KR101732594B1

KR101732594B1 - 피부 각질 줄기세포 증식용 조성물

Info

Publication number: KR101732594B1
Application number: KR1020090075678A
Authority: KR
Inventors: 신동욱; 박준성; 김동현; 노민수; 김덕희
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2009-08-17
Filing date: 2009-08-17
Publication date: 2017-05-10
Also published as: WO2011021818A3; JP2013502410A; WO2011021818A2; KR20110018067A; CN102470093B; CN102470093A; HK1164747A1

Abstract

4',7,8-트리하이드록시이소플라본, 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 및 3',4',7-트리하이드록시이소플라본을 포함하는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체를 유효성분으로 함유하는 피부 재생력 향상 또는 피부탄력 개선용 조성물이 개시된다. 상기 조성물은 피부 각질 줄기세포의 증식을 유도하여, 피부 재생력 향상 또는 피부탄력 개선 효과를 나타내며, 이를 통해 화장품 또는 의약 분야에서 다양하게 활용 가능하다.

오르토-디하이드록시이소플라본, 피부 각질 줄기세포, 피부 외용제

Description

피부 각질 줄기세포 증식용 조성물 {Compositions for Epidermal Keratinocyte Stem Cells Proliferation}

본 발명은 인간 피부 각질 줄기세포(Epidermal Keratinocyte Stem Cells, KSC) 증식 효능이 있는 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체 함유 조성물에 관한 것이다.

피부의 가장 중요한 역할은 외부의 손상 및 세균의 침입으로부터 인체를 보호하는 방어장벽(defense barrier)의 역할을 함과 동시에 내부로부터의 열과 수분의 손실을 방지하는 것이다. 피부는 구조적으로 크게 표피(epidermis) 및 진피(dermis)를 포함하며, 표피는 납작한 육각형 모양의 죽은 세포로 구성된 각질층(Stratum Corneum)과 살아있는 표피로 나눌 수 있다.

살아있는 표피는 기저층(Stratum Basale), 유극층(Stratum Spinosum), 과립층(Stratum Granulosum), 및 투명층(Stratum lucidum)의 4 개의 층을 포함한다. 이중에서 기저층에 피부의 각질 줄기세포(Keratinocyte stem cells, KSC)가 위치하고 있으며, 피부 각질 줄기세포가 지속적으로 분열하여 전이-증폭 세포(Transit Amplifying Cells, TA cells)를 만들게 된다. 이 세포들은 수차례의 분열을 하며, 피부 발생학적으로 중/후반부에 해당되는 피부 장벽기능에 중추역할을 하는 각질 세포(Keratinocyte cells)를 형성한다. 각질 세포는 분화(differentiation)를 진행하여, 피부 발생학적으로 마지막 단계인, 피부 표면으로 밀려 올라가게 된다. 이 과정에서 각질 세포의 분화와 각화(Keratinazation)가 일어나면서 각질층을 만들게 되며, 결국에는 각질 세포는 각질층에서 떨어져 나간다.

사람이 나이가 들어가게 됨에 따라, 이러한 피부 각질 줄기세포(Keratinocyte Stem Cells, KSC)와 전이-증폭 세포(Transit Amplifying Cells, TA cells)를 증식하는 능력이 저하된다. 각질세포를 만드는 능력이 저하되면, 결국에는 피부재생 능력이 감퇴되면서, 피부탄력 저하 등의 노화 현상이 심화된다 (Fuchs E. Nature. 2007 Feb 22;445(7130):834-42).

본 발명의 일실시예의 목적은 피부 재생력 향상 또는 피부탄력 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은 피부 재생력 향상 또는 피부탄력 개선용 화장료 또는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 조성물은, 4',7,8-트리하이드록시이소플라본, 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 및 3',4',7-트리하이드록시이소플라본을 포함하는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체를 유효성분으로 함유한다.

본 발명에 따른 조성물은 피부 각질 줄기세포의 증식을 유도함으로써, 피부 재생력 향상 및/또는 피부탄력 개선효과를 나타내며, 이를 통해 화장품 또는 의약 분야에서 다양하게 활용 가능하다.

본 발명은 피부 재생력 향상 및/또는 피부탄력 개선용 조성물에 관한 것으 로, 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다. 일실시예에서, 상기 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체는, 예를 들어, 4',7,8-트리하이드록시이소플라본, 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 및 3',4',7-트리하이드록시이소플라본을 포함하는 군으로부터 선택되는 1 종 이상일 수 있다.

상기 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체는, 피부 각질 줄기세포의 증식을 통해, 피부 재생력을 향상시키고, 피부탄력을 개선시키는 효능이 인정된다. 구체적으로는, 피부 각질 줄기세포는 지속적으로 분열하여 전이-증폭 세포(Transit Amplifying Cells, TA cells)를 만들게 된다. 이러한 전이-증폭 세포들은 십여차례 이상의 분열을 하면서 피부의 주요 세포중의 하나인 각질 세포(Keratinocyte cells)가 되며, 분화(differentiation)를 통해 피부 표면으로 올라가게 된다. 따라서, 피부 각질 줄기세포(Keratinocyte Stem Cells, KSC)의 증식을 통해 궁극적으로는 표피를 재생시키는 역할을 하게 된다(Fuchs E. Nature. 2007 Feb 22;445(7130):834-42).

일실시예에서, 상기 4',7,8-트리하이드록시이소플라본, 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 및 3',4',7-트리하이드록시이소플라본은 각각 다음의 화학식 1~3과 같이 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체들인, 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 4',7,8-트리하이드록시이소플라본 및 3',4',7-트리하이드록시이소플라본은, 당업계에 알려진 공지의 방법으로 제조될 수 있다. 상기 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체는, 예를 들어 다이드제인(daidzein)을 생변환함으로써 제조할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

일실시예에서, 상기 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체는, 조성물 전체 중량을 기준으로, 0.001 내지 30 중량%의 양으로 함유될 수 있다. 상기 유도체의 함량이 0.001 중량% 미만이면 피부 각질 줄기세포의 증식을 통한 피부 재생 및 탄력 개선의 효과를 충분히 얻을 수 없고, 30 중량%를 초과하면 효과의 증가가 크지 않기 때문에 비효율적이며 제형 안정성에 문제가 생길 수 있다.

또한, 피부 각질 줄기세포(Keratinocyte Stem Cells, KSC)와 전이-증폭 세포(Transit Amplifying Cells, TA cells)에 대한 표지마커(단백질)를 동정하였으며, 그 결과 CD71과 알파6 인테그린(alpha 6 integrin)을 표지마커로 확인하였다.

CD71 단백질(또는 Transferrin 수용체)은 세포막에 존재하는 단백질로, 세포 혈류를 타고 흐르는 철분과 결합되는 트랜스패린(transferrin) 단백질과 상호작용을 하여, 수용체를 매개로하는 트랜스패린 단백질의 함입(receptor mediated transferrin endocytosis)이라는 과정을 거쳐 세포 내에 철분을 공급하는 역할을 한다. 철분은 보통 독성을 지니므로, 세포 내 철분의 양은 CD71 단백질의 발현량 등을 통해 잘 조절되어야 한다.

또 하나의 표지마커로 알파6 인테그린(alpha 6 integrin)이 밝혀졌는데, 상기 표지마커의 단백질이 발현되지 않는 넉아웃 생쥐(knockout mice)에서 심각한 피부 수포가 생긴 것이 관찰되었으며, 출생하자마자 죽는 것으로 알려져 있다. 알파6 인테그린(alpha 6 integrin)은 피부 각질 줄기세포(Keratinocyte Stem Cells, KSC)에서 주로 베타4 인테그린(beta 4 integrin)과 결합된 상태로, 헤미데스모솜 (hemidesmosome)이라고 하는 세포 구조 복합체의 중요한 인자를 이루고 있다. 알파6 인테그린은 세포의 상호 전달(cellular communication), 세포 이동, 증식, 및 분화와 같은 다양한 영역의 세포 기능에 영향을 주는 것으로 알려져 있다.

일반적으로, 피부를 만드는 초기 단계(early stage)는 피부 각질 줄기세포(Keratinocyte Stem Cells, KSC)와 전이-증폭 세포(Transit Amplifying Cells, TA cells)가 중요한 역할을 한다. 피부 각질 줄기세포(Keratinocyte Stem Cells, KSC)에서는, 알파6 인테그린(alpha 6 integrin)의 발현은 강하며, CD71 단백질(또는 Transferrin 수용체)의 발현은 약하다는 특징이 있다 (Li A, Kaur P. Methods Mol Biol. 2005;289:87-96). 또한, 전이-증폭 세포(Transit Amplifying Cells, TA cells)에서는, 알파6 인테그린(alpha 6 integrin)과 CD71 단백질(또는 Transferrin 수용체)이 모두 강한 발현을 보이는 특징이 있다.

이외에도, FZD1(Frizzled homolog 1)도 피부 각질 줄기세포의 표지마커로 인식되어 있는데, 아직 이들 단백질들이 이들 세포에서 어떤 기능을 하는지는 밝혀진 바가 없다.

본 발명의 실험예 등에서는, 위에서 언급된 알파6 인테그린(alpha 6 integrin), CD71 단백질 및 FZD1(Frizzled homolog 1) 유전자 등의 발현 정도를 측정함으로써, 오르토-디하이드록시이소플라본의 특정 유도체들이, 피부 각질 줄기세포의 증식 효능이 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체를 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다. 일실시예에서, 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체를 함유하는 피부 재생력 향상 및/또는 피부탄력 개선용 화장료 조성물 및 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은, 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균, 발열 물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태로 제형화될 수 있다. 유중수형 유화액은, 올리브유와 같은 식물성 기름 또는 액상 파라핀과 같은 광물성 오일을 유상으로 하고, 대두 레시틴 등의 자연산 인지질 및 소르비탄 모노올레이트와 같은 무수 헤시톨이나 지방산의 에스테르에서 유래된 것, 리옥시에틸렌소르비톨 모노올레이트와 같이 무수헥시톨과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌옥사이드와 축합한 화합물들을 유화제로 하여 활성성분을 유화시킨 것이다.

본 발명에 따른 조성물이 화장료의 형태로 제형화된 경우에는, 피부 재생력 향상 및 피부탄력 개선 등을 통한 노화방지의 목적으로 사용될 수 있다. 상기 화장료 제형은, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 마사지크림, 아이크림, 영양크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 에센스, 팩, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형일 수 있으며, 또한 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형 일 수 있다. 또한, 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들을 기타 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 약학 조성물은, 피부 재생력 향상 및/또는 피부탄력 개선용 조성물일 수 있다. 구체적으로는, 상기 약학 조성물은, 피부 각질 줄기세포의 증식을 통해 피부 재생력을 향상시키고, 피부 탄력을 개선시키는 효능이 인정된다.

본 발명에 따른 조성물을 의약품에 적용할 경우에는, 상기 조성물을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구 투여제 혹은 비경구 투여제로 제제화 할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 제재로서는 정제(錠劑), 환제(丸劑), 과립제(顆粒劑), 연·경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제(乳濁濟), 시럽제, 펠렛제 등을 들 수 있다. 또한, 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑) 등을 들 수 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 활성성분의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적인 투여량은 0.001 mg/kg/일 내지 2000 mg/kg/일, 보다 구체적으로는 0.5 mg/kg/일 내지 1500 mg/kg/일이다.

이하, 실시예 및 시험예 등을 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

[제조예] 대두 추출물의 제조

대두 2 에 헥산 6 ℓ를 넣고 상온에서 3 회 교반 추출하여 탈지시켰다. 그런 다음, 탈지된 대두 1 kg에 80% 메탄올 4 ℓ를 넣고 3 회 환류 추출하고 15℃에서 1 일간 침적시켰다. 이어서, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고 분리된 여액을 감압 농축하였다. 얻어진 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 1 ℓ로 5 회 추출하여 색소를 제거하고, 수층을 1-부탄올 500 ㎖로 3 회 추출하였다. 1-부탄올층을 감압 농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 다량의 에틸아세테이트를 추가하였다. 에틸아세테이트의 추가로 생성된 침전물을 건조하여, 대두 추출물 300 g을 얻었다.

[실시예 1] 대두 추출물을 이용한 4',6,7-트리하이드록시이소플라본(4',6,7-trihydroxyisoflavone)의 제조

상기 제조예 1에서 수득한 대두 추출물 10 g을 100 ㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30 분간 멸균한 다음 30℃로 냉각시켰다. 냉각 후, 미리 배양된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) KCCM 11885를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 37℃에서 7 일 동안 배양시킨 후에 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3 회 세척하고 다시 원심분리하여 침전물을 얻었다. 침전물에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반하고(3 회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수 득하였다. 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 0.23 g을 얻었다.

[실시예 2] 다이드진(daidzin)을 이용한 4',6,7-트리하이드록시이소플라본의 제조

다이드진 5 g(Sigma Cat. No. D7802)을 100 ㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30 분간 멸균한 다음 30℃로 냉각시켰다. 냉각 후, 미리 배양된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) KCCM 11885를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 37℃에서 7 일 동안 배양시킨 후에 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3 회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 그 침전물에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반하고(3 회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 0.34 g을 얻었다.

[실시예 3] 다이드제인(daidzein)을 이용한 4',6,7-트리하이드록시이소플라본의 제조

다이드제인 3 g(Sigma Cat. No. D7802)을 100 ㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30 분간 멸균한 다음 30℃로 냉각시켰다. 냉각 후, 배양된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) KCCM 11885를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 이어 서 37℃에서 7 일 동안 배양시킨 후에 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3 회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 침전물에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반하고(3 회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 0.45 g을 얻었다.

[실시예 4] 대두 추출물을 이용한 3',4',7-트리하이드록시이소플라본(3',4',7-trihydroxyisoflavone)의 제조

상기 제조예 1에서 수득한 대두 추출물 10 g을 100 ㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30 분간 멸균한 다음 30℃로 냉각시켰다. 냉각 후, 미리 배양된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCCM 11732를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 30℃에서 7 일 동안 배양시킨 후에 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3 회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 침전물에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반하고(3 회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 0.23 g을 얻었다.

[실시예 5] 다이드진(daidzin)을 이용한 3',4',7-트리하이드록시이소플라본의 제조

다이드진 5 g(Sigma Cat. No. 30408)을 100 ㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30 분간 멸균한 다음 30℃로 냉각시켰다. 냉각 후, 미리 배양된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCCM 11732를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 37℃에서 7 일 동안 배양시킨 후, 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3 회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 침전물에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반하고(3 회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 0.44 g을 얻었다.

[실시예 6] 다이드제인(daidzein)을 이용한 3',4',7-트리하이드록시이소플라본의 제조

다이드제인 3 g을 100 ㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30 분간 멸균한 다음 30℃로 냉각시켰다. 냉각 후, 미리 배양된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCCM 11732를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 37℃에서 7 일 동안 배양시킨 후에 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 침전물에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반하고(3 회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 다음, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 0.45 g을 얻었다.

[실시예 7] 대두 추출물을 이용한 4',7,8-트리하이드록시이소플라본(4',7, 8-trihydroxyisoflavone)의 제조

상기 제조예 1에서 수득한 대두 추출물 10 g을 100 ㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30 분간 멸균한 다음 30℃로 냉각시켰다. 냉각 후, 미리 배양된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCCM 11732를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 30℃에서 7 일 동안 배양시킨 후, 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 침전물에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반하고(3 회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 4',7,8-트리하이드록시이소플라본 0.16 g을 얻었다.

[실시예 8] 다이드진(daidzin)을 이용한 4',7,8-트리하이드록시이소플라본 제조

다이드진 5 g을 100 ㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30 분간 멸균한 다음 30℃로 냉각시켰다. 냉각 후, 미리 배양된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCCM 11732를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 37℃에서 7 일 동안 배양시킨 후, 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3 회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 침전물에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반하고(3 회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 4',7,8-트리하이드록시이소플라본 0.55 g을 얻었다.

[실시예 9] 다이드제인(daidzein)을 이용한 4',7,8-트리하이드록시이소플라본 제조

다이드제인 3 g을 100 ㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30 분간 멸균한 다음 30℃로 냉각시켰다. 냉각 후, 미리 배양된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCCM 11732를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 37℃에서 7 일 동안 배양시킨 후에 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3 회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 침전물에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반하고(3 회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 다음, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 4',7,8-트리하이드록시이소플라본 0.42 g을 얻었다.

[실험예 1] 유세포 분석을 통한 각질 줄기세포(Keratinocyte Stem Cells, KSC)의 측정

인간피부 각질세포(Human neonatal keratinocyte cells)를 론자사(Lonza, Cat No C2507A)에서 구입하여, 25 cm² T-플라스크에 계대배양을 하여, CO₂ 배양기(CO₂ Incubator)에서 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 실험은 세포의 2~3 세대 계대배양(passage) 후 진행하였다.

세포 배양액은 론자사(Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA)의 방법에 따라, 500 ㎖의 KBM-2(Clonetics CC-3103) 배지에 KGM-2 뷸렛 키트(KGM-2 Bullet kit; Bovine pituitary extract(2 ㎖), human epidermal growth factor(0.5 ㎖), Insulin(0.5 ㎖), Hydrocortisone(0.5 ㎖), Transferrin(0.5 ㎖), Epinephrine(0.5 ㎖), Gentamycin Suflate + Amphofericin-B(GA-1000, 0.5 ㎖))를 넣어 사용하였다.

세포 계대 배양 후 이틀 정도 후에, 50%정도의 세포 밀도(confluency)가 보이면 혈청을 결핍시켜(serum starvation) 24 시간 후, 위에서 각각 제조한 4', 7, 8-트리하이드록시이소플라본, 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 3 종에 대해 각각 10 μM 농도로 24 시간 동안 처리하였다. 인간피부 각질세포를 0.25% 트립신(Trypsin-EDTA)으로 25 cm² T 플라스크로부터 분리한 뒤, 1500 rpm에서 5 분간 세포를 가라앉힌 다음, 배양액을 제거한 뒤에 3 ㎖의 블록킹 버퍼(Blocking buffer), 2% 소혈청 단백질(Bovine Serum Albumin(BSA) KGM-2)을 넣고 세포를 현탁하였다. 4℃에서 15 분 동안 세포(약 10⁶ 개의 세포)를 적응시킨 다음, FITC(Fluorescein isothiocyanate)가 부착된 알파6 인테그린(alpha 6 integrin) 항체(BD Pharmingen, CA, US, Cat No. 555735)와 PE-Cy(phycoerythrin-cyanine)가 부착된 CD71 항체(BD Pharmingen, CA, US, Cat No. 551143)을 각각 10 ㎕(1 ㎍/㎕)씩 넣고, 4℃에서 45 분 동안 반응시켰다. 한편, 음성 대조군으로 사용되는 세포에는 FITC Rat IgG2a, k isotype(Cat No. 555843)와 PE-Cy5 mouse IgG1 k isotype(Cat No. 555750)를 역시 10 ㎕(1 ㎍/㎕)씩 넣고, 4℃에서 45 분 동안 반응시켰다.

반응이 끝난 후, 3 ml의 워싱 버퍼(Washing buffer: 2% Bovine Serum Albumin(BSA) KGM-2)로 2 회 세척한 후 세포를 현탁하였다. 이후 유세포 형광 분석기(FACS, BD Bioscience, San Jose, CA, U.S)를 통해 분석하였다. 구체적으로는, 유세포 형광 분석기에 위에서 반응한 세포들을 넣어주고, 컴퓨터 이미지상(FACS Imaging Program)으로 사분면을 설정하게 되면 (Li A, Kaur P. Methods Mol Biol. 2005;289:87-96), CD71 단백질을 약하게, 그리고, 알파6 인테그린(alpha 6 integrin)을 강하게 발현하는 것을 특징으로 하는 피부 각질 줄기세포들의 숫자의 변화가 나타나게 되면서, 분리가 된다. 예를 들어, 유세포 형광 분석기의 측정결과는 하기 도 5와 같이 나타날 수 있다. 도 5를 참조하면, 우측 상단의 1 사분면을 기준으로, 반시계방향으로 2, 3, 4 사분면이 된다. 1 사분면은 CD71과 알파6 인테그린 강하게 발현된 영역, 2 사분면은 CD71은 강하게 발현되고, 알파6 인테그린은 약하게 발현된 영역, 3 사분면은 CD71과 알파6 인테그린이 모두 약하게 발현된 영역, 그리고 4 사분면은 CD71는 약하게 발현되고 알파6 인테그린은 강하게 발현된 영역을 나타낸다.

구체적인 유세포 형광 분석기의 측정결과는, 하기 표 1에 정리하였다.

	음성 대조군 (daidzein)	4',6,7-하이드록시이소플라본	3',4',7-하이드록시이소플라본	4',7,8-하이드록시 이소플라본
1 사분면	158	335	1308	1650
2 사분면	522	1756	2855	3872
3 사분면	8954	7449	5245	3612
4 사분면	356	448	592	856

또한, 하기 표 2는, 음성대조군(다이드제인; Daidzein)과 4',7,8-트리하이드록시이소플라본, 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 및 3',4',7-트리하이드록시이소플라본을 각각 10 μM 처리한 후, CD71은 약하게 발현되고, 알파6 인테그린은 강하게 발현되는 영역, 즉 4 사분면에 해당하는 각질 줄기세포(Keratinocyte Stem Cells, KSC)들의 숫자 및 음성대조군 대비%를 표시한 결과이다.

	음성 대조군 (daidzein)	4',6,7-하이드록시이소플라본	3',4',7-하이드록시이소플라본	4',7,8-하이드록시 이소플라본
4 사분면	356	448	592	856
대조군 대비 증가 %		25.8%	66.2%	140%

표 2의 결과로부터, 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 또는 4',7,8-트리하이드록시이소플라본 10 μM를 각각 처리한 경우, 음성대조군(다이드제인; Daidzein)에 비해서 CD71 단백질은 약하게 발현되며, 알파6 인테그린(alpha 6 integrin)은 강하게 발현되는 피부 각질 줄기세포(Keratinocyte Stem Cells, KSC)의 수가 각각 25.8%, 66.2%, 140% 증가함을 확인할 수 있다.

[실험예 2] 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체의 피부 줄기세포 FZD1(Frizzled homolog 1)유전자 발현 수준에 대한 효과 측정

실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 인간피부 각질세포(Human neonatal keratinocyte cells)를 배양한 후, 각질 줄기세포를 분리하여, 혈청을 결핍시킨 후(serum starvation)을 24 시간 경과 후, 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 및 4',7,8-트리하이드록시이소플라본을 각각 10 μM 농도로 24 시간 동안 처리하였다. 이후, 트리졸시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 깨끗하게 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase(RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여, 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)을 통해 정량적으로 분석하였다. 피부 각질 줄기세포에서 각 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan®gene expression assay kit, AppliedBiosystems, FosterCity,CA)(Frizzled homolog 1(FZD1)- HS00268943_s1(TagMan primer catalog name))을 이용하여 발현량을 확인하였다. 실험결과는 하기 도 6에 나타내었다.

도 6을 참조하면, 음성대조군에 비해 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 3',4',7-트리하이드록시이소플라본, 및 4',7,8-트리하이드록시이소플라본을 각각 처리한 경우, FZD1(Frizzled homolog 1)의 발현이 각각 약 1.9 배, 1.4 배, 2.6 배 정도 증가함을 확인하였다.

하기에 상기 조성물의 제형예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아니라 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 영양화장수

하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양화장수를 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
정제수	잔량
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
히알루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본	0.05
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	8.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.1

[제형예 2] 영양크림

하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
정제수	잔량
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본	3.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
트리에탄올아민	0.1

[제형예 3] 마사지크림

하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 마사지크림을 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
정제수	잔량
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	45.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본	1.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
밀납	4.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
세스퀴올레인산 소르비탄	0.9
바세린	3.0
파라핀	1.5

[제형예 4] 팩

하기 표 6에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 팩을 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
정제수	잔량
글리세린	4.0
폴리비닐알콜	15.0
히알루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
알란토인	0.1
4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본	0.5
노닐페닐에테르	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
에탄올	6.0

[제형예 5] 연고

하기 표 7에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
정제수	잔량
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본	1.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
밀납	4.0

도 1 내지 4는 알파 6 인테그린(FL1-H)과 CD71(FL3-H)이 각각 발현되는 양의 차이 (형광의 세기)를 보이는 세포들의 분포도를 나타낸 그래프들이다. 도 2 내지 4에서 나타난 점선의 그래프(녹색 표시)는 도 1에서 얻은 세포 분포도를 나타낸 것 (음성 대조군)이며, 이는 도 2 내지 4에 사용한 각 시험군으로부터 얻은 결과와 비교를 위한 것이다;

도 5는 유세포 형광 분석기의 측정결과를 예시적으로 나타낸 것이다;

도 6은 FZD1(Frizzled homolog 1) 유전자의 발현량을 각 실험군별로 나타낸 그래프이다.

Claims

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4',7,8-트리하이드록시이소플라본, 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 및 3',4',7-트리하이드록시이소플라본을 포함하는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체를 유효성분으로 함유하는 인-비트로(in-vitro) 피부 각질 줄기세포 증식 촉진제.