KR101738596B1

KR101738596B1 - 유전자 표적부위 염기서열분석방법 및 그 분석용 조성물

Info

Publication number: KR101738596B1
Application number: KR1020140064639A
Authority: KR
Inventors: 김재일; 신수경; 조우재; 홍선표; 김석준; 김수옥
Original assignee: (주)진매트릭스
Priority date: 2014-05-28
Filing date: 2014-05-28
Publication date: 2017-05-22
Also published as: KR20150136916A; WO2015182804A1

Abstract

본 발명은 유전자 표적부위 염기서열분석방법 및 그 방법을 이용한 유전자 표적부위 염기서열분석용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 다수의 변이가 존재하는 짧은 표적부위를 효율적이고 정확하게 증폭, 분석할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 짧은 표적부위의 증폭을 제한효소와 중합효소, 반응온도로 조절함으로서 합성 시작점은 같고 종결 지점은 다양한 각기 다른 계단식 증폭생성물을 얻게 된다. 이 생성물의 질량을 분석함으로서 짧은 표적부위의 염기서열분석이 가능하다.

Description

유전자 표적부위 염기서열분석방법 및 그 분석용 조성물{A METHOD FOR ANALYZING BASE SEQUENCE OF GENE TARGET REGION AND A COMPOSTION FOR ANALYZING BASE SEQUENCE OF GENE TARGET REGION}

본 발명은 유전자 표적부위 염기서열분석방법 및 그 방법을 이용한 유전자 표적부위 염기서열분석용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 2013년도 미래창조과학부의 재원으로 첨단의료기기사업본부-신기술융합형성장동력사업의 지원을 받아 수행된 연구이다(2013K000428).

휴먼게놈 프로젝트 완료 이후, 인간 질병에 관여하는 유전자 및 병원체의 유전자 정보 규명이 약 99% 정도 진행되어 질병 관련 유전자 메커니즘 규명, 질병의 진단 및 분류, 그리고 약물에 대한 반응을 예측 가능케 하는 유전자 분석 기술이 지속적으로 발달하고 있다. 휴먼게놈프로젝트에 의하면 인간 유전체 중 단 2%가 인간에 필요한 단백질 정보를 저장하고 있고, 50%는 반복 염기 서열로 구성되어 있다. 따라서 유전체 전체를 검사하지 않고 특정 표적부위만을 검사함으로서 유전자 분석 비용을 절감하고 분석의 편리성을 확보할 수 있다. 표적부위라 함은 질병에 관련되어 질환을 유발하는 단백질 발현 조절 유전자 부위 또는 약제내성을 갖는 돌연변이 지역 등의 특수 부분을 말한다.

기존의 표적부위 분석을 위한 유전자 분석법은 Sanger 법에 의한 염기서열분석법(DNA sequencing), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 단일염기연장반응(Single Base Extension, SBE)과 리가제 연쇄반응 (Ligase reaction, LCR) 등이 이용되어 왔다.

Sanger 법에 의한 염기서열분석법(DNA sequencing)은 넓은 범위의 변이를 조사 진단할 수 있다는 장점으로 인해 유전자 분석의 standard로 사용되고 있다. 원래의 DNA를 주형으로 하여 표지된 DNA를 합성해 나가는 방식으로 염기서열을 분석한다. 그러나 Sanger 법에 의한 염기서열분석법은 일반적인 사용 빈도에도 불구하고 돌연변이 검출에서 민감도가 떨어져 mutant DNA가 최소 20% 이상의 농도를 유지해야 검출 가능하고, somatic mutation 이나 virus mixture infection 상태로 존재할 경우, major 유전형의 진단만이 가능하거나 혹은 진단이 불가능하다는 점과 사용의 불편함 및 자동화에 대한 문제점이 있다. 또한 짧은 표적부위를 검출하기에는 한계가 존재하여 일정 길이 이상을 분석해야 하는 번거로움이 따른다는 단점도 있다.

파이로시퀀싱(Pyrosequencing)은 DNA 합성 시 방출되는 pyrophosphate를 검출하는 방법으로, 중합단계에서 4개의 염기(dNTP)를 하나씩 순차적으로 투입해 반응시킨다. 중합반응 시 순차적으로 들어간 각각의 dNTP와 반응하여 발생하는 PPi는 효소반응으로 빛을 발생하고, 발생된 빛은 시그널로 변환되어 각각의 dNTP가 반응한 수에 비례하여 높아지고 낮아지는 패턴을 나타내 염기서열을 결정할 수 있게 하는 기술이다.(Travasso, CM et al, J. Biosci., 33:73-80, 2008; Gharizadeh, B et al., Molecular and Cellular Probes, 20, 230-238, 2006; Hoffmann, C et al., Nucleic Acid Research, 1-8, 2007). 반응 시 동일한 서열이 연속적으로 나오면 방출되는 빛의 양이 늘어 피크가 높아지게 되는데, 여러 가지 타겟이 동일시료 내에 존재할 경우 염기서열의 구성에 따라 여러 가지 타겟의 염기서열의 피크가 중첩되어 나타나기 때문에 염기서열 확인에 어려움이 따른다. 특히 반복되는 서열의 개수가 증가하면 앞에 위치하는 서열의 피크가 상대적으로 낮아지는 특징이 있어 다중 시료의 경우 분별하고자 하는 피크를 확인하기가 어려운 단점이 있다.

단일염기연장반응(Single Base Extension, SBE)은 분석하고자 하는 변이 위치에 근접한 primer를 타겟 유전자에 붙이고 DNA 중합효소와 ddNTP를 이용하여 삽입된 염기를 동정하는 기술로서 단일염기변이 분석에 효율적이다.(Ross et al., Nat. Biotechnol.,16:1347, 1998). 그러나 제한된 범위 내에 많은 변이들을 갖고 있는 유전자변이 연구에는 적절하지 않다는 단점이 있다.

리가제 연쇄반응은 인접한 두 가닥의 서로 다른 프로브가 분석하고자 하는 유전자 서열과 완전히 상보적으로 결합한 경우에만 리가제에 의해서 연결되는 특징을 이용한 기술로 이를 질량분석기를 통해 확인하면, 해당 위치에 어떤 염기 서열을 가지고 있는지 파악이 가능 하다. (Jurinke et al., Anal. Biochem., 237:174, 1996). 그러나 리가제 연쇄반응은 두 가닥의 프로브가 연결되는 반응이므로, 리가제 연쇄반응 산물이 질량분석기에서 실험적으로 허용될 수 있는 질량보다 큰 경우가 많아 대량의 돌연변이 분석에는 한계가 있다.

또한 유전적 특성을 검출하여 유전자 정보를 얻는 방법으로 제한단편 길이 다형성(RFLP) 분석, 증폭단편 길이 다형성(AFLP) 분석, 펄스장 전기영동, 임의 프라임 중합효소 연쇄반응(AP-PCR), 반복서열-기초 PCR, 리보타이핑(Ribotyping) 및 비교 핵산 서열결정법 등의 경우에는 대체로 느리고, 비경제적이며, 재현불가능하고, 숙련된 기술을 요하기 때문에 대부분의 염기서열 분석에 대한 진단 환경에는 사용불가능하다.

위와 같이 다수의 염기서열 분석 방법 이외에도 modified nucleotide와 화학반응을 도입하여 염기서열을 절단하고 절단된 단편의 질량을 이용하여 서열정보를 얻는 방법이 보고된 바 있다.(Kay L. Nakamaye et al, Nucleic Acids Research, 16:9947-9959, 1988; Lenore M. Polo et al, Anal. Chem., 69:1107-1112, 1997) 위 방법은 표적부위의 선택적 분석이 가능하다는 장점이 있지만 chemical reaction의 부산물 등으로 인해 분석 시 간섭을 받을 수 있고, 고가의 modified nucleotide를 사용해야 하므로 임상에서 이용이 어려운 단점이 있다.

따라서 본 발명이 속하는 기술 분야에서는 염기서열 분석 시 제약이나 불편함이 없고, 효율적으로 표적하는 부위의 염기서열만을 정확히 분석할 수 있는 개선된 염기서열 분석방법을 개발해야 할 필요성이 지속적으로 요구되었다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 효율적인 표적부위의 염기서열 분석방법을 제공하는 것이다.

구체적으로, 본 발명은 분석하고자 하는 유전자 염기서열 짧은 표적부위를 염기서열의 시작점이 같고 종결점이 각기 다른 계단식 증폭산물을 만들어내는 염기서열 증폭 방법 및 이를 이용하여 염기서열을 분석하는 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 새로운 염기서열 증폭 및 분석 방법 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유전자 표적부위 염기서열분석방법:a) 니킹(Nicking) 제한효소(이하 니킹제한효소) 인지서열이 삽입된 프라이머를 이용하여 분석하고자 하는 짧은 표적부위 염기서열을 증폭하여 양 말단에 니킹제한효소 및 제한효소 인지서열이 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 생성하고 니킹제한효소 및 제한효소를 이용하여 합성 시작점은 같으나 종결점이 상이한 계단식 결과물을 생성하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 생성된 계단식 결과물의 질량을 측정하여 상보적인 염기서열에 맞춰 확장되는 염기의 종류를 알아내 염기서열을 분석하는 단계를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 a) 단계의 분석하고자 하는 짧은 표적 부위 염기서열의 염기 개수는 6 내지 19 개인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 a) 단계의 니킹제한효소는 Nt.BstNBI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, 및 Nt.BspQI으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 a) 단계의 제한효소는 타입 제한효소인 것이 바람직하고, 상기 타입 II 제한효소는 AcuI, AlwI, BbsI, BbvI, BccI, BceAI, BciNI, BcoDI, BfuAI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BspMI, BtgZI, BtsI, BtsIMutI, BtsCI, EarI, EciI, EcoP15I, FokI, HgaI, HphI, HpyAV, MboII, MlyI, MmeI, MnlI, PleI, SapI, SfaNI 등이 바람직하며, 가장 바람직하게는 FokI, 또는 BtsCI이 좋으나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 a) 단계의 양 말단에 니킹제한효소 및 제한효소 인지서열이 삽입된 폴리뉴클레오타이드로부터 합성 시작점은 같으나 종결점이 상이한 계단식 결과물 생성 시 Taq DNA 중합효소를 사용하는 것이 바람직 하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서,제 1항에 있어서, 상기 b) 단계의 합성 시작점은 같으나 종결점이 상이한 계단식 결과물의 질량을 측정하여 계단식 결과물의 그 질량 차이를 4가지 표식으로 인지할 때, 구아닌은 329.2, 아데닌은 313.2, 티민은 304.2, 및 시토신은 289.2의 질량 값을 가지는 것이 바람직 하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 니킹제한효소 인지서열이 삽입된 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 8, 및 서열번호 17 내지 19로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 B형 간염 바이러스 치료제에 대한 약제내성 분석, 인유두종바이러스(HPV)의 유전자형 결정 또는 인간유전자 중 선천성난청을 유발하는 유전자의 돌연변이를 분석하기 위한 용도인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 니킹제한효소 인지서열이 삽입된 프라이머를 유효성분으로 포함하는 유전자 표적부위 염기서열분석용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 상기한 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자들은 니킹제한효소 및 제한효소와 Taq DNA 중합효소를 특정온도에서 이용하면 분석하고자 하는 유전자 염기서열의 짧은 표적부위를 합성의 시작점이 같고 종결점이 각기 다른 계단식 증폭산물을 형성할 수 있다는 점에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서는 대표적인 염기서열 분석 방법을 제시하기 위해 짧은 표적부위를 발명한 염기서열 증폭 방법으로 증폭시키고, 이를 MALDI-TOF 질량분석기를 이용하여 분석하였다.

본 발명의 분석 방법은 MALDI-TOF 질량분석기에만 적용 가능한 기술이 아니고, PCR 증폭산물을 이용하여 염기서열을 분석하는 다양한 기술, 예를 들어 마이크로어레이 칩 또는 질량을 측정할 수 있는 다양한 분석기기 예를 들어 LC-MS 와 같은 염기서열 분석 기술에 적용될 수 있는 기반기술로서 이해되어야 할 것이다.

본 발명의 구성은 (A) 표적 부위 염기서열을 합성의 시작점이 같고 종결점이 각기 다르며, 시작점 기준으로 정렬 가능한 계단식 절편으로 증폭하는 단계, (B) (A)단계에 의해 증폭된 염기서열 단편을 질량을 측정하여 질량 값 비교 분석하는 단계를 포함한다. (A) 단계를 실시함에 있어서 한 쪽 프라이머는 니킹제한효소 인지서열을, 나머지 한 쪽 프라이머는 제한효소 인지서열을 포함하는데, “니킹제한효소 인지서열”이란 용어는 염기서열 분석을 위해 염기서열 단편 중 합성의 시작점이 되는 틈을 만들어 주는 서열로서 니킹제한효소가 인지서열을 인식하고 이중나선을 형성하는 염기 중 한 가닥 염기서열의 인산사슬을 절단하여 틈을 만드는 부위를 뜻한다. 구체적으로 후술하는 본 발명의 실시예에서 일례로서 사용된 니킹제한효소 Nt.BstNBI은 GAGTC 서열을 인지하고, 절단되는 위치는 인지서열의 3'말단으로부터 4번째 염기 다음이다. 한편, 본 발명에서 사용될 수 있는 제한효소는 Nt.BstNBI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, 및 Nt.BspQI 등이 있는데 이 중 인지서열로부터 절단위치가 떨어져 있고, 중합효소의 활성온도인 50℃ 이상에서 활성을 잃지 않는 Nt.BstNBI, Nt.BstPQI 등이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

포워드, 리버스 프라이머 중 한 쪽에 니킹제한효소 인지서열을 삽입하고 다른 한 쪽의 프라이머에 제한효소 인지서열을 삽입하여 생성되는 염기서열의 길이를 조절할 수 있으며, 사용되는 니킹제한효소, 제한효소에 따라 표적하는 짧은 염기서열 부위가 포함된 증폭산물의 길이를 자유롭게 조절할 수 있다. 이 때 만들어지는 증폭산물의 길이는 ~19mer까지가 적당하다. 먼저 제한효소의 작용으로 제한효소, 니킹제한효소의 인지서열이 삽입되어 증폭된 증폭산물의 한쪽 말단이 일정 부분 잘려 나가게 되고, 이후 온도에 변화를 주어 니킹제한효소가 활성을 갖게 되면 니킹제한효소의 작용으로 염기서열의 틈새가 만들어지게 된다. 온도 등의 외부 물리적 요인에 의하여 만들어진 염기서열의 틈새부터 이중구조가 풀어지게 되고 표적하는 염기서열을 포함한 증폭산물이 단일가닥으로 존재하게 되어 니킹제한효소 인지서열의 절단위치 이후부터 증폭이 시작되게 된다. 증폭의 시작과 동시에 니킹제한효소가 다시 작용함으로서 짧은 염기서열 표적부위는 특정 반응 온도에서 증폭 도중 쉽게 이중 구조가 풀려 증폭을 끝까지 이루지 못하고 반응용액으로 확산된다. 반응 온도는 니킹제한효소와 DNA 중합효소가 활성을 갖고, 짧은 이중 구조가 단일가닥으로 풀어질 수 있는 온도로서 55 내지 65 ℃ 사이를 뜻한다. 반응 온도에 따라 짧은 염기서열 표적부위 이중가닥이 단일가닥으로 확산되기 때문에 염기 이중가닥 중 한 가닥을 Displacement 할 수 있는 기능이 없는 Taq DNA 중합효소를 사용함에 있어서 반응에 영향을 주지 않는다는 것을 특징으로 한다. 이 때 반응 버퍼의 Mg² ⁺ 의 농도, 제한효소와 중합효소의 Unit에 따라 염기서열의 중합 속도를 조절 할 수 있고, 염기서열이 합성되는 속도보다 니킹제한효소가 합성 시작점을 만드는 속도가 빠르면 염기서열 합성으로 생성되고 있던 짧은 표적부위가 이중가닥을 유지하지 못하고 일정온도 이상에서 단일가닥으로 분리되어 합성이 중단될 수 있다. 따라서 합성 시작점은 같지만 합성완료 지점이 달라 절편의 길이가 상이한 염기서열이 형성된다. 반응 버퍼의 Mg² ⁺ 농도는 실험 결과에 따르면 5 mM 내지 20 mM이 바람직하고, 10 mM이상의 농도에서는 염기서열 증폭에 큰 영향을 미치지 않으므로 8 mM 내지 12 mM이 가장 바람직하나, 이에 제한되지 않으며 반응 조건에 따라 변화할 수 있다.

일정한 온도에서 증폭이 이뤄지기 때문에 반응시간을 조절할 필요가 있는데, 조성물을 모두 혼합하여 목표 온도에 도달하는 순간부터 증폭이 이뤄지게 되므로 증폭반응은 혼합 직후부터 다양한 시점에 종결시킬 수 있다. 또한 니킹제한효소의 첨가량에 따라 생성되는 증폭산물의 정도가 상이한데, 1, 2, 5, 10, 20 ,30U을 각각 첨가하여 반응을 수행한 결과 5U 이상의 니킹제한효소를 첨가하였을 때 안정적으로 표적부위를 분석할 수 있다. 따라서 5U 이상의 니킹제한효소를 반응에 첨가하는 것이 바람직하며 가장 바람직하게는 10U의 니킹제한효소를 반응에 첨가하여야 한다. 후술하는 실시예와 같이 분석 장비를 MALDI-TOF 질량분석기를 사용할 시에는 30분 이상의 증폭 반응 시간이 바람직하며 1시간 이상의 반응시간은 생성되는 염기서열의 양이 포화상태에 이르러 MALDI-TOF 질량분석기를 이용해 분석 시 영향을 주지 않으므로 30분 이상 1시간 이내의 반응시간이 가장 바람직하다. 이는 분석기술에 따라 다양하게 적용할 수 있다. 반응의 종결은 고온 및 유기용매 등의 화학물질을 이용하여 물리적으로 효소의 활성을 떨어뜨려 종결시킬 수 있다. 종결된 반응 생성물은 다음과 같은 방법으로 분석 가능하다. 질량값을 구할 수 있는 분석기기 예를 들면 MALDI-TOF MS, LC-MS 등을 이용하여 모든 반응생성물의 질량 값을 측정한 후 질량 값의 크기순으로 정렬하여 분자량의 차이만큼을 읽어내 첨가된 염기서열이 무엇인지 파악하는 것으로 각각의 염기를 순서대로 분석할 수 있다. 각각의 계단식 증폭산물의 질량을 측정하고 가장 큰 질량으로부터 순차적으로 차이를 계산하여 분석하는데, 질량의 차이가 329.2가 나면 구아닌으로 분석 가능하고, 313.2 차이라면 아데닌으로 분석 할 수 있다. 304.2 차이는 티민으로 분석 가능하며, 289.2 차이는 시토신으로 분석 할 수 있다. 각각의 질량 값은 염기서열분석법에서의 형광과 같은 표식으로서 사용되며 이러한 표식의 반복을 이용해 염기서열을 분석하면 연속되는 염기서열의 확인이 가능하며 이를 이용해 짧은 표적부위 염기서열 분석이 가능하다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 방법은 B형 간염 바이러스 치료제에 대한 약제내성을 분석하기 위한 것이 바람직하고 그 중 라미부딘의 Mrt204VIS 지역 등의 B형 간염 바이러스 치료제에 대한 약제내성 검출을 위한 것이 더욱 바람직하다. 또한 인유두종바이러스(HPV)의 유전자형을 결정하기 위한 것이 바람직하다. 그 중 16형, 18형 등의 고위험군 바이러스 감염을 검사하기 위한 것이 더욱 바람직하다. 또한 인간유전자 중 선천성난청을 유발하는 유전자의 돌연변이를 분석하기 위한 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 GJB2 유전자의 nt35, nt167, nt235의 deletion 돌연변이를 분석하는 것이 좋으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 따르면, 다수의 변이가 존재하는 짧은 표적부위를 효율적이고 정확하게 증폭, 분석할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 짧은 표적부위의 증폭을 니킹제한효소와 Taq DNA 중합효소, 반응온도로 조절함으로서 합성 시작점은 같고 종결 지점은 다양한 각기 다른 계단식 증폭생성물을 얻게 된다. 이 생성물의 질량을 분석함으로서 짧은 표적부위의 염기서열분석이 가능하다.

본 발명은 기존 염기서열분석방법이 갖는 돌연변이 검출 시 낮은 민감도 및 고비용, 다중시료 혼합 시 낮은 분별력 등의 단점을 보완하고 표적부위만을 선택적으로 증폭하여 분석함으로서 사용자 편의성 및 효율성을 증대시키고, 정확성을 높여 분석이 경제적이라는 장점이 있다.

추가로, 본 발명은 표적 부위의 증폭을 니킹제한효소와 DNA 중합효소 및 그 반응온도로 조절함으로서 합성 시작점은 같고 종결 지점은 다양한 각기 다른 계단식 증폭생성물을 생성한 후 분석기기를 다양하게 적용하여 질량값을 얻을 수 있고, 다양한 기법으로 표적부위의 염기서열분석이 가능하기 때문에 폭 넓은 분석방법에 적용할 수 있다는 장점이 있다.

따라서 본 발명은 염기변이분석을 필요로 하는 바이오, 의학 및 약학 분야, 범죄수사를 위한 유전자 감식 등 다양한 분야에 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명인 표적부위 염기서열 증폭 및 분석 방법에 대한 간략한 모식도
도 2는 본 발명 중 니킹제한효소의 처리량에 따른 결과 비교 - HBV 라미부딘 약제내성(rt204) 야생형 (a) 니킹제한효소 2U, (b) 니킹제한효소 5U, (c) 니킹제한효소 10U, (d) 니킹제한효소 30U
도 3은 본 발명 중 Taq DNA 중합효소의 추가에 따른 차이 비교 - HBV 라미부딘 약제내성(rt204) 야생형 (a) Taq 추가 적용, (b) Taq 미첨가
도 4는 본 발명을 적용한 HBV 라미부딘 약제내성(rt204) 분석 결과 - (a) 야생형, (b) 돌연변이형
도 5는 본 발명을 적용한 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 분석 결과 - 16형
도 6은 본 발명을 적용한 선천성 난청 유발 GJB2 돌연변이 분석 결과 - (a) 야생형, (b) nt167 돌연변이형

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.

실시예 1. 니킹제한효소의 첨가량에 따른 발명의 효과 증명

니킹제한효소의 첨가량에 따라 생성되는 계단식 증폭물의 증폭 시간, 증폭량 등에 영향을 미치게 된다. 제한효소의 첨가량이 많고, 증폭 시간이 길면 증폭량이 늘어나게 되고, 첨가량이 일정량 이하이면 증폭 시간이 길어도 계단식 증폭물을 형성하지 못한다. 이하 실시예 1은 B형 간염 바이러스의 약제내성 지역을 표적으로 하여 위의 니킹제한효소 첨가량에 따른 비교실험을 실시한 방법 및 결과의 나열이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 만성 간염, 간경변 그리고 간암 등의 만성 간질환을 유발 하는 비세포병변성(non-cytopathic) DNA 바이러스이다. 만성 B형간염의 치료제인 경구용 항바이러스제는 인터페론 등과 비교하여 부작용이 적고, 복용이 간편하기 때문에 널리 사용되고 있는데, 이러한 경구용 항바이러스제 중 하나인 라미부딘은 HBV 복제를 억제하는 효과가 우수하며 성별, 연령, 감염 경로, 다른 항바이러스제 치료 유무, HBV DNA 수치, 간질환의 정도 등 치료 전 환자 상태에 크게 영향을 받지 않는 등의 여러 가지 장점을 가지고 있다. 그러나 바이러스의 완벽제거가 불가능하기 때문에 약제를 지속적으로 복용해야 하고, 이에 따라 DNA 중합효소 유전자 내에 염기변이가 나타나게 되는데, rtL180M, rtM204V/I/S 등이 이에 따른 돌연변이로 보고되고 있다.

1. PCR 증폭

HBV 유전자 염기서열 중 라미부딘 약제내성 지역 부근에 프라이머 결합부분을 선택하여 한 쌍의 증폭 프라이머를 제작한다. 이 때 증폭 프라이머의 중앙에 니킹제한효소 인지서열을 삽입하여 PCR 증폭 후 염기서열분석에 활용되도록 하였다. 분석대상이 되는 HBV 염기서열에서 프라이머에 의해 증폭되는 주형 DNA의 서열(5‘-3’)은 하기와 같다.

라미부딘 약제내성-야생형

GCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATatgGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTC (서열번호 1)

HBV의 주형 DNA 서열들 중 밑줄 친 서열들은 아래의 프라이머1, 2가 결합하는 부위이다. 각각의 HBV 주형 DNA 서열의 전반부에 밑줄 친 부분은 프라이머 1이 결합하는 부위이고, 각각의 HBV 주형 DNA 서열의 후반부에 밑줄 친 부분은 프라이머 2가 결합하는 부위이다. 소문자로 표기된 염기는 “염기서열분석 표적부위”이다.

프라이머 1 (포워드)

GCTTTCCCCCACTGTTTGGCgagtcTTCAGTTA (서열번호 2)

프라이머 2 (리버스)

GACTTGGCCCCCAATAggatgCACATGATC (서열번호 3)

상기 프라이머 1에서 소문자로 표기된 서열은 Nt.BstNBI 등의 니킹제한효소 인지서열로서 본 실시예에서 본 발명을 이용하기 위해 Nt.BstNBI 의 인지서열을 임의로 삽입한 것이다. 상기 프라이머 2에서 소문자로 표기된 서열은 제한효소로 사용된 FokI 의 인지서열로서 본 실시예에서 본 발명을 이용하기 위해 임의로 삽입한 것이며, 프라이머 2에서 밑줄 친 부분은 표적부위 염기서열에 자연적으로 존재하는 FokI 인지서열을 제거하기 위하여 임의로 치환한 염기서열이다.

PCR 버퍼(PCR buffer) (1X), dNTP 400 mM, Taq DNA 폴리머라아제(Taq DNA Polymerase)(NEB, M0267S) 0.5U, 프라이머 1, 프라이머 2를 각각 400 nM 혼합하고 분석대상이 되는 HBV DNA 100 ng을 추가하여 총 반응부피를 25 ㎕로 맞추었다. 그리고 다음의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다.

94 ℃ 10분

94 ℃ 15초 56 ℃ 15초 72 ℃ 15초 (40 cycle)

72 ℃ 2분

이로써 생성되는 HBV DNA 단편의 서열은 다음과 같다.(5'→3')

GCTTTCCCCCACTGTTTGGCgagtcTTCAGTTAT [ atg ]GATCATGTGcatccTATTGGGGGCCAAGTC (서열번호 4)

상기 PCR을 통해 생성된 서열에서 전반부에 위치한 소문자로 표시된 부위는 니킹제한효소 인지서열이고, 후반부에 위치한 소문자 표시 부위는 FokI의 인지서열이다. 밑줄 친 부위는 제한효소에 의한 절단에 의해 생성되는 가장 긴 절편의 서열이며, 대괄호로([]) 표기된 부위는 “염기서열분석 표적부위” 이다. 서열번호 5는 야생형 DNA에 의해 생성된 DNA 단편의 서열이다.

2. 니킹제한효소에 의한 염기서열 절단 및 분석서열의 증폭

상기 PCR을 통해 증폭된 생성물 20 ㎕에 Nt.BstNBI(NEB R0607S)을 각각 1, 2, 5, 10, 20, 30U 첨가하고, Taq 폴리머라아제(NEB M0267S)1U, FokI(NEB R0109S) 0.5U, dNTP 100 mM, 반응 버퍼(Reaction buffer, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9 @25℃))를 총 반응부피 30 ㎕가 되도록 첨가하였다. 위 반응물을 37℃에서 30분, 60℃에서 60분, 95℃에서 5분간 반응시킨다.

생성되는 합성 시작점이 같고 종결점이 상이한 분석서열은 다음 표와 같다.

표 1은 실시예1에서 생성되는 염기서열 및 분자량

3. 말디- 토프 매스 스펙트로메트리 ( MALDI - TOF Mass Spectrometry )

제한효소로 처리한 상기 용액으로부터 생성된 DNA 절편을 순수분리한 후, 분리된 DNA 절편의 분자량을 측정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 생성된 DNA 절편의 순수 분리를 위해 Oasis (Waters) C18 이온 수지 교환 컬럼 (C18 reverse phase column chromatography)을 이용할 수 있다.

말디 매트릭스(MALDI matrix)[22.8 ㎎ 암모늄 시트레이트, 148.5 ㎎ 히드록시피콜린산(hydroxypicolinic acid), 1.12 ㎖ 아세토니트릴, 7.8 ㎖ H2O] 4 ㎕를 MALDI-TOF 질량분석기(Microflex LT, Bruker)의 앵커 칩 플레이트(Anchor chip plate)에 미리 점적(dotting)한 후, 37℃에서 30분 동안 건조시킨다. 정제 및 탈염 과정을 거친 샘플에 3차 증류수를 10 ㎕을 넣어 녹여낸 후, 건조된 MALDI 매트릭스 위에 2 ㎕ 점적하고, MALDI 매트릭스를 다시 37 ℃에서 30분 동안 건조시킨 후, MALDI-TOF 질량분석기로 분석한다.

분석방법은 MALDI-TOF 질량분석기의 매뉴얼을 따른다.

상기 반응에 의해 생성된 절편들의 분자량을 MALDI-TOF 질량분석기로 분석한 결과는 도 2에 도시되는 바와 같다. 2U의 니킹제한효소를 첨가하였을 경우에는 계단식 증폭물 생성 반응이 일어나지 않아 분석할 수 있는 peak의 개수가 일정하게 나타나지 않았고, 5U 이상의 니킹제한효소를 첨가하였을 때는 분석하고자 하는 표적부위를 포함하여 생성하고자 하는 증폭산물을 모두 증폭하는 것을 확인 할 수 있었다.

실시예 2. Taq DNA 중합효소의 별도 첨가에 따른 효과 증명

본 실시예에서는 Taq DNA 중합효소의 별도 첨가 없이도 계단식 증폭물의 생성이 가능함을 증명하고자 한다. 제한효소, 니킹제한효소의 인지서열을 삽입하기 위해 PCR을 수행할 때 사용되었던 Taq DNA 중합효소가 증폭물 안에 존재하기 때문에 별도의 Taq DNA 중합효소를 첨가하지 않고도 반응이 가능하다. 본 실시예에서는 실시예 1에서 사용하였던 HBV 약제내성 분석과 동일한 부위를 표적으로 하여 실험을 진행하였다. 사용한 프라이머, 생성되는 염기서열 및 PCR 증폭 과정 모두 상기 실시예 1과 동일하며, 니킹제한효소에 의한 염기서열 절단 및 분석서열의 증폭과정에서 Taq을 추가하는 실험과, 추가하지 않는 실험으로 진행하였다.

1. PCR 증폭

상기 실시예 1과 동일

2. 니킹제한효소에 의한 염기서열 절단 및 분석서열의 증폭

상기 PCR을 통해 증폭된 생성물 20 ㎕에 Nt.BstNBI(NEB R0607S) 10U, Taq 폴리머라아제(NEB M0267S)1U, FokI(NEB R0109S) 0.5U, dNTP 100 mM, 반응 버퍼(Reaction buffer, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9 @25℃))를 총 반응부피 30 ㎕가 되도록 첨가하였다. 또한 PCR증폭을 통해 동일한 방법으로 생성된 다른 튜브의 생성물 20㎕에는 Nt.BstNBI(NEB R0607S) 10U, FokI(NEB R0109S) 0.5U, dNTP 100 mM, 반응 버퍼(Reaction buffer, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9 @25℃))를 총 반응부피 30 ㎕가 되도록 첨가하였다. 위 반응물들을 37℃에서 30분, 60 ℃에서 60분, 95 ℃에서 5분간 반응시킨다.

생성되는 합성 시작점이 같고 종결점이 상이한 분석서열은 실시예 1과 동일하다.

이후 과정(말디-토프 매스 스펙트로메트리 과정) 또한 모두 실시예 1과 동일한 방법으로 수행되었다.

상기 반응에 의해 생성된 절편들의 분자량을 분석한 결과는 도 3에 도시되는 바와 같다. 도 3의 (a)와 (b)를 비교하였을 때 Taq DNA 중합효소의 추가가 반응의 정도에 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인 할 수 있다.

실시예 3. HBV LMV 약제 내성 분석

본 실시예에서는 라미부딘의 약제 내성을 보이는 표적부위를 전술한 바와 같은 본 발명을 이용해 증폭하였고, MALDI-TOF MS를 이용해 야생형과 돌연변이를 분석하였다.

1. PCR 증폭

표적하는 염기서열은 상기 실시예 1에 서술한 바와 같고, 표적하는 염기서열 중 돌연변이의 서열은 다음과 같다.

라미부딘 약제내성-rtM204V 돌연변이

GCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATgtgGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTC (서열번호 5)

PCR 증폭 과정 및 생성되는 염기서열 또한 상기 실시예 1과 동일하며 돌연변이를 포함하여 생성되는 염기서열 다음과 같다.

GCTTTCCCCCACTGTTTGGCgagtcTTCAGTTAT [ gtg ]GATCATGTGcatccTATTGGGGGCCAAGTC (서열번호 6)

2. 니킹제한효소에 의한 염기서열 절단 및 분석서열의 증폭

실시예 1과 같이 상기 PCR을 통해 증폭된 생성물 20 ㎕에 Nt.BstNBI(NEB R0607S) 10U, Taq 폴리머라아제(NEB M0267S)1U, FokI(NEB R0109S) 0.5U, dNTP 100 mM, 반응 버퍼(Reaction buffer, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9 @25℃))를 총 반응부피 30 ㎕가 되도록 첨가하였다. 위 반응물을 37℃에서 30분, 60 ℃에서 60분, 95 ℃에서 5분간 반응시킨다.

생성되는 합성 시작점이 같고 종결점이 상이한 야생형 분석서열은 실시예 1과 동일하며, 돌연변이 분석서열은 다음과 같다.

표 2는 실시예3에서 생성되는 염기서열 및 분자량

상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.

상기 반응에 의해 생성된 절편들의 분자량을 MALDI-TOF 질량분석기로 분석한 결과는 도 4에 도시되는 바와 같고, 다양한 HBV 라미부딘 약제내성 돌연변이에 대한 분석결과를 정리하여 분자량으로서 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 2의 결과를 기초로 HBV 라미부딘 약제내성의 야생형(a)과 돌연변이형(b)을 구분하여 결정할 수 있다.

도 4에 도시된 염기서열분석 결과에 따르면 본 실시예에 따른 증폭산물로 라미부딘 약제내성 돌연변이형이 데이터의 분자량을 비교 분석함으로서 빠르고 편리하게 구분됨을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 증폭 방법은 Mass를 이용한 분석방법에 적용 가능하고 다수의 염기서열분석에 있어 간편하고 효율적으로 표적한 부위만을 정밀하게 분석할 수 있다는 장점이 있다.

한편, 본 실시예에서는 HBV　DNA 라미부딘 약제내성을 갖는 rt204 지역을 표적으로 하여 2가지 종류의 돌연변이를 분석하였지만 HBV DNA 라미부딘 약제내성을 갖는 다른 돌연변이에 대해서도 위 발명을 이용한 PCR 증폭을 응용할 수 있다. 분석 가능한 rt204 돌연변이 예상 생성서열은 다음 표와 같다. 일반적인 염기서열분석법에서 각각의 형광이 각각의 염기를 대표하는 표식으로서 서열을 분석 할 수 있듯이, 본 발명에서는 각각의 특정한 질량값이 각각의 염기를 대표하여 서열을 분석할 수 있다. 이는 질량 값을 계산하여 미리 서열을 예측할 수 있기도 하고, 사전 정보 없이도 염기서열을 분석할 수 있다는 특징을 갖는다.

표 3은 분석 가능한 rt204 돌연변이 예상 생성서열

실시예 4. 인유두종 바이러스( HPV ) 유전형 분석

본 실시예 4 에서는 짧은 표적부위의 길이를 20mer로 하도록 프라이머를 선정하여 결과 분석이 가능함을 증명하고자 한다. 그 타겟으로는 인유두종바이러스(HPV) 16형 DNA를 사용하였다.

인유두종바이러스(HPV)는 약 7,900 개의 염기쌍으로 이루어진 이중나선 원형의 DNA 유전자를 가진 바이러스로 현재 120 여종의 유전형이 발견되었고 이 중 60 여종이 생식기에 감염되는 것으로 알려져 있다. 자궁경부암 발병 과정에서 HPV의 감염이 핵심 역할을 한다는 사실이 입증되었고, 지속적인 HPV 고위험군 감염이 자궁경부 고등급 병변과 자궁경부암의 원인임이 알려지면서 자궁경부 세포진 검사와 함께 HPV 유전형검사의 임상적 효용성에 대한 관심이 증대되고 있다.

1. PCR 증폭

HPV 유전자 염기서열 중 유전형 구분이 가능한 표적부위를 증폭하는 한 쌍의 증폭 프라이머를 제작한다. 이 때 포워드 프라이머의 중앙에 니킹제한효소 인지서열을 삽입하고, 리버스 프라이머의 중앙에 FokI 제한효소 인지서열을 삽입하여 PCR 증폭 후 염기서열분석에 활용되도록 하였다. 분석대상이 되는 HPV 16형 염기서열에서 프라이머에 의해 증폭되는 주형 DNA의 서열(5'→3')은 하기와 같다.

HPV 16형 염기서열

GCACAGGGCCACAATAAtggcatttgttggggtAACCAACTATTTGTTACTGTTGTTGATACTACACG (서열번호 7)

HPV의 주형 DNA 서열들 중 밑줄 친 서열들은 아래의 프라이머3, 4 가 결합하는 부위이다. 각각의 HPV 주형 DNA 서열의 전반부에 밑줄 친 부분은 프라이머 3이 결합하는 부위이고, 각각의 HPV 주형 DNA 서열의 후반부에 밑줄 친 부분은 프라이머 4가 결합하는 부위이다. 소문자로 표기된 염기는 “염기서열분석 표적부위”이다.

프라이머 3 (포워드)

GCACAGGGgagtcCACAATAA (서열번호 8)

프라이머 4 (리버스)

CGTGTAGTATCAACAACAGTAACAggatgATAGTTG (서열번호 9)

상기 프라이머에서 소문자로 표기된 서열은 Nt.BstNBI 등의 니킹제한효소 인지서열로서 본 실시예에서 본 발명을 이용하기 위해 Nt.BstNBI 의 인지서열을 임의로 삽입한 것이다. 상기 프라이머 4에서 소문자로 표기된 서열은 FokI 의 인지서열로서 본 실시예에서 본 발명의 이해를 도와 발명의 효과를 극대화 하기위해 임의로 삽입한 것이다. 위 프라이머 3, 4의 경우 밑줄 친 프라이머 부위 중 일정 부분에 single letter code(R, Y, M, K, S, W, H, B, V, D 및 N 등)를 삽입하여 디자인할 수 있다.

PCR 버퍼(PCR buffer) (1X), dNTP 400 mM, Taq DNA 폴리머라아제(Taq DNA Polymerase)(NEB, M0267S) 0.5U, 프라이머 3, 프라이머 4를 각각 400 nM 혼합하고 분석대상이 되는 HBV DNA 100 ng을 추가하여 총 반응부피를 25 ㎕로 맞추었다. 그리고 다음의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다.

94 ℃ 10분

94 ℃ 15초 45 ℃ 15초 72 ℃ 15초 (50 cycle)

72 ℃ 2분

이로써 생성되는 HPV 16형 DNA 단편의 서열은 다음과 같다.(5'→3')

GCACAGGGgagtcCACAATAAT[ggcatttgttggggta]ACCAACTATcatccTGTTACTGTTGTTGATACTACACG(서열번호 10)

상기 PCR을 통해 생성된 서열에서 전반부에 위치한 소문자로 표시된 부위는 니킹제한효소 인지서열이고, 후반부에 위치한 소문자 표시 부위는 FokI의 인지서열이다. 밑줄 친 부위는 제한효소에 의한 절단에 의해 생성되는 가장 긴 절편의 서열이며, 대괄호로([]) 표기된 부위는 “염기서열분석 표적부위” 이다.

2. 니킹제한효소에 의한 염기서열 절단 및 분석서열의 증폭

상기 PCR을 통해 증폭된 생성물 20 ㎕에 Nt.BstNBI(NEB R0607S) 10U, Taq 폴리머라아제(NEB M0267S)1U, FokI(NEB R0109S)0.5U, dNTP 100 mM 반응 버퍼(Reaction buffer, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9 @25℃))를 총 반응부피 30 ㎕가 되도록 첨가하고 37℃에서 30분, 60 ℃에서 60분, 95 ℃에서 5분간 반응시킨다. FokI의 첨가는 생성되는 DNA의 절편을 보다 짧게 하여 DNA 생성 효과를 극대화하기 위함이다.

표 4는 실시예4에서 생성되는 염기서열 및 분자량

실시예 1과 동일하게 진행한다.

상기 반응에 의해 생성된 절편들의 분자량을 MALDI-TOF 질량분석기로 분석한 결과는 도 5에 도시되는 바와 같다. 도 5에 도시된 염기서열분석 결과에 따르면 본 발명은 표적부위를 포함한 계단식 염기서열은 20mer 까지 생성 및 분석이 가능함을 알 수 있다. 또한 HPV 유전자형을 구분하는 표적 부위의 분석을 통해 HPV 16형 염기서열을 분석할 수 있다. 따라서 본 발명의 증폭 방법은 Mass를 이용한 분석방법에 적용 가능하고 다수의 염기서열분석에 있어 간편하고 효율적으로 유전자형을 구분지을 수 있다는 장점이 있다.

실시예 5. 선천성 난청 유발 돌연변이 다중분석

난청은 현재 발견되는 신생아의 선천성 질환 중 발병률이 높은 질환의 하나로 1,000명의 신생아당 0.9명부터 5.9명까지 보고되고 있다. 신생아 난청은 비유전적인 원인과 귀 속 달팽이관 내 세포들 사이 막의 통로를 구성하는 단백질인 GJB2 (connexin26)의 유전자 이상과 같은 유전적인 원인으로 인해 나타나는데, GJB2 유전자 변이는 열성유전이므로 부모로부터 물려받은 염색체 한 쌍에 모두 변이가 있을 경우 난청이 유발된다. GJB2에서 가장 빈발하는 3개의 소실 돌연변이(deletion)인 35delG, 167delT, 235delC 총 3개의 돌연변이를 조사함으로써 신생아 난청 선별 및 산전 예측이 가능하다.

본 발명이 다중 증폭 및 검출에도 이용가능한 지 여부를 추가로 확인하기 위해 선천성난청 유발 돌연변이 표적부위 nt35, nt167, nt235를 동시에 본 발명에 접목하여 PCR 수행 후 Nicking 증폭 수행하여 MALDI-TOF 질량분석기로 분석하였다.

1. PCR 증폭

GJB2 내의 nt35, nt167, nt235의 deletion 돌연변이를 분석하기 위해 세 쌍의 증폭 프라이머를 제작하였다. 분석대상이 되는 GJB2 유전자에서 프라이머에 의해 증폭되는 주형 DNA 서열(5'→3')은 하기와 같다.

nt35 일반형

ACGCTGCAGACGATCCTGGGGGgTGTGAACAAACACTCCACCAGCATTGG (서열번호 11)

nt35 돌연변이형

ACGCTGCAGACGATCCTGGGGG-TGTGAACAAACACTCCACCAGCATTGG (서열번호 12)

nt167 일반형

GCAGGCCGACTTTGTCTGCAACACCCtGCAGCCAGGCTGCAAGAACGTGTGCTA (서열번호 13)

nt167 돌연변이형

GCAGGCCGACTTTGTCTGCAACACCC-GCAGCCAGGCTGCAAGAACGTGTGCTA (서열번호 14)

nt235 일반형

CCATCTCCCACATCCGGCTATGGGCCcTGCAGCTGATCTTCGTGTCCACGCCAGC (서열번호 15)

nt235 돌연변이형

CCATCTCCCACATCCGGCTATGGGCC-TGCAGCTGATCTTCGTGTCCACGCCAGC (서열번호 16)

GJB2의 주형 DNA 서열 들 중 밑줄 친 서열들은 하기에 나열된 프라이머 3 내지 프라이머 8이 결합하는 부위들이다. 각각의 GJB2 주형 DNA 서열의 전반부에 밑줄 친 부분은 포위드 프라이머가 결합하는 부위이고, 후반부에 밑줄 친 부분은 리버스 프라이머가 결합하는 부위이다. 소문자로 표기된 염기는 염기서열 분석 표적 부위이다.

프라이머 5 (nt35 포워드)

ACGCTGCAGACGATgagtcCTGGGGG (서열번호 17)

프라이머 6 (nt167 포워드)

GCAGGCCGACTTTgagtcCTGCAACA (서열번호 18)

프라이머 7 (nt235 포워드)

CCATCTCCCACATCgagtcGGCTATGG (서열번호 19)

프라이머 8 (nt35 리버스)

CCAATGCTGggatgTGGAGTGTTTGTTCAC (서열번호 20)

프라이머 9 (nt167 리버스)

TAGCACACGTTCTggatgGCAGCCTGG (서열번호 21)

프라이머 10 (nt235 리버스)

GCTGGCGTGGACAggatgAAGATCAGC (서열번호 22)

PCR 버퍼(PCR buffer)(1X), MgSO₄ 2 mM, dNTP 200 mM, Taq 중합효소(Taq DNA Polymerase)(NEB M0267S) 1U, 프라이머 5과 프라이머 8, 프라이머 7와 프라이머 10를 각각 250 mM, 프라이머 6과 프라이머 9를 각각 150 mM 혼합하고, 분석대상이 되는 GJB2 DNA 100 ng을 넣어 총 반응부피를 25 ㎕ 로 맞추었다. 그리고 다음의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다.

94 ℃ 10분,

94 ℃ 15초, 56 ℃ 15초, 72 ℃ 15초 (40 cycle)

72 ℃ 5분

이로써 생성되는 GJB2 DNA 단편의 서열은 다음과 같다.(5'→3')

nt35 일반형

ACGCTGCAGACGATgagtcCTGG[GGGgTGTGAACA]AACACTCCAcatccCAGCATTGG (서열번호 23)

nt35 돌연변이형

ACGCTGCAGACGATgagtcCTGG[GGG-TGTGAACA]AACACTCCAcatccCAGCATTGG (서열번호 24)

nt167 일반형

GCAGGCCGACTTTGagtcCTGC[AACACCCtGCAG]CCAGGCTGCcatccAGAACGTGTGCTA (서열번호 25)

nt167 돌연변이형

GCAGGCCGACTTTGagtcCTGC[AACACCC-GCAG]CCAGGCTGCcatccAGAACGTGTGCTA (서열번호 26)

nt235 일반형

CCATCTCCCACATCgagtcGGCT[ATGGGCCcTGCA]GCTGATCTTcatccTGTCCACGCCAGC (서열번호 27)

nt235 돌연변이형

CCATCTCCCACATCgagtcGGCT[ATGGGCC-TGCA]GCTGATCTTcatccTGTCCACGCCAGC (서열번호 28)

상기 PCR을 통해 생성된 서열에서 소문자로 표시된 부위는 니킹제한효소 인지서열이고, 대괄호로([]) 표기된 부위는 제한효소에 의한 절단에 의해 생성되는 염기서열분석이 필요한 표적부위를 함유하는 절편의 서열이다.

2. 니킹제한효소에 의한 염기서열 절단 및 분석서열의 증폭

상기 PCR을 통해 증폭된 생성물은 본 발명의 실시예1에서 수행하였던 니킹제한효소에 의한 염기서열 절단 및 분석서열의 증폭 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

염기서열 분석을 위해 증폭, 생성되는 분석서열은 다음 표와 같다.

표 5는 실시예5에서 생성되는 염기서열 및 분자량

상기 반응에 의해 생성된 염기서열 분석을 위한 절편들은 본 발명의 실시예1에서 수행하였던 말디 토프 스펙트로메트리 전처리 과정을 동일하게 수행하였다.

상기 반응에 의해 생성된 절편들의 분자량을 말디-토프 매스 스펙트로메트리로 분석한 결과는 도 6에 도시되는 바와 같고, 다양한 경우의 GJB2 돌연변이에 대한 예상결과를 정리하여 분자량으로서 상기 표 5에 나타내었다. 상기 표 5의 결과를 기초로 GJB2 돌연변이형을 결정할 수 있다.

도 6에 도시된 염기서열분석 결과에 따르면 본 실시예에 따른 증폭산물로 GJB2 야생형과 돌연변이형의 구분이 분자량의 비교만으로 간편하게 표적부위의 염기서열을 분석할 수 있다. 도 6의 (a)는 야생형 GJB2 분석결과이고, (b)는 nt167의 돌연변이를 포함하는 GJB2 분석 결과이다. 표적부위의 염기서열 하나가 돌연변이로서 삭제됨에 따라 그 이후에 생성되는 염기서열이 각기 다른 분자량을 갖게 되며, 그 분자량의 차이를 계산하면 특정 염기의 대표 질량값이 나타나 돌연변이 형의 구분이 가능케 된다. 따라서 본 발명의 증폭 방법은 Mass를 측정 할 수 있는 그 어떤 기기를 사용하는 분석방법에 쉽게 적용 가능하고 짧은 표적부위 염기서열분석에 있어 간편하고 효율적으로 표적한 부위만을 정밀하게 분석 할 수 있다는 장점이 있다.

이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

<110> GENEMATRIX INC. <120> A METHOD FOR ANALYZING BASE SEQUENCE OF GENE TARGET REGION AND A COMPOSTION FOR ANALYZING BASE SEQUENCE OF GENE TARGET REGION <130> HY140519 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 59 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 1 gctttccccc actgtttggc tttcagttat atggatcatg tggtattggg ggccaagtc 59 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gctttccccc actgtttggc gagtcttcag tta 33 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gacttggccc ccaataggat gcacatgatc 30 <210> 4 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Fragment <400> 4 gctttccccc actgtttggc gagtcttcag ttatatggat catgtgcatc ctattggggg 60 ccaagtc 67 <210> 5 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rtM204V Mutant <400> 5 gctttccccc actgtttggc tttcagttat gtggatgatg tggtattggg ggccaagtc 59 <210> 6 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Fragment <400> 6 gctttccccc actgtttggc gagtcttcag ttatgtggat catgtgcatc ctattggggg 60 ccaagtc 67 <210> 7 <211> 68 <212> DNA <213> Human papillomavirus Type 16 <400> 7 gcacagggcc acaataatgg catttgttgg ggtaaccaac tatttgttac tgttgttgat 60 actacacg 68 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcacagggga gtccacaata a 21 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgtgtagtat caacaacagt aacaggatga tagttg 36 <210> 10 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Fragment <400> 10 gcacagggga gtccacaata atggcatttg ttggggtaac caactatcat cctgttactg 60 ttgttgatac tacacg 76 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 acgctgcaga cgatcctggg gggtgtgaac aaacactcca ccagcattgg 50 <210> 12 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant <400> 12 acgctgcaga cgatcctggg ggtgtgaaca aacactccac cagcattgg 49 <210> 13 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gcaggccgac tttgtctgca acaccctgca gccaggctgc aagaacgtgt gcta 54 <210> 14 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant <400> 14 gcaggccgac tttgtctgca acacccgcag ccaggctgca agaacgtgtg cta 53 <210> 15 <211> 55 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 ccatctccca catccggcta tgggccctgc agctgatctt cgtgtccacg ccagc 55 <210> 16 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant <400> 16 ccatctccca catccggcta tgggcctgca gctgatcttc gtgtccacgc cagc 54 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 acgctgcaga cgatgagtcc tggggg 26 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gcaggccgac tttgagtcct gcaaca 26 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ccatctccca catcgagtcg gctatgg 27 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ccaatgctgg gatgtggagt gtttgttcac 30 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tagcacacgt tctggatggc agcctgg 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gctggcgtgg acaggatgaa gatcagc 27 <210> 23 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Fragment <400> 23 acgctgcaga cgatgagtcc tggggggtgt gaacaaacac tccacatccc agcattgg 58 <210> 24 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Fragment <400> 24 acgctgcaga cgatgagtcc tgggggtgtg aacaaacact ccacatccca gcattgg 57 <210> 25 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Fragment <400> 25 gcaggccgac tttgagtcct gcaacaccct gcagccaggc tgccatccag aacgtgtgct 60 a 61 <210> 26 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Fragment <400> 26 gcaggccgac tttgagtcct gcaacacccg cagccaggct gccatccaga acgtgtgcta 60 60 <210> 27 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Fragment <400> 27 ccatctccca catcgagtcg gctatgggcc ctgcagctga tcttcatcct gtccacgcca 60 gc 62 <210> 28 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Fragment <400> 28 ccatctccca catcgagtcg gctatgggcc tgcagctgat cttcatcctg tccacgccag 60 c 61

Claims

a) 니킹(Nicking) 제한효소 인지서열이 삽입된 프라이머를 이용하여 분석하고자 하는 표적부위 염기서열을 증폭하여 양 말단에 니킹제한효소 및 제한효소 인지서열이 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 생성하고 니킹제한효소 및 제한효소를 이용하여 합성 시작점은 같으나 종결점이 상이한 계단식 결과물을 생성하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서 생성된 계단식 결과물의 질량을 측정하여 상보적인 염기서열에 맞춰 확장되는 염기의 종류를 알아내 염기서열을 분석하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 니킹제한효소 인지서열이 삽입된 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 17, 서열번호 18, 및 서열번호 19에 기재된 프라이머로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머인 것을 특징으로 하는 유전자 표적부위 염기서열분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 a) 단계의 분석하고자 하는 표적 부위 염기서열의 염기 개수는 6 ~ 19 개인 것을 특징으로 하는 유전자 표적부위 염기서열 분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 a) 단계의 니킹제한효소는 Nt.BstNBI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, 및 Nt.BspQI으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 표적부위 염기서열분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 a) 단계의 제한효소는 타입 Ⅱ 제한효소인 것을 특징으로 하는 유전자 표적부위 염기서열분석방법.
제 4항에 있어서, 상기 타입 II 제한효소는 AcuI, AlwI, BbsI, BbvI, BccI, BceAI, BciNI, BcoDI, BfuAI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BspMI, BtgZI, BtsI, BtsCI, EarI, EciI, EcoP15I, FokI, HgaI, HphI, HpyAV, MboII, MlyI, MmeI, MnlI, PleI, SapI, 및 SfaNI으로 구성된 군으로부터 선택된 제한효소인 것을 특징으로 하는 유전자 표적부위 염기서열분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 a) 단계의 양 말단에 니킹제한효소 및 제한효소 인지서열이 삽입된 폴리뉴클레오타이드로부터 합성 시작점은 같으나 종결점이 상이한 계단식 결과물 생성 시 Taq DNA 중합효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 유전자 표적부위 염기서열분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 b) 단계의 합성 시작점은 같으나 종결점이 상이한 계단식 결과물의 질량을 측정하여 계단식 결과물의 그 질량 차이를 4가지 표식으로 인지할 때, 구아닌은 329.2, 아데닌은 313.2, 티민은 304.2, 및 시토신은 289.2의 질량 값을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자 표적부위 염기서열분석방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 방법은 B형 간염 바이러스 치료제에 대한 약제내성 분석, 인유두종바이러스(HPV)의 유전자형 분석 또는 인간유전자 중 선천성난청을 유발하는 유전자의 돌연변이를 분석하기 위한 용도인 것을 특징으로 하는 유전자 표적부위 염기서열분석방법.
니킹제한효소 인지서열이 삽입된 프라이머, 니킹제한효소 및 제한효소를 유효성분으로 포함하고,
여기서, 상기 니킹제한효소 인지서열이 삽입된 프라이머를 사용하여 표적부위 염기서열을 증폭하여 양 말단에 니킹제한효소 및 제한효소 인지서열이 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 생성하고 상기 니킹제한효소 및 제한효소를 이용하여 합성 시작점은 같으나 종결점이 상이한 계단식 결과물을 생성하고,
여기서, 상기 니킹제한효소 인지서열이 삽입된 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 8, 서열번호 17, 서열번호 18, 및 서열번호 19로 구성된 프라이머 군으로부터 선택된 프라이머인 것을 특징으로 하는 유전자의 돌연변이를 분석하기 위한 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 조성물은 상기 생성된 계단식 결과물의 질량을 측정하여 상보적인 염기서열에 맞춰 확장되는 염기의 종류를 알아내는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 조성물은 B형 간염 바이러스 치료제에 대한 약제내성 분석,
인유두종바이러스(HPV)의 유전자형 분석, 또는
인간유전자 중 선천성난청을 유발하는 유전자의 돌연변이 분석에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 12항에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스 치료제는 라미부딘인 것을 특징으로 하는 조성물.