KR101754378B1

KR101754378B1 - 리포좀 기반 종양진단 방사성구리 추적자 합성 및 활용

Info

Publication number: KR101754378B1
Application number: KR1020160050285A
Authority: KR
Inventors: 유정수; 이웅희; 살카 스왈바누; 팔 라미아니; 풍 투 흉
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-04-25
Filing date: 2016-04-25
Publication date: 2017-07-05

Abstract

본 발명은 리포좀 기반 종양진단 방사성구리 추적자 합성 및 활용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 금속성 방사성 동위원소와 착화합물을 형성하는 새로운 구조의 킬레이트 및 이를 리포좀의 인지질 이중층에 표지하여 낮은 백그라운드를 보이며 선명하게 종양을 진단할 수 있는 영상 프로브 및 이를 포함하는 PET 조영제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 PET 조영제는 체내 독성이 낮고 세포와 유사한 구조를 가지는 리포좀 기반의 영상 프로브를 이용한 것으로, 뛰어난 신호 대 백그라운드 비를 갖고 선명하게 종양을 진단할 수 있기 때문에 조기 진단 및 항암치료 효과 모니터링 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

리포좀 기반 종양진단 방사성구리 추적자 합성 및 활용 {Synthesis of liposome-based radioactive copper tracer and use thereof}

본 발명은 리포좀 기반 종양진단 방사성구리 추적자 합성 및 활용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 금속성 방사성 동위원소와 착화합물을 형성하는 새로운 구조의 킬레이트 및 이를 리포좀의 인지질 이중층에 표지하여 낮은 백그라운드를 보이며 선명하게 종양을 진단할 수 있는 영상 프로브 및 이를 포함하는 PET 조영제에 관한 것이다.

양전자방출단층촬영기(Positron Emission Tomography, PET)는 생체 내에 주입 된 방사성 의약품의 분포를 영상화하는 기기로서, 질병으로 인한 인체의 생물학적 변화를 영상화 하여 질병의 조기진단 및 질환의 치료방법 결정에 정확한 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 핵의학 영상기기의 중요성이 증가되고 있다.

PET에 사용하는 방사성의약품은 물, 산소, 이산화탄소, 포도당 등과 같은 생체 내 특정 대사에 참여하고 있는 분자에 방사성동위원소인 [¹⁸F]불소(fluoride), [¹¹C]탄소(carbon), [¹⁵O]산소(oxygen), 또는 [¹³N]질소(nitrogen) 등을 표지한 C¹⁵O, [¹³N]암모니아, H₂ ¹⁵O, [¹⁸F]FDG(F-Deoxy Glucose) 등과 같은 합성 양전자 방출체들이다. 이들 방사성의약품과 민감도가 우수한 PET을 이용하여 종양 수용체(receptor), 대사(metabolism) 및 이와 관련된 다양한 생물학적 기능 및 정보에 관한 자료를 영상으로 표현할 수 있게 되었다.

한편, 지난 수십년 동안, 다양한 이미징 프로브들이 개발되었고, 의학적 응용을 위해 시험되었다. 예를 들어, 산화철(Fe₂O₃), 양자점(quantum dot) 및 금 나노입자 같은 나노 결정들은 그들의 고유한 이미징 조영 효과(imaging contrast effect)를 가지기 때문에, 가장 많이 선호되어 왔다. 그러나, 대부분의 나노 결정들은 세망내피계 시스템(reticuloendothelial system, RES)에 의해 흡수되고, 체내로부터 천천히 소멸한다. 따라서, 핵의학 영상(nuclear imaging)을 위해 방사선 동위 원소를 나노 결정에 공유 결합할 경우, 배경 잡음(background noise)을 증가시킬 뿐 아니라, 환자들을 방사선에 노출시키므로 의학적 응용에 제한을 가지는 문제점이 있다.

체내 독성이 낮고 세포와 유사한 구조를 가지는 리포좀을 활용한 나노입자 개발이 활발히 진행되고 있지만, 치료약물이 아닌 진단조영제의 전달의 목적의 연구는 많지 않다. 특히 방사성 추적자가 표지된 리포좀을 이용하여 핵영상을 통한 종양 진단을 진행한 예는 드물며, 여러 구조의 킬레이트를 리포좀에 표지하여 그에 따른 체내 분포정도 및 종양 섭취정도가 어떻게 달라지는지를 비교하며 낮은 백그라운드를 보이며 선명하게 종양을 진단할 수 있는 조건을 찾기 위한 연구 역시 현재까지 진행되어진 바가 없다. 나노입자가 체내에서 세망내피계 등에 오래 머무르며 백그라운드를 높여 정확한 진단을 저해하는 경우가 많은데 뛰어난 신호 대 백그라운드 비를 가지는 리포좀 기반의 영상프로브를 개발함으로써 조기진단 및 항암치료 효과 모니터링 등에 사용될 수 있는 조영제를 개발하는 것이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 금속성 방사성 동위원소를 이용하여 우수한 이미징 효과를 나타낼 뿐만 아니라 체내 독성이 경감된 조영제를 개발하기 위하여 예의 노력을 기울인 결과, 리포좀에 킬레이트를 이용하여 금속성 방사성 동위원소를 표지함으로써 낮은 백그라운드를 보이며 선명하게 종양을 진단할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이미징 프로브로서 리포좀을 포함하는 PET 조영제를 제공하는 것이다:

[화학식 1]

상기 식에서,

R₁은 5환 또는 6환의 방향족 고리; 또는 C₁-₄의 알킬렌이고,

R₂는 -C(=O)O-; 또는 메틸렌이고,

n은 0 내지 2의 정수이고,

m은 5 내지 30의 정수이고,

상기 리간드는 DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DTPA(Diethylene triamine penta aeetic acid), DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid), NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA(1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid), TE3A(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid), TE2A(1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid), PCTA(3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid), 사이클렌(Cyclen), 사이클람(cyclam) 또는 DFO(Deferrioxamine)이고,

상기 X는 Cu-64(Ⅱ), Cu-67(Ⅱ), Ga-68(Ⅲ), Zr-89(Ⅳ), Y-86(Ⅲ), Y-90(Ⅲ), Lu-177(Ⅲ), Tc-99m(I~Ⅶ) 및 In-111(Ⅲ)로 이루어진 군에서 선택되는 금속성 방사성 동위원소로서, 상기 리간드에 배위결합되어 있다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이미징 프로브로서 리포좀을 포함하는 PET 조영제를 제공한다:

[화학식 1]

상기 식에서,

R₂는 -C(=O)O-; 또는 메틸렌이고,

n은 0 내지 2의 정수이고,

m은 5 내지 30의 정수이고,

이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이미징 프로브로서 리포좀을 포함하는 PET 조영제를 제공한다:

[화학식 1]

상기 식에서,

R₂는 -C(=O)O-; 또는 메틸렌이고,

n은 0 내지 2의 정수이고,

m은 5 내지 30의 정수이고,

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 화학식 1의 화합물의 리간드에 핵의학 분자 영상용 금속성 방사성 동위원소를 결합시켜 착물을 형성함으로써, 리포좀 기반의 이미징 프로브에 방사성 동위원소를 표지하는 것이 가능하다는 것을 확인하였다.

본 발명의 상기 화학식 1에서 [리간드 → X] 는 상기 리간드에 금속성 방사성 동위원소인 X가 배위결합하여 형성된 착물을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "착물"은 1 개 또는 그 이상의 원자나 이온을 중심으로 몇 개의 다른 원자, 이온, 분자 또는 원자단이 방향성을 갖고 입체적으로 배위(配位)하여 하나의 원자집단을 이루고 있는 것을 말한다. 여기서, 중심이 되는 원자 또는 이온에 배위하고 있는 원자이온분자(chelator:킬레이터) 또는 원자단을 리간드(ligand:배위자)라고 부른다.

본 발명의 상기 화학식 1에서 리간드는 DOTA는 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DTPA는 Diethylene

triamine penta aeetic acid, DO3A는 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid, NOTA는 1,4,7-

triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid, NODAGA는1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic

acid, TETA는 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid, TE3A는 1,4,8,11-

tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid, TE2A는 1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic

acid, PCTA는 3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid의 약어로서 금속 친화성의 리간드 화합물이다. 상기 리간드는 금속 친화성의 리간드로서 작용하여 체내에서 금속성 방사성 동위원소가 유리되지 않도록 할 수 있고, 방사성 물질을 체외로 제거하는 작용이 있어 방사성 물질에 의한 세포독성을 줄일 수 있으므로 방사선 장해에 대한 화학적 방호제로서 작용할 수 있다.

바람직하게, 상기 화학식 1에서 리간드는 사이클람(cyclam) 또는 TE2A일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 X는 PET 측정을 가능하게 하는 금속성 방사성 동위원소로서, 상기 리간드에 배위결합되어 있다. 본 발명의 상기 화학식 1에서 X는 Cu-64, Cu-67, Ga-68, Tc-99m, In-111, Y-86, Y-90 및 Zr-89일 수 있으며, 바람직하게는, Cu-64 또는 Cu-67일 수 있으며, 가장 바람직하게는 Cu-64일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

Cu-64 또는 Cu-67을 방사선 동위원소로 사용했을 때의 이점으로는 구리 이온은 갑상선이나 위 등 특정 장기에 축적이 되지 않는다는 점을 들 수 있다. 구리 이온은 인체에 필요한 무기질 성분 중 하나이며, 킬레이트 등이 구리이온과 강력한 착물을 형성하여 체내 안정도 또한 매우 우수하다. 따라서, 체내에서 떨어져 나오는 구리이온의 양은 매우 미미한 수준이다.

또 다른 장점으로는 반감기를 고려할 수 있다. PET 이미징에 광범위하게 사용되고 있는 I-124의 경우 체내 안정성이 낮아 체내에 투여가 된 후 조영제로부터 분리되어 떨어져 나올 수 있으며, 이렇게 떨어져 나온 I-124는 갑상선에 축적이 된다. 또한 모든 요오드는 체내에서 갑상선 및 위에 집중적으로 축적이 되고 아주 천천히 빠져나가게 되는데 반감기가 4.2일로 체내에 들어가 축적된 요오드 방사능양이 쉽게 줄어들지 않는다. 종양 이미징은 24시간 이내에 이루어지기 때문에 24시간이 지난 뒤 체내에 더 이상 방사능이 남아 있을 필요는 없기 때문에 요오드의 경우 불필요한 방사능을 인체에 피폭시킬 우려가 있다.

반면 Cu-64의 반감기는 12.7시간이기 때문에 24시간이 지나면 처음 방사능양의 1/4만 남고 나머지는 자연적으로 사라지게 되어 설사 동일한 양의 방사능이 종양 및 기타 장기 (간, 신장)에 남아 있다고 해도 I-124로 부터 받는 방사능양에 비해 훨씬 적은 방사능양을 받아 환자의 방사능 피폭을 혁신적으로 줄일 수 있는 장점이 있다.

본 발명에서 상기 리포좀은 포집된 수성 용적을 함유하는 완전히 폐쇄된 지질 이중층 막이다. 리포좀은 단일 층상구조 (unilamellar)의 소포 (단일의 막 이중층을 보유하는) 또는 다층상구조 (multilamellar)의 소포 (각각 수성층에 의해 다음 것으로부터 분리된, 다수개의 막 이중층에 의해 특성화된 양파 유사한 구조)일 수 있다. 이중층은 소수성의 "테일" 영역 및 친수성의 "헤드" 영역을 갖는 2개의 지질 단일층으로 구성된다. 막 이중층의 구조는, 지질 단일층의 소수성 (비극성) "테일"이 이중층 중심을 향해 배향되는 반면, 친수성의 "헤드"는 수성상을 향해 배향되게 한다.

본 발명의 상기 리포좀은 당업계에서 통상적으로 사용되는 리포좀 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 간략하게 폴리올, 계면활성제, 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물을 고압 호모게나이저에 적용하여 제조될 수 있다(Prescott, Ed., MethodsinCellBiology, (XIV),p.33et seq.(1976)).

리포좀에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자이리톨 및 솔비톨을 포함한다.

리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있고, 바람직하게는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용된다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트를 포함한다. 비이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알콕시레이티드알킬에테르, 알콕시레이티드알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르를 포함한다.

리포좀의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질로 이용된 것으로서, 천연 인지질 (예: 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질 (예: 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 보다 바람직하게는, 상기 레시틴은 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이다.

리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C12-22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 리포좀의 구성성분으로는 리피드인 DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine)와 Cholesterol, DSPE-mPEG-2000 (DSPE-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000])이 사용되었으며, 그 조성비는 DPPC : Cholesterol : DSPE-mPEG-2000 = 16 : 1 : 7의 비율로 사용하였다.

상기 리포좀은 페길화(PEGylation)된 것이 바람직하며, 50 내지 200 nm의 직경, 바람직하게는 100 내지 130nm의 직경을 갖는 것이 더욱 바람직하다. 리포좀은 상기 범위의 직경을 가질 경우에 혈류 보존 시간을 상승시키고, RES의 섭취를 최소화시킴으로써 우수한 종양 섭취량(tumor uptake)을 나타낼 수 있기 때문이다.

본 발명에서 상기 금속성 방사성 동위원소가 금속에 배위결합하여 형성된 킬레이트는 소수성 성질을 갖는 지방산 사슬로 인해 리포좀을 형성하는 인지질 이중층 내부에 삽입이 될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에서 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PET 조영제를 제공한다:

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

가장 바람직하게, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 6 내지 10으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PET 조영제를 제공한다:

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

상기 PET 조영제는 인체의 내부 부위(internal region)에 대한 이미징에 매우 유용하다. 이미징 과정은 사람에게 조영제의 진단학적 유효량을 투여한 다음 인체의 내부 부위(조직)의 가시적 이미지를 얻기 위하여 PET 이미징을 이용하여 인체를 스캐닝함으로써 이루어진다. 특히, 본 발명의 PET 조영제는 암 이미징에 유용하다.

본 발명의 PET 조영제는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조영제는 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 근육 내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수막강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두 개강내(intracranial) 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조영제의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 용어 "진단학적 유효량"은 인체의 PET 이미지를 얻는데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조영제를 이용하여 PET 미지를 얻는 방법은 종래의 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, PET 이미징 방법 및 장치는, 미국 특허 제6,151,377호, 제6,072,177호, 제5,900,636호, 제5,608,221호, 제5,532,489호, 제5,272,343호 및 제5,103,098호에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 PET 조영제는 체내 독성이 낮고 세포와 유사한 구조를 가지는 리포좀 기반의 영상 프로브를 이용한 것으로, 뛰어난 신호 대 백그라운드 비를 갖고 선명하게 종양을 진단할 수 있기 때문에 조기 진단 및 항암치료 효과 모니터링 등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 구리-64가 표지된 (Hexadecyl 4-((1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl)benzoate) 킬레이트의 Radio TLC 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 구리-64가 표지된 (Hexadecyl 2-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)acetate) 킬레이트의 Radio TLC 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 구리-64가 표지된 (Hexadecyl 3-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)propanoate) 킬레이트의 Radio TLC 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 구리-64가 표지된 (1-hexadecyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane) 킬레이트의 Radio TLC 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 구리-64가 표지된 (2,2'-(4-hexadecyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,8-diyl)diacetic acid) 킬레이트의 Radio TLC 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 방사선 동위원소가 표지된 리포좀을 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 7은 제조된 리포좀을 정제한 후 리포좀의 크기 및 구조를 나노입자분석기(왼쪽 도면)와 투과전자현미경(오른쪽 도면)을 이용하여 관찰한 결과이다.
도 8은 Cu- 64가 표지된 (Hexadecyl 4-((1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl)benzoate) 컨쥬게이트 리포좀의 생체분포를 확인한 결과이다.
도 9는 Cu-64가 표지된 (Hexadecyl 2-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)acetate) 컨쥬게이트 리포좀(왼쪽 도면) 및 Cu-64가 표지된 (1-hexadecyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane) 컨쥬게이트 리포좀의 PET 영상 결과(주입 후 24시간 째)를 나타난 도면이다.
도 10은 Cu-64가 표지된 (Hexadecyl 3-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)propanoate) 컨쥬게이트 리포좀의 PET 이미지 결과(주입 후 1시간, 4시간 및 24시간 째)를 나타낸 도면이다.
도 11은 Cu-64가 표지된 (2,2'-(4-hexadecyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,8-diyl)diacetic acid) 컨쥬게이트 리포좀의 생체분포를 주입 24시간 후에 확인한 결과이다.
도 12는 금속성 방사성 동위원소와 착화합물을 형성하는 새로운 구조의 킬레이트 및 이를 리포좀의 인지질 이중층에 표지하여 낮은 백그라운드를 보이며 선명하게 종양을 진단할 수 있는 영상 프로브의 모식도를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

금속성 방사성 동위원소 표지를 위한 킬레이트의 합성

<1-1> (Hexadecyl 4-((1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl)benzoate) 의 합성

20mL의 toluene에 cyclam (1 당량)과 hexadecyl 4-(bromomethyl)benzoate (0.25 당량)을 넣고 혼합하여, 무수의 K₂CO₃ (0.3 당량)을 추가한 후 그 혼합물을 16 시간 동안 환류시켜 주었다. 거기에 20 mL의 dichloromethane을 추가한 후 여과를 진행하였다. 여과된 합성물을 농축하는 방법을 이용한 건조를 진행한 후, 컬럼크로마토그래피로 정제해주었다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): d = 0.9 (t, 3H, J = 5.6 Hz), 1.27 (m, 22 H), 1.51-1.54 (m, 2H), 1.76-1.79 (m, 2H), 2.04-2.06 (m, 16 H), 2.22-2.66 (m, 6H), 3.50 (s, 2H), 4.32 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 7.41 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 8.01 (d, 2H, J = 6.4 Hz)

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): d = 14.13, 20.32, 21.12, 22.70, 26.05, 27.22, 29.31, 29.33, 29.71, 31.93, 49.43, 53.77, 58.69, 65.22, 68.95, 129.21, 129.53, 129.89, 129.92, 170.68

ESI MS: m/z calcd. for C₃₄H₆₂N₄O₂ [M+Na]+: 581.48; found: 581.32.

<1-2> (Hexadecyl 2-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)acetate) 의 합성

20mL의 toluene에 cyclam (1 당량)과 hexadecyl 2-bromoacetate(0.25 당량)을 넣고 혼합하여, 무수의 K₂CO₃ (0.3 당량)을 추가한 후 그 혼합물을 16 시간 동안 환류시켜 주었다. 거기에 20 mL의 dichloromethane을 추가한 후 여과를 진행하였다. 여과된 합성물을 농축하는 방법을 이용한 건조를 진행한 후, 컬럼크로마토그래피로 정제해주었다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): d = 0.87 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.28-1.32 (m, 26 H), 1.52-1.68 (m, 2H), 1.77-1.81 (m, 4H), 2.04-2.06 (m, 16 H), 2.77-2.82 (m, 16H), 4.17 (s, 2H, J = 7.0 Hz).

¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): d = 14.10, 22.67, 25.82, 27.74, 29.34, 29.47, 29.60, 29.63, 29.68, 31.91, 32.86, 40.25, 40.47, 48.35, 50.27, 62.68, 169.23.

<1-3> (Hexadecyl 3-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)propanoate)의 합성

20mL의 toluene에 cyclam (1 당량)과 hexadecyl 3-bromopropanoate(0.25 당량)을 넣고 혼합하여, 무수의 K₂CO₃ (0.3 당량)을 추가한 후 그 혼합물을 16 시간 동안 환류시켜 주었다. 거기에 20 mL의 dichloromethane을 추가한 후 여과를 진행하였다. 여과된 합성물을 농축하는 방법을 이용한 건조를 진행한 후, 컬럼크로마토그래피로 정제해주었다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): d = 0.89 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.26-1.32 (m, 26 H), 1.57-1.59 (m, 2H), 1.76-1.78 (m, 6H), 2.73-2.80 (m, 16H), 3.14 (t, 2H, J = 5.5 Hz), 4.03 (t, 2H, J = 7.0 Hz);

¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): d = 14.12, 22.67, 25.82, 28.43, 29.69, 31.92, 35.16, 39.02, 40.30, 49.01, 50.65, 53.46, 65.50, 171.40;

HR MS (FAB) calcd for C₂₉H₆₀N₄O₂ [M+H]+: 497.4795; found 497.4796.

<1-4> (1-hexadecyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane)의 합성

20mL의 toluene에 cyclam (1 당량)과 1-bromohexadecane(0.25 당량)을 넣고 혼합하여, 무수의 K₂CO₃ (0.3 당량)을 추가한 후 그 혼합물을 16 시간 동안 환류시켜 주었다. 거기에 20 mL의 dichloromethane을 추가한 후 여과를 진행하였다. 여과된 합성물을 농축하는 방법을 이용한 건조를 진행한 후, 컬럼크로마토그래피로 정제해주었다.

¹H NMR (500 MHz, CD₃OD): d = 0.93 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.32-1.35 (m, 28 H), 1.54-1.55 (m, 2H), 1.72-1.76 (m, 4H), 2.67-2.77 (m, 16 H), 3.54-3.57 (m, 3H);

¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): d = 13.17, 22.41, 25.64, 28.30, 29.16, 29.31, 29.44, 29.45, 29.48, 31.75, 32.36, 48.58, 50.38, 54.73

<1-5> (2,2'-(4-hexadecyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,8-diyl)diacetic acid) 의 합성

20mL의 toluene에 tert-butyl TE2A (1 당량)과 1-bromohexadecane(0.5 당량)을 넣고 혼합하여, 무수의 K2CO3 (0.3 당량)을 추가한 후 그 혼합물을 16 시간 동안 환류시켜 주었다. 거기에 20 mL의 dichloromethane을 추가한 후 여과를 진행하였다. 여과된 합성물을 농축하는 방법을 이용한 건조를 진행한 후, 컬럼크로마토그래피로 정제해주었다. 정제 과정 이후 얻어진 고체에 TFA/H2O (1:1, v/v)을 추가한 후 6 시간 동안 환류시켜 주었고, 이후 농축하는 방법을 이용하여 용액을 건조시켜 주었고 MeOH를 사용하여 재결정과정을 진행하여 흰색의 고체로 된 화합물을 얻었다.

¹H NMR (400 MHz, D₂O): d = 0.83 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.23-2.85 (s, 50H), 3.50 (s, 4H).

<실시예 2>

합성된 킬레이트를 활용한 금속 착물의 합성

상기 실시예 1에서 합성한 여러 가지 종류의 킬레이트와 ⁶⁴Cu의 혼합체를 형성하는 과정은 carrier를 첨가하지 않는 방법으로 0.01 N HCl에 용해된 ⁶⁴CuCl₂ (1 - 2 L, 300 Ci - 3.0 mCi)를 사용하여 진행하였다. 0.1 M ammonium acetate (pH = 8) 100 L에 MeOH에 용해된 킬레이트 10 g (Stock solution: 10 g/L)과 ⁶⁴CuCl₂를 넣고 80 C에서 30분간 반응을 진행하였다. 반응 후, ⁶⁴Cu의 혼합체가 잘 형성되었는지를 radio-TLC를 통하여 확인해주었다.

- 사용한 radio-TLC의 조건은 아래와 같다.

1) C-18(고정상) / MeOH:NH4OAc = 1:1 (이동상)

2) ITLC(고정상) / 50mM EDTA (이동상)

- 모든 킬레이트에서 95% 이상의 높은 수율로 구리-64 표지가 이루어짐을 각각의 Radio TLC 결과를 통하여 확인하였으며, 이에 대한 결과를 도 1 내지 도 5에 나타내었다.

<실시예 3>

방사성 구리-64가 표지된 리포좀 기반의 방사성 프로브 합성

리포좀의 구성성분으로는 리피드인 DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine)와 Cholesterol, DSPE-mPEG-2000 (DSPE-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000])이 사용되었으며, 그 조성비는 DPPC : Cholesterol : DSPE-mPEG-2000 = 16 : 1 : 7의 비율로 사용하였다.

리포좀을 합성하는 과정은 먼저 리포좀을 구성하는 성분들과 함께 앞서 표지 과정을 진행한 구리-64가 표지된 킬레이트가 함께 혼합된 Lipid solution을 Round flask에 넣고, evaporation 과정을 통하여 얇은막을 만들어준 후, 적당량의 Water를 이용해 상전이온도에서 Hydration 시켜주고, 이 후 준비된 리포좀을 60°C (water bath) 와 -4°C (냉장고)를 번갈아 3회 처리 한 후 1000nm, 400nm, 100nm의 membrane filter를 이용하여 Size extrusion 해주는 과정을 통해 적절한 크기의 리포좀을 합성해주었다(도 6).

합성되어진 리포좀은 PD-10 column을 이용하여 정제하는 과정을 진행해주었고, 리포좀의 크기 및 구조 확인은 Dynamic light scattering과 TEM을 통하여 측정하여 그 크기가 대략 100-130 nm 인 것을 확인할 수 있었다(도 7).

이와 같은 과정을 통하여 방사성 구리-64가 표지된 리포좀 기반의 방사성 프로브를 합성해줄 수 있었고 이를 활용하여 종양모델에 대한 생체분포확인 및 PET 영상 촬영 실험을 진행하였다.

<실시예 4>

리포좀 기반의 방사성 프로브에 대한 생체분포확인 및 PET 영상 결과

<4-1> 종양 동물 모델

BALB/c 마우스(6주령/Female)를 이용하여 종양 모델을 확립하여 리포좀의 종양 섭취 확인 실험을 수행하였다.

5×10⁶에 해당하는 CT26 세포를 RPMI-1640 배지에 희석시켜 6주령 된 BALB/C 마우스의 오른쪽 옆구리 부위에 피하 주사하고 적절한 크기로 자랐을 때에 맞춰서 실험에 사용하였다. 모든 생체분포확인 및 PET 영상 실험에는 CT26 종양 모델을 사용하여 실험을 진행하였고, 종양의 크기가 대략 0.7 cm 정도가 되었을 때에 맞춰 실험을 진행하였다.

꼬리 정맥을 통하여 앞서 합성한 방사성 구리-64가 표지된 리포좀 기반의 방사성 프로브를 주사하였고, 주사 후 4시간 또는 24시간에 맞추어서 생체분포 확인 실험 및 PET 영상 촬영을 진행하였다.

<4-2> ⁶⁴ Cu-(Hexadecyl 4-((1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl)benzoate) liposome에 대한 생체분포확인 결과

20μCi의 ⁶⁴Cu-(Hexadecyl 4-((1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl)benzoate) liposome을 주사한 후, 4시간과 24시간 후에 종양 모델의 각 장기를 얻어 여러 장기들에 대한 %ID/g에 대한 값을 확인하였다.

그 결과, 주사 후 4시간에서는 간, 신장, 비장과 같은 여러 장기들에 대한 섭취정도가 종양에 비해 상대적으로 높았지만 주사 후 24시간에서는 섭취정도가 급격히 감소하는 다른 장기들에 비하여 1.9 %ID/g으로 4시간에 대한 종양에 대한 섭취정도(%ID/g=2.3)로부터 서서히 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 8).

추후 다른 방사성 구리-64가 표지된 리포좀 기반의 방사성 프로브에 대하여서는 종양모델에 주사한 후 24시간 뒤에 PET 영상 실험을 진행하며 킬레이트의 구조에 따른 종양 섭취 정도 및 각 장기들에 대한 섭취정도를 비교해보았다.

<4-3> ⁶⁴ Cu-(Hexadecyl 2-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)acetate)-liposome과 64Cu-(1-hexadecyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane)-liposome에 대한 PET 영상 결과

⁶⁴Cu-(Hexadecyl 2-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)acetate)-liposome과 ⁶⁴Cu-(1-hexadecyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane)-liposome을 각각 준비하여 ~350μCi 정도를 CT26 종양모델에 주사한 후 24시간 뒤에 PET 영상 촬영을 진행하였다.

이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.

⁶⁴Cu-(Hexadecyl 2-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)acetate)-liposome의 경우 종양에 대한 섭취정도보다 간과 신장에 대한 섭취정도가 더욱 높은 것을 확인할 수 있었다. ⁶⁴Cu-(1-hexadecyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane)-liposome의 경우 종양에 대한 섭취정도가 간과 신장에 대한 섭취정도보다는 더욱 높은 것을 확인할 수 있었지만, 내장에 대한 높은 섭취정도가 보이며 신호 대 백그라운드 비가 비교적 높은 결과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

더구나 ⁶⁴Cu-(Hexadecyl 2-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)acetate)-liposome의 경우 주사한 후 24시간 뒤에 처음 주사한 activity의 7%가 체내에 남아있던 반면에 ⁶⁴Cu-(1-hexadecyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane)-liposome의 경우 주사한 후 24시간 뒤에 처음 주사한 activity의 22%가 체내에 남아있었고, 이러한 결과를 통하여 구리-64가 표지된 킬레이트의 구조에 따라 종양 섭취 정도 및 각 장기들에 대한 섭취 및 배출속도가 다른 것을 확인할 수 있었다.

<4-4> ⁶⁴ Cu-(Hexadecyl 3-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)propanoate)-liposome에 대한 PET 영상 결과

⁶⁴Cu-(Hexadecyl 3-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)propanoate)-liposome을 준비하여 ~220μCi 정도를 CT26 종양모델에 주사한 후 1시간, 4시간, 24시간에 맞춰 PET 영상 촬영을 진행하였다.

이에 대한 결과를 도 10에 나타내었다.

주사한 후 1시간, 4시간에는 간, 신장, 내장과 같은 장기에 높은 섭취정도를 보여 종양에 대한 섭취정도를 잘 확인할 수 없었지만, 주사한 후 24시간에 대한 결과를 확인해보았을 때 처음 주사한 activity의 8.5%가 체내에 남아 낮은 백그라운드를 보이며 선명하게 종양을 진단할 수 있는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 결과는 종양에 대한 섭취 정도는 상당히 천천히 감소하는 반면에 다른 장기들의 섭취정도가 시간이 지남에 따라 급격하게 감소되어지기 때문에 발생한 것으로 판단되었다.

앞선 결과와 마찬가지로 구리-64가 표지된 킬레이트의 구조에 따라 종양 섭취 정도 및 각 장기들에 대한 섭취 및 배출속도가 다른 것을 다시 한 번 더 확인할 수 있었고 ⁶⁴Cu-(Hexadecyl 3-(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)propanoate)-liposome과는 탄소사슬 하나의 구조 차이가 있을 뿐인데 그 결과가 많이 다르다는 것을 확인할 수 있었으며 킬레이트의 구조에서 Ester group (COO)의 유무 및 위치가 종양 섭취 및 체내배출속도에 큰 영향을 미치는 것으로 판단하였다.

<4-5> ⁶⁴ Cu-(2,2'-(4-hexadecyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,8-diyl)diacetic acid)-liposome에 대한 생체분포확인 결과

앞선 실험에 사용한 킬레이트들은 모두 Cyclam을 기반으로 하였는데, 보다 안정한 TE2A를 기반으로 한 HIB 유도체(TE2A-HIB hexadecyl)를 합성하였고, 구리-64를 표지하여 리포좀을 합성하는 과정을 진행한 후, 20μCi의 ⁶⁴Cu-(2,2'-(4-hexadecyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,8-diyl)diacetic acid)-liposome을 주사한 후, 24시간 후에 종양 모델의 각 장기를 얻어 여러 장기들에 대한 %ID/g에 대한 값을 확인해보았다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 주사 후 24시간에서 간, 비장과 같은 장기들에 대한 섭취정도가 종양에 비해 좀 더 높았지만 앞선 실험에 사용하였던 Cyclam을 기반으로 한 킬레이트(2 %ID/g 미만)보다는 종양에 대한 섭취정도(2.7 %ID/g)가 더 높은 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 통하여 구리-64가 표지된 킬레이트의 구조의 안정성도 마찬가지로 종양 섭취 정도 및 배출속도에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 PET 조영제는 체내 독성이 낮고 세포와 유사한 구조를 가지는 리포좀 기반의 영상 프로브를 이용한 것으로, 뛰어난 신호 대 백그라운드 비를 갖고 선명하게 종양을 진단할 수 있기 때문에 조기 진단 및 항암치료 효과 모니터링 등에 유용하게 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이미징 프로브로서 리포좀을 포함하는 PET 조영제:
[화학식 1]

상기 식에서,
R₁은 5환 또는 6환의 방향족 고리; 또는 C₁-₄의 알킬렌이고,
R₂는 -C(=O)O-; 또는 메틸렌이고,
n은 0 내지 2의 정수이고,
m은 5 내지 30의 정수이고,
상기 리간드는 DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DTPA(Diethylene triamine penta aeetic acid), DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid), NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA(1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid), TE3A(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid), TE2A(1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid), PCTA(3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid), 사이클렌(Cyclen), 사이클람(cyclam) 또는 DFO(Deferrioxamine)이고,
상기 X는 Cu-64(Ⅱ), Cu-67(Ⅱ), Ga-68(Ⅲ), Zr-89(Ⅳ), Y-86(Ⅲ), Y-90(Ⅲ), Lu-177(Ⅲ), Tc-99m(I~Ⅶ) 및 In-111(Ⅲ)로 이루어진 군에서 선택되는 금속성 방사성 동위원소로서, 상기 리간드에 배위결합되어 있다.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PET 조영제:
[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 6 내지 10으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PET 조영제:
[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]
제1항에 있어서, 상기 리포좀은 페길화(PEGylation)된 것을 특징으로 하는 PET 조영제.
제1항에 있어서, 상기 리포좀은 50 내지 200 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 PET 조영제.