KR20110038778A - Multilectin-based biomarker development method and hepatocellular carcinoma biomarkers derived through the method - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 암의 발생 및 진행과정 중 양적, 질적 변화를 보이는 당단백질들을 다양한 렉틴을 사용하여 포집한 후 질량분석기로 동정하는 방법에 관한 것으로 동정된 당단백질들을 간암 바이오마커로 설정하고자 하는 것이다.The present invention relates to a method for capturing glycoproteins showing quantitative and qualitative changes during the development and progression of cancer using various lectins, and then identifying them by mass spectrometry.
암은 전세계적으로 제1의 사망원인이며, 이 상황은 국내에도 마찬가지이다. 암은 유전적, 환경적 요인에 의해서 형성, 발전되며 식생활의 변화, 환경오염의 심화, 환경 및 정신적 스트레스의 노출 심화 등으로 인하여 암 발생 및 암으로 인한 사망자가 해마다 증가하는 추세이다. 다른 질병과 비교해 볼 때 암의 특징은 완치가 비교적 어렵다는 것과 치료 후 생존율이 평균적으로 낮다는데 있다. 생존율과 관련하여 암이 갖는 특징은 암의 진행 정도에 따라 환자의 예후와 생존율이 큰 차이를 보인다는 것인데 약 100여년에 가까운 암치료기술의 발전에도 불구하고 암종마다 약간의 차이는 있지만 말기 암이나 전이가 이루어진 암의 경우는 완치율이 매우 낮은 것이 사실이다 (Etzioni R. et al., Nature Reviews Cancer 3, 243-252, 2003). 더욱이 암은 초기에 자각증상이 별로 없는 것이 일반적이며 자각증상에 의한 진단의 경우는 이미 치료가 불가능한 말기 상태로 발전한 경우가 많다. 즉, 암의 치료법 개발 필요성과 함께, 치료가 가능한 초기에 암을 진단할 수 있는 방법이 암의 효과적인 치료와 생존율 제고라는 목표에 가장 부합하는 전략이라고 할 수 있다. 이러한 목적으로 암의 조기진단을 도울 수 있는 생체인자, 즉 바이오마커의 연구, 개발이 현재 프로테오믹스 기법을 중심으로 해서 전 세계적으로 활발하게 진행되고 있다. Cancer is the leading cause of death worldwide, and the situation is the same in Korea. Cancer is formed and developed by genetic and environmental factors, and cancer deaths and deaths from cancer increase every year due to changes in diet, deepening environmental pollution, and deepening environmental and mental stress. Compared with other diseases, the characteristics of cancer are relatively difficult to cure and the average survival rate after treatment is low. The characteristics of cancer in relation to the survival rate is that the prognosis and survival rate of patients vary greatly according to the progression of the cancer. Despite the development of cancer treatment technology for nearly 100 years, there are some differences between cancer types. It is true that the rate of cure is very low in metastatic cancers (Etzioni R. et al., Nature Reviews Cancer 3, 243-252, 2003). In addition, cancers generally have few subjective symptoms in the early stages, and the diagnosis of subjective symptoms often develops into a terminal state that is already incurable. In other words, along with the need to develop treatments for cancer, a method of diagnosing cancer at the earliest possible stage can be said to be the strategy that best meets the goals of effective treatment and improvement of survival rate. For this purpose, the research and development of biofactors that can help early diagnosis of cancer, that is, biomarkers, is currently being actively conducted around the world based on proteomic techniques.
종양 바이오마커는 다양한 용도가 있는데, 암의 조기진단을 도울 수 있고, 암의 시기를 측정하고, 치료에 따른 암의 진행상황을 모니터링할 수 있게 하며 수술 후의 예후를 판단할 수 있게 하는 기능도 가지고 있다 (Rifai N. et al., Nature Biotech. 24, 971-983, 2006). 이런 목적과 기능을 가진 바이오마커를 통하여 암의 발견 및 진행상황을 추적하기 위해서는 비파괴적인 방법이 요구되며 따라서 검사시 위험부담이 적은 혈액 등의 체액이 바이오마커 개발연구에 있어 최적의 생체시료로 인식되고 있다. 즉, 소변이나 타액, 혈액 등을 통하여 탐지할 수 있는 바이오마커 개발이 가장 표준화된 방식의 접근법이며, 그 중에서도 혈액은 모든 조직 유래의 단백질이 모이는 가장 포괄적인 생체시료라고 할 수 있다. 또한, 생체물질의 형태로 볼 때 가장 선호되는 종양 바이오마커의 형태는 단백질이라고 할 수 있다. Tumor biomarkers have a variety of uses, including the ability to help early diagnosis of cancer, to determine the timing of cancer, to monitor the progress of cancer following treatment, and to determine the prognosis after surgery. (Rifai N. et al., Nature Biotech. 24, 971-983, 2006). Non-destructive methods are required to track cancer detection and progression through biomarkers with this purpose and function. Therefore, the body fluids such as blood, which are less risky at the time of examination, are recognized as the optimal biological samples for biomarker development research. It is becoming. In other words, the development of biomarkers that can be detected through urine, saliva, and blood is the most standardized approach. Among them, blood is the most comprehensive biological sample in which proteins from all tissues are collected. In addition, the most preferred form of tumor biomarkers in the form of biomaterials can be said to be a protein.
간암의 경우, 동아시아권의 나라에서 그 발생 빈도가 매우 높으며 우리나라도 예외는 아니다. 간암은 대한민국의 3대 호발암 중 하나이고, 2008년 기준으로 위암에 이어 두 번째로 높은 발병률을 보이며 여성보다 남성에게 높게 나타나는 경향을 보인다. In the case of liver cancer, the frequency of occurrence is very high in countries of East Asia, and Korea is no exception. Liver cancer is one of the three most common cancers in South Korea, and as of 2008, it has the second highest incidence rate after gastric cancer.
현재 간암 진단을 위해 사용되는 바이오마커는 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein; AFP)이 있다. AFP는 태아에서 높게 발현되어 알부민의 기능을 대신하는 것으로 보고되어 있다. 하지만 완전히 성숙된 태아에서부터 점차 발현이 줄어들면서 생후에는 거의 발현되지 않는 것으로 알려져 있다 (Alpert E et al., J. Biol. Chem 247, 3792-3798, 1972). 성인의 경우 임신기나 폐경기 직후를 제외하고는 AFP가 정상상태에서는 혈액 내에서 15ng/ml 이하로 검출된다. 하지만 간암이 발생할 경우 간암조직에서 다량의 AFP가 발현되어 혈액내 농도가 수백 ng/ml에 이르기도 한다 (Malati T, Indian J. Clin. Biochem. 22, 17-31, 2007). 현재 AFP는 FDA의 승인을 받아 간암의 진단 및 모니터링에 이용되고 있다. 하지만 중요한 사실은 간암 바이오마커로서의 AFP의 유용성은 낮은 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)로 인해 한계가 있다는 점이다 (Zhou L. et al., World J. Gastroenterol. 12, 1175-1181, 2006). 즉 AFP라는 단일 바이오마커로서는 간암의 효율적인 진단 및 모니터링에 한계가 있다. 따라서, AFP와 독립적 또는 의존적인 조합을 통해 간암 진단의 효율성을 증가시켜줄 수 있는 새로운 간암 바이오마커의 개발이 필요성하다.Biomarkers currently used for the diagnosis of liver cancer include alpha-fetoprotein (AFP). AFP is reported to be highly expressed in the fetus and replace albumin's function. However, it gradually decreases in expression in fully mature fetuses and is rarely expressed after birth (Alpert E et al., J. Biol. Chem 247, 3792-3798, 1972). In adults, except in gestational or postmenopausal periods, AFP is detected in the blood at less than 15 ng / ml in normal conditions. However, when liver cancer occurs, a large amount of AFP is expressed in liver cancer tissue, resulting in blood concentrations of several hundred ng / ml (Malati T, Indian J. Clin. Biochem. 22, 17-31, 2007). Currently, AFP has been approved by the FDA and used to diagnose and monitor liver cancer. However, it is important to note that the usefulness of AFP as a liver cancer biomarker is limited by its low sensitivity and specificity (Zhou L. et al., World J. Gastroenterol. 12, 1175-1181, 2006). ). That is, a single biomarker called AFP has limitations in the efficient diagnosis and monitoring of liver cancer. Therefore, there is a need for the development of new liver cancer biomarkers that can increase the efficiency of liver cancer diagnosis through an independent or dependent combination with AFP.
혈액 내 AFP의 양만을 측정할 경우 AFP의 간암 바이오마커로서의 유용성은 제한되지만 AFP의 질적 변화, 다시 말하여 당단백질의 구조 변화를 함께 고려할 경우 간암 진단의 민감도를 높일 수 있다. 즉 AFP를 통한 간암 예측의 민감도는 약 70% 수준이지만, AFP에 있는 당쇄에 퓨코오스가 결합된 형태인 AFP-L3를 통한 예측의 경우는 민감도가 90% 이상인 것으로 보고되어 있다 (Aoyagi Y. et al., Cancer 61, 769-774, 1988). AFP의 예에서 볼 수 있듯이 암의 발생과 진행과정에서 당단백질의 당쇄가 변하는 현상이 종종 일어나고 있으며 이는 N-형 당단백질의 경우 다양한 형태로 나타난다. AFP의 예에서 볼 수 있듯이 N-글라이칸(glycan)의 중심(core) 당쇄에 퓨코오스가 결합되는 중심 퓨코실화(core-fucosylation)가 그 대표적인 형태이며, 간암과 관련하여 중심 퓨코실화가보고된 몇몇 당단백질들이 있다 (Miyoshi E. et al, J. Biochem. 725-729, 2008). 또한, N-아세틸글루코사민 전이효소 V(N-acetylglucosaminyltransferase V, GnT-V)에 의한 β1,6-N-아세틸글루코사민(acetylglucosamine, GlcNAc) 가지는 암의 침윤(invasion)과 전이(metastasis)에 직접 연관성이 있는 것으로 알려져 있다(Dennis et al., 1987, Science, 236:582-5853; Kim et al., 2008, Mol. Cell. Proteome 7, 1-14). GnT-V에 의해 형성된 β1,6-GlcNAc 가지는 당전이효소의 좋은 기질로 알려지고 있으며, 그 이후에 갈락토스(galactose)와 GlcNAc이 교차로 부가되면서 폴리락토스아민(polylactosamine) 구조가 형성된다 (Chakraborty A.K. et al., Clin. Exp. Metastasis 20, 365-373, 2003). N-형 당단백질이나 O-형 당단백질의 말단에 퓨코스-GlcNAc-갈락토스라는 루이스(Lewis) 구조가 형성될 수 있으며 말단에 시알산이 결합될 경우 시알릴 루이스 a/x(sialyl Lewis a/x) 구조가 완성된다. 간암세포의 표면에 시알릴 루이스 a/x 구조가 갖추어지면 상피세포의 표면에서 발현되는 E-셀렉틴(selectin)의 기질로 작용하여 혈관에서 암의 전이가 일어날 때, 암세포의 초기 혈관부착에 관여한다 (Hakomori S. Adv. Exp. Med. Biol. 491, 369-402, 2001). 즉 시알릴 루이스 a/x 구조를 갖는 암세포는 전이활성이 매우 큰 것으로 보고되어 있다. 이처럼 암세포에서는 다양한 형태로 당단백질의 당쇄가 변형이 되며 이 변형된 당쇄가 암의 발생 및 진행에 여러 형태로 작용하는 것으로 예상된다.When measuring the amount of AFP in the blood alone, the usefulness of AFP as a liver cancer biomarker is limited, but considering the qualitative change of AFP, that is, the structural change of glycoprotein, can increase the sensitivity of liver cancer diagnosis. In other words, the sensitivity of AFP to liver cancer is about 70%, but it is reported that the sensitivity of AFP-L3, which is a form of a fucose bound to sugar chains in AFP, is more than 90% (Aoyagi Y. et. al., Cancer 61, 769-774, 1988). As can be seen in the case of AFP, glycoprotein glycoproteins are frequently changed during cancer development and progression, which are various forms of N-type glycoproteins. As can be seen in the AFP example, the core form of fucose binding to the core sugar chain of the N-glycan is a representative form, and several cases of central fucosylation have been reported in connection with liver cancer. Glycoproteins (Miyoshi E. et al, J. Biochem. 725-729, 2008). In addition, β1,6-N-acetylglucosamine (GlcNAc) with N-acetylglucosaminyltransferase V (GnT-V) has a direct association with cancer invasion and metastasis. (Dennis et al ., 1987, Science, 236: 582-5853; Kim et al., 2008, Mol. Cell. Proteome 7, 1-14). The β1,6-GlcNAc branch formed by GnT-V is known to be a good substrate of glycotransferase, and then, after the addition of galactose and GlcNAc, a polylactosamine structure is formed (Chakraborty AK et. al., Clin. Exp. Metastasis 20, 365-373, 2003). Lewis structure called fucose-GlcNAc-galactose may be formed at the end of N-type or O-type glycoprotein, and when sialic acid is bound at the end, sialyl Lewis a / x ) The structure is completed. Sialyl Lewis a / x structure on the surface of hepatocellular carcinoma acts as a substrate for E-selectin expressed on the surface of epithelial cells, and is involved in the initial blood vessel adhesion of cancer cells when cancer metastases occur in blood vessels. (Hakomori S. Adv. Exp. Med. Biol. 491, 369-402, 2001). In other words, cancer cells having a sialyl Lewis a / x structure have been reported to have very high metastatic activity. As described above, glycoproteins of the glycoprotein are modified in various forms in cancer cells, and the modified sugar chains are expected to act in various forms in the development and progression of cancer.
본 발명의 목적은 암의 진단을 위해 체액에서 당쇄의 변이나 단백질 양의 변화를 보이는 단백질을 검출해내는 방법을 제공하는 것이다. SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a method for detecting a protein showing alterations in sugar chains or protein in body fluids for the diagnosis of cancer.
또한, 본 발명의 목적은 상기 검출 방법에 의해 검출된 단백질들을 간암 바이오마커로 이용하려는 것이다.In addition, an object of the present invention is to use the proteins detected by the detection method as a liver cancer biomarker.
뿐만 아니라, 본 발명의 목적은 상기 바이오마커 단백질에 대한 항체를 이용하여 암을 진단할 수 있는 암 진단용 키트를 제공하려는 것이다. In addition, an object of the present invention is to provide a cancer diagnostic kit that can diagnose cancer using the antibody to the biomarker protein.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 일 실시예에서 비드에 결합된 L-PHA, DSA, AAL, E-셀렉틴 및 Con-A를 이용하여 혈액 내 단백질들을 포집하였으며, 상기 렉틴에 결합하지 않는 단백질은 SDS-PAGE 겔에서 분자량에 따라 분리시켰다. 이렇게 포집, 분리된 단백질들의 효율적인 절단, 동정 과정을 통해 의미 있는 간암 바이오마커 후보군을 설정하였다. In order to achieve the above object, the present inventors collected the proteins in the blood using L-PHA, DSA, AAL, E-selectin and Con-A bound to beads in one embodiment, the protein does not bind to the lectin Silver was separated according to molecular weight on SDS-PAGE gel. Through the collection, efficient cleavage and identification of isolated proteins, we established a meaningful liver cancer biomarker candidate group.
좀더 자세히 설명하면, 본 발명자들은 도 1에서 설명한 바와 같은 프로토콜에 기반을 두어 특이적인 당쇄구조를 인식할 수 있는 다양한 렉틴을 이용하여 체액에서 종양 바이오마커 후보군을 선발하는 방법을 발명하였다. 먼저 본 발명자들은 β1,6-GlcNAc 가지를 가진 당단백질을 포집하기 위해 피토헴어글루티닌L4(phytohemagglutinin-L4, LPHA)를 사용하였으며 폴리락토스아민 가지는 이에 대해 서 높은 친화도를 보이는 DSA(Datura stramonium agglutinin)를 사용하였다. 또, 중심 퓨코실화 당단백질의 포집을 위해서 AAL(Aleuria aurantia agglutinin)을 사용하였다. 또한, 시알릴 루이스 a/x구조를 가진 당단백질의 포집은 rhE-셀렉틴을 발현, 정제하여 사용하였다. 위 네 가지 렉틴에 의한 체액 단백질 포집은 각 렉틴을 순차적으로 적용하여 진행되었으며, 포획되지 않은 당단백질은 콘카나발린 A(Concanavalin-A, Con-A)를 사용하여 포집하였다. 또한 위 모든 렉틴에도 결합되지 않은 단백질들을 SDS-PAGE 겔에서 분리하여 단백질 분자량 별로 구분하였다. 렉틴에 결합된 단백질은 용액내 절단(in-solution digestion) 방법을, SDS-PAGE 겔에서 분리된 단백질들은 젤내 절단(in-gel digestion) 방법을 수행하여 펩타이드를 얻었으며, 얻어진 펩타이드를 질량분석기로 질량분석한 후 데이터베이스를 이용하여 단백질을 동정하였다. In more detail, the present inventors invented a method for selecting tumor biomarker candidates in body fluid using various lectins capable of recognizing specific sugar chain structures based on the protocol described in FIG. 1. First DSA present inventors have used a heme Pitot eogeul Ruti non-L 4 (phytohemagglutinin-L 4, LPHA) to capture the glycoproteins with the β1,6-GlcNAc of the visible also poly lactose amine having high affinity for it standing ( Datura stramonium agglutinin) was used. In addition, AAL ( Aleuria aurantia agglutinin) was used for capture of the central fucosylated glycoprotein. In addition, the collection of glycoproteins having sialyl Lewis a / x structure was used by expressing and purifying rhE-selectin. The humoral protein collection by the above four lectins was performed by sequentially applying each lectin, and the uncaptured glycoprotein was collected using Concanavalin-A (Con-A). In addition, the proteins not bound to all of the above lectins were separated by SDS-PAGE gel and classified by protein molecular weight. Proteins bound to lectins were subjected to in-solution digestion, and proteins isolated from SDS-PAGE gels were subjected to in-gel digestion to obtain peptides. After mass spectrometry, proteins were identified using a database.
또한, 본 발명자들은 정상인의 혈액과 간암 환자의 혈액으로부터 동정한 단백질들을 비교, 분석하여 간암에 특이적으로 발현되거나 높게 발현되는 단백질들을 분류하여 간암 바이오마커 예비 후보군으로 설정하였다. 당단백질 여부와 종양 관련성 여부를 문헌 조사하여 유용하다고 판단되는 단백질들을 간암 바이오마커군으로 설정함으로써 본 발명을 완성하였다.In addition, the present inventors compared and analyzed proteins identified from blood of a normal person and blood of a liver cancer patient to classify proteins specifically expressed or highly expressed in liver cancer and set them as a candidate candidate for liver cancer biomarker. The present invention was completed by setting the liver cancer biomarker groups to be proteins useful by examining literatures on whether glycoproteins and tumors are related.
본 발명은 The present invention
a) 체액 시료를 환원 및 알킬화하는 단계;a) reducing and alkylating a bodily fluid sample;
b) 리간드가 결합된 렉틴과 상기 리간드에 결합하는 리간드 수용체가 결합된 비드를 반응시켜 얻어지는 렉틴-비드 복합체에 상기 환원 및 알킬화된 시료를 가하여 반응시키는 단계;b) adding the reduced and alkylated sample to the lectin-bead complex obtained by reacting a ligand bound lectin with a ligand receptor bound to the ligand;
c) 상기 렉틴-비드 복합체에 결합한 시료를 용출하는 단계;c) eluting the sample bound to the lectin-bead complex;
d) 리간드가 결합된 다른 종류의 렉틴과 상기 리간드에 결합하는 리간드 수용체가 결합된 비드를 반응시켜 얻어지는 다른 종류의 렉틴-비드 복합체에 상기 c) 단계에서 렉틴-비드 복합체에 결합하지 않은 시료를 가하여 반응시키는 단계;d) a sample that does not bind to the lectin-bead complex in step c) is added to another lectin-bead complex obtained by reacting another type of lectin to which the ligand is bound and beads to which the ligand receptor is bound to the ligand. Reacting;
e) 상기 다른 종류의 렉틴-비드 복합체에 결합한 시료를 용출하는 단계;e) eluting the sample bound to said other type of lectin-bead complex;
f) 상기 c) 단계 및 e) 단계에서 용출된 시료를 절단(digestion)하여 질량분석하는 단계;f) digesting the sample eluted in steps c) and e) by mass spectrometry;
를 포함하는 렉틴 친화 크로마토그래피를 이용하여 체액 유래 단백질을 동정하는 방법을 제공한다. It provides a method for identifying a body fluid-derived protein using lectin affinity chromatography comprising a.
또한, 본 발명은 상기 a) 단계 이전에 체액 시료 내의 과상존 단백질을 제거하는 단계가 부가되는 것을 특징으로 하는 체액 유래 단백질 동정방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for identifying a body fluid-derived protein, characterized in that the step of removing the excess protein in the body fluid sample before step a) is added.
또한, 본 발명은 상기 과상존 단백질 제거 단계가 과상존 단백질 제거용 크로마토그래피를 이용하여 수행됨을 특징으로 하는 체액 유래 단백질 동정방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for identifying a body fluid-derived protein, characterized in that the step of removing the supernatant protein is performed using chromatography for removing the superphase protein.
또한, 본 발명은 각기 다른 종류의 렉틴으로 상기 d) 단계 및 e) 단계를 여러 번 수행하는 것을 특징으로 하는 체액 유래 단백질 동정방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for identifying a body fluid-derived protein, characterized in that the step d) and e) is performed several times with different kinds of lectins.
또한, 본 발명은 상기 리간드 및 리간드 수용체가 바이오틴 및 아비딘인 것을 특징으로 하는 체액 유래 단백질 동정방법을 제공한다. The present invention also provides a method for identifying a body fluid-derived protein, characterized in that the ligand and ligand receptor are biotin and avidin.
또한, 본 발명은 상기 리간드 및 리간드 수용체가 프로테인 A 및 프로테인 G 중 1종 이상과 IgG Fc인 것을 특징으로 하는 체액 유래 단백질 동정방법을 제공한다. The present invention also provides a method for identifying a body fluid-derived protein, characterized in that the ligand and ligand receptor are at least one of Protein A and Protein G and IgG Fc.
또한, 본 발명은 상기 렉틴 및 다른 종류의 렉틴이 L4-PHA(Phytohemagglutinin-L4), LCA(lens culinaris agglutinin), DSA(Datura stramonium agglutinin), AAL(Aleuria aurantia agglutinin), rhE-셀렉틴, 콘카나발린 A(Concanavalin-A, Con-A), WGA(Wheat germ agglutinin), 자칼린(Jacalin), SNA(Sambucus Nigra agglutinin) 및 갈렉틴(galectin) 중 선택된 2종임을 특징으로 하는 체액 유래 단백질 동정방법을 제공한다. In addition, the present invention is the lectin and other kinds of lectin L 4 -PHA (Phytohemagglutinin-L 4 ), LCA ( lens culinaris agglutinin), DSA ( Datura stramonium agglutinin), AAL ( Aleuria aurantia agglutinin), rhE-selectin, cone Humoral-derived protein characterized by two types selected from concanavalin-A (Con-A), heat germ agglutinin (WGA), jackalin (Jacalin), S ambucus Nigra agglutinin (SNA) and galectin Provide a method of identification.
또한, 본 발명은 상기 c) 단계 및 e) 단계에서 렉틴-비드 복합체와 결합된 시료의 용출은 카오트로픽제(chaotropic agent)를 처리하고 원심분리하여 렉틴-비드 복합체로부터 분리함을 특징으로 하는 체액 유래 단백질 동정방법을 제공한다.In addition, the present invention is a body fluid characterized in that the elution of the sample bound to the lectin-bead complex in step c) and e) is separated from the lectin-bead complex by treatment with a chaotropic agent and centrifugation Provided is a method for identifying a derived protein.
또한, 본 발명은 상기 f) 단계의 절단 방법은 용액 내 절단(in-solution digestion)임을 특징으로 하는 체액 유래 단백질 동정방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for identifying a body fluid-derived protein, characterized in that the cutting method of step f) is in-solution digestion.
또한, 본 발명은 상기 f) 단계에 렉틴-비드 복합체에 결합하지 않은 시료를 전기영동(electrophoresis)으로 분리하고, 젤내 절단(in-gel digestion)하여 질량분석하는 단계를 추가하는 것을 특징으로 하는 체액 유래 단백질 동정방법을 제공한다.In addition, the present invention further comprises the step of f) separating the sample not bound to the lectin-bead complex by electrophoresis, in-gel digestion and mass spectrometry, further comprising the step of mass spectrometry. Provided is a method for identifying a derived protein.
또한, 본 발명은 상기 체액 시료를 각각 정상 대조구 시료 및 분석구 시료로 하여 양적 및/또는 질적 변화를 나타내는 체액 유래 단백질을 동정하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for identifying a body fluid-derived protein exhibiting quantitative and / or qualitative changes by using the body fluid sample as a normal control sample and an analyte sample, respectively.
또한, 본 발명은 상기 양적 및/또는 질적 변화를 나타내는 체액 유래 단백질은 종양 바이오마커 단백질임을 특징으로 하는 체액 유래 단백질 동정방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for identifying a body fluid-derived protein, characterized in that the body fluid-derived protein exhibiting quantitative and / or qualitative changes is a tumor biomarker protein.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 어느 한 방법에 의해 탐지된 무명 단백질 산물(Unnamed protein product) FLJ52590; 인히빈 베타 E 사슬(Inhibin beta E chain); 세르핀(Serpin) B4; 짧은 구개, 폐 및 비강 상피암-관련 단백질 2(Short palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associated protein 2); 메탈로리덕테이즈(Metalloreductase) STEAP2; 트랜스멤브레인 단백질분해효소, 세린 4(Transmembrane protease, serine 4); 트랜스멤브레인 부고환 단백질 1(Transmembrane epididymal protein 1); 및 콘드로렉틴(Chondrolectin)으로 구성되는 단백질 군 중 선택된 1종 이상의 간암 바이오마커를 제공한다. In addition, the present invention provides an unnamed protein product FLJ52590 detected by any one of the above methods; Inhibin beta E chains; Serpin B4; Short palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associated
본 발명은 렉틴 침전 기법을 이용하여 암 발생 및 전이에 관여하여 β1,6-N-아세틸글루코사민 가지 등의 '잘못된 당질화'를 보이는 미량의 당단백질을 혈액 등 체액으로부터 직접 탐지함으로써 체액으로부터 각종 암을 손쉽게 진단할 수 있으며, 각종 암에 대한 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 높은 바이오마커 및 암 진단키트를 제공할 수 있다. The present invention utilizes a lectin precipitation technique to detect various glycoproteins, such as β1,6-N-acetylglucosamine eggplant, and the like. Can be easily diagnosed, and can provide biomarkers and cancer diagnostic kits with high sensitivity and specificity for various cancers.
본 발명은 간암과 관련되어 양적, 질적 차이를 보이는 단백질들을 동정함으로써 간암 바이오마커군을 설정하고, 조기진단을 가능하게 하는 간암진단키트의 콘텐츠를 제공한다. The present invention establishes a liver cancer biomarker group by identifying proteins showing quantitative and qualitative differences in relation to liver cancer, and provides the contents of a liver cancer diagnosis kit that enables early diagnosis.
본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 당단백질의 당쇄 변화 및 양적 변화를 렉틴을 이용한 침전법으로 민감하게 분석하는 방법 및 이 방법을 이용하여 탐지한 암 바이오마커에 관한 것이다. 본 방법은 간암뿐만 아니라 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암 등의 다양한 고형암으로 확대 적용할 수 있다. The present invention relates to a method for sensitively analyzing sugar chain changes and quantitative changes of glycoproteins involved in cancer development and metastasis by lectin precipitation and cancer biomarkers detected using this method. The method can be broadly applied to various solid cancers such as colon cancer, stomach cancer, lung cancer, liver cancer, uterine cancer, breast cancer and pancreatic cancer as well as liver cancer.
본 발명의 일 실시예에서는 정상인 혈액과 간암 환자 혈액으로부터 5종류의 렉틴, 즉 L-PHA, DSA, AAL, E-셀렉틴 및 Con-A에 친화력을 보이는 당단백질을 포집하고, 또한 상기 렉틴에 결합되지 않은 단백질들을 SDS-PAGE 겔에서 분자량에 따라 분리하였다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 렉틴은 바이오틴이나 IgG의 Fc부분이 결합된 형태를 사용하였으며, 각각 아비딘이나 단백질 G가 결합된 비드와 결합시켜 렉틴-아비딘-비드 또는 렉틴-단백질 G-비드 형태의 복합체를 사용하여 당단백질 포집에 이용하였다. In one embodiment of the present invention, the glycoproteins showing affinity for five kinds of lectins, namely L-PHA, DSA, AAL, E-selectin, and Con-A, are collected from normal blood and blood of liver cancer patients. Unresolved proteins were separated according to molecular weight in an SDS-PAGE gel. In one embodiment of the present invention, the lectin was used in the form of binding the Fc portion of biotin or IgG, respectively, by binding with avidin or protein G-bound beads, respectively, in the form of lectin-avidin-bead or lectin-protein G-bead. The complex was used for glycoprotein capture.
본 발명의 일 실시예에서 렉틴에 결합된 단백질의 경우 용액내 절단(in-solution digestion)을 수행하였고 SDS-PAGE 겔에서 분리된 단백질들을 젤내 절단(in-gel digestion)을 수행하여 펩타이드를 추출하였다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 상기와 같이 얻어진 펩타이드를 고자장(7-테슬러)의 퓨리에변환 이온공 명형 질량분석기(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance; FTICR)와 LTQ(Linear Trap Quadrupole) 질량분석기가 결합된 텐덤형 질량분석기를 이용하여 펩타이드 서열을 분석함으로써 미량의 단백질을 동정하였다.In one embodiment of the present invention, the protein bound to the lectin was subjected to in-solution digestion and peptides were extracted by performing in-gel digestion of the proteins separated from the SDS-PAGE gel. . In addition, in one embodiment of the present invention, the peptide obtained as described above is a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FTICR) and a Linear Trap Quadrupole (LTQ) mass spectrometer of a high magnetic field (7-Tesler). Trace proteins were identified by analyzing peptide sequences using a bound tandem mass spectrometer.
본 발명은 리간드가 결합된 렉틴과 상기 리간드에 결합하는 수용체가 결합된 글라이칸 비드를 반응시켜 얻어지는 렉틴-글라이칸 비드에 당단백질을 가하여 반응시키고, 적절한 완충용액으로 세척하고, 각 렉틴과 포집된 단백질의 결합을 끊은 후, 포집된 단백질을 절단하여 얻어진 펩타이드를 질량분석기로 서열분석하는 방법에 관한 것이다. The present invention reacts by adding a glycoprotein to lectin-glycan beads obtained by reacting a ligand-bound lectin with a glycan-bead bound to a receptor that binds to the ligand, washing with an appropriate buffer, and collecting each lectin After cleaving the protein, and the peptide obtained by cleaving the collected protein sequencing by mass spectrometry.
또한 모든 렉틴에 결합하지 않은 단백질들을 SDS-PAGE 겔에서 분리한 후 겔 내부로 트립신을 넣어 분리된 단백질을 절단하여 얻어진 펩타이드를 질량분석기로 서열분석하는 방법에 관한 것이다. The present invention also relates to a method of sequencing a peptide obtained by separating all proteins that do not bind to lectin from an SDS-PAGE gel and inserting trypsin into the gel to cleave the separated protein.
또한, 본 발명은 상기 글라이칸 비드가 아가로스 비드 또는 세파로스 비드인 것을 특징으로 하는, 체액 단백질을 동정하는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for identifying humoral protein, characterized in that the glycan beads are agarose beads or sepharose beads.
또한, 본 발명은 상기 리간드 및 리간드 수용체가 바이오틴 및 아비딘인 것을 특징으로 하는, 체액 단백질을 동정하는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for identifying humoral proteins, wherein said ligand and ligand receptor are biotin and avidin.
본 발명은 정상인의 혈액과 간암 환자의 혈액에 L-PHA-비드 복합체를 가하여 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지의 차이를 보이거나 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지를 보유한 단백질중 양의 차이를 보이는 당단백질을 분석 및 동정하 는 방법에 관한 것이다.In the present invention, L-PHA-bead complex is added to blood of normal human and liver cancer patients to show the difference of sugar chain branch of β1,6 N-acetylglucosamine or the amount of protein having sugar chain branch of β1,6 N-acetylglucosamine. The present invention relates to a method for analyzing and identifying glycoproteins showing differences.
본 발명은 정상인의 혈액과 간암 환자의 혈액에 DSA-비드 복합체를 가하여 폴리락토사민 당쇄 구조 차이를 보이거나 폴리락토사민 당쇄 구조를 보유한 단백질 중 양의 차이를 보이는 당단백질을 분석 및 동정하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for analyzing and identifying glycoproteins showing a difference in polylactosamine sugar chain structure or a positive difference in proteins having a polylactosamine sugar chain structure by adding a DSA-bead complex to blood of a normal person and blood of a liver cancer patient. It is about.
본 발명은 정상인의 혈액과 간암 환자의 혈액에 AAL-비드 복합체를 가하여 중심 퓨코오스 당쇄 구조 차이를 보이거나 중심 퓨코오스 당쇄 구조를 보유한 단백질 중 양의 차이를 보이는 당단백질을 분석 및 동정하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for analyzing and identifying glycoproteins that show a difference in the central fucose sugar chain structure by adding an AAL-bead complex to the blood of a normal person and the blood of liver cancer patients, or a positive difference in a protein having a central fucose sugar chain structure. It is about.
본 발명은 정상인의 혈액과 간암 환자의 혈액에 E-셀렉틴-비드 복합체를 가하여 시알릴 루이스(sialy Lewis) 당쇄 구조 차이를 보이거나 시알릴 루이스 당쇄 구조를 보유한 단백질 중 양의 차이를 보이는 당단백질을 분석 및 동정하는 방법에 관한 것이다. The present invention provides a glycoprotein which shows a difference in the sialyl Lewis sugar chain structure by adding an E-selectin-bead complex to the blood of a normal person and the blood of a liver cancer patient or a positive difference in a protein having a sialyl Lewis sugar chain structure. It relates to a method of analysis and identification.
본 발명은 정상인의 혈액과 간암 환자의 혈액에 Con-A-비드 결합체를 가하여 양의 차이를 보이는 N-형 당단백질을 분석 및 동정하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for analyzing and identifying N-type glycoproteins having a positive difference by adding a Con-A-bead conjugate to blood of a normal person and blood of a liver cancer patient.
본 발명은 정상인의 혈액과 간암 환자의 혈액 단백질 중 상기 렉틴에 결합하지 않는 단백질들에 대하여 SDS-PAGE 겔로 분리한 후 양의 차이를 보이는 단백질을 분석 및 동정하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for analyzing and identifying proteins having a positive difference after separation with a SDS-PAGE gel for proteins that do not bind the lectin among blood proteins of normal people and liver cancer patients.
또한 본 발명은 비록 당단백질은 아니라 할지라도 특정 당단백질과 특이적 또는 비특이적 결합을 함으로써 렉틴-비드 결합체로 포집되어 동정되는 비당단백질들까지도 포함한다.The present invention also includes nonglycoproteins, which are not glycoproteins, but are identified and captured by lectin-bead conjugates by specific or nonspecific binding to specific glycoproteins.
바이오마커를 통안 암의 진단을 위해서는 바이오마커가 비파괴적인 방법으로 쉽게 도달할 수 있는 곳에 위치해 있어야 하기 때문에 혈액과 같은 체액이 가장 가능성 있고 합리적인 시료로 판단된다. 이에 정상인의 혈액과 간암 환자의 혈액을 바이오마커 개발의 시료로 삼았으며 1차로 당단백질을 바이오마커의 대상으로 삼았다. 이는 세포로부터 분비되는 대다수의 단백질이 당단백질이며, 현재 종양 바이오마커로 사용되는 대부분의 단백질들이 당단백질이라는 사실에 근거한다. 하지만 반드시 암 바이오마커가 당단백질일 필요는 없으므로 SDS-PAGE를 통해 비당단백질까지도 그 범위를 확대하였다. In order to diagnose cancer using biomarkers, a fluid such as blood is considered the most likely and reasonable sample because the biomarkers must be located within easy reach of non-destructive methods. The blood of normal and liver cancer patients was used as a sample for biomarker development, and the glycoprotein was the first target for biomarker. This is based on the fact that the majority of proteins secreted from cells are glycoproteins, and most proteins currently used as tumor biomarkers are glycoproteins. However, cancer biomarkers do not necessarily need to be glycoproteins, so SDS-PAGE extends the range to non-glycoproteins.
혈액은 모든 조직 유래 단백질들을 포괄한다는 장점이 있는 반면 알부민과 같은 과상존 단백질과 이소류킨(isoleukin)과 같은 미량 단백질들 간의 농도차이가 심하다. 반면, 지금까지의 수많은 연구 결과에 비추어 보면 유용한 바이오마커들은 미량 단백질군에 포함되어 있을 개연성이 크다. 따라서 혈액의 '고 다이내믹 레인지(high dynamic range)' 특성에 의한 단점을 극복하기 위해 20개의 과상존 단백질을 면역친화컬럼(immuno-affinity column) 등의 방법으로 제거하였으며 남은 단백질들을 여러 종류의 렉틴으로 분획화하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 총 10명의 정상인 혈액과 12명의 간암 환자 혈액을 통하여 단백질의 양적, 질적 차이를 조사하였는데, 과상존 단백질 제거, 단백질 포집 및 분리, 단백질 동정이라는 순서로 진행하였다. 동정된 단백질들을 비교, 분석하여 간암에 대하여 80% 이상 특이도 (specificity)를 보이는 동시에 50% 이상의 민감도 (sensitivity)를 보이는 단백질들을 대상으로 암 관련성 여부를 문헌 조사하여 유용하다고 판단되는 단백질들을 [표 1]과 같이 선별하였다.Blood has the advantage of encompassing all tissue-derived proteins, while the difference in concentration between superconducting proteins, such as albumin, and trace proteins, such as isoleucin. On the other hand, in the light of numerous studies so far, useful biomarkers are likely to be included in the trace protein family. Therefore, in order to overcome the shortcomings caused by the 'high dynamic range' characteristics of the blood, 20 supernatant proteins were removed by an immuno-affinity column or the like. Fractionation. In an embodiment of the present invention, the quantitative and qualitative differences of proteins were examined through a total of 10 normal bloods and 12 hepatic cancer patients, and the procedure of removing supernatant proteins, protein collection and isolation, and protein identification was performed. By comparing and analyzing the identified proteins, we searched for proteins that showed more than 80% specificity and at least 50% sensitivity to liver cancer and searched for cancer-related proteins. 1] were selected.
gi NO.Accession
gi NO.
(%)Sensitivity
(%)
(%)Specificity
(%)
serine 4Transmembrane protease,
위 [표 1]에 명시된 단백질들은 간암 바이오마커군으로서 향후 항체 및 질량분석기를 이용한 검증절차를 거친 후 간암 바이오마커로 확정될 후보단백질이다. 위 간암 바이오마커 단백질들은 단독 또는 여러 후보단백질들과 병행하여 간암의 진단 및 병과 진행, 예측에 이용될 수 있으며, 간암 진단키트에 이용될 수 있다.The proteins listed in Table 1 above are candidates for liver cancer biomarkers, which will be confirmed as liver cancer biomarkers after verification using antibodies and mass spectrometry. Gastric liver cancer biomarker proteins can be used alone or in combination with several candidate proteins to diagnose, progress and predict liver cancer, and can be used in liver cancer diagnostic kits.
무명 단백질 산물(Unnamed protein product) FLJ52590에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.Little is known about the unnamed protein product FLJ52590.
인히빈 베타 E 사슬(Inhibin beta E chain)은 TGF-베타 패밀리의 멤버로 세포막 단백질과 결합하여 신호를 전달하는 단백질 호르몬의 일종이다. 난소암의 경우 특정암에 비특이적인 발현형태를 보이며 상피세포암 및 간질종양에서 발현되는 양상을 보인다. 하지만 그중에서도 난소 간질 종양(gonadal stromal tumor)의 약 96%에서 상기 단백질이 발현된다는 보고가 있다 (Ciris et al., Acta Obstet Gynecol Scand. 83, 491-496, 2004). 또한 악성 유방암세포주에서 과발현되는 것으로 보고되어 있다 (Liang et al., Proteomics 9, 182-193, 2009). Inhibin beta E chain is a member of the TGF-beta family and is a protein hormone that binds to and transmits signals to cell membrane proteins. Ovarian cancer has a nonspecific expression pattern in certain cancers and is expressed in epithelial cell carcinoma and stromal tumor. However, it is reported that the protein is expressed in about 96% of gonadal stromal tumors (Ciris et al., Acta Obstet Gynecol Scand. 83, 491-496, 2004). It has also been reported to be overexpressed in malignant breast cancer cell lines (Liang et al.,
세르핀(Serpin) B4는 SCCA2(squamous-cell carcinoma antigen 2)라고도 불리며 주로 키모트립신계 세린 단백질 분해효소의 저해단백질이다. 정상 세포에서는 주로 세포질에 존재하지만 편평세포암(squamous-cell carcinomas)의 경우 세포 밖으로 흘러나와 혈액에 존재한다는 보고가 있다 (Uemura et al. Int. J. Cancer 89, 368-377, 2000).Serpin B4, also called squa-cell carcinoma antigen 2 (SCCA2), is an inhibitory protein of chymotrypsin-based serine proteases. In normal cells, mainly in the cytoplasm, squamous-cell carcinomas have been reported to flow out of the cells and in the blood (Uemura et al. Int. J. Cancer 89, 368-377, 2000).
짧은 구개, 폐 및 비강 상피암-관련 단백질 2(Short palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associated protein 2)는 침샘암에서 발현이 증가하는 것으로 보고되어 있다 (Vargas et al., Oral Dis. 14, 613-619, 2008).Short palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associated
메탈로리덕테이즈(Metalloreductase) STEAP2는 전립선의 6-트랜스멤브레인 상피 항체 2(Six-transmembrane epithelial antigen of prostate 2)라고도 불리며 특히 전립선암에서 과발현되는 것으로 보고되어 있다 (Korkmaz et al., J. Biol. Chem. 277, 36689-36696, 2002).Metalloreductase STEAP2, also called 6-transmembrane epithelial antigen of
트랜스멤브레인 단백질분해효소, 세린 4(Transmembrane protease, serine 4)는 단백질 분해효소 작용을 하며, 정상의 위나 비뇨기 계통의 세포에서는 발현이 낮으나 췌장암, 위암, 결장암 등에서 발현하여 전이조직 형성이나 침윤에 관여하는 것으로 보고되어 있다 (Wallrapp et al., Cancer Res. 60, 2602-2606, 2000).Transmembrane protease,
트랜스멤브레인 부고환 단백질 1(Transmembrane epididymal protein 1)에 대해서 암과의 관련된 보고는 존재하지 않는다. 하지만 많은 바이오마커 단백질들이 고환이나 난소와 같은 생식기 계통 조직에서 발현되는 점을 감안할 때 잠재적 가능성이 존재한다고 판단된다.There are no reports of cancer related to Transmembrane
콘드로렉틴(Chondrolectin)은 성인의 간에서는 발현이 잘 되지 않으나 태아의 간에서 발현되는 것으로 보고되어 있다 (Weng et al., Genomics 80, 62-70). 이러한 발현의 양상은 알파태아단백질의 경우와 비슷한 양상을 띠어 바이오마커로서의 잠재적 가능성이 존재한다고 판단된다.Chondrlectin is not well expressed in adult liver but has been reported to be expressed in fetal liver (Weng et al., Genomics 80, 62-70). This pattern of expression is similar to that of alpha-fetoprotein, suggesting the potential of biomarkers.
이상의 단백질들은 암과 관련이 있다고 보고된 것도 있으나, 암과 관련되었다는 연구결과에서도 그 단백질의 당질화에 대한 보고는 없었다. 따라서, 상기 단백질들에 대하여 당단백질로서 당질 변화를 탐지하여 간암 진단 마커로서 유용성을 규명한 본 발명은 신규성과 진보성을 갖춘 발명이라 하겠다.Although these proteins have been reported to be associated with cancer, studies showing that they have been associated with cancer have not reported the glycosylation of the protein. Therefore, the present invention, which detects the glycemic changes as glycoproteins and finds the usefulness as a diagnostic marker for liver cancer, is a novel and advanced invention.
본 발명의 진단키트는 상기 단백질의 발현을 정량 분석 또는 정성 분석하거나, N-연결형 당쇄 변화인 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄 가지 변화를 측정하며, 상기 분석을 위하여 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질에 대한 항체를 제조하여 표면에 코팅시킨 96 웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 ELISA를 수행하도록 상기 진단키트를 제공할 수 있다.The diagnostic kit of the present invention quantitatively or qualitatively analyzes the expression of the protein, or measures the β-, 6-N-acetylglucosamine sugar chain change, which is an N-linked sugar chain change, and for the analysis, an ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). ) Method can be used. For example, the diagnostic kit may be provided to perform an ELISA using a 96-well microtiter plate or the like prepared with an antibody to the protein and coated on the surface thereof.
본 발명의 진단키트는 상기 단백질에 대한 항체, 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있고, 당쇄 가지 변화를 측정하기 위하여 형광물질이 표지된 2종 이상의 렉틴을 포함한다.The diagnostic kit of the present invention may include an antibody against a protein, a substrate, a suitable buffer, a secondary antibody labeled with a chromophore or a fluorescent substance, a chromogenic substrate, and the like, and a fluorescent substance is labeled to measure the sugar chain change. Two or more lectins.
상기 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline Phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS{2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)} 또는 OPD(o-Phenylenediamine), TMB(Tetramethyl Benzidine) 등이 사용될 수 있다.The substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96 well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96 well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like. Peroxidase, alkaline phosphatase, and the like may be used, and fluorescent materials may be used, such as FITC and RITC, and the colorant substrate solution may be ABTS {2, 2'-Azino-bis (3). -ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) or OPD (o-Phenylenediamine), TMB (Tetramethyl Benzidine) and the like can be used.
또한, 본 발명의 진단키트는 암을 진단하기 위해 생물학적 마이크로 칩을 이용한 자동화된 분석 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 암 발생 및 전이에 관여하여 당쇄 변화를 나타내는 단백질들의 항체를 글래스 슬라이드 등의 표면에 고정화시켜 단백질 칩을 제작하고, 사람의 혈청을 단백질 칩에 도포한 후 결합된 단백질의 당쇄 부분을 렉틴을 사용하여 인식함으로써 당쇄 변화를 동시에 측정하도록 진단키트를 구성할 수 있다. 이와 같은 진단키트는 상기 단백질, 적당한 완충용액 및 렉틴 등을 포함한다.In addition, the diagnostic kit of the present invention may use an automated analysis method using a biological microchip to diagnose cancer. For example, the protein chips are prepared by immobilizing antibodies on proteins that exhibit sugar chain changes in cancer development and metastasis on the surface of a glass slide, etc., applying human serum to the protein chips, and then removing the sugar chain portion of the bound protein. By using lectins to recognize, the diagnostic kit can be configured to measure sugar chain changes simultaneously. Such diagnostic kits include such proteins, suitable buffers and lectins.
LPHA 등의 렉틴은 N-연결형 당구조의 당쇄를 인식하지만 친화크로마토그래피 컬럼으로 제작시 붙은 당쇄를 떼어내는 방법이 없어 2차원 전기영동 후 렉틴 블랏을 수행하는 방법이 통상 이용되어 왔다. 천연의 기질은 극미량이라 사용이 불가능하다. 이 2차원 전기영동 겔에 기초한 렉틴 블랏은 두 가지의 문제를 안고 있다. 첫째, 2차원 전기영동에 펼칠 수 있는 시료량의 한계를 지니고 있으며, 둘째, 중요한 기술인 고민감도 질량분석기의 등장으로 하나의 스팟에서 여러 단백질에 대한 스코어가 나타남으로 인해 진짜 단백질을 선정하는데 어려움이 있다. 이런 문제는 혈액과 같은 체액이 여러 단백질에 대한 높은 양적 범위(dynamic range)를 지니고 있어 겔 전기영동에 이은 렉틴 블럿을 적용할 수 없는 한계를 보인다.Lectins, such as LPHA, recognize sugar chains of N-linked sugar structures, but there is no method of removing the sugar chains attached to the affinity chromatography column, and thus a method of performing lectin blots after two-dimensional electrophoresis has been commonly used. Natural substrates are extremely small and cannot be used. Lectin blots based on this two-dimensional electrophoretic gel present two problems. First, it has a limit of the amount of sample that can be applied to two-dimensional electrophoresis, and second, it is difficult to select a real protein due to the appearance of a high sensitivity mass spectrometer, an important technology, scores for several proteins in one spot. This problem is limited by the application of lectin blots followed by gel electrophoresis, since body fluids such as blood have a high dynamic range for several proteins.
본 발명자들은 우선 간암 환자의 혈청을 확보하고, 건강진단을 받아 건강한 사람으로 판단되는 지원자의 정상 혈청을 확보하였다. 혈청 200㎕를 0.45㎛의 필터에 통과시킨 후 Sigma사에서 제공하는 ProteomPrep 20 plasma immunodepletion LC 컬럼 키트(혈청내 과상존하는 20개의 단백질 제거용 컬럼)를 사용하여 혈액에 과상존(high abundant) 단백질을 키트 사용법에 따라 제거하였다. The present inventors first secured the serum of liver cancer patients and secured normal serum of volunteers judged to be healthy by receiving a medical examination. 200 μl of serum was passed through a 0.45 μm filter and high abundant protein was applied to the blood using a ProteomPrep 20 plasma immunodepletion LC column kit (column for removal of 20 proteins in serum) provided by Sigma. Removed according to kit usage.
이렇게 부분 정제된 단백질 시료에 최종 10mM β-머캡토에탄올을 가하여 환원시킨 후 아이오도아세트아마이드(100mM)를 가하여 상온에서 한 시간 반응시켜 알킬화시켰다. 이 환원, 알킬화의 과정에 관여하는 시약은 렉틴과 당단백질간의 결합에 방해가 되므로 HiPrep 26/10 (GE Healthcare) 염제거 컬럼으로 염을 제거한 후 최종 부피가 1㎖ 되게 농축하였다. 이 단백질 용액을 미리 아비딘-아가로스에 상온에서 한 시간 붙여 비특이적으로 아비딘에 붙는 단백질을 제거하였다. 이어 여기서 나온 단백질을 렉틴-비오틴-아비딘-비드에 반응시켜 4℃에서 밤새 결합시켰다. 이 결합을 떼어내는 기질은 자연에 존재하는 당단백질의 당쇄에 1,6 N-아세틸글루코사민 가지가 부가된 당쇄이므로 거의 얻어낼 수가 없어서 현재까지 알려진 방법은 산성 pH에 의해 물리적으로 떼어내는 방법이 있다. 그러나 낮은 pH에서는 단백질이 분해되거나 또는 비특이적 용출로 인해 동일하게 전체 단백질이 떨어지지 않는 결점을 지니고 있다. 이를 떼어내기 위하여 과량의 PBS로 씻어준 다음, 1배의 SDS-PAGE 로딩 염액(Loading dye)이나 6M 우레아 등의 카오트로픽제(chaotropic agent)를 이용하여 결합을 떼어내었다. SDS-PAGE 로딩 염액을 이용한 경우 이를 SDS-PAGE를 짧게 전개한 후 겔에서 단백질을 잘라내어 젤 내부 소화(in-gel digestion) 방법을 이용하여 트립신 처리하였고(Shevchenko, A. et al "Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels". Anal. Chem., 1996, 68, 850-858), 6M 우레아의 경우 0.6M이 되도록 희석한 후 트립신을 처리하였다. 절단된 펩타이드는 SpeedVac 시스템을 이용하여 동결건조시킨 후 질량분석기를 이용하여 동정하였다. 따라서 본 발명자들은 일련의 과정을 통해 간단하고 신뢰도가 높은 방법을 발명한 것이다. 이 방법을 통해 간암에서 8개의 바이오마커 단백질을 제시함으로써 본 발명을 완성하였다. The final purified protein sample was reduced by adding the final 10 mM β-mercaptoethanol, followed by alkylation by adding iodoacetamide (100 mM) for 1 hour at room temperature. Reagents involved in this reduction and alkylation process interfere with the binding between lectins and glycoproteins. Thus, the salts are removed using a
본 발명은 상기 단백질군 중 1 이상에 대한 각각의 항체가 흡착된 기질; The present invention is a substrate adsorbed to each antibody to one or more of the above protein group;
상기 단백질에 대하여 상기 항체가 인식하는 항원부위와는 다른 항원부위를 인식하는 항체;An antibody that recognizes an antigenic site different from the antigenic site recognized by the antibody to the protein;
리간드가 결합된 N-연결형 당쇄변화 측정용 렉틴 2종 이상; Two or more lectins for measuring a N-linked sugar chain change in which a ligand is bound;
발색 효소, 발광 효소, 발색물질 및 발광물질 중 선택된 1종 이상으로 표지된 2차 항체;Secondary antibodies labeled with at least one selected from chromogenic enzymes, luminescent enzymes, chromogenic materials and luminescent materials;
및 발색 효소, 발광 효소, 발색물질 및 발광물질 중 선택된 1종 이상으로 표지된 상기 리간드의 수용체;를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.And a receptor for the ligand labeled with at least one selected from chromogenic enzymes, luminescent enzymes, chromogenic materials, and luminescent materials.
본 발명은 상기 암이 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암, 췌장암 등의 고형암인 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트를 제공한다.The present invention provides a kit for diagnosing cancer, wherein the cancer is a solid cancer such as colon cancer, stomach cancer, lung cancer, liver cancer, uterine cancer, breast cancer, or pancreatic cancer.
본 발명은 상기 기질이 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐 수지로 합성된 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트를 제공한다.The present invention provides a kit for diagnosing cancer, wherein the substrate is selected from the group consisting of a nitrocellulose membrane, a well plate synthesized with a polyvinyl resin, a well plate synthesized with a polystyrene resin, and a slide glass made of glass.
본 발명은 상기 발색 효소 또는 발광 효소가 퍼옥시데이즈, 알칼라인 포스파테이즈로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트를 제공한다. 상기 발색물질 또는 발광물질은 형광물질 등을 포함한다.The present invention provides a kit for diagnosing cancer, wherein the chromogenic enzyme or luminescent enzyme is selected from the group consisting of peroxidase and alkaline phosphatase. The coloring material or light emitting material includes a fluorescent material and the like.
본 발명은 상기 리간드 및 상기 리간드 수용체가 바이오틴 및 아비딘인 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트를 제공한다.The present invention provides a kit for diagnosing cancer, wherein the ligand and the ligand receptor are biotin and avidin.
본 발명은 발색 또는 발광 기질액을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트를 제공한다.The present invention provides a kit for diagnosing cancer, further comprising a coloring or luminescent substrate solution.
본 발명은 상기 N-연결형 당쇄 변화 측정용 렉틴이 L4-PHA(Phytohemagglutinin-L4), LCA(lens culinaris agglutinin), DSA(Datura stramonium agglutinin), AAL(Aleuria aurantia agglutinin), rhE-셀렉틴, 콘카나발린 A(Concanavalin-A, Con-A), WGA(Wheat germ agglutinin), 자칼린(Jacalin), SNA(Sambucus Nigra) 및 갈렉틴(galectin) 중 선택되는 것임을 특징으로 하는 암 진단용 키트를 제공한다.The present invention is a lectin for measuring the N-linked sugar chain change L 4 -PHA (Phytohemagglutinin-L 4 ), LCA ( lens culinaris agglutinin), DSA ( Datura stramonium agglutinin), AAL ( Aleuria aurantia agglutinin), rhE-selectin, cone Provided is a cancer diagnostic kit characterized in that the selected from Cancanallin A (Concanavalin-A, Con-A), WGA (Wheat germ agglutinin), Waka (Jacalin), SNA (Sambucus Nigra) and galectin (galectin) .
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, this invention is demonstrated in detail based on an Example. However, the following examples are merely to illustrate the invention, it is apparent to those skilled in the art that the contents of the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> 면역친화컬럼을 이용한 과상존 단백질 제거Example 1 Removal of Hyperphase Protein Using Immunoaffinity Column
정상 및 환자의 혈청을 0.45㎛ 주사기 필터로 통과시킨 후 얻어진 혈액 200㎕를 면역제거컬럼 (ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion LC column; Sigma)에 부하하여 부분 정제하였다. 도 2와 같이, 알부민을 비롯한 과상존 20종의 단백질은 면역제거컬럼에 흡착되어 용출용액을 흘려주고 난 뒤에 용출된다. 따라서 과상존 단백질이 제거된 시료는 머무름 시간상으로 앞부분에서 흘러나오게 된다. 이렇게 부분 정제된 시료에는 여전히 과상존 단백질이 부분 함유되어 있으므로 면역제거컬럼을 1회 이상 반복 수행하였다. 도 2의 하단은 2회 반복 면역제거컬럼 수행으로 미량의 과상존 단백질까지도 제거된 시료의 크로마토그램이다. 이때 평형 및 전개시 사용된 완충용액은 인산완충액 생리식염수(phosphate buffered saline)이고, 용출용액은 0.1M 글라이신-HCL, pH 2.5, 옥틸 β-D-글루코피라노사이드(Octyl β-D-glucopyranoside)이다. 평형화 및 전개과정의 유속은 0.3㎖/min이고 용출과정의 유속은 3㎖/min이었다. 과상존 단백질이 제거된 단백질 시료는 농축용 필터 (M.W. Cutoff: 5,000 Da; Millipore)를 사용하여 1~3㎖ 부피로 농축시켰다. 농축된 혈청 단백질 시료에 베타-머캡토에탄올 (최종농도 1%, v/v)을 가하여 37℃에서 30분 방치하여 단백질을 환원시킨 후, 요오드아세트아마이드 (최종농도 50mM)를 가하여 암소에서 1시간 동안 반응시켜 단백질 알킬화를 진행하였다. 염 제거 컬럼을 이용하여 반응 후 남은 베타-머캡토에탄올과 요오드아세트아마이드를 제거하였다. 염이 제거된 단백질 시료를 농축용 필터를 사용하여 1㎎/㎖로 농축하였다.Normal and patient serum was passed through a 0.45 μm syringe filter, and 200 μl of the obtained blood was partially purified by loading onto an immunodepletion column (ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion LC column; Sigma). As shown in Figure 2, albumin 20 superphase proteins, including albumin is adsorbed in the immune elimination column and eluted after flowing the elution solution. Therefore, the sample from which the excess zone protein is removed flows out in front of the retention time. Since the partially purified sample still contains the excess protein, the immunoremoval column was repeated one or more times. 2 is a chromatogram of a sample in which even a small amount of excess protein was removed by performing two repeated immunoassay columns. At this time, the buffer solution used for equilibration and development was phosphate buffered saline, and the elution solution was 0.1M glycine-HCL, pH 2.5, and octyl β-D-glucopyranoside. to be. The flow rate during equilibration and development was 0.3 ml / min and the flow rate during the elution was 3 ml / min. Protein samples from which the supernatant protein was removed were concentrated to a volume of 1 to 3 ml using a concentration filter (M.W. Cutoff: 5,000 Da; Millipore). Beta-mercaptoethanol (
<실시예 2> 여러 렉틴을 이용한 순차적 당단백질 포집 및 절단Example 2 Sequential Glycoprotein Capture and Cleavage Using Multiple Lectins
바이오틴이 결합된 L4-PHA(Phytohemagglutinin-L4)와 스트렙타비딘 비드를 반응시켜 L4-PHA-비드 복합체를 제조하였다. 실시예 1에서 농축된 시료를 도 3에서 나타낸 바와 같이 5종의 렉틴을 사용하여 단백질을 포획하고 분획화하였다. 우선 1㎖의 시료를 바이오틴이 결합된 L4-PHA(Phytohemagglutinin-L4)와 스트렙타비딘 비드를 반응시켜 얻은 L4-PHA-비드 복합체와 반응시켰다. 시료를 원심분리하여 포획된 단백질과 L4-PHA-비드 복합체로부터 단백질 시료를 분리한 후, L4-PHA에 결합되지 않은 단백질을 위와 유사한 방법으로 얻은 DSA(Datura stramonium agglutinin)-비드 복합체와 반응시켰다. DSA와의 반응에 참여하지 않은 단백질들은 AAL(Aleuria aurantia agglutinin)-비드와 반응시키고, 마찬가지로 반응하지 않은 단백질 시료를 E-셀렉틴-비드와 Con A(Concanavalin A)-비드를 이용하여 순차적으로 반응시켰다. 위 반응은 모두 4℃에서 밤새 이루어졌으며 완충용액은 PBS이며 필요할 경우 1mM CaCl2를 첨가해 주었다. 각 단계에서 렉틴에 결합된 단백질들은 원심분리를 하여 단백질 시료로부터 분리하였으며, 비드에 결합된 단백질들은 PBS로 3회 세척하였다. 그 후 6M 유레아 용액 50㎖에 넣어 결합된 단백질들을 렉틴-비드로부터 분리시켰다. 3,000×g에서 5분간 원심분리하여 렉틴-비드를 제거한 후 유레아 용액에서 변성된 단백질들을 0.5㎖로 10배 희석하였다. 이때 완충용액은 50mM NaHCO3이며 1mM CaCl2이 첨가되었다. 여기에 5㎍의 트립신을 넣은 후 37℃에서 밤새 반응시켜 단백질을 절단하였다. 반응 후 단백질 용액을 동결건조시켰다. Biotin-coupled L 4 -PHA (Phytohemagglutinin-L 4 ) and streptavidin beads were reacted to prepare an L 4 -PHA-bead complex. The concentrated sample in Example 1 was used to capture and fractionate proteins using five lectins as shown in FIG. 3. First, 1 ml of sample was reacted with L 4 -PHA-bead complex obtained by reacting biotin-coupled L 4 -PHA (Phytohemagglutinin-L 4 ) with streptavidin beads. After removing the sample centrifuged to remove the protein sample from the captured protein, and L 4 -PHA- bead complexes, DSA unbound protein to L 4 -PHA obtained by the above similar method (Datura stramonium agglutinin) - bead complex and the reaction I was. Proteins that did not participate in the reaction with DSA were reacted with Aleuria aurantia agglutinin (AAL) -beads , and similarly, unreacted protein samples were sequentially reacted with E-selectin-beads and Con A (Concanavalin A) -beads. All of the above reactions were carried out overnight at 4 ° C. The buffer solution was PBS and 1 mM CaCl 2 was added if necessary. At each step, the proteins bound to the lectin were separated from the protein samples by centrifugation, and the proteins bound to the beads were washed three times with PBS. The bound proteins were then separated from lectin-beads in 50 ml of 6M urea solution. After removing lectin-beads by centrifugation at 3,000 × g for 5 minutes, the denatured proteins in urea solution were diluted 10-fold to 0.5 ml. At this time, the buffer solution was 50 mM NaHCO 3 and 1 mM CaCl 2 was added. 5 μg of trypsin was added thereto, followed by reaction at 37 ° C. overnight to cleave the protein. The protein solution was lyophilized after the reaction.
<실시예 3> SDS-PAGE를 통한 잔여 단백질의 분리 및 절단Example 3 Isolation and Cleavage of Residual Protein via SDS-PAGE
우선 신체 일부에서 유래하는 케라틴 및 기타 단백질의 혼입을 막기 위해 전기영동장치를 아세트산으로 세척하였다. 그 후 실시예 2에서 5종류의 렉틴에 결합하지 않은 단백질 시료를 농축용 필터로 농축한 후 8% SDS-PAGE 겔에서 분리시켰다. 분리된 단백질은 도 4와 같이 단백질 사이즈 마커를 기준으로 95kDa이상, 95~55kDa, 34~55kDa, 34kDa 이하의 네 부분으로 나눠 겔을 절단하였다. 각 부분의 겔을 깨끗이 세척한 칼로 1x1x1 (mm)의 크기로 잘라낸 후 증류수로 3회 세척하였다. 그 후 10 mM 베타-머캡토에탄올 용액에서 환원시킨 후 50mM 요오드아세트아마이드 용액에서 알킬화시켰다. 다시 증류수 용액으로 세척한 후 진공 상태에서 수분을 모두 말렸다. 말려진 겔에 10㎍의 트립신과 1mM CaCl2를 넣은 후 37℃에서 밤새 반응시켜 단백질을 절단하였다. 반응이 끝난 후 겔 외부에 있는 용액을 취하고 겔 내부에 있는 펩타이드를 증류수를 넣고 1시간 동안 흔들어주면서 겔 밖으로 용출시켰다. 이 과정을 2회 반복하였으며 마지막으로 아세토나이트릴 용액을 넣어 잔여 펩타이드의 회수율을 높였다. 용출된 펩타이드 용액을 모두 합친 후 동결건조시켰다. First, the electrophoresis apparatus was washed with acetic acid to prevent the incorporation of keratin and other proteins from body parts. Then, in Example 2, the protein samples not bound to the five lectins were concentrated with a concentration filter and separated on an 8% SDS-PAGE gel. The separated protein was cleaved into four parts of 95kDa or more, 95-55kDa, 34-55kDa, 34kDa or less based on the protein size marker as shown in FIG. The gel of each portion was cut out to a size of 1 × 1 × 1 (mm) with a clean knife and washed three times with distilled water. It was then reduced in 10 mM beta-mercaptoethanol solution and then alkylated in 50 mM iodineacetamide solution. After washing again with distilled water solution, all moisture was dried under vacuum. 10 μg of trypsin and 1 mM CaCl 2 were added to the dried gel, and then reacted at 37 ° C. overnight to cleave the protein. After the reaction, the solution was taken from the outside of the gel, and the peptide inside the gel was added to distilled water and eluted out of the gel while shaking for 1 hour. This process was repeated twice and finally acetonitrile solution was added to increase the recovery of residual peptide. All the eluted peptide solutions were combined and then lyophilized.
<실시예 4> 질량분석기를 이용한 펩타이드 서열분석 및 단백질 동정Example 4 Peptide Sequencing and Protein Identification Using Mass Spectrometry
실시예 2와 실시예 3에서 동결건조 후 얻은 펩타이드 시료를 10㎕의 아세토나이트릴에 녹였다. 이 중 5㎕를 아질런트 1100 나노플로우 시스템(Agilent Technologies)에 주입하여 분리한 후 연동된 FTICR (7테슬라)-LTQ 질량분석기(Thermo Electron)로 서열 분석하였다. 펩타이드의 결합과 크로마토그래픽 분리는 10㎝의 실리카 emitter(내경 75mm)에 역상 ReproSil-Pur C18-AQ 3m 레진(Ammerbuch-Entringen, 독일)이 충진된 것을 이용하였고 펩타이드의 시료 로딩은 오토샘플러(Surveyor)로 20㎖/min의 속도로 진행시켰고, 펩타이드는 C18(입자크기 5㎜)이 충진된 미세모세관 컬럼(길이 100mm)을 이용하여 분리하였다. 이때 사용한 이동상은 0.1%의 개미산에 0%(A)와 100%(B)의 아세토나이트릴을 각각 다른 구배(15분간 B 5%, 3분간 B 20%, 47분간 B 50%로 올리고 최종 95%로 씻어주었다)를 주어 전개하였다. 용출된 펩타이드는 일렉트로스프레이하여 직접 질량분석기로 유입되었다. 질량분석 소프트웨어는 Xcalibur(Thermo Electron Version 1.4SR1)을 이용, 데이터에 따라 자동으로 MS와 MS/MS를 연동하여 분석하도록 수행하였다. 분석된 서열로부터 Mascot engine (버전, )을 이용하여 단백질을 동정하였다. 이때 이용된 데이타베이스는 IPI_human349 20081008 (74017 sequences; 31156865 residues)이었다. Peptide samples obtained after lyophilization in Examples 2 and 3 were dissolved in 10 μl of acetonitrile. 5 μl of this was injected into an Agilent 1100 Nanoflow System (Agilent Technologies), isolated, and sequenced with an associated FTICR (7 Tesla) -LTQ mass spectrometer (Thermo Electron). Peptide binding and chromatographic separation were performed using a 10 cm silica emitter (75 mm inner diameter) filled with reverse phase ReproSil-Pur C18-AQ 3m resin (Ammerbuch-Entringen, Germany). The process proceeded at a rate of 20 mL / min, and peptides were separated using a microcapillary column (
<실시예 5> 동정된 단백질 비교, 분석Example 5 Comparison and Analysis of Identified Proteins
실시예 4에서 정상혈액과 간암환자의 혈액에서 각각 동정된 단백질들을 Excel (Microsoft) 프로그램을 이용하여 비교, 분석하였다. 이 중 간암의 혈액에서만 동정된 단백질들을 구분하였고, Mascot을 통해 검색된 펩타이드 중 ‘붉은 글씨체(Redbold)’로 검색된 펩타이드를 최소한 1개 이상 포함하는 단백질들을 추출하였다. 또한 추출된 단백질들 중 100%의 특이도(specificity)를 보이고 50% 이상의 민감도(sensitivity)를 보이는 단백질들을 구분하여 표 1의 간암 바이오마커 후보군을 설정함으로써 본 발명을 완성하였다. 이때 특이도는 전체 정상 혈액 중에서 특정단백질이 발견되지 않은 비율이며 민감도는 전체 환자 혈액 중에서 특정단백질이 발견된 비율을 의미한다. 도 5는 동정된 바이오마커 후보군 중에서 ‘메탈로리덕테이즈(Metalloreductase) STEAP2’의 질량분석 결과를 나타내며 모두 간암 환자 혈액 중에서 발견되었다.In Example 4, proteins identified in normal blood and liver cancer patients' blood were compared and analyzed using Excel (Microsoft) program. Among them, proteins identified only in the blood of liver cancer were distinguished, and proteins containing at least one peptide searched in the red font (Redbold) among the peptides searched through Mascot were extracted. In addition, the present invention was completed by setting a liver cancer biomarker candidate group of Table 1 by distinguishing proteins showing specificity of 100% and showing sensitivity of 50% or more among the extracted proteins. In this case, the specificity is the ratio of the specific protein not found in the whole normal blood, and the sensitivity means the ratio of the specific protein found in the whole patient blood. FIG. 5 shows the mass spectrometry results of 'Metalloreductase STEAP2' among the identified biomarker candidate groups, all of which were found in the blood of liver cancer patients.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의하여 정상 및 간암 혈액을 다양한 렉틴과 SDS-PAGE로 분리하여 단백질을 동정하는 과정에 대한 순서도이다. 1 is a flowchart illustrating a process for identifying proteins by separating normal and liver cancer blood into various lectins and SDS-PAGE according to one embodiment of the present invention.
도 2는 실시예 1에서 2차례에 걸쳐 혈액 과상존 상위 20종의 단백질이 면역제거컬럼에서 제거되는 크로마토그램을 나타낸 것이다. 상측은 1회 면역제거컬럼을 실시한 시료의 크로마토그램이고, 하측은 2회 면역제거컬럼을 실시한 시료의 크로마토그램이다.FIG. 2 shows a chromatogram in which the top 20 proteins in the blood hyperphase were removed from the immunoassay column over two times in Example 1. FIG. The upper side is a chromatogram of a sample subjected to one immunoremission column, and the lower side is a chromatogram of a sample subjected to two immunoremission column.
도 3은 실시예 2에서 사용된 5종의 렉틴과 각 렉틴이 인식하는 당구조를 도식화한 것이다. Figure 3 is a schematic of the five lectins used in Example 2 and the sugar structure recognized by each lectin.
도 4는 실시예 3에서 SDS-PAGE 겔이 4부분으로 구분되어진 단백질의 분자량 범위와 각 부분에 위치한 단백질들이 곧바로 젤내 절단(in-gel digestion)을 통해 단백질이 동정되는 과정을 나타낸 것이다. Figure 4 shows the protein molecular weight range of the SDS-PAGE gel divided into four parts in Example 3 and the proteins located in each portion of the protein is directly identified through in-gel digestion (in-gel digestion).
도 5는 동정된 단백질들 중 ‘메탈로리덕테이즈 STEAP2’에 대하여 질량분석기를 통해 분석된 펩타이드의 서열로부터 검색엔진을 통해 동정된 결과를 예시한 것이다.Figure 5 illustrates the results identified through a search engine from the sequence of peptides analyzed by mass spectrometry for the 'metallureductase STEAP2' among the identified proteins.
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Cited By (3)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPH0718875B2 (en) | 1987-06-19 | 1995-03-06 | ヤマサ醤油株式会社 | Method for measuring trace substance content in blood or body fluids |
| KR100475642B1 (en) | 2001-12-29 | 2005-03-10 | 한국생명공학연구원 | A method for the diagnosis of cancers by measuring the changes of glycosylation of proteins related to tumorigenesis and metastasis and kit for diagnosis of cancers using the same |
| WO2004113571A2 (en) | 2003-06-26 | 2004-12-29 | Exonhit Therapeutics Sa | Prostate specific genes and the use thereof as targets for prostate cancer therapy and diagnosis |
-
2009
- 2009-10-09 KR KR1020090095940A patent/KR101207797B1/en active IP Right Grant
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190014785A (en) | 2017-08-03 | 2019-02-13 | 동국대학교 경주캠퍼스 산학협력단 | Screening method of cancer therapeutic composition using N-acetylglucosamine kinase |
| CN107782897A (en) * | 2017-10-09 | 2018-03-09 | 广东医科大学 | Markers for breast cancer |
| CN107782896A (en) * | 2017-10-09 | 2018-03-09 | 广东医科大学 | Markers for breast cancer |
| CN107782897B (en) * | 2017-10-09 | 2020-03-17 | 广东医科大学 | Markers for breast cancer |
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