KR101601020B1

KR101601020B1 - 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체를 함유하는 표피 과증식 억제용 및 염증성 피부 질환 개선용 피부 외용제 조성물

Info

Publication number: KR101601020B1
Application number: KR1020080114594A
Authority: KR
Inventors: 박준성; 박혜윤; 김동현; 이상민; 신동욱; 김신형; 노민수; 김덕희; 김한곤
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2008-11-18
Filing date: 2008-11-18
Publication date: 2016-03-09
Also published as: US20110224291A1; EP2349254B1; JP2012509254A; EP2349254A2; CN102209536A; WO2010058936A3; WO2010058936A2; EP2349254A4; CN102209536B; KR20100055733A

Abstract

본 발명은 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체를 유효성분으로 함유하는 표피 과증식 억제용 및 염증성 피부 질환 개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체인 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 또는 이들의 혼합물을 함유함으로써 Wnt 신호 전달을 적절하게 제어하는 DKK3 단백질 및 FZD1단백질의 발현을 향상시켜 표피의 과도한 증식을 억제하고, 표피의 과증식으로 인한 염증성 피부 질환을 개선하는 표피 과증식 억제용 및 염증성 피부 질환 개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

오르토-디하이드록시이소플라본 유도체, DKK3, FZD1, Wnt신호전달, 피부 각질 세포, 염증성 피부질환, 피부 외용제

Description

오르토-디하이드록시이소플라본 유도체를 함유하는 표피 과증식 억제용 및 염증성 피부 질환 개선용 피부 외용제 조성물 {Skin external composition for inhibiting epidermal hyperproliferation and treating inflammatory skin diseases containing σ-dihydroxyisoflavone derivatives}

피부 각질 세포(keratinocyte)는 적절한 증식과 분화를 통해서, 피부 보습을 유지하며, 피부 장벽으로서의 기능을 한다. 그러나, 피부 각질 세포의 증식과 분화에 변이가 생기면, 결국 피부 장벽에 흠(impairment)을 유발하고 다양한 피부 질환 이 나타나게 된다.

예를 들어, 건선의 경우 부적절한 피부 각질 세포(keratinocyte)의 증식과 분화에 의해 나타나는 염증성 피부 질환인데, 일부 원인 중의 하나는 베타-카테닌이라는 단백질에서 문제가 일어났을 때 나타난다고 알려졌다. 베타-카테닌은 크게 두 가지의 기능을 하는데, 세포와 인접세포간의 부착(cell-cell adhesion)의 역할에 기여를 하며, 또 한편으로는 Wnt 신호 전달의 매개체이다. Wnt 리간드는 정상적인 피부에서 발현되며, 일반적으로 피부 세포가 성장과 분화를 하는 동안에 피부 각질 세포의 여러 세대에 걸친 증식 조절에 이용된다. 그러나 Wnt 리간드가 과다 발현되거나, 없을 경우에는 피부의 항상성 조절에 심각한 변이를 일으키게 된다. 임상적 실험에서 정상인과 건선환자로부터 분리한 피부 세포로부터 건선 환자의 경우에는 Wnt 신호 전달 체계의 매개체인 베타-카테닌의 발현이 상당히 크게 나타남이 관찰되었으며, 베타-카테닌에 의해 조절되는 효소에도 영향을 주는 것으로 관찰되었다. 따라서, 부적절한 피부 분화가 일어났을 경우에, 그 원인의 하나로서 Wnt 신호 전달 체계가 연관이 있고, 이들을 조절해줌으로써 피부 장벽을 보호하고 보습을 유지하는 데 기여할 것으로 예측될 수 있다. Wnt를 억제하는 것으로 알려진 DKK3(Dickkopf homolog 3) 및 FZD1(Frizzled homolog 1)의 발현을 향상시키는 방법을 고려한다면, Wnt의 기능을 적절하게 제어하는 기능을 하므로 궁극적으로는 피부 보습을 유지하며 피부 장벽을 보호할 것으로 기대된다.

이소플라본은 주로 콩에 함유된 식물성 화합물로서, 이소플라본을 아글리콘(aglycon)으로 하는 배당체(glucosides)로 존재하다 발효과정 중 미생물의 대사 에 의해 비당질 형태로 전환된다. 이러한 이소플라본은 항암, 항산화, 항동맥경화, 혈당강하 및 골다공증 예방 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있어 이에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

다이드제인과 제니스테인은 수많은 식물(plant)과 대두(soybean)에서 발견되는 다이페놀(diphenol)의 파이토에스트로겐(phytoestrogen) 화합물이다. 이 화합물들은 항산화제, 항균제 및 금속 킬레이트제의 효과가 있다고 보고되고 있다 (Middleton et al., 1992; Dixon et al., 2002). 더욱이, 인류의 건강을 위해서 의약용이나 화학치료제로 사용되고 있다(Foti et al., 2005).

이에 본 발명자들은 피부 각질 세포의 과도한 증식과 분화에 의해 나타나는 염증성 피부 질환의 원인인 Wnt 신호 전달을 적절하게 조절하는 소재를 찾고자 연구한 결과, 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체인 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본이 Wnt 신호 전달의 억제제인 DKK3 단백질 및 FZD1단백질의 발현을 향상시킴으로써 Wnt 신호 전달의 조절 효과가 탁월한 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 Wnt 신호 전달을 조절하는 DKK3 단백질 및 FZD1 단백질의 발현을 향상시켜 표피의 과증식을 억제하고, 표피의 과증식으로 인한 염증성 피부 질환을 개선하는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체인 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 표피 과증식 억제용 및 염증성 피부 질환의 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체인 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 또는 이들의 혼합물을 유효 성분으로 함유하는 항염증 치료제를 제공한다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체를 유효 성분으로 함유하여 피부 각질 세포의 과증식의 원인이 되는 Wnt 신호 전달을 적절하게 조절하는 DKK3 단백질 및 FZD1 단백질의 발현을 향상시킴으로써 피부 각질 세포의 과도한 증식을 억제하고 정상적인 각질 세포 분화를 유도하였다. 또한 본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 표피 과증식에 수반되는 염증성 피부 질환을 개선 및 치료하는 효과가 뛰어나 우수한 피부 개선 효과를 나타내었다.

본 발명은 오르토-디하이드록시이소플라본(σ-dihydroxyisoflavone) 유도체인 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 또는 이들의 혼합물을 유효 성분으로 함유하는 피부각질세포의 과증식 억제용 및 염증성 피부 질환의 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체인 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 또는 이들의 혼합물을 유효 성분으로 함유하는 항염증 치료제를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 오르토-디하이드록시이소플라본(ortho-dihydroxyisoflavone, ODI) 유도체는 항산화 효과가 다른 이소플라본에 비해 높다. 이소플라본은 주로 콩에 함유된 식물성 화합물로서, 이소플라본을 아글리콘(aglycon)으로 하는 배당체로 존재하다 발효과정 중 미생물의 대사에 의해 비당질 형태로 전환된다.

본 발명에서 유효성분으로 사용하는 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체는 4',6,7-트리하이드록시이소플라본(4',6,7-trihydroxyisoflavone) (하기 화학식 1) 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본(3',4',7-trihydroxyisoflavone) (하기 화학식 2)이고, Wnt 신호 전달의 억제제인 DKK3(Dickkopf homolog 3) 및 FZD1(Frizzled homolog 1)의 발현을 효과적으로 향상시켜 피부각질세포의 과증식을 억제하여 정상적인 분화를 유도하고, 피부각질세포의 과증식에 수반되는 염증성 피부 질환을 개선 및 치료하는 효과를 나타낸다.

본 발명의 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체인 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 및 3',4',7-트리하이드록시이소플라본은 당업계에 잘 알려진 공지의 방법으로 다이드제인을 생변환하여 제조할 수 있으나, 이에만 한정되지 않으며 통 상적인 임의의 방법에 의해 생산이 가능하다.

상기 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체는 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 30중량%의 양으로 함유되는 것이 바람직하다. 그 함량이 0.001중량% 미만이면 표피 과증식 억제 및 염증성 피부 질환의 개선 효과를 얻을 수 없고, 30중량%를 초과하면 효과의 증가가 크지 않기 때문에 비효율적이며 제형 안정성에 문제가 생길 수 있기 때문이다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 또는 이들의 혼합물을 그 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물 형태로 제조될 수 있으며, 당업계에 통상적으로 사용하는 하나 이상의 무독성, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 보조제, 희석액 또는 다른 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제를 이용하여 공지의 방법으로 제제화될 수 있다.

구체적인 예를 들면 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제 등의 외용제 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용할 수 있으며, 이들 각 제형은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균, 발열 물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태로 제형화될 수 있다. 유중수형 유화액은 올리브유와 같은 식물성 기름 또는 액상 파라핀과 같은 광물성 오일을 유상으로 하고, 대 두 레시틴 등의 자연산 인지질 및 소르비탄 모노올레이트와 같은 무수 헤시톨이나 지방산의 에스테르에서 유래된 것, 리옥시에틸렌소르비톨 모노올레이트와 같이 무수헥시톨과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌옥사이드와 축합한 화합물들을 유화제로 하여 활성성분을 유화시킨 것이다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물이 화장료로 제형화될 경우, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 에센스 또는 팩 등의 제형을 가질 수 있다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.

[제조예 1] 대두 추출물의 제조

대두 2㎏에 헥산 6ℓ를 넣고 상온에서 3회 교반 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 대두 1kg에 80% 메탄올 4ℓ를 넣고 3회 환류 추출하고 15℃에서 1일간 침적시켰다. 이어서 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고 분리된 여액을 감압 농축하였다. 얻어진 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 1ℓ로 5회 추출하여 색소를 제거하고 수층을 1-부탄올 500㎖로 3회 추출하였다. 이로부터 얻은 1-부탄올층을 감압 농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트를 추가해 생성된 침전물을 건조하여 대두 추출물 300g을 얻었다.

[실시예 1] 대두 추출물을 이용한 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 (4',6,7-trihydroxyisoflavone)의 제조

상기 제조예 1에서 수득한 대두 추출물 10g을 100㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한 후 미리 배양된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) KCCM 11885를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 이어서 37℃에서 7일 동안 배양시킨 후에 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 그 침전물에 에탄올(200㎖)을 가해 교반하고(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 상기 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 0.23g을 얻었다.

[실시예 2] 다이드진(daidzin)을 이용한 4',6,7-트리하이드록시이소플라본의 제조

다이드진 5 g(시그마사)을 100㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한 후 미리 배양된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) KCCM 11885를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 이어서 37℃에서 7일 동안 배양시킨 후에 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000rpm으로 원심 분리하여 회수한 침 전물을 증류수로 3회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 그 침전물에 에탄올(200㎖)을 가해 교반하고(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 상기 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 0.34g을 얻었다.

[실시예 3] 다이드제인(daidzein)을 이용한 4',6,7-트리하이드록시이소플라본의 제조

다이드제인 3g(시그마사)을 100㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한 후 미리 배양된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) KCCM 11885를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 이어서 37℃에서 7일 동안 배양시킨 후에 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 그 침전물에 에탄올(200㎖)을 가해 교반하고(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 상기 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 0.45g을 얻었다.

[실시예 4] 대두 추출물을 이용한 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 (3',4',7-trihydroxyisoflavone)의 제조

상기 제조예 1에서 수득한 대두 추출물 10g을 100㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한 후 미리 배양된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCCM 11732를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 30℃에서 7일 동안 배양시킨 후에 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 그 침전물에 에탄올(200㎖)을 가해 교반하고(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 상기 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 0.23g을 얻었다.

[실시예 5] 다이드진(daidzin)을 이용한 3',4',7-트리하이드록시이소플라본의 제조

다이드진 5g(시그마사)을 100㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한 후 미리 배양된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCCM 11732를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 37℃에서 7일 동안 배양시킨 후에 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 그 침전물에 에탄올(200㎖)을 가해 교반하고(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 후, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 상기 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 0.44g을 얻었다.

[실시예 6] 다이드제인(daidzein)을 이용한 3',4',7-트리하이드록시이소플라본의 제조

다이드제인 3g(시그마사)을 100㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한 후 미리 배양된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCCM 11732를 액체량 대비 5~10%로 접종하였다. 37℃에서 7일 동안 배양시킨 후에 반응을 종료시켰다. 배양액을 5,000 내지 10,000rpm으로 원심 분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척하고 다시 원심 분리하여 침전물을 얻었다. 그 침전물에 에탄올(200㎖)을 가해 교반하고(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 다음, 여과된 여액을 감압 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 이후 상기 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 0.45g을 얻었다.

[시험예 1] 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체의 각질 세포 분열의 억제 효과

인간의 각질 형성 세포주인 HaCaT 세포에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)을 포함한 DMEM 배지[둘베코의 수정된 이글스 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium), 집코(Gibco) 1210-0038]를 첨가하여 24공 평판배양기에 70% 밀도로 배양하였다. 상기 HaCaT 세포에 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 및 3',4',7-트리하이드록시이소플라본을 1, 10 및 50μM 농도로 각각 처리하고 48시간이 경과한 시점에 BrdU 분석법을 수행하였다. BrdU 분석법을 수행하기 12시간 전에 BrdU 표지를 수행하였다. BrdU 분석은 BrdU colorimetric ELISA 키트(Roche사)를 이용하였으며, Roche사에서 제공하는 실험 방법을 따랐다. 우선 BrdU 용액을 12시간 처리한 후 배양액을 제거하고 세포를 고정시키고, 퍼옥시다제가 결합된 BrdU에 대한 항체를 첨가한 후 기질을 처리하여 발색 반응을 유도하고, ELISA 리더기로 발색 정도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 피부 각질 분화에 사용되는 공지된 물질인 칼슘 및 세포 분열을 억제하고 분화를 유도한다고 보고된 트로글리타존(troglitazone;TGZ)을 사용하였다.

도 1에서 알 수 있듯이, 본 발명의 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 및 3',4',7-트리하이드록시이소플라본은 이소플라본의 일종인 다이드제인과 비교하여 유의적으로 높은 피부 각질 세포의 분열 억제 효과를 나타내었고, 50μM 농도로 처리할 경우에는 양성대조군인 칼슘 및 트로글리타존과 유사하거나 보다 우수한 효과를 나타내었다. 또한, 본 발명의 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 및 3',4',7-트리하이드록시이소플라본은 농도 의존적으로 피부각질 세포의 분열을 억제하는 효과를 나타내었다.

[시험예 2] 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체의 DKK3 및 FZD1의 발현 촉진 효과

사람의 어린 각질 피부 세포(Human Neonatal Keratinocyte Cells)를 웰스 킨(Welskin Co, Seoul, Korea)에서 구입하여, 25㎠ T-플라스크에 계대 배양을 하여, CO₂배양기(CO₂ Incubator)에서 37℃, 5% CO₂조건하에서 배양을 하였다. 통상적으로 실험은 세포의 2~3세대 계대 배양 후 진행하였다. 세포 배양액은 론자사(Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA)의 방법에 따라, 500㎖의 KBM-2(Clonetics CC-3103)배지에 KGM-2 Bullet kit(소 뇌하수체 추출물(2㎖), 인간 상피세포 성장인자(0.5㎖), 인슐린(0.5㎖), 하이드로코티존(0.5㎖), 트랜스페린(0.5㎖), 에피네프린(0.5㎖), 겐타마이신 설페이트+암포페리신-B(GA-1000, 0.5㎖))을 넣어 사용하였다. 세포 계대 배양을 하고 2일이 지나고 50%정도의 세포 밀도(confluency)를 보이면 혈청을 결핍시켰다(serum starvation). 24시간 후, 음성대조군, 당귀 추출물(양성대조군), 다이드제인 및 상기 실시예 1~6을 각각 10μM 농도로 24시간 동안 처리하였다. 음성 대조군으로는 비처리군을 사용하였고, 양성 대조군인 당귀 추출물은 건조된 당귀 (Angelica gigas Nakai) 5kg을 메탄올 50ℓ에 24 시간 동안 용출시킨 후, 잔사를 분리 여과하고 감압 농축 건조하여 사용하였다.

이어서, 트리졸시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 깨끗하게 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase(RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA) 를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)을 통해 정량적으로 분석하였다. 피부 각질 줄기세포에서 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan®gene expression assay kit, AppliedBiosystems, FosterCity, CA) Dickkopf homolog 3(DKK3)-HS00247426_m1; Frizzled homolog 1(FZD1)-HS00268943_s1(TagMan primer catalog name)을 이용하여 DKK3 및 FZD1의 발현량을 확인하고, 그 결과를 하기 도 2~3에 나타내었다.

도 2~3에서 알 수 있듯이, 본 발명의 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체가 처리된 경우에는 음성대조군 및 디하이드록시이소플라본인 다이드제인과 비교하여 DKK3 및 FZD1의 발현이 더욱 증가되었다. 또한 이소플라본의 일종인 다이드제인을 처리한 군은 본 발명에 의한 오르토-디하이드록시이소플라본을 처리한 군에 비해 DKK3 및 FZD1의 발현 수준이 현저히 낮았다. 따라서, 본 발명의 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본이 DKK3 및 FZD1의 발현을 효과적으로 촉진시켰다.

[시험예 3] 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체의 항염증 효과

인간의 각질 형성 세포인 HaCaT 세포는 한국 세포주은행(Korean Cell Line Bank;Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. HaCaT 세포를 10% (v/v) FBS, 페니실린 100U/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖를 포함하는 DMEM 배지에 주입하고 37 ℃, 5% CO₂ 공급조건을 갖춘 동물세포배양기에서 배양하였다. 공(Well) 당 1.5×10⁶ 농도로 준비된 HaCaT 세포에 FBS가 포함되지 않은 배지로 3시간 동안 적응시켰다. 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본, 다이드제인 및 TGZ를 각각 10μM 농도로 2시간 동안 전처리하고 1㎍/㎖ 농도로 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)를 첨가하여 8시간 동안 추가 배양하였다. Total RNA는 TRIzolTM(GIBCO BRL, MD, USA)을 사용하여 추출하였고 -80℃에서 보관하였다.

총 RNA 1㎍을 50mM 트리스-HCl(Tris-HCl, pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl₂, 0.1M DTT, 10mM dNTP 및 40 유닛/㎕ RNase 저해제가 함유된 역전사 반응 완충액 25㎕에 넣고, 0.5㎍/㎕ 올리고(dT)₁₆의 프라이머와 200 유닛 수퍼스크립트 II[SuperScript II, 집코비알엘(GiboBRL)]의 역전사 중합효소를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시킨 다음 역전사 반응 용액 2.5㎕를 엠플리택(AmpliTaq) DNA 중합효소[0.04U, 퍼킨 엘멀, 쉘튼, 씨티(Perkin Elmer, Shelton, CT)], 50mM 트리스(pH 8.3), 0.25mg/㎖ 우혈청알부민, 3mM MgCl₂, 0.25mM dNTPs, SYBR 그린 I의 1/50,000 희석액[몰레큘라 프로브, 유진, 오알(Molecular Probes, Eugene, OR)]이 함유된 PCR 반응 완충액 50리터에 섞고, 10μM의 프라이머를 첨가하여 94℃에서 30초간 변성, 53℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 확장하는 사이클을 30회 수행하였다.

상대적인 mRNA 레벨은 아이사이클러(ICycler) 소프트웨어를 이용하여 SYBR 그린 I 형광 변화를 측정함으로써 분석하였다. 내부 표준물질로 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 사용하여 유전자의 정량적 발현 수준을 보정하여 도 4에 나타내었다.

TNF-alpha는 상처치료 과정 중 염증기에서 중요한 작용을 하는 염증 관련 인자로서 많은 실험 논문들에서도 염증 억제의 효능을 확인하는 데 자주 사용되고 있으며, 지질다당류(LPS)로 유도된 염증반응에서 다양하게 발현하는 유전자이다.

도 4의 결과를 살펴보면, 본 발명에 의한 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본을 처리한 군에서는 TNF-alpha 유전자의 발현이 강하게 억제되었다. 또한 이소플라본의 일종인 다이드제인을 처리한 군에서도 염증 관련 인자 유전자의 발현이 다소 억제되기는 하였으나 본 발명에 의한 오르토-디하이드록시이소플라본을 처리한 군에 비해 그 효과가 현저히 낮았다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 유효성분으로 사용하는 4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본은 각질 세포 분열을 효과적으로 억제하고 Wnt 신호 전달을 적절하게 제어하는 DKK3 단백질 및 FZD 단백질의 발현을 향상시킴으로써 표피의 과증식을 억제하고 표피의 과증식으로 인한 염증성 질환을 개선하는 효능을 가졌다. 이를 통하여 본 발명에서는 4',6,7-트리하이드록시이소플라본, 3',4',7-트리하이드록시이소플라본 또는 그들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 표피 과증식 억제제 또는 염증성 피부 질환 개선제를 제공할 수 있었다.

[제형예 1] 영양화장수

하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양화장수를 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
정제수	잔량
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
히알루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본	0.05
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	8.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.1

[제형예 2] 영양크림

하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
정제수	잔량
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본	3.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
트리에탄올아민	0.1

[제형예 3] 마사지크림

하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 마사지크림을 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
정제수	잔량
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	45.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본	1.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
밀납	4.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
세스퀴올레인산 소르비탄	0.9
바세린	3.0
파라핀	1.5

[제형예 4] 팩

하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 팩을 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
정제수	잔량
글리세린	4.0
폴리비닐알콜	15.0
히알루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
알란토인	0.1
4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본	0.5
노닐페닐에테르	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
에탄올	6.0

[제형예 5] 연고

하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조하였다.

성분	함량(단위:중량%)
정제수	잔량
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
4',6,7-트리하이드록시이소플라본 또는 3',4',7-트리하이드록시이소플라본	1.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
밀납	4.0

도 1은 본 발명의 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체에 의한 각질 세포 분열의 억제능을 측정한 결과이다.

도 2는 본 발명의 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체에 의한 DKK3의 발현 변화를 측정한 결과이다.

도 3은 본 발명의 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체에 의한 FZD1의 발현 변화를 측정한 결과이다.

도 4는 본 발명의 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체에 의한 항염증 효과를 측정한 결과이다.

Claims

오르토-디하이드록시이소플라본 유도체인 3',4',7-트리하이드록시이소플라본을 유효성분으로 함유하는, 표피 과증식으로 인한 건선 치료용 피부 외용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 오르토-디하이드록시이소플라본 유도체가 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 30 중량%의 양으로 함유되는 것을 특징으로 하는, 표피 과증식으로 인한 건선 치료용 피부 외용 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물이 연고, 젤, 크림, 패취 또는 분무제의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는, 표피 과증식으로 인한 건선 치료용 피부 외용 약학 조성물.
삭제
삭제