KR101814006B1 - 개똥쑥 추출물을 함유하는 해마신경재생 촉진용 조성물 - Google Patents

개똥쑥 추출물을 함유하는 해마신경재생 촉진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 해마신경재생 촉진용 조성물에 관한 것으로서 개똥쑥(Artemisia annua L) 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 부작용없이 신경 재생을 촉진할 수 있으며 독성이 없으므로 식품의 형태로 섭취할 수 있다.

Description

개똥쑥 추출물을 함유하는 해마신경재생 촉진용 조성물{A composition for impairment of hippocampal neurogenesis comprising artemisia annua L extract}
본 발명은 개똥쑥(Artemisia annua L) 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 해마신경재생을 촉진할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
신경세포와 신경세포간의 연결을 시냅스(synapse)라고 하며, 평균적으로 신경세포 1개는 다른 신경 세포와 약 1000-5000개의 시냅스를 이루며 인간의 뇌에는 적어도 1011개 정도의 신경세포가 있을 것으로 추정된다. 따라서 뇌내에는 적어도 1014개 이상의 무수한 시냅스 연결이 있을 것이며 이 수 많은 신경망을 통해서 인간의 모든 복잡하고 다양한 기능, 즉 사고, 인식, 기억, 학습, 행동과정이 수행되고 있는 것이다.
이러한 많은 시냅스의 연결은 신경세포의 생존에 필수적인 요건이며, 각 신경세포간의 연결에 따른 특수한 기능이 수행되므로써 다양하고 무한한 고차원의 뇌 기능이 인간에게서 표출되게 되는 것이다.
시냅스의 주체인 신경세포의 특징은 특히 중추신경계의 경우 손상을 받으면 재생하기 어려운 것으로 알려져 있다. 따라서 손상신경 조직 또는 아직 확실하게 규명되어 있지 않은 만성퇴행성 질환을 치료할 방법에 대한 발상과 시도들이 다방면에서 이루어지고 있다. 1940년대에 Hamburger와 Levi-Montalcini들이 Chick embryo limb의 분화과정에서 운동신경세포 생존에 결정적인 미지의 물질을 발견하고 그 근거로 제기한 신경성장인자 가설(neurotrophic factor hypothesis)을 바탕으로 NGF(nerve growth factor)가 발견되었고, 그 후에 뇌로부터 유도된 BDNF(brain-derived neurotrophic factor), NT-3(neurotrophic factor-3) 등의 신경성장인자(neurotrophic factor)들이 발견되었다.
아울러 각 분화신경세포 집단의 생존에 어떤 종류의 신경성장인자들의 공급이 필수적인 지에 대해서도 일부 형질전환 동물실험상에서 밝혀져 있다. 물론 신경세포의 생존에는 각종 뉴로트로핀(neurotrophin)들 만이 관여하는 것은 아니고 여러 종류의 싸이토카인(cytokine)들도 참여하고 있음이 밝혀지고 있다. 신경세포의 생존에는 그 외에 또 다른 많은 요인들이 관여하겠지만 뉴로트로핀이나 싸이토카인의 공급이 중단되거나 이 인자들을 받아들이는 수용체들이 세포에서 발현되지 않을 경우에 세포는 사망하게 되고 이러한 인자들이 공급될 때 세포는 생존 할 수 있는 것이다. 신경세포가 죽음에 이르는 형태는 일반 다른 세포의 경우처럼 세포자멸사(apoptosis)와 괴사(necrosis)로 대별된다.
이들은 서로 다른 형태학적, 분자생물학적 특징을 나타낸다. 축색돌기(axon)가 절단되면(axotomy) 세포체가 붙어있는 부분과 시냅스를 형성하고 있던 말단부분이 두 부분으로 분리된다. 축색돌기의 절단은 표적 세포체로부터 공급받는 여러 고유한 단백질 인자의 단절로 인한 시냅스의 변성뿐만 아니라, 축색돌기가 절단된 신경세포에 접촉하고 있는 시냅스들의 대부분이 탈리되는 현상(synaptic detachment)이 일어난다. 즉 재생이 성공적으로 이루어진다면 세포가 생존 할 수 있겠지만 대부분의 신경세포는 이로 인해 결국 세포자멸사의 형태로 사망한다. 사망한 신경세포의 자리는 흔히 말초신경계에서는 신경교세포(glia cell)로, 중추신경계에서는 미세교세포(microglia) 또는 신경별교세포(astrocyte)로 대치되는 과정(synaptic stripping)이 진행된다.
또한 손상의 정도에 따라 여기에 단핵세포(monocyte), 대식세포(macrophage)등의 면역계 세포들이 참여할 수도 있다. 신경세포의 물리적인 손상을 포함하여 급성 신경독성, 급 만성 신경장애, 간질, 치매의 기전은 너무나 많은 방면에서 이론이 제기되고 있지만 이들 질환의 궁극적인 공통무대는 특정 신경 세포들과 그 지지 조직이다. 이 세포들이 수직 및 수평 방향으로 뻗고 있는 수많은 수상돌기들과 축색돌기들의 연결, 이들로 이루어지는 수많은 신경회로의 이상이 신호전달계의 이상을 초래하고 다양한 뇌신경계질환으로 나타나는 것이다.
현재 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트(glutamate)에 반응하는 글루타메이트성 신경회로는 급 만성 뇌신경질환 발병에 가장 주목받고 있는 신경회로이다.
한편, 개똥쑥(Artemisia annua L)은 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 한해살이 풀로 잔잎쑥, 개땅쑥이라고도 한다.
상기 개똥쑥은 풀 전체에 털이 없고 특이한 냄새가 나며, 줄기는 녹색으로 가지가 많이 갈라지고, 잎은 어긋나고 2 내지 3회 가늘게 깃꼴로 깊게 갈라진다. 길이 4 내지 7 cm로, 모양은 바소꼴이고, 겉에 잔털과 선점이 있다. 꽃은 6 내지 9월에 녹황색으로 피며, 작은 두상화가 이삭처럼 달려서 전체가 원추꽃차례를 이룬다.
상기 두상화는 공 모양이고 지름 1.5 cm이며, 총포 조각은 털이 없고 2 내지 3줄로 배열하고, 외포 조각은 긴 타원형으로 녹색이다. 열매는 수과로 길이 약 0.7 mm이다.
상기 개똥쑥은 한방에서 발열 감기, 학질, 소아경기, 소화불량, 이질 등의 치료에 사용하며, 항말라리아제인 아르테미시닌(artemisinin)의 공급원으로도 알려져 있다.
대한민국 공개특허 제2016-0067029호 대한민국 등록특허 제1511233호
본 발명의 목적은 개똥쑥(Artemisia annua L) 추출물을 유효성분으로 함유하여 해마신경재생을 촉진할 수 있는 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 개똥쑥(Artemisia annua L) 추출물을 유효성분으로 함유하여 해마신경재생을 촉진할 수 있는 식품 조성물을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 해마신경재생 촉진용 약학 조성물은 개똥쑥(Artemisia annua L) 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 개똥쑥 추출물은 개똥쑥과 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매를 1 : 20 내지 50의 중량비로 혼합하여 추출한 것일 수 있다.
상기 혼합용매는 20 내지 80 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액일 수 있다.
상기 약학 조성물은 하위 및 상위 운동뉴런질환, 신경총질환 및 말초신경장애로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 말초신경계질환을 개선 또는 예방할 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 비만으로 저하된 해마신경재생의 촉진을 위한 약학 조성물은 개똥쑥(Artemisia annua L) 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 해마신경재생 촉진용 식품 조성물은 개똥쑥(Artemisia annua L) 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명의 해마신경재생 촉진용 조성물은 개똥쑥(Artemisia annua L) 추출물을 유효성분으로 함유하여 부작용 없이 해마신경재생을 촉진할 수 있으며, 더욱이 독성이 없으므로 식품의 형태로도 섭취할 수 있다.
체내에서 염증 반응의 완화가 뇌 기능에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 해마신경재생 촉진용 조성물이 비만에 투입되면 해마에서 신경세포의 분화를 촉진하고 신경세포의 성숙이 향상되는데, COX-2 발현은 감소하므로 상기와 같은 효과가 COX-2 경로를 통해 얻어지는 것은 아니다.
도 1A는 마우스에 식이를 28일 동안 섭취시켜 변화된 체중을 나타낸 그래프이며, 도 1B는 28일 동안 마우스가 섭취한 식이의 양을 나타낸 그래프이다.
도 2는 마우스에 식이를 28일 동안 섭취시킨 후의 IL-6를 측정한 그래프이다.
도 3A는 마우스에 식이를 28일 동안 섭취시킨 후 항 Iba-1 항체로 염색된 소교세포를 나타낸 사진이며, 상기 도 3B는 상기 도 3A의 염색된 소교세포의 수를 정량화한 그래프이고, 도 3C는 상기 식이군에 대한 COX-2 및 Iba-1 발현을 나타낸 웨스턴 플롯이며, 도 3D는 상기 도 3C의 COX-2 발현을 정량화한 그래프이고, 상기 도 3E는 상기 도 3C의 Iba-1 발현을 정량화한 그래프이다.
도 4A는 식이를 28일 동안 섭취시킨 마우스의 해마에서 신경 모세포(DCX_Blast) 및 DCX 양성세포기관으로 부터의 수상돌기(DCX_Branch)를 나타낸 사진이며, 도 4B는 상기 도 4A의 신경 모세포(DCX_Blast)의 레벨을 나타낸 그래프이고, 도 4C는 상기 도 4A의 수상돌기(DCX_Branch)의 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 5A 및 5B는 식이를 28일 동안 섭취시킨 마우스의 해마균상회에서 신경 모세포 마커 DCX(레드) 및 성숙 신경세포 마커 NeuN(그린)으로 이중 염색한 사진이며, 도 5C 및 5D는 식이를 28일 동안 섭취시킨 마우스의 해마균상회가 BrdU로 표지된 사진이고, 5E 및 5F는 DCX(그린)와 BrdU(레드)가 이중 염색된 사진 이며, 도 5G는 해마에서 BrdU 양성 세포의 수를 나타낸 그래프이고, 도 5H는 과립세포층(GCL)에서 BrdU 양성 세포의 수를 나타낸 그래프이다.
도 6은 대조군 및 실시예 1에서 제조된 개똥쑥 추출물에 처리된 예쁜꼬마선충의 Aβ의 발현에 의해 발생된 마비율을 측정한 그래프이다.
본 발명은 개똥쑥(Artemisia annua L) 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 해마신경재생 촉진용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 해마신경재생 촉진용 조성물은 개똥쑥(Artemisia annua L) 추출물을 유효성분으로 함유한다. 특히, 상기 해마신경재생 촉진용 조성물은 비만으로 유래되어 저하된 해마신경세포의 재생을 촉진시킨다.
상기 개똥쑥(Artemisia annua L)은 항말라리아, 항염증, 항암 및 항비만 활성을 갖는다는 것은 알려져 있으나, 열 스트레스 및 산화 스트레스에 대한 활성을 갖는다는 것은 알려져 있지 않다.
상기 개똥쑥 추출물을 제조하기 위하여, 먼저 개똥쑥을 물에 세척하고 건조한다.
다음으로, 상기 세척된 개똥쑥과 추출용매를 1 : 20 내지 50의 중량비, 바람직하게는 1 : 25 내지 40의 중량비로 혼합하여 50 내지 100 ℃, 바람직하게는 60 내지 90 ℃에서 10분 내지 10시간, 바람직하게는 20 분 내지 3시간 동안 추출하여 추출물을 제조한다.
상기 추출온도가 상기 하한치 미만인 경우에는 개똥쑥의 유효성분이 추출되지 않을 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 개똥쑥의 유효성분이 적은 양으로 추출되고 특히, 1100 ℃이상이면 추출물이 변질될 수 있다.
상기 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매이며, 바람직하게는 물이다. 상기 혼합용매로는 특별히 한정하는 것은 아니지만 20 내지 80%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올을 들 수 있다.
상기 추출시 개똥쑥과 추출용매의 중량비가 벗어나는 경우에는 추출물에 개똥쑥의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.
본 명세서에서 개똥쑥을 언급하면서 사용되는 용어 '추출물'은 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 개똥쑥 추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 개똥쑥의 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 개똥쑥 추출물은 광의로는 개똥쑥을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 개똥쑥의 가공물, 예컨대, 개똥쑥 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 개똥쑥 추출물로 실험을 진행하긴 하였으나, 개똥쑥의 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.
한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 함유하는'이란 개똥쑥 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 개똥쑥 추출물은 10 내지 1500 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 개똥쑥 추출물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 개똥쑥 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 함유하는 해마신경재생 촉진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 개똥쑥 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 개똥쑥 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 상기 개똥쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 해마신경재생 촉진용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 개똥쑥 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 개똥쑥 추출물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 해마신경재생 촉진용 의약 또는 식품의 제조를 위한 개똥쑥 추출물의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 개똥쑥 추출물은 해마신경재생 촉진을 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 개똥쑥 추출물을 투여하는 것을 포함하는 해마신경재생 촉진 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 개똥쑥 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 개똥쑥 추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 개똥쑥 물 추출물(AA)
개똥쑥(Artemisia annua) 40 g과 1.8 L 증류수를 혼합하여 1.5 bar, 80 ℃에서 30분 동안 열수추출한 후 냉각시킨 다음 185 mm 여과지(Advantec, Tokyo, Japan)를 통해 1차 여과하였다. 상기 1차 여과 후 여과물을 0.2 um 병 상단 여과(Nalgene Rapid-Flow Bottle Top Filter, Thermo Scientific, Waltham, USA)를 통해 2차 여과하여 개똥쑥 물 추출물을 제조하였다.
<시험예>
마우스 준비
실험동물은 7주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(평균 중량 23 g) 24마리를 코아텍(KOATECH, Pyeongtaeksi, Korea)으로부터 구입하였다. 실험 시작 전 1주일간 적응시킨 후 12시간 명암주기(light cycle from 7:00-19:00) 하에서 상온(23±1 ℃) 및 60% 습도로 4주간 사육하였다. 본 실험에 사용한 모든 시험물질은 매일 동일한 시간에 경구 투여하였다.
또한, 마우스의 내인성 증식 세포를 표지하기 위하여 4주 동안 5'-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU, Sigma-Aldrich, USA)를 주입하고 28일째 희생되었다. 또한, 실험시작일로부터의 뇌신경재생 효과를 확인하기 위하여, 처음 3일간 12시간 간격으로 5'-bromo-2'-deoxyuridine을 50mg/kg 용량으로 복강 주사하였다.
상기 마우스와 관련된 모든 절차는 순천향대학교의 기관동물관리 및 사용위원회(IACUC approval no. SCH15-0001)의 윤리적 기준에 따라 수행하였다.
-4개 군의 마우스-
A: 일반 식이(2018S; Harlan, USA) + 증류수(DW) 10 ml/kg무게을 혼합한 식이군 6마리; ND/DW
B: 일반 식이(2018S; Harlan, USA) + 실시예 1의 개똥쑥 추출물 0.2 g/kg무게 + 증류수(DW) 10 ml/kg무게을 혼합한 식이군 6마리; ND/AA
C: 고지방 식이(2018S; Harlan, USA) + 증류수(DW) 10 ml/kg무게을 혼합한 식이군 6마리; HD/DW
D: 고지방 식이(2018S; Harlan, USA) + 실시예 1의 개똥쑥 추출물 0.2 g/kg무게 + 증류수(DW) 10 ml/kg무게을 혼합한 식이군 6마리; HD/AA
시험예 1. 체중 측정
도 1A는 마우스에 식이를 28일 동안 섭취시켜 변화된 체중을 나타낸 그래프이며, 도 1B는 28일 동안 마우스가 섭취한 식이의 양을 나타낸 그래프이다.
마우스에 식이를 섭취시킨 28일 동안 일정시각에 체중변화를 측정하였으며, 일정시각에 식이섭취량(식이섭취량=급여량-잔량)을 측정하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 일반 식이를 섭취한 2개의 식이군(ND/DW, ND/AA)은 모두 체중이 증가하지 않았지만, 고지방 식이를 섭취한 2개의 식이군(HD/DW, HD/AA)은 체중이 많이 증가한 것을 확인하였다.
상기 고지방 식이를 섭취한 2개의 식이군 중 실시예 1의 개똥쑥 추출물을 섭취한 HD/AA군은 HD/DW군에 비하여 체중이 적게 증가한 것을 확인하였다.
한편, 상기 4개의 군 모두 섭취량은 비슷하였다.
시험예 2. 혈청에서 인터루킨-6(IL-6) 레벨 측정
도 2는 마우스에 식이를 28일 동안 섭취시킨 후의 IL-6를 측정한 그래프이다.
마우스 희생 후 심장으로부터 수집한 혈액을 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 내 인터루킨-6(IL-6) 농도의 측정은 Mouse IL-6 ELISA Kit (Koma Biotech, Seoul, South Korea) 제품 내 설명서에 따라 진행되었다.
도 2에 도시된 바와 같이, IL-6 레벨은 HD/DW > ND/AA > ND/DW > HD/AA의 순으로 높은 것을 확인하였다. 즉, 고지방 식이 및 실시예 1의 개똥쑥 추출물을 섭취한 HD/AA가 가장 낮은 IL-6 레벨을 나타내므로 실시예 1의 개똥쑥 추출물이 염증성 인자를 크게 감소시키는 것으로 확인하였다.
이는 개똥쑥 추출물이 과잉 지방세포생성을 억제하여 만성 염증 반응을 완화시키는 것을 의미한다. 그러나 이러한 결과가 해마에서는 동일하게 나타나지 않았다.
시험예 3. Iba -1 및 COX-2 측정
도 3A 내지 3E는 실시예에 따라 제조된 개똥쑥 추출물의 경구 투여에 의해 향상된 신경세포 분화 및 신경세포 성숙에 대한 Iba-1 및 COX-2의 염증성 마커 단백질 발현에 대한 것이다. 스케일 바 = 100 um
구체적으로, 도 3A는 마우스에 식이를 28일 동안 섭취시킨 후 항 Iba-1 항체로 염색된 소교세포를 나타낸 사진이며, 상기 도 3B는 상기 도 3A의 염색된 소교세포의 수를 정량화한 그래프이고, 도 3C는 상기 식이군에 대한 COX-2 및 Iba-1 발현을 나타낸 웨스턴 플롯이며, 도 3D는 상기 도 3C의 COX-2 발현을 정량화한 그래프이고, 상기 도 3E는 상기 도 3C의 Iba-1 발현을 정량화한 그래프이다.
시험예 3에서 실험한 면역조직화학을 위하여, -1.46 내지 2.47 mm 사이의 뇌 조직 섹션(해마)에서 브레그마 해부학적 기준으로 측정되었다. 상기 섹션은 Iba-1 (1:1,000; Chemicon, USA)에 대한 특정 1차 항체와 12시간 배양된 후 비오틴이 부착된 2차 항체 및 스트엡타아비딘 퍼옥시다아제 복합체(streptavidin peroxidase complex; Vector Labs, USA)와 배양되었다. 항체 바인딩은 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB; Sigma-Aldrich, USA)로 검출하였다. 모든 그룹에 대한 양성 Iba-1 세포의 수는 기록되었다.
또한, 웨스턴 블롯은 마우스 희생 후 뇌조직을 적출하여 해마부위만 분리하였다. 액체질소에서 상기 해마를 얼린 후 PRO-PREP Protein Extraction Solution(Intron, Seongnamsi, Korea)을 사용하여 단백질을 추출하고, SMARTTM BCA Kit(Intron, Seongnamsi, Kora)를 사용하여 각 단백질들의 농도를 정량하였다. 모든 마우스 해마로부터 추출된 단백질들은 10% SDS-PAGE에서 단백질의 분자량에 따라 전기영동에 의해 분리되었고, 곧바로 PVDF membrane(Bio Rad, Hercules, CA, USA)에 옮겨졌다. 1차 항체 rabbit anti-COX-2(Cayman, MI, USA), rabbit anti-Iba-1(Wako, Osaka, Japan) 그리고 rabbit anti-GAPDH(Cell signaling Technologies, Denver, Massachusetts, USA)를 각각 0.1% TWEEN20-TPS 용액에 희석하였고, 단백질이 포함된 PVDF membrane을 각 항체가 희석된 용액에 담가 하룻밤동안 반응시켰다. 이튿날에 PVDF membrane을 수세한 뒤 2차 항체 peroxidase-labeled anti-rabbit 희석용액에 넣고 반응시켰다. 수세 후 ECL substrate solution (Progma, WI, USA)용액을 뿌려 반응시키고 CheBi (Neoscience, Suwonsi, Korea) 장비를 이용하여 각 마우스 뇌에서의 항체들의 발현을 촬영하였다.
도 3A 내지 3E에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 개똥쑥 추출물이 투여된 ND/AA군 및 HD/AA군의 Iba-1 레벨은 DW를 투여한 군에 비하여 상당히 감소하였으나(도 3A, 3B), 이러한 경향이 웨스턴 블롯(WB)에서는 나타나지 않았다(도 3C).
즉, 상기 양성세포 수는 실시예 1의 개똥쑥 추출물이 투여된 ND/AA군 및 HD/AA군이 ND/DW군 및 HD/DW군 보다 낮았다.
또한, 웨스턴 블롯(WB)에서 고지방 식이를 공급한 HD/AA군 및 HD/DW군이 ND/AA군 및 ND/DW군에 비하여 COX-2 및 Iba-1 발현이 높은 것을 확인하였다(도 3C 내지 3E). 특히, HD/AA군 및 HD/DW군의 COX-2 및 Iba-1 발현이 유사하며, 이러한 결과는 COX-2 및 Iba-1 발현이 개똥쑥 추출물에 의해 감소되지 않았음을 보여준다.
도 3C에 도시된 웨스턴 블롯(WB)의 결과는 해마에서 COX-2 발현이 개똥쑥 추출물에 의해 변화되지 않았음을 의미하며, 이는 개똥쑥 추출물이 COX-2 관련된 경로에 영향을 주지 않고, 다른 신호 경로로 신경세포를 향상시킬 수 있다는 것이다.
체내에서 염증 반응의 완화가 뇌 기능에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다는 것을 의미하지만, COX-2 경로는 개똥쑥 추출물 처리에 따른 신경세포 성숙의 증진을 위해 필수적인 것은 아니다.
시험예 4. 신경 모세포 DCX 염색
도 4A 내지 4C는 식이의 경구 투여에 의한 신경세포 분화 및 해마균상회에서의 DCX 양성 신호에 대한 것이다.
구체적으로, 도 4A는 식이를 28일 동안 섭취시킨 마우스의 해마에서 신경 모세포(DCX_Blast) 및 DCX 양성세포기관으로 부터의 수상돌기(DCX_Branch)를 나타낸 사진이며, 도 4B는 상기 도 4A의 신경 모세포(DCX_Blast)의 레벨을 나타낸 그래프이고, 도 4C는 상기 도 4A의 수상돌기(DCX_Branch)의 레벨을 나타낸 그래프이다. 스케일 바 = 100 um
면역조직화학염색을 이용하여 마우스 해마에서 doublecortin(DCX)를 확인하기 위하여, 마우스 희생 후 0.9% 생리식염수로 혈액을 모두 제거한 뒤 4% 파라포름알데히드 용액으로 관류고정하여 뇌를 적출하였다. 각각의 뇌는 30% sucrose용액에서 충분히 탈수되었고, 30 um의 두께로 동결절편하여 동결절편 보존용액(cryoprotectant)에 담가 -25 ℃에 보관하였다. 이후 박절된 뇌절편을 0.3% H2O2용액과 normal rabbit serum과 반응시켜 비특이적 반응이 제거하였고 goat anti-DCX (Santa Cruz Biotechnology, USA) 1차 항체와 rabbit anti-goat (Vector Labs, USA) 2차 항체에 차례로 반응시켰다. 3,3'-diaminobenxidine tetrahydrochloride (DAB, Sigma-Aldirich, USA)로 항체를 발색시켰으며, 해마에서 DCX 항체에 반응한 세포들의 가지들을 현미경으로 확인하였다. 각 조직 슬라이드마다 해마의 치상회(dentate gyrus) 부분에 일정한 구역을 설정하여 구역 내 2차, 3차, 4차 가지의 개수에 따라 점수를 부과하였고 뇌신경재생 효과를 판정하였다.
DCX 면역 반응은 신경세포 분화 및 신경 모세포의 존재를 나타내며, DAB 색원체(chromogen)에 의한 DCX 양성 신호는 해마균상회에서 나타난다.
도 4A 내지 4C에 도시된 바와 같이, 신경 모세포로서 DCX-양성 세포체 또는 DCX_Blasts의 수는 해마균상회의 과립하 지역(SGZ)에서 카운트되며(도 4A, 4B), 신경 모세포로부터 DCX 양성 수상돌기는 해마균상회에서 과립 세포층(GCL) 및 분자층(ML)에서 카운트된다(도 4A, 4C).
상기 DCX_Blast 및 DCX_Branch 레벨은 DW 투여된 군에 비하여 개똥쑥 추출물이 투여된 군에서 증가하였으며, 해마균상회에서 DCX_Blast 및 DCX_Branch 그룹에서 ND/DW군이 및 ND/AA군 보다 레벨이 낮았다. 또한, DCX_Branch에서 HD/DW군이 HD/AA군 보다 레벨이 낮았다(***, P<0.005).
즉, 고지방 식이군에서 상기 신경 모세포의 수는 개똥쑥 추출물의 투입으로 변화하지 않았으나, 신경 모세포에 따른 신경세포 수상돌기(2차 및 3차 수상돌기)는 HD/DW 군에 비하여 HD/AA 군에서 약간 높아진 것을 확인하였다.
시험예 5. 해마균상회에서 DCX , NeuN 및 BrdU -양성 신경세포 측정
도 5A 내지 도 5H는 식이의 경구 투여에 의한 신경세포 성숙 및 신경 모세포의 수에 대한 것이다.
구체적으로, 도 5A 및 5B는 식이를 28일 동안 섭취시킨 마우스의 해마균상회에서 신경 모세포 마커 DCX(레드) 및 성숙 신경세포 마커 NeuN(그린)으로 이중 염색한 사진이며, 도 5C 및 5D는 식이를 28일 동안 섭취시킨 마우스의 해마균상회가 BrdU로 표지된 사진이고, 5E 및 5F는 DCX(그린)와 BrdU(레드)가 이중 염색된 사진 이며, 도 5G는 해마에서 BrdU 양성 세포의 수를 나타낸 그래프이고, 도 5H는 과립세포층(GCL)에서 BrdU 양성 세포의 수를 나타낸 그래프이다. 스케일 바 = 100 um. 상기 5B, 5D, 5F는 각각 5A, 5C, 5E의 흰색 박스 부분을 확대한 사진이다.
이중 면역형광염색(double immunofluorescence)을 이용한 마우스 해마에서의 NeuN, DCX의 확인은 30 um로 동결절편된 뇌조직을 normal donkey serum에 반응시켜 비특이적 반응을 제거하고, neuroblast 마커인 goat anti-DCX 1차 항체와 성숙한 신경세포의 마커인 rabbit anti-NeuN (Millipore, CA, USA) 1차 항체에 하룻밤동안 반응시켰다. 이어서 각 1차 항체에 대하여 형광물질이 표지된 Alexa Flour 594 donkey anti-goat IgG (Invitrogen, CA, USA), Alexa 488 donkey anti-rabbit IgG (Invitrogen, CA, USA) 2차 항체에 반응시켰다. 수세 후 뇌 조직을 슬라이드에 올려 Vector Shield media (Vector Labs, USA)로 봉입하였고, 형광필터가 장착된 현미경(Olympus, Japan)으로 해마의 치상회 부위를 관찰하여 Meta Imaging series 7.1 software program (Molecular Devices, CA, USA)으로 촬영하였다.
또한, 이중 면역형광염색(double immunofluorescence)을 이용한 마우스 해마에서의 DCX, BrdU의 확인은 30 um로 동결절편된 뇌 조직을 2XSSC로 수세 후 50% formamide/2SSC 용액에 담가 65 ℃에서 2시간, 2N HCl 용액에 담가 37 ℃에서 30분 반응시켰다. 이후 0.1M boric acid 와 PBS (pH7.4)로 수세한 뒤 normal donkey serum에 반응시켜 비특이적 반응을 제거하였다. Rat anti-BrdU (Santa Cruz Biotechnology, USA), goat anti-DCX 1차 항체를 희석한 용액으로 하룻밤동안 반응시키고 이어 Cy3-conjugated AffiniPure donkey anti-rat IgG (Jackson ImmunoResearch, PA, USA)와 Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG 2차 항체를 희석용액에 반응시켰다. 수세 후 뇌 조직을 슬라이드에 올려 Vector Shield media로 봉입 후, 형광필터가 장착된 현미경으로 해마의 치상회 부위를 관찰하여 Meta Imaging series 7.1 Software program으로 촬영하였다.
도 5A 및 도 5B는 DCX/NeuN로 이중 염색되었으며, DCX로 염색된 양성 세포는 레드로 표시되고 NeuN로 염색된 양성 세포는 그린으로 표시된다. 상기 DCX 양성 세포는 일반적으로 SGZ에서 관찰되는데 ND 및 HD 식이에 개똥쑥 추출물이 처리된 군에서는 치상회(dentate gyrus)의 과립세포층(GCL)에서 관찰되었다(도 5B의 화살표). 개똥쑥 추출물로 처리된 군(ND/AA, HD/AA)은 비처리된 군(ND/DW, HD/DW)에 비하여 DCX 양성 세포가 과립세포층(GCL)으로 많이 이동되었으며, ND군은 HD군보다 분자층(ML)에서 추가 수상돌기로 DCX 양성 세포를 함유하였다.
상기 양성 세포의 수는 개똥쑥 추출물로 처리된 군에서 증가하였다.
한편, HD/DW 군에서 DCX 면역 형광법에 의해 평가된 수상돌기의 길이는 ND/DW 그룹보다 짧았다.
또한, 도 5C 및 도 5D의 데이터를 얻기 위하여 BrdU는 개똥쑥 추출물의 투여 초기에 조직적으로 주입되고, 개똥쑥 추출물로 처리된 그룹(ND/AA, HD/AA), 특히 HD/AA 군에서 BrdU 표지된 세포(레드)가 SGZ 및 GCL 영역에서 확인되었다(도 5D: 화살표). 즉, 개똥쑥 추출물로 처리된 군에서 BrdU 표지된 세포는 SGZ에서 GCL로 이동된다. 이중 표지된 세포는 노란색으로 보인다.
또한, 도 5E 및 5F는 DCX와 BrdU를 이중염색함으로써, 개똥쑥 추출물에 의한 신경세포의 재생과 성숙의 여부와 그 효과 정도를 확인하였다. 개똥쑥 추출물이 처리된 마우스의 치상회에서 DCX로 표지된 세포의 수상돌기가 분지된 수는 DW를 처리한 마우스의 치상회에서보다 많았다. BrdU 양성 세포의 수 역시 개똥쑥 추출물을 처리한 마우스에서 더 많았는데, 이는 특이하게도 GCL 영역에서 더 많이 발견되었다. 이는 마우스에 개똥쑥 추출물을 주입하기 시작한 당일부터 재생된 신경세포가 성숙하여 GCL 영역으로 이동하는 것을 촉진하는 효과가 있었음을 나타낸다.
또한, 도 5G에서 BrdU 양성 세포의 수는 해마균상회에서 측정된다. 해마에서 HD/DW군에 비하여 HD/AA군의 BrdU 양성 세포의 수가 많은 것을 확인하였다.
또한, 도 5H 역시 GCL에서 BrdU 양성 세포의 수가 HD/DW군에 비하여 HD/AA군의 BrdU 양성 세포의 수가 많은 것을 확인하였다.
즉, 고지방 식이의 연속적인 섭취는 해마에서 신경조직발생을 억제하지만 개똥쑥 추출물의 투입으로 고지방 식이의 부정적인 효과가 완화되어 신경세포의 분화를 촉진시킨다.
또한, GCL에서 BrdU 양성 세포의 수 증가는 신경세포 성숙이 더욱 활성화되는 것을 의미하므로 개똥쑥 추출물의 투입이 신경세포 성숙에 영향을 미친다고 판단된다.
시험예 6. 알츠하이머 병(AD) 동물 모델에서 A 억제 효과 관찰
예쁜꼬마선충을 NGM(Nematode Growth Media), 20 ℃에서 배양하였으며, CL4176 L4/young adult 5마리를 새로운 NGM으로 옮겨 paralysis assay를 수행하였다. 15 ℃에서 2시간 동안 알을 낳게 한 뒤 성충은 모두 제거하였으며, 알은 5일간 같은 환경에서 두었다. 이후 age-synchronized 된 성충은 100 uL의 개똥쑥 추출물(실시예 1)이 포함된 NGM, 15 ℃에서 2시간동안 배양되었고, 다음 자손들은 25 ℃ 조건으로 변경하여 amyloid-beta 단백질을 생성하도록 유도되었다. 매 24시간 마다 A에 의해 마비된 예쁜꼬마선충의 마릿수를 세어 점수를 부과하였다. 개똥쑥 추출물이 처리되지 않은 배지에서 배양한 예쁜꼬마선충은 대조군으로서 비교되었다.
AD는 뇌에서 Aβ로 구성된 노쇠한 플라크의 축적과 연관된 퇴행성 신경 질환으로서, 근육에서 인간 Aβ를 발현하는 형질 전환 동물은 마비 표현형을 보여준다. 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)에서 인간 Aβ 유전자의 유도는 AD 동물 모델로 사용된다.
Aβ 이식 유전자에 의해 유도된 마비에 개똥쑥(Artemisia annua) 추출물의 효과를 측정하였다.
도 6은 대조군 및 실시예 1에서 제조된 개똥쑥 추출물에 처리된 예쁜꼬마선충의 Aβ의 발현에 의해 발생된 마비율을 측정한 그래프이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 개똥쑥 추출물로 처리된 예쁜꼬마선충은 대조군에 비하여 근육에서 Aβ의 발현에 의해 발생된 마비가 상당히 억제되는 것을 확인하였다.
상기 결과에 따르면, 개똥쑥 추출물은 뇌 기능 향상 및 항-AD제로서도 역할을 할 수 있는 유망한 조성물이다.
-장치 및 통계
실험적 객관성을 유지하기 위하여 각 실험마다 동일한 조건으로 두 실험자가 수행하였다. 면역조직화학염색 결과의 정량을 위해 마우스 한 마리당 5 군데의 구역이 검사되었으며, 뇌조직절편 내 DCX, BrdU, NeuN의 면역반응은 digital camera (DP71, Olympus, Japan)이 장착된 BX53light microscope (Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 또한 각 그래프마다 mean ± standard error (SE)를 이용하여 유의성을 나타내었다. 각 그룹의 평균 수치를 비교, 평가하기 위해 Bonferroni test와 Duncan's new multiple range test에 따른 이원 분산 분석법과 일원 분산 분석법이 이용되었다.
하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 500 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 300 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 200 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 600 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4 ,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 4 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 과립제의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 기능성 음료의 제조
실시예 1에서 얻은 추출물 분말 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

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  1. 개똥쑥(Artemisia annua L) 물 추출물을 유효성분으로 함유하여 하위 및 상위 운동뉴런질환, 신경총질환 및 말초신경장애로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 말초신경계질환의 개선 또는 예방용 약학 조성물.
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  6. 개똥쑥(Artemisia annua L) 물 추출물을 유효성분으로 함유하여 하위 및 상위 운동뉴런질환, 신경총질환 및 말초신경장애로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 말초신경계질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114668758A (zh) * 2021-05-17 2022-06-28 澳门大学 青蒿素及其衍生物在制备ChAT活性增强剂中的应用

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KR101317320B1 (ko) 2010-09-17 2013-10-11 한국식품연구원 청호 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 학습 능력 증진용 조성물

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