KR101742935B1 - Genetic polymorphic markers for determining type of white skin and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단일염기다형성 (SNP) 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커를 포함하는 피부 타입의 미백 여부 진단용 마커, 상기 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 또는 마이크로어레이 및 상기 마커를 이용한 피부 타입의 미백 여부에 대한 정보의 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단일염기다형성 마커들은 개개인의 피부 타입에 정확한 정보를 제공하므로 개인 맞춤형 화장품 개발 및 맞춤형 유효성분을 개발할 수 있다.The present invention relates to a skin type whitening diagnostic marker comprising one or more single base polymorphic markers selected from single base polymorphism (SNP) markers, a composition comprising an agent capable of detecting said marker, a kit comprising said composition Or a microarray, and a method of providing information on whitening of a skin type using the marker. The single nucleotide polymorphic markers of the present invention provide accurate information on the individual's skin type and thus can develop personalized cosmetics and develop customized active ingredients.
Description
본 발명은 미백 피부 여부를 판단할 수 있는 단일염기다형성 (SNP) 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커를 포함하는 피부 타입의 미백 여부 진단용 마커, 상기 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 또는 마이크로어레이 및 상기 마커를 이용한 피부 타입의 미백 여부에 대한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.The present invention provides a skin type whitening diagnostic marker comprising one or more single base polymorphic markers selected from single base polymorphism (SNP) markers capable of judging whether a skin is whitened, a preparation capable of detecting the marker A kit, or a microarray comprising the composition, and a method for providing information on whitening of a skin type using the marker.
인간의 피부는 개개인마다 피부상태가 차이가 있다. 특히, 같은 연령, 같은 피부타입이라도 개개인이 처한 내적, 외적인 환경에 따라 피부상태는 많이 달라질 수 있다. 과학 문명이 발달할수록 각종 오염된 환경의 노출, 오존층 파괴로 인한 자외선 노출, 각종 스트레스 등으로 인하여 피부에 심각한 영향을 주어 피부기능이 저하되고 심지어는 피부 트러블이 발생되는 심각한 상태에 이르는 사례가 늘고 있다. 따라서 사용자들은 피부상태를 호전 또는 유지시킬 수 있는 기능성 화장품에 대한 요구가 점차 높아지고 있다.Human skin has different skin condition for each individual. In particular, even skin types of the same age and the same skin type can vary greatly depending on the internal and external environment of each individual. As the scientific civilization develops, there are more and more cases in which the skin is severely affected by exposure to various polluted environments, exposure to ultraviolet rays due to destruction of the ozone layer, various stresses, and the like, resulting in deterioration of skin function and even skin troubles . Accordingly, there is a growing demand for functional cosmetics that can improve or maintain the condition of the skin.
그러나, 현재는 주로 사용자 개개인에 대한 피부상태의 판단은 단순한 피부문진 및 간단한 피부테스트를 통하여 자기 자신의 피부상태가 어떤지를 파악하는 정도이므로 피부상태 정보에 대한 완전한 신뢰를 얻기는 어렵다. 또한 현재 시판되고 있는 기능성 화장품들은 개개인을 타깃으로 하는 것이 아니라 범용적인 측면이 강하기 때문에 사용자 자신만의 적합한 화장품을 찾기에는 많은 제약이 따른다. 따라서 과학적인 근거에 접근하여 피부상태를 정밀하게 진단하여 맞춤형 화장품을 제공하는 시스템은 거의 전무후무하다고 할 수 있다.However, at present, it is difficult to obtain complete trust in the skin condition information because the judgment of the skin condition for each user is mainly about the skin condition of the user through simple skin test and simple skin test. In addition, functional cosmetics currently on the market are not aimed at individuals, but are universal. Therefore, there are many limitations in finding suitable cosmetics for users. Therefore, there is almost no system to provide customized cosmetics by precisely diagnosing skin condition by approaching scientific basis.
피부특성에 따른 맞춤형 화장품에 대한 요구가 점차 증가하면서, 피부 분류의 체계적 기준 확립 및 이에 따른 제품 처방의 특성화가 요구되고 있다. 하지만 현재 피부 분류에 이용되고 있는 유수분 밸런스 분류기준으로는 정확한 피부 분류를 하지 못하는 실정이다. 또한 종래의 피부상태를 측정하여 맞춤형 화장품 제공하는 방법에는 사용자의 현재 피부상태를 검사하기 위하여 주름의 경우에는 주로 모사판을 이용하여 이미지 분석 시스템(image analyzer system)으로 피부주름의 상태를 파악하며, 피부미백의 경우에는 색차계(mexameter) 및 색채계(colorimeter)를 이용하여 홍반이나 피부색깔의 변화를 측정하고 있으며, 피부보습의 경우에는 주로 코니오메타(corneometer)를 이용하여 보습량을 측정하고 있다. 이런 측정방법들은 피부표면에 대한 물리적인 상태를 단순한 수치화로 나타내고 있으며 측정하는 프로그램에 따라 그 수치가 달라질 수 있기 때문에 피시험자의 작은 개선정도를 평가하는데 있어서는 오차가 발생할 우려가 있다. 또한, 시험자의 육안평가 및 피시험자의 설문평가의 경우에는 주관적인 측면이 크게 작용하여 피시험자의 피부상태를 객관적이고 정밀하게 평가하기에는 어려운 단점이 있다.With the increasing demand for customized cosmetics according to skin characteristics, it is required to establish a systematic standard of skin classification and to characterize product prescription accordingly. However, the current water balance classification standard used for skin classification is not able to accurately classify the skin. In addition, in a method of providing customized cosmetics by measuring the skin condition of the prior art, in order to check the current skin condition of the user, the condition of the skin wrinkles is grasped by an image analyzer system using mainly a replica plate in case of wrinkles, In the case of skin whitening, a change in erythema or skin color is measured using a mexameter and a colorimeter. In the case of skin moisturizing, a moisturizing amount is measured mainly using a corneometer have. These measurement methods simply represent the physical state of the skin surface by numerical values and may vary depending on the program to be measured. Therefore, there is a fear that errors may occur in evaluating the degree of improvement of the subject. In addition, in the case of the visual evaluation of the tester and the evaluation of the questionnaire by the tester, the subjective aspect greatly affects and it is difficult to evaluate the subject's skin condition objectively and precisely.
이러한 배경하에 본 발명자들은 개체의 피부 특성을 결정하는 유전적 특징을 파악하여 과학적 피부 분류 기준을 구축하고, 이를 근거로 한 개인 맞춤형 유효성분을 개발하여, 다양한 제품 세분화를 통해 피부 특성별 맞춤형 화장품 개발에 기여하고자 예의 노력한 결과, 피부 미백과 유의적 상관관계를 갖는 특정 단일염기다형성 (SNP) 마커를 선별하여 피부 타입이 미백인지 여부를 진단하는 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Under these circumstances, the present inventors constructed a scientific skin classification standard by grasping the genetic characteristics that determine the skin characteristics of the individual, developed a personalized customized ingredient based on the classification, developed customized cosmetics according to skin characteristics through various product segmentation (SNP) markers having a significant correlation with skin whitening were selected, and a method of diagnosing whether skin type was whitening was selected to confirm the present invention.
본 발명의 하나의 목적은 미백 피부 여부를 판단할 수 있는 단일염기다형성 (SNP) 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커를 포함하는 피부 타입의 미백 여부 진단용 마커를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a skin type whitening diagnosis marker comprising one or more single base polymorphism markers selected from single base polymorphism (SNP) markers capable of judging the whitening skin condition.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 피부 타입의 미백 여부 진단용 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 피부 타입의 미백 여부 진단용 조성물을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a skin type whitening detection composition comprising a probe capable of detecting the skin type whitening diagnosis marker or an amplifiable preparation.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 피부 타입의 미백 여부 진단용 조성물을 포함하는 피부 타입의 미백 여부 진단용 키트 또는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a skin type whitening diagnosis kit or microarray comprising the skin type whitening presence detection composition.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 확인하는 단계를 포함하는 피부 타입의 미백 여부에 대한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide a method for providing skin whitening information including identifying a polymorphic site of the single nucleotide polymorphism marker.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 미백 피부 여부를 판단할 수 있는 단일염기다형성 (SNP) 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커를 포함하는 피부 타입의 미백 여부 진단용 마커를 제공한다.In one aspect of the present invention, there is provided a skin type whitening diagnostic marker comprising at least one single base polymorphism marker selected from single nucleotide polymorphism (SNP) markers capable of determining whitening skin to provide.
본 발명에서 용어, "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.In the present invention, the term "polymorphism" refers to a case where two or more alleles exist in one locus. Of the polymorphic sites, only a single base differs from a polymorphism region to a single base polymorphism (single nucleotide polymorphism, SNP). Preferred polymorphic markers have two or more alleles exhibiting an incidence of 1% or more, more preferably 10% or 20% or more, in the selected population.
본 발명에서 용어, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자 (biallele)를 갖는다.The term "allele " in the present invention refers to various types of genes that exist on the same locus of a homologous chromosome. Alleles are also used to represent polymorphisms, for example, SNPs have two kinds of bialles.
본 발명에서 용어, "rs_id"란 1998년부터 SNP 정보를 축적하기 시작한 NCBI가 초기에 등록되는 모든 SNP에 대하여 부여한 독립된 표지자인 rs-ID를 의미한다. 이와 같은 표에 기재된 rs_id는 본 발명의 다형성 마커인 SNP 마커를 의미한다.In the present invention, the term "rs_id " means rs-ID, which is an independent marker assigned to all SNPs initially registered by the NCBI that has started accumulating SNP information since 1998. [ The rs_id shown in the above table means the SNP marker which is the polymorphism marker of the present invention.
본 발명에서 용어, "피부 타입"이란 측정 또는 진단하고자 하는 개체의 피부 타입을 의미하는 것으로, 본 발명의 SNP로 측정할 수 있는 피부 타입은 제한 없이 포함하나, 바람직하게는 미백일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 본 발명자들은 피험자의 피부 타입을 색소가 적은 미백 피부 또는 색소가 많아서 잘 타는 피부로 분류하였다. 본 발명의 단일염기다형성 마커는 정확한 피부 타입을 측정할 수 있도록 하므로, 유효 성분과 접촉된 피부의 변화된 피부 타입에 대한 정보도 줄 수 있다.In the present invention, the term "skin type " refers to a skin type of an individual to be measured or diagnosed. The type of skin that can be measured by the SNP of the present invention is not limited but may be preferably whitening. According to one embodiment of the present invention, the present inventors classified the subject's skin type into whitened skin having less pigment or skin having more pigment and having better skin burning. Since the single nucleotide polymorphic marker of the present invention enables accurate skin type measurement, information on the changed skin type of skin contacted with the active ingredient can also be provided.
바람직하게 상기 단일염기다형성 마커는 표 3 및 표 4에 표시된 단일염기다형성 마커들 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커일 수 있다. 상기 표 3 및 표 4에 표시된 단일염기다형성 마커는 피부 타입이 미백인지 여부를 판단하는 것일 수 있다.Preferably, the single nucleotide polymorphism marker may be at least one single nucleotide polymorphism marker selected from the single nucleotide polymorphism markers set forth in Table 3 and Table 4. The single nucleotide polymorphism markers shown in Table 3 and Table 4 may be used to determine whether the skin type is whitening.
본 발명의 단일염기다형성 마커의 피부 타입 진단 여부는 각 마커들의 빈도 수를 측정하여 판단하였다. 이와 같은 유의성은 0.05 미만, 0.01 미만, 0.001 미만, 0.0001 미만, 0.00001 미만, 0.000001 미만, 0.0000001 미만, 0.00000001 미만, 또는 0.000000001 미만의 p-value와 같은 p-값을 특징으로 하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 p-value가 0.01 미만일 수 있으며, 더 바람직하게는 p-value가 0.001 미만일 수 있다.Whether the single nucleotide polymorphism marker of the present invention was diagnosed with the skin type was determined by measuring the frequency of each marker. Such significance is not limited to p-values such as less than 0.05, less than 0.01, less than 0.001, less than 0.0001, less than 0.00001, less than 0.000001, less than 0.0000001, less than 0.00000001, or less than 0.000000001 p-value. Preferably, the p-value may be less than 0.01, more preferably the p-value may be less than 0.001.
본 발명의 다형성 마커는 표 3 및 표 4에 표시된 마커로서, 개체의 다형성 마커의 다형성 부위의 염기가 소수 대립유전자 (minor allele)인 경우 표 3 및 표 4에 표시된 잘 타는 피부인 대조군 (control)과 미백 피부인 시험군 (case)의 빈도 수 중 빈도 수가 높은 군의 피부로 판단하며, 다형성 부위의 염기가 다수 대립유전자 (major allele)인 경우 표 3 및 표 4에 표시된 잘 타는 피부인 대조군과 미백 피부인 시험군의 빈도 수 중 빈도 수가 낮은 군의 피부로 판단할 수 있는 마커이다. 예를 들어, 개체의 10번 염색체의 54189156번째 염기가 C인 경우에는 표 3을 보면 대조군의 빈도 수가 더 높으므로 소수 대립유전자인 C가 나온 상기 개체의 피부는 대조군인 잘 타는 피부로 판단할 수 있는 것이다. 만약 개체의 10번 염색체의 54189156번째 염기가 다수 대립유전자인 T인 경우에는 표 3을 보면 시험군의 빈도 수가 더 낮으므로 이는 시험군인 잘 타지 않는 미백 피부로 판단할 수 있다.The polymorphic markers of the present invention are the markers shown in Tables 3 and 4, wherein when the base of the polymorphic site of the individual polymorphic marker is a minor allele, And the frequency of the whitening skin test case is judged to be the skin of the high frequency group. When the polymorphic base is a major allele, the skin of the well-skinned control group shown in Table 3 and Table 4 This is a marker that can be judged as the skin of a group with a low frequency in the frequency of the test group which is a whitening skin. For example, when the 54189156 base of the chromosome 10 of the individual is C, the frequency of the control group is higher in Table 3, so that the skin of the individual having the minority allele C can be judged as a control group It is. If the 54189156 base of chromosome 10 of the individual is T, which is a multiple allele, the frequency of the test group is lower than that of the test group.
더 바람직하게, 상기 표 3은 인간의 10번 염색체의 54189156번째 염기가 T 또는 C인(rs1100311), 상기 54189156번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 5번 염색체의 82834514번째 염기가 G 또는 A인(rs1833890), 상기 82834514번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 1번 염색체의 55831811번째 염기가 T 또는 C인(rs7526426), 상기 55831811번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 191042669번째 염기가 G 또는 A 인(rs1019321), 상기 191042669번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 10번 염색체의 54169046번째 염기가 C 또는 T인(rs1238575), 상기 54169046번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 5번 염색체의 82829792번째 염기가 G 또는 T인(rs2652106), 상기 82829792번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 13번 염색체의 43428336번째 염기가 G 또는 A인(rs7322264), 상기 43428336번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 10번 염색체의 54196212번째 염기가 T 또는 C인(rs1082479), 상기 54196212번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 191009613번째 염기가 A 또는 G인(rs9646748), 상기 191009613번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 1번 염색체의 55855971번째 염기가 T 또는 C인(rs1118219), 상기 55855971번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 3번 염색체의 134657139번째 염기가 C 또는 T인(rs9865003), 상기 134657139번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 10번 염색체의 54182014번째 염기가 T 또는 G인(rs1100311), 상기 54182014번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 10번 염색체의 54191096번째 염기가 C 또는 T인(rs1693307), 상기 54191096번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 6번 염색체의 4860027번째 염기가 A 또는 G인(rs9405785), 상기 4860027번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 4번 염색체의 79431934번째 염기가 G 또는 T인(rs1484344), 상기 79431934번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 14번 염색체의 32866528번째 염기가 G 또는 A인(rs8011225), 상기 32866528번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 1번 염색체의 83969386번째 염기가 A인(rs3470503), 상기 83969386번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 16번 염색체의 22067299번째 염기가 T 또는 G인(rs1164222), 상기 22067299번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 3번 염색체의 134656869번째 염기가 C 또는 T인(rs2370246), 상기 134656869번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 191098371번째 염기가 A 또는 G인(rs1093145), 상기 191098371번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 1번 염색체의 188206372번째 염기가 G 또는 A인(rs1711758), 상기 188206372번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 191041973번째 염기가 T 또는 C인(rs4340549), 상기 191041973번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 15번 염색체의 96368401번째 염기가 T 또는 C인(rs2845633), 상기 96368401번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 10번 염색체의 54203366번째 염기가 A 또는 G인(rs1031101), 상기 54203366번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 8번 염색체의 29970271번째 염기가 G 또는 A인(rs6987138), 상기 29970271번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 20번 염색체의 900218번째 염기가 C 또는 T인(rs2223962), 상기 900218번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 6번 염색체의 37655240번째 염기가 G 또는 A인(rs804846), 상기 37655240번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 2번 염색체의 235675961번째 염기가 A 또는 G인(rs4277473), 상기 235675961번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 13번 염색체의 43418348번째 염기가 T 또는 C인(rs9525880), 상기 43418348번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 5번 염색체의 58468246번째 염기가 C 또는 T인(rs1006239), 상기 58468246번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 10번 염색체의 54173326번째 염기가 G 또는 A인(rs996232), 상기 54173326번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 1번 염색체의 244670509번째 염기가 C 또는 T인(rs2340778), 상기 244670509번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 5번 염색체의 158512290번째 염기가 A 또는 G인(rs6556401), 상기 158512290번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 8번 염색체의 17963006번째 염기가 A 또는 G인(rs1763609), 상기 17963006번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 17번 염색체의 67559320번째 염기가 T 또는 C인(rs9911193), 상기 67559320번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 16번 염색체의 65093758번째 염기가 T 또는 C인(rs1428106), 상기 65093758번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 9번 염색체의 20186505번째 염기가 T 또는 G인(rs1456958), 상기 20186505번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 9번 염색체의 20186466번째 염기가 T 또는 C인(rs1456959), 상기 20186466번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 9번 염색체의 20218652번째 염기가 C 또는 T인(rs321218), 상기 20218652번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 인간의 9번 염색체의 19969813번째 염기가 A 또는 C인(rs1892011), 상기 19969813번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것인, 피부 타입이 색소가 많아서 잘 타는 피부인지 또는 색소가 적어서 잘 타지 않는 미백 피부인지 여부를 판단하는 피부 타입의 미백 여부 진단용 마커일 수 있다.More preferably, Table 3 shows a polynucleotide consisting of 5-100 consecutive DNA sequences comprising the 54189156 base of the human chromosome 10, T or C (rs1100311), and the 54189156 base; A polynucleotide consisting of 5-100 consecutive DNA sequences comprising the 82834514 base sequence of the human chromosome 5 (G) or G (A) (rs1833890), and the 82834514 base sequence; A polynucleotide consisting of 5-100 consecutive DNA sequences comprising the 55831811 base of the
본 발명의 일 실시예에 따르면, 표 3에서 VCAN (versican) 유전자가 의미 있는 결과를 나타내고 있으며, 특히 Versican의 2개 위치가 의의 있게 SNP를 보였는데, Versican 유전자상의 SNP인 rs1833890와 rs2652106는 염색체 5번의 82834514, 82829792 번째에 각각 위치한다. Versican은 CSPG (chondroitin sulfate proteoglycan)으로서 발생과 질환의 중요 시점에 수화 기질 (loose & hydrated matrix)을 제공하는 세포외기질(ECM)의 주요한 성분 중의 하나이다. Versican은 세포결합, 증식, 이동, 혈관생성에 참여함으로써 조직 형태형성(morphogenesis) 및 유지에 중요한 역할을 한다. 아울러 Versican은 죽상경화성 혈관질환, 암, 건 재구조 (tendon remodelling), 모발 주기, 중추신경계 손상, 신경세포의 돌기 연장 (neurite outgrowth) 등에 관여한다. Versican은 중심 단백 (core protein)과 글리코사미노글리칸 곁사슬 (glycosaminoglycan (GAG) side chain)로 구성된다. Versican은 여러 세포에 의해 시간적, 공간적으로 다르게 발현되며, 발생학적으로 병적 시간에 따라서도 다르게 발현된다 (도 3). Versican 유전자는 인간 게놈의 5번 염색체에 위치하며, 90KB 염기의 15개 엑손으로 이루어져 있다. 발생학적으로 신경세포와 멜라닌세포는 신경외배엽 (neuroectoderm)에서 유래하는 동일 기원의 세포로서, 모양도 서로 비슷하여 중심에 세포체 (cell body)가 있고 주변으로 돌기(process; neurite/dendrite)가 나뭇가지 모양으로 뻗어 있다. 돌기의 연장(extension, outgrowth)에는 작은 GTP (guanosine triphosphate)-결합 단백질인 Rho, Rac, cdc42가 신경세포와 멜라닌세포 모두에 관여한다. GTP-결합 단백질 (Rho, Rac1, cdc42)이 신경세포의 신경돌기 발아 (neurite outgrowth)에 미친 영향이 똑같은 방식으로 멜라닌세포에도 적용되었던 것처럼 Versican v1 isoform (또는 일부인 G3 domain)이 멜라닌세포에도 작용하여 분화를 유도하고, 수상돌기 연장 (dendrite extension)을 촉진할 것으로 생각된다 (도 4a 및 도 4b). 따라서 궁극적으로는 Versican이 피부의 흑화 (pigmentation)에도 영향을 미칠 것이라 추측된다. According to one embodiment of the present invention, the VCAN (versican) gene shows meaningful results in Table 3, and in particular, the two positions of Versican showed a significant SNP, whereas the Versican gene SNPs rs1833890 and rs2652106 are
본 발명자들은 상기 SNP가 피부 타입 진단용 마커임을 다음과 같은 입증을 통하여 확인하였다. 구체적으로, 미백 피부 여부는 최소홍반량 (MED)에 따라, MED 47 이상은 대조군, MED 38 이하는 시험군으로 분류하였다. 상기 분류된 개체로부터 타액 또는 혈액으로부터 gDNA를 추출하고, 유전자형 분석 실험을 Axiom(TM) ASI array plate로 수행하였다 (도 1). 그 결과, 미백의 피부 타입에 유의성을 갖는 SNP를 분류하였다 (표 3 및 표 4). 이와 같은 피부 타입을 분류할 수 있는 SNP는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다.The present inventors confirmed that the above-mentioned SNP is a skin type diagnostic marker through the following proof. Specifically, the skin whitening status was classified according to the minimum erythema (MED), MED 47 or higher as a control group, and
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피부 타입의 미백 여부 진단용 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 피부 타입의 미백 여부 진단용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a skin type whitening detection composition comprising a probe capable of detecting the skin type whitening diagnostic marker or an amplifiable preparation.
본 발명에서 용어, "피부 타입의 미백 여부 진단용 마커를 검출할 수 있는 프로브"는 상기와 같은 유전자의 다형성 부위와 특이적으로 혼성화 반응을 통해 확인하여 피부 타입이 미백인지 여부를 진단할 수 있는 조성물을 의미하며, 이와 같은 유전자 분석의 구체적 방법은 특별한 제한이 없으며, 이 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 유전자 검출 방법에 의하는 것일 수 있다.In the present invention, the term "a probe capable of detecting a skin type whitening diagnostic marker" refers to a composition capable of diagnosing whether a skin type is whitening by specifically hybridizing with a polymorphic site of the above- And the specific method of such gene analysis is not particularly limited and may be by any gene detection method known in the art to which this invention belongs.
본 발명에서 용어, "피부 타입의 미백 여부 진단용 마커를 증폭할 수 있는 제제"란 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 피부 타입이 미백인지 여부를 진단할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 피부 타입의 미백 여부 진단용 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 의미한다.In the present invention, the term "agent capable of amplifying a skin type whitening diagnosis marker" means a composition capable of diagnosing whether a skin type is whitened by confirming a polymorphic site of the above- Preferably means a primer capable of specifically amplifying the polynucleotide of the skin-type whitening diagnostic marker.
상기 다형성 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.The primers used for the polymorphic marker amplification can be amplified by PCR using appropriate conditions in suitable buffers (e.g., four different nucleoside triphosphates and polymerase such as DNA, RNA polymerase or reverse transcriptase) and template-directed DNA Refers to a single stranded oligonucleotide that can serve as a starting point for synthesis. The appropriate length of the primer may vary depending on the intended use, but is usually 15 to 30 nucleotides. Short primer molecules generally require a lower temperature to form a stable hybrid with the template. The primer sequence need not be completely complementary to the template, but should be sufficiently complementary to hybridize with the template.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 피부 타입을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. The term "primer" in the present invention means a base sequence having a short free 3 'hydroxyl group and can form base pairs with a complementary template, It means a short sequence functioning as a point. The primer can initiate DNA synthesis in the presence of reagents and four different nucleoside triphosphates for polymerization reactions (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffer solutions and temperatures. PCR amplification can be performed to predict skin type through the production of desired products. The PCR conditions, the lengths of the sense and antisense primers can be modified based on what is known in the art.
본 발명의 프로브 또는 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The probes or primers of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, "capping ", replacement of natural nucleotides with one or more homologues, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers, such as methylphosphonate, Phosphoamidates, carbamates, etc.) or charged linkages (e.g., phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피부 타입의 미백 여부 진단용 조성물을 포함하는 피부 타입의 미백 여부 진단용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a skin type whitening diagnosis kit comprising the skin type whitening detection composition.
상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있다.The kit may be an RT-PCR kit or a DNA chip kit.
본 발명의 키트는 피부 타입 진단용 마커인 SNP 다형성 마커를 증폭을 통해 확인하거나, SNP 다형성 마커의 발현 수준을 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 피부 타입을 진단할 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 피부 타입 진단용 마커의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 피부 타입 진단용 마커의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 피부 타입 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.The kit of the present invention can diagnose the skin type by confirming the SNP polymorphism marker which is a skin type diagnostic marker through amplification or by confirming the expression level of SNP polymorphism marker with the mRNA expression level. As a specific example, in the present invention, the kit for measuring the mRNA expression level of the skin type diagnostic marker may be a kit containing essential elements necessary for performing RT-PCR. In addition to the individual primer pairs specific for the genes of the skin type diagnostic marker, the RT-PCR kit also includes a test tube or other appropriate container, reaction buffer (pH and magnesium concentrations vary), deoxynucleotides (dNTPs) , Enzymes such as Taq polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. It may also contain a primer pair specific for the gene used as a quantitative control. Also preferably, the kit of the present invention may be a skin type diagnostic kit containing essential elements necessary for carrying out a DNA chip. DNA chip kits are those in which nucleic acid species are attached in a gridded array on a generally flat solid support plate, typically a glass surface not larger than a slide for a microscope, and nucleic acids are uniformly arranged on the chip surface, Hybridization reaction occurs between the nucleic acid on the surface and the complementary nucleic acid contained in the solution treated on the surface of the chip to enable a mass parallel analysis.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피부 타입의 미백 여부 진단용 마커의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 피부 타입의 미백 여부 진단용 마이크로어레이를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a skin-type whitening-detecting microarray comprising a polynucleotide of the skin-type whitening diagnostic marker.
상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.The microarray may comprise DNA or RNA polynucleotides. The microarray comprises a conventional microarray except that the polynucleotide of the present invention is contained in the probe polynucleotide.
프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립유전자를 검출하여 피부 타입 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 2530 ℃의 조건이 대립유전자 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.Methods for producing microarrays by immobilizing probe polynucleotides on a substrate are well known in the art. The probe polynucleotide means a polynucleotide capable of hybridizing, and means an oligonucleotide capable of binding to the complementary strand of the nucleic acid in a sequence-specific manner. The probe of the present invention is an allele-specific probe in which a polymorphic site exists in a nucleic acid fragment derived from two members of the same species and hybridizes to a DNA fragment derived from one member but does not hybridize to a fragment derived from another member . In this case, the hybridization conditions show a significant difference in the intensity of hybridization between alleles, and should be sufficiently stringent to hybridize to only one of the alleles. This can lead to good hybridization differences between different allelic forms. The probe of the present invention can detect an allele and can be used for diagnosis of skin type and the like. The diagnostic methods include detection methods based on hybridization of nucleic acids such as Southern blots, and may be provided in a form pre-bonded to a substrate of a DNA chip in a method using a DNA chip. The hybridization can usually be performed under stringent conditions, for example, a salt concentration of 1 M or less and a temperature of 25 ° C or higher. For example, conditions of 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) and 2530 [deg.] C may be suitable for allele-specific probe hybridization.
본 발명의 피부 진단과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.Immobilization on the substrate of the probe polynucleotide associated with the skin diagnosis of the present invention can also be easily made using this conventional technique. In addition, hybridization of nucleic acids on a microarray and detection of hybridization results are well known in the art. The detection can be accomplished, for example, by labeling the nucleic acid sample with a labeling substance capable of generating a detectable signal comprising a fluorescent material, such as Cy3 and Cy5, and then hybridizing on the microarray and generating The hybridization result can be detected.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 상기 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 피부 타입의 미백 여부에 대한 정보의 제공 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for producing a DNA comprising: (a) obtaining DNA from a sample isolated from an individual; (b) amplifying the polymorphic site of the single nucleotide polymorphic marker from the DNA obtained in step (a) or hybridizing with the probe; And (c) identifying the base of the amplified or hybridized polymorphic site of step (b).
본 발명의 용어, "개체"란 피부 타입이 미백인지 여부에 대한 진단을 하기 위한 피험자를 의미한다. 상기 검체에서 머리카락, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등으로부터 DNA를 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The term "individual" of the present invention means a subject for diagnosing whether or not the skin type is whitening. DNA can be obtained from the sample, such as hair, urine, blood, various body fluids, isolated tissues, isolated cells or saliva, but is not limited thereto.
상기 (a) 단계의 게놈 DNA 수득 방법은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다.The method of obtaining the genomic DNA of step (a) may be any method known to those skilled in the art.
상기 (b) 단계의 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 상기 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다. The amplification of the polymorphic site of the single nucleotide polymorphic marker from the DNA obtained in step (a) of step (b) or hybridization with the probe may be performed by any method known to those skilled in the art. For example, the target nucleic acid can be obtained by PCR amplification and purification thereof. Other ligase chain reaction (LCR) (Wu and Wallace,
상기 방법 중 (c)단계의 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용가능한 다른 방법에 의해, 마이크로새틀라이트, SNP 또는 다른 종류의 다형성 마커를 포함한, 다형성 마커에서의 하나 이상의 대립유전자가 확인될 수 있다. 이와 같은 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 바람직하게는 SNP 칩을 통해 수행할 수 있다.Determination of bases in the polymorphic site of step (c) of the above method can be performed by sequencing analysis, hybridization by microarray, allele specific PCR, dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR extension analysis, SSCP, PCR-RFLP analysis or TaqMan technique, SNPlex platform (Applied Biosystems), mass spectrometry (e.g., Sequenom's MassARRAY system), mini-sequencing method, Bio- But are not limited to, the BioRad system, the CEQ and SNPstream system (Beckman), the Molecular Inversion Probe array technology (e.g., Affymetrix GeneChip), and BeadArray Technologies (e.g. Illumina GoldenGate and Infinium assay). One or more alleles in a polymorphic marker, including microsatellite, SNP or other types of polymorphic markers, can be identified by such methods or by other methods available to those skilled in the art to which this invention pertains. The base of such a polymorphic site can be determined preferably through a SNP chip.
본 발명에서 용어, "SNP 칩"은 수십만개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.The term "SNP chip" in the present invention means one of DNA microarrays capable of confirming each base of several hundred thousand SNPs at a time.
TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.The TaqMan method comprises the steps of: (1) designing and constructing a primer and a TaqMan probe to amplify a desired DNA fragment; (2) labeling probes of different alleles with FAM dyes and VIC dyes (Applied Biosystems); (3) performing PCR using the DNA as a template and using the primer and the probe; (4) after completion of the PCR reaction, analyzing and confirming the TaqMan assay plate with a nucleic acid analyzer; And (5) determining the genotype of the polynucleotides of step (1) from the analysis results.
상기에서, 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 SNP 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.In the above, the sequencing analysis can be performed using a conventional method for determining the nucleotide sequence, and can be performed using an automated gene analyzer. The allele-specific PCR means a PCR method in which a DNA fragment in which the SNP is located is amplified with a primer set including a primer designed with the base at the 3 'end at which the SNP is located. The principle of the above method is that, for example, when a specific base is substituted by A to G, an opposite primer capable of amplifying a primer containing the A as a 3 'terminal base and a DNA fragment of an appropriate size is designed, In the case where the base at the SNP position is A, the amplification reaction is normally performed and a band at a desired position is observed. When the base is substituted with G, the primer can be complementarily bound to the template DNA, And the amplification reaction is not performed properly due to the inability of complementary binding at the terminal. DASH can be performed by a conventional method, preferably by a method such as Prince et al.
한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.On the other hand, in the PCR extension analysis, first, a DNA fragment containing a base in which a single base polymorphism is located is amplified by a pair of primers, and all nucleotides added to the reaction are deactivated by dephosphorylation, and SNP- specific extension primers, a dNTP mixture, a digoxin nucleotide, a reaction buffer, and a DNA polymerase to perform a primer extension reaction. At this time, the extension primer has a base immediately adjacent to the 5 'direction of the base in which the SNP is located at the 3' terminus, and the nucleic acid having the same base as the dodecoxynucleotide is excluded in the dNTP mixture, and the dodecoxynucleotide indicates the SNP Base type. For example, when dGTP, dCTP and TTP mixture and ddATP are added to the reaction in the presence of substitution from A to G, the primer is extended by the DNA polymerase in the base in which the substitution has occurred, The primer extension reaction is terminated by ddATP at the position where the base first appears. If the substitution has not occurred, the extension reaction is terminated at the position, so that it is possible to discriminate the type of the base representing the SNP by comparing the lengths of the extended primers.
이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP을 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.As the detection method, when the extension primer or the dioxynucleotide is fluorescently labeled, the SNP is detected by detecting fluorescence using a gene analyzer (for example, Model 3700 of ABI Co., Ltd.) used for general nucleotide sequence determination And when the unlabeled extension primer and the didyxin nucleotide are used, the SNP can be detected by measuring the molecular weight using MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) technique.
바람직하게, 본 발명의 정보의 제공 방법은 (d) 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기가 소수 대립유전자 (minor allele)인 경우 표 3 및 표 4에 표시된 잘 타는 피부인 대조군과 미백 피부인 시험군의 빈도 수 중 빈도 수가 높은 군의 피부로 판단하며, 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기가 다수 대립유전자 (major allele)인 경우 표 3 및 표 4에 표시된 잘 타는 피부인 대조군과 미백 피부인 시험군의 빈도 수 중 빈도 수가 낮은 군의 피부로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.Preferably, the method of providing information of the present invention comprises the steps of: (d) when the base of the amplified or hybridized polymorphic site is a minor allele, The frequency of the frequency of the group is judged to be the skin of the higher group. If the base of the amplified or hybridized polymorphic region is a major allele, the control group and the whitened skin shown in Table 3 and Table 4 And judging the skin of the group having the lower frequency frequency frequency of the test group as the skin of the lower frequency group.
본 발명의 단일염기다형성 마커는 각각의 개체에 대한 피부 특성을 진단할 수 있는 마커로, 개체에 대한 정확한 피부 타입에 대한 정보를 줄 수 있어서, 피부 특성에 따른 맞춤형 화장품을 제공할 수 있다. 아울러, 화장품 소비자의 피부 특성을 과학적으로 분류하여 개인에 따른 맞춤형 유효성분을 개발하여 다양한 제품 세분화를 통해 피부 특성별 맞춤형 화장품 개발을 할 수 있을 것이다.The single nucleotide polymorphic marker of the present invention is a marker capable of diagnosing skin characteristics for each individual, and can give information on the accurate skin type to an individual, thus providing a customized cosmetic according to the skin characteristics. In addition, by classifying the skin characteristics of cosmetics consumers scientifically, it is possible to develop tailor-made effective ingredients according to individuals and to develop customized cosmetics according to skin characteristics through various product segmentation.
도 1은 본 발명의 Axiom(TM) ASI array plate를 이용한 유전자 분석의 개략도를 나타낸 도이다.
도 2는 미백에 대한 각 SNP 마커들의 빈도에 대한 p-value의 로그값과 SNP의 염색체상 위치를 나타낸 도이다.
도 3은 Versican의 구조 및 주변 분자들 간의 관계를 나타낸 도이다.
도 4a 및 도 4b는 vesican의 작용기작 및 경로를 나타낸 도이다.1 is a schematic diagram of gene analysis using the Axiom (TM) ASI array plate of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the log value of the p-value with respect to the frequency of each SNP marker for whitening and the chromosomal location of the SNP.
FIG. 3 is a diagram showing the structure of Versican and the relationship between neighboring molecules. FIG.
Figures 4a and 4b show the mechanism and pathway of vesican.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.
실시예 1: 피부의 특성 분류 및 유전자 채취Example 1: Characterization of Skin and Gene Collection
본 발명자들은 유전자 타입별 피부 분류 기준 확립 및 개인 맞춤형 유효성분 개발을 위하여 20~50세의 건강한 여성 피험자를 대상으로 이들의 피부 특성을 분류하기 위해서 피부 생리 요인 중 중요한 요소인 피부 미백에 대하여 ㈜더마프로가 보유하고 있는 피험자의 기초 데이터 중 본 발명의 피험자 선정 기준에 부합하는 피험자 81명과 경상대학교병원 피부과에서 미백 피부 분류가 완료된 20명을 선정한 다음 피부특성을 분류한 후 샘플을 채취하였다 (표 1). 샘플은 타액 또는 혈액을 의미한다. 예를 들어 타액 채취는 두 번에 걸쳐 이루어졌으며, 1차 타액은 피험자로 하여금 채취 1시간 전에 금식하도록 한 후 채취하였고, 2차 타액은 아침 기상 직후 피험자가 채취한 타액을 수득하였다.In order to establish skin classification standards for gene types and to develop a personalized active ingredient, the inventors of the present invention conducted experiments to evaluate skin whitening, which is an important factor of skin physiological factors, in order to classify the skin characteristics of healthy female subjects of 20 to 50 years old. 81 subjects who met the subject selection criteria of the present invention and 20 subjects who completed whitening skin classification in the dermatology department of Gyeongsang National University were selected from the basic data of the subjects possessed by the pros and then the skin characteristics were classified and samples were collected ). The sample means saliva or blood. For example, the saliva was collected twice, and the first saliva was collected after subjects were fasted one hour before collection, and the second saliva was obtained immediately after the morning wake.
분류는 다음과 같은 기준으로 수행하였다.The classification was carried out according to the following criteria.
○ 피부 색 (미백)의 분류 : 피부 색은 최소홍반량 (MED)에 따라 다음과 같이 분류하였고, MED 47 이상은 대조군, MED 38 이하는 시험군으로 사용하였다. ○ Skin color (whitening) classification: Skin color was classified according to the minimum erythema (MED) as follows: MED 47 or higher was used as a control group, and
상기 피험자 중 ① 임신, 수유 중 또는 6 개월 이내에 임신을 계획하고 있는 경우, ② 피부질환의 치료를 위해 스테로이드가 함유된 피부외형제를 1 개월 이상 사용한 경우, ③ 동일한 시험에 참가한 뒤 6 개월이 경과되지 않는 경우, ④ 민감성, 과민성 피부를 가진 경우, ⑤ 시험부위에 점, 여드름, 홍반, 모세혈관확장 등의 피부 이상 소견이 있는 경우, ⑥ 시험시작 3 개월 이내에 시험부위에 동일 또는 유사한 화장품 또는 의약품을 사용한 경우, ⑦ 시험부위에 시술(피부 박피술, 보톡스, 기타 피부관리)을 받거나 6 개월 이내 계획한 경우, ⑧ 만성 소모성 질환이 있는 경우 (천식, 당뇨, 고혈압 등), ⑨ 아토피 피부염을 가지는 경우, ⑩ 그 외 주 시험자의 판단으로 시험이 곤란하다고 판단되는 경우는 피험자에서 제외하였다.If you are pregnant or breastfeeding, or if you plan to become pregnant within 6 months, (2) you have used steroid-containing skins for at least one month to treat skin conditions, (3) you have not taken more than six
실시예 2: 피부의 특성에 따른 유전자형 분석Example 2: Analysis of genotypes according to skin characteristics
Affymetrix Axiom(TM) ASI array plate를 이용하여 피부타입별 시료들의 유전자형 분석 (geno-typing)을 수행하였다.Genotyping of the skin type samples was performed using the Affymetrix Axiom (TM) ASI array plate.
피부타입은 상기 실시예 1의 기준에 의해서 미백 여부를 판단하기 위하여, 각 군은 시험군 20명, 대조군 20명 총 40명으로 구성하였고, 시험군 혹은 대조군 시료를 구성하는 개수의 50%는 40대 여성의 타액에서 얻어졌으며, 나머지 50%는 20대 여성의 혈액에서 얻어졌다.In order to determine whether the skin type was whitened according to the criteria of Example 1, the skin type consisted of 40 persons in each of 20 test groups and 20 control groups, and 50% of the test group or control group was 40 And the remaining 50% was obtained from the blood of women in their twenties.
각 군에 해당하는 여성들의 타액 혹은 혈액은 QIAmp mini gDNA prep kit (QIAGEN, Korea)을 이용하여 gDNA를 추출하였고, OD 260/280 > 1.7, 10ng/㎕이상, 1xTAE 1% 아가로스 겔에서 intact gDNA 밴드를 확인한 후 유전자형 분석 실험을 진행하였다. Axiom ASI plate를 이용한 유전자형 분석 실험은 매뉴얼을 따라 진행하였으며, Axiom ASI plate kit에 포함된 시약을 이용하여, gDNA 증폭, DNA 단편화 (fragmentation), 품질관리 (quality control), 혼성화 (hybridizaion), 염색 (staining), 스캐닝 (scanning)의 과정을 거쳐 수행하였다. 칩의 이미지는 GeneTitan MC(Affymetrix) 시스템과 CeneChip Command Console Software(AGCC)를 이용하여 스캔하였고, 스캔한 이미지인 dat 파일은 AGCC에 의해 자동으로 cel 파일로 변환되었다. 각 칩에 대한 cel 파일은 genotyping console 4 프로그램을 이용하여 data quality control 및 genotype call을 수행하였다. 이와 같은 Affymetrix Axiom(TM) ASI array plate를 이용한 유전자 분석 실험 방법의 전체적인 개략도를 도 1에 나타냈다. The saliva or blood of women in each group was extracted with QIAmp mini gDNA prep kit (QIAGEN, Korea) and OD260 / 280> 1.7, more than 10ng / ㎕,
총 40개 시료의 genotyping chip 실험이 진행되었고, 시험군의 1개 시료가 QC를 통과하지 못하여 유전자형 분석 결과가 생성되지 않았다. QC 기준은 Axiom Chip의 DISHQC value가 0,82 이상, genotype call rate이 97% 이상이면 통과된다.A total of 40 genotyping chip tests were performed, and one sample in the test group failed to pass QC, resulting in no genotyping results. QC standards are passed if the DISHQC value of the Axiom Chip is greater than 0,82 and the genotype call rate is more than 97%.
실시예 3: 피부 타입별 유전자형 분석을 이용한 미백 피부의 유전자 다형성 조사 및 유의적 SNP 선별Example 3: Investigation of genetic polymorphisms of skin whitening skin using SNP genotype analysis and screening of significant SNPs
피부 타입과 연관된 유전자형을 검출하기 위하여 시험군/대조군들의 SNP 마커를 이용한 연관분석을 수행하였다. 이를 위해 PLINK 1.07 프로그램을 사용하였으며, 각 마커들의 QC를 위한 파라미터로서, MAF(Minor Allele Frequency) > 0.1, HWE(Hardy-Weinberg Equilibrium) > 0.001로 설정하였다.In order to detect genotypes associated with skin type, association analysis using SNP markers of test group / control group was performed. For this, we used the PLINK 1.07 program and set MAF (Minor Allele Frequency)> 0.1 and Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE)> 0.001 as QC parameters for each marker.
각각 시험군/대조군을 비교하였고, 비교에 사용된 데이터 개수는 다음과 같다 (표 2). 피부 타입에 관련될 것으로 추정되는 최종 주요 SNP 마커들은 각 대립유전자 (allele)에 대한 카이제곱테스트의 유의수준이 p < 0.0001 이하이거나 혹은 p < 0.01이면서 Affymetrix SNP annotation이 피부 타입과 관련된 것들만 선택하였다.The test group / control group were compared, and the number of data used in the comparison was as follows (Table 2). The final major SNP markers predicted to be associated with the skin type selected only the Affymetrix SNP annotation associated with the skin type, with a significance level of the chi-square test for each allele of p <0.0001 or less, or p <0.01.
아울러, 미백에 관하여 카이제곱테스트의 유의수준이 p < 0.01인 것을 선택하였다.In addition, a significant level of chi-square test for whitening was selected to be p < 0.01.
미백에 대한 연관분석에 있어 각 마커들의 빈도에 대한 p-value의 로그값과 SNP의 염색체상 위치를 도 2에 나타냈다. 그 결과, 높은 유의성을 보이는 SNP 마커들은 염색체 1, 2, 5, 10번에 상에 존재했으며, 특히 염색체 10번의 연속된 특정 위치에 SNP들이 많이 존재함을 확인하였다. 이와 같은 민감성과 유의하게 관련된 주요 SNP 마커 리스트는 하기 표 3에 나타냈다.In the association analysis for whitening, the logarithm of the p-value with respect to the frequency of each marker and the chromosomal location of the SNP are shown in FIG. As a result, SNP markers showing high significance existed on
10번 염색체, 54169046 ~ 54203366 부근에 총 7개의 SNP들이 높은 유의성을 보였는데, 대부분 DKK1과 MLB2 유전자 사이에 존재하는 SNP 마커들이었다. 이는 rs12385751, rs996232, rs11003114, rs11003118, rs16933073, rs10824792, rs1031101이며, 흥미로운 것은 minor allele들이 대조군 (잘탐)에서 높은 빈도로 존재하는 반면, 시험군 (잘안탐)에서는 비교적 낮은 빈도로 검출되었다 (표 3). 따라서 이들 SNP 마커의 minor allele이 색소침착과 높은 연관이 있을 것으로 추정되었다.A total of seven SNPs showed high significance in the vicinity of chromosome 10, 54169046 ~ 54203366, mostly SNP markers existing between DKK1 and MLB2 genes. Interestingly, minor alleles were present at a high frequency in the control group, while they were detected at a relatively low frequency in the test group (Table 3) (Table 3) . Therefore, minor alleles of these SNP markers were predicted to be highly related to pigmentation.
그중 Versican (VCAN) 유전자가 가장 의미 있는 결과를 보였고, 특히 Versican의 2개 위치가 의의 있게 SNP를 보였는데, Versican 유전자상의 SNP인 rs1833890와 rs2652106는 염색체 5번의 82834514, 82829792 번째에 각각 위치한다.Among them, the Versican (VCAN) gene showed the most significant results, especially Versican two SNPs. Versican gene SNPs rs1833890 and rs2652106 are located on
미백과 유의하게 관련된 p < 0.01인 SNP 마커 리스트는 하기 표 4에 나타냈다.The SNP marker list with p <0.01 significantly associated with whitening is shown in Table 4 below.
Claims (5)
상기 피부 타입의 미백 여부 진단용 단일염기다형성 마커는 인간의 13번 염색체의 43418348번째 염기가 T 또는 C인(rs9525880), 상기 43418348번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것인, 피부 타입의 미백 여부 진단용 조성물.
A skin type whitening diagnosis composition comprising a probe capable of detecting a single nucleotide polymorphism (SNP) marker for skin type whitening diagnosis or an agent capable of amplifying,
The single nucleotide polymorphism marker for the skin type of whitening diagnosis is a polynucleotide consisting of 5-100 consecutive DNA sequences comprising 43418348 base of human chromosome 13 (rs9525880) with T or C (rs9525880) Or a complementary polynucleotide thereof.
A skin type whitening diagnosis kit comprising the composition of claim 1
상기 피부 타입의 미백 여부 진단용 단일염기다형성 마커는 인간의 13번 염색체의 43418348번째 염기가 T 또는 C인(rs9525880), 상기 43418348번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것인, 피부 타입의 미백 여부 진단용 마이크로어레이.
A skin-type whitening diagnosis microarray comprising a single nucleotide polymorphism (SNP) marker for skin type whitening diagnosis,
The single nucleotide polymorphism marker for skin type whitening diagnosis comprises a polynucleotide consisting of 5-100 consecutive DNA sequences comprising 43418348 base (439518880) of 43418348 base (rs9525880) of human chromosome 13, T or C Or a complementary polynucleotide of the same or a complementary polynucleotide of the skin type.
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 피부 타입의 미백 여부 진단용 단일염기다형성(SNP) 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계로서,
상기 피부 타입의 미백 여부 진단용 단일염기다형성 마커는 인간의 13번 염색체의 43418348번째 염기가 T 또는 C인(rs9525880), 상기 43418348번째 염기를 포함하는 5-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것인, 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 피부 타입의 미백 여부에 대한 정보의 제공 방법.
(a) obtaining DNA from a sample isolated from an individual;
(b) amplifying or hybridizing a polymorphic site of a single nucleotide polymorphism (SNP) marker for skin type whitening diagnosis from the DNA obtained in step (a)
The single nucleotide polymorphism marker for skin type whitening diagnosis comprises a polynucleotide consisting of 5-100 consecutive DNA sequences comprising 43418348 base (439518880) of 43418348 base (rs9525880) of human chromosome 13, T or C Or a complementary polynucleotide thereof; And
(c) identifying the base of the amplified or hybridized polymorphic site of step (b).
5. The method according to claim 4, wherein (d) the base of the amplified or hybridized polymorphic site is C, and if the base of the amplified or hybridized polymorphism site is T, Wherein the skin type is a skin type.
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