JP6861643B2

JP6861643B2 - テキサフィリン−リン脂質複合体及びその調製方法

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Description

本発明は、テキサフィリン誘導体の分野に関し、より詳細には、テキサフィリン−リン脂質複合体ならびにその用途及び方法に関する。

ペンタアザシッフ塩基のマクロサイクルであるテキサフィリンは、ポルフィリン及び誘導体と強いが「拡張した」類似性を共有する。テキサフィリンは数十年前に発見され^［１］、様々な魅力的な固有の特性を示してきた。広い範囲の金属カチオン（特に三価ランタニド）との安定な１：１錯体を形成する実証された能力によって、癌の治療及び画像化においてテキサフィリンの用途が認められている^［２］。テキサフィリンは、組織透過性の７００〜９００ｎｍの範囲で強く吸収するので、外部の光子源を介したインビボ励起の特有の能力を提供する。これらの特性に加えて、テキサフィリンは、腫瘍に対する選択性を有するだけでなく、所定の組織において固有の選択的生体内局在性（ｂｉｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示す。

複合体化方法論を通じてテキサフィリンの有効性及び選択性を向上させるための努力がなされてきた。１つのそのような例は、癌の治療において白金薬物耐性を克服するための「担体」としてのテキサフィリンの使用であり^［３］、これは、ベンジル位での共有結合を介するテキサフィリンの白金薬物（すなわち、シスプラチン）に対する複合体化を含む。その上、親油性分子は、生物学的ベシクルに組み込むための努力の中でテキサフィリンと複合体化されてきた^［４］。

生物学的に活性な化合物のテキサフィリンに対する複合体化はいくつかの利点をもたらす：ｉ）テキサフィリンの固有の腫瘍選択性は所定の薬物の特定の毒性を低減し得る、ｉｉ）親水性単位の付加によりテキサフィリンの水溶解性に役立ち、それによりバイオアベイラビリティが増大し得る、及びｉｉｉ）テキサフィリンの標的部分への複合体化により標的組織における局在性及び蓄積を増大させ得る。新規なテキサフィリン複合体の探究は、癌の治療及び画像化に関連する用途において、テキサフィリンの実証された治療的に関連する特性を構築する道筋をもたらす。

一態様によれば、リン脂質のグリセロール部分に、一実施形態では脂質側鎖を介して、共有結合したテキサフィリン、テキサフィリン誘導体またはテキサフィリン類似体を含むテキサフィリン−リン脂質複合体が提供される。

更なる態様によれば、本明細書に記載のテキサフィリン−リン脂質複合体を含むナノ粒子が提供される。

更なる態様によれば、本明細書に記載のテキサフィリン−リン脂質複合体を調製するための方法が提供される。

更なる態様によれば、本明細書に記載のテキサフィリン−リン脂質複合体またはナノ粒子の光音響画像化、光力学療法、光熱療法または蛍光画像化のための使用が提供される。

本発明の実施形態は、以下の説明及び添付の図面を参照することによって最も良好に理解され得る。

遊離塩基のテキサフィリン−脂質複合体の特性評価を示している。Ａ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。Ｂ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。ルテチウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。ガドリニウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体９の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。鉄（ＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。コバルト（ＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。動的光散乱を介して得られた遊離塩基のナノテキサフィリンナノ粒子の体積分布を示している。Ａ．時間ゼロ（ナノ粒子形成の直後）でのＤＬＳサイズ分布。Ｂ．粒子の安定性及び完全性を実証する、ナノ粒子形成の４８時間後でのＤＬＳサイズ分布。動的光散乱を介して得られたガドリニウム−ナノテキサフィリンナノ粒子の体積サイズ分布を示している。Ｍｎ−ナノテキサフィリンのワンポット形成を示している。Ｔ１及びＴ２緩和の両方についての高磁場強度（７Ｔ）での溶液ベースのＭＲＩ評価を示している。それぞれ適合直線状回帰直線及び緩和値と共に、測定されたＲ１（１／Ｔ１）及びＲ２（１／Ｔ２）値の対応するプロットでの溶液中の様々な濃度のＭｎ−ナノテキサフィリンの定量的ａ）Ｔ１及びｂ）Ｔ２マップ、ｃ）２４時間及び４８時間の血清（５０％ＦＢＳ）におけるマンガンキレート安定性（ｎ＝５）、ｄ）Ｔ２緩和時間に基づく血清安定性。ＶＸ−２頭頸部腫瘍を有するウサギの腫瘍部位（上）及びリンパ節（下）のＴ１及びＴ２強調画像を示している。Ｍｎ−ナノテキサフィリン（８ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍＬ）を腫瘍領域の周囲に皮下注射した。２時間後、７Ｔ前臨床ＭＲ画像化システムでＴ１及びＴ２強調画像化を実施し、腫瘍部位から隣接するリンパ節へのリンパ排液の向上した視覚化を示している。表された図は、頭頸部領域の矢状断Ｔ１及びＴ２強調画像、腫瘍部位（上）及び頸部転移性ＬＮ（下）のＴ２注射前、Ｔ２注射後及びＴ１注射後を示している。Ｍｎ−ナノテキサフィリンの注射がリンパ排液を実証した後、明確なシグナル増強が検出された（黄色の矢印）。Ｍｎ−ナノテキサフィリン群と対照群との間の全ての血液試験について、対照マウスとＭｎ−ナノテキサフィリンの静脈注射後の血液試験パラメータ（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝５）、ｐ＞０．０５を示しており、Ｍｎ−ナノテキサフィリンの注射によって誘導される有意な変化はないことを示している。１０ｍｇｋｇ^−１のＭｎ−ナノテキサフィリン静脈注射の２４時間後またはＰＢＳ（対照）のマウスからの示された臓器の代表的なヘマトキシリン及びエオシンの染色切片を示している。スケールバー＝１００ｎｍ。テキサフィリン−リン脂質複合体キレート化ライブラリを示している。安定な１：１キレート化を有することが実証された元素を太字で表している。マンガン（ＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。Ｂ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。イットリウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。カドミウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。インジウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。ビスマス（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。サマリウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。ユーロピウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。テルビウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。ジスプロシウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。ホルミウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。エルビウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。ツリウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。イッテルビウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。レニウム（ＩＩＩ）−テキサフィリン錯体の特性評価を示している。Ａ．Ｍ＋Ｚ及び対応する断片化パターンを示す高解像度質量分析。Ｂ．フォトダイオードアレイスペクトル（２００〜８００ｎｍの範囲）。ＰＢＳにおいて記録された、動的光散乱プロファイルの遊離塩基及びＧｄ−ナノテキサフィリンを示している。

本発明は、新規な分子実体であるテキサフィリン−リン脂質の調製を記載する。以前は親油性分子がテキサフィリンに対して複合体化されていたが、本発明は合理的な合成アプローチを使用して新規な分類の化合物を示す。テキサフィリン−リン脂質合成は方策的に設計され、他の合成方法は、不成功の合成試験を通じて潜在的な道筋として排除された。

テキサフィリン−リン脂質複合体の合成のための一般的なスキームは、リン脂質に複合体化された中心的なフェニレンジアミンの形成に基づいており、これは、トリピランと反応した場合、遊離塩基のテキサフィリン−リン脂質複合体を容易に形成する。次いでこのコア部分は、様々な金属：Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｙ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｂｉ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、及びＬｕと既知の安定な１：１錯体を形成する潜在性を有する。

金属の選択に応じて、分子は特定の生物医学的用途のために微調整され得る。本発明は、全てのテキサフィリン−リン脂質構造、及びそれらの金属配位対応物を含む。

一態様によれば、リン脂質の脂質側鎖に共有結合したテキサフィリン、テキサフィリン誘導体またはテキサフィリン類似体を含むテキサフィリン−リン脂質複合体が提供される。

テキサフィリンは、ポルフィリンとして知られる複素環分子のサブクラスであり、以下の式Ｉに図示されるコア部分を有する。テキサフィリン分子の一部は、星の点に重ね合わせることができる形状を有する。本明細書で使用される場合、「テキサフィリン、テキサフィリン誘導体またはテキサフィリン類似体」は、式Ｉによって表されるコア部分を有する分子を指す。テキサフィリン、テキサフィリン誘導体またはテキサフィリン類似体の例は、米国特許第５，１６２，５０９号、第６，２０７，６６０号、第４，９３５，４９８号及び第６，３７５，９３０号に記載されており、それらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。

好ましい実施形態では、テキサフィリン、テキサフィリン誘導体またはテキサフィリン類似体は、ｓｎ−１またはｓｎ−２位でリン脂質の脂質側鎖に共有結合している。

本明細書で使用される場合、「リン脂質」は、リン酸基を有する親水性頭部基及び疎水性脂質尾部を有する脂質である。親水性頭部基及び疎水性脂質尾部は、グリセロール分子によって共に繋がっている。例示的なリン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルイノシトールが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、リン脂質は１２〜２２個の炭素のアシル側鎖を含む。

他の実施形態では、テキサフィリン、テキサフィリン誘導体またはテキサフィリン類似体は、０〜２０個の炭素の炭素鎖連結部によってリン脂質上のグリセロール基に対して複合体化している。

テキサフィリンのコア部分は、様々な金属との既知の安定な錯体を形成する潜在性を有する。テキサフィリン−リン脂質複合体が錯体形成する例示的な金属には、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｙ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌａ、Ｈｇ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、及びＬｕが含まれるがこれらに限定されない。

［ナノ粒子］
上述のテキサフィリン−リン脂質複合体を集合させてナノ粒子とすることができる。更なる態様によれば、このテキサフィリン−リン脂質複合体を含むナノ粒子が提供される。そのようなナノ粒子は、少なくとも１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５または１００モル％の複合体を含み得る。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ＰＥＧリン脂質、ＰＥＧ脂質、及び／またはＰＥＧ−ＤＳＰＥを更に含む。更なる実施形態では、これらのＰＥＧ、ＰＥＧ−脂質、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥは、約５モル％の量でナノ粒子に存在する。ナノ粒子の残りは、非複合体化リン脂質から構成され得る。

ナノ粒子は二重層ベシクルまたは単層ベシクルであり得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に球状であり、直径が約３ｎｍ〜約２００ｎｍである。より好ましい実施形態では、ナノベシクルは、実質的に球状であり、直径が約１００ｎｍ〜約１２０ｎｍである。

他の実施形態では、ナノ粒子は、その中に封入された活性剤を更に含む。好ましくは、活性剤は治療剤または診断剤である。より好ましくは、活性剤は、タキサンまたはドキソルビシンなどの（これらに限定されない）化学療法剤である。

「治療剤」という用語はその技術で認識されており、生物学的、生理学的、または薬理学的に活性な物質である任意の化学的部分を指す。「薬物」とも称される治療剤の例は、ＭｅｒｃｋＩｎｄｅｘ、ＰｈｙｓｉｃｉａｎｓＤｅｓｋＲｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓなどのよく知られた参考文献に記載されており、それらには、限定されないが、医薬、ビタミン、ミネラルサプリメント、疾患または病気の治療、予防、診断、治癒または緩和に使用される物質、身体の構造または機能に影響を及ぼす物質、または生理学的環境に置かれた後に生物学的に活性またはより活性になるプロドラッグが含まれる。対象に投与すると対象組成物から隣接する組織または体液に放出され得る様々な形態の治療剤が使用され得る。

「診断薬」または「診断剤」は、診断のために使用され得る任意の化学的部分である。例えば、診断剤には、インジウムまたはテクネチウムなどの放射性同位体を含有するものなどの画像化剤、ヨウ素またはガドリニウムを含有する造影剤、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＧＦＰ、アルカリホスファターゼ、またはβ−ガラクトシダーゼなどの酵素、ユーロピウム誘導体などの蛍光物質、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体などの発光性物質などが含まれる。

更に他の実施形態では、ナノ粒子は標的化分子を更に含む。好ましくは、標的化分子は抗体、ペプチドまたはアプタマーである。

「標的化分子」は、例えば、標的細胞の表面上の受容体または他の分子に結合することによって、特定の標的にナノベシクルを向かわせることができる任意の分子である。標的化分子は、タンパク質、ペプチド、核酸分子、糖類もしくは多糖類、受容体リガンドまたは他の小分子であり得る。特異性の程度は標的化分子の選択を介して調節され得る。例えば、抗体は典型的には高い特異性を示す。これらは、ポリクローナル、モノクローナル、フラグメント、リコンビナント、または単鎖であり得、それらの多くは商業的に利用可能であるかまたは標準的な技術を使用して容易に得られる。

［方法］
更なる態様によれば、上述のテキサフィリン−リン脂質複合体を調製する方法であって、好適な反応条件下で、

を、

と反応させて、

を生成することを含む、方法が提供される。任意に、化合物６、７、及び８を必要に応じて置換することができる。化合物６及び７を任意に置換して、化合物８、すなわち、米国特許第５，１６２，５０９号、第６，２０７，６６０号、第４，９３５，４９８号、及び第６，３７５，９３０号のいずれかに記載されているものを含む所望のテキサフィリン、テキサフィリン誘導体、またはテキサフィリン類似体を有するテキサフィリン−リン脂質複合体を生成することができる。

例えば、化合物６、７、及び８は、以下の一般式を有し得る。

Ｒ_７〜Ｒ_１０のうちの１つは、化合物６に関して上記で例示したようなリン脂質結合を有するであろう。Ｒ_７〜Ｒ_１０の残りは、独立して、Ｈ、アルキル基、ヘテロアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、ヘテロアルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環基、及びアシル基から選択され得る。好ましくは、リン脂質以外のＲ_７〜Ｒ_１０基は１〜４個の炭素を含む。

Ｒ_１〜Ｒ_６は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、またはＯＨ基、ＳＨ基、ヘテロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、もしくは複素環式基で置換されたアルキル基からなる群から選択される。例えば、Ｒ_１〜Ｒ_６は、水溶解性またはナノ粒子膜における有利な積層相互作用を改善するように選択され得る。好ましくは、アルキルは低級Ｃ_１〜４アルキルである。

ｎは整数、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。

化合物６及び８におけるリン脂質は、上述したものを含むがこれらに限定されない任意の好適なリン脂質と所望により置換され得る。

「基」という用語は、分子実体内の結合した原子の集合または単一原子を意味し、分子実体は、別個に区別可能な実体として識別可能な任意の構成的または同位体的に異なる原子、分子、イオン、イオン対、ラジカル、ラジカルイオン、錯体、配座異性体などである。特定の化学変換によって「形成される」場合の基の記載は、この化学変換がその基を含む分子実体を作製することに関与することを意味しない。

「有機基」という用語は少なくとも１つの炭素原子を含有する基を意味する。

「アルキル基」という用語は、アルカンの炭素から水素を除去することによって形成される基を意味し、アルカンは、全体として水素原子及び飽和炭素原子からなる非環状または環状化合物である。アルキル基は１つ以上の置換基を含み得る。

「ヘテロアルキル基」という用語は、ヘテロアルカンの炭素から水素を除去することによって形成される基を意味し、ヘテロアルカンは、全体として水素原子、飽和炭素原子、及び１つ以上のヘテロ原子からなる非環状または環状化合物である。ヘテロアルキル基は１つ以上の置換基を含み得る。

「アルケニル基」という用語は、アルケンの炭素から水素を除去することによって形成される基を意味し、アルケンは、全体として水素原子及び炭素原子からなり、且つ少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む非環状または環状化合物である。アルケニル基は１つ以上の置換基を含み得る。

「ヘテロアルケニル基」という用語は、ヘテロアルケンの炭素から水素を除去することによって形成される基を意味し、ヘテロアルケンは、全体として水素原子、炭素原子及び１つ以上のヘテロ原子からなり、且つ少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む非環状または環状化合物である。ヘテロアルケニル基は１つ以上の置換基を含み得る。

「アルキニル基」という用語は、アルキンの炭素から水素を除去することによって形成される基を意味し、アルキンは、全体として水素原子及び炭素原子からなり、且つ少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む非環状または環状化合物である。アルキニル基は１つ以上の置換基を含み得る。

「ヘテロアルキニル基」という用語は、ヘテロアルキンの炭素から水素を除去することによって形成される基を意味し、ヘテロアルキンは、全体として水素原子、炭素原子及び１つ以上のヘテロ原子からなり、且つ少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む非環状または環状化合物である。ヘテロアルキニル基は１つ以上の置換基を含み得る。

「アリール基」という用語は、芳香族炭化水素の環炭素原子から水素を除去することによって形成される基を意味する。アリール基は単環式または多環式であり得、１つ以上の置換基を含み得る。

「ヘテロアリール基」という用語は、アリール基における１つ以上のメチン（−Ｃ＝）及び／またはビニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）基をそれぞれ３価または２価のヘテロ原子で置換することによって形成される基を意味する。ヘテロアリール基は単環式または多環式であり得、１つ以上の置換基を含み得る。

「置換基」という用語は、分子実体における１つ以上の水素原子を置換する基を意味する。

「複素環式基」という用語は、その環（複数可）の構成物として少なくとも２つの異なる元素の原子を有する環状化合物から水素を除去することによって形成される基を意味する。

「アシル基」という用語は、オキソ酸から１つ以上のヒドロキシル基を除去することによって形成される基、すなわち、ＲＣＯ−を意味する。

更なる態様によれば、好適な条件下で、

を還元することによって、

を調製する方法が提供される。

上述のテキサフィリン−リン脂質複合体を調製する方法を追加的に実施する場合、化合物５及び６のいずれかを任意に必要に応じて置換して化合物８、すなわち、米国特許第５，１６２，５０９号、第６，２０７，６６０号、第４，９３５，４９８号、及び第６，３７５，９３０号のいずれかに記載されているものを含む所望のテキサフィリン、テキサフィリン誘導体、またはテキサフィリン類似体を有するテキサフィリン−リン脂質複合体を生成することができる。

したがって、化合物５は以下の一般式を有し得る。

Ｒ_７〜Ｒ_１０のうちの１つは、上記で例示したようなリン脂質結合を有するであろう。Ｒ_７〜Ｒ_１０の残りは上記の通りであり得る。

化合物５及び６におけるリン脂質は、上述したものを含むがこれらに限定されない任意の好適なリン脂質と所望により置換され得る。化合物６、すなわち、２−（（５−（３，４−ジアミノフェノキシ）ペンタノイル）オキシ）−３−（パルミトイルオキシ）プロピル（２−トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートはこの方法によって調製される。

更なる態様によれば、好適な反応条件下で、

を、

と反応させることによって、

を調製する方法が提供される。

上述の方法を追加的に実施する場合、化合物４を任意に必要に応じて置換して化合物８、すなわち、米国特許第５，１６２，５０９号、第６，２０７，６６０号、第４，９３５，４９８号、及び第６，３７５，９３０号のいずれかに記載されているものを含む所望のテキサフィリン、テキサフィリン誘導体またはテキサフィリン類似体を有するテキサフィリン−リン脂質複合体を生成することができる。

したがって、化合物４は以下の一般式を有し得る。

Ｒ_７〜Ｒ_１０のうちの１つはリン脂質が結合される連結部を含むであろう。Ｒ_７〜Ｒ_１０の残りは上記の通りであり得る。

前述のように、

は、所望により上述したものを含むがそれらに限定されない任意の好適なリン脂質で置換され得る。化合物５、すなわち、２−（（５−（３，４−ジニトロフェノキシ）ペンタノイル）オキシ）−３−（パルミトイルオキシ）プロピル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェートはこの方法によって調製される。

更なる態様によれば、テキサフィリン、テキサフィリン誘導体またはテキサフィリン類似体を合成する方法であって、上述のテキサフィリン−リン脂質複合体からテキサフィリン、テキサフィリン誘導体またはテキサフィリン類似体を開裂することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、上述の方法によって調製されたテキサフィリン−リン脂質複合体が開裂される。他の実施形態では、開裂は酵素を使用して実施される。好ましくは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／１６７３５０に記載されているような開裂酵素を使用する。

［使用］
更なる態様によれば、上述のテキサフィリン−リン脂質複合体またはナノ粒子の光音響画像化、光力学療法、光熱療法または蛍光画像化のための使用が提供される。

更なる態様によれば、上述のテキサフィリン−リン脂質複合体またはナノ粒子の磁気共鳴画像化のための使用が提供される。

以下の実施例は本発明の様々な態様の実例となるものであり、本明細書に開示された本発明の広い態様を限定するものではない。

テキサフィリン−リン脂質複合体の一般的な構築及び一般に好まれる金属イオンの取り込みを以下のスキームに図示する。テキサフィリン−脂質複合体の特性評価については図１を参照。

設計された合成経路は、可能性のある他の方策を排除し、リン脂質に対して複合体化した中心的なフェニレンジアミンを形成する必要性を回避するものであった。様々な条件及び合成方策において様々なリン脂質とのカップリング複合体化を試みるために、環外カルボキシレートを用いてテキサフィリンを形成する試みがなされた。この方策はテキサフィリン−リン脂質複合体の形成において効果的ではないことが明白に決定された。

本明細書に記載のテキサフィリン−リン脂質複合体は、様々なアルキル鎖長（ｎ＝１、２、３など）、分岐（−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＭｅなど）、不飽和、及び配置を有するリン脂質を含む。

［テキサフィリン−リン脂質複合体の合成スキーム］

エチル５−（３，４−ジニトロフェノキシ）ペンタノエート（３）：１５ｍＬの無水ＤＭＦ中の３，４−ジニトロフェノール（４．５８ｇ、２４．８７ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（５．１６ｇ、３７．３１ｍｍｏｌ）を反応容器に添加する。次に、０℃でエチル−５−ブロモバレレート（４．３３ｍＬ、２７．３６ｍｍｏｌ）を滴下して添加し、反応を６５℃で２４時間攪拌する。完了したら水（５０ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（３×３５ｍＬ）で抽出する。有機層を組み合わせ、水（３５ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×２５ｍＬ）、ブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して黄色固体として３を得る：７．２ｇ、収率９４％、^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ ８．０６（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．１２（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１１ − ４．１８（ｍ，４Ｈ），２．４１（ｔ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，２Ｈ），１．８０ − １．９５（ｍ，４Ｈ），１．２６ − １．３０（ｍ，３Ｈ）、^１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ １６３．０，１２７．５，１１７．０，１１０．７，６９．４，６０．５，３３．６，３２．０，２８．１，２３．５，２１．３，１４．２。

５−（３，４−ジニトロフェノキシ）ペンタン酸（４）：２０ｍＬの２：１ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ溶液中の３（５．６８ｇ、１８．１８ｍｍｏｌ）及び水酸化リチウム（８７０．９４ｍｇ、３６．３７ｍｍｏｌ）をＲＢＦに入れる。３時間後、溶媒を完全に除去し、水（１０ｍＬ）を残留物に添加する。次いで容器を氷浴に置き、１ＭのＨＣｌでｐＨ３に酸性化する。その後、混合物を酢酸エチル（３×２５ｍＬ）で抽出し、組み合わせ、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、淡黄色固体として４を得る：５．１７ｇ、定量、^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３） δ ８．０５（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．１２（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），２．４８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．０６（ｓ，１Ｈ），１．８２ − １．９８（ｍ，８Ｈ）。

２−（（５−（３，４−ジニトロフェノキシ）ペンタノイル）オキシ）−３−（パルミトイルオキシ）プロピル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（５）：１５ｍＬの無水ＣＨＣｌ_３中の４（４５０ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）、１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（７８４．７２ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１６５．５μＬ、０．９５ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（９６．７１ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、及びＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（６０７ｍｇ、３．１７ｍｍｏｌ）を反応容器に入れ、室温で２４時間攪拌する。完全な生成物転化の確認はＬＣＭＳ分析を使用して決定した。２４時間後、残留物を５０ｇのフラッシュクロマトグラフィシリカゲルカラムに直接添加し、初期グラジエントのメタノール：ジクロロメタン（０〜２５％、１０分で）、続いて第２グラジエントのクロロホルム：メタノール：水（３５：１４：１、１５分でアイソクラチック）を使用して精製し、淡黄色固体として６を得る：９６７．５ｍｇ、収率８０％。

２−（（５−（３，４−ジアミノフェノキシ）ペンタノイル）オキシ）−３−（パルミトイルオキシ）プロピル（２−トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（６）：１０ｍＬの無水メタノール中の５（６４１ｍｇ、０．８５９ｍｍｏｌ）及びパラジウム担持炭素（９１．５ｍｇ、８５．９μｍｏｌ）をＲＢＦに添加し、続いて濃ＨＣｌ（２１３．８μＬ、２．５８ｍｍｏｌ）を添加する。次いで反応容器を密封し、水素雰囲気で数回パージして、パラジウム触媒を活性化させる。完了したら反応容器を室温で３時間水素雰囲気下に置く。完了時に、ＬＣＭＳ分析によって確認し、混合物を濾過し、真空中で濃縮して、淡桃色固体として６を得る：６０２ｍｇ、収率９９％。

３−（パルミトイルオキシ）−２−（（５−（（１３，３３，３４，５３−テトラエチル−１４，５４−ジメチル−１２Ｈ，３１Ｈ，５２Ｈ−７，９−ジアザ−１，３，５（２，５）−トリピロラ−８（１，２）−ベンゼンアシクロデカファン−６，９−ジエン−８４−イル）オキシ）ペンタノイル）オキシ）プロピル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（８）：６ｍＬの無水メタノール中の７（２２６．７ｍｇ、０．５３８ｍｍｏｌ）及び６（３７７．５ｍｇ、０．５３８ｍｍｏｌ）を反応容器に添加し、続いて濃ＨＣｌ（８９．２μＬ、１．０８ｍｍｏｌ）を添加する。次いで反応容器を遮光しながら３０分間５０℃に加熱する。完了時に、溶媒を減圧下で完全に除去する。次いで残留物をヘキサン（５×１０ｍＬ）で洗浄し、疎水性の有色不純物を除去し、暗赤色固体として８を得る：５７３ｍｇ、収率９８％。

ガドリニウム（ＩＩＩ）錯体９（図３参照）：４ｍＬのメタノール中の８（３７．０ｍｇ、３４．０２μｍｏｌ）、酢酸ガドリニウム（ＩＩＩ）水和物（１２．５９ｍｇ、３５．７３μｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（４７．４３μＬ、３４０．２５μｍｏｌ）を反応容器に添加し、５０℃で３時間空気に開放して攪拌する。完了したら溶媒を完全に除去し、ヘキサン（３×１０ｍＬ）を残留物に添加し、淡桃色の不純物を除去して暗緑色固体として９を得る：３６．５０ｍｇ、収率７９％。

ルテニウム（ＩＩＩ）錯体（図２参照）：５ｍＬのメタノール中の８（２５．０ｍｇ、２３．００μｍｏｌ）、酢酸ルテニウム（ＩＩＩ）水和物（８．９３ｍｇ、２４．１４μｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（３２．０４μＬ、２２９．９０μｍｏｌ）を反応容器に添加し、５２℃で１．５時間空気に開放して攪拌する。完了したら溶媒を完全に除去し、ヘキサン（３×１０ｍＬ）を残留物に添加し、淡桃色の不純物を除去して暗緑色固体としてルテニウム（ＩＩＩ）錯体化テキサフィリン−脂質を得る：１９．８３ｍｇ、収率６３％。

鉄（ＩＩ）錯体（図４参照）：５ｍＬのメタノール中の８（１７．０ｍｇ、１５．６３μｍｏｌ）、酢酸鉄（ＩＩ）（３．１５ｍｇ、１６．４１μｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（２１．７９μＬ、１５６．３３μｍｏｌ）を反応容器に添加し、５２℃で１時間１５分空気に開放して攪拌する。完了したら溶媒を完全に除去し、ヘキサン（３×１０ｍＬ）を残留物に添加し、淡桃色の不純物を除去して暗緑色固体として鉄（ＩＩ）錯体化テキサフィリン−脂質を得る：１３．５ｍｇ、収率６９％。

コバルト（ＩＩ）錯体（図５参照）：５ｍＬのメタノール中の８（１５．０ｍｇ、１３．７９μｍｏｌ）、酢酸コバルト（ＩＩ）（２．８２ｍｇ、１４．４８μｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（１９．２３μＬ、１３７．９４μｍｏｌ）を反応容器に添加し、５２℃で４５分空気に開放して攪拌する。完了したら溶媒を完全に除去し、ヘキサン（３×１０ｍＬ）を残留物に添加し、淡桃色の不純物を除去して暗緑色固体としてコバルト（ＩＩ）錯体化テキサフィリン−脂質を得る：１４．１ｍｇ、収率８１％。

マンガン（ＩＩ）錯体、イットリウム（ＩＩＩ）錯体、カドミウム（ＩＩＩ）錯体、インジウム（ＩＩＩ）錯体、ビスマス（ＩＩＩ）錯体、サマリウム（ＩＩＩ）錯体、ユーロピウム（ＩＩＩ）錯体、テルビウム（ＩＩＩ）錯体、ジスプロシウム（ＩＩＩ）錯体、ホルミウム（ＩＩＩ）錯体、エルビウム（ＩＩＩ）錯体、ツリウム（ＩＩＩ）錯体、イッテルビウム（ＩＩＩ）錯体及びレニウム（ＩＩ）錯体の特性評価を図１４〜２７に示す。

［試みられた方策］
方法１の反応スキーム：

テキサフィリン−リン脂質複合体を得るための初期合成努力は、カルボジイミドのクロスカップリングを含むテキサフィリン及びリン脂質複合体化プロトコル用の先に報告された合成に基づいていた。テキサフィリンは、ベンジル脱保護及びその後のホルミル化を介して１から形成される中心的なトリピラン（３）中間体を必要とする合成を介して先に報告されている。合成プロトコルは１から３への調製の点で異なる。主な方策はフェニル部分に由来するカルボキシレート基を有するテキサフィリンを開発することであった。次いで、この中心的な中間体から、脂質上の遊離ヒドロキシル部位を使用して様々なリン脂質が複合体化するであろう。この方策は、様々なリン脂質をテキサフィリン部分に対して複合体化させることを可能にし、化合物の大きなライブラリを発生させる経路をもたらすので、非常に望ましいものであった。第２に、ポルフィリンのテキサフィリン（「拡張ポルフィリン」と見なされる）に対する構造的類似性に起因して、各々のマクロサイクルの反応性は比較的類似しているであろうと我々は予想した。リン脂質のポルフィリンへのカルボジイミド媒介複合体化を実証する先の報告に起因して、この方策をテキサフィリン−リン脂質複合体化に採用した。

３，４−ジアミノ安息香酸をトリピラン３と反応させて、芳香族カルボキシレートテキサフィリン５を得た。その後、ガドリニウム（ＩＩＩ）をテキサフィリンマクロサイクルに中心的に配位させ、これにより、一般的に好まれるリン脂質である１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（リゾ−ＰＣ）とのカップリングする６試みがなされた。カルボジイミド（ＥＤＣ、ＤＣＣなど）及び反応条件（溶媒、温度、ｐＨ）の調節にもかかわらず、所望のテキサフィリン−リン脂質複合体７への転化は不成功であった。中心に配位された金属がリン脂質結合を妨げたかどうかを決定しようとする努力の中で、遊離塩基のテキサフィリン５とリゾ−ＰＣとの間での複合体化の試みが行われた。先に観察されたように、標的複合体化生成物への転化は得られなかった。

方法２の反応スキーム：

これらの先の知見に基づいて、芳香族カルボキシレートが失活され、これによりカルボジイミド媒介複合体化における効果のないカップリングパートナーとなり得るという仮説が立てられた。これを回避するために、アルキルカルボキシレートがカルボジイミド媒介カップリングプロセスのためのより理想的なカップリングパートナーとして作用し得るという仮説が立てられた。これが効果的な方策であるかどうかを試験するために、メチレン単位を３，４−ジニトロフェノールとブロモ酢酸エチルとの間のエーテル結合を介して導入し、その後の加水分解及び還元によって候補のアルキルカルボキシレート誘導体である２−（３，４−ジアミノフェノキシ）酢酸を得た。記載された先の方法を使用して、アルキルカルボキシレートテキサフィリンを、その対応するＧｄ（ＩＩＩ）中心配位対応物と共に合成した。カルボジイミド媒介カップリングを使用して、これらの「アルキルカルボキシレートテキサフィリン」をホスホコリンと複合体化させる試みがなされた。

様々な条件及びカップリング試薬にもかかわらず、リン脂質のアルキルカルボキシレートテキサフィリンへの結合は得られなかった。

方法３の反応スキーム：

追加的なアプローチを探究して、いくつかの置換基及びリン脂質複合体化の成功への潜在的効果を調査した。リン脂質複合体化のためにアミド分岐テキサフィリンを使用することを含む方策を採用した。費用対効果の高い試薬である３，４−ジアミノ安息香酸を使用して、ジ−ｂｏｃ保護及びその後のペプチド結合によりトリ−ｂｏｃ保護中間体を得た。ＴＦＡの存在下での三重脱保護は、所望の部分を定量的収率で遊離させ、これによりトリピラン３との反応により遊離塩基のアミド分岐カルボキシレートテキサフィリンを得た。金属（ＩＩＩ）の配位は、上記の条件を使用して効果的に達成され、優れた収率で配位金属（ＩＩＩ）−テキサフィリン＃を得た。リン脂質とのカルボジイミド媒介複合体化を使用して、遊離塩基のテキサフィリン及び金属（ＩＩＩ）配位テキサフィリンの両方を複合体化させる試みを我々は行った。様々な条件及び合成プロトコルを採用したにもかかわらず、反応トライアルのいずれにおいても標的のテキサフィリン−リン脂質複合体は得られなかった。このことは、カルボキシレートテキサフィリンが、リン脂質とのカルボジイミド媒介複合体化において好適な基質ではなく、別の方策への調査が必要になるという見解を明らかにした。

方法４の反応スキーム：

カルボキシレートテキサフィリンとリン脂質との間のカルボジイミド媒介結合の失敗の後、第２級ヒドロキシルとカルボキシレートとの間の結合形成について他の方策を調査した。光延反応はよく知られており特性化され、エステル形成及び立体化学の反転において非常に効果的な経路を示す。文献を通してこのプロトコルの強力な成功を考慮して、それはカルボキシレートテキサフィリン中間体ならびに別のマクロサイクルであるピロフェオホルビドＡで試みられた。第２のマクロサイクルは、ポルフィリンベースのものであり、テキサフィリン（「拡張ポルフィリン」とも称される）との顕著な類似性を共有する。この第２のマクロサイクルは、ポルフィリンベースのマクロサイクルがテキサフィリンマクロサイクルと同様に挙動したかどうか、及びマクロサイクル部分が先に試みられた複合体化プロトコルにおける成功または失敗の原因であるかどうかを決定するためのテンプレートとして使用された。両方のマクロサイクルテンプレートについて光延条件を使用して多数の合成トライアルを試みたが、いかなるシナリオにおいても標的のリン脂質複合体への転化は得られなかった。カルボキシレートテキサフィリンとのリン脂質複合体化が効果的でない合成経路であるという発見に導かれ、この問題を回避するために、テキサフィリン部分を発生させる前に、まずリン脂質をジアミノ構築ブロックに結合させることが必要である。

［金属テキサフィリン脂質複合体の自己組織化］
両親媒性分子は、疎水性表面の互いの相互作用、及び水面に対する親水性部分との相互作用に起因する所定の条件下での自己組織化を受けることが実証されている。テキサフィリン−脂質複合体の構造は、本質的に、大きな親水性マクロサイクル頭部、及び長い疎水性脂肪酸鎖を有する両親媒性の双性イオン性分子である。自己組織化の原理の知識を考慮し、これをテキサフィリン−脂質複合体の特徴に適用すると、理想的な条件下で、遊離塩基のテキサフィリン−脂質及び金属−テキサフィリン脂質複合体が自己組織化を受けて繰り返し単位のナノ構造を形成するであろうということが予測された。遊離塩基のテキサフィリン−脂質及び金属−テキサフィリン脂質複合体の両方が適切な条件で容易に自己組織化することができ、１００〜１２０ｎｍの範囲の直径を有するナノ粒子を生成すると共に、単分散性を示すことが実証された（図６参照）。

迅速なクリアランス及び代謝ならびに低い腫瘍蓄積などの遊離薬物の投与に関連する障壁を克服するために、ナノ粒子が送達ビヒクルとして使用されてきた。固形腫瘍は、不規則で漏れやすい脈管構造及び貧弱なリンパ排液を特徴とし、ナノ粒子が優先的に送達されて腫瘍内に保持されることが可能である。疎水性分子の場合、これらの薬物の装填は、その薬物のベシクルの膜に対する制限のために著しく制約されてきた。ポルフィリン脂質で完全に構成された（１００ｎｍのナノ粒子当たり８０，０００のポルフィリン）ポルフィソームナノベシクルは、伝統的な送達ビヒクルの制限された装填容量能力を克服している^［５］。各々のナノ粒子中でのポルフィリンの高密度の充填は、光音響画像化、光力学療法及び活性化可能な蛍光画像化における用途でこれまでにない光子特性をもたらした（図１）。これにより固有のマルチモーダルな光子特性を有する第１の全有機ナノ粒子を導入した。また、放射性銅６４または常磁性マンガンなどの金属イオンを、これらの構築ブロックに直接組み込んで、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）及び磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）におけるそれらの潜在的用途を切り開き得る。ポルフィソームの基盤及びポルフィリンとテキサフィリンとの間の構造的類似性に基づいて、遊離塩基及び金属テキサフィリン−リン脂質複合体のナノテキサフィリン（ナノ粒子当たり８００００を超えるテキサフィリン−リン脂質を有する）への自己組織化は、両方の画像化目的及び治療用途にとって活性を著しく向上させるであろう。ナノテキサフィリンの構築物は、１）各々のナノ粒子中の高い装填量のテキサフィリンを送達する、２）インビボ循環時間を延長する、及び３）全体的な腫瘍蓄積を増加させることによっていくつかの現在の障害を克服する。

考えられる計画の例は、ガドリニウム−テキサフィリンリン脂質ナノテキサフィリンであろう。ガドリニウム−ナノテキサフィリンナノ粒子のサイズ分布についての図７、及び動的光散乱プロファイルについての図２８を参照。ガドリニウム−ナノテキサフィリンナノ粒子の物理的特徴を以下の表１に列挙する。

Ｇｄ−テキサフィリンの固有のＭＲ特性は、腫瘍及びインビボクリアランスにおけるＧｄ−テキサフィリンの分布を非侵襲的に監視するために使用され得る。より大きな放射向上及びＭＲＩ造影向上の両方が、遊離Ｇｄ−テキサフィリンで実証され、Ｇｄ−テキサフィリンが多くの異なる癌タイプの臨床プラクティスに入る道筋を提供するであろうと我々は予想している。更に、ナノテキサフィリンの開発は、多くの臨床的画像化及び治療機会を切り開くであろう。ナノテキサフィリン中のテキサフィリン構築ブロックの５−配位により、幅広い医療用放射性同位体（例えば、^９０Ｙ、^１１１Ｉｎ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^２１３Ｂｉなど）の安定したキレート化が可能になり、それ故、このナノテクノロジーを核医学用途（ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ画像化、小線源治療及びアルファ治療など）の全領域に参入させることができるであろう。

［ＭＮ−ナノテキサフィリンのＭＲＩ能力］
Ｍｎ−ナノテキサフィリンのワンポット形成（図８参照）：１０ｍＬの無水ＭｅＯＨ中の遊離塩基のテキサフィリン−リン脂質複合体（６０ｍｇ、５５．１８μｍｏｌ）及びＭｎ（ＯＡｃ）_２・（Ｈ_２Ｏ）_４（１３．５２ｍｇ、５５．１８μｍｏｌ）を反応容器に添加し、０℃に冷却する。次に、トリエチルアミン（７６．７１μＬ、５５１．７５μｍｏｌ）を添加することにより、明るい赤から濃緑への即時の色変化によってＭｎの即座のキレート化が観察される。コレステロール（１４．８３ｍｇ、４０ｍｏｌ％）及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−２ＫＰＥＧ、１３．４６ｍｇ、５ｍｏｌ％）を導入し、溶媒を高真空下で溶媒を除去すると、フィルムが形成される。フィルムをＰＢＳ（３０ｍＬ）で再水和化し、凍結融解サイクル（８）に付し、７５℃で１００ｎｍのポリカーボネート膜で押し出した。Ｍｎ−ナノテキサフィリンのサイズは、ＮａｎｏｓｉｚｅｒＺＳ９０（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて特性化された。ＴＥＭ画像は、２００ｋＶの加速電圧（及び１５００００倍の倍率）を有するＦＥＩＴｅｃｈｎａｉ２０顕微鏡を使用して収集した。試料をカーボン被覆銅グリッド上に沈着させ、２％酢酸ウラニル染色剤と共にインキュベートして画像造影を誘導した。Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ蛍光光度計（ＨｏｒｉｂａＪｏｂｉｎＹｖｏｎ）を使用して、Ｍｎ−ナノテキサフィリンの蛍光消光を特性化した。ＰＢＳ（完全粒子）及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ナノ構造破壊試料）を有するＰＢＳ中のＭｎ−ナノテキサフィリン溶液をそれぞれ４６０ｎｍで励起し、蛍光発光スペクトルを６００〜８００ｎｍで収集した。発光ピーク下の面積を積分し、完全な及び解離したナノ粒子からの値を比較した。

実施例１
メタロ−テキサフィリンライブラリのナノアセンブリは、マンガン（Ｍｎ）−テキサフィリン−リン脂質構築ブロックの合成から開始した。常磁性のＭｎは、組織のＴ１及びＴ２両方の緩和時間定数の大幅な低下を引き起こす強力な磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）造影剤である。（ｉ）インビボ安定性；（ｉｉ）安全性；及び（ｉｉｉ）造影向上についてＭｎ送達を改善するための多くのキレート化方策が開発されてきた。ポルフィリンは、Ｍｎ用の有望なキレート化マクロサイクルとして使用されており^［１０］、主にＴ_１の観点から、有効な造影向上を有する一方で、インビボで極めて安定な錯体を提供する^［１１］。従来のポルフィリン（４−配位状態）と比較して、テキサフィリンのより大きな構築及びより強い配位（５−配位状態）により、安定性及び緩和性の改善などの新しい特性を有するより安定なＭｎベースのキレート化を導き得る。

実施例２
Ｍｎ−ナノテキサフィリンを７Ｔの磁場強度で評価した。縦緩和（ｒ_１）及び横緩和（ｒ_２）は、Ｍｎ−テキサフィリン−リン脂質濃度に対して緩和時間の逆数をプロットすることによって決定した（図９）。完全Ｍｎ−ナノテキサフィリンは、Ｔ１及びＴ２強調画像の両方において用量依存的増加を示し、ポジティブ（Ｔ１）及びネガティブ（Ｔ２）の造影向上の際立った増大が観察された。完全Ｍｎ−ナノテキサフィリンについて、計算された０．８１ｍＭ^−１ｓ^−１のｒ_１が決定された（図９ａ）。ホスファチジルコリンヘッドグループから構成される直径１００ｎｍのベシクルについての幾何学的計算は、ナノテキサフィリン当たりおおよそ８×１０^４のテキサフィリン複合体があることを示している。我々のＭｎ−ナノテキサフィリン中の各々のテキサフィリンは安定な１：１キレート化から構成されているので、これはおよそ８×１０^４のＭｎ（ＩＩ）イオンを有する各々のＭｎ−ナノテキサフィリンと同等である（ナノ粒子当たり６．４８×１０^４ｍＭ^−１ｓ^−１のｒ_１）。０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳにおいてＭｎ−ナノテキサフィリンを個々のモノマーに解離させた後、計算された０．９９ｍＭ^−１ｓ^−１のｒ_１が確立され、自己組織化構築物と比較して２２％の向上を示した。各々の個々のナノ粒子へのＭｎ（ＩＩ）の高装填は、透過性及び保持効果の向上による新生物組織への送達及び選択性の向上に結びつき^［１２］、個々のモノマーの使用によって達成できない利点をもたらし得る。

Ｍｎ−テキサフィリンの横緩和特性も評価し、対応する解離した個々のモノマーと比較した。完全Ｍｎ−ナノテキサフィリンは、７Ｔで１３．５９ｍＭ^−１ｓ^−１のｒ_２を示した。前述したのと同じ幾何学的計算に続いて、直径１００ｎｍの各々のＭｎ−ナノテキサフィリンは１．０９×１０^６ｍＭ^−１ｓ^−１のｒ_２を有する。Ｍｎ−ナノテキサフィリンを個々のモノマーに解離させると、計算された８．２０ｍＭ^−１ｓ^−１のｒ_２となり、完全Ｍｎ−ナノテキサフィリンから６０％減少する。これは、粒子サイズの増加がｒ_２の増加につながるという先の報告に従うものである^［１３］。その効果は、粒子サイズの増加に伴う相対的飽和磁化の増大、フェライト及び鉄ベースのナノ粒子で実証された相関関係によっておそらく引き起こされる^［１４］。

Ｍｎ−ナノテキサフィリンは、ウシ胎子血清（ＦＢＳ）の存在下でＭｎに対する安定なキレート化を維持することができた。安定性はｕＰＬＣ−ＭＳによって評価され、ｕＰＬＣ−ＭＳは、吸収スペクトル及び質量分析によって、遊離塩基のテキサフィリン−リン脂質とＭｎ−テキサフィリン−リン脂質との間の明らかな区別を可能とする。ナノテキサフィリンに対するＭｎ−キレート化の安定性は、５０％ＦＢＳにおいて２４時間後及び４８時間後にそれぞれ９９．５±０．８％及び９８．８±０．８％であり、それ故、テキサフィリンマクロサイクルキレート剤に対するＭｎの強い親和性を実証した（図９ｃ）。Ｍｎ配位は金属イオンをキレート化する場合に完全に芳香族になるために「ｓｐ^３−テキサフィリン」を引き起こすので、芳香族性の熱力学的な好ましさは、テキサフィリンのＭｎに対する強い親和性及びＭｎ解離に対する回復性に寄与し得る。血清におけるＭｎ−ナノテキサフィリンの構造的安定性はＴ２強調画像によって評価し、この場合、構造的分解は、前述したように、Ｒ_２値の低下により確認することができる。００２０

５０％ＦＢＳ中のＭｎ−ナノテキサフィリンは、４８時間までの間、Ｒ_２の顕著な減少はなく、構造安定性を有することが示された（図９ｄ）。代わりに、（ＰＢＳ中の試料と比較して）Ｒ_２のわずかな初期増加がＦＢＳの存在下で観察され、このことは、Ｍｎ−ナノテキサフィリン粒子がタンパク質コロナを形成し得、より大きな粒子サイズで相対的飽和磁化を増大させることを示す。

０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、計算された０．９９ｍＭ^−１ｓ^−１のｒ_１が確立され、自己組織化構築物と比較して２２％の向上を示した。各々の個々のナノ粒子へのＭｎ（ＩＩ）の高装填は、透過性及び保持効果の向上による腫瘍性組織への送達及び選択性の向上に結びつき^［８］、個々のモノマーの使用によって達成できない利点をもたらし得る。

Ｍｎ−テキサフィリンの横緩和特性も評価し、対応する解離した個々のモノマーと比較した。完全Ｍｎ−ナノテキサフィリンは、７Ｔで１３．５９ｍＭ^−１ｓ^−１のｒ_２を示した。前述したのと同じ幾何学的計算に続いて、直径１００ｎｍの各々のＭｎ−ナノテキサフィリンは１．０９×１０^６ｍＭ^−１ｓ^−１のｒ_２を有する。Ｍｎ−ナノテキサフィリンを個々のモノマーに解離させると、計算された８．２０ｍＭ^−１ｓ^−１のｒ_２となり、完全Ｍｎ−ナノテキサフィリンから６０％減少する。これは、粒子サイズの増加がｒ_２の増加につながるという先の報告に従うものである^［９］。その効果は、粒子サイズの増加に伴う相対的飽和磁化の増大、フェライト及び鉄ベースのナノ粒子で実証された相関関係によっておそらく引き起こされる^［１０］。

Ｍｎ−ナノテキサフィリンは、ウシ胎子血清（ＦＢＳ）の存在下でＭｎに対する安定なキレート化を維持することができた。安定性はｕＰＬＣ−ＭＳによって評価され、ｕＰＬＣ−ＭＳは、吸収及び質量スペクトルによって、遊離塩基のテキサフィリン−リン脂質とＭｎ−テキサフィリン−リン脂質との間の明らかな区別を可能とする。ナノテキサフィリンに対するＭｎ−キレート化の安定性は、５０％ＦＢＳにおいて２４時間後及び４８時間後にそれぞれ９９．５±０．８％及び９８．８±０．８％であり、それ故、テキサフィリンマクロサイクルキレート剤に対するＭｎの強い親和性を実証した（図９ｃ）。Ｍｎ配位は金属イオンをキレート化する場合に完全に芳香族になるために「ｓｐ^３−テキサフィリン」を引き起こすので、芳香族性の熱力学的な好ましさは、テキサフィリンのＭｎに対する強い親和性及びＭｎ解離に対する回復性に寄与し得る。血清におけるＭｎ−ナノテキサフィリンの構造的安定性はＴ２強調画像によって評価し、この場合、構造的分解は、前述したように、Ｒ_２値の低下により確認することができる。

頸部リンパ節転移を伴うＶＸ−２頭頸部腫瘍を有するウサギを使用してセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）における薬剤の蓄積に依存するリンパシンチグラフィ手順で、造影を向上する能力についてＭｎ−ナノテキサフィリンを評価した。腫瘍部位の近位のＭｎ−ナノテキサフィリンの皮下注射を、腫瘍部位からのリンパ排液の視覚的向上を補助するその能力について評価した。Ｍｎ−ナノテキサフィリンの注射の２時間後のＴ１及びＴ２強調画像は、腫瘍部位から隣接する転移性リンパ節へのリンパ排液の視覚化の向上を示した（図１０）。概念実証として、その画像は、Ｍｎ−ナノテキサフィリンが注射部位からリンパ節に向かって排液するように見えるという見解を支持しており、それによりこの領域における造影向上を提供している。更に、また概念実証であるが、これらの結果は、ＳＬＮ生検手順のためのＭＲＩ造影剤としてのインビボ画像化のためのＭｎ−ナノテキサフィリンの潜在的な実用性を強調するものである。

毒性試験ではＭｎ−ナノテキサフィリンの安全性を評価し、潜在的な急性毒性作用を調査した（図１１）。健常雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に高用量（１０ｍｇｋｇ^−１）のＭｎ−ナノテキサフィリンを注射した。注射の２４時間後、マウスを屠殺し、心臓穿刺により血液を採取した。同じ年齢及び性別のマウスの対照群から血液を採取し、試験したパラメータ用の標準として使用した。我々はまた、高用量のＭｎ−ナノテキサフィリンでの処置は、診断上重要な肝臓酵素のレベルに影響を与えないことを実証した。赤血球の数及びヘムレベルは有意に変化せず、内因性ポルフィリンの影響を受けない生理的調節を実証した。白血球数の無変化は、Ｍｎ−ナノテキサフィリンが急性期において非免疫原性であることを示す。対照群及び実験群の動物からの主要臓器を採取し、組織病理学的分析（図１２）のために送付し、Ｍｎ−ナノテキサフィリンが注射の２４時間後に急性毒性作用を示さないことを更に実証した。

テキサフィリン−リン脂質複合体との金属キレート化の多様性を実証するために、１７種の金属−テキサフィリン−リン脂質複合体を合成した（図１３）。金属−テキサフィリン−複合体の多様なライブラリは、それらの独自の特有の固有の特性及びその後の放射線療法、放射線増感、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴ画像化、ＭＲＩ、光線力学療法、及び蛍光画像化における用途をそれぞれ有する。その上、これらの金属−テキサフィリン−リン脂質を組み合わせて、多官能性を有する混合ナノテキサフィリンを作り出すことができる。

［ＭＮ−ナノテキサフィリンの評価］
キレート化安定性：ＰＢＳ中のＭｎ−テキサフィリン−リン脂質をＦＢＳと１：１で混合し、３７℃でインキュベートした。０、２４及び４８時間で、少量のアリコートを使用してキレート安定性を評価した。Ｍｎ−キレート化の割合は、ｕＰＬＣ−ＭＳ分析による遊離塩基のテキサフィリンリン脂質及びＭｎ−テキサフィリン−リン脂質のピークの積分によって計算した。

Ｍｎ−ナノテキサフィリンのサイズ及び形状の特性評価：ＭａｌｖｅｒｎＮａｎｏｓｉｚｅｒＺＳ９０（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してＭｎ−ナノテキサフィリンのサイズを測定した。Ｍｎ−ナノテキサフィリン溶液をＰＢＳ中に希釈し、１５回の実行でそれぞれ３回の測定を実施し、結果を平均した。グロー放電した炭素被覆グリッド上に２分間０．０５ｍｇ／ｍＬのＭｎ−ナノテキサフィリン（５％のＰＥＧ−脂質、５５％のＭｎ−テキサフィリン−リン脂質、及び４０％のコレステロール）をインキュベートし、ミリＱ水で３回リンスし、２％酢酸ウラニルで染色することによって電子顕微鏡試料を調製した。次いで、試料を２００ｋＶで動作するＴｅｃｎａｉＦ２０電子顕微鏡（ＦＥＩＣｏｍｐａｎｙ）で視覚化し、画像をＴｉｅｔｚＦ１１４ＣＣＤ（ＴＶＩＰＳ）で記録した。

Ｔ２評価による血清安定性：Ｍｎ−ナノテキサフィリン（０．３５ｍＭ）を３７℃で５０％ＦＢＳ（１ｍＬの全体積）中でインキュベートし、１．５Ｔリラキソメータ（Ｍｉｎｉｓｐｅｃ、Ｂｒｕｋｅｒ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で特定の時間間隔でＴ２測定を行った。

インビトロ緩和性：インビトロでの測定のために、Ｂｒｕｋｅｒ製品のＢ−ＧＡ１２勾配コイル挿入物及び７．２ｃｍの内径の直線偏円筒状ＲＦボリュームコイルをＢｉｏｓｐｅｃに装備した。局在化及びチューニング後、０．２５ｍｍの面内解像度、１８０×１２８のマトリックス、４５×３２ｍｍの視野、及び３ｍｍのスライス厚を含む垂直配向Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管（４００ｐｌ）内で、一致する幾何学的特徴を有する冠状断のＴ１及びＴ２マップを試料から取得した。Ｔ１マッピングは、可変反復時間スピンエコー技術（エコー時間９．１ｍｓ、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２５００及び４０００ｍｓの８回の反復時間、スキャン時間８分２９秒）を使用した。Ｔ２マッピングは、マルチエコースピンエコー技術（１０〜４８０ｍｓの範囲の４８エコー時間、リフォーカス間隔１０ｍｓ、反復時間６０００ｍｓ、スキャン時間９分３６秒）を使用した。

インビボＭＲＩ：全ての動物は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｅａｌｔｈＮｅｔｗｏｒｋ（ＵＨＮ）ＡｎｉｍａｌＣａｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ、オンタリオ州のＡｎｉｍａｌｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈＡｃｔ、及びＣａｎａｄｉａｎＣｏｕｎｃｉｌｏｎＡｎｉｍａｌＣａｒｅによって策定された方針に従って人間のケアを受けた。全ての動物研究はＵＨＮＡｎｉｍａｌＣａｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅプロトコルによって承認されている。２．０〜３．５ｋｇの体重の雄のニュージーランド白ウサギ（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）に３００μＬのＶＸ−２腫瘍細胞懸濁液（５×１０６／ｍＬ）を注射して、腫瘍を頬筋に誘導した。腫瘍はＶＸ−２細胞の注射部位に形成され、全てのウサギは接種後２週間で少なくとも１つの頸部リンパ節転移を示した。ＣＴ画像によって確認されたリンパ節転移を有する一匹のウサギに１．５ｍＬの８ｍｇ／ｍＬのＭｎ−ナノテキサフィリンを腫瘍領域の周囲の皮下に注射した（テクネチウム−９９を使用する歩哨リンパ節生検（ＳＬＮＢ）手順と同様）。２時間の注射の後、７Ｔｅｓｌａ前臨床ＭＲ画像化システム（Ｂｉｏｓｐｅｃ、Ｂｒｕｋｅｒ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でＭＲＩを実施した。ウサギ画像については、画像化はＢｒｕｋｅｒ製品のＢ−ＧＡ２０Ｓ勾配コイル及び１５．５ｃｍの内径の直角円筒状ＲＦボリュームコイルを使用した。ウサギは、プレキシガラスホルダー内で側臥位に向いており、足から先にボアに挿入された。ＭＲ−適合システムを使用して麻酔をノーズコーンに直接送達した。冠状断及び軸方向のＴ２強調画像化をベースラインで実施し、冠状断及び軸方向のＴ２強調及びＴ１強調画像化を造影剤皮下注入の２時間後に実施した。全ての取得物は１ｘ１ｘ１．５ｍｍの空間分解能を共有していた。冠状断の取得物は、１１０ｘ８０ｍｍの視野、１１０ｘ８０のマトリックスサイズ、及び３６のスライスカバレッジを共有していた。軸方向の取得物は、９６ｘ７２ｍｍの視野、９６ｘ７２ｍｍのマトリックスサイズ、及び５５のスライスカバレッジを共有していた。全てのＴ２強調画像セットは、６６．５ｍｓの有効エコー時間（エコー時間９．５ｍｓ、１４のＲＡＲＥ係数）及び６０００ｍｓの反復時間で取得された。全てのＴ１強調画像セットは、９．５ｍｓの有効エコー時間（エコー時間９．５ｍｓ、２のＲＡＲＥ係数）及び１０００ｍｓの反復時間で取得された。取得時間は、冠状断の７２強調画像の場合は４分２４秒から、軸方向のｒ２強調画像の場合は７分３０秒までの範囲であった。

本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されているが、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、変形がなされ得ることが当業者によって理解されるであろう。以下の参考文献リストにおけるものを含む本明細書に開示された全ての文献は参照により組み込まれる。

［参考文献］
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［２］Ｌ．Ｓｅｓｓｌｅｒ，Ｔ．Ｄ．Ｍｏｄｙ，Ｇ．Ｗ．Ｈｅｍｍｉ，Ｖ．Ｌｙｎｃｈ，ＩｎｏｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９３，３２，３１７５−３１８７．
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［５］Ｊ．Ｌ．Ｓｅｓｓｌｅｒ，Ｎ．Ａ．Ｔｖｅｒｍｏｅｓ，Ｄ．Ｍ．Ｇｕｌｄｉ，Ｔ．Ｄ．Ｍｏｄｙ，Ｗ．Ｅ．Ａｌｌｅｎ，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｓｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＡ１９９９，１０３，７８７−７９４．
［６］Ｓ．Ｗ．Ｙｏｕｎｇ，Ｆ．Ｑｉｎｇ，Ａ．Ｈａｒｒｉｍａｎ，Ｊ．Ｌ．Ｓｅｓｓｌｅｒ，Ｗ．Ｃ．Ｄｏｗ，Ｔ．Ｄ．Ｍｏｄｙ，Ｇ．Ｗ．Ｈｅｍｍｉ，Ｙ．Ｈａｏ，Ｒ．Ａ．Ｍｉｌｌｅｒ，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ１９９６，９３，６６１０−６６１５．
［７］Ｊ．Ｆ．Ａｒａｍｂｕｌａ，Ｊ．Ｌ．Ｓｅｓｓｌｅｒ，Ｍ．Ｅ．Ｆｏｕｎｔａｉｎ，Ｗ．−ｈ．Ｗｅｉ，Ｄ．Ｍａｇｄａ，Ｚ．Ｈ．Ｓｉｄｄｉｋ，ＤａｌｔｏｎＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ２００９，４８，１０８３４−１０８４０．
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［９］Ｊ．Ｆ．Ｌｏｖｅｌｌ，Ｃ．Ｓ．Ｊｉｎ，Ｅ．Ｈｕｙｎｈ，Ｈ．Ｊｉｎ，Ｃ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｌ．Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃａｏ，Ｌ．Ｖ．Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｚｈｅｎｇ，ＮａｔｕｒｅＭａｔｅｒｉａｌｓ２０１１，１０，３２４−３３２．
［１０］Ｌ．Ｊ．Ｂｏｕｃｈｅｒ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ１９６８，９０，６６４０−６６４５．
［１１］ａ）Ｈ．Ｌ．Ｍ．Ｃｈｅｎｇ，Ｉ．Ｅ．Ｈａｅｄｉｃｋｅ，Ｗ．Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．ＴｃｈｏｕａｌａＮｏｆｉｅｌｅ，Ｘ．ａ．Ｚｈａｎｇ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅＩｍａｇｉｎｇ２０１４，４０，１４７４−１４８０、ｂ）Ｗ．Ｃｈｅｎｇ，Ｉ．Ｅ．Ｈａｅｄｉｃｋｅ，Ｊ．Ｎｏｆｉｅｌｅ，Ｆ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｋ．Ｂｅｅｒａ，Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｏｌｌ，Ｈ．−Ｌ．Ｍ．Ｃｈｅｎｇ，Ｘ．−ａ．Ｚｈａｎｇ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１４，５７，５１６−５２０；ｃ）Ｚ．Ｚｈａｎｇ，Ｒ．Ｈｅ，Ｋ．Ｙａｎ，Ｑ．−ｎ．Ｇｕｏ，Ｙ．−ｇ．Ｌｕ，Ｘ．−ｘ．Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｌｅｉ，Ｚ．−ｙ．Ｌｉ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ２００９，１９，６６７５−６６７８．
［１２］Ａ．Ｅ．Ｈａｎｓｅｎ，Ａ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｒ．Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ，Ｂ．Ｂｏｅｒｒｅｓｅｎ，Ｐ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ｅｌｅｍａ，Ｐ．Ｍ．Ｒｏｓｅｎｓｃｈｏｅｌｄ，Ａ．Ｔ．Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ａ．Ｋｊａｅｒ，Ｔ．Ｌ．Ａｎｄｒｅｓｅｎ，ＡＣＳＮａｎｏ２０１５，９，６９８５−６９９５．
［１３］ａ）Ｙ．−ｗ．Ｊｕｎ，Ｙ．−Ｍ．Ｈｕｈ，Ｊ．−ｓ．Ｃｈｏｉ，Ｊ．−Ｈ．Ｌｅｅ，Ｈ．−Ｔ．Ｓｏｎｇ，Ｓ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｙｏｏｎ，Ｋ．−Ｓ．Ｋｉｍ，Ｊ．−Ｓ．Ｓｈｉｎ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ２００５，１２７，５７３２−５７３３、ｂ）Ｒ．Ａ．Ｂｒｏｏｋｓ，Ｆ．Ｍｏｉｎｙ，Ｐ．Ｇｉｌｌｉｓ，ＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅ２００１，４５，１０１４−１０２０．
［１４］ａ）Ｔ．Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｉｉｊｉｍａ，Ｍ．Ｓｅｋｉ，Ｎ．Ｉｎａｇａｋｉ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭａｇｎｅｔｉｓｍａｎｄＭａｇｎｅｔｉｃＭａｔｅｒｉａｌｓ１９８７，６５，２５２−２５６、ｂ）Ｈ．Ｓｈｏｋｒｏｌｌａｈｉ，ＭａｔｅｒｉａｌｓＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｃ２０１３，３３，４４８５−４４９７；ｃ）Ｄ．Ｐａｎ，Ａ．Ｈ．Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒ，Ｓ．Ａ．Ｗｉｃｋｌｉｎｅ，Ｇ．Ｍ．Ｌａｎｚａ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ２０１１，６７，８４３１−８４４４．

Claims

テキサフィリン−リン脂質複合体を調製する方法であって、
前記テキサフィリン−リン脂質複合体が、リン脂質の脂質側鎖に共有結合している、テキサフィリン、テキサフィリン誘導体又はテキサフィリン類似体を含み、
前記テキサフィリン誘導体又は前記テキサフィリン類似体が下記式Ｉで表されるコア部分を有し、

塩酸存在下及び少なくとも５０℃の加熱下で、

（上記式中、Ｒ_７〜Ｒ_１０のうちの１つは、下記式（Ｃ）で表されるリン脂質基であり、

Ｒ_７〜Ｒ_１０の残りは、独立して、Ｈ、アルキル基、ヘテロアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、ヘテロアルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環基、及びアシル基から選択される。ｎは１〜２０の整数である。）
を、

（上記式中、Ｒ_１〜Ｒ_６は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、またはＯＨ基、ＳＨ基、ヘテロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、もしくは複素環式基で置換されたアルキル基からなる群から選択される。）
と反応させて、

（上記式中、Ｒ_１〜Ｒ_１０は、上記の通りである。）
を生成することを含む、方法。
前記化合物６が、水素雰囲気下、並びにパラジウム担持炭素及び塩酸存在下で下記化合物５を還元することによって調製される、請求項１に記載の方法。

（上記式中、Ｒ_７〜Ｒ_１０のうちの１つは、下記式（Ｃ）で表されるリン脂質基であり、

Ｒ_７〜Ｒ_１０の残りは、独立して、Ｈ、アルキル基、ヘテロアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、ヘテロアルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環基、及びアシル基から選択される。ｎは１〜２０の整数である。）
前記化合物５が、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン及びＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩存在下で、ａ）下記化合物４と、ｂ）下記式（Ｂ）で表されるリン脂質とを反応させることによって調製される、請求項２に記載の方法。

（上記式中、Ｒ’_７〜Ｒ’_１０のうちの１つは、下記式Ａで表される炭素鎖連結部であり、Ｒ’_７〜Ｒ’_１０の残りは、独立して、Ｈ、アルキル基、ヘテロアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、ヘテロアルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環基、及びアシル基から選択される。）

（上記式中、ｎは１〜２０の整数である。）
前記複合体から前記テキサフィリン、テキサフィリン誘導体又はテキサフィリン類似体を開裂することを含むテキサフィリン、テキサフィリン誘導体又はテキサフィリン類似体を合成することを更に含む、請求項１に記載の方法。
前記開裂が、酵素を使用して実施される、請求項４に記載の方法。
前記リン脂質が分岐又は不飽和である、請求項１に記載の方法。
前記リン脂質基が下記である、請求項１に記載の方法。

上記式中、ｎは０〜２０の整数である。
前記ａ）化合物４が下記４であり、

前記ｂ）リン脂質が下記リゾ−ＰＣ（Ｃ１６）であり、

前記化合物５が、下記５であり、

前記化合物６が下記６であり、

前記化合物７が下記７であり、

前記化合物８が下記８である、

、請求項３に記載の方法。
前記テキサフィリン、テキサフィリン誘導体またはテキサフィリン類似体が、ｓｎ−１またはｓｎ−２位で前記脂質側鎖に結合している、請求項１に記載の方法。
前記テキサフィリン、テキサフィリン誘導体またはテキサフィリン類似体が、テキサフィリンである、請求項１に記載の方法。
前記ポルフィリン−リン脂質複合体をＭｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｙ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌａ、Ｈｇ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、及びＬｕよりなる群から選択される金属と錯体形成することを更に含む、請求項１に記載の方法。
前記テキサフィリン−リン脂質複合体を含むナノ粒子を形成することを更に含み、
前記ナノ粒子が少なくとも１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５または１００モル％のテキサフィリン−リン脂質複合体を含む、請求項１に記載の方法。
前記ナノ粒子が、ＰＥＧ、ＰＥＧ−脂質及びＰＥＧ−ＤＳＰＥよりなる群から選択されるＰＥＧ化物を更に含む、請求項１２に記載の方法。
前記ＰＥＧ化物が、約５モル％の量で存在する、請求項１３に記載の方法。
二重層ベシクル又は単層ベシクルである、請求項１２に記載の方法。
前記ナノ粒子が、実質的に球状であり、直径が約３ｎｍ〜約２００ｎｍである、請求項１２に記載の方法。
活性剤を中に封入することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
前記ナノ粒子が、標的分子を更に含む、請求項１２に記載の方法。