KR101685248B1 - Multi-layered electrospun fiber incorporated hydrogel - Google Patents
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Abstract
본 발명은 3차원 망상 구조를 가지는 하이드로젤; 및
상기 하이드로젤의 내부에 형성된 나노섬유를 포함하는 복합체에 관한 것으로,
나노섬유의 복합에 의해 하이드로젤의 물성을 강화할 수 있으며, 둘 이상의 생리활성 성분이나 화학물질을 나노섬유 및 하이드로젤에 도입하여 독립적으로 방출을 제어하여 조직공학이나 미용목적의 패치에 응용 가능하다.The present invention relates to a hydrogel having a three-dimensional network structure; And
And a nanofiber formed on the inside of the hydrogel,
The physical properties of the hydrogel can be enhanced by the combination of nanofibers, and two or more physiologically active ingredients or chemicals can be introduced into nanofibers and hydrogels to independently control the release of the nanoparticles, which can be applied to tissue engineering or cosmetic patches.
Description
본 발명은 나노섬유를 복합시켜 물성의 향상 및 기능성이 도입된 하이드로젤에 관한 것으로, 나노섬유의 복합에 의해 하이드로젤의 물성을 강화할 수 있으며, 둘 이상의 생리활성 성분이나 화학물질을 나노섬유 및 하이드로젤에 도입하여 독립적으로 방출을 제어하여 조직공학이나 미용목적의 패치에 응용 가능하다.
The present invention relates to a hydrogel in which nanofibers are compounded to improve physical properties and functionality, and the hydrogel can be reinforced by the composite of nanofibers, and two or more physiologically active ingredients or chemicals can be added to nanofibers and hydro- It can be applied to patches for tissue engineering or cosmetic purposes by independently controlling release by introducing into gel.
전기방사법은 다양한 고분자 등의 물질을 수십 나노미터에서 수 마이크로미터의 섬유를 생산해 낼 수 있는 간편하고 활용도가 매우 높은 기술이다. 전기방사된 섬유는 가닥들의 모임으로, 기본적으로 같은 재료보다 구조적으로 매우 큰 기계적 강도를 가지고, 이 외에 높은 활용성을 기반으로 섬유 사이의 간격을 조절하므로 필터에 응용하거나, 높은 비표면적을 통해 바이오센서 등에도 응용이 가능하며, 특히 최근에는 약물전달이나 세포 지지체 등의 바이오메디컬 분야에서 활발히 응용되고 있다. Electrospinning is a simple and highly utilizable technique that can produce materials with tens of nanometers to several micrometers of various polymeric materials. The electrospun fiber is a group of strands, basically having a mechanical strength that is very much larger than that of the same material, and it can be applied to a filter because it adjusts the spacing between the fibers based on high utilization, Sensor and the like, and recently it has been actively applied in biomedical fields such as drug delivery and cell support.
나노섬유를 형성하는 고분자 물질로 다양한 천연 고분자와 합성 고분자가 사용되고 있다. 바이오메디컬 분야 내의 약물전달 적 측면에서 생각해보면, 생분해 특성을 갖지 않는 고분자 물질이 사용되기도 하나, 효율적이고 상업적으로 이용가능성이 있는 폴리카프로락톤(Polycaprolactone, PCL), 폴리라틱 산(Polylactic acid, PLA), 폴리글리콜 산(Polyglycolic acid, PGA), 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG), 폴리(락틱-co-글리콜 산)(Poly(lactic-co-glycolic acid, PLGA), 폴리(락티드-co-카프로락톤)(Poly(lactide-co-caprolactone), PLCL), PLA-b-PEG-b-PLA 등의 생분해성 고분자가 주로 활용되고 있다. 특히, PLA와 PGA의 블록공중합체인 PLGA는 PLA와 PGA의 비율변화를 이용하여 생분해속도를 수 주에서 수 개월까지 조절이 가능한 큰 장점을 가지고 있다. 전기방사된 섬유를 통한 나노섬유의 약물전달은, 수 일 내에 일어나는 초기방출은 확산을 기반으로 한 방출 중점적으로 발생하지만, 수 주에서 수 개월에 걸쳐 일어나는 장기적 방출은 물질의 생분해속도를 기반으로 하기 때문에, 재료의 선택이 목적에 따라 중요한 영향을 미칠 수 있다. A variety of natural polymers and synthetic polymers have been used as polymeric materials to form nanofibers. Polycaprolactone (PCL), polylactic acid (PLA), and polylactic acid (PLA), both of which are effective and commercially available, may be used in the biomedical field, Polyglycolic acid (PGA), polyethylene glycol (PEG), poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA), poly (lactide-co- PLGA, PLGA, PLGA, PLGA, PLGA, PLGA, PLGA, PLGA, PLGA, PLGA, and PLGA) have been widely used as biodegradable polymers such as poly (lactide-co-caprolactone) The nanofiber delivery of nanofibers through electrospun fibers is characterized by the fact that the initial release that takes place within a few days is due to diffusion-based emission- However, Because a number of long-term emissions occur throughout the month based on the biodegradation rate of the materials in, you can choose the material have a major impact, depending on the purpose.
전기방사된 섬유를 활용한 약물전달은 매우 큰 다공성과 높은 비표면적의 장점을 기반으로 효율적인 약물의 방출 및 전달을 도모한다. 일반적으로 사용되는 약물의 종류는 화학적 약물 외에 세포의 성장인자, 단백질, DNA 등의 생물분자를 장착하여 방출시키는 것이 가능하다. 전달하고자 하는 약물을 전기방사된 섬유에 첨가하는 방법은 몇 가지로 분류될 수 있다. 먼저, 가장 간단한 방법으로는, 전기방사를 하기 위한 고분자 용액에 첨가해 약물을 섬유 내에 첨가시킬 수 있다. 이 방법은 매우 간단한 공정을 통해 얻을 수 있는 장점을 가지지만, 방출 거동의 조절이 쉽지 않으며, 상황에 따라서는 생체물질이 고분자를 녹이는 유기용매와 직접 접촉하는 문제가 있다. Drug delivery using electrospun fibers facilitates efficient drug release and delivery based on the advantages of very large porosity and high specific surface area. In addition to chemical drugs, biological drugs such as growth factors, proteins, and DNA can be loaded and released in general. Methods for adding the drug to be delivered to the electrospun fiber can be classified into several types. First, in the simplest method, the drug can be added to the fiber by adding it to the polymer solution for electrospinning. Although this method has advantages that can be obtained through a very simple process, it is not easy to control the release behavior, and depending on the situation, there is a problem that the biomaterial directly contacts the organic solvent which dissolves the polymer.
다른 방법으로는 두 개의 노즐을 이용하는 coaxial 전기방사를 활용하여 코어/쉘(core/shell) 형태의 섬유를 만들어 코어 부분에 약물을 삽입하는 방법이 존재한다. 이 방법은 코어 부분에 존재하는 약물을 보호하는 측면에서 큰 장점을 가지지만, 공정을 이끌어 내는 것이 쉽지 않고, 대형화가 어려운 단점이 있다. 그 외에 약물을 전기방사한 섬유 표면에 물리적/화학적으로 부착시키는 방법이 있으며, 이 방법은 전기방사 과정에 관계없이 약물을 첨가할 수 있지만, 약물 전달시 약물이 외부에 노출되어 쉽게 비활성화되는 단점이 존재한다. 즉, 상황에 따라서 유리한 약물 첨가방법을 사용해야 하며, 혹은 단점을 극복하여 전기방사 섬유를 약물 전달에 이용하여야 한다. Alternatively, coaxial electrospinning using two nozzles can be used to create fibers in the form of a core / shell to insert the drug into the core. This method has a great advantage in terms of protecting the drug existing in the core portion, but it is not easy to draw the process and it is difficult to increase the size. In addition, there is a method of physically / chemically attaching the drug to the surface of the electrospun fiber. This method can add the drug irrespective of the electrospinning process, but the disadvantage that the drug is easily inactivated due to exposure to the drug exist. That is, it is necessary to use an advantageous drug addition method depending on the situation, or to overcome the drawbacks and to use the electrospun fiber for drug delivery.
세포생물학적 측면에서 전기방사된 섬유를, 세포의 증가된 활성이나 기능성을 보여주는 3 차원 지지체로 활용할 수 있다. 세포 등의 생물분자들은 실제 동물 내에서는 단백질, 다당류 등을 포함하는 세포외기질(extracellular matrix, ECM)로 구성된 3 차원 구조의 하이드로젤 내부에 고정되어 있으므로, 2 차원 시스템에 존재하는 세포는 3 차원 배양에서와는 일반적으로 다른 특성을 지니다. 전기방사된 나노섬유를 사용하면 부피당 넓은 표면적 비를 가지며, 세포외기질과 유사한 구조를 가지므로 인체의 조직을 대체하는데 적합하다. 이러한 구조는 세포간의 상호작용과 세포의 분화를 증진시키기도 한다. 하지만 3 차원 구조를 갖는 나노섬유의 두께는 수 마이크로미터에서 수백 마이크로미터 정도로 일반적으로 큰 부피를 갖기 어려운 단점을 지니고 있다. From the cell biology perspective, electrospun fibers can be used as a three-dimensional support to show increased activity or functionality of the cells. Since the biological molecules such as cells are immobilized in a hydrogel of a three-dimensional structure composed of an extracellular matrix (ECM) including proteins and polysaccharides in an actual animal, the cells existing in the two- Generally different characteristics from cultures. Electrospun nanofibers have a large surface area per volume and have a structure similar to that of the extracellular matrix, making them suitable for replacing tissues of the human body. These structures also promote cell-cell interactions and cell differentiation. However, the nanofiber having a three-dimensional structure has a thickness of several micrometers to several hundreds of micrometers, which generally has a disadvantage that it is difficult to have a large volume.
하이드로젤은 큰 수분함량을 지니며, 생체적합성이 뛰어난 특성을 가지고 있어 생물학적 응용에 사용되고 있다. 그 중에서도 세포를 하이드로젤 내부에 고정시키는 세포 캡슐화에도 응용되고 있다. 세포 캡슐화는 세포를 하이드로젤 내부에 배양하여, 세포에게 수분함유량이 높은 하이드로젤 그물 구조로 되어있는 3 차원 환경을 제공한다. 이러한 활용에 응용될 수 있는 하이드로젤 형성 물질은 크게 천연 고분자와 합성 고분자로 구분할 수 있다. 천연 고분자로는 알긴산(alginate), 한천(agarose), 히알루론산(hyaline acid). 콜라젠(collagen), 젤라틴(gelatin) 및 키토산(chitosan) 등이 있으며, 합성 고분자로는 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(poly hydroxyethyl methacrylate), 폴리에틸렌글리콜(poly ethylene glycol), 폴리비닐알코올(poly vinyl alchol), 폴리비닐피롤리돈(poly vinyl pyrrolidone), 폴리이미드(poly imide), 폴리아크릴레이트(polyacrylate) 및 폴리우레탄(polyurethane) 등이 있다. 이러한 하이드로젤을 활용하여 세포 캡슐화에 사용하면, 주변이 매우 소프트한 3 차원 구조에 세포가 둘러싸이게 되는 특성을 갖는다. 즉, 우리 몸속에서 이와 유사한 환경에 있는 연골세포, 간세포 및 최장도세포(pancreatic islet cell) 등의 세포에게 매우 적합한 환경을 제공한다. 반면에, 강하게 붙어서 자라는 세포(adhesion cell)에게는 세포가 결합할 수 있는 위치를 거의 제공하지 않기 때문에, 두 세포가 공동으로 자라는 경우에는 적절한 환경을 제공하기 어렵다. 또한, 대부분의 하이드로젤은 기계적 강도가 약한 단점을 가지고 있다.Hydrogels have a high moisture content and have excellent biocompatibility and are used in biological applications. Among them, it is applied to cell encapsulation in which cells are immobilized in a hydrogel. Cellular encapsulation cultivates the cells inside a hydrogel to provide a three-dimensional environment in which the cells are hydrated with a high water content of the hydrogel network. Hydrogel-forming materials that can be applied to such applications can be classified into natural polymers and synthetic polymers. Natural polymers include alginate, agarose, and hyaline acid. Collagen, gelatin and chitosan. Examples of the synthetic polymer include polyhydroxyethyl methacrylate, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, and the like. Polyvinyl pyrrolidone, polyimide, polyacrylate, and polyurethane. The term " polyvinylpyrrolidone " When these hydrogels are utilized for cell encapsulation, the cells are surrounded by a very soft three-dimensional structure. In other words, it provides a very suitable environment for cells such as cartilage cells, hepatocytes and pancreatic islet cells in similar environments in our body. On the other hand, it is difficult to provide a suitable environment when two cells grow together because the adhesion cell provides little binding sites for the cells to bind. In addition, most hydrogels have a weak mechanical strength.
나노섬유와 하이드로젤을 복합시키면 각 물질이 갖는 단점을 극복할 수 있다. 먼저, 수 마이크로에서 수백 마이크로의 얇은 시트(sheet) 구조의 나노섬유는 수 센티미터 정도의 두께로 만들 수 있는 하이드로젤에 둘러싸여 큰 부피를 차지할 수 있으며, 동시에 나노섬유를 한 층뿐 아니라, 여러겹을 겹쳐 사용할 수 있는 장점을 가질 수 있다. 동시에 나노섬유를 포함하는 하이드로젤은 나노섬유가 없는 하이드로젤에 비해, 나노섬유의 기계적 강도를 크게 증가시키는 역할을 하여 보다 이로운 물성을 얻을 수 있다. 생물학적 측면에서 비접착세포(non-adherent cell)와 접착세포(adherent cell)가 각각 하이드로젤과 나노섬유를 지지체로 삼아 자랄 수 있기 때문에, 두 종류의 세포를 공동배양하는 경우에 큰 장점이 될 수 있다. Combining nanofibers and hydrogels can overcome the disadvantages of each material. First, nanofibers of a few micro-microns thin sheet structure can occupy a large volume surrounded by a hydrogel which can be made to a thickness of several centimeters, and at the same time, Can have the advantage of being able to. At the same time, hydrogels including nanofibers can provide more advantageous physical properties by greatly increasing the mechanical strength of the nanofibers as compared with hydrogels without nanofibers. In terms of biology, non-adherent cells and adherent cells can grow using hydrogel and nanofibers as supports, which is a great advantage when co-culturing two types of cells have.
이러한 장점을 이용하여 하이드로젤에 다른 물질을 복합시켜 성질을 강화하려는 선행문헌이 존재한다. There is a prior literature to enhance the properties of hydrogels by combining these materials with other materials using these advantages.
특허문헌 1은 섬유층을 라미네이션(lamination) 방법을 이용해 다층으로 쌓고, 강한 압력을 통해 압착하여 결합시키는 방법을 활용하고 있다. 이 방법은 여러 섬유층을 쌓을 수 있는 장점이 있으나, 강한 압력을 가하는 방법을 이용하기 때문에, 나노섬유층이 가지고 있는 3 차원의 다공성 구조가 유지되지 못하며, 최종적으로 만들어진 구조체가 최대 수백 마이크로미터 정도의 시트가 될 우려가 있다.
특허문헌 2는 세균성 섬유소(Bacterial cellulose, BC)를 하이드로젤에 복합화, 특히, PHEMA에 BC를 복합화한다. 투명하고, 강도가 증가된다는 장점이 있으나, 복합시키는 물질을 BC에 한정하여 나노섬유의 구조제 변화에는 제한이 있다. BC는 쉽게 구조를 바꾸기 어렵고, 생분해 등의 물성을 쉽게 조절할 수 없다는 문제점이 있다.
In Patent Document 2, Bacterial cellulose (BC) is compounded in hydrogel, and in particular, BC is compounded in PHEMA. Transparent, and increased in strength. However, there is a limit to the structural change of the nanofibers by limiting the compound to the BC. BC has a problem that it is difficult to easily change the structure and physical properties such as biodegradability can not be easily controlled.
본 발명에서는 생리활성성분 등을 도입시킨 여러 층의 전기방사 나노섬유와, 하이드로젤을 복합화하여 물성의 향상 및 방출거동을 독립적으로 조절할 수 있는 구조체를 제공한다.
The present invention provides a structure capable of independently controlling the property enhancement and release behavior by compounding a plurality of electrospun nanofibers into which a physiologically active component or the like is introduced and a hydrogel.
본 발명에서는 3차원 망상 구조를 가지는 하이드로젤; 및 In the present invention, a hydrogel having a three-dimensional network structure; And
상기 하이드로젤의 내부에 형성된 나노섬유를 포함하는 복합체를 제공한다. And a nanofiber formed inside the hydrogel.
또한, 본 발명에서는 틀에 나노섬유를 넣고 하이드로젤 전구체 용액을 부어 상기 나노섬유가 내부에 형성된 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함하는 복합체의 제조 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for producing a composite comprising the step of pouring nanofibers into a mold and pouring a hydrogel precursor solution to prepare a hydrogel in which the nanofibers are formed.
또한, 본 발명에서는 전술한 복합체의 하이드로젤 내부 또는 나노섬유 상에 생체물질이 고정화된 생체물질 전달체, 또는 세포가 포집된 배양 지지체를 제공한다.
In addition, the present invention provides a biosubstance carrier in which a biomaterial is immobilized on the inside of the hydrogel or nanofibers of the complex, or a culture supporter in which cells are collected.
본 발명의 하이드로젤 내부에 나노섬유가 형성된 복합체는 활용에 제한이 있던 하이드로젤의 강도를 증가시켜 활용성을 증가시킬 수 있다. The composite in which the nanofiber is formed in the hydrogel of the present invention can increase the strength of the hydrogel, which is limited in utilization, and can increase the usability.
또한, 나노섬유 및/또는 하이드로젤에 생리활성물질(생체물질)을 도입하고, 각 도입된 생체물질의 방출속도를 조절하여 보다 효율적인 약물전달시스템이 가능하도록 할 수 있다.Further, it is possible to introduce a physiologically active substance (biosubstance) into the nanofibers and / or hydrogels and control the release rate of each introduced biomaterial, thereby enabling a more efficient drug delivery system.
또한, 나노섬유 및 하이드로젤 내부의 3 차원적 구조를 이용하여 세포의 지지체로 활용할 수 있다.
In addition, it can be utilized as a support of a cell by using a three-dimensional structure inside the nanofiber and the hydrogel.
도 1은 전기방사된 나노섬유와 하이드로젤을 복합하여 만들 수 있는 본 발명의 복합체를 나타내는 개요도이다.
도 2는 전가방사를 통해 제조된 노나섬유의 사진(a) 및 주사형 전자현미경을 통해서 본 나노섬유의 사진(B)이다.
도 3은 틀에 나노섬유를 넣고(a), 하이드로젤 전구용액을 부어(b) 복합체를 제작하는 과정과, 제작된 복합체의 사진(c)이다.
도 4는 알긴산 하이드로젤(a), PCL 알긴산 복합체(b) 및 PCL-젤라틴 알긴산 복합체(c)의 기계적 강도를 측정하는 사진이며, 상기 측정된 강도의 그래프(d)를 나타낸다.
도 5는 나노섬유에 함유시킨 bFGF의 방출 거동을 나타낸다.
도 6은 MSC(mesenchymal stem cell), disc cell 및 MSC+disc cell을 배양했을 때, 생존성(살아있는 세포는 초록색, 죽은 세포는 붉은색)을 나타내는 사진이다.
도 7은 MSC(mesenchymal stem cell), disc cell 및 MSC+disc cell의 활성을 측정한 그래프이다. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic view showing a composite of the present invention which can be prepared by combining electrospun nanofibers and a hydrogel. FIG.
FIG. 2 is a photograph (a) of a nona fiber produced through a transfer-inducing radiation and a photograph (B) of a nanofiber observed through a scanning electron microscope.
FIG. 3 is a photograph (c) of a process of preparing a composite by pouring a nanofiber into a mold and pouring a hydrogel precursor solution; and FIG.
4 is a photograph for measuring the mechanical strength of the alginic acid hydrogel (a), the PCL alginate complex (b) and the PCL-gelatin alginate complex (c), and shows a graph (d) of the measured intensity.
5 shows the release behavior of bFGF contained in nanofibers.
FIG. 6 is a photograph showing viability (living cells are green and dead cells are red) when mesenchymal stem cells (MSC), disc cells and MSC + disc cells are cultured.
7 is a graph showing the activity of MSC (mesenchymal stem cell), disc cell and MSC + disc cell.
본 발명은 3차원 망상 구조를 가지는 하이드로젤; 및 The present invention relates to a hydrogel having a three-dimensional network structure; And
상기 하이드로젤의 내부에 형성된 나노섬유를 포함하는 복합체에 관한 것이다.
And a nanofiber formed inside the hydrogel.
이하, 본 발명에 따른 복합체를 보다 상세하게 설명한다. Hereinafter, the composite according to the present invention will be described in more detail.
본 발명에 따른 복합체는 전술한 바와 같이, 하이드로젤 및 상기 하이드로젤의 내부에 형성된 나노섬유를 포함한다. 하이드로젤은 수 kPa 정도에 해당하는 기계적 강도를 가지므로, 응용적 측면에서 쉽게 찢어지거나 파손되는 등 많은 제약을 가지고 있다. 그러나, 본 발명에서는 수 MPa에서 수 GPa 의 기계적 강도는 가지는 나노섬유를 하이드로젤의 내부에 형성시킴으로써, 우수한 기계적 강도를 가지며, 응용적 측면에서 용이한 복합체를 얻을 수 있다. The composite according to the present invention includes a hydrogel and nanofibers formed inside the hydrogel as described above. Since hydrogels have mechanical strengths of the order of a few kPa, they have many limitations such as easy tearing or breakage in application. However, in the present invention, by forming the nanofiber having a mechanical strength of several GPa to several GPa in the hydrogel, it is possible to obtain a composite having excellent mechanical strength and easy application.
이러한 복합체의 강도는 0.1 내지 0.5 MPa 또는 0.2 내지 0.4 MPa를 가질 수 있다. The strength of such a composite can be 0.1 to 0.5 MPa or 0.2 to 0.4 MPa.
본 발명에 따른 복합체에서, 나노섬유는 수 십 나노미터에서 수 마이크로미터의 직경을 갖는 초극세 실로서, 본 발명에서는 이러한 초극세 실의 집합체를 이용할 수 있다. 구체적으로, 나노섬유는 집합체를 이루며, 상기 나노섬유 집합체(단층)가 여러 개의 층을 형성하는 다층 구조를 지닐 수 있다. 특히, 본 발명에서 나노섬유는 집합체의 단층 또는 다층 구조가 3 차원적 오픈 셀 메트릭스를 형성하고 있는 나노섬유 스캐폴드일 수 있다. In the composite according to the present invention, the nanofiber is an ultrafine yarn having a diameter of several tens of nanometers to several micrometers. In the present invention, such an ultrafine yarn aggregate can be used. Specifically, the nanofibers may form an aggregate, and the nanofibrous aggregate (single layer) may have a multi-layer structure in which multiple layers are formed. In particular, in the present invention, the nanofiber may be a nanofiber scaffold in which a single layer or multilayer structure of the aggregate forms a three-dimensional open cell matrix.
나노섬유 스캐폴드는 3차원적 구조체를 형성하고 있고, 다수의 포어를 형성하고 있으며, 이들 포어는 소정의 모양, 크기 및 부피를 가진다. 이런 포어의 크기는 나노섬유의 직경이나 밀도의 변화를 통해 조절할 수 있다. 구체적으로 나노섬유의 직경은 재료가 될 수 있는 물질을 녹인 용액의 농도, 유속, 전압 등을 조절하여 변화시킬 수 있다. 밀도는 후술할 전기방사법에서 나노섬유가 적층되는 기판의 종류 변화에 따라 조정가능하다. 전기가 잘 통하는 기판 상에서는 고밀도, 전기전도도가 낮은 기판 상에서는 저밀도로 적층될 수 있다. 하기 실시예에서는, 나노섬유의 밀도를 비교적 높게 하기 위하여 스테인리스스틸 기판을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용 가능한 기판은 금속, 합금, 유리, 실리콘 또는 종이 등으로 형성 된 것일 수 있다.The nanofiber scaffold forms a three-dimensional structure and forms a plurality of pores, which have a predetermined shape, size and volume. The size of these pores can be controlled by changing the diameter or density of nanofibers. Specifically, the diameter of the nanofibers can be changed by adjusting the concentration, flow rate, voltage, etc. of the solution in which the material, which can be a material, is dissolved. The density can be adjusted according to the kind of the substrate on which the nanofibers are stacked in the electrospinning method described later. It can be stacked at a high density on a substrate having good electrical conductivity and a low density on a substrate having low electrical conductivity. In the following examples, a stainless steel substrate is used to relatively increase the density of the nanofibers, but the present invention is not limited thereto. The substrate usable in the present invention may be formed of a metal, an alloy, glass, silicon, paper or the like.
상기 나노섬유 스캐폴드의 포어의 크기는 20 내지 100 ㎛로 조절될 수 있다. 대부분의 세포는 스캐폴드에 고정되어 형질변환이 일어나기 전에는 10 내지 15 ㎛로 존재하기 때문에, 상기 크기 범위에서 포어 내부로 들어가 스캐폴드 내부에 고정되어 성장과 분화가 일어나기 적당하다. The size of the pores of the nanofiber scaffold can be controlled to 20 to 100 mu m. Since most of the cells are fixed to the scaffold and are present in the range of 10 to 15 占 퐉 before transformation, they enter the pore in the above-mentioned size range and are fixed inside the scaffold to be suitable for growth and differentiation.
상기 나노섬유 스캐폴드는 후술할 전기방사법과 같은 공지의 방법에 의해 나노섬유를 이용하여 형성될 수 있다. 나노섬유를 제조하기 위해 사용되는 물질은 나노섬유를 생성될 수 있는 물질이면 어떠한 것이든 사용할 수 있다. 나노섬유로 형성된 스캐폴드는 생체물질이 나노섬유에 잘 고정되도록 하기 위하여 추가적 변형(modification)을 거칠 수 있다. 예를 들어, 상기 추가적 변형에는 산소 플라즈마 처리, 라디에이션 그라프팅(Radiation grafting) 방법 또는 자기조립 단일층(Selfassembly monolayer, SAM) 방법이 이용될 수 있다. 산소 플라즈마 처리의 경우 소수성이 큰 나노섬유의 경우 친수성을 증가시키기 위해 사용된다. 라디에이션 그라프팅 방법으로 예를 들어 나노섬유 스캐폴드에 UV 조사로 벤조페논과 아자이드 물질을 사용하여 나노섬유의 표면을 원하는 물질로 변형시킬 수 있도록 반응성을 줄 수 있다. SAM 방법은 하이드록시 작용기가 존재하는 표면과 실란(Silane)의 자발적인 반응을 이용하여 실란과 결합된 부분을 표면에 고정시키는 방법이다. 라디에이션 그라프팅이나 SAM 방법에서는 일반적으로 단백질과 화학적 결합을 하는 물질인 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)를 결합시켜 사용하게 된다. 이러한 나노섬유로 형성된 스캐폴드에 대한 추가적 변형은 나노섬유 생성 물질의 종류에 상관없이 생체물질이 잘 고정될 수 있도록 해 주므로, 스캐폴드의 제조를 위해 사용될 수 있는 나노섬유 생성 물질의 종류에는 제한이 없다.The nanofiber scaffold may be formed using nanofibers by a known method such as electrospinning, which will be described later. The material used for producing the nanofibers can be any material that can produce nanofibers. The scaffolds formed of nanofibers can undergo further modifications to ensure that the biomaterial is well immobilized on the nanofibers. For example, an oxygen plasma treatment, a radiation grafting method, or a selfassembled monolayer (SAM) method may be used for the additional modification. In the case of oxygen plasma treatment, nanofibers with high hydrophobicity are used to increase hydrophilicity. For example, nanoparticle scaffolds may be irradiated with UV radiation to produce benzophenone and azide compounds to modify the surface of the nanofibers to a desired material by a radiation grafting method. The SAM method uses a spontaneous reaction of a silane with a surface on which a hydroxy functional group exists to fix a portion bonded with the silane to the surface. Radiation grafting and SAM methods generally use N-hydroxysuccinimide (NHS), which is a chemical compound that binds to proteins. Additional modifications to the scaffolds formed with these nanofibres allow the biomaterial to be immobilized irrespective of the type of nanofiber material, thus limiting the types of nanofiber-forming materials that can be used to make the scaffold none.
한 구체예에서, 나노섬유는 생체물질을 고정시킬 수 있는 생체 적합성 고분자를 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 나노섬유는 이에 제한되는 것은 아니나, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산)) (PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트) (PHBV), 폴리다이옥산온 (PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄) (PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)] (PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린 (PAN)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자이거나, 상기 둘 이상의 고분자들의 공중합체 또는 혼합물일 수 있다. 나노섬유가 다층 구조일 경우, 각 층은 다른 종류의 생체적합성 고분자로부터 제조될 수 있다. In one embodiment, the nanofibers can be made using a biocompatible polymer capable of immobilizing the biomaterial. For example, the nanofibers include, but are not limited to, chitosan, elastin, hyaluronic acid, alginate, gelatin, collagen, cellulose, polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polycaprolactone (PLA), polyglycolic acid (PGA), poly (lactic-co- (glycolic acid)) (PLGA), poly [(3-hydroxybutyrate) -co- (3-hydroxyvalerate) (PDU), poly [(L-lactide) -co- (D-lactide)], polydioxanone (PDO) (PVA), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyrrolidone (PVP), polystyrene (PS) and polyaniline (PAN)), poly [ethylene-co- (vinyl alcohol)] One or more biocompatible polymers selected from the group consisting of, or copolymers or mixtures of the two or more polymers. When the nanofibers are multi-layered, each layer can be made from other types of biocompatible polymers.
한 구체예에서, 나노섬유에는 생체물질이 고정화 될 수 있다. 이러한 생체물질로는 성장인자, 약물, 아미노산, 단백질, 지질, 탄수화물, 당질, 핵산, 효소, 무기물, 호르몬 및 항원으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 상기 나노섬유는 생체물질의 이동 및 전달에 유용하게 이용될 수 있다. 상기 나노섬유가 다층 구조를 지닐 경우, 각각의 층은 다른 종류의 활성성분이 고정되어 있을 수 있다. In one embodiment, the biomaterial may be immobilized on the nanofiber. Such biomaterials may include at least one selected from the group consisting of growth factors, drugs, amino acids, proteins, lipids, carbohydrates, saccharides, nucleic acids, enzymes, minerals, hormones and antigens. The nanofibers can be usefully used for transferring and transporting biomaterials. When the nanofibers have a multi-layer structure, each layer may have different kinds of active components fixed.
또한, 한 구체예에서, 나노섬유에는 세포가 고정되어, 상기 세포의 배양이 이루어질 수 있다. 나노섬유 스캐폴드는 부피당 넓은 비표면적비를 가지며, 세포외기질과 유사한 구조를 가지므로, 3 차원에서의 세포의 배양을 통해 인체의 조직을 대체하는데 적당하다. 특히 나노섬유를 지지체로 삼아 성장하는 접착세포(부착성 세포), 예를 들어, 동물 세포의 배양에 유리할 수 있다.Further, in one embodiment, the cells are immobilized on the nanofibers, and the cells can be cultured. The nanofiber scaffold has a wide specific area ratio per volume and has a structure similar to that of the extracellular matrix, so it is suitable for replacing the tissues of the human body through the cultivation of cells in three dimensions. Particularly, it may be advantageous to cultivate adherent cells (adherent cells), for example, animal cells that grow using nanofibers as a support.
본 발명에 따른 복합체에서, 전술한 나노섬유는 하이드로젤의 내부에 삽입된 구조를 가진다. 나노섬유 스캐폴드는 쉽게 손상되어 취급하기 까다롭다는 문제를 가지며, 하이드로젤은 기계적 강도가 낮으므로, 응용적 측면에서 쉽게 찢어지거나 파손되는 문제점을 가진다. 본 발명에서는 상기 나노섬유 스캐폴드 및 하이드로젤 각각의 문제점을 보안하여, 상기 하이드로젤 내부에 나노섬유, 즉, 나노섬유 스캐폴드를 위치시킴으로써, 취급성이 우수하며, 큰 강도를 지녀 응용적 측면에서 우수한 복합체를 얻을 수 있다. In the composite according to the present invention, the above-described nanofibers have a structure inserted into the interior of the hydrogel. The nanofiber scaffold is easily damaged and difficult to handle, and the hydrogel has a low mechanical strength and therefore tears or breaks easily in terms of application. In the present invention, the problems of the nanofiber scaffold and the hydrogel are secured, and the nanofiber, that is, the nanofiber scaffold is positioned in the hydrogel, so that the nanofiber scaffold is excellent in handleability, An excellent composite can be obtained.
이러한, 하이드로젤은 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA),폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 및 폴리카프로락톤 (PCL), 젤라틴, 알지네이트, 카라기난, 키토산, 하이드록시알킬셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, 실리콘, 고무, 아가, 카르복시비닐 공중합체, 폴리디옥솔란, 폴라아크릴아세테이트, 폴리비닐클로라이드 및 무수말레인산/비닐에테르로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 친수성 고분자이거나, 둘 이상의 친수성 고분자의 복합체 또는 혼합물로부터 제조될 수 있다. Such hydrogels may be selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polyhydroxyethyl methacrylate (PHEMA), polyacrylic acid (PAA), polyvinyl alcohol (PVA), poly (N-isopropyl acrylamide) (PNIPAM), polyvinylpyrrolidone (PVP), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA) and polycaprolactone (PCL), gelatin, alginate, carrageenan, chitosan, hydroxyalkylcellulose, alkylcellulose, silicone At least one hydrophilic polymer selected from the group consisting of polyvinyl alcohol, polyvinyl alcohol, polyvinyl alcohol, polyvinyl alcohol, polyvinyl alcohol, polyvinyl alcohol, polyvinyl alcohol, polyvinyl alcohol, polyvinylacetate, rubber, agar, carboxyvinyl copolymer, polydioxolane, polyacrylate, polyvinyl chloride and maleic anhydride / have.
상기 하이드로젤은 3 차원적 내부 구조를 가지며, 구체적으로 3 차원 망상 구조를 가진다. 따라서, 세포를 상기 하이드로젤의 3 차원적 구조에서 배양할 수 있다는 장점을 가진다. 종래, 나노섬유에 하이드로젤을 UV 조사하여 패턴화하는 구조가 개시되었으나, 이 경우, 외부로 노출된 나노섬유에서만 세포의 배양이 가능하여, 하이드로젤이 패턴화된 부분에서는 세포가 부착할 수 없다는 단점이 있었다. 본 발명에서는 세포를 하이드로젤 내부에서 배양하는 세포캡슐화를 활용하여 하이드로젤의 3 차원 구조에서 세포를 배양하여 나노섬유에서 세포를 배양하는 것보다 더 생체 내 환경과 유사한 세포환경을 제공할 수 있다. 이러한 환경을 통해 일반적으로 세포의 개체 수 증가보다 세포의 기능성 강화에 도움을 줄 수 있다. The hydrogel has a three-dimensional internal structure, and specifically has a three-dimensional network structure. Therefore, the cells can be cultured in the three-dimensional structure of the hydrogel. Conventionally, a structure for patterning a hydrogel by UV irradiation on a nanofiber has been disclosed. However, in this case, since cells can be cultured only in nanofibers exposed to the outside, cells can not be adhered to the patterned portion of the hydrogel There were disadvantages. In the present invention, cells can be cultured in a three-dimensional structure of hydrogel using cell encapsulation in which the cells are cultured in a hydrogel to provide a cell environment similar to that in a living body environment than culturing cells in nanofibers. Such an environment can generally help to strengthen the function of the cell rather than increase the number of cells.
특히, 하이드로젤은 나노섬유와 비교하여 부드러운 물리적 성질을 지니므로, 이러한 환경에서 자라는 것을 선호하는 세포를 배양할 수 있다. 이러한 세포로는 섬유아세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포, 연골 세포, 뼈세포, 피부세포, 슈반세포 및 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 구체적으로, 비접착성 세포(비부착성 세포 혹은 부유 세포)나 신경세포, 연골 세포 등을 배양할 수 있다. In particular, since hydrogels have a soft physical property as compared to nanofibers, cells that prefer to grow in such environments can be cultured. Such cells may be selected from the group consisting of fibroblasts, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, nerve cells, cartilage cells, bone cells, skin cells, Schwann cells and stem cells, Sex cells or floating cells), nerve cells, cartilage cells and the like can be cultured.
전술한 나노섬유에서는 접착성 세포의 배양에 용이하므로, 본 발명의 복합체에서는 접착성 세포와 비접착성 세포를 동시에 배양할 수 있으며, 공동배양이 가능하다는 장점을 지닌다. 또한, 같은 세포라고 해도 나노섬유 또는 하이드로젤에서 배양됨에 따라 세포의 성장이나 분화 등의 행동이 다르기 때문에, 이러한 성질을 활용하여 세포 행동의 다양성을 유도하고 이를 활용할 수 있다. 특히, 나노섬유에 원하는 방향으로 갈 수 있도록 하는 성장인자 등을 탑재하여 방출시키면, 하이드로젤의 3 차원 구조 내의 세포(예를 들어, 줄기세포)는 원하는 세포의 분화로 유도하는데 도움을 줄 수 있다. Since the above-mentioned nanofibers are easy to cultivate adherent cells, the complex of the present invention has the advantage that both adherent cells and non-adherent cells can be cultured simultaneously, and co-cultivation is possible. Also, even if the same cells are cultured in nanofibers or hydrogels, behaviors such as growth and differentiation of cells are different. Therefore, this property can be utilized to induce and utilize diversity of cell behavior. Particularly, when a nanofiber is loaded with a growth factor or the like for allowing it to go in a desired direction, cells (for example, stem cells) in the three-dimensional structure of the hydrogel can be induced to induce the differentiation of the desired cell .
본 발명에 따른 복합체는 약물전달 측면에서도 응용성이 매우 높다. 약물을 포함하는 단일 나노섬유층을 하이드젤 내부에 삽입시켜 하이드로젤과 복합화시키면, 일반적으로 나노섬유를 이용한 방출에서 나타나는 초기 대량 방출을 감소시키는 효과를 얻을 수 있다. 한 구체예에서, 나노섬유는 다층 구조를 가지므로, 각 층마다 다른 물성을 갖는 나노섬유층에 약물을 넣어 복합체를 만들어 약물을 방출시키면, 독립적으로 순차적인 약물의 방출거동을 조절할 수 있다. The complex according to the present invention is highly applicable in terms of drug delivery. When a single nanofiber layer containing a drug is inserted into a hydrogel and complexed with a hydrogel, an effect of reducing the initial mass release generally occurring in nanofiber-based release can be obtained. In one embodiment, the nanofibers have a multi-layer structure, so that sequential release behavior of the drug can be controlled by releasing the drug by forming a complex by putting the drug into the nanofiber layer having different physical properties for each layer.
또한, 하이드로젤은 자체적으로 방출이 가능한 재료이기 때문에, 오랜시간동안 지속적인 방출을 하기 위해 하이드로젤 3 차원 망 내부에 약물을 넣는 것도 가능하다. 즉, 다양한 조합의 나노섬유와 하이드로젤을 복합하여 원하는대로 약물 방출을 제어할 수 있다.
In addition, because the hydrogel is a self-releasing material, it is also possible to put the drug inside the hydrogel three-dimensional network for sustained release over a long period of time. That is, various combinations of nanofibers and hydrogels can be combined to control drug release as desired.
또한, 본 발명은 전술한 복합체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 복합체는, 틀에 나노섬유를 넣고 하이드로젤 전구체 용액을 부어 상기 나노섬유가 내부에 형성된 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. The present invention also relates to a method for producing the above-mentioned composite, wherein the composite may include a step of pouring a hydrogel precursor solution into a mold with nanofibers inserted therein to prepare a hydrogel in which the nanofibers are formed .
본 발명에 따른 복합체의 제조 방법에서, 나노섬유는 전기방사에 의해 제조될 수 있다. 상기 전기방사는 당업계에서 사용되는 일반적인 방법을 이용할 수 있다. 또한, 나노섬유의 제조를 위해 사용되는 물질은 전술한 생체적합성 고분자를 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명에서는 생체적합성 고분자의 농도, 유속 및 전압 등을 조절하여 나노섬유의 직경을 조절하고, 전기방사에서 나노섬유가 적층되는 기판의 종류를 변화시켜 나노섬유의 밀도를 조절할 수 있으며, 최종적으로, 나노섬유의 포어 크기를 조절할 수 있다. 상기 나노섬유가 적층되는 기판은 전술한 것을 제한없이 사용할 수 있으며, 코어의 크기는 20 내지 100 ㎛로 조절될 수 있다.In the process for producing a composite according to the present invention, the nanofibers can be produced by electrospinning. The electrospinning may be performed by a general method used in the art. The materials used for the production of nanofibers can be any of the biocompatible polymers described above. In the present invention, it is possible to control the density of the nanofibers by controlling the diameter of the nanofibers by controlling the concentration, flow rate, and voltage of the biocompatible polymer, and changing the type of the substrate on which the nanofibers are stacked in the electrospinning. The pore size of the nanofibers can be controlled. The substrate on which the nanofibers are stacked can be used without limitation, and the size of the core can be adjusted to 20 to 100 mu m.
한 구체예에서, 나노섬유는 생체물질이 나노섬유에 잘 고정되도록 하기 위하여 추가적 변형(modification)을 거칠 수 있다. 예를 들어, 상기 추가적 변형에는 산소 플라즈마 처리, 라디에이션 그라프팅(Radiation grafting) 방법 또는 자기조립 단일층(Selfassembly monolayer, SAM) 방법이 이용될 수 있다. In one embodiment, the nanofibers may undergo further modifications to ensure that the biomaterial is immobilized on the nanofibers. For example, an oxygen plasma treatment, a radiation grafting method, or a selfassembled monolayer (SAM) method may be used for the additional modification.
한 구체예에서, 나노섬유는 생체물질 및 세포가 고정되어 있을 수 있다. 이러한, 생체물질 및 세포의 고정은 나노섬유의 제조 시 생체적합성 고분자에 상기 생체물질 및 세포를 혼합한 후, 전기방사함으로써 제조될 수 있다. 상기 생체물질 및 세포는 전술한 것을 사용할 수 있다. In one embodiment, the nanofibers may be biomaterials and cells fixed. Such biomaterials and cell fixation can be produced by mixing the biomaterial and the cell with a biocompatible polymer during the production of nanofibers, and then electrospinning. The above-mentioned biomaterial and cell can be used as described above.
본 발명에서 복합체는 상기 나노섬유를 틀에 넣고 하이드로젤 전구체 용액을 부어서 제조된다. 이러한 하이드로젤 전구체 용액으로는 전술한 친수성 고분자를 제한없이 사용할 수 있다. In the present invention, the composite is prepared by molding the nanofibers into a mold and pouring the hydrogel precursor solution. As the hydrogel precursor solution, the above-mentioned hydrophilic polymer can be used without limitation.
상기 하이드로젤 전구체 용액은 가교에 의해 하이드로젤로 생성될 수 있다. 이러한, 가교는 UV 조사에 의한 화학적 가교, 물리학적 가교 또는 생물학적 가교에 의해 하이드로젤로 형성될 수 있다. 여기서, UV 조사에 의한 화학적 가교로는 광가교(photo-crosslinking) 또는 반응성가교제(reactive crosslinker)를 활용한 가교 등을 들 수 있고, 생물학적 가교로는 헤파린과 성장인자의 결합력을 활용한 가교 또는 DNA 등의 상보적 결합을 이용한 가교 등을 들 수 있으며, 물리적 가교로는 수소결합에 의한 가교, 소수성(hydrophobic) 상호적용에 의한 가교 또는 정전기적 상호작용을 활용한 가교 등을 들 수 있다. The hydrogel precursor solution may be formed into a hydrogel by crosslinking. Such crosslinking can be formed into a hydrogel by chemical crosslinking by UV irradiation, physical crosslinking or biological crosslinking. Examples of the chemical crosslinking by UV irradiation include photo-crosslinking or crosslinking using a reactive crosslinker. Examples of the biological crosslinking include crosslinking using a binding force between heparin and a growth factor, or DNA And crosslinking using complementary bonding such as crosslinking. Examples of the physical crosslinking include crosslinking by hydrogen bonding, crosslinking by hydrophobic mutual application, or crosslinking by utilizing electrostatic interactions.
본 발명에서는 세포의 배양관점에서 물리학적 가교 또는 생물학적 가교를 사용하는 것이 좋다. 더욱이, 광개시제를 활용한 UV 조사에 의한 화학적 가교의 경우 대면적화가 쉽지 않으므로, 물리학적 가교 또는 생물학적 가교를 사용하는 것이 좋다. 화학적 가교는 하이드로젤의 패턴화에 적용될 수 있다. In the present invention, it is preferable to use physical crosslinking or biological crosslinking from the viewpoint of cell culture. Furthermore, it is preferable to use physical crosslinking or biological crosslinking because chemical crosslinking by UV irradiation using a photoinitiator is not easy to make large area. Chemical crosslinking can be applied to the hydrogel patterning.
한 구체예에서, 제조되는 복합체의 하이드로젤의 3 차원 망 내부에 생체물질 및 세포를 포집하기 위하여, 하이드로젤 전구체 용액에 생체물질 및 세포를 혼합한 후, 상기 하이드로젤을 제조할 수 있다. In one embodiment, the hydrogel may be prepared by mixing the biomaterial and the cell into the hydrogel precursor solution in order to collect the biomaterial and the cells inside the three-dimensional network of the hydrogel of the composite to be produced.
또한, 본 발명은 전술한 복합체의 나노섬유 및 하이드로젤 중 어느 한 곳 이상에 생체물질을 포함하는 생체물질 전달체에 관한 것이다. The present invention also relates to a biomaterial transporter comprising a biomaterial in at least one of the aforementioned nanofibers and hydrogel of the composite.
본 발명에서는 복합체의 하이드로젤의 3 차원 망 내부 및/또는 나노섬유 상에 생체물질을 고정화하여 상기 생체물질의 전달 및 방출에 이용할 수 있다. 하이드로젤은 일반적으로 나노섬유를 이용한 방출에서 나타나는 초기 대량 방출을 감소시킬 수 있다. 특히, 일례에서 나노섬유는 다층 구조를 가지므로, 각 층마다 다른 종류의 생체물질을 고정화하면, 순차적인 생체물질의 방출을 조정할 수 있다. 또한, 하이드로젤의 3 차원 망 내부에 생체물질을 고정화하여 오랜 시간 동안 지속적인 방출을 가능하게 할 수 있다. 이러한 복합체는 미용 또는 의료용 패치 등으로 활용될 수 있다. In the present invention, a biomaterial may be immobilized in the three-dimensional network and / or nanofibers of the hydrogel of the composite, and the biomaterial may be used for the transfer and release of the biomaterial. Hydrogels can generally reduce the initial mass release in nanofiber-based emissions. Particularly, in one example, since nanofibers have a multi-layer structure, sequential release of biomaterials can be adjusted by immobilizing different kinds of biomaterials in each layer. In addition, it is possible to immobilize the bio-material inside the three-dimensional network of the hydrogel to enable continuous release for a long time. Such a complex can be used as a beauty or medical patch.
또한, 본 발명은 전술한 복합체의 나노섬유 및 하이드로젤 중 어느 한 곳 이상에 세포를 포함하는 배양 지지체에 관한 것이다. The present invention also relates to a culture supporter comprising cells in at least one of the above-mentioned nanofibers and hydrogel of the complex.
일반적으로, 나노섬유는 접착성 세포의 배양에 유리하며, 하이드로젤에서는 비접착성 세포의 배양에 유리하다. 따라서, 본 발명에서는 나노섬유 및 하이드로젤을 복합화하여, 접착성 세포 및 비접착성 세포를 동시에 배양할 수 있으며, 공동배양 역시 가능하다. 또한, 같은 세포라고 해도 나노섬유 또는 하이드로젤의 배양 됨에 따라 세포의 성장이나 분화 행동이 다르므로, 이러한 성질을 활용하여 세포 행동의 다양성을 유도할 수 있다. 상기 복합체를 이용하여 세포를 배양함으로써, 인공피부 또는 인공장기 등을 생산할 수 있다.
In general, nanofibers are advantageous for culturing adherent cells, and hydrogels are advantageous for culturing nonadherent cells. Therefore, in the present invention, the nanofibers and the hydrogel can be complexed to simultaneously cultivate the adhesive cells and the non-adhesive cells, and co-culture is also possible. Also, since the growth or differentiation behavior of cells is different depending on the cultivation of nanofibers or hydrogels, it is possible to utilize these properties to induce diversity of cell behavior. By culturing the cells using the complex, artificial skin or artificial organs can be produced.
본 발명에서 도 1은 전기방사된 나노섬유와 하이드로젤을 복합하여 만들 수 있는 본 발명의 복합체를 나타내는 개요도이다. 상기 도 1에 나타난 바와 같이, 하이드로젤 내부에 나노섬유를 위치시켜 복합체를 얻을 수 있으며, 상기 복합체는 생체물질의 전달 및 방출 또는 세포 배양 지지체로 활용될 수 있다. FIG. 1 is a schematic view showing the composite of the present invention, which can be prepared by combining electrospun nanofibers and a hydrogel. As shown in FIG. 1, a nanocomposite can be obtained by placing a nanofiber in a hydrogel, and the complex can be utilized as a biomaterial transfer and release or a cell culture support.
또한, 도 2는 전기방사를 통해 제조된 나노섬유의 사진으로, (a)는 나노섬유의 사진을, (b)는 나노섬유의 주사형 전자현미경 사진을 나타낸다. 상기 도 2에 나타나듯이, 나노섬유는 판 상으로 제조될 수 있으며, 상기 나노섬유는 미세한 실의 집합체임을 확인할 수 있다, 2 is a photograph of nanofibers produced by electrospinning, wherein (a) shows a photograph of the nanofiber, and (b) shows a scanning electron micrograph of the nanofiber. FIG. As shown in FIG. 2, the nanofibers can be produced in the form of plates, and the nanofibers are aggregates of fine threads.
또한, 도 3은 본 발명에 따른 복합체의 제조 과정을 나타내는 사진으로, 상기 복합체는 (a) 틀에 나노섬유를 넣고, (b) 상기 틀에 하이드로젤 전구 용액을 부어서, (c) 나노섬유가 하이드로젤 내부에 형성된 복합체를 제조할 수 있다.
3 is a photograph showing a process for producing a composite according to the present invention, wherein the composite is prepared by (a) putting nanofibers into a mold, (b) pouring a hydrogel precursor solution into the mold, and (c) A complex formed inside the hydrogel can be prepared.
실시예Example
이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예의 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples of the present invention and Comparative Examples which are not based on the present invention, but the scope of the present invention is not limited by the following embodiments.
실시예 1. 전기방사 나노섬유 구조체 제조Example 1 Preparation of Electrospun Nanofiber Structure
1) 전기방사법을 이용한 PLGA 나노섬유층의 형성1) Formation of PLGA nanofiber layer by electrospinning
폴리락틱글리콜 산(PLGA, Evonik) 2g을 트리플루오로에탄올(TFE, Sigma) 10 ml에 혼합한 후, 80℃에서 12 시간 두어 PLGA를 완전히 녹여 고분자 용액을 제조하였다. 상기 고분자 용액을 상온에서 식힌 후, 전기방사법을 이용하기 위해 고분자 용액을 10 ml 주사기에 넣고, 1 ml/hr의 일정한 속력으로 관을 지나 금속으로 이루어진 원통형 바늘로 흘려주었다. 이때, 금속으로 이루어진 원통형 바늘에 고전압 장치를 이용하여 10 kV의 전압을 흘려주었다. 전압차이로 인해 접지된 스테인리스 스틸 기판으로 용액이 잡아당겨지면서 나노섬유를 형성하였다. 상기 형성된 나노섬유는 잔여 용매를 제거하기 위해서 50℃ 및 진공 상태에서 24 시간 정도 두었다.
2 g of polylactic glycolic acid (PLGA, Evonik) was mixed with 10 ml of trifluoroethanol (TFE, Sigma), and PLGA was completely dissolved at 80 ° C for 12 hours to prepare a polymer solution. After cooling the polymer solution at room temperature, the polymer solution was put into a 10 ml syringe to be used for electrospinning, and was poured into a cylindrical needle made of metal through a tube at a constant speed of 1 ml / hr. At this time, a voltage of 10 kV was applied to a cylindrical needle made of metal using a high-voltage device. Due to the voltage difference, the solution was pulled into a grounded stainless steel substrate to form nanofibers. The nanofibers were left at 50 DEG C for 24 hours in a vacuum to remove residual solvent.
2) 전기방사법을 이용한 PCL 나노섬유층의 형성2) Formation of PCL nanofiber layer by electrospinning
폴리카프로락톤(PCL, Sigma) 2g을 트리플루오로에탄올 10 ml에 혼합한 후, 80℃에서 12 시간 두어 PCL을 완전히 녹여 고분자 용액을 제조하였다. 상기 고분자 용액을 상온에서 식힌 후, 전기방사법을 이용하기 위해 용액을 10 ml 주사기에 넣고 0.5 ml/hr의 일정한 속력으로 관을 지나 금속으로 이루어진 원통형 바늘로 흘려주었다. 금속으로 이루어진 원통형 바늘에 고전압 장치를 이용하여 10 kV의 전압을 흘려주었다. 전압차이로 인해 접지된 스테인리스 스틸 기판으로 용액이 잡아당겨지면서 나노섬유를 형성하였다. 상기 형성된 나노섬유는 잔여 용매를 제거하기 위해서 50℃ 및 진공 상태에서 24 시간 정도 두었다.
2 g of polycaprolactone (PCL, Sigma) was mixed with 10 ml of trifluoroethanol, and the mixture was placed at 80 ° C for 12 hours to completely dissolve PCL to prepare a polymer solution. After the polymer solution was cooled at room temperature, the solution was poured into a 10-ml syringe through a tube at a constant speed of 0.5 ml / hr through a cylindrical needle to use electrospinning. A voltage of 10 kV was applied to a cylindrical needle made of metal using a high voltage device. Due to the voltage difference, the solution was pulled into a grounded stainless steel substrate to form nanofibers. The nanofibers were left at 50 DEG C for 24 hours in a vacuum to remove residual solvent.
3) 전기방사법을 이용한 PCL과 절라틴 나노섬유층의 형성3) Formation of PCL and truncated nano-fiber layer by electrospinning
폴라카프로락톤(PCL)의 소수성을 감소시키며, 세포의 부착이 유용한 장소를 제공하는 젤라틴을 혼합하는 방법을 이용할 수 있다. 폴리카프로락톤(PCL) 1g과 젤라틴 1g을 트리플루오로에탄올(TFE) 10 ml에 혼합한 후, 80 ℃에서 12 시간 두어 PCL 및 젤라틴을 완전히 녹여 고분자 용액을 제조하였다. 상기 고분자 용액을 상온에서 식힌 후, 전기방사법을 이용하기 위해 고분자 용액을 10 ml 주사기에 넣고 0.5 ml/hr의 일정한 속력으로 관을 지나 금속으로 이루어진 원통형 바늘로 흘려주었다. 금속으로 이루어진 원통형 바늘에 고전압 장치를 이용하여 10 kV의 전압을 흘려주었다. 전압차이로 인해 접지된 스테인리스 스틸 기판으로 용액이 잡아당겨지면서 나노섬유를 형성하였다. 상기 형성된 나노섬유는 잔여 용매를 제거하기 위해서 50℃, 진공 상태에서 24 시간 정도 두었다.
A method of mixing gelatin which reduces the hydrophobicity of polar caprolactone (PCL) and which provides a place where cell attachment is useful can be used. 1 g of polycaprolactone (PCL) and 1 g of gelatin were mixed in 10 ml of trifluoroethanol (TFE), and then the mixture was placed at 80 ° C for 12 hours to completely dissolve PCL and gelatin to prepare a polymer solution. After the polymer solution was cooled at room temperature, the polymer solution was injected into a 10 ml syringe at a constant speed of 0.5 ml / hr and passed through a tube with a cylindrical needle made of metal to use the electrospinning method. A voltage of 10 kV was applied to a cylindrical needle made of metal using a high voltage device. Due to the voltage difference, the solution was pulled into a grounded stainless steel substrate to form nanofibers. The nanofibers were left at 50 DEG C for 24 hours in a vacuum to remove residual solvent.
4) 나노섬유층의 산소 플라즈마 처리4) Oxygen plasma treatment of the nanofiber layer
상기 1. 1) 내지 1. 3)에서 제조된 나노섬유의 친수성을 증가시키기 위해 나노섬유층에 플라즈마 장치를 이용하여 산소 플라즈마를 처리하였다. 무선주파수 출력은 40 W, 압력은 1 X 10-1 mmHg으로 5 분 동안 처리했다. 친수성의 증가는 물이나 하이드로젤 전구용액의 침투성을 증가시키고, 세포의 흡착이 용이하도록 하였다.
In order to increase the hydrophilicity of the nanofibers prepared in the above 1. 1) to 1.3), the nanofiber layer was treated with oxygen plasma using a plasma apparatus. The radio frequency output was 40 W and the pressure was maintained at 1 X 10 -1 mmHg for 5 minutes. The increase of hydrophilicity increases permeability of water or hydrogel precursor solution and facilitates cell adsorption.
실시예 2. 알긴산을 이용한 나노섬유와 하이드로젤의 결합Example 2: Combination of nanofiber and hydrogel using alginic acid
나노섬유층을 봉입하기 위한 하이드로젤의 재료로 2 wt% 알긴산 나트륨(Sodium alginate, Sigma)을 사용하였다. 일반적으로 알긴산 하이드로젤의 가교(crosslinking)는 알긴산 나트륨 수용액을 Ca2 +나 Mg2 + 등의 2가 양이온이 포함된 수용액에 첨가하여 알긴산 나트륨의 가교를 유도하였다.2 wt% sodium alginate (Sigma) was used as the material of the hydrogel for encapsulating the nanofiber layer. Generally, the crosslinking of alginic acid hydrogel was effected by adding an aqueous solution of sodium alginate to an aqueous solution containing divalent cations such as Ca 2 + or Mg 2 + .
일정한 틀 위에 실시예 1.1) 내지 3)에서 제조된 나노섬유층을 두고, 2 wt% 알긴산 나트륨 용액 1 wt% CaCl2(Sigma) 용액 0.5ml를 부었다. 상온에서 3시간 정도 두어 알긴산이 하이드로젤로 가교되어 나노섬유층을 포함하는 하이드로젤을 제조하였다.
0.5 ml of 1 wt% CaCl 2 (Sigma) solution of 2 wt% sodium alginate solution was poured on the nanofiber layer prepared in Examples 1.1) to 3) on a certain frame. Alginic acid was crosslinked with a hydrogel at room temperature for about 3 hours to prepare a hydrogel including a nanofiber layer.
도 4는 하이드로젤(a) 및 본 발명의 실시예에 의해 제조된 복합체(b,c)의 기계적 강도를 측정한 사진 및 그래프이다. 구체적으로, (a)는 나노섬유를 삽입시키지 않은 하이드로젤(실시예 2만 수행, 알긴산 하이드로젤), (b)는 나노섬유의 재료 물질로 PCL을 사용한(실시예 1.2) 및 실시예 2 수행) 복합체(PCL 알긴산 복합체), 및 (c)는 나노섬유의 재료 물질로 PCL 및 젤라틴을 사용한(실시예 1.3) 및 실시예 2 수행) 복합체(PCL-젤라틴 알긴산 복합체)의 기계적 강도를 측정하는 사진이다. 4 is a photograph and a graph showing mechanical strength of the hydrogel (a) and the composite (b, c) produced by the embodiment of the present invention. Specifically, (a) is a hydrogel in which nanofibers are not inserted (performed only in Example 2, alginic acid hydrogel), (b) is a sample obtained by using PCL (Example 1.2) and Example 2 (PCL-gelatin alginate complex) and PCL-gelatin complex (PCL-gelatin alginate complex), and (c) to be.
상기 도 4에 타나난 바와 같이, 나노섬유 및 하이드로젤의 복합체의 기계적 강도가 우수하며, 특히, PCL-젤라틴 알긴산 복합체의 기계적 강도가 우수함을 확인할 수 있다.
As shown in FIG. 4, the mechanical strength of the composite of nanofiber and hydrogel was excellent, and the mechanical strength of the PCL-gelatin alginate composite was particularly excellent.
실시예 3. 생리활성성분을 도입한 나노섬유 하이드로젤 복합체 제작Example 3. Fabrication of a nanofiber hydrogel composite incorporating a physiologically active ingredient
1) 전기방사법을 이용한 성장인자가 포함된 PCL 나노섬유층의 형성1) Formation of PCL nanofiber layer containing growth factor by electrospinning
성장인자(growth factor)나 약물을 포함하는 나노섬유를 형성하기 위해, 전기방사를 위한 고분자용액에 성장인자나 약물을 혼합하여 전기방사를 하는 방법으로 얻을 수 있다.In order to form a nanofiber containing a growth factor or a drug, it can be obtained by mixing a growth agent or a drug with a polymer solution for electrospinning and electrospinning the mixture.
먼저 폴리카프로락톤(PCL) 1g과 젤라틴 1g을 트리플루오로에탄올(TFE) 10 ml에 혼합한 후, 80℃에서 12시간 두어 PCL 및 젤라틴을 완전히 녹여 고분자 용액을 제조하였다. 여기에 성장인자중의 세포의 증식을 증가시키는 bFGF(basic fibroblast growth factor) 0.1 mg/ml의 알부민(albumin) 0.01 ml를 상기 고분자 용액에 혼합한 후, 상온에서 식혔다. First, 1 g of polycaprolactone (PCL) and 1 g of gelatin were mixed in 10 ml of trifluoroethanol (TFE), and then the mixture was placed at 80 ° C for 12 hours to completely dissolve PCL and gelatin to prepare a polymer solution. 0.01 ml of albumin (0.1 mg / ml) of basic fibroblast growth factor (bFGF), which increases cell proliferation in growth factors, was added to the polymer solution and then cooled at room temperature.
전기방사법을 이용하기 위해, 고분자 용액을 10 ml 주사기에 넣고 0.5 ml/hr의 일정한 속력으로 관을 지나 금속으로 이루어진 원통형 바늘로 흘려주었다. 금속으로 이루어진 원통형 바늘에 고전압 장치를 이용하여 10 kV의 전압을 흘려주었다. 전압차이로 인해 접지된 스테인리스 스틸 기판으로 용액이 잡아당겨지면서 나노섬유를 형성하였다. To use electrospinning, the polymer solution was poured into a 10 ml syringe and passed through a tube at a constant rate of 0.5 ml / hr through a cylindrical needle made of metal. A voltage of 10 kV was applied to a cylindrical needle made of metal using a high voltage device. Due to the voltage difference, the solution was pulled into a grounded stainless steel substrate to form nanofibers.
생성된 나노섬유는 잔여 용매를 제거하기 위해서 50℃ 및 진공 상태에서 24 시간 정도 두었다.
The resulting nanofibers were left at 50 < 0 > C and vacuum for 24 hours to remove residual solvent.
2) 성장인자를 포함한 나노섬유층과 알긴산 하이드로젤의 결합2) Combination of alginate hydrogel with nanofiber layer containing growth factor
일정한 틀 위에 전기방사를 통해 얻은 bFGF가 포함 된 나노섬유층을 두고, 2wt% 알긴산 나트륨 용액 1ml를 부어주고, 1wt% CaCl2 용액 0.5ml를 부어주었다. 상온에서 3시간 정도 두어 알긴산이 하이드로젤로 가교되어 나노섬유층을 포함한 하이드로젤을 생성하였다.
The nanofiber layer containing bFGF obtained by electrospinning on a given frame was poured into 1 ml of 2 wt% sodium alginate solution and poured into 0.5 ml of 1 wt% CaCl 2 solution. After 3 hours at room temperature, alginic acid was crosslinked with hydrogel to produce a hydrogel including a nanofiber layer.
도 5는 실시예 3에서 제조된 복합체의 생체물질, 즉 bFGF 방출거동을 나타내는 그래프이다. 상기 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예에 의해 제조되는 복합체는 우수한 방출 거동을 나타낸다.
FIG. 5 is a graph showing the biomaterial of the complex prepared in Example 3, that is, bFGF release behavior. As shown in FIG. 5, the composite produced by the embodiment of the present invention exhibits excellent release behavior.
실시예 4. MSC를 포함한 나노섬유 하이드로젤 복합체 제작Example 4. Fabrication of Nanofiber Hydrogel Composite Including MSC
1) 전기방사법을 이용한 PCL과 젤라틴 나노섬유층의 형성1) Formation of PCL and gelatin nanofiber layers by electrospinning
폴리카프로락톤(PCL) 1g과 젤라틴 1g을 트리플루오로에탄올(TFE) 10 ml에 혼합한 후, 80℃에서 12 시간 두어 PCL 및 젤라틴을 완전히 녹여 고분자 용액을 제조하였다. 상기 고분자 용액을 상온에서 식힌 후, 전기방사법을 이용하기 위해 용액 10 ml를 주사기에 넣고 0.5 ml/hr의 일정한 속력으로 관을 지나 금속으로 이루어진 원통형 바늘로 흘려주었다. 금속으로 이루어진 원통형 바늘에 고전압 장치를 이용하여 10 kV의 전압을 흘려주었다. 전압차이로 인해 접지된 스테인리스스틸 기판으로 용액이 잡아당겨지면서 나노섬유를 형성하였다. 생성된 나노섬유는 잔여 용매를 제거하기 위해서 50 ℃, 진공 상태에서 24시간 정도 두었다.
1 g of polycaprolactone (PCL) and 1 g of gelatin were mixed in 10 ml of trifluoroethanol (TFE), and then the mixture was placed at 80 ° C for 12 hours to completely dissolve PCL and gelatin to prepare a polymer solution. After cooling the polymer solution at room temperature, 10 ml of the solution was poured into a syringe through a tube at a constant speed of 0.5 ml / hr through a cylindrical needle to use electrospinning. A voltage of 10 kV was applied to a cylindrical needle made of metal using a high voltage device. Due to the voltage difference, the solution was pulled into a grounded stainless steel substrate to form nanofibers. The resulting nanofibers were left at 50 ° C for 24 hours in a vacuum to remove residual solvent.
2) 나노섬유에 MSC 배양2) MSC culture on nanofiber
MSC(mesenchymal stem cell)를 배양하기 위한 배지는 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Medium, Sigma)에 10% FBS(Fetal bovine serum, Sigma)와 1%의 antibiotic/antimycotic solution(Sigma)을 혼합한 용액을 사용하였다. 나노섬유의 단위면적에 대해 1 X 104 cells/cm2의 농도의 MSC를 나노섬유에 가하여 세포가 충분히 부착하는데 필요한 6~12시간 동안 배양하였다.
The medium for culturing MSC (mesenchymal stem cell) was a mixture of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma) mixed with 10% FBS (Fetal bovine serum, Sigma) and 1% antibiotic / antimycotic solution (Sigma) . MSCs at a concentration of 1
3) MSC를 포함한 나노섬유와 하이드로젤의 결합3) Combination of nanofiber and hydrogel including MSC
일정한 틀 위에 MSC가 포함 된 나노섬유층을 두고, 2wt% 알긴산 나트륨 용액 1ml를 부어주고, 1wt% CaCl2 용액 0.5ml를 부어주었다. 상온에서 3시간 정도 두어 알긴산이 하이드로젤로 가교되어 나노섬유층을 포함한 하이드로젤을 생성하였다.
The nano fiber layer containing MSC was placed on a given frame, and 1 ml of a 2 wt% sodium alginate solution was poured, and 0.5 ml of a 1 wt% CaCl 2 solution was poured. After 3 hours at room temperature, alginic acid was crosslinked with hydrogel to produce a hydrogel including a nanofiber layer.
실시예 5. disc cell을 포함한 나노섬유 하이드로젤 복합체 제작Example 5. Fabrication of nanofiber hydrogel complex including disc cell
1) 전기방사법을 이용한 PCL과 젤라틴 나노섬유층의 형성1) Formation of PCL and gelatin nanofiber layers by electrospinning
실시예 4의 1)과 동일한 방법으로 나노섬유층을 제조하였다.
A nanofiber layer was prepared in the same manner as in 1) of Example 4.
2) disc cell이 포함된 알긴산 용액을 이용한 나노섬유층과의 결합2) Combination with nanofiber layer using alginate solution containing disc cells
디스크 세포(Disc cell)를 배양하기 위한 배지는 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Medium, Sigma)에 10% FBS(Fetal bovine serum, Sigma)와 1%의 antibiotic/antimycotic solution(Sigma)을 혼합한 용액을 사용하였다. 1 X 106 cells/ml 의 비율이 되도록 세포를 배지에 2 wt%가 되도록 알긴산 나트륨을 녹인 용액에 분산시켰다. 일정한 틀 위에 전기방사를 통해 얻은 나노섬유층을 두고, 세포가 혼합되어 있는 배지에 용해시킨 2 wt% 알긴산 나트륨 용액 1 ml를 부어주고, 1 wt% CaCl2 용액 0.5 ml를 부어주었다. 상온에서 3시간 정도 두어 알긴산이 하이드로젤로 가교되어 나노섬유층과 세포를 동시에 포함한 하이드로젤을 생성하였다.
Disc cells were prepared by mixing 10% FBS (Fetal bovine serum, Sigma) and 1% antibiotic / antimycotic solution (Sigma) in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma) . The cells were dispersed in a solution prepared by dissolving sodium alginate to 2 wt% in a medium such that the ratio was 1
실시예 6. 두 종류의 세포를 포함한 나노섬유 하이드로젤 복합체 제작Example 6. Fabrication of nanofiber hydrogel complex containing two kinds of cells
1) 전기방사법을 이용한 PCL과 젤라틴 나노섬유층의 형성1) Formation of PCL and gelatin nanofiber layers by electrospinning
실시예 4의 1)과 동일한 방법으로 나노섬유층을 제조하였다.
A nanofiber layer was prepared in the same manner as in 1) of Example 4.
2) 나노섬유에 MSC 배양2) MSC culture on nanofiber
MSC를 배양하기 위한 배지는 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Medium, Sigma)에 10% FBS(Fetal bovine serum, Sigma)와 1%의 antibiotic/antimycotic solution(Sigma)을 혼합한 용액을 사용하였다. 나노섬유의 단위면적에 대해 1 X 104 cells/cm2의 농도의 MSC를 나노섬유에 가하여 세포가 충분히 부착하는데 필요한 6~12시간 동안 배양하였다.
MSCs were prepared by mixing 10% FBS (Fetal bovine serum, Sigma) and 1% antibiotic / antimycotic solution (Sigma) in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma). MSCs at a concentration of 1
3) Disc 세포가 포함된 알긴산 용액을 이용한, MSC를 포함한 나노섬유층과의 결합3) Combination with nanofiber layer containing MSC using alginate solution containing Disc cells
디스크 세포(Disc cell)를 배양하기 위한 배지는 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Medium, Sigma)에 10% FBS(Fetal bovine serum, Sigma)와 1%의 antibiotic/antimycotic solution(Sigma)을 혼합한 용액을 사용하였다. 1 X 106 cells/ml 의 비율이 되도록 세포를 배지에 2 wt%가 되도록 알긴산 나트륨을 녹인 용액에 분산시켰다. 일정한 틀 위에 전기방사를 통해 얻은 나노섬유층을 두고, 세포가 혼합되어 있는 배지에 용해시킨 2 wt% 알긴산 나트륨 용액 1 ml를 부어주고, 1 wt% CaCl2 용액 0.5 ml를 부어주었다. 상온에서 3시간 정도 두면 알긴산이 하이드로젤로 가교되어 MSC가 배양 된 나노섬유층과 Disc 세포를 동시에 포함한 하이드로젤을 생성하였다.
Disc cells were prepared by mixing 10% FBS (Fetal bovine serum, Sigma) and 1% antibiotic / antimycotic solution (Sigma) in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma) . The cells were dispersed in a solution prepared by dissolving sodium alginate to 2 wt% in a medium such that the ratio was 1
도 6은 실시예 4 내지 6에서 제조된 복합체를 세포 배양에 이용했을 때의 세포 배양성을 나타내는 사진으로, 도 4는 실시예 4, 도 5는 실시예 5, 도 6은 실시예 6에서 제조된 복합체의 사진을 나타낸다. 또한, 상기 도 6에서 살아있는 세포는 초록색, 죽은 세포는 붉은색으로 나타난다. MSC는 나노섬유 층에서 배양되었고, Disc 세포는 젤에 포집시켜 배양하였다. MSC만 배양한 경우(실시예 4)에는 세포가 나노섬유에 부착되어 자라서 모양이 다각형의 모양을 보여준다. Disc 세포만 배양한 경우(실시예 5)에는 세포가 부착되지 않았기 때문에 뻗어나가는 모습을 보여주지 못하고, 구형을 유지하는 것을 볼 수 있다. MSC와 Disc 세포를 함께 배양한 경우(실시예 6)에는 나노섬유에 부착 된 나노섬유를 따라 뻗어있는 다각형 모양의 MSC와 구형을 유지하고 있는 Disc 세포를 모두 관찰할 수 있다.Fig. 6 is a photograph showing cell purity when the complexes prepared in Examples 4 to 6 were used for cell culture, Fig. 4 is a photograph of Example 4, Fig. 5 is Example 5, Fig. Lt; / RTI > In FIG. 6, living cells are green, and dead cells are red. MSCs were cultured in the nanofiber layer, and Disc cells were collected on gels and cultured. When MSC alone was cultured (Example 4), the cells adhered to the nanofibers and showed a polygonal shape. In the case of culturing only Disc cells (Example 5), it can be seen that the cells do not extend, and thus the cells do not extend. When the MSC and the Disc cells were cultured together (Example 6), both the polygonal MSC extending along the nanofibers adhered to the nanofibers and the Disc cells retaining the spherical shape can be observed.
또한, 도 7은 상기 세포의 활성을 측정한 그래프로, 상기 세포는 복합체 내에서 우수한 활성을 가진다.
FIG. 7 is a graph showing the activity of the cells, wherein the cells have excellent activity in the complex.
Claims (16)
상기 하이드로젤의 내부에 형성된 나노섬유를 포함하고,
상기 하이드로젤의 3 차원 망 내부에 생체물질 또는 세포가 삽입되고,
상기 나노섬유에 생체물질 또는 세포가 고정화되며,
강도는 0.1 내지 0.5 MPa인 복합체. A hydrogel having a three-dimensional network structure; And
And a nanofiber formed inside the hydrogel,
A biomaterial or a cell is inserted into the three-dimensional network of the hydrogel,
A biomaterial or a cell is immobilized on the nanofiber,
Wherein the strength is 0.1 to 0.5 MPa.
상기 하이드로젤은 수소결합에 의한 가교, 소수성(hydrophobic) 상호작용에 의한 가교 또는 정전기적 상호작용에 의한 가교를 포함하는 물리적 가교에 의해 제조되는 제1항에 따른 복합체의 제조 방법. And placing the nanofibers in a mold and pouring a hydrogel precursor solution to prepare a hydrogel in which the nanofibers are formed,
The method according to claim 1, wherein the hydrogel is produced by physical crosslinking including crosslinking by hydrogen bonding, crosslinking by hydrophobic interaction, or crosslinking by electrostatic interaction.
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