KR101809721B1 - Primers for Detecting Avian Influenza Virus Hemagglutinin Subtype and Uses Thereof - Google Patents

Abstract

본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(hemagglutinin) 아형 검출용 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 조류 인플루엔자 바이러스(Avian Influenza Virus) 검출용 프라이머 세트, 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물, 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 키트 및 조류 인플루엔자 바이러스 검출 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 한 번의 RT-PCR만으로 조류 인플루엔자 바이러스 A형 자체뿐만 아니라 상기 바이러스의 각 아형에 대한 감염을 간편하고 용이할 뿐만 아니라 우수한 민감도로 동시 판정할 수 있으며, 다중튜브의 방식을 이용하여 반응 산물에 의한 교차오염을 방지하여 위양성/위음성 시그널 발생 문제를 해결할 수 있다.More particularly, the present invention relates to a primer set for detecting Avian Influenza Virus, a composition for detecting avian influenza virus, avian influenza virus (hereinafter referred to as " avian influenza virus "), A detection kit and a method for detecting avian influenza virus. According to the present invention, not only the avian influenza virus A type itself but also the infection of each subtype of the virus can be simultaneously and easily determined with excellent sensitivity even by a single RT-PCR, It is possible to prevent cross contamination by reaction products and solve the problem of false positive / false negative signal generation.

Description

조류 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 아형 검출용 프라이머 및 이의 용도{Primers for Detecting Avian Influenza Virus Hemagglutinin Subtype and Uses Thereof}FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to primers for detecting avian influenza virus hemagglutinin subtypes and their uses. [0002] Primers for Detecting Avian Influenza Virus Hemagglutinin Subtype and Uses Thereof [

본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 아형에 대한 검출용 프라이머 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to primers for detection of avian influenza virus hemagglutinin subtypes and uses thereof.

조류 인플루엔자는 전파가 빠르고 병원성이 다양하며, 닭, 칠면조, 야생 조류 등 여러 종류의 조류에 감염되며, 주로 닭과 칠면조에 피해를 주는 급성 바이러스성 전염병이다. 국내에서는 고병원성 조류 인플루엔자(H5N1)가 2차례에 걸쳐 발생한 바 있으며(2003년 12월~2004년 3월, 2006년 11월~2007.3월), 저병원성 조류 인플루엔자(H9N2)는 1996년에 처음 발생한 이후 현재에는 상재화가 되어 있는 상황이다.Avian influenza is an acute viral infectious disease that affects chickens and turkeys, infecting many kinds of birds such as chickens, turkeys, and wild birds. (H5N1) occurred two times in Korea (from December 2003 to March 2004, November 2006 to March 2007), and the low-pathogenic avian influenza (H9N2) There is a situation in the top.

이러한 인플루엔자 바이러스는 바이러스성 호흡기 질환의 주요 원인 병원체로서 NP(nuleocapsid)와 M(matrix) 단백질의 항원성 차이에 의해 크게 A, B 및 C형으로 구분된다. 이 중 A형은 다시 헤마글루티닌(hemagglutinin) 단백질 항원 특성에 따라 H1형에서 H16형까지, 뉴라미다아제(Neuramidase) 단백질 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류된다(참고문헌: Wiely DC and Skehel TT, Ann Rev Biochem, 56:365-394, 1987). 각각의 바이러스 아형은 다른 병리적 특성을 가지고 있으며, 현재까지 가금류에서 심각한 질병을 일으키는 H5, H7형 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 초점을 맞추어 신속진단방법(real time PCR, ELISA) 등이 개발이 되어있다.These influenza viruses are classified into A, B, and C types due to the antigenicity of NP (nuleocapsid) and M (matrix) proteins, which are major causative agents of viral respiratory diseases. Among them, type A is classified from H1 type to H16 type according to the hemagglutinin protein antigen characteristics and from N1 type to N9 type depending on the neuramidase protein antigen characteristics (References : Wiely DC and Skehel T T, Ann Rev Biochem, 56: 365-394, 1987). Each virus subtype has different pathological characteristics and has been developed to focus on H5 and H7 highly pathogenic avian influenza viruses, which cause severe disease in poultry, and real-time PCR (ELISA).

그러나, 이러한 조류 인플루엔자 바이러스 외에 나머지 H 항원(H1-H16)에 대한 신속한 진단 역시 필요하다. 역사적으로 세 차례의 세계 대유행을 일으킨 Spanish Flu(1918-1920), Asian Flu(1957-1957) 및 Hong kong Flu(1968-1969)는, H1N1, H2N2, H3N2 아형의 인플루엔자 A 바이러스에 의해 발생하였다. 또한, 최근 발생한 2009년 H1N1의 팬데믹 신종 인플루엔자 바이러스도 인간, 돼지 및 조류 인플루엔자 바이러스가 재조합 과정을 거치면서 출현한 신종 인플루엔자 A 바이러스이다. 그 외에도 홍콩 (1999년, 2003년, H9N2), 대만(2013년 6월, H6N1), 중국(2014년 2월, H10N8) 등에서도 다양한 조류 인플루엔자의 인체감염 등이 보고되고 있으며, 향후 어떠한 아형의 조류 인플루엔자가 인체감염을 일으킬 지는 누구도 예측하지 못하는 상황이다.However, in addition to this avian influenza virus, rapid diagnosis of the remaining H antigen (H1-H16) is also necessary. Spanish Flu (1918-1920), Asian Flu (1957-1957) and Hong kong Flu (1968-1969), which have historically caused three global pandemics, were caused by influenza A viruses of the H1N1, H2N2 and H3N2 subtypes. In addition, the recent H1N1 pandemic influenza virus in 2009 was also a new strain of influenza A virus that appeared in humans, pigs and avian influenza virus through recombinant processes. In addition, various human avian influenza infections have been reported in Hong Kong (1999, 2003, H9N2), Taiwan (June 2013, H6N1) and China (February 2014, H10N8) No one can predict whether avian influenza will cause human infection.

다중 돌연변이 및 진화로 인하여 인플루엔자 바이러스는 매 유행기마다 상이한 아형을 발달시킨다. 하나의 돌연변이 유형이 특히 공격적으로 변할 수 있다는 전세계적 공포가 상존하므로 그러한 바이러스에 의해 발생할 것으로 우려되는 세계적 유행병의 전파를 모니터하고 최소화하기 위하여 인간 및 조류 모두에게서 공격적 유형의 인플루엔자 바이러스를 신속하게 검출 및 단리할 긴급한 필요가 있다.Due to multiple mutations and evolution, influenza virus develops different subtypes at every epidemic. Rapid detection and detection of aggressive forms of influenza viruses in both humans and birds to monitor and minimize the spread of pandemic, which is likely to be caused by such viruses, as there is global fears that one mutation type can be particularly aggressive. There is an urgent need to isolate.

이러한 인플루엔자 바이러스를 진단하기 위해, 바이러스의 분리, 단백 항원이나 유전자를 검출하는 방법 및 혈청학적 검사법 등이 이용되고 있다. 이 중 가장 기준이 되는 방법은 바이러스 분리로서, 이후에 간접면역형광법이나 혈구응집억제시험법 등을 이용하여 동정을 하지만 최근에는 인플루엔자 바이러스 특이 유전자를 검출하는 역전사 중합효소 연쇄반응법(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) 등을 이용한 분자생물학적인 진단법이 많이 사용된다. 유전자 검출법을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 형 및 아형을 구분하기 위해서 NP, M, HA 유전자에 특이적인 프라이머를 제작하여 이용하는 다양한 RT-PCR 방법이 수행 될 수 있다(참고문헌: Fouchier RAM., J. Clin. Microbiol., 38(11): 4096-4101). 최근 여러 가지 아형의 유전자를 동시에 특이적으로 검출할 수 있도록 제작된 프라이머를 이용하는 다중유전자(multiplex, 멀티플렉스) RT-PCR 진단법이 일부 연구진에 의해 보고 되었다 (참고문헌: Stockton J et al., J. Clin. Microbiol., 36(10): 2990-2995; Poddar SK, J. Virol. Methods, 99:63-70, 2002; Wright KE et al., J Clin. Microbiol., 33(5): 180-1184, 1995; Zambon et al., Options for the Control of Influenza III. Elsevier, Amsterdam pp 607-614, 1996). 이러한 다중유전자 RT-PCR은 하나의 튜브에서의 여러 개의 목적 유전자들의 동시증폭을 구현할 수 있는 PCR 방식으로서 다수의 프라이머들을 하나의 튜브에 첨가하여 유전자 증폭을 실시하는 당분야에서는 잘 알려진 방법이다. 그러나, 기존의 조류 인플루엔자 바이러스 동시감별검출에 사용되던 다중유전자 RT-PCR 방법은 다음과 같은 심각한 단점을 갖고 있다. 그 중 하나는 조류 인플루엔자 바이러스 각 형(type)의 유전자에 공통으로 존재하는 보존 서열을 기반으로 설계된 프라이머를 사용할 경우에 검출(진단) 민감도와 특이도가 크게 떨어진다는 점이다. 이는 조류 인플루엔자 바이러스의 경우에 여러 숙주에 감염하면서 유전자 재배열 과정 등으로 인하여 보존적인 서열을 유지하는 구간이 매우 짧기 때문에 발생한다(BMC Evol Biol 14: 16, 2014; J Virol 86(3): 1750-1757, 2012). 다른 하나는 다수의 프라이머들이 사용됨에 따라 프라이머들 간의 상호 간섭 및 경쟁이 초래되어 검출의 민감도와 특이도가 떨어질 뿐만 아니라 위음성 결과까지도 초래된다는 점이다. 임상적으로 주요한 조류 인플루엔자 바이러스의 경우에는 보다 정확한 감별검출을 위해서 각각의 H형을 결정짓는 헤마글루티닌 유전자 상의 서로 다른 2가지의 특정 영역에 대한 증폭을 통한 교차 검증을 하는 것이 필요한데, 이를 실시하려고 할 경우에는 앞의 프라이머들 간의 상호 간섭 및 경쟁으로 인한 문제가 일반적으로 수반된다. 즉, 하나의 Segment 상에 4 개의 프라이머가 작동하게 되어 이러한 문제가 발생되는 것이다.In order to diagnose such influenza virus, isolation of virus, detection of protein antigen or gene, and serological test are used. The most common method is virus isolation followed by identification using indirect immunofluorescence or hemagglutination inhibition test. Recently, reverse transcription-polymerase (PCR), which detects influenza virus-specific genes, chain reaction, RT-PCR) are widely used for molecular biologic diagnosis. Various RT-PCR methods using primers specific for NP, M, and HA genes can be performed to identify influenza virus types and subtypes using gene detection (Fouchier RAM, J. Clin. Microbiol., 38 (11): 4096-4101). Recently, several gene-based (multiplex) RT-PCR diagnostic methods using primers designed to specifically detect multiple subtypes of genes have been reported by some researchers (see, eg, Stockton J et al., J J. Clin. Microbiol., 33 (5): 180 < RTI ID = 0.0 > Zambon et al., Options for the Control of Influenza III, Elsevier, Amsterdam pp. 607-614, 1996). This multi-gene RT-PCR is a PCR method capable of realizing simultaneous amplification of several target genes in one tube, and is a well-known method in the art to perform gene amplification by adding a plurality of primers to one tube. However, the multiple gene RT-PCR method used for simultaneous differential detection of avian influenza virus has the following serious drawbacks. One of them is that the sensitivity and specificity of detection are greatly reduced when using primers designed based on conserved sequences common to the avian influenza virus type gene. This is because of the very short interval in which avian influenza virus infects several hosts and maintains a conserved sequence due to the rearrangement of the gene (BMC Evol Biol 14: 16, 2014; J Virol 86 (3): 1750 -1757, 2012). The other is that the use of multiple primers results in mutual interference and competition between the primers, resulting in a decrease in the sensitivity and specificity of the detection as well as a false negative result. In the case of clinically important avian influenza viruses, cross-validation through amplification of two distinct regions of the hemagglutinin gene, which determine each H-type, is required for more accurate differential detection. There is generally a problem due to mutual interference and competition among the above primers. That is, four primers operate on one segment, which causes this problem.

따라서, 조류 인플루엔자 바이러스 검출 결과에 따라 대량의 살처분과 같은 후속 작업이 수반된다는 점을 고려할 때 이는 결코 간과되어서는 안 될 문제이고, 이러한 문제를 해결해 줄 수 있는 새로운 기술적 방법이 필요하다.Therefore, considering that the results of detection of avian influenza virus are accompanied by subsequent work such as mass disposal, this should not be overlooked, and a new technical method is needed to solve this problem.

이에 본 발명자는 다양한 조류 인플루엔자 바이러스 아형을 신속 정확하게 검출 및 동시 진단하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 조류 인플루엔자 바이러스의 아형인 16 종의 헤마글루티닌(H항원, H1-H16) 아형을 각각 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였고, 이를 이용하여 다중튜브(multi-tube) 형태의 방식으로 검출을 실시하여 우수한 민감도로 위음성 문제없이 신속하고 간편하게 한번의 실험만으로도 각 아형을 동시에 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventor has tried to develop a method for rapidly and accurately detecting and simultaneously diagnosing various avian influenza virus subtypes. As a result, a primer set capable of detecting the subtypes of avian influenza viruses, namely 16 subtypes of hemagglutinin (H antigen, H1-H16) subtypes, was constructed and a multi-tube type . The present inventors completed the present invention by confirming that the subtypes can be diagnosed simultaneously with a single experiment without any problem of false negativity with excellent sensitivity.

따라서, 본 발명의 목적은 조류 인플루엔자 바이러스(Avian Influenza Virus) 검출용 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a primer set for detecting Avian Influenza Virus.

또한, 본 발명의 다른 목적은 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a composition for detecting avian influenza virus.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공하는 데 있다.It is still another object of the present invention to provide a kit for detecting avian influenza virus.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 조류 인플루엔자 바이러스 검출 방법을 제공하는 데 있다.It is still another object of the present invention to provide a method for detecting avian influenza virus.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 22의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 23의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 24의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 25의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 29의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 30의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및 서열번호 31의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 32의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스(Avian Influenza Virus) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.According to one aspect of the present invention, there is provided a primer set comprising a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30; And a primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 31 and a primer represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32, and at least one primer set selected from the group consisting of primers set forth in SEQ ID NO: Lt; / RTI >

본 발명자들은 인플루엔자 바이러스의 당단백질에 해당되는 유전자 중 변이가 심한 지역을 아형(subtype)별로 구분하여 다중튜브(multitube) RT-PCR을 실시할 경우, 프라이머들 간의 상호 간섭 및 경쟁으로 인한 민감도 저하 및 위음성 발생없이 동일한 검체로부터 여러 인플루엔자 바이러스 아형을 동시에 진단 및 구분할 수 있으며, 특정 인플루엔자 바이러스의 감염 여부를 보다 확정적으로 진단할 수 있다는 점에 착안하여 국내 및 국외 인플루엔자 분리주에 대한 HA 유전자의 염기서열을 종합적으로 분석하여, 이의 염기서열로부터 상응되는 프라이머를 제작하였다.The inventors of the present invention have found that when multitube RT-PCR is performed by dividing subtypes of regions having high mutation among influenza virus glycoprotein genes, mutual interference between primers, It is possible to simultaneously diagnose and distinguish several influenza virus subtypes from the same specimen without the occurrence of false negativity and to be able to diagnose the infection of a specific influenza virus more definitively. Thus, the sequence of the HA gene for the influenza isolate of domestic and foreign influenza , And a corresponding primer was prepared from the nucleotide sequence thereof.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 22의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 23의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 24의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 25의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 29의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 30의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및 서열번호 31의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 32의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 포함한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the primer set includes a primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30; And a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조류 인플루엔자 바이러스는 A형 조류 인플루엔자 바이러스이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the avian influenza virus is avian avian influenza virus.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 A형 조류 인플루엔자 바이러스는 HA 1형, HA 2형, HA 3형, HA 4형, HA 5형, HA 6형, HA 7형, HA 8형, HA 9형, HA 10형, HA 11형, HA 12형, HA 13형, HA 14형, HA 15형, 및 HA 16형으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 아형을 포함한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the A type avian influenza virus is selected from the group consisting of HA 1 type, HA 2 type, HA 3 type, HA 4 type, HA 5 type, HA 6 type, HA 7 type, HA 8 type, HA 9 type At least one subtype selected from the group consisting of HA10, HA11, HA12, HA13, HA14, HA15, and HA16.

본 명세서에서 사용되는 용어, "인플루엔자 바이러스(Influenza Virus A) A형"은 인플루엔자 바이러스 중에서 16개의 HA(Hemagglutinin, H) 아형과 9개의 NA(Neureminidase, N) 아형을 갖는 바이러스를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 바이러스 아형은 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트를 통해 검출될 수 있는 대상으로서 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.As used herein, the term "Influenza Virus A type A" means a virus having 16 HA (Hemagglutinin, H) subtypes and 9 NA (Neureminidase, N) subtypes among influenza viruses. For the purpose of the present invention, the viral subtype can be used as an object that can be detected through the primer set provided in the present invention, but is not particularly limited thereto.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.As used herein, the term "primer" refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group and capable of forming a base pair with a complementary template, Refers to a short nucleic acid sequence that functions as a starting point. The primers can initiate DNA synthesis in the presence of reagents and four different nucleoside triphosphates for polymerization reactions (i. E., DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffer solutions and temperatures.

또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, ³²P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.In addition, the primer nucleic acid sequences of the present invention may, if necessary, comprise markers detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of labels include enzymes (e.g., horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), radioactive isotopes (e.g., ³² P), fluorescent molecules, chemical groups (e.g., biotin), etc. .

본 명세서에서 사용되는 용어, "프라이머 세트"은 목적하는 유전자를 중합효소 연쇄반응을 통하여 증폭시키기 위하여 사용되는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된 세트를 의미하며, 용어 "프라이머 쌍"과 호환된다. As used herein, the term "primer set " means a set consisting of a forward primer and a reverse primer used for amplifying a desired gene through a polymerase chain reaction, and is compatible with the term" primer pair ".

본 발명의 프라이머들은 A형 인플루엔자 바이러스 아형의 검출에 사용될 수 있도록 하기 위한 본 발명의 목적상 상기 프라이머 세트 중, HA1형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: FJ536843.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 69번째에서 89번째까지의 정방향 프라이머(H1-F) 및 동일한 유전자에서 368번째에서 389번째까지의 역방향 프라이머(H1-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.For the purpose of the present invention, the primers of the present invention can be used for the detection of influenza A virus subtypes. Among the primer sets, the primer set for detection of the HA1 type is preferably a hemagglutinin type A avian influenza virus ) Primer capable of amplifying the gene (NCBI accession number: FJ536843.1), more preferably a forward primer (Hl-1) from the 69th to 89th from the 5 'end of the HA gene, F) and the reverse primer (H1-R) at positions 368 to 389 in the same gene, and most preferably, a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 Primer.

또한, HA2형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: AB669133.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 43번째에서 62번째까지의 정방향 프라이머(H2-F) 및 동일한 유전자에서 225번째에서 243번째까지의 역방향 프라이머(H2-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다. In addition, the primer set for detection of the HA2 type may preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: AB669133.1) More preferably, it may be composed of a forward primer (H2-F) from the 5'end of the HA gene to the 43rd to 62nd primers and a reverse primer (H2-R) from the 225th to 243rd of the same gene, Most preferably a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.

또한, HA3형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: JX051229.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 842번째에서 863번째까지의 정방향 프라이머(H3-F) 및 동일한 유전자에서 1604번째에서 1622번째까지의 역방향 프라이머(H3-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.In addition, the primer set for detection of the HA3 type may preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: JX051229.1) (H3-F) from the 5'end of the HA gene to the 842nd to 863th of the HA gene, and a reverse primer (H3-R) from the 1604th to 1622th of the same gene, Most preferably a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.

또한, HA4형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: CY006017.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 1314번째에서 1335번째까지의 정방향 프라이머(H4-F) 및 동일한 유전자에서 1669번째에서 1685번째까지의 역방향 프라이머(H4-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.In addition, the HA4 type detection primer set may preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: CY006017.1) More preferably, it may be composed of a forward primer (H4-F) from the 5'end of the HA gene to 1314th to 1335th and a reverse primer (H4-R) from 1669th to 1685th of the same gene, Most preferably, a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.

또한, HA5형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: DQ997405.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 1115번째에서 1134번째까지의 정방향 프라이머(H5-F) 및 동일한 유전자에서 1331번째에서 1353번째까지의 역방향 프라이머(H5-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다. In addition, the HA5 type detection primer set may preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: DQ997405.1) More preferably, it can be composed of a forward primer (H5-F) from 1115 to 1134 from the 5 'end of the HA gene and a reverse primer (H5-R) from 1331 to 1353 in the same gene, Most preferably a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.

또한, HA6형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: AY862613.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 661번째에서 680번째까지의 정방향 프라이머(H6-F) 및 동일한 유전자에서 943번째에서 962번째까지의 역방향 프라이머(H6-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.In addition, the HA6 type detection primer set can preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: AY862613.1) More preferably, it can be composed of a forward primer (H6-F) from the 5'end of the HA gene to the 661th to 680th and a reverse primer (H6-R) from the 943rd to the 962nd of the same gene, Most preferably, a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.

또한, HA7형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: AY724257.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 1499번째에서 1520번째까지의 정방향 프라이머(H7-F) 및 동일한 유전자에서 1675번째에서 1690번째까지의 역방향 프라이머(H7-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.In addition, the primer set for detection of the HA7 type may preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: AY724257.1) More preferably, it can be composed of a forward primer (H7-F) from 1499th to 1520th from the 5'end of the HA gene and a reverse primer (H7-R) from the 1675th to 1690th in the same gene, Most preferably a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14.

또한, HA8형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: AB669137.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 1307번째에서 1324번째까지의 정방향 프라이머(H8-F) 및 동일한 유전자에서 1665번째에서 1685번째까지의 역방향 프라이머(H8-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.In addition, the HA8 type primer set may preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: AB669137.1) More preferably, it can be composed of a forward primer (H8-F) from the 5'end of the HA gene to the 1307th to 1324th and a reverse primer (H8-R) from the 1665th to 1685th of the same gene, Most preferably a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.

또한, HA9형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: KF188323.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 1249번째에서 1271번째까지의 정방향 프라이머(H9-F) 및 동일한 유전자에서 1577번째에서 1595번째까지의 역방향 프라이머(H9-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.In addition, the HA9 type primer set may preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: KF188323.1) More preferably, it can be composed of a forward primer (H9-F) from the 5'end of the HA gene to 1249th to 1271th and a reverse primer (H9-R) from the 1577th to 1595th in the same gene, Most preferably a primer represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 and a primer represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 18.

또한, HA10형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: JN817576.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 1468번째에서 1488번째까지의 정방향 프라이머(H10-F) 및 동일한 유전자에서 1596번째에서 1615번째까지의 역방향 프라이머(H10-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.In addition, the primer set for detection of the HA10 type may preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: JN817576.1) More preferably, it can be composed of a forward primer (H10-F) from the 5'end of the HA gene to 1468th to 1488th and a reverse primer (H10-R) from the 1596th to 1615th of the same gene, Most preferably a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20.

또한, HA11형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: DQ080993.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 433번째에서 452번째까지의 정방향 프라이머(H11-F) 및 동일한 유전자에서 1301번째에서 1321번째까지의 역방향 프라이머(H11-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 22의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.In addition, the primer set for detection of the HA11 type may preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: DQ080993.1) More preferably, it may be composed of a forward primer (H11-F) from the 5'end of the HA gene to the 433rd to 452nd and a reverse primer (H11-R) from the 1301th to 1321th of the same gene, Most preferably a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22.

또한, HA12형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: CY139550.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 1190번째에서 1211번째까지의 정방향 프라이머(H12-F) 및 동일한 유전자에서 1673번째에서 1693번째까지의 역방향 프라이머(H12-R) 로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 23의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 24의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.In addition, the primer set for detection of the HA12 type may preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: CY139550.1) More preferably, it can be composed of a forward primer (H12-F) from the 5'end of the HA gene to 1190th to 1211th and a reverse primer (H12-R) from the 1673th to 1693th of the same gene, Most preferably a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24.

또한, HA13형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: AY684886.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 374번째에서 395번째까지의 정방향 프라이머(H13-F) 및 동일한 유전자에서 580번째에서 599번째까지의 역방향 프라이머(H13-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 25의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.In addition, the primer set for detection of the HA13 type may preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: AY684886.1) More preferably, it may be composed of a forward primer (H13-F) from the 5'-end of the HA gene to the 374th to 395th and a reverse primer (H13-R) from the 580th to 599th in the same gene, Most preferably a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26.

또한, HA14형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: CY133381.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 331번째에서 349번째까지의 정방향 프라이머(H14-F) 및 동일한 유전자에서 699번째에서 719번째까지의 역방향 프라이머(H14-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.In addition, the HA14 type primer set may preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: CY133381.1) More preferably, it may be composed of a forward primer (H14-F) from the 5'end of the HA gene to the 331st to 349th and a reverse primer (H14-R) from the 699th to 719th from the same gene, Most preferably a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28.

또한, HA15형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: KP087869.1 및 CY098540.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 184번째에서 202번째까지의 정방향 프라이머(H15-F) 및 동일한 유전자에서 501번째에서 519번째까지의 역방향 프라이머(H15-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 29의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 30의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.In addition, the primer set for detection of the HA15 type is preferably composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: KP087869.1 and CY098540.1) (H15-F) from the 5'end of the HA gene to the 184th to 202nd primers (H15-F) and the reverse primer (H15-R) from the 5'- Most preferably a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30.

또한, HA16형 검출용 프라이머 세트는 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: CY185585.1)를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 HA 유전자의 5' 말단으로부터 673번째에서 692번째까지의 정방향 프라이머(H16-F) 및 동일한 유전자에서 1054번째에서 1071번째까지의 역방향 프라이머(H16-R)로 구성될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 31의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 32의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성될 수 있다.In addition, the primer set for detection of the HA16 type may preferably be composed of forward and reverse primers capable of amplifying the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: CY185585.1) More preferably, it can be composed of a forward primer (H16-F) from the 5'end of the HA gene to the 673th to 692nd and a reverse primer (H16-R) from the 1054th to 1071st of the same gene, Most preferably a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32.

본 명세서에는 프라이머의 서열을 나타냄에 있어 IUB 중의성(ambiguity) 코드(codes)를 사용했다. 따라서 프라이머 서열에서 A는 아데닌(adenine)을, G는 구아닌(guanine)을, C는 시토신(cytosine)을, T는 티민(thymine)을 나타내고, R은 구아민과 아데닌 둘 다가 가능한 자리를 나타낸다. 이는 본 명세서의 모든 서열을 제시하는 데에 있어 동일하게 적용하였다.In this specification, ambiguity codes are used in representing the sequence of primers. Thus, in the primer sequence, A represents adenine, G represents guanine, C represents cytosine, T represents thymine, and R represents a possible site for both a guanine and an adenine. This applies equally to presenting all the sequences in this specification.

본 발명의 프라이머 세트는 A형 조류 인플루엔자 바이러스 자체의 검출에 활용될 수 있을 뿐만 아니라, A형 조류 인플루엔자 바이러스의 아형인 조류 인플루엔자 바이러스 HA 1형, HA 2형, HA 3형, HA 4형, HA 5형, HA 6형, HA 7형, HA 8형, HA 9형, HA 10형, HA 11형, HA 12형, HA 13형, HA 14형, HA 15형, 및 HA 16형 인플루엔자 바이러스 아형으로 이루어진 군으로부터 선택된 2 종 이상을 동시에 검출하는 단순검출 및 동시감별에도 활용될 수 있다.The primer set of the present invention can be used not only for the detection of the avian influenza A virus itself but also for the detection of the avian influenza virus subtypes HA 1, HA 2, HA 3, HA 4, HA 5, HA 6, HA 7, HA 8, HA 9, HA 10, HA 11, HA 12, HA 13, HA 14, HA 15 and HA 16 influenza virus subtypes And simultaneously detecting two or more species selected from the group consisting of < RTI ID = 0.0 > a < / RTI >

예컨대, 인플루엔자 바이러스의 병원성은 헤마글루티닌 단백질과 관련이 있는데 이 헤마글루티닌 단백질 분절부위(cleavage site)는 병원성에 관련된 특정한 유전자 배열을 가진다. 이런 이유로 이 헤마글루티닌 단백질 분절부위에 해당하는 유전자 배열을 조사하여 이를 기준으로 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 감염 여부를 확진할 수 있다. 다시 말해, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 A형 검출 및 이의 아형 동시감별검출 키트에서의 조류 인플루엔자 바이러스 H5형에 대한 증폭산물(서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성된 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때의 증폭산물)과 조류 인플루엔자 바이러스 H7형에 대한 증폭산물(서열번호 13 및 서열번호 14로 구성된 특이 프라이머 쌍을 사용했을 때의 증폭산물)은 상기한 헤마글루티닌 단백질 분절부위에 해당하는 유전자들의 증폭산물들이므로 이들의 유전자 서열을 조사하면 해당 조류 인플루엔자 바이러스의 고병원성 여부를 확인할 수 있다.For example, the virulence of influenza virus is associated with the hemagglutinin protein, which has a specific gene sequence related to pathogenicity. For this reason, the gene sequence corresponding to the segment of the hemagglutinin protein segment can be examined to confirm the infection with the highly pathogenic avian influenza virus. In other words, the amplification products of the avian influenza virus H5 type (amplification products using the specific primer pairs of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10) in the influenza virus A type detection and its simultaneous discrimination detection kit of the present invention, And an amplification product for the avian influenza virus type H7 (amplification product using the specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14) are the amplification products of the genes corresponding to the hemagglutinin protein segment Investigations of these gene sequences can confirm whether the avian influenza virus is highly pathogenic.

본 발명의 상기 각 특이 프라이머들은 구성염기 서열의 일부가 변경될 수 있다. 이와 같은 변경은 구성염기 서열의 일부결실, 부가, 치환, 또는 이들의 복합적인 것으로 구현될 수 있으나, 이러한 구성염기 서열의 일부 변경은 특이 프라이머들의 주형(cDNA 또는 PCR 증폭산물들)과의 특이적 결합을 훼손할 수 있기 때문에 적용에 있어 상당한 주의를 요한다. 한편, 조류 인플루엔자 바이러스의 경우 여러 숙주를 거치면서 유전자의 재배열을 통한 변이가 매우 활발하기 때문에 주기적으로 최신의 유행하는 조류 인플루엔자 바이러스의 유전자 서열을 탐색하여 특이 프라이머들에 반영하여야 하며, 이에 따라 필요 시 특이 프라이머들의 구성염기 서열의 일부 변경이 불가피하다. 이때에는 반드시 특이성을 훼손하지 않는 범위 내에서 실험적으로 조사되어 변경되어야 한다. 이는 당업자에게는 일반적인 사항이므로 이에 대한 상세한 설명은 생략한다. 본 발명에서 제시된 프라이머들의 서열을 유지하는 것이 가장 바람직하다.In the specific primers of the present invention, some of the constitutive base sequences may be changed. Such modifications may be accomplished by partial deletion, addition, substitution, or a combination thereof, of the constitutive nucleotide sequence, but some modifications of such constitutive nucleotide sequences are specific for the template (cDNA or PCR amplification products) of the specific primers It requires considerable care in application because it can damage the bond. On the other hand, in the case of avian influenza virus, since mutation through gene rearrangement is very active through several hosts, it is necessary to periodically search for the latest avian influenza virus gene sequence and reflect it in specific primers, A partial modification of the constitutive base sequence of the siRNA specific primers is inevitable. At this time, it must be experimentally investigated and changed to the extent that the specificity is not impaired. Since these are general matters to those skilled in the art, a detailed description thereof will be omitted. It is most preferred to maintain the sequences of the primers presented in the present invention.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 실시하기 위한 프라이머 세트이며, 가장 바람직하게는 다중튜브(multitube) RT-PCR을 실시하기 위한 것이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the primer set of the present invention is a set of primers for performing RT-PCR, most preferably for performing multitube RT-PCR .

기존 다중유전자(싱글튜브 멀티플렉스) RT-PCR 결과에서는 다수의 증폭산물들이 혼재되어 있어 프라이머들 간의 상호 간섭 및 경쟁으로 인한 민감도 저하 및 위음성 시그널이 발생한다. 또한, 이들의 유전자 서열 분석을 수행하기 위해서는 증폭산물의 분리 및 정제가 필요하고 이를 위해서는 복잡한 과정이 수행되어야 한다. In RT-PCR of existing multiple genes (single-tube multiplex), multiple amplification products are mixed, resulting in mutual interference between primers, decreased sensitivity due to competition, and false signals. Further, in order to perform these gene sequence analysis, it is necessary to separate and purify the amplification product, and a complicated process must be performed for this purpose.

그러나, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 A형 검출 및 이의 아형 감별검출을 위한 프라이머 세트는 각 아형별 특이 프라이머 세트를 튜브별로 구분하여 수용하는 다중튜브(multitube) 방식으로 적용되므로, 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자 RT-PCR에서의 다수의 프라이머들의 프라이머들 간의 상호 간섭 및 경쟁으로 인한 민감도 및 특이도 저하 문제나 위음성 결과 초래 문제를 해결할 수 있다.However, since the primer set for the detection of influenza virus type A of the present invention and its subtype discrimination detection is applied by a multitube method in which specific primer sets for each subtype are divided and accommodated by tubes, It is possible to solve the problem of sensitivity and specificity degradation or false negative result caused by mutual interference and competition between primers of a plurality of primers in gene RT-PCR.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 프라이머 세트를 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a composition for detecting avian influenza virus including the above-described primer set, and a kit for detecting avian influenza virus comprising the composition.

본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 키트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형 검출 및 이의 아형 동시감별검출 키트로서, 상술한 특이 프라이머 세트가 사용되었을 뿐만 아니라 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자 RT-PCR에서의 민감도 저하 및 위음성 발생 문제를 회피할 수 있게 다중튜브 방식이 적용된다. The kit for the detection of avian influenza virus of the present invention is a kit for detecting the avian influenza virus A type and its subtype simultaneous discrimination detection kit. In addition to the above-mentioned specific primer set, sensitivity of the multi-gene RT- PCR for detection of avian influenza virus And the multi-tube method is applied so as to avoid the occurrence of false negatives.

즉, 본 발명의 키트는 하나의 키트에 이러한 다중튜브 방식이 적용되어 사용자는 하나의 키트를 사용하여 한 번의 반응을 통하여 인플루엔자 바이러스 자체의 검출과 임상적으로 주요한 인플루엔자 바이러스 아형들을 비롯한 HA1형 내지 HA16형의 동시감별검출을 수행할 수 있다. That is, the kit of the present invention is applied to a single kit such that the user can use the single kit to detect the influenza virus itself and detect influenza virus subtypes HA1 to HA16 including clinically important influenza virus subtypes Simultaneous discrimination detection of the type can be performed.

본 발명에 따른 다중튜브 방식은 특이 프라이머 쌍이 구분하여 적용된 16 개의 튜브로 구성되는 2 개의 스트립(strip) 형태를 지칭한다.The multi-tube system according to the present invention refers to two strips composed of 16 tubes separated by a specific primer pair.

예를 들어, 본 발명에 따르면 상기 각 튜브에는 특이 프라이머가 구분되어 수용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 튜브 1에는 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 2에는 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 3에는 서열번호 5 및 서열번호 6로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 4에는 서열번호 7 및 서열번호 8로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 5에는 서열번호 9 및 서열번호 10로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 6에는 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 7에는 서열번호 13 및 서열번호 14로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 8에는 서열번호 15 및 서열번호 16로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 9에는 서열번호 17 및 서열번호 18로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 10에는 서열번호 19 및 서열번호 20로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 11에는 서열번호 21 및 서열번호 22로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 12에는 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 13에는 서열번호 25 및 서열번호 26로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 14에는 서열번호 27 및 서열번호 28로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 15에는 서열번호 29 및 서열번호 30로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용되고, 튜브 16에는 서열번호 31 및 서열번호 32로 구성된 특이 프라이머 쌍이 수용된다.For example, according to the present invention, specific primers may be separately contained in each of the tubes, but the present invention is not limited thereto. Preferably, a specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 is contained in Tube 1, a specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 is accommodated in Tube 2 and SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 The specific primer pair composed of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 is accommodated in tube 4, the specific primer pair composed of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 is accommodated in tube 5, The specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 12 is accommodated, the specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 is accommodated in the tube 7, the specific primer pair composed of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 is accommodated in the tube 8, The specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 is accommodated, and in the case of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: And a specific primer pair composed of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 is accommodated in the tube 12, and a specific primer pair composed of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: The specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 26 is accommodated in the tube 14, the specific primer pair composed of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: Tube 16 contains a specific primer pair consisting of SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32.

상술한 바와 같이 특이 프라이머 쌍을 튜브별로 구분하여 수용함으로써 기존 조류 인플루엔자 바이러스 검출용 다중유전자 RT-PCR에서의 다수의 프라이머들의 프라이머들 간의 상호 간섭 및 경쟁으로 인한 민감도 및 특이도 저하 문제나 위음성 결과 초래 문제가 해소된다.As described above, the specific primer pairs are divided into tubes. Thus, mutual interference between primers of a plurality of primers in RT-PCR for detection of existing avian influenza viruses, sensitivity and specificity of the primers due to competition, The problem is solved.

또한, 단일 종의 증폭산물만이 있는 상태에서 증폭산물을 회수하면 되기 때문에 상대적으로 매우 단순한 과정을 통하여 증폭산물을 확보할 수 있어 결과적으로 용이하게 증폭산물의 유전자 형을 판정하고, 조류 인플루엔자 A 형 아형 분석 및 감별을 실시할 수 있다.Since the amplification products are recovered in the presence of only a single species of amplification products, the amplification products can be obtained through a relatively simple process. As a result, the genotype of the amplification products can be easily determined, and avian influenza A Subtype analysis and discrimination can be performed.

또한, 본 발명의 검출용 조성물 및 검출용 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. The detection composition and the detection kit of the present invention may further comprise one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.

바람직하게는, 상기 검출용 조성물 및 검출용 키트는 역전사 반응 및 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. Preferably, the composition for detection and the detection kit may include necessary elements for performing the reverse transcription reaction and RT-PCR.

본 발명의 검출용 조성물 및 검출용 키트는, 검출 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 인플루엔자 바이러스 A의 유전자인 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.The detection composition and the detection kit of the present invention are characterized by comprising a reverse transcriptase for synthesizing complementary cDNA from RNA which is a gene of influenza virus A, DNA polymerase for amplifying complementary DNA Enzymes such as enzymes, tubes or other appropriate containers, reaction buffers (varying in pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), Hot start Taq polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC- water, sterile water, and the like.

본 발명에서 각 튜브에 포함되는 성분들로는 이에 국한되지 않지만, 역전사 효소, DNA 중합효소, Tris-HCl, MgCl2, KCl, dATP, dTTP, dGTP, dCTP, RNase Inhibitor, DTT, 8-MOP 등을 제시할 수 있다. 이들은 적절한 농도 범위에서 포함되어야 하는데, 0.1-10 unit의 역전사 효소, 1-10 unit의 DNA 중합효소, 10-300 mM의 Tris-HCl, 1-50 mM의 MgCl2, 1-100 mM의 KCl, 1-5 mM의 dATP, 1-5 mM의 dTTP, 1-5 mM의 dGTP, 1-5 mM의 dCTP, 1-10 unit의 RNase Inhibitor, 0.001-0.1 M의 DTT, 0.5-5 ㎍의 8-MOP을 포함하는 것이 바람직하다.The components included in each tube in the present invention include, but are not limited to, reverse transcriptase, DNA polymerase, Tris-HCl, MgCl2, KCl, dATP, dTTP, dGTP, dCTP, RNase inhibitor, DTT and 8-MOP . These should be included in the appropriate concentration range, including 0.1-10 units of reverse transcriptase, 1-10 units of DNA polymerase, 10-300 mM Tris-HCl, 1-50 mM MgCl2, 1-100 mM KCl, 1 -5 mM dATP, 1-5 mM dTTP, 1-5 mM dGTP, 1-5 mM dCTP, 1-10 units of RNase inhibitor, 0.001-0.1 M DTT, 0.5-5 μg of 8-MOP .

한편, 각 튜브에 첨가된 성분들은 액상 형태로 제조할 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성(stability)을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조할 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이에 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는, 이들의 복합 공정도 사용될 수 있다.On the other hand, the components added to each tube may be prepared in a liquid form or in a dried form in order to improve the stability of the product by lowering the degree of freedom of contained components. In order to produce such a dried form, it is necessary to apply a drying step, and it can be used in the form of warm drying, natural drying, vacuum drying, freeze drying, or a combination thereof.

본 발명의 조성물 및 카트는 상술한 본 프라이머 세트를 이용하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.Since the compositions and carts of the present invention utilize the present set of primers described above, their description is omitted in order to avoid the undue complexity of the present specification with respect to repeating substrates.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스(Avian Influenza Virus) 검출 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for detecting Avian Influenza Virus comprising the steps of:

(a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계;(a) separating RNA from a specimen;

(b) 상기 분리된 RNA를 주형으로 하고, 상기 조류 인플루엔자 바이러스검출용 프라이머 세트를 이용하여 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 실시하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및(b) performing reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using the separated RNA as a template and using the primer set for detecting avian influenza virus to amplify the target sequence; And

(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계.(c) detecting the amplification product.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검체는 조류, 가축 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the specimen can be selected from the group consisting of algae, livestock and humans.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 실시될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the detection of the amplification product can be performed by DNA chip, gel electrophoresis, capillary electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 RT-PCR은 다중튜브(multitube) 방식으로 실시할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the RT-PCR may be performed by a multitube method.

본 발명에 따르면, 당업계에 공지의 방법에 따라 검체로부터 RNA를 추출한 후, 추출된 RNA를 함유한 추출액에 본 발명의 프라이머 세트, 본 발명의 프라이머 세트가 포함된 조성물 또는 본 발명의 프라이머 세트가 포함된 키트를 이용하여 다중튜브 RT-PCR을 실시한다. 다중튜브 RT-PCR을 실시한 후에 얻어진 산물(반응액)에 대하여 통상적인 방법으로 아가로즈 젤 전기영동 분석을 실시하여 증폭산물의 생성 여부 및 그 크기에 근거하여 조류 인플루엔자 바이러스 A형 검출 및 이의 아형을 동시 검출하여 판정한다. According to the present invention, after extracting RNA from a specimen according to a method known in the art, a primer set of the present invention, a composition containing the primer set of the present invention, or a primer set of the present invention is added to an extract containing the extracted RNA Perform multi-tube RT-PCR using the included kit. Agarose gel electrophoresis analysis was performed on the obtained product (reaction solution) after performing multi-tube RT-PCR to detect the avian influenza virus A type and its subtypes based on whether or not the amplification product was generated and its size Simultaneous detection is performed.

예를 들어, 1번 튜브에서 이에 해당하는 322 bp 크기의 증폭산물이 관찰되면 이는 검체 내에 조류 인플루엔자 바이러스 A형 자체가 존재한다는 것을 의미한다. 또한, 조류 인플루엔자 바이러스 HA1형에 공통적으로 존재하는 유전자로 인한 증폭산물이 확인된 것이므로 검체 내에 조류 인플루엔자 바이러스 A형은 HA1형의 아형으로 존재한다는 것을 의미한다. For example, when the corresponding 322 bp amplification product is observed in the first tube, it means that the avian influenza virus A type exists in the sample. In addition, since the amplification product due to the gene commonly present in the avian influenza virus HA1 type was confirmed, it means that the avian influenza virus A type exists as a subtype of the HA1 type in the specimen.

이와 같이 16 개 튜브의 결과를 종합적으로 검토함으로써 검체 내의 조류 인플루엔자 바이러스 A형 존재 유무와 더불어 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 아형까지 감별검출 할 수 있다.By examining the results of 16 tubes in this way, it is possible to discriminate the presence or absence of avian influenza virus A in the sample as well as the subtype of avian influenza virus A type.

본 발명에서는 조류 인플루엔자 바이러스 HA(hemagglutinin, H) 유전자의 아형에 특이적으로 결합하는 신규한 프라이머 세트를 설계하고, 상기 프라이머 세트가 조류 인플루엔자 바이러스 아형에 대해 선택적으로 결합함을 확인함으로써, 상기 프라이머 세트를 이용하여 조류 인플루엔자 바이러스 아형을 동시에 선택적으로 진단할 수 있음을 확인하였다. 아울러, 기존 다중유전자 검출 방법에 비해 본 발명의 다중튜브 검출 방법으로 적용된 동시 진단 키트의 현저한 효과를 확인하였으므로, 조류 인플루엔자 바이러스 A형 검출 및 이의 아형을 동시에 진단하는 방법에 유용하게 이용될 수 있다.In the present invention, a novel primer set that specifically binds to the subclass of the hemagglutinin (H) gene of avian influenza virus was designed and confirmed that the primer set selectively binds to the avian influenza virus subtype, Were used for the detection of avian influenza virus subtypes. Further, since the present invention has a remarkable effect of the simultaneous diagnostic kit applied to the multi-tube detection method of the present invention compared to the existing multiple gene detection method, it can be usefully used for the simultaneous diagnosis of avian influenza A type detection and its subtypes.

본 발명의 조성물 및 키트는 상술한 본 프라이머 세트를 이용하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.Since the compositions and kits of the present invention utilize the present primer sets described above, their description is omitted in order to avoid the excessive complexity of the present specification in accordance with the repeating substrate.

본 발명에 따르면, 한 번의 RT-PCR만으로 인플루엔자 바이러스 A형 자체뿐만 아니라 상기 바이러스의 각 아형에 대한 감염을 간편하고 용이할 뿐만 아니라 우수한 민감도로 동시 판정할 수 있으며, 다중튜브의 방식을 이용하여 반응 산물에 의한 교차오염을 방지하여 위양성/위음성 시그널 발생 문제를 해결할 수 있다.According to the present invention, not only the influenza virus A type itself but also the infection of each subtype of the virus can be easily and easily determined with a single sensitivity of sensitivity, by using only one RT-PCR, Cross contamination by products can be prevented and the problem of false positive / false negative signal generation can be solved.

도 1은 본 발명에 따른 특이 프라이머로 증폭되는 조류 인플루엔자 바이러스 HA형에 대한 유전자 부위를 표시한 그림이다.
도 2은 조류 인플루엔자 바이러스 A형(HA1 내지 HA16)의 HA(hemagglutinin)형 동시감별검출 키트의 구성을 도식적으로 보여주는 그림이다.
도 3은 도 2의 조류인플루엔자 바이러스 HA형에 대한 각각의 프라이머만을 이용한 RT-PCR 반응 결과로서 단편 밴드의 크기를 보여준다.
도 4는 본 발명의 다중튜브(도 4a) 및 기존 멀티플렉스(도 4b)에서의 민감도 비교 결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 다중튜브에서의 다른 샘플 시료와의 특이도 결과를 보여준다.FIG. 1 is a diagram showing gene regions for the avian influenza virus type HA amplified by the specific primer according to the present invention.
FIG. 2 is a diagram schematically showing the configuration of a HA (hemagglutinin) type simultaneous discrimination detection kit of avian influenza virus type A (HA1 to HA16).
FIG. 3 shows the size of fragment bands as a result of RT-PCR using only the respective primers for the avian influenza virus HA type of FIG. 2.
Figure 4 shows the results of the sensitivity comparisons in the multi-tube (Figure 4a) and the existing multiplex (Figure 4b) of the present invention.
Fig. 5 shows the results of specificity with other sample samples in the multi-tubes of the present invention.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the invention as defined by the appended claims. It will be obvious to you.

실시예Example 1. 인플루엔자 바이러스 A형( 1. Influenza virus type A ( HA1HA1 내지  To HA16HA16 )의 HA 지역에 대한 ) For the HA region 프라이머primer 세트의 제작 Production of sets

본 발명자들은 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 검출 및 이의 아형인 HA1 내지 HA16형의 동시감별을 위하여, 목적의 RT-PCR에 적합한 특이 프라이머를 하기 표 1과 같이 제작하였다.The present inventors produced specific primers suitable for the purpose of RT-PCR for the detection of avian influenza A virus type and simultaneous differentiation of HA1 to HA16 subtypes thereof, as shown in Table 1 below.

먼저, GenBank에서 확보된 유전자 정보를 이용하여 HA(hemagglutinin, H) 유전자를 구분할 수 있는 유전자 특이 영역을 선정하고 이를 기초로 조류 인플루엔자 바이러스로부터 추출된 HA 유전자(HA1형 내지 H16형)를 증폭할 수 있는 프라이머를 설계하였다.First, using the gene information obtained from GenBank, a gene-specific region capable of distinguishing HA (hemagglutinin, H) gene was selected, and HA gene (HA1 type to H16 type) extracted from avian influenza virus Primer was designed.

HA1형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: FJ536843.1)의 5' 말단으로부터 69번째에서 89번째까지의 정방향 프라이머(H1-F) 및 동일한 유전자에서 368번째에서 389번째까지의 역방향 프라이머(H1-R)를 포함하도록 하였다.The primer sets for detection of HA1 type include forward primers (H1-F) at positions 69 to 89 from the 5 'end of avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: FJ536843.1) The reverse primer (H1-R) from the 368th to 389th was included in the same gene.

HA2형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: AB669133.1)의 5' 말단으로부터 43번째에서 62번째까지의 정방향 프라이머(H2-F) 및 동일한 유전자에서 225번째에서 243번째까지의 역방향 프라이머(H2-R)를 포함하도록 하였다. The primer set for detection of the HA2 type is composed of the forward primer (H2-F) from the 43th to 62nd position from the 5 'end of the avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: AB669133.1) And the reverse primer (H2-R) from the 225th to 243th in the same gene was included.

HA3형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: JX051229.1)의 5' 말단으로부터 842번째에서 863번째까지의 정방향 프라이머(H3-F) 및 동일한 유전자에서 1604번째에서 1622번째까지의 역방향 프라이머(H3-R)를 포함하도록 하였다.The primer set for detection of the HA3 type comprises a forward primer (H3-F) from the 5'-end of the avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: JX051229.1) The reverse primer (H3-R) from the 1604th to the 1622th was included in the same gene.

HA4형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: CY006017.1)의 5' 말단으로부터 1314번째에서 1335번째까지의 정방향 프라이머(H4-F) 및 동일한 유전자에서 1669번째에서 1685번째까지의 역방향 프라이머(H4-R)를 포함하도록 하였다.The primer set for detection of the HA4 type comprises a forward primer (H4-F) from 1314 to 1335 from the 5 'end of avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: CY006017.1) (H4-R) from the 1669th to 1685th positions in the same gene.

HA5형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: DQ997405.1)의 5' 말단으로부터 1115번째에서 1134번째까지의 정방향 프라이머(H5-F) 및 동일한 유전자에서 1331번째에서 1353번째까지의 역방향 프라이머(H5-R)를 포함하도록 하였다.The primer sets for detection of HA5 type were prepared from the 5'end of the avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: DQ997405.1) to the 1115th to 1134th forward primer (H5-F) (H5-R) from the 1331 th to 1353 th in the same gene.

HA6형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: AY862613.1)의 5' 말단으로부터 661번째에서 680번째까지의 정방향 프라이머(H6-F) 및 동일한 유전자에서 943번째에서 962번째까지의 역방향 프라이머(H6-R)를 포함하도록 하였다.The primer sets for detection of HA6 type were prepared from forward primer (H6-F) at positions 661 to 680 from the 5 'end of avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: AY862613.1) The reverse primer (H6-R) from the 943th to the 962nd was included in the same gene.

HA7형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: AY724257.1)의 5' 말단으로부터 1499번째에서 1520번째까지의 정방향 프라이머(H7-F) 및 동일한 유전자에서 1675번째에서 1690번째까지의 역방향 프라이머(H7-R)를 포함하도록 하였다.The primer set for detection of the HA7 type was a forward primer (H7-F) from 1499th to 1520th from the 5 'end of avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: AY724257.1) The reverse primer (H7-R) from the 1675th to 1690th was included in the same gene.

HA8형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: AB669137.1)의 5' 말단으로부터 1307번째에서 1324번째까지의 정방향 프라이머(H8-F) 및 동일한 유전자에서 1665번째에서 1685번째까지의 역방향 프라이머(H8-R)를 포함하도록 하였다.The primer set for detection of the HA8 type was prepared from the 5'end of the avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: AB669137.1) to the 1307th to 1324th forward primer (H8-F) The reverse primer (H8-R) from the 1665th to the 1685th was included in the same gene.

HA9형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: KF188323.1)의 5' 말단으로부터 1249번째에서 1271번째까지의 정방향 프라이머(H9-F) 및 동일한 유전자에서 1577번째에서 1595번째까지의 역방향 프라이머(H9-R)를 포함하도록 하였다.The primer set for detection of HA9 type is composed of a forward primer (H9-F) from 1249th to 1271th from the 5 'end of avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: KF188323.1) The reverse primer (H9-R) from the 1577th to 1595th was included in the same gene.

HA10형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: JN817576.1)의 5' 말단으로부터 1468번째에서 1488번째까지의 정방향 프라이머(H10-F) 및 동일한 유전자에서 1596번째에서 1615번째까지의 역방향 프라이머(H10-R)를 포함하도록 하였다.The primer set for detection of the HA10 type was prepared from the 5'end of the avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: JN817576.1) to the 1468th to 1488th forward primer (H10-F) The reverse primer (H10-R) from the 1596th to the 1615th was included in the same gene.

HA11형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: DQ080993.1)의 5' 말단으로부터 433번째에서 452번째까지의 정방향 프라이머(H11-F) 및 동일한 유전자에서 1301번째에서 1321번째까지의 역방향 프라이머(H11-R)를 포함하도록 하였다.The primer sets for detection of the HA11 type were primer sets (H11-F) from the 5'-end to the 433rd to 452'th from the avian influenza virus A type hemagglutinin gene (NCBI accession number: DQ080993.1) And the reverse primer (H11-R) from the 1301th to 1321th in the same gene was included.

HA12형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: CY139550.1)의 5' 말단으로부터 1190번째에서 1211번째까지의 정방향 프라이머(H12-F) 및 동일한 유전자에서 1673번째에서 1693번째까지의 역방향 프라이머(H12-R)를 포함하도록 하였다.The primer sets for detection of HA12 type include forward primer (H12-F) from 1190th to 1211th from the 5 'end of avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: CY139550.1) And the reverse primer (H12-R) at positions 1673 to 1693 in the same gene.

HA13형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: AY684886.1)의 5' 말단으로부터 374번째에서 395번째까지의 정방향 프라이머(H13-F) 및 동일한 유전자에서 580번째에서 599번째까지의 역방향 프라이머(H13-R)를 포함하도록 하였다.The primer sets for detection of HA13 type include a forward primer (H13-F) from 374th to 395th from the 5 'end of avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: AY684886.1) The reverse primer (H13-R) from 580th to 599th was included in the same gene.

HA14형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: CY133381.1)의 5' 말단으로부터 331번째에서 349번째까지의 정방향 프라이머(H14-F) 및 동일한 유전자에서 699번째에서 719번째까지의 역방향 프라이머(H14-R)를 포함하도록 하였다.The primer sets for detection of HA14 type were prepared from the 5'end of the avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: CY133381.1) to the 331st to 349th forward primer (H14-F) And reverse primers (H14-R) from 699th to 719th in the same gene were included.

HA15형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: KP087869.1 및 CY098540.1)의 5' 말단으로부터 184번째에서 202번째까지의 정방향 프라이머(H15-F) 및 동일한 유전자에서 501번째에서 519번째까지의 역방향 프라이머(H15-R)를 포함하도록 하였다.A primer set for detection of HA15 type was prepared from the 5 'end of the avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession numbers: KP087869.1 and CY098540.1), 184th to 202nd forward primers (H15 -F) and the reverse primer (H15-R) at positions 501 to 519 in the same gene.

HA16형 검출용 프라이머 세트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자(NCBI accession number: CY185585.1)의 5' 말단으로부터 673번째에서 692번째까지의 정방향 프라이머(H16-F) 및 동일한 유전자에서 1054번째에서 1071번째까지의 역방향 프라이머(H16-R)를 포함하도록 하였다.The primer set for detection of the HA16 type contained forward primer (H16-F) from the 5'end of the avian influenza virus type A hemagglutinin gene (NCBI accession number: CY185585.1) to the 673rd to 692nd primers The reverse primer (H16-R) from the 1054th to the 1071st was included in the same gene.

상기 프라이머들은 Tm 값은 모두 56℃가 되어 동시에 증폭이 가능하도록 제작하였다.The Tm values of the above primers were all 56 ° C, so that they were simultaneously amplified.

표적Target 서열번호SEQ ID NO: 이름name 서열order HA 1HA 1 1One H1-FH1-F CTACCATGCAAACAATTCTAC CTACCATGCAAACAATTCTAC 22 H1-RH1-R TTCTCAAATGAAGACACTGAAC TTCTCAAATGAAGACACTGAAC HA 2HA 2 33 H2-FH2-F GGAGACCAGATATGCATTGG GGAGACCAGATATGCATTGG 44 H2-RH2-R ATTCTGGATTTCCAAGGAG ATTCTGGATTTCCAAGGAG HA 3HA 3 55 H3-FH3-F GCTCAATAATGAGATCAGATGCGCTCAATAATGAGATCAGATGC 66 H3-RH3-R AAGCATGATATGGCAAAGG AAGCATGATATGGCAAAGG HA 4HA 4 77 H4-FH4-F TTGATTTATGGTCATATAATGC TTGATTTATGGTCATATAATGC 88 H4-RH4-R CGTTTTGACAAGCCCAC CGTTTTGACAAGCCCAC HA 5HA 5 99 H5-FH5-F ATGGTAGATGGTTGGTATGGATGGTAGATGGTTGGTATGG 1010 H5-RH5-R GCATTATAAGTCCAGACATCTAG GCATTATAAGTCCAGACATCTAG HA 6HA 6 1111 H6-FH6-F AGCATGAATTTTGCCAAGAGAGCATGAATTTTGCCAAGAG 1212 H6-RH6-R GGRCATTCTCCTATCCACAGGGRCATTCTCCTATCCACAG HA 7HA 7 1313 H7-FH7-F ATAACACCTATGATCACAGCAA ATAACACTATGATCACAGCAA 1414 H7-RH7-R TGCACCGCATGTTTCC TGCACCGCATGTTTCC HA 8HA 8 1515 H8-FH8-F GGGCCTACAATGCAGAGC GGGCCTACAATGCAGAGC 1616 H8-RH8-R CATCTACAAGATCCATTTTGC CATCTACAAGATCCATTTTGC HA 9HA 9 1717 H9-FH9-F ATGATCAATAATAAGATTGATGA ATGATCAATAATAAGATTGATGA 1818 H9-RH9-R GCGACAGTCGAATAAATGG GCGACAGTCGAATAAATGG HA 10HA 10 1919 H10-FH10-F GAGAGCATAAGAAACAACACC GAGAGCATAAGAAACAACACC 2020 H10-RH10-R GAAGAACAAAACATGATGCC GAAGAACAAAACATGATGCC HA 11HA 11 2121 H11-FH11-F CAGGAGTGACTGCTGCATG CAGGAGTGACTGCTGCATG 2222 H11-RH11-R GGAGTTGTGCATTATATGACC GGAGTTGTGCATTATATGACC HA 12HA 12 2323 H12-FH12-F AACAATGTCATTGACAAAATGA AACAATGTCATTGACAAAATGA 2424 H12-RH12-R GAAAGTACAACGAACATTTCC GAAAGTACAACGAACATTTCC HA 13HA 13 2525 H13-FH13-F GAGAGTTAGACAACAATGGAGA GAGAGTTAGACAACAATGGAGA 2626 H13-RH13-R CTGCCAGTTGTGTTGTTGTA CTGCCAGTTGTGTTGTTGTA HA 14HA 14 2727 H14-FH14-F CAATGGACACGTGCTATCC CAATGGACACGTGCTATCC 2828 H14-RH14-R TGGTCTACTTCCTATATTGGG TGGTCTACTTCCTATATTGGG HA 15HA 15 2929 H15-FH15-F AAAGGGAGGAAAGCTGTGG AAAGGGAGGAAAGCTGTGG 3030 H15-RH15-R TAGTTGTGGGAACACCTGGTAGTTGTGGGAACACCTGG HA 16HA 16 3131 H16-FH16-F ATCAACAAAAGAGTGGAGCA ATCAACAAAAGAGTGGAGCA 3232 H16-RH16-R TGGCACTTTGTGTTGCAT TGGCACTTTGTGTTGCAT

R은 구아민과 아데닌 둘 다가 가능한 자리를 나타낸다.R represents a possible site for both a guanamine and an adenine.

실시예Example 2. 검체 시료 준비 2. Sample preparation

검체 바이러스주로는 국립환경과학원에서 보유하고 있는 조류 인플루엔자 바이러스 표준주 및 국내 분리주 등을 사용하였다. 주형으로 사용할 RNA 시료를 준비하기 위한 RNA 추출은 해당 바이러스주 혹은 검체(유제액) 150 ㎕로부터 Patho Gene-spinTM DNA/RNA Extraction Kit ((주)인트론바이오테크놀로지)를 사용하여 제품사용설명서에 따라 실시하였다. 이렇게 하여 준비된 RNA 시료는 RT-PCR 반응의 주형으로 사용하였다.The sample virus was mainly used for the avian influenza virus standard stocks and the domestic isolates from the National Institute of Environmental Research. RNA extraction for preparation of RNA samples to be used as a template is carried out using 150 μl of the virus strain or the specimen (emulsion solution) according to the product manual using the Patho Gene-spin ™ DNA / RNA Extraction Kit (Intron Biotechnology Co., Ltd.) Respectively. The prepared RNA samples were used as a template for RT-PCR reaction.

실시예Example 3. 조류 인플루엔자 바이러스 검출 및 이의 아형인  3. Avian influenza virus detection and its subtype HA1HA1 내지  To HA16HA16 형의 동시감별 검출 Simultaneous discrimination detection of mold 키트의Of kit 제작 making

실시예 1에서 제작한 본 발명의 특이 프라이머 세트를 이용하여 조류 인플루엔자 바이러스 A형 검출 및 이의 아형인 HA1 내지 HA16형의 동시감별검출을 위한 키트를 제작하였다. Using the specific primer set of the present invention prepared in Example 1, a kit for the detection of avian influenza virus type A and simultaneous differentiation detection of its subtypes HA1 to HA16 was constructed.

보다 구체적으로, 조류 인플루엔자 바이러스 A형 검출 및 이의 아형인 HA1 내지 HA16형 동시감별검출 키트의 스트립을 구성하는 각 튜브에 RT-PCR에 필요한 모든 성분들(3 unit의 역전사 효소, 5 unit의 DNA 중합효소, 50 mM의 Tris-HCl, 25 mM의 MgCl₂, 10 mM의 KCl, 2.5 mM의 dATP, 2.5 mM의 dTTP, 2.5 mM의 dGTP, 2.5 mM의 dCTP, 5 unit의 RNase Inhibitor, 0.01 M의 DTT, 1 ㎍의 8-MOP)을 첨가한 다음에, 추가하여 튜브 1에는 HA 1형 바이러스에 대한 서열번호 1과 2의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 2에는 HA 2형 바이러스에 대한 서열번호 3과 4의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 3에는 HA 3형 바이러스에 대한 서열번호 5과 6의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 4에는 HA 4형 바이러스에 대한 서열번호 7과 8의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 5에는 HA 5형 바이러스에 대한 서열번호 9과 10의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 6에는 HA 6형 바이러스에 대한 서열번호 11과 12의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 7에는 HA 7형 바이러스에 대한 서열번호 13과 14의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 8에는 HA 8형 바이러스에 대한 서열번호 15과 16의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 9에는 HA 9형 바이러스에 대한 서열번호 17과 18의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 10에는 HA 10형 바이러스에 대한 서열번호 19과 20의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 11에는 HA 11형 바이러스에 대한 서열번호 21과 22의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 12에는 HA 12형 바이러스에 대한 서열번호 23과 24의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 13에는 HA 13형 바이러스에 대한 서열번호 25과 26의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 14에는 HA 14형 바이러스에 대한 서열번호 27과 28의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 15에는 HA 15형 바이러스에 대한 서열번호 29과 30의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였고; 튜브 16에는 HA 16형 바이러스에 대한 서열번호 31과 32의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 10 pmole씩 첨가하였다. 그 다음으로는 동결건조하여 건조제형으로 제작하였다. More specifically, all the components required for RT-PCR (3 units of reverse transcriptase, 5 units of DNA polymerase 50 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl ₂ , 10 mM KCl, 2.5 mM dATP, 2.5 mM dTTP, 2.5 mM dGTP, 2.5 mM dCTP, 5 units RNase inhibitor, 0.01 M DTT , 1 ug of 8-MOP), followed by addition of 10 pmoles of forward and reverse primers of SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively, to HA1 type virus in tube 1; Tube 2 was supplemented with 10 pmole each of forward and reverse primers of SEQ ID NOS: 3 and 4 for HA type 2 virus; Tube 3 was supplemented with 10 pmole each of the forward and reverse primers of SEQ ID NOS: 5 and 6 for the HA type 3 virus; Tube 4 was added with 10 pmoles of forward and reverse primers of SEQ ID NOS: 7 and 8, respectively, for HA4 virus; Tube 5 contained 10 pmole each of forward and reverse primers of SEQ ID NOs: 9 and 10 for the HA 5 virus; Tube 6 contained 10 pmole each of forward and reverse primers of SEQ ID NOS: 11 and 12 for the HA 6 virus; Tube 7 contained 10 pmole each of forward and reverse primers of SEQ ID NOs: 13 and 14 for HA7 virus; Tube 8 was loaded with 10 pmole each of forward and reverse primers of SEQ ID NOs: 15 and 16 for the HA 8 virus; Tube 9 was loaded with 10 pmole each of forward and reverse primers of SEQ ID NOS: 17 and 18 for HA9 type virus; Tube 10 contained 10 pmole each of the forward and reverse primers of SEQ ID NOS: 19 and 20 for the HA 10 type virus; Tube 11 was loaded with 10 pmoles of forward and reverse primers of SEQ ID NOS: 21 and 22, respectively, for the HA 11 virus; Tube 12 was added with 10 pmole each of forward and reverse primers of SEQ ID NOS: 23 and 24 for HA 12 type virus; Tube 13 contained 10 pmole each of forward and reverse primers of SEQ ID NOS: 25 and 26 for HA 13 type virus; Tube 14 was loaded with 10 pmole each of forward and reverse primers of SEQ ID NOS: 27 and 28 for HA 14 type virus; Tube 15 was loaded with 10 pmole each of forward and reverse primers of SEQ ID NOs: 29 and 30 for HA 15 type virus; Tube 16 contained 10 pmole each of forward and reverse primers of SEQ ID NOS: 31 and 32 for the HA 16 virus. And then lyophilized to form a dry formulation.

실시예Example 4. 조류 인플루엔자 바이러스 A형 검출 및 이의 아형에 대한 동시감별 확인 4. Simultaneous identification of A type of avian influenza virus detection and its subtypes

4-1. 본 발명의 다중튜브(4-1. The multi-tube ( multitubemultitube ) RT-) RT- PCRPCR

본 발명자들은 멀티플렉스(다중유전자, 싱글튜브) 유형에서 발생하는 위양성/위음성 시그널 문제를 해결하기 위하여, 실시예 3에서 제작된 각각의 아형에 해당하는 프라이머 세트를 개별 튜브에 넣어 증폭시키는 다중튜브(multitube) 형태의 키트를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다.In order to solve the problem of false positives / false signals generated in a multiplex (multiple gene, single tube) type, the present inventors have developed a multiplex tube (hereinafter, referred to as " primer set " RT-PCR was performed using a multitube kit.

실시예 3에서 제조한 각 튜브에 실시예 2에서 추출된 각각의 RNA 2-3 ㎕ 및 분자생물학 실험용 물 17-18 ㎕를 첨가하여 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 조정한 후 RT-PCR을 수행하였다. 역전사 반응은 50℃에서 30분 동안 수행되었고, 94℃에서 5분간 전 변성시켰다. 이어서 94℃에서 20초, 56℃에서 40초, 72℃에서 30초간의 증폭반응을 35회 반복한 후 72℃에서 5분간 반응시켜 유지시켜 PCR을 종료하였다. 모든 반응에는 음성대조군으로 증류수를 사용하였다. 2-3 μl of each RNA extracted in Example 2 and 17-18 μl of water for molecular biological experiments were added to each tube prepared in Example 3, and the final volume was adjusted to 20 μl, followed by RT-PCR . The reverse transcription reaction was carried out at 50 ° C for 30 minutes and denatured at 94 ° C for 5 minutes. Then, amplification reaction at 94 ° C for 20 seconds, 56 ° C for 40 seconds, and 72 ° C for 30 seconds was repeated 35 times, followed by reaction at 72 ° C for 5 minutes to terminate the PCR. Distilled water was used as a negative control for all reactions.

RT-PCR 반응물 7 ㎕를 전기영동(1.5% agarose gel w/ RedSafeTM Nucleic Acid Staining Solution (20,000x) 혹은 EtBr. 110V, 40분)한 후 UV 램프하에서 관찰하였다.7 μl of RT-PCR reaction was electrophoresed (1.5% agarose gel w / RedSafe ™ Nucleic Acid Staining Solution (20,000x) or EtBr. 110V, 40 minutes) and observed under UV lamp.

교차 오염을 방지하기 위하여, 반응 및 분석 이후 잔량의 증폭 산물을 자외선이 조사 되는 벤치에 튜브 상태로 놓고 20~30분간 자외선을 조사하였다. 이에 의해 8-MOP이 활성화되어 증폭 산물이 주형으로 작용할 수 없게 되므로 교차 오염을 예방할 수 있다.To prevent cross-contamination, amplification products of the remaining amount after reaction and analysis were irradiated with ultraviolet rays for 20 to 30 minutes in a tube state on a bench to be irradiated with ultraviolet rays. This can prevent cross-contamination since 8-MOP is activated and the amplification product can not act as a template.

그 결과, 도 3 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제작된 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 HA(hemagglutinin)에 특이적인 각각의 프라이머는 각 아형 바이러스의 HA 유전자에 특이적인 산물들을 각각 증폭시켰으며 각 아형간의 비특이 반응은 나타나지 않았다. 표 2에 증폭 산물들의 구체적인 크기를 명시하였다.As a result, as shown in FIG. 3 and Table 2, each of the primers specific to HA (hemagglutinin) of the avian influenza virus A type prepared in the present invention amplified the products specific to the HA gene of each subtype virus No nonspecific reaction between each subtype was observed. Table 2 specifies the specific sizes of the amplification products.

따라서, 본 발명의 프라이머 세트는 각 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 아형에 대하여 현저한 특이도를 나타낸다는 것을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the primer set of the present invention shows a significant specificity for each subtype of avian influenza virus A type.

즉, 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 A형 검출 및 각 아형 동시감별검출 키트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 검출 및 이의 아형인 HA1 내지 HA16형을 동시적으로 감별 및 검출하는 데 유효하였다.That is, the avian influenza virus A type detection and simultaneous differentiation simultaneous detection kit of the present invention were effective for simultaneous detection and detection of avian influenza virus A type and its subtypes HA1 to HA16.

표적Target 크기(bp)Size (bp) 표적Target 크기(bp)Size (bp) HA-1HA-1 322 bp322 bp HA-9HA-9 348 bp348 bp HA-2HA-2 203 bp203 bp HA-10HA-10 149 bp149 bp HA-3HA-3 782 bp782 bp HA-11HA-11 889 bp889 bp HA-4HA-4 373 bp373 bp HA-12HA-12 505 bp505 bp HA-5HA-5 240 bp240 bp HA-13HA-13 227 bp227 bp HA-6HA-6 301 bp301 bp HA-14HA-14 390 bp390 bp HA-7HA-7 193 bp193 bp HA-15HA-15 337 bp337 bp HA-8HA-8 380 bp380 bp HA-16HA-16 400 bp400 bp

4-2. 통상적인 싱글-튜브 멀티플렉스(single-tube multiplex) RT-4-2. Conventional single-tube multiplex RT- PCRPCR

상기 실시예 4-1에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 다중튜브(multitube) 형태의 RT-PCR을 실시한 경우 본 발명의 각 프라이머 세트 및 조건이 각 아형에 특이적으로 작용함이 확인됨에 따라, 상기 프라이머를 동시에 하나의 시험관내에 혼합한 멀티플렉스 형태의 경우와 비교하기 위하여 상술한 동일 조건하에서 싱글-튜브 멀티플렉스 RT-PCR을 실시하였다.As shown in Example 4-1, when the multitube RT-PCR of the present invention was performed, it was confirmed that each primer set and conditions of the present invention specifically acted on each subtype, Single-tube multiplex RT-PCR was performed under the same conditions as described above in order to compare with the case of the multiplex type in which the primers were simultaneously mixed in one test tube.

16 쌍의 프라이머 세트가 모두 포함되어 있는 튜브에 실시예 2에서 추출된 각각의 RNA 2-3 ㎕ 및 분자생물학 실험용 물 17-18 ㎕를 첨가하여 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 조정한 후 RT-PCR을 수행하였다. 역전사 반응은 50℃에서 30분동안 수행되었고, 94℃에서 5분간 전 변성시켰다. 이어서 94℃에서 20초, 56℃에서 40초, 72℃에서 30초간의 증폭반응을 35회 반복한 후 72℃에서 5분간 반응시켜 유지시켜 PCR을 종료하였다. 모든 반응에는 음성대조군으로 증류수를 사용하였다. 2-3 μl of each RNA extracted in Example 2 and 17-18 μl of water for molecular biological experiments were added to a tube containing all 16 sets of primer sets, and the final volume was adjusted to 20 μl, followed by RT-PCR Respectively. The reverse transcription reaction was carried out at 50 ° C for 30 minutes and denatured at 94 ° C for 5 minutes. Then, amplification reaction at 94 ° C for 20 seconds, 56 ° C for 40 seconds, and 72 ° C for 30 seconds was repeated 35 times, followed by reaction at 72 ° C for 5 minutes to terminate the PCR. Distilled water was used as a negative control for all reactions.

RT-PCR 반응물 7 ㎕를 전기영동(1.5% agarose gel w/ RedSafeTM Nucleic Acid Staining Solution (20,000x) 혹은 EtBr. 110V, 40분)한 후 UV 램프하에서 관찰하였다.7 μl of RT-PCR reaction was electrophoresed (1.5% agarose gel w / RedSafe ™ Nucleic Acid Staining Solution (20,000x) or EtBr. 110V, 40 minutes) and observed under UV lamp.

교차 오염을 방지하기 위하여, 반응 및 분석 이후 잔량의 증폭 산물을 자외선이 조사 되는 벤치에 튜브 상태로 놓고 20~30분간 자외선을 조사하였다. 이에 의해 8-MOP이 활성화되어 증폭 산물이 주형으로 작용할 수 없게 되므로 교차 오염을 예방할 수 있다.To prevent cross-contamination, amplification products of the remaining amount after reaction and analysis were irradiated with ultraviolet rays for 20 to 30 minutes in a tube state on a bench to be irradiated with ultraviolet rays. This can prevent cross-contamination since 8-MOP is activated and the amplification product can not act as a template.

그 결과, 본 발명의 다중튜브 RT-PCR에 비하여 민감도 및 특이도 부분에서 떨어지는 결과를 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the sensitivity and specificity were lower than those of the multi-tube RT-PCR of the present invention.

따라서, 본 발명의 다중튜브 방식의 조류 인플루엔자 바이러스 A형 검출 및 각 아형 동시감별검출 키트가 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 검출 및 이의 아형인 HA1 내지 HA16형을 동시적으로 감별 및 검출하는 데 유효함을 확인할 수 있었다.Therefore, the multi-tube avian influenza A type detection and simultaneous discrimination detection kit of the present invention is effective for simultaneous detection and detection of avian influenza A type A and its subtypes HA1 to HA16 I could confirm.

실시예Example 5. 임상 시료에서의 본 발명의 다중튜브( 5. Multi-tubes of the invention in clinical samples ( multitubemultitube ) RT-) RT- PCRPCR 및 기존 싱글-튜브 멀티플렉스(single-tube multiplex) RT- And conventional single-tube multiplex RT- PCRPCR 의 효과 비교Comparison of Effects

본 발명자들은 추가적으로 실제 임상 시료에서의 본 발명의 다중튜브(multitube) RT-PCR 및 기존 싱글-튜브 멀티플렉스(single-tube multiplex) RT-PCR의 민감도 및 특이도를 비교하기 위하여, 국립환경과학원에서 국내분리주로부터 추출한 AIV HA RNA 및 NDV, APMV RNA를 제공받아 테스트를 진행하였다.We further compared the sensitivity and specificity of the present multitube RT-PCR and conventional single-tube multiplex RT-PCR in actual clinical samples using the National Institute of Environmental Research AIV HA RNA, NDV, and APMV RNA extracted from domestic isolates were tested and tested.

5-1. 민감도 비교5-1. Sensitivity comparison

본 발명의 다중튜브의 경우, 실시예 3에서 제조한 AIV HA(1-16) 아형 검출을 위한 다중튜브 검출 키트를 사용하였다.For the multi-tube of the present invention, a multi-tube detection kit for subtyping AIV HA (1-16) prepared in Example 3 was used.

간략하게, 샘플 RNA 5 ㎕, 각 F/R 프라이머 10 pmol 및 DNase/RNase free water를 첨가하여 하기 표 3과 같은 조건으로 PCR을 실시한 후, 2% 아가로즈 겔에 전기영동(150V, 30mins)하여 확인하였다. 이때, 민감도 관찰을 위하여 RNA를 1/2씩 일련으로 희석하였다. Briefly, 5 μl of sample RNA, 10 pmol of each F / R primer and DNase / RNase free water were added and subjected to PCR under the conditions shown in Table 3 below. Then, electrophoresis (150 V, 30 mins) was performed on 2% agarose gel Respectively. At this time, RNA was serially diluted by 1/2 for sensitivity observation.

RT-RT- PCRPCR 사이클 cycle 온도Temperature 시간time 1 사이클1 cycle Reverse transcriptionReverse transcription 50℃ 50 ℃ 30 min30 min Inactivation of reverse transcriptionInactivation of reverse transcription 94℃ 94 ° C 5 min5 min 35 사이클35 cycles DenaturationDenaturation 94℃ 94 ° C 20 sec20 sec AnnealingAnnealing 56℃ 56 ℃ 40 sec40 sec ExtensionExtension 72℃ 72 ℃ 30 sec30 sec 1 사이클1 cycle Final extensionFinal extension 72℃ 72 ℃ 5 min5 min

기존 싱글 튜브 멀티플렉스의 경우, 공지된 HiSenScript RH(-) RT-PCR Premix 키트((주) 인트론, Cat No. 25135)를 사용하였다.For the conventional single-tube multiplex, a known HiSenScript RH (-) RT-PCR Premix kit (Intron, Cat No. 25135) was used.

간략하게, 샘플 RNA 5 ㎕, 각 F/R 프라이머 10 pmol 및 DNase/RNase free water를 첨가하여 상술한 다중튜브와 같은 조건으로 PCR을 실시한 후, 2% 아가로즈 겔에 전기영동(150V, 30mins)하여 확인하였다. 이때, 인위적으로 샘플의 크기를 고려하여 2, 3 및 4 가지 멀티플렉스 쌍(primer)을 첨가하였다(표 4). Briefly, 5 μl of sample RNA, 10 pmol of each F / R primer and DNase / RNase free water were added and PCR was carried out under the same conditions as those of the above-described multi-tube. Then, electrophoresis (150 V, 30 mins) Respectively. At this time, 2, 3 and 4 multiplexers (primers) were added considering the sample size artificially (Table 4).

2가지 멀티플렉스 유형Two multiplex types (H1,H3) (H7,H8) (H12,H15) (H13,H16)(H1, H3) (H7, H8) (H12, H15) (H13, H16) 3가지 멀티플렉스 유형Three multiplex types (H1,H2,H3) (H4,H5,H7) (H8,H12,H13)(H1, H2, H3) (H4, H5, H7) (H8, H12, H13) 4가지 멀티플렉스 유형4 multiplex types (H4,H5,H10,H11)(H4, H5, H10, H11)

그 결과, 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 다중튜브(도 4a)는 기존 싱글 튜브 멀티플렉스(도 4b)와 비교하여, 저농도의 샘플 RNA도 검출하였다.As a result, as shown in Figs. 4A and 4B, the multi-tubes of the present invention (Fig. 4A) also detected low-concentration sample RNAs as compared to conventional single-tube multiplexes (Fig. 4B).

따라서, 본 발명의 다중튜브는 각 아형에 대하여 현저한 민감도를 나타낸다는 것을 알 수 있다.Thus, it can be seen that the multiple tubes of the present invention exhibit significant sensitivity to each subtype.

즉, 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스 A형 검출 및 각 아형 동시감별검출 키트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 검출 및 이의 아형인 HA1 내지 HA16형을 동시적으로 민감하게 감별 및 검출하는 데 유효하였다.That is, the avian influenza virus A type detection and each simultaneous discrimination detection kit of the present invention were effective for simultaneous and sensitive discrimination and detection of avian influenza virus type A detection and its subtypes HA1 to HA16.

5-2. 특이도 비교5-2. Comparison of specificity

간략하게, 본 발명의 다중튜브의 경우, 실시예 3에서 제조한 AIV HA(1-16) 아형 검출을 위한 다중튜브 검출 키트를 사용하였으며, 국립환경과학원 측에서 전달 받은 APMV와 NDV 시료를 적용하여 샘플 RNA 5 ㎕, 각 F/R 프라이머 10 pmol 및 DNase/RNase free water를 첨가하여 상기 표 4와 같은 조건으로 PCR을 실시한 후, 2% 아가로즈 겔에 전기영동(150V, 30mins)하여 확인하였다. Briefly, in the case of the multi-tube of the present invention, a multi-tube detection kit for detecting AIV HA (1-16) subtype prepared in Example 3 was used, APMV and NDV samples received from the National Institute of Environmental Research 5 μl of the sample RNA, 10 pmol of each F / R primer, and DNase / RNase free water were added and PCR was carried out under the conditions shown in Table 4, followed by electrophoresis (150 V, 30 mins) on 2% agarose gel.

즉, 실시예 3에서 제조한 AIV HA(1-16) 아형 검출을 위한 다중튜브 검출 키트에 AIV와 유사성이 높은 APMV, NDV와 같은 다른 시료를 적용하여, 이들의 검출 여부를 확인해 본 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 다른 샘플 시료와의 특이적 반응을 보이지 않는 것으로 나타났다.That is, other samples such as APMV and NDV, which have high similarity to AIV, were applied to a multi-tube detection kit for subtyping AIV HA (1-16) prepared in Example 3, As shown in Fig. 5, no specific reaction with other sample samples was observed.

따라서, 본 발명의 다중튜브는 AIV HA에 대하여 현저한 특이도를 나타낸다는 것을 알 수 있다.Thus, it can be seen that the multiple tubes of the invention exhibit significant specificity for AIV HA.

즉, 본 발명의 다중튜브 방식을 이용한 조류 인플루엔자 바이러스 A형 검출 및 각 아형 동시감별검출 키트는 조류 인플루엔자 바이러스 A형의 검출 및 이의 아형인 HA1 내지 HA16형만을 특이적으로 감별 및 검출하는 데 유효하였다.That is, the avian influenza virus A type detection and simultaneous differentiation simultaneous detection kit using the multi-tube method of the present invention is effective for specifically detecting and detecting only avian influenza A type and its subtypes HA1 to HA16 .

<110> National Institute of Environmental Research INTRON BIOTECHNOLOGY CO., LTD <120> Primers for Detecting Avian Influenza Virus Hemagglutinin Subtype and Uses Thereof <130> INTRON1-2p-1 <150> KR 10-2015-0144264 <151> 2015-10-15 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1-F <400> 1 ctaccatgca aacaattcta c 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1-R <400> 2 ttctcaaatg aagacactga ac 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H2-F <400> 3 ggagaccaga tatgcattgg 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H2-R <400> 4 attctggatt tccaaggag 19 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3-F <400> 5 gctcaataat gagatcagat gc 22 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3-R <400> 6 aagcatgata tggcaaagg 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H4-F <400> 7 ttgatttatg gtcatataat gc 22 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H4-R <400> 8 cgttttgaca agcccac 17 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5-F <400> 9 atggtagatg gttggtatgg 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5-R <400> 10 gcattataag tccagacatc tag 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H6-F <400> 11 agcatgaatt ttgccaagag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H6-R <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> R denotes G or A. <400> 12 ggrcattctc ctatccacag 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7-F <400> 13 ataacaccta tgatcacagc aa 22 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7-R <400> 14 tgcaccgcat gtttcc 16 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H8-F <400> 15 gggcctacaa tgcagagc 18 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H8-R <400> 16 catctacaag atccattttg c 21 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H9-F <400> 17 atgatcaata ataagattga tga 23 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H9-R <400> 18 gcgacagtcg aataaatgg 19 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H10-F <400> 19 gagagcataa gaaacaacac c 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H10-R <400> 20 gaagaacaaa acatgatgcc 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H11-F <400> 21 caggagtgac tgctgcatg 19 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H11-R <400> 22 ggagttgtgc attatatgac c 21 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H12-F <400> 23 aacaatgtca ttgacaaaat ga 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H12-R <400> 24 gaaagtacaa cgaacatttc c 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H13-F <400> 25 gagagttaga caacaatgga ga 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H13-R <400> 26 ctgccagttg tgttgttgta 20 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H14-F <400> 27 caatggacac gtgctatcc 19 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H14-R <400> 28 tggtctactt cctatattgg g 21 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H15-F <400> 29 aaagggagga aagctgtgg 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H15-R <400> 30 tagttgtggg aacacctgg 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H16-F <400> 31 atcaacaaaa gagtggagca 20 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H16-R <400> 32 tggcactttg tgttgcat 18 <110> National Institute of Environmental Research          INTRON BIOTECHNOLOGY CO., LTD <120> Primers for Detecting Subtype of Avian Influenza Virus Hemagglutinin          and Uses Thereof <130> INTRON1-2p-1 <150> KR 10-2015-0144264 <151> 2015-10-15 <160> 32 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1-F <400> 1 ctaccatgca aacaattcta c 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1-R <400> 2 ttctcaaatg aagacactga ac 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> H2-F <400> 3 ggagaccaga tatgcattgg 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H2-R <400> 4 attctggatt tccaaggag 19 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3-F <400> 5 gctcaataat gagatcagat gc 22 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3-R <400> 6 aagcatgata tggcaaagg 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H4-F <400> 7 ttgatttatg gtcatataat gc 22 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H4-R <400> 8 cgttttgaca agcccac 17 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5-F <400> 9 atggtagatg gttggtatgg 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5-R <400> 10 gcattataag tccagacatc tag 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H6-F <400> 11 agcatgaatt ttgccaagag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H6-R <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> R denotes G or A. <400> 12 ggrcattctc ctatccacag 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7-F <400> 13 ataacaccta tgatcacagc aa 22 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7-R <400> 14 tgcaccgcat gtttcc 16 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H8-F <400> 15 gggcctacaa tgcagagc 18 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H8-R <400> 16 catctacaag atccattttg c 21 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H9-F <400> 17 atgatcaata ataagattga tga 23 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H9-R <400> 18 gcgacagtcg aataaatgg 19 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H10-F <400> 19 gagagcataa gaaacaacac c 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H10-R <400> 20 gaagaacaaa acatgatgcc 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H11-F <400> 21 caggagtgac tgctgcatg 19 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H11-R <400> 22 ggagttgtgc attatatgac c 21 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H12-F <400> 23 aacaatgtca ttgacaaaat ga 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H12-R <400> 24 gaaagtacaa cgaacatttc c 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H13-F <400> 25 gagagttaga caacaatgga ga 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H13-R <400> 26 ctgccagttg tgttgttgta 20 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H14-F <400> 27 caatggacac gtgctatcc 19 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H14-R <400> 28 tggtctactt cctatattgg g 21 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H15-F <400> 29 aaagggagga aagctgtgg 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H15-R <400> 30 tagttgtggg aacacctgg 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H16-F <400> 31 atcaacaaaa gagtggagca 20 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H16-R <400> 32 tggcactttg tgttgcat 18

Claims (12)

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 22의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 23의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 24의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 25의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 29의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 30의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및 서열번호 31의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 32의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 프라이머 세트;를 포함하는 A형 조류 인플루엔자 바이러스(Avian Influenza Virus) 검출을 위한 다중튜브(multitube) RT-PCR 용 프라이머 세트로서,
상기 프라이머 세트는 HA 1형, HA 2형, HA 3형, HA 4형, HA 5형, HA 6형, HA 7형, HA 8형, HA 9형, HA 10형, HA 11형, HA 12형, HA 13형, HA 14형, HA 15형, 및 HA 16형을 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28; A primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30; And a primer set consisting of a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 and a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32, and a multitube RT- As a primer set for PCR,
HA 1 type, HA 2 type, HA 3 type, HA 4 type, HA 5 type, HA 6 type, HA 7 type, HA 8 type, HA 9 type, HA 10 type, HA 11 type, HA 12 type , HA 13 type, HA 14 type, HA 15 type, and HA 16 type at the same time. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 A형 조류 인플루엔자 바이러스(Avian Influenza Virus) 검출용 조성물로서,
상기 프라이머 세트는 HA 1형, HA 2형, HA 3형, HA 4형, HA 5형, HA 6형, HA 7형, HA 8형, HA 9형, HA 10형, HA 11형, HA 12형, HA 13형, HA 14형, HA 15형, 및 HA 16형을 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 조성물. A composition for detecting avian influenza virus (A) comprising the primer set according to claim 1,
HA 1 type, HA 2 type, HA 3 type, HA 4 type, HA 5 type, HA 6 type, HA 7 type, HA 8 type, HA 9 type, HA 10 type, HA 11 type, HA 12 type HA 13, HA 14, HA 15, and HA 16 at the same time. 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 A형 조류 인플루엔자 바이러스(Avian Influenza Virus) 검출을 위한 다중튜브(multitube) RT-PCR 용 키트로서,
상기 프라이머 세트는 HA 1형, HA 2형, HA 3형, HA 4형, HA 5형, HA 6형, HA 7형, HA 8형, HA 9형, HA 10형, HA 11형, HA 12형, HA 13형, HA 14형, HA 15형, 및 HA 16형을 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 키트. A kit for multitube RT-PCR for detection of Avian Influenza Virus comprising a primer set according to claim 1,
HA 1 type, HA 2 type, HA 3 type, HA 4 type, HA 5 type, HA 6 type, HA 7 type, HA 8 type, HA 9 type, HA 10 type, HA 11 type, HA 12 type Type, HA 13 type, HA 14 type, HA 15 type, and HA 16 type. 삭제delete 다음 단계를 포함하는 A형 조류 인플루엔자 바이러스(Avian Influenza Virus) 검출 방법:
(a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 RNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 다중튜브(multitube) 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 실시하여 표적 서열을 증폭하는 단계로서,
상기 프라이머 세트는 HA 1형, HA 2형, HA 3형, HA 4형, HA 5형, HA 6형, HA 7형, HA 8형, HA 9형, HA 10형, HA 11형, HA 12형, HA 13형, HA 14형, HA 15형, 및 HA 16형을 동시에 검출하며; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계.Method for detecting avian influenza virus (Avian Influenza Virus) comprising the steps of:
(a) separating RNA from a specimen;
(b) amplifying the target sequence by performing a multitube RT-PCR (RT-PCR) using the separated RNA as a template and using the primer set according to claim 1,
HA 1 type, HA 2 type, HA 3 type, HA 4 type, HA 5 type, HA 6 type, HA 7 type, HA 8 type, HA 9 type, HA 10 type, HA 11 type, HA 12 type HA 13, HA 14, HA 15, and HA 16 at the same time; And
(c) detecting the amplification product. 제9항에 있어서, 상기 검체는 조류, 가축 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.10. The method according to claim 9, wherein the specimen is at least one selected from the group consisting of algae, livestock, and human. 제9항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.10. The method of claim 9, wherein the detection of the amplification product is performed by DNA chip, gel electrophoresis, capillary electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement. 삭제delete

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