KR101814744B1

KR101814744B1 - 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법

Info

Publication number: KR101814744B1
Application number: KR1020160139335A
Authority: KR
Inventors: 장애라; 김동욱; 김정수; 김한나; 이신영
Original assignee: 천유화장품(주)
Priority date: 2016-10-25
Filing date: 2016-10-25
Publication date: 2018-01-03

Abstract

개시된 내용은 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 당나귀 껍질을 전처리하는 원료전처리단계, 상기 원료전처리단계를 통해 전처리된 당나귀 껍질을 물과 혼합하고 고온고압을 가하여 콜라겐을 추출하고 여과하는 콜라겐추출여과단계, 상기 콜라겐추출여과단계를 통해 추출 및 여과된 콜라겐에 단백질분해효소를 혼합하여 콜라겐을 분해하는 콜라겐분해단계, 상기 콜라겐분해단계를 통해 분해된 콜라겐 분해물에 함유된 효소를 불활성화하는 효소불활성화단계 및 상기 효소불활성화단계를 통해 효소가 불활성화된 콜라겐 분해물을 여과하는 여과단계로 이루어진다.
상기의 과정을 통해 제조되는 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물은 알칼리나 산처리과정을 거치지 않아 피부자극이 적고, 우수한 피부노화 방지 및 주름 개선 효과를 나타낸다.

Description

당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법 {MANUFACTURING METHOD OF COMPOSITION FOR INHIBITING SKIN AGING USING DONKEY SKIN}

개시된 내용은 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 알칼리나 산처리과정을 거치지 않아 피부자극이 적고, 우수한 피부노화 방지 및 주름 개선 효과를 나타내는 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

한국의 65세 이상 노인의 수는 해마다 지속적으로 증가하고 있으며, 2050년에는 전체인구의 37%가 노인인구로 편입될 것으로 예상되는데, 이는 다른 나라에 비해 노인인구의 비율이 매우 높은 상태다. 따라서, 젊은 층뿐만 아니라 노령층의 피부노화에 대한 관심이 높아질 것으로 예상되며, 보다 넓은 범위의 소비자층에서 피부노화에 대한 대비책이 요구되고 있다.

피부 노화의 원인은 외재적 요인과 내재적 요인으로 나누어 구분할 수 있는데, 외재적 요인으로는 일상생활 방식 인자로 예를 들어 자외선, 환경오염, 흡연 및 스트레스 등이 있으며, 내재적 요인으로는 나이 및 유전적 요인 등이 있다. 이 때, 노화 원인에 대한 유력한 매커니즘은 자외선에 의한 자유라디칼(free radical) 생성을 하는 광노화라 할 수 있다.

특히, 자외선 중 UVB에 의해 DNA의 손상과 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성이 초래되어 피부질환 및 광 노화가 진행되는데, 피부는 비타민 E₁₁, 비타민 C등과 같은 항산화 네트워크로 자유라디칼을 소멸시켜 피부를 보호하지만 오랜 시간이 경과함에 따라 그 기능이 점차 감소하여 피부노화가 진행되는 것이다.

또한, UVB의 노출은 피부 내 콜라겐을 감소하게 하여 주름이 형성되고, 색소 침착 또는 건조하고 거친 피부를 유발하기 때문에, 피부노화 방지를 위해 자유라디칼 생성을 억제할 수 있는 항산화 기능 소재 개발이 요구되며, 콜라게나아제(Collagenase)와 엘라스테이스(Elastase) 억제 기능을 통해 피부 주름과 같은 피부 질환을 억제할 수 있는 소재의 개발이 요구되고 있다.

한국특허등록 제10-1557409호(2015.09.25) 한국특허공개 제10-2012-0063693호(2012.06.18)

개시된 내용은 알칼리나 산처리과정을 거치지 않아 피부자극이 적고, 우수한 피부노화 방지 및 주름 개선 효과를 나타내는 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

하나의 일 실시예로서 이 개시의 내용은 당나귀 껍질을 전처리하는 원료전처리단계, 상기 원료전처리단계를 통해 전처리된 당나귀 껍질을 물과 혼합하고 고온고압을 가하여 콜라겐을 추출하고 여과하는 콜라겐추출여과단계, 상기 콜라겐추출여과단계를 통해 추출 및 여과된 콜라겐에 단백질분해효소를 혼합하여 콜라겐을 분해하는 콜라겐분해단계, 상기 콜라겐분해단계를 통해 분해된 콜라겐 분해물에 함유된 효소를 불활성화하는 효소불활성화단계 및 상기 효소불활성화단계를 통해 효소가 불활성화된 콜라겐 분해물을 여과하는 여과단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법에 대해 기술하고 있다.

바람직하기로는, 상기 콜라겐추출단계는 상기 원료전처리단계를 통해 전처리된 당나귀 껍질 100 중량부를 물 150 내지 250 중량부와 혼합하고 110 내지 130℃의 온도와 1 내지 2kgf/cm²의 압력으로 50 내지 70분 동안 추출 및 여과하는 제1추출여과단계 및 상기 제1추출여과단계를 통해 콜라겐이 추출된 당나귀 껍질 100 중량부를 물 80 내지 120 중량부와 혼합하고 110 내지 130℃의 온도와 1 내지 2kgf/cm²의 압력으로 50 내지 70분 동안 추출 및 여과하는 제2추출여과단계로 이루어질 수 있다.

더 바람직하기로는, 상기 콜라겐분해단계는 상기 콜라겐추출여과단계를 통해 추출 및 여과된 콜라겐 100 중량부에 단백질분해효소 0.05 내지 0.2 중량부를 혼합하고 40 내지 50℃의 온도에서 2 내지 4시간 동안 이루어질 수 있다.

더욱 바람직하기로는, 상기 단백질분해효소는 판크레아제와 알카린프로테아제가 1:1의 중량부로 혼합되어 이루어질 수 있다.

더욱 더 바람직하기로는, 상기 효소불활성화단계는 상기 콜라겐분해단계를 통해 분해된 콜라겐분해물을 85 내지 95℃의 온도로 10 내지 20분 동안 가열하여 이루어질 수 있다.

더욱 더 바람직하기로는, 상기 여과단계는 분자량이 3kDa를 초과하는 성분을 걸러낼 수 있는 맴브레인 필터로 이루어질 수 있다.

이상에서와 같은 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법은 알칼리나 산처리과정을 거치지 않아 피부자극이 적고, 우수한 피부노화 방지 및 주름 개선 효과를 나타내는 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물을 제공하는 효과를 나타낸다.

도 1은 개시된 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법을 나타낸 순서도이다.
도 2 내지 도 5는 실시예 1을 통해 제조된 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 항산화 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6 내지 도 7은 실시예 1을 통해 제조된 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 주름개선 효과를 측정하여 나타낸 그래프이다.

이하에는, 본 발명의 바람직한 실시예와 각 성분의 물성을 상세하게 설명하되, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세하게 설명하기 위한 것이지, 이로 인해 본 발명의 기술적인 사상 및 범주가 한정되는 것을 의미하지는 않는다.

개시된 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법은 당나귀 껍질을 전처리하는 원료전처리단계(S101), 상기 원료전처리단계(S101)를 통해 전처리된 당나귀 껍질을 물과 혼합하고 고온고압을 가하여 콜라겐을 추출하고 여과하는 콜라겐추출여과단계(S103), 상기 콜라겐추출여과단계(S103)를 통해 추출 및 여과된 콜라겐에 단백질분해효소를 혼합하여 콜라겐을 분해하는 콜라겐분해단계(S105), 상기 콜라겐분해단계(S105)를 통해 분해된 콜라겐 분해물에 함유된 효소를 불활성화하는 효소불활성화단계(S107) 및 상기 효소불활성화단계(S107)를 통해 효소가 불활성화된 콜라겐 분해물을 여과하는 여과단계(S109)로 이루어진다.

상기 원료전처리단계(S101)는 당나귀 껍질을 전처리하는 단계로, 당나귀 껍질을 수세 및 가열하고, 지방층을 제거하여 이루어진다.

상기 수세는 당나귀 껍질을 흐르는 물로 수세하여 당나귀 껍질에 잔존하는 털이나 불순물 등을 제거하는 과정이며, 상기 가열은 수세된 당나귀 껍질을 끓는 물에 투입하여 15 내지 25분 동안 가열하는 과정을 통해 당나귀 껍질에 잔존하는 털, 불순물 및 기름층을 제거하는 과정이다.

또한, 상기 지방층의 제거는 당나귀 껍질의 콜라겐층과 지방층의 경계부분을 커팅기 등으로 절단하여 지방층을 콜라겐층으로부터 분리하는 단계로, 지방층이 제거된 후에는 다시 한번 흐르는 물에 수세하는 것이 바람직하다.

상기의 과정을 통해 털, 분순물 및 지방층 등이 제거된 당나귀 껍질은 상기 콜라겐분해단계에서 진행되는 효소분해 과정에서 지방층으로 인한 콜라겐분해를 억제현상이 발생하지 않기 때문에, 높은 수율로 콜라겐 분해물을 수득할 수 있다.

상기 콜라겐추출여과단계(S103)는 상기 원료전처리단계(S101)를 통해 전처리된 당나귀 껍질을 물과 혼합하고 고온고압을 가하여 콜라겐을 추출하고 여과하는 단계로, 더욱 상세하게는 상기 원료전처리단계(S101)를 통해 전처리된 당나귀 껍질 100 중량부를 물 150 내지 250 중량부와 혼합하고 110 내지 130℃의 온도와 1 내지 2kgf/cm²의 압력으로 50 내지 70분 동안 추출 및 여과하는 제1추출여과단계(S103-1) 및 상기 제1추출여과단계(S103-1)를 통해 콜라겐이 1차로 추출된 당나귀 껍질 100 중량부를 물 80 내지 120 중량부와 다시 혼합하고 110 내지 130℃의 온도와 1 내지 2kgf/cm²의 압력으로 50 내지 70분 동안 추출 및 여과하는 제2추출여과단계(S103-2)로 이루어지며, 상기 제1추출여과단계(S103-1) 및 상기 제2추출여과단계(S103-2)를 통해 여과된 추출물은 혼합하여 사용하는데, 상기와 같이 추출과정을 2회에 걸쳐 실시하게 되면, 당나귀의 껍질에 함유된 콜라겐의 추출효율성이 향상된다.

상기 제1추출여과단계(S103-1) 및 상기 제2추출여과단계(S103-2)에서 사용되는 여과장치는 100 내지 200 마이크로미터의 입자를 걸러낼 수 있는 필터를 사용하는 것이 바람직하다.

상기의 과정으로 이루어지는 콜라겐추출여과단계(S103)를 거치면, 당나귀 껍질 추출물에 함유된 콜라겐 성분을 저렴한 비용과 우수한 수율 및 짤은 가공시간 내에 추출할 수 있다.

상기 콜라겐분해단계(S105)는 상기 콜라겐추출여과단계(S103)를 통해 추출 및 여과된 콜라겐에 단백질분해효소를 혼합하여 콜라겐을 분해하는 단계로, 상기 콜라겐추출여과단계(S103)를 통해 추출 및 여과된 콜라겐 100 중량부에 단백질분해효소 0.05 내지 0.2 중량부를 혼합하고 40 내지 50℃의 온도에서 2 내지 4시간 동안 이루어진다.

상기 단백질분해효소의 함량이 0.05 중량부 미만이면, 콜라겐의 분해효율성이 저하되어 3kDa 이하의 저분자 펩타이드 형태의 콜라겐 생성비율이 낮아지고, 상기 단백질분해효소의 함량이 0.2 중량부를 초과하게 되면 콜라겐의 분해효율성은 크게 향상되지 않으면서 제조비용을 증가시키고, 상기 효소불활성화단계(S107)의 시간이 길어져 생산성 측면에서도 바람직하지 못하다.

또한, 상기 콜레겐분해단계(S105)에서 설정된 pH는 6.5 내지 7.5인 것이 바람직하며, 상기 콜라겐추출여과단계(S103)를 통해 추출 및 여과된 콜라겐을 단백질 분해 효소로 분해하는 과정을 통해 저분자 펩타이드로 분해된 콜라겐 효소 분해물을 얻을 수 있는데, 콜라겐 효소 분해물에 함유된 저분자 펩타이드의 함량이 높을수록 3kDa 이하 콜라겐 저분자 펩타이드 분해물의 수율을 높일 수 있다.

이때, 상기 단백질분해효소는 판크레아제와 알카린프로테아제가 1:1의 중량부로 혼합되어 이루어지는데, 상기 판크레아제는 돼지 췌장에서 유래한 것을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 알카린프로테아제는 Bacillus licheniformis에서 유래한 Foodpro Alkalin Protease(原Protex 6L)을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 효소불활성화단계(S107)는 상기 콜라겐분해단계(S105)를 통해 분해된 콜라겐 분해물에 함유된 효소를 불활성화하는 단계로, 상기 콜라겐분해단계(S105)를 통해 분해된 콜라겐분해물을 85 내지 95℃의 온도로 10 내지 20분 동안 가열하여 이루어진다.

상기의 온도와 시간 동안 가열된 콜라겐 분해물에 함유되어 있는 단백질 효소는 불활성화가 진행된다.

상기 여과단계(S109)는 상기 효소불활성화단계(S107)를 통해 효소가 불활성화된 콜라겐 분해물을 여과하는 단계로, 상기 효소불활성화단계(S107)를 통해 효소가 불활성화된 콜라겐 분해물을 분자량이 3kDa를 초과하는 성분을 걸러낼 수 있는 맴브레인 필터로 여과하여, 피부 노화억제 및 주름 개선 효과가 우수한 3kDa 이하의 펩타이드의 형태를 갖는 저분자 콜라겐 분해물의 수율을 높이는 단계다.

상기의 여과단계를 거치면, 3kDa 이하의 펩타이드의 형태를 갖는 저분자 콜라겐 분해물로 이루어진 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조가 완료되며, 상기의 과정을 통해 제조된 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물은 동결건조의 과정을 통해 분말형태로 보관하는 것이 바람직하다.

상기의 과정을 통해 제조되는 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물은 일반적인 화장품의 제형인 크림, 로션, 에센스 및 토너 등과 같은 대부분의 화장품 제형에 적용가능하며, 상기와 같이 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물이 함유된 개시된 크림, 로션, 에센스 및 토너 등의 화장품은 피부노화 방지 및 주름 개선효과를 나타낸다.

이하에서는, 개시된 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법 및 그 제조방법을 통해 제조된 피부노화 억제용 조성물의 물성을 실시예를 들어 설명하기로 한다.

<실시예 1>

당나귀 껍질을 흐르는 찬물에 수세한 후 100℃의 물에 20분 동안 가열하여 이물질(털 및 불순물 등)을 제거하고, 이물질이 제거된 당나귀 껍질에 지방층을 컷팅기로 제거한 후에 흐르는 찬물에 다시 수세한 다음 가로 1센티미처, 세로 0.5 센티미터의 크기로 절단하고, 절단된 당나귀 껍질 100g에 200ml의 물을 혼합하고 고온고압추출기로 121℃의 온도에서 1.5kgf/cm²의 압력으로 1시간 동안 1차 추출하고, 150 마이크로미터 이상의 입자를 여과할 수 있는 필터로 여과하여 1차 추출물을 제조하고, 1차 추출과정을 거친 당나귀 껍질에 여과물 100 중량부에 100ml의 물을 혼합하고 고온고압추출기로 121℃의 온도와 1.5kgf/cm2의 압력으로 1시간 동안 2차 추출하고, 150 마이크로미터 이상의 입자를 여과할 수 있는 필터로 여과한 후에, 상기 1차 추출물과 혼합하여 콜라겐 추출물을 제조하고, 제조된 콜라겐 추출물 100 중량부에 0.1 중량부의 단백질 분해효소{(돼지 판크립신(Pancripsin, 판크레아틴의 제품명, 비전바이오켐)과 푸드프로알칼린프로테아제(Foodpro alkaine protease, 이전 Protax 6L의 제품명, dupont genencor)} 0.1 중량부를 혼합하고, 45℃에서 3시간 동안 효소분해하고, 효소분해된 콜라겐 분해물을 90℃에서 10분간 효소불활성화한 후에, 맴브레인 필터를 이용하여 3kDa 이하의 저분자 효소분해물과 3kDa 초과 효소분해물로 분리하여 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물을 동결건조하여 분말형태로 제조하였다.

상기 실시예 1을 통해 제조된 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 수율, 가수분해도 및 고형분의 함량을 측정하여 아래 표 1에 나타내었다.

[단, 수율(%)={가수분해물 동결건조후 무게(g)/원료무게(g)}×100의 계산법을 이용하였으며, 가수분해도(%)={10% TCA에 용해될 수 있는 sample의 단백질함량/sample 내 존재하는 총 단백질 함량}×100의 계산법을 이용하였으며, 고형분 함량(g/100g)=굴절당도계를 이용하여 측정하였다.]

<표 1>

또한, 상기 실시예 1을 통해 제조된 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 3kDa이하 분말의 수율(%)과 3kDa초과 분말의 수율(%)을 측정하여 아래 표 2에 나타내었다.

[단, 3kDa이하 분말의 수율(%)과 3kDa초과 분말의 수율(%)={맴브레인필터 여과 후 동결건조무게(g)/원료무게(g)}×의 계산법을 이용하였다.]

<표 2>

또한, 상기 실시예 1을 통해 제조된 3kDa 초과 및 이하의 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 항산화 활성을 확인하고자 ORAC(Oxygen radical absorbance capacity)활성을 측정하였다. 당나귀 껍질 내 콜라겐 추출물로부터 추출 된 3kDa 이하의 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물(이하 '분말'이라 함)과 3kDa 초과 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물을 0.1, 0.2, 0.3 mg/ml의 농도로 희석하여 분석하였으며, 표준 시약으로서는 트롤록스(Trolox)를 이용하였다. 블랙 96 웰 플레이트(Black 96 well plate)에 각각의 시료와 표준시약 25㎕(마이크로리터)를 각각 넣고, 80nM 플루오르세인(Fluorescein) 150㎕를 각각 넣어 혼합한 뒤, 37℃ 인큐베이트(incubate)에서 15분 동안 방치하였다. 그 후 150mM AAPH(2,2'-Azobis(2-Amidinopropane) Dihydrochloride) 25㎕를 넣고 잘 혼합한 후에, 형광분광광도계(Fluorescent microplate reader)를 사용하여 37℃에서 여기 파장(Excitation wavelength) 485nm과 방사 파장(emission wavelength) 520nm에서 60분 동안 1분 간격으로 측정하였다. 그 후, 시료와 표준시약의 AUC(area under the curve)를 측정한 후에 표준시약 농도와 AUC 간의 회귀곡선을 이용하여 ㎛ Trolox equivalent를 측정하여 아래 도 2의 그래프로 나타내었다.

아래 도 2에 나타낸 것처럼, 실험결과 3kDa 이하 분말이 모든 농도에서 3kDa 초과 분말 보다 높은 ORAC 활성을 나타내었다.

또한, 3kDa 이하 분말과 초과분말의 항산화 활성을 확인하고자 ABTS 라디칼 소거활성을 측정하였다. 3kDa 이하 분말과 3kDa 초과 분말을 0.5, 1, 5mg/ml의 농도로 희석하여 분석하였으며, 표준 시약으로서는 트롤록스(Trolox)를 이용하였다. 7mM ABTS 용액 10mL 및 2.45 포타슘 퍼설페이트(Potassium persulphate)용액 10mL를 혼합하고, ABTS⁺라디칼을 만들기 위해 실온에서 16시간 동안 암소 반응을 시켰다. 라디칼이 생성된 용액을 735nm에서 흡광도 값이 0.700±0.002가 되도록 희석하여 ABTS⁺ 용액을 제조하였다. 그 후, 각각의 시료 50㎕를 각각 혼합하여 30℃ 암실에서 30분간 반응시킨 뒤, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 735nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거활성은 트롤록스(Trolox)의 항산화 효과를 나타내는 M Trolox equivlent를 측정하여 아래 도 3의 그래프로 나타내었다.

아래 도 3에 나타낸 것처럼, 실험결과 3kDa 이하 분말은 모든 농도에서 3kDa 초과 분말 보다 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타내었다.

또한, 3kDa 이하 분말 및 3kDa 초과 분말의 항산화 활성을 확인하고자 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다. 3kDa 이하 분말과 3kDa 초과 분말을 5, 10, 20 mg/ml 의 농도로 희석하여 분석하였으며, 표준 시약으로서는 트롤록스(Trolox)를 이용하였다. 96 웰 플레이트(96 well plate)에 각각의 시료와 표준시약 100㎕를 각각 넣고, DPPH 용액 100㎕를 각각 넣어 혼합한 뒤, 암소 상온에서 30분간 반응시킨 다음 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 트롤록스(Trolox)를 표준물질로 하여, (μM) Trolox equivalent를 측정하여 아래 도 4의 그래프로 나타내었다.

아래 도 4에 나타낸 것처럼, 실험결과, 3kDa 이하 분말이 모든 농도에서 3kDa 초과 분말 보다 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다.

또한, 3kDa 이하 분말 및 3kDa 초과 분말의 항산화 활성을 확인하고자 FRAP(Ferric reducing anti-oxidants power)활성을 측정하였다. 3kDa 이하 분말과 3kDa 초과 분말의 유효성분을 5, 10, 20mg/ml의 농도로 희석하여 분석하였으며, 표준 시약으로서는 트롤록스(Trolox)를 이용하였다. 반응용액은 300mM 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 3.6), 40mM HCl에 녹인 10mM TPTZ(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine), 20mM FeCl₃·6H₂O를 각각 10:1:1의 중량부로 혼합하고 37℃의 온도를 유지하면서 사용하였다. 그 후 각각의 시료 및 표준시약 25㎕와 상기 반응 용액 175㎕를 각각 혼합하여 암실에서 5분간 방치한 후, 590nm에서 흡광도를 흑정하였다. FRAP 활성은 표준물질로 사용한 트롤록스(trolox) 농도에 상당하는 (μM) trolox equivalent로 측정하여 아래 도 5에 나타내었다.

아래 도 5에 나타낸 것처럼, 실험결과, 3kDa 이하 분말이 모든 농도에서 3kDa 초과 분말 보다 높은 FRAP 라디칼 소거 활성을 나타내었다.

또한, 3kDa 이하 분말의 피부 주름 개선 효과를 확인하고자 엘라스테이스(elastase) 저해활성을 측정하였다. 시료로서 10, 50, 100, 200, 300 mg/ml의 농도로 고정한 3kDa 이하 분말을 이용하였다. 0.2M Tris-HCl buffer(pH 8) 120㎕, 1.0mM SANA(N-succinyl-(Ala)3-p-nitro anilide) 20㎕, 농도별 시료 100㎕를 각각 넣고, 25℃에서 10분간 배양한 다음, 1 U/mL의 농도인 돼지 췌장으로 분리한 엘라스테이스(Porcine pancreas elastase) 효소를 20㎕ 넣고, 25℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 아래 도 6에 나타내었다. 이때, 양성 대조군으로는 100㎍/mL의 우르솔릭산(ursolic acid)을 이용하였다. 또한, 엘라스테이스 저해활성은 다음과 같은 공식을 이용하였다.

엘라스테이스 저해율(Elastase inhibition activity,%)=[1-{(sample OD-blank OD)/(control OD-blank OD)}×100]

아래 도 6에 나타낸 것처럼, 실험결과, 농도 의존적으로 엘라스테이스 저해활성이 높았으며, 300mg/mL 농도의 3kDa 이하 분말이 가장 높은 엘라스테이스 저해 활성을 나타내었다.

또한, 3kDa 이하 분말의 피부 주름 개선 효과를 확인하고자 콜라게네이스(Collagenase)저해활성을 측정하였다. 시료로서 0.5, 1, 5, 10, 15, 20 mg/ml의 농도로 고정한 3kDa 이하 분말을 이용하였다. 0.3mg/ml 콜라게네이스 발색단(Collagenase Chromophore)기질 0.25mL에 농도별로 시료 0.1mL를 넣고 0.2mg/ml 콜라게네이스(Collagenase) 효소를 0.15mL 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% 시트릭산(Citric acid) 0.5 mL를 넣어 효소반응을 정지시켰다. 그 후, 에틸아세테이트(ethylacetate) 1.5mL를 첨가하여 상등액을 320nm에서 흡광도를 측정하여 아래 도 7에 나타내었다. 콜라게네이스(Collagenase) 저해활성은 다음의 공식을 이용하여 계산하였다.

콜라게네이스 저해율(Collgaenase inhibition activity,%)=[1-{(sample OD-blank OD)/(control OD-blank OD)}×100]

아래 도 7에 나타낸 것처럼, 실험결과, 농도 의존적으로 콜라게네이스(Collagenase) 저해활성이 높게 나타났다. 특히, 20mg/mL 농도의 3kDa 이하 분말이 가장 높은 콜라게네이스 저해 활성을 나타내었다.

상기와 같은 결과로 인해 3kDa 이하 분말은 우수한 피부 노화 억제 효과 및 피부 주름 개선 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

S101 ; 원료전처리단계
S103 ; 콜라겐추출여과단계
S103-1 ; 제1추출여과단계
S103-2 ; 제2추출여과단계
S105 ; 콜라겐분해단계
S107 ; 효소불활성화단계
S109 ; 여과단계

Claims

당나귀 껍질을 전처리하는 원료전처리단계;
상기 원료전처리단계를 통해 전처리된 당나귀 껍질을 물과 혼합하고 고온고압을 가하여 콜라겐을 추출하고 여과하는 콜라겐추출여과단계;
상기 콜라겐추출여과단계를 통해 추출 및 여과된 콜라겐에 단백질분해효소를 혼합하여 콜라겐을 분해하는 콜라겐분해단계;
상기 콜라겐분해단계를 통해 분해된 콜라겐 분해물에 함유된 효소를 불활성화하는 효소불활성화단계; 및
상기 효소불활성화단계를 통해 효소가 불활성화된 콜라겐 분해물을 여과하는 여과단계;로 이루어지며,
상기 콜라겐추출여과단계는 상기 원료전처리단계를 통해 전처리된 당나귀 껍질 100 중량부를 물 150 내지 250 중량부와 혼합하고 110 내지 130℃의 온도와 1 내지 2kgf/cm²의 압력으로 50 내지 70분 동안 추출 및 여과하는 제1추출여과단계; 및
상기 제1추출여과단계를 통해 콜라겐이 추출된 당나귀 껍질 100 중량부를 물 80 내지 120 중량부와 혼합하고 110 내지 130℃의 온도와 1 내지 2kgf/cm²의 압력으로 50 내지 70분 동안 추출 및 여과하는 제2추출여과단계;로 이루어지며,
상기 효소불활성화단계는 상기 콜라겐분해단계를 통해 분해된 콜라겐분해물을 85 내지 95℃의 온도로 10 내지 20분 동안 가열하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법.
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 콜라겐분해단계는 상기 콜라겐추출여과단계를 통해 추출 및 여과된 콜라겐 100 중량부에 단백질분해효소 0.05 내지 0.2 중량부를 혼합하고 40 내지 50℃의 온도에서 2 내지 4시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법.
청구항 1 또는 3에 있어서,
상기 단백질분해효소는 판크레아제와 알카린프로테아제가 1:1의 중량부로 혼합되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법.
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 여과단계는 분자량이 3kDa를 초과하는 성분을 걸러낼 수 있는 맴브레인 필터로 이루어지는 것을 특징으로 하는 당나귀 껍질을 이용한 피부노화 억제용 조성물의 제조방법.