical molecular weight 36454.4 Da, oligosaccharide composition Hex21-HexNAc17-NeuAc8,
Theoretical molecular weight 36600.6 Da, oligosaccharide composition Hex21-HexNAc17-Fuc1-NeuAc8,
Theoretical molecular weight 36819.8 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-NeuAc8,
Theoretical molecular weight 36891.8 Da, oligosaccharide composition Hex21-HexNAc17-Fuc1-NeuAc9,
Theoretical molecular weight 36893.9 Da, oligosaccharide composition Hex23-HexNAc19-NeuAc7,
Theoretical molecular weight 36965.9 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-Fuc1-NeuAc8,
Theoretical molecular weight 37111.0 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-NeuAc9,
Theoretical molecular weight 37184.9 Da, oligosaccharide composition Hex23-HexNAc19-NeuAc8,
Theoretical molecular weight 37257.2 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-Fuc1-NeuAc9,
Theoretical molecular weight 37259.2 Da, oligosaccharide composition Hex24-HexNAc20-NeuAc7,
Theoretical molecular weight 37402.3 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-NeuAc10,
Theoretical molecular weight 37476.4 Da, oligosaccharide composition Hex23-HexNAc19-NeuAc9,
Theoretical molecular weight 37548.4 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-Fuc1-NeuAc10,
Theoretical molecular weight 37550.4 Da, oligosaccharide composition Hex24-HexNAc20-NeuAc8,
Theoretical molecular weight 37694.6 Da, oligosaccharide composition Hex22-HexNAc18-Fuc2-NeuAc10,
Theoretical molecular weight 37768.7 Da, oligosaccharide composition Hex23-HexNAc19-Fuc2-NeuAc9,
Theoretical molecular weight 37770.7 Da, oligosaccharide composition Hex25-HexNAc21-Fuc1-NeuAc7,
Theoretical molecular weight 38424.2 Da, oligosaccharide composition Hex24-HexNAc20-NeuAc11 and
A theoretical molecular weight of 38425.3 Da, and a sugar chain composition Hex24-HexNAc20-Fuc2-NeuAc10.
청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
피검자 시료의 상기 전분자량 피크가 정상인 대조군에 비하여 10% 이상 발현량이 적거나 많은 시료의 경우 위암일 가능성이 큰 것으로 판단하는 고민감도 위암 진단마커 분석방법.
The method according to claim 3 or 4,
A method for diagnosing a gastric cancer marker having a high sensitivity, wherein the test sample is judged to have a high possibility of gastric cancer in a case where the expression amount of the test sample is 10% or more in comparison with the control group in which the total molecular weight peak is normal.
정상인 대조군 또는 위암 환자군 중 하나 이상의 군의 피검체 시료 중 80% 이상의 시료에서 관찰되며, 정상인 대조군에 비하여 위암 환자군에서 빈도가 25% 이상 높은
이론적 분자량 35138.4 Da,
이론적 분자량 35142.4 Da,
이론적 분자량 36250.4 Da,
이론적 분자량 36308.5 Da,
이론적 분자량 36541.3 Da,
이론적 분자량 37913.3 Da,
이론적 분자량 37922.4 Da,
이론적 분자량 38351.1 Da 및
이론적 분자량 38569.4 Da 중 선택된 한 가지 이상을 위암 진단마커로 선정하고,
정상인 대조군에서 분리, 정제한 변성된 단량체 햅토글로빈 베타 사슬의 전분자량 질량분석 결과와 비교하여 피검자 시료에서 분리, 정제한 변성된 단량체 햅토글로빈 베타 사슬 전분자량 질량분석 결과, 상기 위암 진단마커가 유의하게 높게 나타나는 경우 위암일 가능성이 큰 것으로 판단함을 특징으로 하는 고민감도 위암 진단마커 분석방법.
More than 80% of the specimens of one or more of the normal control group or the gastric cancer patient group were observed, and the frequency of gastric cancer patients was more than 25%
Theoretical molecular weight 35138.4 Da,
Theoretical molecular weight 35142.4 Da,
Theoretical molecular weight 36250.4 Da,
Theoretical molecular weight 36308.5 Da,
Theoretical molecular weight 36541.3 Da,
Theoretical molecular weight 37913.3 Da,
Theoretical molecular weight 37922.4 Da,
Theoretical molecular weight 38351.1 Da and
One or more of the theoretical molecular weights of 38569.4 Da were selected as gastric cancer diagnostic markers,
As a result of mass molecular weight analysis of the mutated monomer haptoglobin beta chain separated and purified from the sample of the subject in comparison with the result of mass molecular weight analysis of the modified monomer human hepatoglobin beta chain separated and purified from the normal control group, The present invention provides a method for diagnosing a gastric cancer diagnosis marker having a high sensitivity.
정상인 대조군 또는 위암 환자군 중 하나 이상의 군의 피검체 시료 중 80% 이상의 시료에서 관찰되며, 정상인 대조군에 비하여 위암 환자군에서 빈도가 25% 이상 낮게 나타나는
이론적 분자량 37530.2 Da,
이론적 분자량 37535.7 Da,
이론적 분자량 37913.9 Da,
이론적 분자량 37919.4 Da,
이론적 분자량 37923.5 Da,
이론적 분자량 37928.4 Da,
이론적 분자량 37972.6 Da,
이론적 분자량 37977.6 Da,
이론적 분자량 39035.3 Da,
이론적 분자량 39039.5 Da 및
이론적 분자량 39520.9 Da 중 선택된 한 가지 이상을 위암 진단마커로 선택하고,
피검자 시료에서 분리, 정제한 변성된 단량체 햅토글로빈 베타 사슬을 전분자량 질량분석하여 정상인 대조군에서 분리, 정제한 변성된 단량체 햅토글로빈 베타 사슬의 전분자량 질량분석 결과와 비교하여 상기 위암 진단마커 중 한 가지 이상이 나타나지 않는 경우 위암일 가능성이 큰 것으로 판단함을 특징으로 하는 고민감도 위암 진단마커 분석방법.In more than 80% of the specimens of one or more of the normal control group or the gastric cancer patient group, the frequency of gastric cancer was lower than that of the control group by 25%
Theoretical molecular weight 37530.2 Da,
Theoretical molecular weight 37535.7 Da,
Theoretical molecular weight 37913.9 Da,
Theoretical molecular weight 37919.4 Da,
Theoretical molecular weight 37923.5 Da,
Theoretical molecular weight 37928.4 Da,
Theoretical molecular weight 37972.6 Da,
Theoretical molecular weight 37977.6 Da,
Theoretical molecular weight 39035.3 Da,
Theoretical molecular weight 39039.5 Da and
One or more of the theoretical molecular weights of 39520.9 Da were selected as gastric cancer diagnostic markers,
The molecular weight of the modified human hepatoglobin beta chain isolated and purified from the sample of the subject was analyzed by mass spectrometry and compared with the mass molecular mass analysis of the modified monomer haptoglobin beta chain which was isolated and purified in a normal control group, And the possibility of gastric cancer is high when one or more abnormalities do not appear.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015126030A1 (en) * 2014-02-19 2015-08-27 한국과학기술원 Novel method for gastric cancer diagnosis

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
2013 Thermo Scientific_Guide to Glycan Analysis*
Scott Mack et al., ‘High Resolution Intact Glycoprotein Analysis by CESI-MS’, Beckman Coulter, 2012, 11-0809-P.*

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102222001B1 (en) 2019-09-11 2021-03-02 충남대학교산학협력단 Disease diagnosing methods through a middle-up-down approach to targeted glycoproteins
KR102222002B1 (en) 2019-09-11 2021-03-02 충남대학교산학협력단 Gastric Cancer Biomarkers Derived from Target Glycoproteins Discovered by Middle-up-down Analysis

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