KR101803179B1 - A method for preparing a pH-sensitive 3D scaffold and a cell culture scaffold using the same - Google Patents

Abstract

본 발명은 pH 민감성 3차원 스캐폴드의 제조방법 및 이에 따라 제조된 세포배양용 스캐폴드에 관한 것이다.The present invention relates to a process for producing a pH-sensitive three-dimensional scaffold and a scaffold for cell culture prepared thereby.

Description

pH 민감성 3차원 스캐폴드 제조방법 및 이를 이용한 세포배양용 스캐폴드{A method for preparing a pH-sensitive 3D scaffold and a cell culture scaffold using the same}[0001] The present invention relates to a method for preparing a pH-sensitive three-dimensional scaffold and a scaffold for cell culture using the same,

본 발명은 pH 민감성 3차원 스캐폴드의 제조방법 및 이에 따라 제조된 세포배양용 스캐폴드에 관한 것이다.The present invention relates to a process for producing a pH-sensitive three-dimensional scaffold and a scaffold for cell culture prepared thereby.

조직공학은 다양한 분야의 생명과학과 공학 기술을 융합하여 생체대용품을 만들어 이식함으로써 사고나 질병에 의해 결손된 우리 몸을 대체 또는 복원하는 것을 목적으로 하고 있는 학문이다. 조직공학에서 중요한 하나의 요소가 인공장기를 구성하고 있는 생체재료로서, 생체적합성이 우수하여야 하며, 독성이 없어야 한다. 이에 더불어, 사용 목적 및 용도에 알맞는 기계적, 물리적 성질 및 성형가공성이 요구되어진다. 큰 표면적의 부피와 다공성을 가져야 하며, 생분해성을 고려해야 한다. 이러한 세포가 지지하며 자랄 수 있는 지지체 역할을 하는 조직공학용 스캐폴드 개발은 생물학, 공학, 그리고, 의학 등 다학제간 협동연구가 필요하다.Tissue engineering is a discipline that aims at replacing or restoring our deficient body by accident or disease by transplanting bio-substitute by implanting bio-science and engineering technology in various fields. One important factor in tissue engineering is biomaterials that make up artificial organs, and should be biocompatible and non-toxic. In addition, there is a demand for mechanical and physical properties and molding processability suited to the intended use and application. It should have a large surface area volume and porosity, and biodegradability should be considered. The development of scaffolds for tissue engineering, which act as supportive supports for these cells, requires multidisciplinary collaborative research in biology, engineering, and medicine.

생체조직공학에서 세포가 자랄 수 있는 지지체 역할을 하는 스캐폴드는 천연고분자재료와 합성고분자재료로 나누어진다. 천연유래 생체재료는 세포외 기질과 비슷한 성질을 가지고 있으며, 비교적 우수한 생체적합성을 지니고 있다. 천연유래 고분자로는 알지네이트, 콜라겐, 피브린, 키토산, 실크 등이 널리 알려져 있다. 이에 비해 합성 고분자 재료는 값이 싸며, 분자구조와 분자량을 조절할 수 있어 물리적, 기계적 특성을 조절할 수 있고, 생분해성을 조절할 수 있는 장점을 가지고 있다. 대표적인 합성고분자 재료로는 PLGA, PGA, PLA, PCL 등이 있다.Scaffolds that serve as support for cell growth in biotissue engineering are divided into natural polymeric materials and synthetic polymeric materials. Natural-derived biomaterials have properties similar to extracellular matrix and have relatively good biocompatibility. As natural polymers, alginate, collagen, fibrin, chitosan, silk and the like are widely known. In contrast, synthetic polymer materials are cheap and can control the molecular structure and molecular weight, so that they can control the physical and mechanical properties and can control the biodegradability. Typical synthetic polymeric materials include PLGA, PGA, PLA, and PCL.

인체 결손부위의 복원을 위한 인공지지체인 3차원 스캐폴드를 제작하기 위한 일반적으로 알려진 기술은 염류 용탈법(salt leaching), 용융주조법(melt moulding), 동결 건조법(freeze drying) 등이 있다. 대표적인 염류 용탈법은 다공성 스캐폴드를 제조하기 위한 잘 알려져 있는 방법으로서, 용액 상태의 고분자에 염 결정을 첨가하여 형성하는 것으로 혼합하는 염결정형태에 따라 공극의 형태가 결정되어진다. 그러나, 지지체 내부의 상호연결성이 약하기 때문에 세포의 침투와 배양을 방해할 수 있으며, 강도가 약한 단점이 있다. 또한, 두꺼운 지지체의 경우, 염결정의 잔류 문제가 야기되어지고 있다. 용융주조법(melt moulding)은 PLGA 파우더와 젤라틴 입자를 테플론 몰드에 넣어 열을 가한 후, 젤라틴은 녹여내는 방법이다. 동결 건조법은 유기용매에 녹인 고분자를 동결 건조에 의해 얼음 결정을 녹여내어 스캐폴드를 제조하는 방법이다.Generally known techniques for fabricating a three-dimensional scaffold, which is an artificial support for restoring a defect site, include salt leaching, melt molding, freeze drying, and the like. As a well-known method for preparing a porous scaffold, a typical salt-type demolding method is formed by adding salt crystals to a polymer in a solution state, and the shape of the pores is determined according to the type of salt crystals to be mixed. However, since the interconnection of the inside of the support is weak, it may interfere with cell infiltration and culturing, and the strength is weak. Further, in the case of a thick support, a problem of residual salt crystals is caused. Melting molding is a method in which PLGA powder and gelatin particles are heated in a Teflon mold to dissolve gelatin. In the freeze-drying method, a polymer dissolved in an organic solvent is lyophilized to dissolve ice crystals to prepare a scaffold.

나아가, 전술한 각각의 스캐폴드의 제조방법의 단점을 보완하고자, 염류 용탈법과 용융주조법을 결합시킨 방법도 제안된 바 있으나(Biomaterials, 2003, 24(22): 4011-4021), 고분자 입자들의 응집으로 인해 균일한 기공을 형성하기 어려운 문제점이 여전히 남아있다.In order to compensate for the disadvantages of the scaffold fabrication methods described above, a combination of a salt leaching method and a melt casting method has been proposed (Biomaterials, 2003, 24 (22): 4011-4021) There is still a problem that it is difficult to form uniform pores.

이에, 본 발명자들은 종래 스캐폴드 제조방법을 개선하여 보다 우수한 성질의 스캐폴드를 제공할 수 있는 방법을 발굴하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 염류 용탈법 및 용융주조법을 조합하여 염 사이에 입자 대신 용액 상태의 고분자를 삽입하고 압력을 가하여 주조한 후 염류를 용출시킴으로서 보다 균일한 기공을 가지면서도 강도가 우수한 3차원 스캐폴드를 제공할 수 있음은 물론, 온도 및 pH 감응성 3중 블록 공중합체를 사용하여 제조한 스캐폴드는 pH 민감성을 나타내어 pH 조건을 변화시키는 방법으로 완전히 제거 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.The present inventors have made intensive researches to find a method of providing a scaffold of better quality by improving the conventional scaffold manufacturing method. As a result, they have found that a combination of a salt dissolution method and a melt casting method, The present invention can provide a three-dimensional scaffold having more uniform pores and higher strength, as well as providing a three-dimensional scaffold with temperature and pH sensitive triple block copolymer A scaffold exhibits a pH-sensitive property and can be completely removed by changing the pH condition, thus completing the present invention.

본 발명의 하나의 목적은 제1블록의 pH 민감성 고분자로서, 폴리(β-아미노에스터); 제2블록의 친수성 고분자로서, 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물; 및 제3블록의 pH 민감성 고분자로서, 폴리(β-아미노에스터)를 포함하는 3중 블록 공중합체를 유기용매에 용해시킨 고분자 용액을 준비하는 제1단계; 상기 고분자 용액에 염을 첨가하여 혼합하는 제2단계; 제2단계로부터 수득한 혼합물로부터 유기용매를 증발시키는 제3단계; 주형에 상부와 하부에는 염을 채우고 그 사이에 제3단계로부터 수득한 유기용매를 증발시킨 혼합물을 넣고 압력을 가하여 스캐폴드를 제조하는 제4단계; 및 상기 제4단계로부터 수득한 스캐폴드를 물을 포함하는 용액에 함침시켜 염을 제거하는 제5단계를 포함하는, pH 민감성 3차원 스캐폴드의 제조방법을 제공하는 것이다.One object of the present invention is a pH-sensitive polymer of the first block comprising a poly (beta -amino ester); As the hydrophilic polymer of the second block, a polyethylene glycol-based compound; A first step of preparing a polymer solution in which a triblock copolymer containing a poly (? -Amino ester) is dissolved in an organic solvent as a pH-sensitive polymer in a third block; A second step of adding and mixing a salt to the polymer solution; A third step of evaporating the organic solvent from the mixture obtained from the second step; A fourth step of preparing a scaffold by applying a pressure to a mold in which salt is filled in the upper part and the lower part and the organic solvent obtained in the third step is evaporated therebetween; And a fifth step of impregnating the scaffold obtained from the fourth step with a solution containing water to remove the salt. The present invention also provides a method for producing a pH-sensitive three-dimensional scaffold.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 세포배양용 3차원 스캐폴드를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a three-dimensional scaffold for cell culture produced by the above method.

본 발명의 또 다른 목적은 제1블록의 pH 민감성 고분자로서, 폴리(β-아미노에스터); 제2블록의 친수성 고분자로서, 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물; 및 제3블록의 pH 민감성 고분자로서, 폴리(β-아미노에스터)를 포함하는 3중 블록 공중합체를 유기용매에 용해시킨 고분자 용액을 준비하는 제1단계; 상기 고분자 용액에 염을 첨가하여 혼합하는 제2단계; 제2단계로부터 수득한 혼합물로부터 유기용매를 증발시키는 제3단계; 주형에 상부와 하부에는 염을 채우고 그 사이에 제3단계로부터 수득한 유기용매를 증발시킨 혼합물을 넣고 압력을 가하여 스캐폴드를 제조하는 제4단계; 상기 제4단계로부터 수득한 스캐폴드를 물을 포함하는 용액에 함침시켜 염을 제거하는 제5단계; 상기 제5단계로부터 수득한 스캐폴드에 세포를 배양하는 제6단계; 및 상기 제6단계로부터 수득한 배양된 세포를 포함하는 스캐폴드를 pH 5 내지 6.5로 조정된 용액에 침지시켜 스캐폴드를 제거하고 배양된 세포를 분리하여 회수하는 제7단계를 포함하는, 분리된 세포의 제조방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is a pH-sensitive polymer of the first block, comprising a poly (beta -amino ester); As the hydrophilic polymer of the second block, a polyethylene glycol-based compound; A first step of preparing a polymer solution in which a triblock copolymer containing a poly (? -Amino ester) is dissolved in an organic solvent as a pH-sensitive polymer in a third block; A second step of adding and mixing a salt to the polymer solution; A third step of evaporating the organic solvent from the mixture obtained from the second step; A fourth step of preparing a scaffold by applying a pressure to a mold in which salt is filled in the upper part and the lower part and the organic solvent obtained in the third step is evaporated therebetween; A fifth step of impregnating the scaffold obtained from the fourth step with a solution containing water to remove the salt; A sixth step of culturing the cells in the scaffold obtained from the fifth step; And a seventh step of immersing the scaffold containing the cultured cells obtained in the step 6 in a solution adjusted to pH 5 to 6.5 to remove the scaffold and isolating and recovering the cultured cells. And to provide a method for producing a cell.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 제1블록의 pH 민감성 고분자로서, 폴리(β-아미노에스터); 제2블록의 친수성 고분자로서, 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물; 및 제3블록의 pH 민감성 고분자로서, 폴리(β-아미노에스터)를 포함하는 3중 블록 공중합체를 유기용매에 용해시킨 고분자 용액을 준비하는 제1단계; 상기 고분자 용액에 염을 첨가하여 혼합하는 제2단계; 제2단계로부터 수득한 혼합물로부터 유기용매를 증발시키는 제3단계; 주형에 상부와 하부에는 염을 채우고 그 사이에 제3단계로부터 수득한 유기용매를 증발시킨 혼합물을 넣고 압력을 가하여 스캐폴드를 제조하는 제4단계; 및 상기 제4단계로부터 수득한 스캐폴드를 물을 포함하는 용액에 함침시켜 염을 제거하는 제5단계를 포함하는, pH 민감성 3차원 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.In one aspect of the present invention, the present invention provides a pH-sensitive polymer of the first block, wherein the poly (beta -amino ester); As the hydrophilic polymer of the second block, a polyethylene glycol-based compound; A first step of preparing a polymer solution in which a triblock copolymer containing a poly (? -Amino ester) is dissolved in an organic solvent as a pH-sensitive polymer in a third block; A second step of adding and mixing a salt to the polymer solution; A third step of evaporating the organic solvent from the mixture obtained from the second step; A fourth step of preparing a scaffold by applying a pressure to a mold in which salt is filled in the upper part and the lower part and the organic solvent obtained in the third step is evaporated therebetween; And a fifth step of impregnating the scaffold obtained from the fourth step with a solution containing water to remove the salt. The present invention also provides a method for producing a pH-sensitive three-dimensional scaffold.

예컨대, 상기 3중 블록 공중합체는 온도 민감성 및 pH 민감성을 나타내는 것일 수 있다. 이에 따라 상기 3중 블록 공중합체는 이의 온도 및 pH 환경을 조절함으로써 졸-겔 상전이 가능한 물질일 수 있다.For example, the triblock copolymer may be one that exhibits temperature sensitivity and pH sensitivity. Accordingly, the triple block copolymer may be a substance capable of sol-gel phase transition by controlling its temperature and pH environment.

예컨대, 상기 3중 블록 공중합체는 8,000 내지 15,000의 수평균 분자량을 갖는 것일 수 있다.For example, the tri-block copolymer may have a number average molecular weight of 8,000 to 15,000.

예컨대, 상기 3중 블록 공중합체는 총 분자량에 있어서 제2블록의 비율이 0.07 내지 0.4일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 3중 블록 공중합체의 총 분자량에 있어서 제2블록의 비율이 0.07 미만이거나 0.4 초과인 경우 이로부터 제조된 스캐폴드 상에서 세포를 배양하는 경우 스캐폴드의 불안정성으로 인해 배양되는 세포의 생존율이 현저히 감소하여 세포 배양에 불리할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 3중 블록 공중합체는 총 분자량에 있어서 제2블록의 비율이 각각 약 0.07 및 0.53인 비교예들의 3중 블록 공중합체로 제조한 스캐폴드에 세포를 배양한 경우 세포 생존율이 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다.For example, the ratio of the second block in the total molecular weight of the triple block copolymer may be 0.07 to 0.4, but is not limited thereto. When the ratio of the second block in the total molecular weight of the triblock copolymer is less than 0.07 or more than 0.4, when the cells are cultured on the scaffold prepared from the triblock copolymer, the survival rate of cells cultured due to scaffold instability is remarkably reduced It may be disadvantageous for cell culture. In a specific example of the present invention, when the cells were cultured in a scaffold prepared from a tri-block copolymer of Comparative Example in which the ratio of the second block in the total molecular weight was about 0.07 and 0.53, respectively, the cell survival rate Which was significantly reduced.

예컨대, 상기 3중 블록 공중합체는 제1블록의 pH 민감성 고분자로서 수평균 분자량 3,000 내지 5,000의 폴리(β-아미노에스터); 제2블록의 친수성 고분자로서 수평균 분자량 1000 내지 3500의 양말단에 이중결합을 갖는 폴리에틸렌글리콜; 및 제3블록의 pH 민감성 고분자로서 수평균 분자량 3,000 내지 5,000의 폴리(β-아미노에스터)가 커플링되어 형성된 공중합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.For example, the triple block copolymer may be a poly (beta -amino ester) having a number average molecular weight of 3,000 to 5,000 as a pH-sensitive polymer in the first block; Polyethylene glycol having a double bond at both ends of a number average molecular weight of 1000 to 3500 as the hydrophilic polymer of the second block; And a poly (? -Amino ester) having a number average molecular weight of 3,000 to 5,000 as a pH-sensitive polymer in the third block, but is not limited thereto.

상기 제1블록 및 제3블록의 pH 민감성 고분자로는 폴리(β-아미노에스터) 이외에 폴리(아미노 아민), 폴리(아미노 우레탄), 폴리(아미노 우레탄 우레아)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As the pH-sensitive polymer in the first block and the third block, poly (aminoamine), poly (amino urethane), and poly (amino urethane urea) may be used in addition to poly (?

또한, 상기 제2블록의 친수성 고분자로는 폴리에틸렌글리콜 이외에 폴리비닐피롤리돈을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As the hydrophilic polymer in the second block, polyvinyl pyrrolidone may be used in addition to polyethylene glycol, but the present invention is not limited thereto.

상기 유기용매로는 클로로포름 또는 디클로로메탄을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 추후 제거가 용이하도록 끓는 점이 낮은 물질을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The organic solvent may be chloroform or dichloromethane, but is not limited thereto. For example, materials with low boiling points may be used to facilitate subsequent removal, but are not limited thereto.

상기 염으로는 염화나트륨 또는 염화칼륨을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As the salt, sodium chloride or potassium chloride can be used, but it is not limited thereto.

상기 염으로서 수가용성 염을 사용하는 경우 최종 형성된 스캐폴드를 물을 포함하는 용액, 예컨대, 탈이온수에 함침시키는 간단한 방법으로 선택적으로 염을 제거할 수 있다.If a water soluble salt is used as the salt, the salt may be selectively removed by a simple method of impregnating the final formed scaffold with a solution containing water, such as deionized water.

본 발명에 따른 제조방법에서 블록 공중합체와 염은 0.7:9.3 내지 5:5의 중량비로 사용할 수 있다. 블록 공중합체의 비율이 상기 범위보다 낮은 경우 기공이 너무 크게 형성되어 구조의 연결이 미흡하여 원하는 강도를 확보하기 어려울 수 있다. 반면, 상기 비율을 초과하는 경우 기공의 크기가 작아져 물질 예컨대, 세포 및/또는 배양액의 출입이 원활하지 못해 그 활용이 제한될 수 있다.In the production process according to the present invention, the block copolymer and the salt may be used in a weight ratio of 0.7: 9.3 to 5: 5. If the ratio of the block copolymer is lower than the above range, the pores are formed too large, so that the connection of the structure is insufficient and it may be difficult to secure the desired strength. On the other hand, when the ratio is exceeded, the size of the pore becomes small, and the utilization of the material, for example, cells and / or culture liquid may be restricted because of insufficient access.

상기 제3단계는 대기 중에 1 내지 5시간 방치하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 클로로포름 또는 디클로로메탄과 같이 끓는 점이 낮은 화합물을 유기용매로서 사용하는 경우 별도의 처리 없이 소정의 시간 동안 대기 중에 방치함으로써 이들 용매가 증발하여 제거되도록 할 수 있다.The third step may be carried out in the air for 1 to 5 hours, but is not limited thereto. For example, when a compound having a low boiling point such as chloroform or dichloromethane is used as an organic solvent, the solvent can be evaporated and removed by leaving it in the atmosphere for a predetermined time without any treatment.

상기 제4단계에서 압력은 0.8 내지 1.5 GPa로 인가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제4단계에서 인가되는 압력이 0.8 GPa 미만인 경우 스캐폴드가 충분히 치밀하게 형성되지 않아 원하는 강도를 갖도록 하기 어려울 수 있으며, 반대로 1.5 GPa 초과하는 경우에는 과도한 압력으로 형성되는 스캐폴드가 손상되거나 너무 치밀하게 형성되어 원하는 크기의 기공을 형성하기 어려울 수 있다.In the fourth step, the pressure may be applied in the range of 0.8 to 1.5 GPa, but the present invention is not limited thereto. If the pressure applied in the fourth step is less than 0.8 GPa, the scaffold may not be formed sufficiently densely and it may be difficult to achieve the desired strength. Conversely, if the pressure exceeds 1.5 GPa, the scaffold formed by excess pressure may be damaged or too dense And it may be difficult to form pores having a desired size.

본 발명은 또한 상기 제조방법으로 제조된 세포배양용 3차원 스캐폴드를 제공한다. 예컨대, 상기 스캐폴드는 줄기세포 배양용 3차원 스캐폴드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 줄기세포는 골막, 제대혈, 또는 골수 유래의 성체줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The present invention also provides a three-dimensional scaffold for cell culture produced by the above-described method. For example, the scaffold may be a three dimensional scaffold for culturing stem cells, but is not limited thereto. The stem cells may be periosteum, umbilical cord blood, or bone marrow-derived adult stem cells, but are not limited thereto.

상기 스캐폴드는 70 내지 250 μm 크기의 기공을 갖는 다공성인 스캐폴드일 수 있다. 예컨대, 스캐폴드의 기공이 70 μm 미만으로 작은 경우 세포의 출입 및/또는 증식에 필요한 충분한 공간을 확보하기 어려울 수 있으며, 250 μm를 초과하는 큰 기공을 갖는 경우 강도가 현저히 감소하여 지지체로서 형태를 유지하기 어려울 수 있다.The scaffold may be a porous scaffold having pores sized from 70 to 250 mu m. For example, if the pores of the scaffold are as small as less than 70 [mu] m, it may be difficult to secure sufficient space for cell entry and / or propagation, and if the pores have a size exceeding 250 [mu] m, It can be difficult to maintain.

예컨대, 상기 스캐폴드는 pH 5 내지 6.5의 환경에서 분해되는 것일 수 있다. 따라서, 상기 스캐폴드 상에서 배양된 세포에 영향을 주지 않는 범위에서 pH를 변화시켜 스캐폴드를 이온화하여 분리시켜 제거하고 배양된 세포를 손상없이 회수할 수 있다.For example, the scaffold may be degraded in an environment of pH 5 to 6.5. Therefore, the scaffold can be ionized by separating and removing the scaffold by changing the pH within a range not affecting the cells cultured on the scaffold, and recovering the cultured cells without damage.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 제조방법에 의해 준비된 pH 민감성 3차원 스캐폴드에 세포를 배양하고 pH를 5 내지 6.5로 조절함으로써 스캐폴드를 이온화하여 3차원 배양된 분리된 세포를 제공한다.The present invention also provides isolated cells that are three-dimensionally cultured by ionizing the scaffold by culturing the cells in a pH-sensitive three-dimensional scaffold prepared by the method of the present invention and adjusting the pH to 5 to 6.5.

종래 3차원 스캐폴드에서 세포를 배양하고 이를 분리하여 세포만을 수득하고자 하는 경우 물리적인 힘을 가하여야 하였으나, 본 발명의 제조방법으로 제조된 스캐폴드는 pH 민감성을 나타내어 세포에 손상을 유발하지 않는 pH 5 내지 6.5의 조건에서 이온화하여 친수성으로 변하므로 세포와 분리되어 완전히 제거될 수 있으므로, pH를 변화시키는 간단한 방법으로 배양된 세포에 물리적인 힘이나 화학적 자극을 가하지 않고 스캐폴드로부터 순수한 세포만을 분리해 낼 수 있다.In the case of culturing cells in a conventional three-dimensional scaffold and separating them to obtain cells only, physical forces must be exerted. However, the scaffold prepared by the method of the present invention exhibits pH-sensitivity, 5 to 6.5, it can be separated completely from the cell. Therefore, it is possible to separate pure cells from the scaffold without applying physical force or chemical stimulation to the cultured cells by a simple method of changing pH You can.

본 발명의 스캐폴드 제조방법은 염류 용탈법 및 용융주조법을 조합하여 고분자 용액의 염 사이에 입자 대신 용액 상태의 고분자를 삽입하고 압력을 가하여 주조한 후 염류를 용출시킴으로서 보다 균일한 기공을 가지면서도 강도가 우수한 3차원 스캐폴드를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 온도 및 pH 감응성 3중 블록 공중합체를 사용하여 제조한 스캐폴드는 pH 민감성을 나타내어 pH 조건을 변화시키는 방법으로 완전히 분해할 수 있으므로 스캐폴드 상에서 배양된 세포는 손상시키지 않으면서 스캐폴드를 완전히 제거하고 배양된 세포를 회수할 수 있는 세포 예컨대, 줄기세포의 배양에 적합한 3차원 스캐폴드로 유용하게 사용될 수 있다.The scaffold manufacturing method of the present invention is a method of producing a scaffold in which a solution state polymer is inserted between a salt of a polymer solution and a salt in a solution of a polymer solution, and the salt is eluted after pressure casting, Can provide an excellent three-dimensional scaffold. In addition, the scaffold prepared using the temperature and pH-sensitive triple block copolymer by the method of the present invention exhibits pH sensitivity and can be completely decomposed by changing the pH condition so that the cells cultured on the scaffold are not damaged Can be usefully used as a three-dimensional scaffold suitable for culturing cells capable of completely removing the scaffold and recovering the cultured cells, such as stem cells.

도 1은 본 발명의 제조예에 따른 블록 공중합체의 온도 및 pH 변화에 따른 블록 공중합체의 졸-겔 전이 거동을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 스캐폴드에 대한 XTT 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 제조예에 따른 pH 민감성 블록 공중합체의 생체 내 체류 시간 변화에 따른 졸-겔 전이 거동을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 스캐폴드의 표면, 내부 및 바닥면의 주사전자현미경 이미지를 나타낸 도이다.FIG. 1 is a graph showing sol-gel transition behavior of a block copolymer according to temperature and pH of a block copolymer according to Preparation Example of the present invention. FIG.
FIG. 2 is a diagram illustrating an XTT analysis result of a scaffold according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 3 is a graph showing the sol-gel transition behavior of the pH-sensitive block copolymer according to the preparation example of the present invention with respect to the residence time in vivo.
4 is a scanning electron microscope image of a surface, an interior and a bottom surface of a scaffold according to an embodiment of the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

제조예Manufacturing example 1 내지 4:  1 to 4: 폴리Poly (β-아미노 에스테르)-(? -aminoester) - 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -- 폴리Poly (β-아미노 에스테르) 블록 공중합체의 제조(? -amino ester) block copolymer

제조예Manufacturing example 1. One.

폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG, Mn=1000) 10 g을 반응기에 넣고 120℃에서 4시간 동안 진공건조시켜 수분을 제거하였다. 진공건조된 PEG 10 g에 무수 벤젠 100 ml을 용매로 하여 아크릴로일클로라이드 3.6 ml 및 촉매로서 트리에틸아민 5.6 ml을 첨가하여 양말단에 이중결합을 갖는 PEG를 얻었다. 상기 반응은 질소 환경 조건으로 80℃에서 3시간 동안 수행하였다. 반응 종료 후, 반응하지 않은 잔류물질을 제거하기 위하여 과량의 n-헥산에 침전시켜 여과한 후 상온에서 진공건조하여 양말단에 이중결합을 갖는 PEG를 90% 이상의 수율로 수득하였다.10 g of polyethylene glycol (PEG, Mn = 1000) was added to the reactor and vacuum dried at 120 ° C. for 4 hours to remove moisture. 3.6 ml of acryloyl chloride and 5.6 ml of triethylamine as a catalyst were added to 10 g of vacuum dried PEG using 100 ml of anhydrous benzene as a solvent to obtain PEG having double bonds at both terminal ends. The reaction was carried out at 80 < 0 > C for 3 hours under nitrogen environmental conditions. After the completion of the reaction, the reaction mixture was precipitated with excess n-hexane to remove unreacted residual materials, filtered, and vacuum-dried at room temperature to obtain PEG having double bonds at both terminal ends in a yield of 90% or more.

상기 제조된 양말단에 이중결합을 갖는 PEG를 상온의 반응기에 넣고, 디클로로메탄을 첨가하여 용해시켰다. 나아가 β-아미노 에스테르 블록을 형성하기 위해 트리메틸렌디피페라딘과 1,6-헥산디올 디아크릴레이트를 상온에서 첨가하여 용해시킨 후, 50℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 과량의 에틸에테르에 침전시키고 여과하여 폴리(β-아미노 에스테르) 블록의 분자량이 3,500이고, 폴리에틸렌글리콜 블록의 분자량이 1,000인, 수평균 분자량 8,000의 PAE-PEG-PAE 삼중 블록 공중합체를 90% 이상의 수율로 획득하였다.PEG having a double bond at both ends was put into a reactor at room temperature, and dichloromethane was added to dissolve it. Furthermore, trimethylene dipiperazine and 1,6-hexane diol diacrylate were added and dissolved at room temperature to form a β-amino ester block, followed by reaction at 50 ° C. for 48 hours. Precipitated in excess ethyl ether and filtered to obtain a PAE-PEG-PAE triblock copolymer having a molecular weight of 3,500, a molecular weight of polyethylene glycol block of 1,000, and a number average molecular weight of 8,000 of 90% or more of poly (? -Amino ester) Yield.

제조예Manufacturing example 2. 2.

분자량 2,000인 PEG를 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수평균 분자량 9,000인 PAE-PEG-PAE 삼중 블록 공중합체를 90% 이상의 수율로 획득하였다.PAE-PEG-PAE triblock copolymer having a number average molecular weight of 9,000 was obtained in a yield of 90% or more in the same manner as in Preparation Example 1, except that PEG having a molecular weight of 2,000 was used.

제조예Manufacturing example 3. 3.

분자량 3,000인 PEG를 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수평균 분자량 10,000인 PAE-PEG-PAE 삼중 블록 공중합체를 70% 이상의 수율로 획득하였다.A PAE-PEG-PAE triblock copolymer having a number average molecular weight of 10,000 was obtained in a yield of 70% or more in the same manner as in Preparation Example 1, except that PEG having a molecular weight of 3,000 was used.

제조예Manufacturing example 4. 4.

각각의 PAE 블록의 분자량이 5,000인 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수평균 분자량 11,000인 PAE-PEG-PAE 삼중 블록 공중합체를 70% 이상의 수율로 획득하였다.A PAE-PEG-PAE triblock copolymer having a number average molecular weight of 11,000 was obtained in a yield of 70% or more in the same manner as in Preparation Example 1, except that the molecular weight of each PAE block was 5,000.

비교예Comparative Example 1 및 2:  1 and 2: 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol 분자량에 따른  Depending on molecular weight 폴리Poly (β-아미노 에스테르)-폴리에틸렌글리콜-폴리(β-아미노 에스테르) 블록 공중합체의 제조(β-amino ester) -polyethylene glycol-poly (β-amino ester) block copolymer

비교예Comparative Example 1. One.

분자량 500인 PEG를 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수평균 분자량 7,500인 PAE-PEG-PAE 삼중 블록 공중합체를 70% 이상의 수율로 획득하였다.PAE-PEG-PAE triblock copolymer having a number average molecular weight of 7,500 was obtained in a yield of 70% or more in the same manner as in Preparation Example 1, except that PEG having a molecular weight of 500 was used.

비교예Comparative Example 2. 2.

분자량 9,000인 PEG를 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수평균 분자량 16,000인 PAE-PEG-PAE 삼중 블록 공중합체를 65% 이상의 수율로 획득하였다.A PAE-PEG-PAE triblock copolymer having a number average molecular weight of 16,000 was obtained in a yield of 65% or more in the same manner as in Preparation Example 1, except that PEG having a molecular weight of 9,000 was used.

실시예Example 1 내지 4:  1 to 4: PAEPAE -PEG--PEG- PAEPAE 삼중 블록 공중합체를 이용한 온도 및 pH 민감성  Temperature and pH sensitivity using tri-block copolymer 스캐폴드의Scaffold 제조 Produce

실시예Example 1. One.

상기 제조예 2에 따라 제조된 PAE-PEG-PAE 블록 공중합체를 이용하여 온도 및 pH 민감성 스캐폴드를 제조하였다. 준비된 블록 공중합체 1 g을 50 ml 바이알에 넣고 8 g의 클로로포름에 용해시킨 후 염화나트륨 염(입자직경 150 내지 250 μm) 9 g을 첨가하고 혼합한 후, 혼합물을 대기 중에 2시간 동안 방치하여 클로로포름을 증발시켰다. 스테인리스스틸(SUS) 몰드에 상기 클로로포름을 증발시킨 혼합물을 넣고 위 아래로 염화나트륨 염을 채운 후 정제 프레스 장치(tablet press machine)을 이용하여 10분 동안 압력(1.1 GPa)을 가하여 원반형의 스캐폴드를 제조하였다. 상온에서 24시간 동안 건조시켜 잔존하는 클로로포름을 추가로 제거하였다. 건조시킨 스캐폴드 내에 존재하는 염화나트륨 염을 제거하기 위하여, 탈이온수에 녹여 염류 용탈 작용(salt leaching)에 의해 염을 제거하였으며, 3일 동안 동결건조하여 다공성 스캐폴드를 획득하였다. 수득율은 85% 이상이었다.A temperature and pH sensitive scaffold was prepared using the PAE-PEG-PAE block copolymer prepared according to Preparation Example 2 above. 1 g of the prepared block copolymer was placed in a 50 ml vial and dissolved in 8 g of chloroform. 9 g of sodium chloride salt (particle diameter 150 to 250 μm) was added and mixed. The mixture was left in the atmosphere for 2 hours, Evaporated. A stainless steel (SUS) mold was charged with the chloroform-evaporated mixture, the sodium chloride salt was filled upside down, and a pressure (1.1 GPa) was applied for 10 minutes using a tablet press machine to prepare a disc- Respectively. After drying at room temperature for 24 hours, the remaining chloroform was further removed. In order to remove the sodium chloride salt present in the dried scaffold, the salt was dissolved in deionized water, the salt was removed by salt leaching, and lyophilized for 3 days to obtain a porous scaffold. The yield was over 85%.

실시예Example 2. 2.

블록 공중합체 2 g, 염화나트륨 염 8 g을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 다공성 스캐폴드를 제조하였다. 상기 제조된 스캐폴드는 실시예 1의 스캐폴드에 비해 다소 낮은 다공성을 나타내었으며, 수득율은 90% 이상이었다.A porous scaffold was prepared in the same manner as in Example 1, except that 2 g of the block copolymer and 8 g of the sodium chloride salt were used. The prepared scaffold exhibited a porosity somewhat lower than that of the scaffold of Example 1, and the yield was 90% or more.

실시예Example 3. 3.

블록 공중합체 3 g, 염화나트륨 염 7 g을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 다공성 스캐폴드를 제조하였다. 상기 제조된 스캐폴드는 실시예 1의 스캐폴드에 비해 비교적 낮은 다공성을 나타내었으며, 수득율은 85% 이상이었다.A porous scaffold was prepared in the same manner as in Example 1 except that 3 g of a block copolymer and 7 g of a sodium chloride salt were used. The prepared scaffold exhibited relatively low porosity as compared to the scaffold of Example 1, and the yield was more than 85%.

실시예Example 4. 4.

블록 공중합체 4 g, 염화나트륨 염 6 g을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 다공성 스캐폴드를 제조하였다. 상기 제조된 스캐폴드는 실시예 1의 스캐폴드에 비해 현저히 낮은 다공성을 나타내었으며, 수득율은 85% 이상이었다.A porous scaffold was prepared in the same manner as in Example 1 except that 4 g of a block copolymer and 6 g of a sodium chloride salt were used. The prepared scaffold exhibited significantly lower porosity than the scaffold of Example 1 and the yield was greater than 85%.

실시예Example 5 내지 8:  5 to 8: PAEPAE -PEG--PEG- PAEPAE 삼중 블록 공중합체를 이용한 온도 및 pH 민감성 스캐폴드를 이용한 세포 배양 및 배양된 세포의 분리 Cell culture and isolation of cultured cells using temperature and pH sensitive scaffolds using triblock copolymer

실시예Example 5.  5.

상기 실시예 1에 따라 제조된 PAE-PEG-PAE 블록 공중합체 스캐폴드를 이용하여 골유사 세포주 MG-63을 10% FBS, 2 mM 글루타민 및 100 U/ml 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO₂ 습식 공기 조건 하에서 배양하였다. 스캐폴드에서의 시험관 내(in vitro) 세포 분화율을 MTT 분석으로 측정하였다.Using the PAE-PEG-PAE block copolymer scaffold prepared according to Example 1, the bone-like cell line MG-63 was cultured in DMEM medium containing 10% FBS, 2 mM glutamine and 100 U / ml penicillin-streptomycin And cultured under the conditions of 37 ° C and 5% CO ₂ wet air. The in vitro cell differentiation rate in the scaffold was measured by MTT assay.

구체적으로, 세포를 분주하기 전 스캐폴드를 96-웰 배양 플레이트에 넣고, 400 μl 배지를 첨가하고 5% CO₂ 및 95% 공기 분위기의 습식 배양기에서 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 2×10³ 세포를 포함하는 100 μl 배지를 스캐폴드 상에 한 방울씩 적가하여 분주하였으며, 이에 따라 세포가 스캐폴드 전체에 고르게 분포될 수 있도록 하였다. 이후 스캐폴드에 세포가 부착될 수 있도록, 세포를 분주한 스캐폴드를 5% CO₂ 조건의 습식 배양기에서 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 세포가 부착 배양된 스캐폴드는 세포에 영향을 주지 않는 조건인 pH 6.0의 환경을 제공하여 pH 민감성 스캐폴드를 선택적으로 이온화시켜 완전히 용해시킴으로써 배양된 세포를 손상시키지 않고 스캐폴드로부터 온전하게 분리하였다.Specifically, before dispensing the cells, the scaffolds were placed in a 96-well culture plate, and 400 μl medium was added and cultured at 37 ° C for 4 hours in a humidified incubator with 5% CO ₂ and 95% air atmosphere. 100 [mu] l of medium containing 2 x 10 < ³ > cells were added dropwise to the scaffold dropwise so that the cells could be evenly distributed throughout the scaffold. The scaffold was then incubated at 37 ° C for 4 hours in a humidified incubator under 5% CO ₂ to allow cells to attach to the scaffold. The scaffolds to which the cells were adhered cultured were completely isolated from the scaffold without damaging the cultured cells by completely dissolving the pH sensitive scaffold selectively ionized by providing an environment of pH 6.0 that does not affect the cells.

실시예Example 6. 6.

실시예 1에 따라 제조된, 다소 기공도가 낮은 스캐폴드를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 세포를 배양하고 분리하여, 스캐폴드의 기공도에 따른 세포 배양에 대한 효과를 확인하였다.Cells were cultured and separated in the same manner as in Example 5 except that a scaffold having a low porosity was used, which was prepared in accordance with Example 1, and the cells were cultured and separated to obtain a cell culture effect according to the porosity of the scaffold Respectively.

실시예Example 7. 7.

실시예 3에 따라 제조된, 비교적 기공도가 낮은 스캐폴드를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 세포를 배양하고 분리하여, 스캐폴드의 기공도에 따른 세포 배양에 대한 효과를 확인하였다.Cells were cultured and separated in the same manner as in Example 5 except that a scaffold having a relatively low porosity was used, which was prepared in accordance with Example 3, and the cell culture was effected according to the porosity of the scaffold Respectively.

실시예Example 8. 8.

실시예 4에 따라 제조된, 현저히 기공도가 낮은 스캐폴드를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 세포를 배양하고 분리하여, 스캐폴드의 기공도에 따른 세포 배양에 대한 효과를 확인하였다.Cells were cultured and separated in the same manner as in Example 5 except that a scaffold having a low porosity was used, which was prepared in accordance with Example 4, and the cell culture was effected according to the porosity of the scaffold Respectively.

실험예Experimental Example 1: pH 변화에 따른 블록 공중합체의 졸-겔 전이 거동 평가 1: Evaluation of Sol-Gel Transition Behavior of Block Copolymer with pH Change

본 발명에 따라 제조된 pH 민감성 블록 공중합체의 온도 및 pH 변화에 따른 졸-겔 전이 거동 평가를 수행하였다.The sol-gel transition behavior of the pH-sensitive block copolymer prepared according to the present invention was evaluated according to the temperature and pH change.

상기 제조예 1 내지 4에 따라 제조된 pH 민감성 블록 공중합체를 완충용액에 30 중량% 농도로 용해시킨 후 상온에서 HCl 및 NaOH 용액으로 적정하여 각각 pH 6.4, 6.6, 7.0 및 7.4가 되도록 조절하였다. 각각 전술한 pH를 갖는 블록 공중합체 용액의 온도를 2℃씩 올리면서 10분 동안 일정한 온도를 유지하여 평형상태가 이루어지도록 한 후, 각 용액을 기울여서 졸-겔 전이 거동을 측정하고, 온도 및 pH 변화에 따른 블록 공중합체의 졸-겔 전이 거동에 대해 측정된 결과를 도 1에 나타내었다.The pH-sensitive block copolymers prepared according to Preparation Examples 1 to 4 were dissolved in a buffer solution at a concentration of 30% by weight and then titrated with HCl and NaOH solution at room temperature to adjust pH to 6.4, 6.6, 7.0 and 7.4, respectively. Each of the solutions was tilted to measure the sol-gel transition behavior, and the temperature and the pH value were measured. The temperature of the block copolymer solution was adjusted by increasing the temperature of the solution of the block copolymer having the above-mentioned pH by 2 DEG C for 10 minutes, The measured results of the sol-gel transition behavior of the block copolymer with the change are shown in Fig.

실험예Experimental Example 2: 세포 독성 평가 2: Assessment of cytotoxicity

NIH-3T3 섬유아세포주를 이용하여 세포 독성을 평가하였다. 배지로는 10% FCS(fetal calf serum), 페니실린(100 units/ml) 및 스트렙토마이신(100 μg/ml)을 포함하는 DMEM을 사용하였다. 96-웰 플레이트와 인큐베이터를 사용하여 2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-2H-테트라졸리움-5-카르복스아닐라이드(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide)에 의한 XTT 분석을 수행하였다. 마이크로플레이트리더(Microplate reader)로 측정 및 분석하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.NIH-3T3 fibroblast cell line was used to evaluate cytotoxicity. DMEM containing 10% FCS (fetal calf serum), penicillin (100 units / ml) and streptomycin (100 μg / ml) was used as the medium. 2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (2,3-bis- 2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide). The microplate reader was used for measurement and analysis, and the results are shown in FIG.

도 2에 나타난 바와 같이, 비교예에 비해, 본 발명에 따른 스캐폴드에서 배양시 세포 생존율을 10 내지 50% 향상되었다.As shown in FIG. 2, the cell viability was improved by 10 to 50% when cultured in the scaffold according to the present invention, as compared with the comparative example.

실험예Experimental Example 3: 생체 내  3: In vivo 겔화Gelling (in (in vivovivo gelationgelation ) 평가) evaluation

제조된 pH 민감성 블록 공중합체의 시험관 내 겔화 평가결과를 토대로 소동물 모델로서 랫트(150 g)를 이용하여 실시예 1에 따라 제조된 pH 민감성 블록 공중합체의 생체 내 겔화를 평가하였다. pH 민감성 블록 공중합체를 PBS 완충 용액에 30 중량% 농도로 용해시킨 후 상온에서 HCl 및 NaOH 용액으로 적정하여 pH를 6.2로 조절한 후 랫트에 주사하여 시간 변화에 따른 졸-겔 전이를 관찰하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.The in vivo gelation of the pH-sensitive block copolymer prepared according to Example 1 was evaluated using a rat (150 g) as a small animal model based on the evaluation of the in-vitro gelation of the prepared pH-sensitive block copolymer. The pH-sensitive block copolymer was dissolved in PBS buffer at a concentration of 30% by weight. After the pH of the solution was adjusted to 6.2 by titration with HCl and NaOH solution at room temperature, the solution was injected into rats to observe sol- The results are shown in Fig.

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 블록 공중합체는 체내에 주사 후 10분 이내에 졸-겔 전이가 일어나는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 3, it was confirmed that the block copolymer according to the present invention underwent sol-gel transition within 10 minutes after injection into the body.

실험예Experimental Example 4:  4: 스캐폴드의Scaffold 다공성 평가 Porosity assessment

본 발명의 실시예에 따라 제조된 스캐폴드의 형태 및 기공도를 확인하기 위하여, 주사전자현미경(scanning electron microscopy, HITACHI S-2400, Japan)을 이용하여 관찰하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 구체적으로, 제조된 스캐폴드를 1 내지 2 mm 두께의 슬라이스로 커팅하여 스캐폴드의 표면, 내부 및 바닥면을 관찰하고 각각에서 기공도를 측정하였다.In order to confirm the shape and porosity of the scaffold prepared according to the embodiment of the present invention, it was observed using a scanning electron microscope (HITACHI S-2400, Japan), and the results are shown in Fig. 4 . Specifically, the prepared scaffold was cut into slices having a thickness of 1 to 2 mm to observe the surface, the inside and the bottom surface of the scaffold, and measure the porosity in each case.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 스캐폴드는 상호 연결된 3차원적 구조로 형태안정성이 양호하며, 높은 밀도로 분포된 균일하고 일정한 크기의 기공을 갖는 구조임을 확인하였다. 이와 같이 균일하고 마이크로 및 나노크기를 갖는 기공구조는 거대(macro) 크기 재료로만 이루어진 스캐폴드에 비해 세포 성장 및 영양분 공급에 유리한 스캐폴드로 사용될 수 있다.As shown in FIG. 4, the scaffold of the present invention was confirmed to be a mutually connected three-dimensional structure having a good shape stability and a uniform and uniform pore size distribution with high density. This uniform, micro- and nano-sized pore structure can be used as a scaffold favoring cell growth and nutrient supply compared to scaffolds made only of macro-sized materials.

실험예Experimental Example 5:  5: 스캐폴드로부터From the scaffold 배양된 세포의 분리 Isolation of cultured cells

본 발명의 실시예에 따라 제조된 스캐폴드는 온도 및 pH 민감성을 갖는 공중합체로 이루어진 고분자로, 제1블록과 제3블록의 pH 민감성 고분자인 폴리(β-아미노에스터)는 등전위점을 기준으로 이보다 낮은 pH에서는 이온화되어 친수성을 갖는 반면, 높은 pH에서는 비이온화되어 소수성을 가지며, 제2블록인 폴리에틸렌글리콜 계열의 화합물은 pH 변화와 무관하게 친수성을 갖는다. 이러한 pH 민감성에 따른 이온화 특성을 이용하여 스캐폴드 상에 세포를 배양한 후 세포에 손상을 주지 않는 pH 범위 내에서 pH 민감성 고분자를 이온화시킴으로써 스캐폴드로부터 배양된 세포를 손상시키지 않고 분리할 수 있었다.The scaffold prepared according to the embodiment of the present invention is a polymer composed of a copolymer having temperature and pH sensitivity, and the poly (? -Amino ester) as the pH-sensitive polymer in the first block and the third block At a lower pH, it is ionized to have hydrophilicity, while at a higher pH it is nonionized to have hydrophobicity. The second block, a polyethylene glycol-based compound, is hydrophilic regardless of pH change. By using the ionization characteristics according to the pH sensitivity, the cells were cultured on the scaffold, and the pH - sensitive polymer was ionized in a pH range which does not damage the cells, so that the cells cultured from the scaffold could be isolated without damaging them.

Claims (12)

제1블록의 pH 민감성 고분자로서, 폴리(β-아미노에스터); 제2블록의 친수성 고분자로서, 폴리에틸렌글리콜 계열 화합물; 및 제3블록의 pH 민감성 고분자로서, 폴리(β-아미노에스터)를 포함하는 3중 블록 공중합체를 유기용매에 용해시킨 고분자 용액을 준비하는 제1단계;
상기 고분자 용액에 염을 첨가하여 혼합하는 제2단계;
제2단계로부터 수득한 혼합물로부터 유기용매를 증발시키는 제3단계;
주형에 상부와 하부에는 염을 채우고 그 사이에 제3단계로부터 수득한 유기용매를 증발시킨 혼합물을 넣고 압력을 가하여 스캐폴드를 제조하는 제4단계; 및
상기 제4단계로부터 수득한 스캐폴드를 물을 포함하는 용액에 함침시켜 염을 제거하는 제5단계;
상기 제5단계로부터 수득한 스캐폴드에 세포를 배양하는 제6단계; 및
상기 제6단계로부터 수득한 배양된 세포를 포함하는 스캐폴드를 pH 5 내지 6.5로 조정된 용액에 침지시켜 스캐폴드를 제거하고 배양된 세포를 분리하여 회수하는 제7단계를 포함하고,
상기 3중 블록 공중합체는 온도 민감성 및 pH 민감성을 나타내는 것인 분리된 세포의 제조방법.
As the pH-sensitive polymer of the first block, poly (beta -amino ester); As the hydrophilic polymer of the second block, a polyethylene glycol-based compound; A first step of preparing a polymer solution in which a triblock copolymer containing a poly (? -Amino ester) is dissolved in an organic solvent as a pH-sensitive polymer in a third block;
A second step of adding and mixing a salt to the polymer solution;
A third step of evaporating the organic solvent from the mixture obtained from the second step;
A fourth step of preparing a scaffold by applying a pressure to a mold in which salt is filled in the upper part and the lower part and the organic solvent obtained in the third step is evaporated therebetween; And
A fifth step of impregnating the scaffold obtained from the fourth step with a solution containing water to remove the salt;
A sixth step of culturing the cells in the scaffold obtained from the fifth step; And
And a seventh step of immersing the scaffold containing the cultured cells obtained from the step 6 in a solution adjusted to pH 5 to 6.5 to remove the scaffold and isolating and recovering the cultured cells,
Wherein said triple block copolymer exhibits temperature sensitivity and pH sensitivity.
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 3중 블록 공중합체는 8,000 내지 15,000의 수평균 분자량을 갖는 것인 분리된 세포의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein said triple block copolymer has a number average molecular weight of from 8,000 to 15,000.
제1항에 있어서,
상기 3중 블록 공중합체는 총 분자량에 있어서 제2블록의 비율이 0.07 내지 0.4인 것인 분리된 세포의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the ratio of the second block in the total molecular weight of the triple block copolymer is 0.07 to 0.4.
제1항에 있어서,
상기 3중 블록 공중합체는 제1블록으로서 수평균 분자량 3,000 내지 5,000의 폴리(β-아미노에스터); 제2블록으로서 수평균 분자량 1000 내지 3500의 양말단에 이중결합을 갖는 폴리에틸렌글리콜; 및 제3블록으로서 폴리(β-아미노에스터)가 커플링된 것인 분리된 세포의 제조방법.
The method according to claim 1,
The triple block copolymer may be a poly (? -Amino ester) having a number average molecular weight of 3,000 to 5,000 as a first block; Polyethylene glycol having a double bond at both ends of a number average molecular weight of 1000 to 3500 as the second block; And a poly (beta -amino ester) as a third block.
제1항에 있어서,
상기 유기용매는 클로로포름 또는 디클로로메탄인 분리된 세포의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the organic solvent is chloroform or dichloromethane.
제1항에 있어서,
상기 염은 염화나트륨 또는 염화칼륨인 것인 분리된 세포의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the salt is sodium chloride or potassium chloride.
제1항에 있어서,
블록 공중합체와 염은 0.7:9.3 내지 5:5의 중량비로 사용하는 것인 분리된 세포의 제조방법.
The method according to claim 1,
Block copolymers and salts are used in a weight ratio of 0.7: 9.3 to 5: 5.
제1항에 있어서,
제3단계는 대기 중에 1 내지 5시간 방치하여 수행하는 것인 분리된 세포의 제조방법.
The method according to claim 1,
And the third step is carried out in the atmosphere for 1 to 5 hours.
제1항에 있어서,
상기 압력은 0.8 내지 1.5 GPa로 인가되는 것인 분리된 세포의 제조방법.
The method according to claim 1,
Lt; RTI ID = 0.0 > GPa. ≪ / RTI >
제1항에 있어서,
상기 세포는 줄기세포인 것인 분리된 세포의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein said cell is a stem cell.
제1항에 있어서,
상기 제5단계로부터 수득한 스캐폴드는 70 내지 250 μm 크기의 기공을 갖는 다공성인 것인 분리된 세포의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the scaffold obtained from the fifth step is porous with pores having a size of 70 to 250 mu m.

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