CN110741250B - 改变电场的电泳方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测一样品中一分析物的电泳方法，所述方法包括提供所述样品以及与所述分析物特异性结合的一试剂，所述样品与所述试剂在一分离通道中的一流体介质中相结合；沿着所述分离通道施加一电场，所述电场具有一电场分布，从而引起结合的及未结合的分析物及/或试剂相对于所述流体移动；改变所述施加的电场以相对于所述分离通道调整所述电场分布，从而使得所述结合的分析物及所述未结合的分析物在由于所述电场产生的一电力以及由于所述流体产生的一流体动力的结合影响下在所述流体中彼此隔开的位置处浓缩。

Description

改变电场的电泳方法
技术领域
本发明涉及用于检测一样品中的一分析物的多种电泳方法。
背景技术
电泳技术是众所周知的，并用于根据其电及流体动力学特性来分离物体。其他分离技术包括使用EP1455949中所述的离心光谱仪。
在常规电泳中，施加一恒定且均匀的电场以使物体移动通过一流体或一筛分介质。当物体在材料中移动时，它们承受取决于其形状及大小(例如：流体动力)及/或取决于它们对材料的亲和力(例如：化学吸引力/排斥力)的力，以及由于施加的电场而产生的取决于它们的视在电荷一电场力。由于每个物体类型承受的力不同，物体根据其各自的特性以不同的终端速度移动，因此它们分成“带”。
目前用于检测一样品中分析物的电泳方法，例如蛋白质转渍法(有时称为蛋白质免疫印迹法)，缓慢且费时，涉及使用多种不同的化学物质及缓冲液进行大量样品制备，并且倾向于仅指示一分析物的存在，以及有关其大小及/或电荷性质的基本信息。在蛋白质转渍法中，进行凝胶电泳(通常使用聚丙烯酰胺凝胶)以按其大小将变性蛋白质分离出来(或按其三维结构的天然蛋白质)。凝胶及样品缓冲液通常包含十二烷基硫酸钠，以使样品中的所有蛋白质具有均匀的负电荷，其有助于电泳。这被称为十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)。在凝胶上分离之前，通常将蛋白质样品煮沸以使存在的蛋白质变性。在电泳凝胶上分离后，将蛋白质印迹至一膜上(通常使用硝化纤维素或聚偏二氟乙烯)。然后使用蛋白质溶液(例如：牛奶)封闭膜上未被占据的结合位点，以防止下一阶段中的非特异性抗体结合。洗涤膜，然后将所述膜与特异性结合至目标蛋白的抗体一起温育。然后，通常进行进一步的洗涤步骤以及使用识别第一抗体并附着于一可检测标签的一抗体的抗体温育步骤以增强信号。由于第一抗体不需要标记，因此这也简化了试剂并降低了试剂成本。然后检测可检测的部分(通常是32P或可以通过切割受质引起颜色变化来被检测的酶)，以提供最终结果：通常是在近似大小的条件下分辨率较差(使用在凝胶上同步制备的大小蛋白质标志样品来计算)。若没有电泳步骤，则可能会有大量的抗体交叉反应，这将使所述测定相对无效。
如上所述，在准备用于蛋白质转渍的样品时，蛋白质经常会变性，因此会失去蛋白质的天然构型。这具有需要使用针对线性表位(抗体识别的结合位点)的结合剂(抗体)的缺点。此类针对线性表位的抗体的范围及研究诊断价值可能受到更大的限制。因此，例如，通过免疫产生的针对天然蛋白质的抗体可能不适用于许多蛋白质的蛋白质转渍。此外，所需的大量步骤及试剂意味着完成蛋白质转渍可能要花费数小时，并且结果可能会变化很大。蛋白质样品所经历的苛刻过程也可能破坏其结构的其他方面，这些方面可能具有研究或诊断价值，例如翻译后修饰(例如糖基化位点)。
其他相关的免疫测定(使用抗体的测定)技术包括斑点杂交分析、定量斑点杂交、免疫组织化学、免疫细胞化学(其中抗体用于通过免疫染色检测组织及细胞中的蛋白质)及酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。
在ELISA中，不涉及电泳步骤。ELISA中使用的样品通常较少受到其他非蛋白质物质(例如DNA、脂质等等)的污染，以实现更干净的结果。在ELISA中，一蛋白质样品通常被放在一多孔培养盘上的塑料孔中。在短暂的温育步骤后，蛋白质自然会贴附在塑料上。然后进行与上述针对蛋白质转渍相同的封闭、清洗及抗体温育、以及清洗步骤。ELISA中二抗上的可检测部分是一种酶，于存在时改变一受质的颜色。因此，在完成所有清洗及温育步骤之后，将每个孔与受质一起温育以显示在每个含有目标蛋白的孔中的一信号(通过存在第一抗体及第二抗体的第二信号)。这是用于检测一样品中一分析物的存在的一有用测定，但是在可检索信息方面受到限制。ELISA相对于其他免疫试验法的一个优势是经固定的蛋白质或多或少保持其天然三级形式，其对于天然产生的抗体进行结合必不可少。
各种装置已被生产以实现免疫测定的自动化及更好的标准化，例如Chen等人(2015)于转化医学期刊(J Transl Med)13：182中综述的毛细管纳米免疫测定装置。这试图解决使用典型的免疫测定对蛋白质样品进行分析本质上的问题，例如临床样本量的限制、再现性差、定量不可靠以及分析稳定性不足。
毛细管纳米免疫测定***是传统免疫测定技术的重大进步，但由于其基本过程与蛋白质转渍法相同，因此仍然存在必须执行多个温育及洗涤步骤的缺点。此外，需要昂贵且复杂的机器以使毛细管作用起作用，因为各种溶液必须通过发生分离及转渍的小毛细管。这些测定比传统的免疫测定要快，但是它们仍然需要很多小时。
所有形式的免疫测定法的另一个问题是信号的可视化，以及由此通过间接手段对分析物的鉴定。如上所述，这涉及两种抗体，一种是特异性识别分析物的一第一抗体，另一种是一第二抗体，其识别所述第一抗体，并连接至一可检测部分，例如一荧光标签或酶。因此，来自所述可检测部分的一信号实际上仅指示存在第二抗体，而不能直接检测所述分析物。可理解地，所述信号来自结合的及未结合的第二抗体。当然，所述过程中的封闭及清洗程序可最大程度地减少非特异性结合，然而这永远无法完全消除。同样，检测分析物的间接方法本质上导致多个小时的一多个步骤过程。
在本说明书中对一显然是先前出版的文件的列出或讨论不应被认为是承认所述文件是现有技术的一部分或是公知常识。
发明内容
本发明提供了一种用于检测一样品中一分析物的电泳方法，所述电泳方法包括提供所述样品以及与所述分析物特异性结合的一试剂，所述样品与所述试剂在一分离通道中的一流体介质中相结合；沿着所述分离通道施加一电场，所述电场具有一电场分布，从而引起结合的及未结合的分析物及/或试剂相对于所述流体移动；改变所述施加的电场以相对于所述分离通道调整所述电场分布，从而使得所述结合的分析物及所述未结合的分析物在由于所述电场产生的一电力以及由于所述流体产生的一流体动力的结合影响下在所述流体中彼此隔开的位置处浓缩。在一个实施方式中，所述流体介质可以是所述样品。
本发明人之一提出了用于通过电泳分离物体的场位移分析的概念，其中，所施加的电场不是恒定的，而是随时间变化的场梯度。在WO 2006/070176及WO 2012/153108中描述了使用所述概念的电泳装置的实例，其全部内容通过引用合并于此。与传统技术相比，场位移分析在分析及处理能力方面具有巨大潜力，可以更快、更灵敏地分离几个数量级。然而，场位移技术先前并未应用于目前要求保护的与结合剂结合的分析物的检测。一技术人员不会想到这样做，因为用于进行此类测定的常规手段需要电泳、转渍/螯合、清洗以及多个结合剂温育及信号放大阶段的多个步骤。本发明人惊奇地发现，结合剂及结合的分析物在一电泳介质上保持缔合，并且仅需简单的单个步骤即可提供准确的鉴定及定量。可以通过使用一经标记的结合剂进一步增强这一点。令人惊奇的是，结合分析实际上可以在电泳介质中进行而无需解离。实际上，如上所述，在某些实施方式中，不需要特定的电泳介质，因为本发明的方法可以直接在含分析物的样品(例如生物流体，例如血液、唾液、环境样品等等)上进行，而无须任何额外的特殊介质或处理。
场位移装置通常采用多个电极的一网络来施加一合适的时间依赖性电场梯度，以在一微流体环境中分离及处理分析物及其他材料。例如，所述微流体环境可以在一玻璃装置内或一玻璃装置上包括一平面的分离通道，其横截面尺寸为0.1至几百微米，长度至少为500微米。在US-A-6277258及US-A-2002/0070113中可以找到不同电泳装置的进一步实例。
本发明使得抗体/分析物结合的直接可视化成为可能，从而可以验证及适当地定量分析物的实际存在。当样品中仅存在少量分析物时，此功能特别有用。本发明可以提供一种免疫测定法，其可以以高水平的灵敏度几乎立即鉴定出所需的分析物。装置的性质还允许所述方法自动化并以高通量方式执行，这将为执行诊断及鉴识方法提供强大的新技术。
本发明还提供了一种快速且简单的方法来检测一样品中的分析物，而无需经历其他形式的电泳，例如蛋白质转渍法及毛细管免疫测定中固有的费时、费力及昂贵的封闭、清洗及温育步骤。实际上，如本文所述将样品直接施加至装置能够实现极快的结果，而无需任何样品处理。可设想到的是，某些特别粘稠的样品可能需要添加添加流体以能够实施本发明的方法，但是如本领域技术人员可理解的，这将在使用时确定。
本发明允许进行直接的单步骤分析，而无需任何样品处理。因此，本发明允许在几分钟之内分析物的可视化，其使它成为用于研究、诊断及鉴识目的的极其有用的工具。
可设想到的是，所述方法可以包括通过与结合剂共定位来检测分析物的进一步步骤。本发明的电泳方法根据例如分析物的大小和其他性质(例如电荷)同时在某些位置分离及浓缩分析物。可以几乎立即在流体介质中将其可视化。因此，由于分析物与结合剂的结合的增加的尺寸，分析物可以通过其与结合剂的共定位来被鉴定。
可设想到的是，样品及试剂可以在接触流体介质之前混合。样品及结合剂的预混合允许在电泳之前结合剂与分析物结合。这可以在加快分离通道中结合的分析物的检测方面提供优势。此外，这可以增强电泳之前结合剂与分析物的结合，这可以起到驱使未结合的分析物与结合剂分开的作用。
或者，可以将样品添加到预装有流体介质及结合剂的分离通道中。因此，在电泳之前或期间，结合剂与分析物的结合可发生在分离通道中。例如，样品、结合剂、流体介质及任何其他合适的缓冲液的混合顺序将部分取决于样品及结合剂的性质。实际上，所使用的流体类型也可能起一定作用。如本领域技术人员可理解的，如果将抗体用作结合剂，则抗体的结合作用是如此之快，以致如果在分离通道中结合样品与结合剂，则不太可能看到任何结合的降低。样品、结合剂及流体介质可以在添加到分离通道之前或之后以任何顺序混合。
在一另一个替代方案中，可以将结合剂添加至样品中，然后将其直接添加到分离通道中，而无需任何其他流体介质。因此，在所述实施方式中，流体介质是所述样品。或者，可以将样品直接添加到分离通道中，然后将结合剂再次添加到分离通道中的样品，而无需任何其他流体介质。同样地，在所述实施方式中，流体介质是所述样品。应当理解的是，在某些情况下，例如当样品特别粘稠或体积小时，可以在加载之前或加载到分离通道上时向所述样品中添加额外的流体介质。
可设想到的是，特定的样品可能非常适合直接添加到分离通道，而无需额外的流体介质。例如，可将水性样品及/或其中分析物浓度不高的样品优先添加到电泳分离通道中，而无需任何其他流体介质。例如，这可能适用于血浆、唾液、尿液、环境来源的水等等。在分析物浓度低或需要在现场进行快速分析的情况下，利用样品的直接电泳可能特别有利。这样可以以最少的样品制备速度获得快速结果。令人惊讶的是，这是可能的，因为常规观点表明电泳需要特定的缓冲液。本发明令人惊讶地提供了一种电泳方法，所述电泳方法更具适应性、灵活及功能性，从而不适用特定缓冲液的要求。
可设想到的是，当执行本发明的方法时，可以随时间监测在一位置的分析物浓度的变化。可以连续或以规定的时间间隔监测所述位置的分析物的浓度。因此，可以确定特定位置处信号的增加并相对于时间作图，以作为一校准步骤，或者确实提供有关原始样品中分析物的浓度的信息。因此，可以实时看到结合剂与分析物的结合，并从样品中获得有用的诊断或分析信息。与其他用于检测一样品中分析物的方法相比，这种实时信号具有很大的优势。
术语“分析物”是指需要检测并可以使用特异性结合剂的任何实体。优选地，分析物包括一生物细胞(例如原核或真核细胞)或一生物分子，例如蛋白质、核酸或其他生物聚合物。例如，生物分子可包含肽、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、脂质、多糖或其修饰。示例性修饰可包括糖基化多肽。分析物可以是细菌细胞或病毒或癌细胞。
术语“试剂”是指具有识别并结合一特定靶标，例如分子或其一部分的能力的任何实体。“结合”是指在非还原条件下半永久性的分子之间的任何典型的强非共价相互作用。这种相互作用通常是氢键、离子缔合及/或通过范德华力，如本领域技术人员将容易理解的那样。
“分析物”、“试剂”以及样品中的任何其他分子在本文中可以统称为要分离的“对象”。
优选地，所述试剂包含抗体或其抗原结合片段或衍生物。术语“(多个)免疫球蛋白”在本文中与术语“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”互换使用。所谓“抗体、其抗原结合片段或其衍生物”，是指抗体包含抗体或其抗原结合片段的意思，例如Fab类分子、Fv分子、单链Fv(ScFv)分子，其中VH与VL伴侣域(partner domain)通过柔性的寡肽以及包含分离的V区的单域抗体(dAbs)连接，但其也可以是表现出本文提及的优先结合特性的任何其他配体。抗体可以是嵌合的。预期抗体将是单克隆的，但它们可能是多克隆的。对于“抗原”，我们包括任何包含被一免疫球蛋白特异性识别的一表位的化合物的含义。因此，当试剂是抗体时，分析物可被描述为抗原。可设想到的是，在分析物上发现抗体结合的表位。
在一另一个实施方式中，试剂可以是核酸分子。当分析物是寡核酸分子(即短核酸分子)时，这将是特别合适的。因此，在这种情况下，可预期试剂与分析物具有互补的核酸序列以允许彼此特异性杂交(即：结合)。所谓“互补”是指两个单体亚基精确配对的能力，无论这两个寡聚物或分析物核酸在试剂中的位置如何。例如，若在一寡聚物的一特定位置的一单体亚基能够与在一靶标核酸的一特定位置的一单体亚基氢键合，则所述寡聚物与所述分析物核酸之间的氢键合位置被视为是一互补位置。当每个分子中足够数量的互补位置被能够彼此氢键合的单体亚基占据时，寡聚物与靶标核酸彼此“基本上互补”。因此，术语“基本上互补”用于表示在足够数量的单体亚基上的足够精确配对的程度，从而在试剂寡聚物与分析物核酸之间发生稳定且特异性的结合。通常，当以5'至3'方向书写时，寡聚物试剂对分析物(靶标)核酸是“反义”的，它包含靶标核酸的相应区域的反向互补序列。在本领域中应理解，寡聚物的序列不必与其靶标核酸的序列100％互补以特异性杂交。此外，寡聚物可在一个或多个区段上杂交，使得在杂交中不涉及中间或相邻区段(例如：凸起、环状结构或发夹结构)。在本发明的一些实施方式中，寡聚物与靶标核酸内的一靶标区域具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的序列互补性。在本发明的其他实施方式中，寡聚物与靶标核酸内的靶标区域具有至少90％的序列互补性。在本发明的其他实施方式中，寡聚物与靶标核酸内的靶标区域具有至少95％或至少99％的序列互补性。例如，其中一寡聚物的20个核碱基中的18个与一靶标序列互补的寡聚物将代表90％的互补性。在所述实例中，剩余的非互补核碱基可以与互补核碱基成簇或散布，并且不需要彼此或与互补核碱基相邻。因此，长度为18个核碱基的一寡聚物具有四个非互补核碱基，其侧部是与靶标核酸完全互补的两个区域，将与靶标核酸具有77.8％的整体互补性，因此将落入本发明的范围内。寡聚物与靶标核酸区域的互补性百分比可以使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)及PowerBLAST程序常规地被确定(Altschul等人,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410；Zhang及Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)。
优选地，所述试剂可以使用一可检测的部分而被标记。如本领域技术人员可理解的，使用可检测的部分标记结合剂通常是所述结合剂与所述部分之间的一永久性共价相互作用，可能是通过一连接分子。所谓“可检测的部分”是指具有能够直接或间接被可视化或以某种方式被检测的性质的任何报告分子或原子，从而可以确定其存在。用于本发明方法的合适的可检测部分的实例包括一荧光分子(例如：Alexa-488)、光致变色化合物(例如：二芳基乙烯)、一酶、一荧光团(例如：Y-FAST)、一放射性标记(例如：32P或3H)、一DNA探针、一重原子(例如：金)或一电化学发光标签。荧光标签可以是任何天然地或当暴露于辐射例如可见光或紫外线时发出荧光的分子。合适的荧光标签的例子包括溴化乙锭、荧光素、罗丹明、绿色、黄色、红色或青色荧光蛋白、一Alexa Fluor染料(例如Alexa-488、-350、-405、-430、-500、-514、-532、-546、-555、-568、-594、-610、-633、-635、-647、-660、-680、-700、-750、或-790)或任何其他本领域技术人员所熟知的可商购的荧光标签。
替代地或另外地，无标记的方法可以用于检测分析物及/或结合剂。可以使用任何合适的无标签检测方法。例如，紫外线吸收可以用于检测分析物及结合剂。由于样品在流体中的一位置的浓缩，本方法特别适合于紫外线吸收。信号可能会被浓缩一千倍，因此很容易吸收紫外线。通常，肽段检测限制紫外线吸收的使用，因为与荧光检测相比，检测到的信号可能非常低，可能低1000倍。使用本方法获得的样品的局部浓缩可以克服紫外线吸收的局限性并实现敏感的紫外线吸收。可设想到的是，当检测蛋白质时，可以使用在150与350nm之间，例如在180与300nm之间、在200与280nm之间、或在210与220nm之间的一波长。可设想到的是，约215nm的一波长将足以检测蛋白质的主链，因此将适合于检测所有蛋白质。大约280nm的一波长也是合适的，因为这是某些氨基酸(例如：色氨酸)吸收紫外线的波长。此外，如本领域技术人员所理解的，当检测DNA或其他核酸例如RNA时，大约255nm的波长可能是合适的。实际上，如本领域技术人员所理解的，分析物及/或结合剂吸收紫外线的任何波长都是合适的。然而，在这些低波长下，用于制造分离通道的材料对紫外线的吸收，以及用于执行本发明方法的装置的其他部件可能会干扰结果。例如，诸如标准玻璃及聚甲基丙烯酸甲酯之类的材料会吸收辐射。因此，为解决此问题，可设想到的是，必要时可使用诸如石英、熔融石英、或环烯烃共聚物塑料之类的材料来制造分离通道及装置的其他部件，如本领域技术人员所理解的。如本领域技术人员可理解的，可以在本方法中采用的检测分析物及结合剂的另一种无标记的方法是激光诱导荧光。通过激光诱导荧光，不仅仅意味着使用荧光标记进行简单的荧光检测，其中激发光源是激光，还包括通过使用一强激发源，即：一激光，来激发内源荧光。其他合适的无标记检测方法也可设想到。
可设想到的是，样品可以是生物流体的一样品。例如，样品可以是血液、血浆、血清、***、唾液、汗液、淋巴液、脑脊液、粪便、腹膜液、痰或粘液样品或取自人体或动物体以进行测试的任何其他样品或拭子。样品可以是环境样品或包含要检测的一分析物的任何其他样品，例如犯罪现场的样品。样品可以未经处理而使用，或者可以经处理以纯化、浓缩或消毒，以提高安全性或使用本发明的方法改善对分析物的检测。例如，如本领域技术人员认为合适的那样，然后可以对样品进行热处理、过滤或干燥。样品也可以充当本文定义的“流体介质”，而无需添加任何其他流体。
“分离通道”是指当流体介质、分析物及试剂根据本发明进行电泳时可以在其中存在的任何封闭空间。它可以是用于电泳的典型通道或其多个通道。应当理解，分离通道的性质可以根据本发明的应用类型而变化。通常，分离通道可以表示在分析期间可以在其中容纳(及/或可以移动穿过)感兴趣的流体或物体的任何体积，而无论是否受到通道或其他实体的实际约束。例如，在分离通道包括一个或多个通道的情况下，每个通道可实体分隔，也可不实体分隔，例如，分离通道可包含在“自由流动”的电泳装置或“平板凝胶”技术中分析物所采用的一条或多条路径(可认为是“虚构(imaginary)”通道或“虚拟(virtual)”通道)。以下描述的实施方式主要是指以实体上限定的通道的形式的分离通道，用于物体的分离，尽管应当理解，这并不旨在进行限制。因此，如本领域技术人员所理解的，然后分离通道可以是孔、盘、毛细管或可以在其中进行电泳的任何其他合适的容器。通道可以是打开的或关闭的，并且可以根据本领域已知的典型方法从任何可能的角度或装置加载。优选地，分离通道包含在芯片上，例如WO 2006/070176或WO 2012/153108中描述的装置，其教示通过引用并入本文。
通过“浓缩在某处”，我们想要分析物及试剂根据流体施加的流体动力以及电场施加的力迁移到电场中的某个位置或相，使其达到平衡。所述位置可以对应于介质及分离通道内的一特定位置，但是它也可以根据电场及流体动力相对于介质及分离通道移动。因此，在流体/电场中的不同位置处的结合的分析物及试剂的实例将迁移到相同或基本相同的位置，从而导致浓缩作用，使得它们在所述特定位置处的浓度随着它们从其他地方移动而增加。这增强了信号，并提供了一种确定分析物是否存在的快速方法。若未结合的分析物最初位于结合的分析物最终将驻留的位置，则它将最初从所述位置移开，直到遇到结合剂，然后在结合后它将迁移回其原始位置。
应当理解的是，术语“流体”在本文中用于描述任何合适的电泳介质。例如，流体可以是一液体、一凝胶、一筛分基质或可以在一移动物体上产生摩擦力或流体动力的任何其他材料。例如，流体可以是聚丙烯酰胺或琼脂糖或本领域技术人员可理解的任何其他合适的流体。流体可以简单地是样品(例如自然界中发现的样品)，而无需任何处理或添加其他流体。对于包含含有分析物的一水性流体的样品，尤其可以设想这一点。
在本发明的方法的实施方式中，电场可以沿着电场分布的至少一部分相对于分离通道变化。此外，或替代地，电场分布的至少一部分可具有一非零的梯度。
通过基本上从电泳过程的开始就改变相对于分离通道的施加电场(与分析物浓缩之后相反)，就可以分离物体，而无需流体流过分离通道。施加的电场建立了随时间变化的电场分布，所述电场分布通过迫使颗粒移动通过流体而实现了电泳分离，因此流体本身可以是固定的。应该注意的是，电场沿着电场分布的至少一部分是非恒定的(相对于通道)。换句话说，施加(非零)随时间变化的电场梯度。因此，物体被分成不随时间扩展的移动带。
这消除了对复杂且昂贵的泵送装置的需求，并且消除了与常规电泳***中遇到的与抛物线速度前沿相关的问题。此外，由于不需要流体流动，所述技术非常适合使用凝胶或筛分基质作为分离流体。特定的电场及其变化将取决于要分离的物体的类型以及用作分离介质的流体。然而，优选地，以这样的方式改变电场，使得电场分布相对于分离通道移动。
电场分布可以随着其移动而改变形状及/或强度，但是更优选地，电场分布在其相对于分离通道移动时保持不变(即：保持其形状及强度)。通常，将物体沿着通道分离是方便的，因此优选以使电场分布沿着分离通道平移的方式来改变电场。
取决于要分离的物体，保持一定程度的流体流过通道可能是有益的。然而，如已经描述的，若能够消除流体流动通常是有利的，因此优选的是，流体与分离通道相对于彼此基本上是固定的。
所施加电场的特定形状将根据装置的所需的输出进行选择。然而，典型地，电场分布被整形为使得每个物体所经历的净力是由电场所施加的电场力与流体所施加的流体动力相结合而产生的，使得物体浓缩在特定的位置，并随着时保留在所述位置。优选地，电场分布使得物体以提升的清晰度浓缩并且最终在分离通道内获得一有限点，并且物体在每个点周围的扩散被约束或限制，使得只要实验条件保持不变，物体就可以保持在同一位置，并且不会随时间扩散。在下文中，这被称为“受限扩散(bound diffusion)”。
一旦多个物体分离并浓缩为奇异点，就可以去除电场。然而，继续施加所述电场并对其进行改变是有利的，使得一旦多个物体分离，则每个物体相对于分离通道以非零的终端速度运动。由于连续移动的物体不会随时间扩散，因此可以保持高分辨率。
在常规的电泳分离中，不同的带以不同的终端速度移动。换句话说，当它们穿过缓冲液或凝胶时，它们彼此之间的距离越来越远。假设相对距离的增加快于由于扩散引起的带加宽，则电泳的分辨率随着较大的分离长度(即：较长的分离通道)而增加。然而，由于扩散信号随时间而减弱，并且非常大的分离通道是不切实际的。因此，实际上，当带到达通道末端时，可能会发生“带丢失”。相反，在本发明中，优选地，物体以基本相等的终端速度移动。因此，分离效率不取决于分离通道的长度，而是取决于所施加的时变电场的特性以及分离缓冲剂的特性。优选地，每个物体的终端速度基本相同，因此保持每个物体之间的间隔。进一步优选地，终端速度随时间为恒定。
电场可以是线性的或非线性的。若电场的至少一部分相对于沿着通道的距离是没有变化的，则是有利的。这有利于样品分子的分离以及带扩散的约束。优选地，电场应沿着电场分布的一部分是连续的。还应注意的是，电场分布可以沿着分离通道在任一方向上移动。
可以使用在本发明的方法中的合适的电场形式以及用于获得合适的电场的装置的细节可以在WO 2006/070176或WO 2012/153108中找到，其教示通过引用并入本文。
在本发明的任何实施方式中，旨在可以在单个测定中，例如在单个分离通道中同时检测多种分析物。因此，可以在单个通道中进行几种不同的免疫测定(例如，当抗体或其片段或衍生物为结合剂时)。可设想到的是，当测定相同样品中的不同分析物时，可以使用每种特异性结合剂的不同的可检测部分。替代地，或另外地，当检测到具有不同物化性质(例如电荷或质量)的分析物时，将期望它们被定位在电场内的不同位置并因此被区分。本文所述的场位移特性将允许操作员将焦点集中在不同的分析物位置上以及之外，作为分析的一部分。这种聚焦可以被称为选择性集合浓缩，因为所述电场可被用于选择性地浓缩并聚焦在一特定的所选集合体上。当然，特别是当所述过程是自动化的并且由一计算机控制时，有可能在电场允许的情况下同时选择性地浓缩不同分析物的集合体。实际上，即使不同的分析物位于相似的位置，也可以根据选择性集合浓缩及/或用于鉴定其位置的可检测部分的准确度来区分它们。例如，当使用某些颜色时，可以预期不同颜色的共定位将提供不同的颜色读数，表明目标分析物具有相似的物化性质。例如，蓝色及黄色信号共定位将提供一绿色信号。可以在单个装置上的多个通道中执行多种测定，从而可以对各种样品进行非常复杂的分析。例如，当对样品进行广泛的蛋白质组或转录组分析时，同时分析多种分析物可能是有用的。这种类型的分析对于研究样品中的蛋白质-蛋白质相互作用也可能是有用的，因为结合的蛋白质将在电场中与单个蛋白质分开定位。因此，检测到的分析物不仅可以是单个蛋白质或其他大分子(例如：核酸、多糖、磷脂等等)，而且可以是蛋白质或其他分子的复合物。如本领域技术人员可理解的，存在许多测定的示例，其中这种复杂的高通量测定可能是有用的。在环境领域中，可以同时筛查样品中的多种有毒化合物或病原体，且几乎可以立即获得结果。可以对暴露于某些刺激的细胞中表达的蛋白质进行实时分析，以提供快速且准确的生化分析。实际上，可以在细胞暴露于流体介质中的测试刺激下实时进行这种分析。本发明允许同时检测分析物的复合模式以提供快速读出，这将在诊断、毒理学及法医领域特别有用。如本文所述，许多应用可被设想到，从中筛选出多种分析物会是有益的。例如，本发明可用于针对化合物库筛选药物靶向，以鉴定合适的候选药物或鉴定合适的适体。
有利地，本发明的方法还可包括改变电场的步骤，用以：(i)调整所述未结合的分析物与所述结合的分析物之间的间隔；(i)调整所述未结合的分析物与所述结合的分析物的相对定位；(iii)调整所述未结合的分析物与所述结合的分析物的信号分辨率；(iv)调整所述未结合的分析物与所述结合的分析物的信号强度；及/或(v)调整在所述流体内一特定位置处的所述未结合的分析物与所述结合的分析物的浓度。例如，这可以通过改变电场分布的形状、其强度或其沿分离通道的位置来实现。例如，这可用于查看不同范围的物体，将一物体沿分离通道移动到一特定的点，或调整可解析的物体的数量。特别地，可以通过改变其时间依赖性及/或其强度来改变电场。本领域技术人员将理解的是，所述物体通常会显示为一荧光图上的峰，并且可以为每种分析物及试剂单独或组合识别不同的峰。当物体浓缩在一特定位置时，峰的高度将增加，而当物体远离一特定位置时，峰的高度将降低。
在一实施方式中，本发明的方法可以进一步包括以下步骤：在分析物及试剂已经定位之后，从分离通道中提取一目标样品。如本领域技术人员可理解的，提取可以通过调整电场使得样品移动到一出口，或者可以通过从分离通道中的适当位置直接物理地提升。
有利地，本发明的方法还可包括以下步骤：振荡电场，使得分析物及/或所述试剂的运动方向反转，因而所述分析物及/或所述试剂沿所述分离通道来回运动。这允许对每个物体成像或以其他方式重复检测，因此可以提高装置对低浓度组分的灵敏度。这也可以通过使物体绕一闭环的分离通道在回路中移动来实现。实际上，这可以用于聚焦于特定的分析物及试剂，从而将分析物导向特定的分析物。因此，可以在初始电泳期间或之后改变电场分布，以修改所识别的信号并查看感兴趣的不同分析物。这种灵活且强大的方法是任何其他形式的用于检测样品中的分析物的电泳分析所无法实现的。在示例中参考特定示例描述了这种选择性集合浓缩效果。可以根据需要将执行本发明的方法的装置从所有峰被识别的一“监测”模式转移至特定峰被聚焦的一“发现”模式。
因此，在本方法的一实施方式中，分离通道可以是一闭合回路，并且在这种情况下，优选地，被施加的电场环绕所述闭合回路是周期性的。
在本发明的电泳方法的一另一实施方式中，可以通过一电场施加组件施加电场，并且一电界面区域可设置在所述分离通道与所述电场施加组件之间，所述电界面区域经布置成用以将所述电场通过所述电场施加组件在与所述分离通道相隔开的一位置处施加至所述电界面区域。所述电界面区域包括至少一离子导体材料，所述离子导体材料经布置而相邻并接触于所述分离通道，使得通过所述电场施加组件而被施加的所述电场通过所述电界面区域而被平顺化，因而使得在所述分离通道内建立的所述电场分布基本上是连续的。
因此，本实施方式允许通过将从电场施加组件(例如：一电极阵列)获得的离散电场转换成分离通道中的基本连续的电场来平顺被施加的电场。一“离散”电场是具有不连续的电场分布的电场，例如，包括间隙或幅度的突然跳跃或下降，例如，在一“阶梯状”整形的电场中可被观察到。例如，一离散电场可以由多个点电压源产生，每个点电压源沿着分离通道的***与下一个隔开。(例如，在通道的情况下，沿着其路径)。一“基本连续”电场是指比离散电场更平顺的电场。例如，在上面的示例中，优选地，平顺电场的值在一个点电压源的位置与下一个点电压源的位置之间的间隔中从与第一点源建立的值相对应的一值逐渐变化为与第二点源建立的值相对应的一值。更一般地，可以在所施加的离散值之间平顺地内插所述基本连续电场。然而，根据所施加的平顺程度，所述连续电场可能会偏离一定程度的理想线性梯度或曲线，并且仍可能包含一些不连续性(尽管其大小小于离散电场的不连续性)。
通过在分离通道与电场施加组件之间设置具有合适的电及几何特性的一电界面区域来实现电场整形，由此，所述电场施加组件通过所述电界面区域与所述分离通道间隔开。特别地，至少部分地借助于在形成所述电界面区域的一部分(或全部)并布置成与分离通道相邻并接触的的一离子导体材料内的离子电流传输来执行电场平顺。这种布置具有很大的优点，即任何电解都在所述电界面区域内或在电极(或其他电压源)处而不是在所述分离通道中发生。这样，所述分离通道本身内的环境不会受到破坏。
应当注意的是，所述电界面区域不需要沿着所述分离通道的整个周边设置，而是可以仅沿着分离通道的一部分延伸。例如，不需要沿着通道的整个长度设置电界面区域，而是可以仅沿着通道的一部分延伸。
“与分离通道相邻并接触”是指离子导体材料与分离通道直接电接触，而其之间没有任何其他材料类型。电界面区域可以由单个组分(离子导体材料)或在电场施加组件与分离通道之间经串联布置(并彼此电接触)的一个以上组分组成。在一个示例中，如将在下面更详细描述的，电界面区域可以包括与分离通道相邻的一离子导体材料及一非离子导体材料，例如一电阻材料，非离子导体材料为设置在电场施加组件与离子导体材料之间。然而，在其他有利的实施方式中，电界面区域由离子导体材料组成。换句话说，电界面区域完全由离子导体材料形成。例如，直接与分离通道接触的前述(单个)离子导体材料可以在分离通道与电场施加组件之间连续地延伸。替代地，可以在分离通道与电场施加组件之间串联地部署不止一个离子导体组分，或者离子导体组分与非离子导电组分的一混合物，以形成电界面区域。
术语“离子电导的”是指材料通过离子运动来导电。电子或空穴在材料中的移动可能也可能不存在。除了电界面区域的与分离通道接触的部分之外，分离通道还优选地是离子电导的而不是主要电导的。例如，分离通道可以是填充有离子导体例如水性缓冲剂的通道，如将在下面更详细地描述的。
理想的是，构成电界面区域的一种或多种组分的电导率/电阻率(尤其是离子导体材料的电导率/电阻率)应配置为与分离通道的电导率/电阻率“匹配”。通过“匹配”，不要求电界面区域的所述或每个组分应当具有与分离通道相同或至少相似的离子电导率，尽管这是优选的。必需平衡相对电导率/电阻率，以避免电流优先通过电界面区域或分离通道传导。若电界面区域的电导率太高或太低，则可能不会在分离通道中形成所需的场形。这是因为，若流体与离子导体材料的相对电导率明显不同，则根据欧姆定律，所有由被施加的电压产生的电流只能通过电界面区域或仅通过分离通道。这将显着改变电场的平顺效果，从而导致电场的过度平顺或不足。特别地，如果电界面区域的相对电导率太低，则在分离通道中获得的电场可能会被衰减，即看起来比施加在电极上的预期电场低得多，因为功率实际上在电界面区域中损失。
为了实现匹配，形成电界面区域的组分的电阻率/电导率与分离通道的电阻率/电导率不必相同，而实际上这是极其困难的。然而，在优选配置中，电导率/电阻率具有相同数量级。在特别优选的实施方式中，构成电界面区域的(多个)组分的电阻率/电导率与分离通道的电阻率/电导率之比(反之亦然)在1：100与1：1之间，优选在1:50与1∶1之间，更优选在1∶10与1∶1之间。
有利地，与分离通道接触的离子导体材料不渗透气体(例如通过在电极上的电解产生的气体)，从而防止它们到达分离通道。可替代地，几何形状可以布置成引导任何气泡离开分离通道。离子导体材料优选地防止要在分离通道内分离的任何分析物到达电极。例如，材料中的任何孔优选地太小而不能允许物体通过。这有助于将物体保留在分离通道内，并避免样品损失。
在某些优选的示例中，电界面区域具有薄，类似于“膜(membrane)”或“膜(film)”的几何形状，由此其宽度(即：电场施加组件与分离通道之间的距离)至少在垂直于所述距离及分离通道两者的方向上(例如：通道的长轴)大于其厚度。更优选地，分离通道与电场施加组件之间的距离为电界面区域的厚度的至少2倍，更优选为电界面区域的厚度的至少5倍，进一步优选为至少5倍，甚至更优选为至少10倍，最优选至少100倍。
优选的膜状几何形状有效地使多个电极之间获得的电压平均化。这沿分离通道的周边“散布”了每个点电压(在任何其他方向上的电压散布都相对较小)，从而能够使电场施加组件的离散施加电场主要沿分离通道的周边平顺。通过保持材料薄，可以将电压设置为在材料的厚度方向上基本恒定，从而避免在分离通道中建立横向电场。然而，这可替代地通过布置电场施加组件以施加在电界面区域的厚度方向上不变化的离散电场来实现(例如，通过使用在材料的整个厚度上接触材料的电极)。
除了平顺化电场之外，同时，电界面区域使分离通道内的微流体环境与电极保持分离，从而不会破坏分离或操作过程。
优选地，分离通道设置在基板中或基板上，并且电界面区域基本上填充基板中或基板上的空腔。基板本身可以使用选定的微加工技术方便地被制造。
优选地，分离通道的深度在相同方向上近似等于或大于界面区域的厚度。特别地，分离通道的深度优选地比材料的厚度大1至5倍，优选地大1.5至3倍，更优选地大约2倍。发明人已经发现，这样的比例使得能够借助于以流体形式作用在电界面区域材料上的毛细作用力以通道的形式形成分离通道，如下所述。
在优选的实施方式中，施加离散电场的位置与分离通道之间的距离在0.1mm至8mm之间，优选在0.5mm至2.5mm之间。优选地，电界面区域的厚度在0.1μm至100μm之间，优选地在20μm至40μm之间。优选地，分离通道的深度(高度)在0.1μm至500μm之间，优选地在10μm至100μm之间。
在某些情况下，希望在基板上的空腔上设置至少一个柱，以提供支撑并防止基片的顶件的塌陷。如下所述，也可以部署多个柱以改变界面的电性能。此外，多个柱提供了额外的表面积，以帮助将一种或多种材料保持在电介面区域中。
在优选的实施方式中，分离通道可以遵循任何期望的路径。例如，通道可以是直线的，或者可以是闭环的形式。与开环设计，例如直线通道相比，闭环配置具有多个优势。首先，闭环通道避免了边缘效应，由此在通道的任一端在通道内部获得的电场偏离了期望的水平。例如，在线性通道中，通常将在通道中间的一部分呈现沿所述通道的所述部分的任一侧施加的电压源，在所述部分中获得的电压是两个电压的平均值。然而，靠近通道一端的部分不会“看到”两侧上提供的电压源，而仅能“看到”朝向通道另一端的一侧上的电压源。这意味着存在非对称平均，这会在通道末端附近的部分内部的场中引起失真。其次，当将时移电场施加到开环通道时，可能会出现电场变化很小且电流方向基本保持不变的区域。这会导致电界面区域中包含的离子导体材料中严重的局部离子耗竭。结果，由于离子耗尽的影响趋向于抵消所施加的电场，因此失去了通道中期望的场形状。相反，在诸如圆形布置的闭环通道中，可以将传播的电“波”(即：整形的、非均匀的电场分布)配置为绕环行进。循环周围的离子导体材料中的“(扫掠sweeps)”离子，不断补充任何离子剥蚀的区域，并从浓缩区域带走相应的离子，从而使通道中的电场保持平稳。第三，当使用开环通道时，装置的有效操作长度由信道的物理长度决定。在闭环***中，主通道没有起点或终点，因此装置的操作长度基本上是无限的。
优选地，电场施加组件包括与电界面区域电接触的多个电极，并且电场施加组件还包括适于向每个电极施加电压以获得期望的电场分布的一控制器。
多个电极优选地沿着与分离通道的***一致的方向彼此间隔开。例如，优选的是，多个电极沿着与通道的路径一致的方向间隔开。
在优选的实施方式中，多个电极沿着分离通道的一侧布置。有利地，电场施加组件还可以包括一第二多个电极，所述第二多个电极沿着分离通道的与第一多个电极相反的侧布置，从而在分离通道的相反的侧上形成多对电极，并且其中可以将电压施加到所述对中的每个电极。在一些优选的实施方式中，基本相同的电压被施加到每一对中的两个电极。然而，在其他情况下，可以将不同的电压施加到所述对中的每一个电极，例如为了抵消由于分离通道的曲率引起的速度差效应(如WO2006/070176中所述)，或为了横向操纵体积内的电场。
装置可以进一步包括一电场测量组件，所述电场测量组件适于测量分离通道中(及/或沿着电介面材料)的电场；并且其中控制器有利地适于基于所测量的电场来改变施加的离散电场。因此，除了施加离散电场的“写入”电极之外，“读取”电极还可用于测量及控制经施加的电场。“读取”电极可以直接接触分离通道，也可以通过一部分电界面区域(可能是也可能不是位于分离通道与电场施加组件之间的电界面区域)测量建立的电场。例如，所述电场测量组件可以优选地包括与电界面区域电接触的多个电极，所述电场测量组件的多个电极优选地布置在分离通道的与电场施加组件相对的一侧。在替代的有利实施方式中，装置可以使用与(多个)写入或读取电极相同的(多个)电极，根据需要在两种模式之间切换。例如，控制器可以适合于以规则的间隔在短时间内停止向每个电极供应电压，并且代替地在恢复电压供应之前瞬时读取局部电场。
可以为基板提供与空腔(以及填充空腔的界面区域)以及基板表面相连接的孔(也称为孔或孔点)，以容纳使用中的电极。所述孔可以填充有离子导体流体，例如水性缓冲液、触变凝胶或粘性凝胶，并且布置成使得电极浸入离子导体流体中。有利地，所述配置为电解的气体产物提供逸出点。此外，为基板提供填充有离子导体的孔允许足够的离子贮存器尺寸，以减轻电界面区域中包含的离子导体材料中的离子消耗。作为上述浸渍电极的替代方案，可以将导电电极(例如：由金属膜形成)沉积在基板上，从而导致装置上的一个或多个连接器与电场控制***集成在一起。这些电极将与界面材料接触，并且可提供排气孔以逸出电解气体。
有利地，在本发明的方法中使用的电场施加组件还包括连接臂，例如布置成将每个电极电连接到电介面区域的流体臂。例如，上述的孔可以通过这样的连接臂连接到填充有电介面区域的腔。在电场施加组件中使用流体臂可提高设计灵活性。例如，可以在基板的一顶片中钻出孔，并且具有便于使用的任何构造，而流体臂充当用于将电压施加到电介面区域的导体。通过仔细设计每个臂的尺寸(以及由此产生的电阻)，可以控制呈现给材料的电压水平。每个连接臂优选将单个电极连接到电介面区域。
基板中的孔可以沿着跟随分离通道的***的单条线周期性地间隔开。然而，这不是必须的，且每个孔可以位于与分隔通道不同的距离处。在一示例中，孔可相对于分离通道的周边交错，以便最大化可沿分离通道的周边设置的孔的数量。可以通过设计孔与材料之间的电场施加组件的流体臂的设计来取消孔的不同位置(以及因此所使用的电极)。然而，在其他示例中，在建立沿分离通道的***产生电场所需的电压变化可以改变距离。
如果分离通道为开环形式(例如，具有至少两个不同的“末端”的通道，无论是否物理定义)，则电场施加组件可以配置为抵消场边缘效应。例如，在线性通道的情况下，可以布置两个额外的电极以在通道的每一端提供额外的电压。优选地，这些电极被***在通道上的孔点中，其中，孔点还可以用作通道的入口及/或出口。
如上所述，电界面区域可以包括一个以上的组分，并且在一个优选的实施方式中，除了离子导体材料之外，还包括非离子导体材料，使得离子导体材料位于非离子导体材料与分离通道之间，并且电场施加组件将离散电场施加到非离子导体材料上。例如，可以将非离子导体材料放置在离子导体材料与电极之间。非离子导体材料主要通过电子(及/或空穴)运动来导电，并且可以是例如电阻性聚合物或诸如硅的半导体。
在这样的实施方式中，优选地，非离子导体材料的电导率/电阻率与离子导体材料的电导率/电阻率匹配。如上文关于分离通道与电界面区域的相对电导率/电阻率所述，在本文中，术语“匹配”并不意味着电导率/电阻率必须相等，尽管优选地它们至少相似。通过“匹配”电界面区域的两个(或多个)组分的电导率/电阻率，电导率/电阻率以及经施加的电场参数皆被考虑在内，从而使得非离子导体材料及离子导体材料皆有助于离散电场的平顺。另一方面，如果两种材料的相对电导率明显不同，则根据欧姆定律，所有由施加电压产生的电流仅能通过离子导体材料或仅能通过非离子导体材料。这将显着改变场的平顺效果，导致电场的过度平顺或欠缺平顺以及可能的场屏蔽效果。因此，在优选的配置中，组分的电导率/电阻率具有相同数量级。在特别优选的实施方式中，两种材料的电阻率/电导率之比在1：100与1：1之间，优选在1:50与1：1之间，更优选在1:10与1：1之间。
相同的考虑适用于包括两个或更多个串联的离子导体组分，或离子与非离子导体组分的一混合物的电界面区域，在这种情况下，每个组分的电导率/电阻率优选地“匹配”。
包括非离子导体材料作为电界面区域的一部分的配置提供了多个优点。特别是，它们在与电场施加组件的连接中提供了灵活性。例如，电极可以连接到“干燥的”固体材料(例如：硅)，而不是如上所述浸入流体填充的孔中。这可以产生更紧密及密封的装置。另一方面，这种配置的缺点是离子导体材料(通常包含流体)及“干燥”非离子导体材料的组合需要流体/固体界面，这往往会引起电解及析出气泡。因此，这样的构造可能需要位于界面处的孔(pore)或孔(well)以充当气泡的排气。
离子导体材料可以包括例如聚合物。有利地，聚合物可以容易地以液体形式引入根据本发明的一装置中，然后例如使用化学引发剂或通过热或光引发原位聚合。
优选地，离子导体材料是多孔材料。“多孔”材料是指流体可以流过的材料，例如通过材料的孔、通道或空腔。泡沫、海绵或任何其他类型的基质状或多孔材料是多孔材料的例子。例如，离子导体的多孔材料可以包括多孔玻璃或多孔陶瓷材料。
可选的，离子导体材料可以是水凝胶。水凝胶是一类能够吸收水溶液但不溶于水的聚合材料。水凝胶具有许多属性，这使其非常适合用于目前公开的场整形界面。特别地，它们是多孔的，通常具有在低纳米范围内的孔径，这意味着它们可渗透水分子及小离子，但不能渗透到包括生物分子，例如蛋白质或DNA的大分析物。此外，水凝胶通常不渗透气泡，从而防止了在电极处由电解形成的气体到达分离通道。
在优选的实施方式中，电界面区域的电阻率在其整个体积上是恒定的。电界面区域的电均匀性通常是期望的，以便实现各向同性场平顺效果。可替代地，在其他实施方式中，电阻率可以在至少一个方向上变化，例如，在垂直于分离通道的***的方向或通道的伸长方向上变化。例如，这可以使得能够在使用单个电场施加组件的同时，将不同幅度的场施加至多个同心圆形通道，每个同心圆形通道由一部分电场界面区域隔开。
可以通过在一个或多个方向上改变区域材料的成分来实现电界面区域的电阻率的改变，例如通过使用多个具有不同电特性的电界面组分。然而，这种改变在实践中可能是困难的。或者，通过在空腔中引入多个柱并在一个或多个方向上改变其尺寸或密度，可以更容易地改变电阻率。这具有去除导电材料的效果，并因此增加了电界面区域的电阻率(或若柱的密度下降，则降低它)。用于改变电界面区域的电阻率的另一示例方法是改变空腔的深度。
电界面区域的电导率及相对厚度优选为使得电流不过大，以避免在施加电极的区域处的产生焦耳热及过度电解。
在优选的实施方式中，基板是电阻性或绝缘性的。可期望基板对以下任何一种或多种为透明：可见、红外、或紫外线辐射，以允许通过基板对电子界面区域材料进行光图案化及光聚合，或者使装置适用于光学检测技术。然而，在其他情况下，基板不必是光学透明的。
有利地，与本发明一起使用的一装置可以允许在分离通道中同时进行分析。例如，容积可包括多个通道，每个通道通过电介面区域的一区域与下一个横向间隔开，其中，电场施加组件被配置成将离散电场施加至电介面材料的一部分，从而通过电介面区域使离散电场平顺，使得在多个通道的每一个中建立基本连续的电场。在优选的配置中，在每个通道中建立的基本连续的电场基本是相同的，尽管如上所述，这不是必需的。作为替代，多个通道可以在分离通道内一个接一个地堆迭，每个层包含由绝缘体的层隔开的一通道，并且电界面材料与每个通道层的一侧或两侧接触。在另一示例中，界面材料层与分离通道(通道)层可以彼此堆迭，并被绝缘层隔开。用于将样品引入分离通道内的分离通道的入口通道可以嵌入绝缘层中。
在所有实施方式中，用于施加电场的装置可包括任何已知的场整形装置，例如沿通道的一可变电阻。然而，优选地，用于施加电场的装置包括沿着分离通道间隔开的多个电极。这样的技术可以对电场进行精确而复杂的整形，并且可以通过分别改变施加至每个电极的电压来方便地进行控制。优选地，电极与分离通道的内部间隔开，使得电流不在电极与流体之间传导。这避免了电流流过流体，从而避免了过多的焦耳加热，其可能导致***不稳定。方便地，电极包括打印在分离通道上或邻近分离通道的导电油墨。
有利地，多个电极中的至少一些电极通过一层电阻材料与分离通道的内部间隔开。以这种方式，在通道内建立的电场更平顺，电极的局部效应所引起的失真也较小。电阻材料优选地是半导体或掺杂的半导体，最优选地是掺杂的硅。
优选地，分离通道是毛细管。这样的尺寸可以在整个通道横截面上精确控制电场，即使是低浓度的样品，也可以产生清晰的点或峰。在一优选实施方式中，分离通道是直线的。替代地，分离通道可以是闭环的形式。这可以是基本上圆形的，或者优选地具有线性部分。
方便地，分离通道被刻在诸如玻璃板的基板中。这提供了以非常小的规模实现用于执行本发明的装置的便利方式。优选地，装置是一微流体装置。
有利地，在本发明的方法中使用的装置包括多个分离通道，每个分离通道设置有用于施加电场的装置及一控制器。可以根据要在每个通道中分离的物体分别选择施加至每个分离通道的电场。然而，优选地，施加至每个分离通道的电场是相同的。方便地，施加至每个分离通道的电场由相同的控制器控制。
可设想到的是，可以执行本发明的方法，以便根据已知的特定分析物的已知参数快速识别它们。这可以通过配置在其上执行方法的装置来实现，以适当地根据其经预测的大小及其他特性，优先分离出一种或多种目标分析物。当筛选多种分析物时，如本领域技术人员所理解的，装置将被适当地配置。因此，在本方法中，可在一预设的迁移窗口上施加电场。所述预设的迁移窗口包括一特定的电场，所述电场将靶向目标分析物/(多个)结合剂，从而使其与样品中的其他成分分离并浓缩。如上所述，可以在开始电泳时立即或在分离之后在一特定分析物/结合剂上/处进行靶向/聚焦/选择性集合浓缩。因此，来自分析物的信号可以***纵以靶向不同的实体。
方法可以在包括分离通道的一装置上执行，并且其中分离通道设置有至少一个出口，用于从分离通道提取材料。因此，可设想到的是，可以将提取的材料提取至一样品收集孔中。可选地或附加地，可根据需要将提取的材料提取到丢弃孔中。
在本发明的任何方法的一另一实施方式中，分离通道还包括一pH梯度。在所述实施方式中，由于所述pH梯度，在所述结合的分析物以及所述未结合的分析物的等电特性的进一步影响下，所述结合的分析物以及所述未结合的分析物在流体中彼此隔开的位置处浓缩。这是等电聚焦技术的发展，所述技术是通过等电点的差异分离不同分子的技术。这是一种带状电泳，通常对凝胶中的蛋白质进行，这利用了以下事实：目标分子上的总电荷是其周围环境的pH值的函数。在所述实施方式中，通常将两性溶液加入固定pH梯度(immobilizedpH gradient,IPG)凝胶中。IPGs是与pH梯度共聚的丙烯酰胺凝胶基质，除了最碱性(>12)的pH值外，它产生完全稳定的梯度。固定pH梯度是通过Immobiline的比率的连续变化获得的。Immobiline是由其pK值定义的弱酸或弱碱。pH值低于其等电点的蛋白质将带正电，因此会向阴极(带负电的电极)迁移。然而，当它通过增加pH的梯度迁移时，蛋白质的总电荷会减少，直到蛋白质到达与其pI相对应的pH区域为止。此时，它没有净电荷，因此迁移停止(因为对任一电极都没有电吸引)。结果，蛋白质变得聚焦在清晰的固定带中，每种蛋白质都位于pH梯度中与其pI相对应的位置。这样的技术具有极高的分辨率，多个蛋白质通过单个电荷被分成不同的带而被区分。因此，这样的技术可以与本发明的方法结合以进一步改善目标蛋白质的聚焦。
本发明提供了包括本文所述方法的诊断或鉴识。因此，本发明可用于鉴定样品中的(多个)分析物/(多个)生物标记，其中所述分析物/所述生物标记与特定疾病状况相关。所述方法的小型化及高通量潜力使得可以建立高度复杂的诊断测试，以监测多种分析物/生物标记的水平。此外，在法医研究中，本发明可用于识别分析物，所述分析物可用于识别个体或有关材料来源等的信息。
附图说明
为了可以更清楚地理解本发明，现在将参考附图以示例的方式描述本发明的实施方式。
图1：如式2中描述的电场影响下四个分子的时空轨迹。分子a及b相同，分子c及d相同。但是a与c不同(在质量、电荷及摩擦系数方面)。
图2：CycloELISA通过“芯片上”抗体(标记有Alexa-488)+抗原复合物形成检测转录因子Stat5。曲线1是抗STAT5(标记有Alexa-488)+STAT5。曲线4是单独的Stat5抗原(仅Ag)。曲线2是单独的抗STAT5抗体(仅标记有Alexa-488的Ab)。曲线3是抗cJUN(标记有Alexa-488)+STAT5。运行条件为：中性pH、Stat5@10ng/μL、Ab为300pg/μL。所有线以相同的比例绘制。
图3：在本发明的方法中信号在背景上的浓缩。
图4：随着时间同时浓缩及分离信号。
图5：在针对不同分析物的不同抗体上使用具有不同光学特性的不同标签进行分离。
图6：于结合之前及之后随时间变化的在X点的一抗体的瞬态分析。
图7：抗体/抗原复合物的选择性集合浓缩。在图的左侧，Emax＝400V/cm，Emin＝0V/cm。电场以100μm/s的速度传播。选择性集合浓度显示在图的右侧，其中使用软件将Emin更改为320V/cm。电场速度保持恒定，并且电场在320-400V/cm之间变化。图表上的峰分别代表抗原结合抗体集合体(Ab+Antigen)，然后分别代表同一抗体的二聚体(Ab2)及单体(Ab1)。
图8：使用不同运行参数的本发明的进一步示范运行：4％线性聚丙烯酰胺筛分基质及0.04cm/s的电场速度(其他条件相同)。虚线曲线仅为Ab，而连续曲线为Ab+STAT5。如我们所见，STAT5峰又与仅Ab运行明显区分开。在这种配置中，在大约120秒内观察到STAT5峰。
具体实施方式
实施例1：使用本发明的电泳方法检测转录因子Stat5。
本文使用申请人开发的并称为CycloChipTM的装置来举例说明本发明。CycloChipTM是一种一次性塑料芯片，包括一个分离通道及多个此处所述的电极。进行一示例性免疫测定，术语CycloELISA用来表示所述芯片的用途与最初设计的目的不同。因此，有效地利用抗体以完全不同的方式使用抗体检测分析物的免疫测定法(如ELISA)。
使用CycloChipTM(如上所述)后，一旦将分析物引入通道，便会在通道中施加时空中的一非均匀电场。所述电场本质上是一个移动波前，它以速度k移动通过分离通道。像电泳一样，分析物分子根据其迁移率在可变电场的影响下开始在通道中迁移。然而，他们现在看到一个可变的电场。
描述的电场是多项式形式：
E(x,t)＝Pn(x-kt) (1)
其中x是通道内的纵向空间位移，t是时间，k是实常数，我们称为“场参数”。为简单起见，让我们现在假设n＝1的最简单形式(1)：
E(x,t)＝α(x-kt+c) (2)
其中a及c是实常数。电荷q分子上的力就是qE。在相同分析物分子上的摩擦系数为f的摩擦力为：
Ff(x,t)＝fv(x,t),f＞0 (3)
实际上，x是时间x＝x(t)的函数，因此v(x，t)＝v(t)。从(2)及(3)我们可以形成以下微分方程：
mv”(t)+fv'(t)-qav(t)+qak=0 (4)
具有以下解：
其中A及B是f、q、a、m的函数。事实证明，在式(5)中对于较大的t(当分析物分子达到一终端速度时)，指数消失，每个分析物分子的位置仅是常数+kt。所述常数取决于分析物分子的特性及场参数，因此所有相同的分析物分子将以速度k共同迁移。但是，不同的分析物分子将在不同的位置迁移(因为常数不同)，但迁移速度仍然相同。这意味着以上***将分离分子。此外，“逃跑”分子在某个时刻碰巧离开了它们的群，将经历一趋向于将其推向所述群的净力。因此，带是连贯的。图1展示了两对分析物分子的解(5)。在每一对中，分析物分子是相同的，但是在所述两对之间，分析物分子是不同的。可以看出，相同的分析物分子从不同的位置开始并会聚到相同的时空路径。但是所述两对分析物分子的路径是不同的，并且彼此平行。这意味着发生了分离，并且从不同位置开始的相同分析物分子倾向于以最终共迁移的方式移动。
在本实施例中，CycloELISA装有含有转录因子Stat5的样品。向其中添加了特异性识别Stat5的抗体，其中所述抗体被Alexa-488标记(可商购的荧光标记)。在流体介质中形成了Stat5与Alexa-488标记的抗体的复合物，并施加了本文所述的电场。
在图2中提供测试的结果，所述图显示了从芯片读取的荧光。曲线1是抗STAT5(标记有Alexa-488的抗体)+STAT5，正如所预期的那样，它是在第4000帧(＝400秒或6.5分)处最大尺寸处的最强信号，对应于稳定的抗原/抗体(Ab+Ag)复合物。这表明抗原/抗体复合物在整个电泳过程中保持完整。图2中的曲线4说明了单独的Stat5抗原(仅Ag)，所述抗原不应发荧光。曲线2是单独的抗STAT5抗体(仅Ab，标记有Alexa-488)，其显示二个信号，分别对应于较低分子量的IgG单体及二聚体。图2中的曲线3是抗cJUN(标记有Alexa-488)+STAT5，显示了在黑色曲线中看到的Ab+Ag相互作用的特异性及明显的质量偏移。这里使用的抗STAT5及抗cJUN IgG是相同的同种型。图2中测定的运行条件为中性pH、Stat5@10ng/μL、Ab为300pg/μL。所有线以相同的比例绘制。
因此，如图2所示，本发明提供了一种强大的方法，可通过直接可视化样品与结合剂的相互作用来快速鉴定样品中的分析物，而无需执行通常与当前方法如ELISA相关的费时费力的过程。
本发明允许将信号与背景快速分离以及将介质中的信号浓缩，这在ELISA中是不可能的。
实施例2：使用本发明的方法对分析物进行说明性的可视化。
图3(情况1)说明使用本发明的方法将信号随时间浓缩在背景上时可以预期的荧光信号种类。在这种情况下，在Emax与Emin之间使用狭窄的电场窗口来聚焦于特定的分析物。自左向右移动，图3显示了来自抗体/抗原复合物(分析物2)的信号在特定点提供了一个峰，而仅抗体(分析物1)没有浓缩在所述窗口中。下方的图表是信号的总和。因此，当与荧光标记的抗体结合时，在背景上获得了强信号。如图6所示，通过测量荧光幅度随时间的瞬态变化，这也可以用于提供更多的定性及定量信息。
图4(情况2)说明当使用本发明的方法随着时间在背景上同时浓缩及分离来自结合的及未结合的抗体中阳性信号时，可以预期的荧光信号种类。在这种情况下，将在Emax与Emin之间使用扩展的电场窗口，以检测结合及未结合的抗体(因为它们的大小不同)。自左向右移动，图4显示了来自抗体/抗原复合物(分析物2)的信号在特定点提供峰，而单独的抗体(分析物1)由于电场窗口更宽，在不同位置提供了峰。下方的图表是信号的总和。因此，当与荧光标记的抗体结合时，在背景上获得了强而有力的信号，这与单独的抗体信号是可分离的。
图5(情况2)是说明当使用本发明的方法随时间在背景上同时浓缩及分离来自使用不同荧光标记物标记的两种不同抗体的阳性信号时，可以预期的荧光信号种类。这种情况还使用了Emax与Emin之间的扩展电场窗口来检测两种抗体(因为它们的大小不同)。自左向右移动，图5显示了来自与第一分析物(分析物1)结合的第一抗体的信号，所述信号在特定点提供峰，而由于电场窗口较宽，因此与第二分析物(分析物2)结合的第二抗体会在不同的位置提供峰。下方的图表是信号的总和。这种同时分析可以扩展到许多不同抗体的倍数，以提供一种非常强大的技术来快速、并行地分析多种分析物。抗体可以在同一通道中运行，并通过使用不同的检测过滤器进行区分。这可以通过测量大量标签来实现自动化。
图6说明了特定分析物在单个点上随时间的瞬态分析。最初，检测到未结合的抗体，所述抗体迁移离开预期的抗体/抗原复合物的预设迁移窗口。因此，在所述点的信号下降。然后，当抗体结合分析物时，抗体迁移回携带分析物的预设窗口，因此浓度增加，直到因为所有可用的复合物都迁移到同一点达到最大值。取决于所使用的分析物及抗体，不同类型的瞬态分析是可能的。可以使用不同形状的图来提供有关各种分析物的局部浓缩及/或分析物之间相互作用的信息。
实施例3：选择性集合浓缩
在常规电泳中，如果用户仅对部分样品感兴趣，则仍需要进行整个分离。对于二维电泳，这意味着需要运行一周。相反，利用本发明，可以将电场特性及场参数k设置为实现预设迁移窗口的分离的值。例如，这允许直接进行特定的生物标记分离，而无需在迁移窗口之外分离任何分子。这是有效的聚焦动作，即选择性的集合浓缩。运行目标迁移窗口的功能允许应用特定的产品。
图7提供了一结合测定中选择性集合浓缩的说明。图7的左侧部分显示了一典型的电场配置(简单的线性场)，其中Emax＝400V/cm及Emin＝0V/cm。所述电场以100μm/s的一速度V传播。每个峰的中间E值在图表上显示为380、300及200V/cm。图表上的多个峰分别代表抗原结合抗体(Ab)集合体(抗体+抗原)，然后同一抗体的二聚体(Ab2)及单体(Ab1)。这三组分子的平衡场位置分别在380、300及200V/cm(在所述场速下)。这导致这些分子聚焦/集中在那些场点，因此也相应地在介质中分离。
图7的右侧部分显示了抗体/抗原复合物的选择性集合浓缩的结果。使用控制CycloChip的软件，电场的Emin被更改为320V/cm。这是非常快的。现在，新的电场比之前平坦得多，但是电场的速度保持不变(请参见右图)。由于电场现在于320至400V/cm之间变化，抗体/抗原复合物的平衡位置仍在所述电场范围内。因此，所述电场仍然围绕着相同的电场点，所述电场点现在在空间上向右移动(这意味着与电场边缘成相对比例，因为点E＝380V/cm实际上以v＝100微米/秒的速度移动)。然而，其他两个峰(单体及二聚体)的平衡点现在不在范围内，因此它们的平衡位置自视野中消失。其他峰将试图找到这样的位置，但将永远无法满足平衡条件，因此这些分子将无法正确聚焦。这将有效地形成一些团块，并仅导致低背景信号。这仅留下具有与新的电场配置兼容的功能的峰以聚焦及浓缩(抗体/抗原复合物)。在这个例子中，这只是一个峰，即抗体/抗原复合物，但是一个峰可以根据需要聚焦在任意数量的峰上及之外。
可扩展所述选择性集合浓缩窗口，以在一“发现模式”下包含所有抗体及抗原，或在“监测”模式下包含这些峰的任何子群组。也可以实时改变电场参数以改变所述选择性集合浓缩位置及窗宽。可以这样做以简单地聚焦在一个峰附近，即一特定的抗体/抗原复合物，或不仅仅是一个峰。在图2中，给出的结果是一包含所有峰的相当宽的窗口。
选择性集合浓缩作用可以用作一选择或纯化作用，以使某些分析物优于其他分析物。根据某些实施方式，这对于从样品中提取分析物特别有用。
在其他策略中，选择性集合浓缩可简单地用于使所需的多个分析物彼此更好地相互分离并远离。这对于分离，例如，异构物或其他互为变体的分子以研究例如糖基化特别有用。
因此，通过选择性集合浓缩的使用，通过电泳进行的初始分离成为一种非常强大的工具，用于查询电泳介质中一样品的内容，而无需随后的提取及处理步骤。
实施例4：本发明的进一步证明
进一步的实验运行被进行以进一步证明本发明的能力。图8说明了使用不同的运行参数，以4％线性聚丙烯酰胺作为筛分基质(电泳介质)以及0.04cm/s的电场速度(其他条件相同)以如图2所示的抗体检测STAT5在不同日期运行的几种配置的结果。虚线曲线仅为Ab，而连续曲线为Ab+STAT5。如图8所示，STAT5的峰又与仅Ab运行明显区分开。在这种配置中，STAT5的峰在大约120秒内被观察到。这表明本发明能够在不到2分钟的时间内检测抗原。这种惊人的速度说明了如上所述的本发明的实用性。

Claims (41)

1.一种用于检测一样品中一分析物的电泳方法，其特征在于，所述电泳方法包含：
提供所述样品以及与所述分析物特异性结合的一试剂，所述样品与所述试剂在一分离通道中的一流体介质中相结合；
沿着所述分离通道，在靶向感兴趣的所述分析物和所述试剂的预设的迁移窗口上施加一电场，所述电场具有一电场分布，从而引起结合的及未结合的分析物及/或试剂相对于所述流体移动；
改变在所述预设的迁移窗口内的被施加的所述电场，以相对于所述分离通道调整所述电场分布，从而使得所述结合的分析物及所述未结合的分析物在由于所述电场产生的一电力以及由于所述流体产生的一流体动力的结合影响下在所述流体中彼此隔开的位置处浓缩；
其中通过所述分析物与一结合剂共定位来检测所述分析物；以及
在所述预设的迁移窗口内调整所述电场，以便选择性地浓缩并集合特定选定的组件，其中所述特定选定的组件是结合的或未结合的分析物及/或试剂，并且所述结合的或未结合的分析物及/或试剂与所述样品中的其它成分隔开浓缩。
2.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述流体介质是所述样品。
3.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：在接触所述流体介质之前将所述样品结合于所述试剂。
4.根据权利要求1或3所述的电泳方法，其特征在于：将所述样品添加至预装有所述流体介质及所述结合剂的所述分离通道中。
5.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：随着时间连续地或在多个定义的时间间隔来监测在一位置处的所述分析物的浓度的变化。
6.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述分析物包括一生物细胞或一生物分子。
7.根据权利要求6所述的电泳方法，其特征在于：所述生物分子为蛋白质或核酸。
8.根据权利要求6所述的电泳方法，其特征在于：所述生物分子为生物聚合物。
9.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述试剂包括一抗体或其抗原结合片段。
10.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述试剂使用一可检测部分加以标记。
11.根据权利要求10所述的电泳方法，其特征在于：所述可检测部分是一荧光分子、一酶、一放射性标记、一DNA探针或一电化学发光标签。
12.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述样品是生物流体的一样品。
13.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述电场相对于所述分离通道沿着所述电场分布的至少一部分而变化，及/或其中所述电场分布的至少一部分具有一非零的梯度。
14.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述电场以所述电场分布相对于所述分离通道移动的方式而变化，并且所述电场分布在所述电场分布相对于所述分离通道移动时仍保持不变。
15.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述电场以所述电场分布沿着所述分离通道平移的方式而变化。
16.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述流体与所述分离通道相对于彼此基本上是固定不动的。
17.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述电场的至少一部分相对于沿着所述通道的距离是没有变化的。
18.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述电泳方法还包含改变电场的步骤，用以：(i)调整所述未结合的分析物与所述结合的分析物之间的间隔；(ii)调整所述未结合的分析物与所述结合的分析物的相对定位；(iii)调整所述未结合的分析物与所述结合的分析物的信号分辨率；(iv)调整所述未结合的分析物与所述结合的分析物的信号强度；及/或
(v)调整在所述流体内一特定位置处的所述未结合的分析物与所述结合的分析物的浓度。
19.根据权利要求18所述的电泳方法，其特征在于：通过改变所述电场的时间依赖性及/或强度来改变所述电场。
20.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述电泳方法还包含以下步骤：在所述分析物及所述试剂已经定位之后，从所述分离通道中提取一目标样品。
21.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于，所述电泳方法还包含以下步骤：振荡所述电场，使得所述分析物及/或所述试剂的运动方向反转，因而所述分析物及/或所述试剂沿所述分离通道来回运动。
22.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述分离通道是一闭合回路，并且被施加的电场环绕所述闭合回路是周期性的。
23.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：通过一电场施加组件以施加所述电场，并且一电界面区域设置在所述分离通道与所述电场施加组件之间，所述电界面区域经布置成用以将所述电场通过所述电场施加组件在与所述分离通道相隔开的一位置处施加至所述电界面区域；
其中所述电界面区域包括至少一离子导体材料，所述离子导体材料经布置而相邻并接触于所述分离通道；
使得通过所述电场施加组件而被施加的所述电场通过所述电界面区域而被平顺化，因而使得在所述分离通道内建立的所述电场分布基本上是连续的。
24.根据权利要求23所述的电泳方法，其特征在于：所述电场施加组件包括与所述电界面区域电接触的多个电极。
25.根据权利要求23所述的电泳方法，其特征在于：所述电界面区域由所述离子导体材料构成；或者其中所述电界面区域包括所述离子导体材料及一非离子导体材料，使得所述离子导体材料位于所述非离子导体材料与所述分离通道之间，并且所述电场通过所述电场施加组件被施加至所述非离子导体材料，并且所述非离子导体材料的电导率与所述离子导体材料的电导率相匹配，使得所述非离子导体材料及所述离子导体材料皆有助于所述电场的平顺。
26.根据权利要求23所述的电泳方法，其特征在于：所述离子导体材料是电绝缘的。
27.根据权利要求23所述的电泳方法，其特征在于：所述离子导体材料是一聚合物。
28.根据权利要求23所述的电泳方法，其特征在于：所述离子导体材料是一多孔材料，使得流体可以通过所述材料。
29.根据权利要求28所述的电泳方法，其特征在于：所述离子导体材料是一水凝胶、一多孔玻璃或一多孔陶瓷材料。
30.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：通过沿所述分离通道设置的多个电极来施加所述电场。
31.根据权利要求30所述的电泳方法，其特征在于：所述多个电极中的至少一些电极通过一层电阻材料与所述分离通道的内部相隔开，并且所述电阻材料是一半导体。
32.根据权利要求31所述的电泳方法，其特征在于：所述半导体是掺杂的半导体。
33.根据权利要求31所述的电泳方法，其特征在于：所述半导体是掺杂硅。
34.根据权利要求30所述的电泳方法，其特征在于：所述多个电极与所述分离通道的内部相隔开，使得电流不被传导在所述电极与所述流体之间。
35.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：将所述电场施加于一预设的迁移窗口上。
36.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述电泳方法被执行在包括多个所述分离通道的一装置上，每个分离通道设置有一用于施加电场的装置及一控制器。
37.根据权利要求36所述的电泳方法，其特征在于：被施加至每个分离通道的所述电场是相同的。
38.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于：所述电泳方法被执行在包括有所述分离通道的一装置上，并且其中所述分离通道设置有至少一个出口以提取来自所述分离通道的物质。
39.根据权利要求38所述的电泳方法，其特征在于：将所述提取的物质提取至一样品收集孔中。
40.根据权利要求38所述的电泳方法，其特征在于：将所述提取的物质提取至一丢弃孔中。
41.根据权利要求1的电泳方法，其特征在于：所述分离通道还包括一pH梯度，并且其中由于所述pH梯度，在所述结合的分析物以及所述未结合的分析物的等电特性的进一步影响下，所述结合的分析物以及所述未结合的分析物在所述流体中彼此隔开的位置处浓缩。
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