KR101772934B1 - 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩타이드가 결합된 코직산 유도체의 피부 미백 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 코직산에 펩타이드를 도입하여 제조한 코직산 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물, 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 봉입한 나노리포좀 제조방법 및 이를 통해 제조된 나노리포좀에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펩타이드가 결합된 코직산 유도체는 피부자극이 적으면서도 우수한 타이로시네이즈 저해 활성 및 멜라닌 생성 억제 활성을 가지고 있는바, 본 발명의 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 유효성분을 포함하는 조성물은 피부 미백을 위한 기능성 소재로서 의약품 및 화장품 산업에 유용하게 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 나노리포좀 제조방법은 미백 활성성분인 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 나노리포좀 내부에 안정적으로 봉입시켜 장시간 기간 경과에도 우수한 회수율을 갖는바, 이러한 방법으로 제조된 코직산 유도체 봉입 나노리포좀은 제형 안정성을 통해 시간 경과에 따른 미백 활성성분(펩타이드가 결합된 코직산 유도체)의 침전형성, 변색, 변취 등의 문제점을 개선할 수 있다.

Description

펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물{Composition for skin whitening comprising peptide coupled kojic acid derivatives}

본 발명은 펩타이드가 결합된 코직산 유도체의 피부 미백 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 코직산에 펩타이드를 도입하여 제조한 코직산 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물, 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 봉입한 나노리포좀 제조방법 및 이를 통해 제조된 나노리포좀에 관한 것이다.

피부는 외부 환경과 직접 접하면서 인체를 보호하며 생화학적 및 물리적인 기능을 가지고 있는 아주 중요한 조직이다. 이 조직은 크게 3가지, 즉, 표피, 진피 그리고 피하조직으로 나누어진다. 사람의 피부색은 혈액내의 적혈구, 카로틴 및 멜라닌에 의해서 복합적으로 결정되나 인종간의 피부색 차이나 기미, 주근깨등의 과색소증은 멜라닌에 의한 영향이 크다. 피부의 외각인 표피층에 존재하는 멜라닌은, 아미노산의 일종인 타이로신에 타이로시네이즈라는 효소가 작용하여 도파, 도파퀴논으로 바뀐후 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어지는 것으로, 자외선을 차단하는 역할을 하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 유용한 역할을 한다. 그러나 내·외적 스트레스 자극에 의해 생겨난 멜라닌은 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통하여 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다.

또한, 생체내에서 티로시나아제(Tyrosinase)등의 효소를 촉매로 하는 중합화 산화과정을 통해 피부에서의 자유라디칼(free-radical)생성이 많아지거나, 염증반응이 있거나 또는 자외선 등을 받게 되면 멜라닌 생성이 증가하게 된다. 특히, 자외선은 멜라닌 생성을 증가시켜 부분적으로 증가된 멜라닌이 기미 등으로 발전하며, 미관상 원하지 않는 결과가 생길 수도 있을 뿐 아니라 심하게는 피부암 등을 유발하여 생명에 위험을 줄 수도 있다.

이러한 이유로, 멜라닌 생성을 억제하기 위해, 생성 억제제로써 하이드로퀴논(Hydroquinone), 코직산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin), 글루타치온(Glutathione), 비타민 C (Ascorbic acid)등이 화장품의 원료로 사용되고 있으나, 미백 효과가 미미하거나, 원료 자체가 불안정하며, 세포독성으로 인한 피부자극이 심하여 그 이용이 매우 제한적인 문제점이 있다.

특히, 코직산(Kojic acid)은 티로시나아제의 활성 자리에 있는 구리를 킬레이트화(chelating)하여 티로시나아제의 활성을 억제하는 작용을 통해 미백 효과를 갖는 것으로 널리 알려져 있는 미백제 중 하나이다. 그러나 코직산은 빛과 열, 그리고 pH에 대한 안정성이 좋지 아니하여 화장품 원료로 배합이 어렵다는 단점이 있으며, 또한 세포독성에 따른 피부 자극의 문제점도 가지고 있다.

이에 본 발명자는 전술한 코직산의 단점을 극복하기 위하여, 코직산에 특정 펩타이드를 도입함으로써 미백 활성과 더불어 생체친화성 및 안전성을 높일 수 있는 코직산 유도체를 발굴함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2012-0119227호 한국공개특허 제10-2004-0037521호

따라서 본 발명의 목적은 우수한 미백 활성과 더불어 고농도에서도 생체 안정성을 통해 인체 자극이 없는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 함유하는 나노리포좀 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 제조된 장시간 기간 경과에도 높은 안정성을 보이는 나노리포좀을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 펩타이드가 결합된 코직산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 PS(프롤릴-세린), ECG(글루타밀-시스테이닐-글라이신), KECG(라이실-글루타밀-시스테이닐-글라이신), PKEK(프롤릴-라이실-글루타밀-라이신) 및 CDPGYIGSR(시스테이닐-아스파티딜-프롤릴-글리실-타이로실-이소루실-글리실-세릴-아르기닌)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드가 결합된 코직산 유도체는 하기 표의 화학식으로 표시되는 유도체 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 유도체일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드가 결합된 코직산 유도체는 10μM 내지 100mM의 농도일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드가 결합된 코직산 유도체는 1mM 내지 10mM의 농도에서도 세포독성을 나타내지 않는다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드가 결합된 코직산 유도체는 전체 조성물 중량 대비 0.001 내지 40%로 함유될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드가 결합된 코직산 유도체는 티로시나아제 및 멜라닌 생성 저해 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 외용제 조성물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종의 제형일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약제학적 외용제 조성물은 겔제, 연고제, 크림제, 액제 및 산제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 제형일 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 글리세롤, 카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드, 인지질 및 콜레스테롤을 혼합하는 단계; b) 상기 혼합물에 온도를 가하여 용해시키는 단계; c) 상기 용해물에 펩타이드가 결합된 코직산 유도체 및 물을 첨가하여 용해시키는 단계; 및 d) 상기 c) 단계를 통해 수득한 용액을 고압에서 리포좀화시키는 단계를 포함하는, 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 함유하는 나노리포좀 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계는 글리세롤, 카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드, 인지질 및 콜레스테롤을 50:15:3:2의 중량비로 혼합할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계는 혼합물을 교반하면서 65℃ 내지 75℃까지 가온하여 용해시키는 단계일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 c) 단계에서 펩타이드가 결합된 코직산 유도체는 b) 단계를 통해 제조된 용해물 대비 0.01 내지 10중량부로 첨가될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 d) 단계에서 고압은 800 내지 1200 bar의 조건일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노리포좀은 100 내지 200 nm의 입자 크기를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드가 결합된 코직산 유도체는 상기 표의 화학식으로 표시되는 유도체 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 유도체일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 펩타이드가 결합된 코직산 유도체가 봉입된 나노리포좀을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노리포좀은 장시간의 기간 경과 후 펩타이드가 결합된 코직산 유도체의 회수율이 90 내지 99.9%일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 장시간의 기간은 90일 내지 150일일 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드가 결합된 코직산 유도체는 피부자극이 적으면서도 우수한 타이로시네이즈 저해 활성 및 멜라닌 생성 억제 활성을 가지고 있는바, 본 발명의 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 유효성분을 포함하는 조성물은 피부 미백을 위한 기능성 소재로서 의약품 및 화장품 산업에 유용하게 사용될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 나노리포좀 제조방법은 미백 활성성분인 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 나노리포좀 내부에 안정적으로 봉입시켜 장시간 기간 경과에도 우수한 회수율을 갖는바, 이러한 방법으로 제조된 코직산 유도체 봉입 나노리포좀은 제형 안정성을 통해 시간 경과에 따른 미백 활성성분(펩타이드가 결합된 코직산 유도체)의 침전형성, 변색, 변취 등의 문제점을 개선할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 펩타이드가 결합된 코직산 유도체가 봉입된 나노리포좀의 사이즈를 측정한 증빙자료이다.
도 2는 본 발명에 따른 펩타이드가 결합된 코직산 유도체의 티로시나아제 억제 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 펩타이드가 결합된 코직산 유도체의 멜라닌 합성 억제 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 펩타이드가 결합된 코직산 유도체인 Kojyl-PS가 봉입된 나노리포좀을 실온, 4, 25, 45℃, 그리고, cycle 조건에서 각각 3개월 동안 방치한 후 Kojyl-PS의 회수율을 나타낸 결과이다(4a: 리포좀 제조 직후, 4b: 4℃ 보관, 4c: 25℃ 보관, 4d: 45℃ 보관, 4e: 실온 보관, 4f: 사이클).

본 발명은 펩타이드가 결합된 코직산 유도체의 피부 미백 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 코직산에 펩타이드를 도입하여 제조한 코직산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상기 펩타이드는 2~10개의 천연 또는 비-천연아미노산이 아미드결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 올리고머, 구체적으로, N-말단에 결합된 2~10개, 바람직하게는 2~9개의 천연 또는 비-천연아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드일 수 있다. 바람직하게는, 상기 펩타이드는 다이, 트리, 테트라, 펜타, 헥사, 옥타, 노나, 데카펩타이드이다.

본 발명에서, 상기 '천연아미노산'은 알라닌, 시스테인, 아스파트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 라이신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판 및 티로신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 알파-아미노산을 의미한다.

또한, 상기 '비-천연아미노산'은 핵산 코돈에 의해 암호화되지 않는 아미노산으로, 이의 예에는 알파-아미노산의 D-이성체, 베타-아미노산, 아미노부티르산(Aib), 감마-아미노부티르산(GABA), 노르발린(Nva)등; N-알킬화 아미노산, 예를 들어 N-메틸글리신(MeGly) 등을 들 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 펩타이드는 PS(프롤릴-세린), ECG(글루타밀-시스테이닐-글라이신), KECG(라이실-글루타밀-시스테이닐-글라이신), PKEK(프롤릴-라이실-글루타밀-라이신) 또는 CDPGYIGSR(시스테이닐-아스파티딜-프롤릴-글리실-타이로실-이소루실-글리실-세릴-아르기닌)일 수 있다.

이러한 펩타이드는 생체 내의 단백질을 추출하여 단백질 분해효소로 처리하여 저분자량화하거나, 유전자 재조합과 단백질 발현시스템을 이용하여 제조할 수도 있고, 바람직하게는 펩타이드 합성기 등을 이용한 화학합성 방법 등으로 제조가 가능하다.

본 발명에 따른 상기와 같은 펩타이드가 결합된 코직산 유도체는 ⅰ) 활성화된 코직산을 준비하는 단계; ⅱ) NH2-보호된-펩타이드-레진의 합성하는 단계; 및 ⅲ) 상기 합성된 NH2-보호된 펩타이드-레진을 활성화된 코직산과 반응시켜 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 합성하는 단계를 통해 제조할 수 있다.

상기 ⅰ) 단계에서 활성화된 코직산은 시중에 판매되는 것을 구입하여 사용할 수 있으며, 또는 종래 알려진 합성법을 이용하여 직접 합성할 수도 있다.

본 발명의 하기 실시예 1에서는 활성화된 코직산을 합성하기 위하여 코직산(Kojic acid)를 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran; THF):디메틸포름아마이드(N,N'-Dimethylformamide)=9:1용액으로 완전히 용해시킨 다음 카르보닐다이이미다졸(Carbonyldiimidazole;CDI) 0.9당량을 첨가하여 실온에서 24시간 교반한 다음, 반응 중 생성된 고체를 필터한 후 THF로 씻은 후 진공 감압 하에서 건조하여 옅은 노란색의 생성물을 70% 수율로 수득하여 사용하였다.

상기 ⅱ) 단계에서 NH2-보호된-펩타이드-레진의 합성은 Fmoc(9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl))을 N-아미노산의 보호기로 사용하는 고체상 합성법(Solid-Phase Peptide Synthesis; SPPS)에 의해 합성하였다. 이러한 고체상 합성법은 본 기술 분야에서 이미 널리 알려진 펩타이드 합성방법으로서 Wang C. Chan, Perter D. White, 'Fmoc solid phase peptide synthesis', Oxford.를 참고하는 본 기술 분야의 통상의 기술을 가진 자가 용이하게 합성할 수 있다.

상기 ⅲ) 단계는 상기 ⅱ) 단계에서 합성된 NH2-보호된 펩타이드-레진을 상기 ⅰ) 단계에서 준비된 활성화된 코직산과 반응시켜 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 합성하는 단계로서, 본 발명의 하기 실시예 1에서는 합성된 NH2-보호된-펩타이드-레진에서 Fmoc(9-플루오레닐메톡시카르보닐)기를 제거하고 활성화된 코직산(Kojyl imidazole)을 반응시켰다. 커플링이 끝난 후 세척하고 건조한 다음, 여기에 트리플루오로아세트산 : 물 : 트리아이소프로필실란(95 : 2.5 : 2.5 (v/v))의 혼합 용액으로 2~3시간 반응시켜 아미노산의 보호기인 t-Bu(t-부틸)을 제거하고, 레진으로부터 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 분리시킨 다음, 차가운 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다. 이렇게 얻은 침전물은 역상 고성능액체크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제함으로써, 최종적으로 본 발명의 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 합성하였다.

하기 반응식 1 및 2에서는 본 발명의 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 합성 과정을 개략적으로 나타내었다.

[반응식 1] 활성화된 코직산 합성 Scheme

[반응식 2] 펩타이드 결합된 코직산 유도체 합성 Scheme

상기와 같은 방법으로 합성된 본 발명의 ‘펩타이드가 결합된 코직산 유도체’는 하기 표의 화학식으로 표시되는 유도체 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 유도체일 수 있다.

본 명세서에서 본 발명의 펩타이드가 결합된 코직산 유도체 중 활성화된 코직산에 디펩타이드인 PS(프롤릴-세린)가 결합된 코직산 유도체는 ‘Kojyl-PS’라 명명하였으며; 활성화된 코직산에 트리펩타이드인 ECG(글루타밀-시스테이닐-글라이신)가 결합된 코직산 유도체는 ‘Kojyl-ECG’라 명명하였고; 활성화된 코직산에 테트라펩타이드인 KECG(라이실-글루타밀-시스테이닐-글라이신)가 결합된 코직산 유도체는 ‘Kojyl-KECG’라 명명하였으며; 활성화된 코직산에 테트라펩타이드인 PKEK(프롤릴-라이실-글루타밀-라이신)이 결합된 코직산 유도체는 ‘Kojyl-PKEK’라 명명하였고; 활성화된 코직산에 노나펩타이드인 CDPGYIGSR가 결합된 코직산 유도체는 ‘Kojyl-CDPGYIGSR’라 명명하였으며, 이러한 본 발명의 펩타이드가 결합된 코직산 유도체의 화학구조는 상기 표에서 자세히 나타내었다.

본 발명자는 미백제로 널리 알려진 코직산의 낮은 안정성 및 세포독성으로 인한 피부자극의 문제점을 해결하고 하였으며, 상기와 같은 공정을 통해 합성된 본 발명의 특정 펩타이드가 결합된 코직산 유도체가 미백 활성과 더불어 생체친화성 및 안전성을 높일 수 있다는 사실을 확인하였다.

본 발명의 하기 실험예 1에서는 펩타이드가 결합된 코직산 유도체가 미백 활성이 우수한지를 평가하기 위하여 티로시나아제 소거 활성을 조사하였으며, 그 결과 펩타이드 결합 코직산 유도체로 Kojyl-PS(KA-PS), Kojyl-PKEK(KA-PKEK) 및 Kojyl-CDPGYIGSR(KA-CDPGYIGSR)와 Kojyl-FWY-NH2가 코직산 대비 더욱 높은 티로시나아제 억제능을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

또한 본 발명의 하기 실험예 2에서는 티로시나아제 소거 활성이 가장 우수한 본 발명의 Kojyl-PS(KA-PS)의 멜라닌 생성 억제 활성을 평가하였으며, 그 결과 Kojyl-PS(KA-PS)는 1mM의 농도에서 세포 독성을 보이지 않으면서 멜라닌 생성을 약 50% 저해능을 보였고, 이는 대조군인 알부틴보다 효능이 현저하게 우수한 것을 확인할 수 있었다. 참고로, 종래 미백 소재로 알려진 코직산의 경우 10mM의 농도에서 멜라닌 생성을 약 50% 저해능을 보이며, 이때 10mM의 농도에서의 세포생존율이 약 60%까지 현저하게 떨어지는 것으로 나타나, 멜라닌 생성 억제 효과와는 별도로 세포독성으로 안전성에 문제가 있다(결과 미도시). 이에 반해, 본 발명의 Kojyl-PS(KA-PS)는 1mM의 농도에서 세포 독성을 보이지 않으면서 멜라닌 생성을 약 50% 저해능을 보임에 따라, 코직산 대비 매우 우수한 미백 활성을 나타냄을 확인하였다(도 3 참조).

이와 같은 결과를 통해, 본 발명자는 펩타이드가 결합된 코직산 유도체로 Kojyl-PS(KA-PS), Kojyl-PKEK(KA-PKEK) 및 Kojyl-CDPGYIGSR(KA-CDPGYIGSR)가 미백 기능성 소재로 이용 가능함을 실험적으로 입증하였으며, 특히 Kojyl-PS(KA-PS)의 경우 높은 미백 활성과 더불어 고농도에서도 세포독성을 보이지 않아 피부에 적용하는 경우 자극이 없는 이점을 확인하였다.

이에 본 발명의 조성물은 상기와 같은 특징을 가진 펩타이드가 결합된 코직산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는바, 피부 미백을 위한 기능성 조성물에 해당한다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 펩타이드가 결합된 코직산 유도체는 1mM 내지 10mM의 농도에서도 세포독성이 없으며, 미백 활성 소재로서 10μM 내지 100mM의 농도로 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 외용제 조성물일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종의 제형을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유효성분(펩타이드가 결합된 코직산 유도체)의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001-40중량%이며, 바람직하게는 0.5-40%이며, 보다 바람직하게는 1.0-30중량%이다. 상기 유효성분(펩타이드가 결합된 코직산 유도체)의 함량이 0.0001중량% 미만이면 피부 미백 효과가 크게 감소되고, 40중량%를 초과하는 경우에는 피부 자극을 초래할 수 있으며, 제형상의 문제점이 발생할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 유효성분(펩타이드가 결합된 코직산 유도체)을 나노리포좀 내부에 함유시켜 안정화하여 제형화할 수도 있다. 상기 유효성분(펩타이드가 결합된 코직산 유도체)을 나노리포좀 내부에 함유시키면, 유효성분이 안정화되어 제형화시 침전형성, 변색, 변취 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 성분의 용해도 및 경피흡수율을 높일 수 있어 상기 유효성분으로부터 기대되는 효능을 최대로 발현시킬 수 있다.

본 발명에서 나노리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 10~500nm인 리포좀을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 나노리포좀의 평균 입자 지름은 50~300nm이며, 더욱 바람직하게는 100~200nm이다. 나노리포좀의 평균 입자 지름이 500nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 피부침투의 개선 및 제형 안정성의 개선이 매우 미약하다.

본 발명에 따라 상기 유효성분(펩타이드가 결합된 코직산 유도체)을 안정화하는데 사용되는 나노리포좀은 폴리올, 유성성분, 계면활성제, 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 나노리포좀에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 10~80중량%, 바람직하게는 30~70중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 유성(oil) 성분은 당업계에 공지된 다양한 오일이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 헥사데칸 및 파라핀 오일과 같은 하이드로카본계 오일, 에스테르계의 합성오일, 디메치콘 및 사이크로메치콘계와 같은 실리콘 오일, 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유 및 어유와 같은 동식물성 오일, 에톡시레이티드 알킬에테르계오일, 프로폭시레이티드 알킬에테르계오일, 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌과 같은 스핑고노이드 지질, 세레브로사이드 콜레스테롤, 시토스테롤 콜레스테릴설페이트, 시토스테릴설페이트, C10-40 지방알콜 및 이의 혼합물이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여1.0~30.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 3.0~20.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있다. 바람직하게는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제이다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트를 포함한다. 비이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알콕시레이티드 알킬에테르, 알콕시레이티드 알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르를 포함한다. 특히 바람직한 계면활성제는 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리솔베이트류이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.1~10중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~5.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질이 이용되며, 천연 인지질(예를 들어, 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예를 들어, 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 특히, 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이 바람직하다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜콜린의 양이 23~95%, 그리고 포스파디딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다. 본 발명의 나노리포좀의 제조에 있어서, 인지질의 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.5~20.0중량%이며, 바람직하게는 2.0~8.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C12-22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.05~3.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.1~1.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이며, 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 5.0~40중량%일 수 있다.

나노리포좀의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 성분들을 포함하는 혼합물을 고압 호모게나이저에 적용하여 제조된다. 고압 호모게나이저에 의한 나노리포좀의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있으며, 바람직하게는 600~1200bar의 압력 하에서 1~5회 고압 호모게나아저를 통과하도록 하여 나노리포좀을 제조할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 미백 효과가 우수한 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

한편, 본 발명의 피부 미백용 조성물은 상기와 같은 화장료 조성물 이외에도 피부외용 약제학적 조성물일 수 있으며, 자세하게는 미백활성을 갖는 피부외용제로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 a) 글리세롤, 카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드, 인지질 및 콜레스테롤을 혼합하는 단계; b) 상기 혼합물에 온도를 가하여 용해시키는 단계; c) 상기 용해물에 펩타이드가 결합된 코직산 유도체 및 물을 첨가하여 용해시키는 단계; 및 d) 상기 c) 단계를 통해 수득한 용액을 고압에서 리포좀화시키는 단계를 포함하는, 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 함유하는 나노리포좀 제조방법을 제공한다.

본 발명의 상기 a) 단계는 글리세롤, 카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드, 인지질 및 콜레스테롤을 혼합하는 단계로서, 바람직하게는 글리세롤, 카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드, 인지질 및 콜레스테롤을 50:15:3:2의 중량비로 혼합하는 단계이다.

본 발명의 상기 b) 단계는 상기 a) 단계를 통해 수득한 혼합물에 온도를 가하여 용해시키는 단계로서, 바람직하게는 상기 a) 단계를 통해 수득한 혼합물을 교반하면서 65℃ 내지 75℃까지 가온하여 완전히 용해시키는 단계이다.

본 발명의 상기 c) 단계는 상기 b) 단계를 통해 수득한 용해물에 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 첨가하여 용해시키는 단계로서, 바람직하게는 상기 b) 단계를 통해 수득한 용해물 100중량부를 기준으로 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 0.01 내지 10중량부를 첨가하는 단계이다.

본 발명의 상기 d) 단계는 상기 c) 단계를 통해 수득한 용액을 고압에서 리포좀화시키는 단계로서, 바람직하게는 상기 c) 단계를 통해 수득한 용액을 10℃에서 압력 800 내지 1200 bar 조건에서 고압유화장치에 통과시켜 나노 리포좀화하는 단계이다.

이렇게 제조된 펩타이드가 결합된 코직산 유도체(Kojyl-PS, Kojyl-ECG, Kojyl-KECG, Kojyl-PKEK, Kojyl-CDPGYIGSR)를 봉입한 나노리포좀은 100 내지 200 nm의 입자 크기를 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 펩타이드가 결합된 코직산 유도체가 봉입된 나노리포좀을 제공한다.

상기 나노리포좀은 장시간의 기간이 경과 후에도 펩타이드가 결합된 코직산 유도체의 회수율이 90 내지 99.9%일 수 있으며, 본 발명의 일 구체예에서 상기 장시간의 기간은 90일 내지 150일 수 있다.

따라서 본 발명의 펩타이드가 결합된 코직산 유도체를 내부에 봉입한 나노리포즘은 제형 안정성을 통해 시간 경과에 따른 미백 활성성분(펩타이드가 결합된 코직산 유도체)의 침전형성, 변색, 변취 등의 문제점을 개선할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실험재료

코직산(kojic acid)은 Wako (Japan)사에서 구입하였으며, 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran; THF)은 J.T Baker (U.S.A)사에서 구입하였고, 디메틸포름아마이드(N,N'-Dimethylformamide)은 대정(S. Korea))에서 구입하였으며, 카르보닐다이이미다졸(Carbonyldiimidazole;CDI)은 Acros(U.S.A)사에서 구입하였다. Fmoc-Rink linker, N-히드록시벤조트리아졸(N-hydroxybenzotriazole: HOBt) 그리고, N,N-디이소프로필카보다이이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide: DIC)은 GL Biochem(China)사에서 구입하였고,피페리딘(Piperidine), N-메틸-2-피롤리돈(N-Methyl-2-pyrrolidone: NMP), 디클로로메탄(dichloromethane: DCM), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), 디에틸에테르로(diethyl ether) 그리고, 아세토니트릴(acetonitrile)은 대정(S.Korea)에서 구입하였으며, 이소프로필실란(Triisopropylsilane)은 GL Biochem(China)에서 구입하였고, 글리세린, 카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드, 인지질 및 콜레스테롤은 4chem (S.Korea)에서 구입하였다.

통계분석

본 실험의 통계처리는 SAS(Statistical analysis system; The SAS system Release 9.4, 2013)의 General linear model를 이용하여 분석하였고, Tukey's Studentized Range (HSD) Test를 사용하여 유의성 5% 수준에서 검증하였다.

< 실시예 1>

본 발명에 따른 5종의 코질- 펩타이드 제조

<1-1> 활성화된 코직산 합성

코직산(142.1g, 1mol)를 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran; THF):디메틸포름아마이드(N,N'-Dimethylformamide)=600ml:50ml 혼합용액으로 완전히 용해시킨 다음 146g(0.9mole)의 카르보닐다이이미다졸(Carbonyldiimidazole;CDI) 0.9당량을 첨가하여 실온에서 24시간 교반하였다. 반응중 생성된 고체를 필터한 후 THF로 씻은 후 진공감압 하에서 건조하여 옅은 노란색의 생성물을 70% 수율(141.1g)로 얻었다. 생성물은 냉동 보관하였다.

<1-2> NH2 -보호된- 펩타이드 -레진의 합성

본 실시예에서 사용되는 다양한 종류의 펩타이드의 합성은 9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl: Fmoc)을 N-아미노산의 보호기로 사용하는 통상의 고체상 합성법(Solid-Phase Peptide Synthesis; SPPS)에 의해 합성하였으며, N-히드록시벤조트리아졸(N-hydroxybenzotriazole: HOBt)과 N,N-디이소프로필카보다이이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide: DIC)/또는 N-히드록시벤조트리아졸 및 N,N'-디시클로헥실카보디이미드(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide: DCC)를 활성제로 사용하여 아미노산 잔기를 연장하였다(참고문헌: Wang C. Chan, Perter D. White, 'Fmoc solid phase peptide synthesis', Oxford).

프롤릴 -세린-레진 (P-S-Resin) 합성

Fmoc-Ser(tBu)-resin(치환율0.72mmole/g) 1mmole (1.39g)을 반응용기에 넣고 DCM (10ml)로 30분간 실온에서 교반하여 레진을 충분히 부풀린 후 용매를 제거한다. 부풀려진 레진을 DMF로 3회 세척(10ml*3)후 용매를 제거하고, Fmoc을 제거하기 위해 20% 피페디딘 용액 10ml을 반응용기에 넣은 후 20분간 1회 처리 후 다시 15분간 한번 더 처리하여 Fmoc을 완전히 제거한다. 제거 후 레진을 DMF로 3회 세척하여 여분의 피페리딘을 완전히 제거하고, 레진에 Fmoc-Pro-OH(m.w=337.3) 3당량 (3mmole=1.01g), HOBt 3당량(m.w=153.1, 3mmole=459.3mg), DIC 3당량(m.w=126.2,3mmole=378.6 mg)을 순차적으로 레진에 첨가 후 최종 부피가 DMF 10 ml로 하여 실온에서 3시간 동안 교반하여 반응을 마친다.

글루타밀 - 시스테이닐 -글리신-레진 ( ECG -Resin) 합성

Fmoc-Gly-resin(치환율0.79mmole/g) 1mmole (1.26g)을 반응용기에 넣고 DCM (10ml)로 30분간 실온에서 교반하여 레진을 충분히 부풀린 후 용매를 제거한다. 부풀려진 레진을 DMF로 3회 세척(10ml*3)후 용매를 제거하고, Fmoc을 제거하기 위해 20% 피페디딘 용액 10ml을 반응용기에 넣은 후 20분간 1회 처리 후 다시 15분간 한번 더 처리하여 Fmoc을 완전히 제거한다. 제거 후 레진을 DMF로 3회 세척하여 여분의 피페리딘을 완전히 제거하고, 레진에 Fmoc-Cys(Trt)-OH(m.w=585.7) 3당량 (3mmole=1.76g), HOBt 3당량(m.w=153.1, 3mmole=459.3mg), DIC 3당량(m.w=126.2,3mmole=378.6 mg)을 순차적으로 레진에 첨가 후 최종 부피가 DMF 10 ml로 하여 실온에서 3시간 동안 교반하여 반응을 마친다. 반응 후 용매를 제거하고 레진을 DMF 10ml로 3회 처리하고 다시 Fmoc을 제거하기 위해 20% 피페디딘 용액 10ml을 반응용기에 넣은 후 20분간 1회 처리 후 다시 15분간 한번 더 처리하여 Fmoc을 완전히 제거한다.

제거 후 레진을 DMF로 3회 세척하여 여분의 피페리딘을 완전히 제거하고, 레진에 Fmoc-Glu(OtBu)-OH(m.w=425.4) 3당량 (3mmole=1.27g), HOBt 3당량(m.w=153.1, 3mmole=459.3mg), DIC 3당량(m.w=126.2,3mmole=378.6 mg)을 순차적으로 레진에 첨가 후 최종 부피가 DMF 10 ml로 하여 실온에서 3시간 동안 교반하여 반응을 마친다.

라이실- 글루타밀 - 시스테이닐 -글리신-레진 ( KECG -Resin) 합성

Fmoc-Gly-resin(치환율0.79mmole/g) 1mmole (1.26g)을 반응용기에 넣고 DCM (10ml)로 30분간 실온에서 교반하여 레진을 충분히 부풀린 후 용매를 제거한다. 부풀려진 레진을 DMF로 3회 세척(10ml*3)후 용매를 제거하고, Fmoc을 제거하기 위해 20% 피페디딘 용액 10ml을 반응용기에 넣은 후 20분간 1회 처리 후 다시 15분간 한번 더 처리하여 Fmoc을 완전히 제거한다. 제거 후 레진을 DMF로 3회 세척하여 여분의 피페리딘을 완전히 제거하고, 레진에 Fmoc-Cys(Trt)-OH(m.w=585.7) 3당량 (3mmole=1.76g), HOBt 3당량(m.w=153.1, 3mmole=459.3mg), DIC 3당량(m.w=126.2,3mmole=378.6 mg)을 순차적으로 레진에 첨가 후 최종 부피가 DMF 10 ml로 하여 실온에서 3시간 동안 교반하여 반응을 마친다. 반응 후 용매를 제거하고 레진을 DMF 10ml로 3회 처리한 다음 Fmoc을 제거하기 위해 20% 피페디딘 용액 10ml을 반응용기에 넣은 후 20분간 1회 처리 후 다시 15분간 한번 더 처리하여 Fmoc을 완전히 제거한다.

제거 후 레진을 DMF로 3회 세척하여 여분의 피페리딘을 완전히 제거하고, 레진에 Fmoc-Glu(OtBu)-OH(m.w=425.4) 3당량 (3mmole=1.27g), HOBt 3당량(m.w=153.1, 3mmole=459.3mg), DIC 3당량(m.w=126.2,3mmole=378.6 mg)을 순차적으로 레진에 첨가 후 최종 부피가 DMF 10 ml로 하여 실온에서 3시간 동안 교반하여 반응을 마친다.

다음 서열의 아미노산의 결합도 위와 동일한 방식과 당량을 사용하여 결합하였다.

프롤릴 -라이실- 글루타밀 -라이신-레진 ( PKEK -Resin) 합성

Fmoc-Lys(Boc)-resin(치환율0.63mmole/g) 1mmole (1.58g)을 반응용기에 넣고 DCM (10ml)로 30분간 실온에서 교반하여 레진을 충분히 부풀린 후 용매를 제거한다. 부풀려진 레진을 DMF로 3회 세척(10ml*3)후 용매를 제거하고, Fmoc을 제거하기 위해 20% 피페디딘 용액 10ml을 반응용기에 넣은 후 20분간 1회 처리 후 다시 15분간 한번 더 처리하여 Fmoc을 완전히 제거한다.

제거 후 레진을 DMF로 3회 세척하여 여분의 피페리딘을 완전히 제거하고, 레진에 Fmoc-Glu(OtBu)-OH(m.w=425.5) 3당량 (3mmole=1.27g), HOBt 3당량(m.w=153.1, 3mmole=459.3mg), DIC 3당량(m.w=126.2,3mmole=378.6 mg)을 순차적으로 레진에 첨가 후 최종 부피가 DMF 10 ml로 하여 실온에서 3시간 동안 교반하여 반응을 마친다. 반응 후 용매를 제거하고 레진을 DMF 10ml로 3회 처리한 다음 Fmoc을 제거하기 위해 20% 피페디딘 용액 10ml을 반응용기에 넣은 후 20분간 1회 처리 후 다시 15분간 한번 더 처리하여 Fmoc을 완전히 제거한다.

다음 서열(PK)의 아미노산의 결합도 위와 동일한 방식과 당량을 사용하여 결합하였다.

시스테이닐 - 아스파티딜 - 프롤릴 -글리실- 타이로실 - 아이소루실 -글리실-세릴-아르기닌-레진 ( CDPGYIGSR -Resin) 합성

Fmoc-Arg(Pbf)-resin(치환율0.63mmole/g) 1mmole (1.58g)을 반응용기에 넣고 DCM (10ml)로 30분간 실온에서 교반하여 레진을 충분히 부풀린 후 용매를 제거한다. 부풀려진 레진을 DMF로 3회 세척(10ml*3)후 용매를 제거하고, Fmoc을 제거하기 위해 20% 피페디딘 용액 10ml을 반응용기에 넣은 후 20분간 1회 처리 후 다시 15분간 한번 더 처리하여 Fmoc을 완전히 제거한다.

제거 후 레진을 DMF로 3회 세척하여 여분의 피페리딘을 완전히 제거하고, 레진에 Fmoc-Ser(tBu)-OH(m.w=384.4) 3당량 (3mmole=1.27g), HOBt 3당량(m.w=153.1, 3mmole=459.3mg), DIC 3당량(m.w=126.2,3mmole=378.6 mg)을 순차적으로 레진에 첨가 후 최종 부피가 DMF 10 ml로 하여 실온에서 3시간 동안 교반하여 반응을 마친다. 반응 후 용매를 제거하고 레진을 DMF 10ml로 3회 처리한 다음 Fmoc을 제거하기 위해 20% 피페디딘 용액 10ml을 반응용기에 넣은 후 20분간 1회 처리 후 다시 15분간 한번 더 처리하여 Fmoc을 완전히 제거한다.

다음 서열(CDPGYIG)의 아미노산의 결합도 위와 동일한 방식과 당량을 사용하여 결합하였다.

<1-3> 코질- 펩타이드의 합성

상기에서 합성된 각 NH2-보호된-펩타이드-레진(1mmole)에 활성화된 코직산(Kojyl imidazole; m.w=236.2) 3당량(708.6mg), HOBt(m.w=153.1) 3당량(459.3mg)을 반응용기에 넣고 실온에서 하룻밤 동안 커플링 반응시켰다. 커플링이 끝난 후 디메틸포름아마이드(N,N'-Dimethylformamide: DMF)와 디클로로메탄(dichloromethane: DCM)으로 각 3회 세척한 다음 건조시켰다.

여기에 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) : 물(water) : 트리아이소프로필실란(Triisopropylsilane)이 95 : 2.5 : 2.5 (v/v)의 부피비로 혼합된 용액 10ml로 3시간 동안 반응시켜 펩타이드를 구성하고 있는 아미노산 잔기의 측쇄에 존재하는 작용기의 보호기를 제거하였으며, 레진으로부터 코질-펩타이드를 분리시킨 다음, 차가운 디에틸에테르로(diethyl ether) 펩타이드를 침전시켰다.

이렇게 얻은 코질-펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴(acetonitrile)을 용매로 하여 역상 고성능액체크로마토그래피 컬럼(reverse phase high performance liquid chromatography column, Gemini, C18 110A 25021.2mm)을 이용하여 정제함으로써, 코질-펩타이드를 합성하였다.

각 펩타이드의 분석 조건은 하기 표 1에서 자세히 나타내었으며, 각 펩타이드별 분석조건을 동일하게 적용하였다.

펩타이드 분석 조건

기기: Water 1525u Binary HPLC Pump 검출기: Water 996 Photodiode Array Detector 컬럼: Hector-M C18(RS Tech), 250*4.6mm, 5um, 100 유속: 1ml/min 용매: 용매 A(0.1 TEA in H2O), 용매 B(0.1 TEA in Acetonitrile) 파장: 230nm
시간(min)	용매 A(%)	용매 B(%)
0	100	0
30	40	60
35	40	60
36	100	0
42	100	0

각 펩타이드의 정제 조건은 하기 표 2 내지 표 6에서 자세히 나타내었으며, 정제시 동일한 HPLC 기기 및 컬럼을 사용하였다.

Kojyl-PS 정제 조건

기기: Water 650E Advanced Protein Purification System 검출기: Water 484 UV Detector 컬럼: Gemini 5u C18 110 A(5m, 21.2250nm, Phenomenex 사) 유속: 5ml/min 용매: 용매 A(0.1 TEA in H2O), 용매 B(0.1 TEA in Acetonitrile) 파장: 230nm
시간(min)	용매 A(%)	용매 B(%)
0	85	15
15	75	25
16	5	95
22	5	95
23	85	15
30	85	15

Kojyl-ECG 정제 조건

기기: Water 650E Advanced Protein Purification System 검출기: Water 484 UV Detector 컬럼: Gemini 5u C18 110 A(5m, 21.2250nm, Phenomenex 사) 유속: 5ml/min 용매: 용매 A(0.1 TEA in H2O), 용매 B(0.1 TEA in Acetonitrile) 파장: 230nm
시간(min)	용매 A(%)	용매 B(%)
0	83	17
15	73	27
16	5	95
22	5	95
23	83	17
30	83	17

Kojyl-KECG 정제 조건

기기: Water 650E Advanced Protein Purification System 검출기: Water 484 UV Detector 컬럼: Gemini 5u C18 110 A(5m, 21.2250nm, Phenomenex 사) 유속: 5ml/min 용매: 용매 A(0.1 TEA in H2O), 용매 B(0.1 TEA in Acetonitrile) 파장: 230nm
시간(min)	용매 A(%)	용매 B(%)
0	88	12
15	78	22
16	5	95
22	5	95
23	88	12
30	88	12

Kojyl-PKEK 정제 조건

기기: Water 650E Advanced Protein Purification System 검출기: Water 484 UV Detector 컬럼: Gemini 5u C18 110 A(5m, 21.2250nm, Phenomenex 사) 유속: 5ml/min 용매: 용매 A(0.1 TEA in H2O), 용매 B(0.1 TEA in Acetonitrile) 파장: 230nm
시간(min)	용매 A(%)	용매 B(%)
0	90	10
15	80	20
16	5	95
22	5	95
23	90	10
30	90	10

Kojyl-CDPGYIGSR 정제 조건

기기: Water 650E Advanced Protein Purification System 검출기: Water 484 UV Detector 컬럼: Gemini 5u C18 110 A(5m, 21.2250nm, Phenomenex 사) 유속: 5ml/min 용매: 용매 A(0.1 TEA in H2O), 용매 B(0.1 TEA in Acetonitrile) 파장: 230nm
시간(min)	용매 A(%)	용매 B(%)
0	80	20
15	70	30
16	5	95
22	5	95
23	80	20
30	80	20

하기에서는 본 발명에서 합성한 총 5개의 코질-펩타이드 종류 및 수율을 표 7에 정리하였으며, 본 발명의 총 5종의 합성 코질 펩타이드 화학구조는 표 8에서 자세히 나타내었다.

본 발명의 5종 코질-펩타이드 및 합성 수율

코질-펩타이드	합성 수율
Kojyl-PS (코질-프롤릴-세린)	27.5 %
Kojyl-ECG (코질-글루타밀-시스테이닐-글리신)	36.2 %
Kojyl-KECG (코질-라이실-글루타밀-시스테이닐-글리신)	42.0 %
Kojyl-PKEK (코질-프롤릴-라이실-글루타밀-라이신)	32.9 %
Kojyl-CDPGYIGSR (코질-시스테이닐-아스파티딜-프롤릴-글리실-타이로실-아이소루실-글리실-세릴-아르기닌)	22.4 %

본 발명의 5종 코질-펩타이드의 화학구조

코질-펩타이드	화학구조
Kojyl-PS
Kojyl-ECG
Kojyl-KECG
Kojyl-PKEK
Kojyl-CDPGYIGSR

< 실시예 2>

코질- 프롤릴 -세린( Kojyl -PS)펩타이드의 리포좀 제조

글리세린 50g, 카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드 15g, 인지질 3g, 콜레스테롤 2 g을 혼합하여 교반기로 교반하면서 70까지 가온하여 완전히 용해시킨 다음 실시예1에서 얻은 Kojyl-PS 0.1g과 정제수 500ml 첨가하여 완전히 용해시켰다. 이 혼탁액을 10에서 압력 1000 bar 조건에서 고압유화장치(Microfluidizer, Picomax, 대한민국)에 3회 통과시켜 나노 리포좀화된 코질-프롤릴-세린(Kojyl-PS)용액을 제조하였다. 이 리포좀의 입자 크기는 대략 112 nm이었다(도 1 참조).

< 비교예 1>

코질-트리펩타이드( Kojyl - FWY - NH2 ; 코질- 페닐알라닐 -트립토판일- 타이로신 아 마이드)의 제조

본 발명의 실시예 1에서 제조한 5종의 코질-펩타이드의 효과 비교 실험을 위하여 종래에 이미 알려진 Kojyl-FWY-NH2를 준비하였다.

Kojyl-FWY-NH2는 상기 실시예 1과 동일한 방식으로 합성되었으며, 수율은 22.0%이었다.

< 비교예 2>

디펩타이드(프롤린-세린; PS)의 제조

본 발명의 실시예 1에서 제조한 5종의 코질-펩타이드의 효과 비교 실험을 위하여 코직산이 결합되지 않은 디펩타이드를 준비하였다.

PS(프롤린-세린) 디펩타이드는 Fmoc을 N-아미노산의 보호기로 사용하는 고체상 합성법에 의해 합성하였으며, HOBt(N-히드록시벤조트리아졸)-DCC(N,N-디시클로헥실카보디이미드) 활성제를 사용하여 아미노산 잔기를 연장하였다(Wang C. Chan, Perter D. White, 'Fmoc solid phase peptide synthesis', Oxford).

상기에서 합성된 NH2-보호된-펩타이드(프롤릴-세린)-레진에 20% 피페리딘(Piperidine)/N-메틸피롤리돈 용액을 가하여 아미노기(-NH)에 붙어있는 Fmoc(9-플루오레닐메톡시카르보닐)기를 제거하고, N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄으로 여러 번 세척한 다음 건조시켰다.

여기에 트리플루오로아세트산 : 물 : 트리아이소프로필실란(95 : 2.5 : 2.5 (v/v))의 혼합 용액으로 2~3시간 반응시켜 펩타이드를 구성하고 있는 아미노산의 보호기인 t-Bu(t-부틸)을 제거하고, 레진으로부터 다이펩타이드를 분리시킨 다음, 차가운 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다. 이렇게 얻은 펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 하여 역상 고성능액체크로마토그래피 컬럼(reverse phase high performance liquid chromatography column, Gemini, C18 110A 25021.2mm)을 이용하여 정제함으로써, PS(프롤린-세린) 디펩타이드를 합성하였다.

합성 수율은 33.0 %이었다.

< 비교예 3>

트리펩타이드( 글루타밀 - 시스테이닐 -글리신; ECG )의 제조

비교예에 사용되는 ECG 트리펩타이드는 상기 비교예 2와 동일한 방식으로 합성하였으며, 수율은 29.3 %이었다.

< 비교예 4>

테트라펩타이드(라이실- 글루타밀 - 시스테이닐 -글리신; KECG )의 제조

비교예에 사용되는 KECG 테트라펩타이드는 상기 비교예 2와 동일한 방식으로 합성하였으며, 수율은 39.8 %이었다.

< 비교예 5>

테트라펩타이드(프롤릴-라이 실- 글루타밀 - 라이신 ; PKEK )의 제조

비교예에 사용되는 PKEK 테트라펩타이드는 상기 비교예 2와 동일한 방식으로 합성하였으며, 수율은 42.0 %이었다.

< 비교예 6>

노나펩타이드 ( 시스테이닐 - 아스파티딜 - 프롤릴 -글리실- 타이로실 - 이소루실 -글리실-세릴-아르기닌; CDPGYIGSR )의 제조

비교예에 사용되는 CDPGYIGSR 노나펩타이드는 상기 비교예 2와 동일한 방식으로 합성하였으며, 수율은 31.0 %이었다.

< 실험예1 >

티로시나아제( Tyrosinase ) 소거 효과

본 실험에서는 상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 5종 코질-펩타이드의 미백활성을 평가하기 위하여 먼저 티로시나아제 소거 효과를 조사하였다.

타이로시나아제는 생체내에서 타이로신(Tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 이 효소의 기능을 억제하여 타이로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자 형성하는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(Pomerantz S.H., J. Biochem., 24:161-168,1966)을 응용하여, 코질-펩타이드의 타이로시나아제 활성 억제효과를 조사하였다.

간략하게는, 티로시나아제에 대한 저해활성 측정을 위하여 시료 농도가 40μM 이 되도록 96웰-플레이트에 넣고, 100mM의 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.8)를 220㎕, 1.5mM L-티로신 용액 40㎕를 넣은 후, 머쉬룸 티로시나아제(1,500units/ml, Sigma)를 20㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 0.2 ml을 취하여 96 웰 플레이트(well plate)에 옮기고, 마이크로플레이트 판독기(Microplate reader)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나아제에 대한 저해율을 측정하였다. 티로시나아제(Tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 저해능의 정도는 순수한 물을 사용한 대조구의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

한편, 코직산 자체, 비교예 1 내지 6에서 제조한 Kojyl-FWY-NH2 및 코직산이 결합되지 않은 5종의 펩타이드를 대조군으로 사용하여 티로시나아제 소거 활성을 비교하였다.

티로시나아제 억제능(%)=100-(각시료의 반응 흡광도/대조군의 반응 흡광도×100)

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Kojyl-PS(KA-PS), Kojyl-PKEK(KA-PKEK), Kojyl-CDPGYIGSR(KA-CDPGYIGSR) 및 비교예 1의 Kojyl-FWY-NH2에서 코직산 대비 더욱 높은 티로시나아제 억제능을 보여주었다.

< 실험예 2>

멜라닌 생성 억제( (Melanin inhibition)효과

본 실험에서는 티로시나아제 억제능이 가장 우수한 본 발명의 Kojyl-PS(KA-PS)의 미백활성을 평가하기 위하여, B16F10 멜라닌 세포에서 코질-펩타이드를 처리하였을 때, 멜라닌 합성의 변화를 흡광도를 이용하여 측정하였다. 또한 기존의 미백효과를 가진 알부틴(Arbutin)을 처리하여, 미백효과를 알아보았다.

간략하게는, 6웰 플레이트(Well plate)에 멜라닌 세포를 접종하고, 이에 시료를 일정 농도로 처리하여 2일간 배양한 후, 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포에 10% DMSO(Dimethylsufoxide)을 포함하는 1N NaOH를 가해 90에서 1시간 반응시켜 멜라닌이 충분히 녹아나오도록 한 후, ELISA 리더(reader)를 이용하여 파장 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 생성도(%)는 하기 식을 이용하여 계산하였다.

한편, 본 발명의 기존의 미백효과를 가진 알부틴(Arbutin), 코직산(kojic acid) 및 비교예 1의 Kojyl-FWY-NH2를 대조군으로 사용하여 멜라닌 생성 억제 활성을 비교하였다.

멜라닌 생성도(%) = 처리구흡광도/미처리구흡광도×100

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Kojyl-PS(KA-PS)는 1mM의 농도에서 세포 독성을 보이지 않으면서 멜라닌 생성을 약 50% 저해능을 보였고, 이는 대조군인 알부틴보다 효능이 현저하게 우수한 것을 확인할 수 있었다.

참고로, 종래 미백 소재로 알려진 코직산의 경우 10mM의 농도에서 멜라닌 생성을 약 50% 저해능을 보이며, 이때 10mM의 농도에서의 세포생존율이 약 60%까지 현저하게 떨어지는 것으로 나타나, 멜라닌 생성 억제 효과와는 별도로 세포독성으로 안전성에 문제가 있다(결과 미도시).

이에 반해, 본 발명의 Kojyl-PS(KA-PS)는 1mM의 농도에서 세포 독성을 보이지 않으면서 멜라닌 생성을 약 50% 저해능을 보임에 따라, 코직산 대비 매우 우수한 미백 활성을 나타냄을 확인하였다.

< 실험예 3>

리포좀화된 코질 - 프롤릴 -세린( Kojyl -PS) 펩타이드의 안정화 실험

상기 실시예2에서 제조한 리포좀화된 코질펩타이드(Kojyl-PS)의 안정성을 확인하기 위해 제조된 용액을 실온, 4℃, 25℃, 45℃, 그리고, 사이클(cycle) 조건에서 각각 3개월 동안 방치 후 고속액체 크로마토그래피로 펩타이드의 순도를 확인하여 안정성을 확인하였다.

그 결과는 하기 표 9 및 도 4a-f에서 자세히 나타내었다.

리포좀화된 코질-프롤릴-세린(Kojyl-PS)펩타이드의 조건에 따른 회수율

보관 조건	피크 면적	회수율 (%)
리포좀 제작 직후	1851808	-
4℃ 보관	1826909	98.6
25℃ 보관	1703867	92.0
45℃ 보관	1749783	94.5
실온 보관	1845462	99.6
cycle	1807557	97.6

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. a) 글리세롤, 카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드, 인지질 및 콜레스테롤을 50:15:3:2의 중량비로 혼합하는 단계;
   b) 상기 혼합물에 온도를 가하여 용해시키는 단계;
   c) 상기 용해물에 하기 화학식 1로 표시되는 프롤린-세린(PS)이 결합된 코직산 유도체(kojyl-PS or KA-PS)와 물을 첨가하여 용해시키는 단계; 및
   d) 상기 c) 단계를 통해 수득한 용액을 10 ℃, 1000 bar 조건에서 리포좀화시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 프롤린-세린(PS)이 결합된 코직산 유도체(kojyl-PS or KA-PS)를 포함하는 나노리포좀의 제조방법:
   [화학식 1]
   

   

   .
8. 삭제
9. 제 7 항에 있어서,
   상기 나노리포좀은 100 내지 200nm의 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법.
10. 삭제
11. 제 7 항의 방법으로 제조된 하기 화학식 1로 표시되는 프롤린-세린(PS)이 결합된 코직산 유도체(kojyl-PS or KA-PS)가 봉입된 나노리포좀:
    [화학식 1]
    

    

    .
12. 제 11 항의 나노리포좀을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
    

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