JP6293829B2 - 安定化された免疫グロブリン可変ドメイン選別方法及び選別されたドメインの応用 - Google Patents
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Description
結論から、今までのヒトVHドメイン抗体の工学的変形及びスクリーニングは例外なしでファージディスプレー及びプロテインA結合(binding)活性に基づいた方法から成ってきた(Kristensen P and Winter G. Fold. Des. 1998 3(5):321-8; Sieber et al., Nat. Biotechnol. 1998 16(10):955-60; Jung et al., J. Mol. Biol. 1999 294(1):163-80; Woern A and Pluckthun A. J. Mol. Biol. 2001 305(5): 989-1010)。
本発明は、そのようなライブラリーを利用して、選別された目的蛋白質に結合能を持つVHまたはVLドメイン抗体、そのようなドメイン抗体のアミノ酸配列及びこれをエンコードするポリヌクレオチドに関する。
(項目1)
目的蛋白質のN-末端にTat-信号配列が結合され、C-末端には抗生剤耐性付与蛋白質が結合された融合蛋白質をコードする遺伝子構造体。
(項目2)
前記目的蛋白質は、免疫グロブリン可変ドメイン、抗体断片、受容体または受容体リガンドであることを特徴とする項目1に記載の遺伝子構造体。
(項目3)
前記目的蛋白質は、免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであることを特徴とする項目2に記載の遺伝子構造体。
(項目4)
追加的に分離精製または検出のためのアミノ酸タグ(Tag)が結合されていることを特徴とする項目1に記載の遺伝子構造体。
(項目5)
前記アミノ酸タグは、6xHisタグ、フラグタグ及びc-mycタグからなる群から選択されたことを特徴とする項目4に記載の遺伝子構造体。
(項目6)
前記Tat-信号配列は、TorA、CuoO、DmsA、FdnG、FdoG、HyaA、NapA、Suf1、WcaM、TagT、YcbK、YcdB、YdhX及びYnfEからなる群から選択されたことを特徴とする項目1に記載の遺伝子構造体。
(項目7)
前記抗生剤耐性付与蛋白質は、TEM-1ベータ-ラクタマーゼであり、前記Tat-信号配列は、TorAであることを特徴とする項目1に記載の遺伝子構造体。
(項目8)
項目1から7のいずれかに記載の遺伝子構造体を含むベクター。
(項目9)
前記ベクターは、pET22b、pAE34、pET9a及びΔpMKから選択されたいずれか一つのベクターに遺伝子構造体が挿入されたことを特徴とする項目8に記載のベクター。
(項目10)
前記ベクターは、pET-TAPEであることを特徴とする項目8に記載のベクター。
(項目11)
項目8に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
(項目12)
前記宿主細胞は、大腸菌であることを特徴とする項目11に記載の宿主細胞。
(項目13)
項目1から7のいずれかに記載の遺伝子構造体で形質転換された一つ以上の宿主細胞で構成された宿主細胞群。
(項目14)
前記宿主細胞群に含まれた各宿主細胞は、互いに異なる目的蛋白質を含む融合蛋白質をコードする遺伝子構造体に形質転換されたことを特徴とする項目13に記載の宿主細胞群。
(項目15)
前記宿主細胞は、グラム-陰性(gram-negative)菌であることを特徴とする項目13に記載の宿主細胞群。
(項目16)
下記の工程を含んで構成される水溶性目的蛋白質の選別方法:
(1)項目13に記載の宿主細胞群を抗生剤が含まれた液状培地で培養する工程;
宿主細胞群を抗生剤が含まれた液状培地で培養する工程;
(2)生存した宿主細胞を回収してプラスミド(plasmid) DNAを回収する工程;
(3)回収されたプラスミドDNAで目的蛋白質をコードする核酸配列を回収する工程; 及び
(4)回収された核酸配列から目的蛋白質の配列を確認して選別する工程。
(項目17)
工程(3)以後、
(3‘)回収された核酸配列を再びTat-信号配列をコードする遺伝子及び抗生剤耐性付与遺伝子に作動可能に連結させた遺伝子構造体を製作して、これを再び宿主細胞群に形質転換させる工程;及び
(3‘’)別途の遺伝子構造体製作なしに回収された核酸配列を含むプラズミドを直ちに宿主細胞群に形質転換させる工程;のうち選択された一つの工程を追加的に含み、
工程(1)乃至工程(3‘)または工程(1)乃至(3“)は、2ラウンド(round)以上繰り返すことを特徴とする項目16に記載の水溶性目的蛋白質の選別方法。
(項目18)
前記抗生剤は、アンピシリン(ampicillin)またはカルベニシリン(carbenicillin)であることを特徴とする項目16または項目17に記載の水溶性目的蛋白質の選別方法。
(項目19)
前記抗生剤は、ラウンドが繰り返されるにつれ少しずつ高い濃度で添加されることを特徴とする項目17に記載の水溶性目的蛋白質の選別方法。
(項目20)
最初ラウンドでの抗生剤の濃度は、0.05〜0.2μg/mlであることを特徴とする項目16に記載の水溶性目的蛋白質の選別方法。。
(項目21)
下記FR1乃至FR4のアミノ酸配列を持つ水溶性VHドメイン抗体骨格:
1) FR1: X0VQLX1X2X3GX4X5X6X7X8PGX9SX10X11X12X13CX14X15X16GX17X18X19
前記FR1のアミノ酸配列において、
X0は、Eまたは、Qであり、
X1は、Vまたは、Lであり、
X2は、Eまたは、Qであり、
X3は、Sまたは、Aであり、
X4は、Gまたは、Aであり、
X5は、G、M、N、Vまたは、Eであり、
X6は、L、Vまたは、Wであり、
X7は、V、K、Aまたは、Iであり、
X8は、Q、Kまたは、Hであり、
X9は、G、T、A、R、E、Sまたは、Tであり、
X10は、L、V、Rまたは、Mであり、
X11は、Rまたは、Kであり、
X12は、L、Iまたは、Vであり、
X13は、S、Aまたは、Tであり、
X14は、A、E、V、R、I、K、Tまたは、Sであり、
X15は、A、G、P、Vまたは、Tであり、
X16は、S、F、または、Yであり、
X17は、F、Y、R、Gまたは、Lであり、
X18は、T、A、S、N、T、P、I、N、Hまたは、Aであり、
X19は、F、L、Vまたは、Cであり、
2) FR2: WX20RX21X22PGX23GX24X25X26X27X28
前記FR2のアミノ酸配列において、
X20は、V、Aまたは、Lであり、
X21は、Q、N、R、I、K、Y、V、M、S、Q、W、F、L、Vまたは、Cであり、
X22は、A、G、K、S、V、Mまたは、Tであり、
X23は、K、Q、E、Rまたは、Tであり、
X24は、L、N、I、P、Y、T、V、W、A、R、Mまたは、Sであり、
X25は、Vまたは、Eであり、
X26は、W、I、V、P、F、H、M、Y、L、Cまたは、Rであり、
X27は、V、M、Iまたは、Lであり、
X28は、S、Aまたは、Gであり、
3) FR3:X29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DX52X53X54YX55CX56X57
前記FR3のアミノ酸配列において、
X29は、R、H、Qまたは、Tであり、
X30は、F、V、Lまたは、Iであり、
X31は、T、Sまたは、Iであり、
X32は、I、L、V、Mまたは、Rであり、
X33は、S、Tまたは、Dであり、
X34は、R、A、V、Nまたは、Iであり、
X35は、D、Nまたは、Aであり、
X36は、N、T、D、I、R、K、Yまたは、Eであり、
X37は、A、S、Vまたは、Tであり、
X38は、K、R、T、Q、V、E、M、Nまたは、Iであり、
X39は、N、R、T、K、S、Dまたは、Vであり、
X40は、T、M、S、V、I、Yまたは、Aであり、
X41は、L、V、Aまたは、Mであり、
X42は、F、Y、N、D、Hまたは、Sであり
X43は、Lまたは、Mであり、
X44は、Q、E、Hまたは、Nであり、
X45は、M、L、V、Iまたは、Wであり、
X46は、N、T、K、D、Y、Iまたは、Sであり、
X47は、Sまたは、Nであり、
X48は、Lまたは、Vであり、
X49は、R、Kまたは、Tであり
X50は、D、A、S、P、T、V、Iまたは、Sであり、
X51は、E、A、Dまたは、Sであり、
X52は、T、Nまたは、Sであり、
X53は、S、Aまたは、Gであり、
X54は、V、I、Lまたは、Mであり、
X55は、Yまたは、Fであり、
X56は、A、G、Vまたは、Sであり、
X57は、R、S、K、T、L、Nまたは、Fであり、
4) FR4: X58GX59GX60X61VTVSS
前記FR4のミノ酸配列において、
X58は、W、C、Y、G、Sまたは、Aであり、
X59は、Q、Rまたは、Lであり、
X60は、A、T、Iまたは、Vであり、
X61は、L、M、P、Vまたは、Tである。
(項目22)
前記FR1乃至FR4は、下記アミノ酸配列を持つことを特徴とする項目21に記載のVHドメイン抗体骨格:
1) FR1: X0VQLX1X2SGGX5X6X7X8PGX9SX10RX12SCX14X15SGX17X18X19
前記FR1のアミノ酸配列において、
X0は、Eまたは、Qであり、
X1は、Vまたは、Lであり、
X2は、Eまたは、Qであり、
X5は、G、M、N、Vまたは、Eであり、
X6は、Lまたは、Vであり、
X7は、V、または、Kであり、
X8は、Q、Kまたは、Hであり、
X9は、G、T、A、R、E、または、Tであり、
X10は、L、または、Vであり、
X12は、L、または、Vであり、
X14は、A、E、V、I、Kまたは、Sであり、
X15は、A、Gまたは、Vであり、
X17は、F、Y、R、Gまたは、Lであり、
X18は、T、A、S、N、T、P、I、N、Hまたは、Aであり、
X19は、F、L、Vまたは、Cであり、
2) FR2: WVRX21X22PGX23GX24X25X26X27X28
前記FR2のアミノ酸配列において、
X21は、Q、N、R、I、K、Y、V、M、S、Q、W、F、L、Vまたは、Cであり、
X22は、A、G、K、Sまたは、Mであり、
X23は、K、Q、E、Rまたは、Tであり、
X24は、L、N、I、P、Y、T、V、W、A、R、Mまたは、Sであり、
X25は、Vまたは、Eであり、
X26は、W、I、V、P、F、H、M、Y、L、Cまたは、Rであり、
X27は、V、M、Iまたは、Lであり、
X28は、S、Aまたは、Gであり、
3) FR3:RX30TX32SX34DX36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DTAX54YX55CX56X57
前記FR3のアミノ酸配列において、
X30は、F、V、Lまたは、Iであり、
X32は、I、L、Vまたは、Mであり、
X34は、R、A、V、Nまたは、Iであり、
X36は、N、T、D、I、R、K、Yまたは、Eであり、
X37は、A、S、Vまたは、Tであり、
X38は、K、R、T、Q、V、E、M、Nまたは、Iであり、
X39は、N、R、T、K、S、Dまたは、Vであり、
X40は、T、M、S、V、I、Yまたは、Aであり、
X41は、L、V、Aまたは、Mであり、
X42は、F、Y、N、D、Hまたは、Sであり、
X43は、Lまたは、Mであり、
X44は、Q、E、Hまたは、Nであり、
X45は、M、L、V、Iまたは、Wであり、
X46は、N、T、K、D、Y、Iまたは、Sであり、
X47は、Sまたは、Nであり、
X48は、Lまたは、Vであり、
X49は、R、Kまたは、Tであり、
X50は、D、A、S、P、T、V、Iまたは、Sであり、
X51は、E、A、Dまたは、Sであり、
X54は、V、I、Lまたは、Mであり、
X55は、Yまたは、Fであり、
X56は、A、G、Vまたは、Sであり、
X57は、R、S、K、T、L、Nまたは、Fであり、
4) FR4: X58GQGX60X61VTVSS
前記FR4のアミノ酸配列において、
X58は、W、C、Y、G、Sまたは、Aであり、
X60は、A、T、Iまたは、Vであり、
X61は、L、M、Vまたは、Tである。
(項目23)
下記FR1乃至FR4のアミノ酸配列を持つ骨格中から選択されることを特徴とする項目21に記載のVHドメイン抗体骨格:
(項目24)
下記FR1乃至FR4のアミノ酸配列を持つ骨格中から選択されることを特徴とする項目21に記載のVHドメイン抗体骨格:
(項目25)
項目21から24のいずれかに記載のVHドメイン抗体骨格をコードするポリヌクレオチド。
(項目26)
項目21から24のいずれかに記載のVHドメイン抗体骨格を持つVHドメイン抗体。
(項目27)
項目26に記載のVHドメイン抗体をコードするポリヌクレオチド。
(項目28)
項目21から24のいずれかに記載のVHドメイン抗体骨格にヒト由来無作為(random) CDRH1、CDRH2及びCDRH3が挿入されたVHドメイン抗体ライブラリー。
(項目29)
前記挿入されたCDRH3のアミノ酸残基の個数は、5〜15であることを特徴とする項目28に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
(項目30)
前記挿入されたCDRH3のアミノ酸残基の個数は、7〜13であることを特徴とする項目28に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
(項目31)
前記ヒト由来無作為(random) CDRH1、CDRH2及びCDRH3は、突然変異か誘発されたことを特徴とする項目28に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
(項目32)
カバット(Kabat)配列順番体系を基準に、CDRH1の30番及び31番、CDRH2の53番及びCDRH3の97番、99番、100番、100a番位置で選択された一つ以上の位置で突然変異が誘発されたことを特徴とする項目31に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
(項目33)
前記ライブラリーは未感作(naive)、合成または免疫ライブラリーであることを特徴とする項目28に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
(項目34)
項目28に記載のVHドメイン抗体ライブラリーを利用した目的とする抗原に対する結合能を持つVHドメイン抗体の選別方法。
(項目35)
前記目的とする抗原に対する結合能を持つVHドメイン抗体の選別は、固定された目的とする抗原に結合したVHドメイン抗体を除いて固定された目的抗原に結合しないVHドメイン抗体を湧出(elution)して行うことを特徴とする項目33に記載の方法。
(項目36)
前記固定された目的抗原に結合しないVHドメイン抗体を湧出する過程は二回以上繰り返すことを特徴とする項目34に記載の方法。
本発明では、ヒト免疫グロブリン可変ドメインライブラリー(library)または、組み合わせ(combinatorial)ライブラリーから高水溶性を持って、熱力学的安定性が高いリガンド、特にVH及びVLドメイン抗体を効率的に選別できるTAPE(Tat-Associated Protein Engineering)と命名された方法を提供する。
FR1のアミノ酸配列:
X0VQLX1X2X3GX4X5X6X7X8PGX9SX10X11X12X13CX14X15X16GX17X18X19-式1)
前記式1)にいおいて、
X0は、Eまたは、Qであり、
X1は、Vまたは、Lであり、
X2は、Eまたは、Qであり、
X3は、Sまたは、Aであり、
X4は、Gまたは、Aであり、
X5は、G、M、N、Vまたは、Eであり、
X6は、L、Vまたは、Wであり、
X7は、V、K、Aまたは、Iであり、
X8は、Q、Kまたは、Hであり、
X9は、G、T、A、R、E、Sまたは、Tであり、
X10は、L、V、Rまたは、Mであり、
X11は、Rまたは、Kであり、
X12は、L、Iまたは、Vであり、
X13は、S、Aまたは、Tであり、
X14は、A、E、V、R、I、K、Tまたは、Sであり、
X15は、A、G、P、Vまたは、Tであり、
X16は、S、F、または、Yであり、
X17は、F、Y、R、Gまたは、Lであり、
X18は、T、A、S、N、T、P、I、N、Hまたは、Aであり、
X19は、F、L、Vまたは、Cである。
WX20RX21X22PGX23GX24X25X26X27X28 -式2)
前記式2) にいおいて、
X20は、V、Aまたは、Lであり、
X21は、Q、N、R、I、K、Y、V、M、S、Q、W、F、L、Vまたは、Cであり、
X22は、A、G、K、S、V、Mまたは、Tであり、
X23は、K、Q、E、Rまたは、Tであり、
X24は、L、N、I、P、Y、T、V、W、A、R、Mまたは、Sであり、
X25は、Vまたは、Eであり、
X26は、W、I、V、P、F、H、M、Y、L、Cまたは、Rであり、
X27は、V、M、Iまたは、Lであり、
X28は、S、Aまたは、Gである。
X29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DX52X53X54YX55C X56X57 -式3)
前記式3) にいおいて、
X29は、R、H、Qまたは、Tであり、
X30は、F、V、Lまたは、Iであり、
X31は、T、Sまたは、Iであり、
X32は、I、L、V、Mまたは、Rであり、
X33は、S、Tまたは、Dであり、
X34は、R、A、V、Nまたは、Iであり、
X35は、D、Nまたは、Aであり、
X36は、N、T、D、I、R、K、Yまたは、Eであり、
X37は、A、S、Vまたは、Tであり、
X38は、K、R、T、Q、V、E、M、Nまたは、Iであり、
X39は、N、R、T、K、S、Dまたは、Vであり、
X40は、T、M、S、V、I、Yまたは、Aであり、
X41は、L、V、Aまたは、Mであり、
X42は、F、Y、N、D、Hまたは、Sであり、
X43は、Lまたは、Mであり、
X44は、Q、E、Hまたは、Nであり、
X45は、M、L、V、Iまたは、Wであり、
X46は、N、T、K、D、Y、Iまたは、Sであり、
X47は、Sまたは、Nであり、
X48は、Lまたは、Vであり、
X49は、R、Kまたは、Tであり、
X50は、D、A、S、P、T、V、Iまたは、Sであり、
X51は、E、A、Dまたは、Sであり、
X52は、T、Nまたは、Sであり、
X53は、S、Aまたは、Gであり、
X54は、V、I、Lまたは、Mであり、
X55は、Yまたは、Fであり、
X56は、A、G、Vまたは、Sであり、
X57は、R、S、K、T、L、Nまたは、Fである。
X58GX59GX60X61VTVSS -式4)
前記式4) にいおいて、
X58は、W、C、Y、G、Sまたは、Aであり、
X59は、Q、Rまたは、Lであり、
X60は、A、T、Iまたは、Vであり、
X61は、L、M、P、Vまたは、Tである。
FR1のアミノ酸配列:
X0VQLX1X2SGGX5X6X7X8PGX9SX10RX12SCX14X15SGX17X18X19 -式5)
前記式5)にいおいて、
X0は、Eまたは、Qであり、
X1は、Vまたは、Lであり、
X2は、Eまたは、Qであり、
X5は、G、M、N、Vまたは、Eであり、
X6は、Lまたは、Vであり、
X7は、V、または、Kであり、
X8は、Q、Kまたは、Hであり、
X9は、G、T、A、R、E、または、Tであり、
X10は、L、または、Vであり、
X12は、L、または、Vであり、
X14は、A、E、V、I、Kまたは、Sであり、
X15は、A、Gまたは、Vであり、
X17は、F、Y、R、Gまたは、Lであり、
X18は、T、A、S、N、T、P、I、N、Hまたは、Aであり、
X19は、F、L、Vまたは、Cである。
WVRX21X22PGX23GX24X25X26X27X28 -式6)
前記式6) にいおいて、
X21は、Q、N、R、I、K、Y、V、M、S、Q、W、F、L、Vまたは、Cであり、
X22は、A、G、K、Sまたは、Mであり、
X23は、K、Q、E、Rまたは、Tであり、
X24は、L、N、I、P、Y、T、V、W、A、R、Mまたは、Sであり、
X25は、Vまたは、Eであり、
X26は、W、I、V、P、F、H、M、Y、L、Cまたは、Rであり、
X27は、V、M、Iまたは、Lであり、
X28は、S、Aまたは、Gである。
RX30TX32SX34DX36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DTAX54YX55CX56X57 -式7)
前記式7) にいおいて、
X30は、F、V、Lまたは、Iであり、
X32は、I、L、Vまたは、Mであり、
X34は、R、A、V、Nまたは、Iであり、
X36は、N、T、D、I、R、K、Yまたは、Eであり、
X37は、A、S、Vまたは、Tであり、
X38は、K、R、T、Q、V、E、M、Nまたは、Iであり、
X39は、N、R、T、K、S、Dまたは、Vであり、
X40は、T、M、S、V、I、Yまたは、Aであり、
X41は、L、V、Aまたは、Mであり、
X42は、F、Y、N、D、Hまたは、Sであり、
X43は、Lまたは、Mであり、
X44は、Q、E、Hまたは、Nであり、
X45は、M、L、V、Iまたは、Wであり、
X46は、N、T、K、D、Y、Iまたは、Sであり、
X47は、Sまたは、Nであり、
X48は、Lまたは、Vであり、
X49は、R、Kまたは、Tで
X50は、D、A、S、P、T、V、Iまたは、Sであり、
X51は、E、A、Dまたは、Sであり、
X54は、V、I、Lまたは、Mであり、
X55は、Yまたは、Fであり、
X56は、A、G、Vまたは、Sであり、
X57は、R、S、K、T、L、Nまたは、Fである。
X58GQGX60X61VTVSS -式8)
前記式8) にいおいて、
X58は、W、C、Y、G、Sまたは、Aであり、
X60は、A、T、Iまたは、Vであり、
X61は、L、M、Vまたは、Tである。
FR1-X-FR2-X-FR3-X-FR4 -式9)
で表示されるアミノ酸配列を持つ。前記式9)でXは、左側から順にCDR1、CDR2及びCDR3を意味する。
具体的に、本発明に係るFR1乃至FR4のフレームのアミノ酸配列を含むVH領域は、表3及び表4に記載された通り、配列番号37乃至89及び配列番号90乃至131によるアミノ酸配列を持つ。
このような抗体骨格は、目的とするターゲット(target)に結合する蛋白質、特にVHドメイン抗体選別のためのCDR変形ライブラリー製作のための骨格として活用することができる。
前記説明した通り、本発明に係るTAPE方法及びこれのためのTAPEシステムは、Tat信号配列に目的蛋白質と抗生剤耐性蛋白質が結合された遺伝子構造体(construct)を製造して、これを含むベクターを宿主細胞、特に大腸菌に形質転換させることによって、融合蛋白質を大腸菌で発現させて、水溶性(soluble)であり熱力学的安定性が優れたヒト生殖細胞由
来免疫グロブリン可変ドメイン(Immunoglobulin variable domain、VHまたはVL)やリガンドなどの目的蛋白質を選別できる方法及びそのような方法を行うためのシステムである。
oid)に移動する経路を誘導する。一般にTat信号配列は、次の三つのモチーフ(motif)に区分される。プラスの電位を示すN-末端モチーフであるn-領域(region)、中間の疏水性(hydrophobic)アミノ酸からなるh-領域、C-末端モチーフであるc-領域からなっている。多く
のTat信号配列を分析した結果、n-領域とh-領域にかけてTat信号配列の特徴的な保存配列であるS/T-R-R-x-F-L-Kが存在することが明らかになった。この中二つのアルギニン(arginine:R)は、すべてのTat信号配列において変わりがない理由からツイン-アルギニン(Twin-arginine)と名付けられた。
複合体によって細胞質でフォールディングが行われて完ぺきな三次構造が形成された蛋白質だけ認知するので、Sec経路とは異なった特性の蛋白質の移動経路に関与する(Baneyx and Mujacic,Nat. Biotech. 2004,22,1399~1408)。
の水溶性及びはやいフォールディングの可否に従属的な特徴を示す点を利用した(DeLisa et al., 2003 PNAS 100(10): 6115-6120; Snaders et al., 2001 Mol Microbiol 41(1): 241-246; Matos et al., 2008 EMBO J 27(15): 2055-2063; Fisher et al., 2006 Protein Sci 15(3): 449-458; Lim et al., 2009 Protein Sci 18(12): 2537-2549)。本発明で用いることができるTat経路信号配列は、前記
考察した通り、TorA、CueO、DmsA、FdnG、FdoG、HyaA、NapA、Suf1、WcaM、YagT、TcbK、YcdB、YdhX及びYnfE蛋白質の信号配列のうち選択されることが好ましいが、これらに限定されない。
である。本願発明のスクリーニングシステムを介して選別を経た生殖細胞のヒトVHドメインまたは変形された(engineered) VHドメインが、どのような物理化学的特性を見せるかは、選別されたVHドメインの特性分析を介してだけで知ることが出来る。このように細胞質内での自発的なフォールディングを成す目的蛋白質の特性が、さらに抗体治療剤としてのどんな物理化学的特性(例えば、蛋白質水溶性、蛋白質熱力学的安定性、長期保管安定
性、及び蛋白質構造的安定性等)に寄与するのかは、単純には予測し難い。本願発明の目的は、前記のようなTAPE方法を導入及び開発して、これを蛋白質工学に適用させることであり、より具体的にこのスクリーニング方法を介して改良されたヒト免疫グロブリン可変ドメイン抗体(VHまたはVL)の選別に応用して、これから出てきた向上した物性の可変ドメイン抗体を新規治療用抗体の開発のための骨格構造(scaffold)に応用することである。
従来のファージディスプレー(phage display)技術を利用してドメイン抗体ライブラリーに温度のような一定のストレスを与えた後、プロテインA(protein A)に付く活性を測定
して、パニングを行う方法(Jepsers L. et al., Nat. Biotechnol. 2004 22(9): 1161-5; Barthelemy P. A. et al., J. Biol. Chem. 2008 283(6): 3639-54)等により、NIHグループの場合は特別な選別を経ないで実験的に偶然にドメイン形態で
安定したm0というドメインを発見したことがある(J. Biol. Chem. 2009 May 22; 284(21): 14203-14210)。
のプレートに105個以上の個別クローンを分離し難い。一般的な結合活性を選別するための目的の抗体ライブラリーの大きさが、109乃至1010個であることを勘案すると、普通の大きさのライブラリーを前記のような方法で全部処理することは、物理的にかなり難しいのでスクリーニングにおいてハイスルプット(high throughput)形態を実現するのが実質的に難しい結果を招く。また、従来の方法(例えばISELATE)を用いた場合、多くの場合に
おいてプレートで抗生剤耐性で選別された個別菌株のプラスミド構造遺伝子塩基配列を確認してみると、目的遺伝子が断片化された形態でクローニングされて短い形態の蛋白質が発現される場合、または、目的遺伝子がなしでレポーター(reporter)遺伝子(例えばTEM1-1 b-lactamase)だけ存在する場合がしばしば発見される(Fisher A. C. et al.,J. Mol. Biol. 2009 385(1): 299-311)。このようにペプチド水準(10〜20個のアミノ酸
で構成)の短い蛋白質は二次三次構造に影響を多くは受けないために、それ自体で非常に水溶性が高い場合が多くて、結果的に偽陽性(false positive)で示されることになる。
既存のTat基盤蛋白質フォールディング選別方法(例えばISELATE、Fisher JMB 2009)では、このような偽陽性の比が、抗生剤耐性を利用した選別次数が増えるほど増幅される傾向があって、蛋白質水溶性スクリーニングを不可能にさせる実質的な障害として作用する。従って、このような多くの方法は、大規模なライブラリーを検査するよりは、水溶性を確保しにくい目的蛋白質の小規模の大きさの突然変異ライブラリーから(105乃至106の大
きさ)蛋白質変形を介して水溶性発現を確保して結晶構造を研究するための目的で利用する(Pedelacq et al., Nat Biotechnol. 2002 20(9):927-32; Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2003 100(2): 455-60)。
の方法においては、抗生剤が含まれた液体培地でライブラリーを選別した後、ライブラリーの発現ベクター(例えばpET-TAPE)へのクローニング過程中の自己連結(self-ligation)
さらた空ベクター(mockベクター)と上で言及したペプチド水準の遺伝子断片が入ったクローンが偽陽性で存在する確率が非常に高い。このようなリガーゼ(ligase)を利用したクローニング方法の内在的問題によって引き起こされるペプチド水準の大きさの遺伝子断片による偽陽性問題を解決するための方法として、回収された大腸菌から全てのプラスミドを
回収して、すでにデザインされた目的蛋白質とTEM-1ベータ-ラクタマーゼ融合蛋白質発現遺伝子の両側終端に制限酵素を処理して完全な大きさの選別遺伝子をゲル電気泳動(gel electrophoresis)及びゲル溶出(gel elution)方法で分離すると、TAPE方法によって一次選別されたすべての真陽性(true positive) VHドメイン遺伝子だけをもれなく回収することができる。従って、本発明に係るTAPE方法は、反復的な抗生剤耐性選別次数が増えるにも関わらず偽陽性が増幅されず完全な目的蛋白質の遺伝子構造体(construct)だけ含ま
れた真陽性(true positive)クローンだけ抗生剤耐性の程度により選別できるという長所も持っている。
(1)目的蛋白質、特に重鎖可変ドメインのN-末端にTat-信号配列が機能的に連結されており、C-末端には抗生剤耐性蛋白質が機能的に連結されている融合蛋白質をコードする遺伝子構造体に形質転換された宿主細胞群を抗生剤が含まれた液状培地で培養する工程;
(2)生存した宿主細胞を回収してプラスミド(plasmid) DNAを回収する工程;
(3)回収されたプラスミドDNAで目的蛋白質をコードする核酸配列を回収する工程;
(4)回収された核酸配列から目的蛋白質の配列を確認して選別する工程;を含んで構成されて、
特に、工程(3)以後、
(3‘)回収された核酸配列を再びTat-信号配列をコードする遺伝子及び抗生剤耐性付与遺伝子に作動可能に連結させた遺伝子構造体を製作して、これを再び宿主細胞群に形質転換させる工程;及び
(3‘’)別途の遺伝子構造体製作なしに回収された核酸配列を含むプラズミドを直ちに宿主細胞群に形質転換させる工程;のうち選択された一つの工程を追加的に含んでも良い。
(3‘’)工程は、(3‘)工程に比べてより迅速に次の工程が進行できるとの長所がある。
(1)工程乃至(3‘)工程または(3‘’)工程が、2回以上繰り返される場合、最終的に(3‘)工程または(3’‘)工程以後(4)工程で目的蛋白質の配列を確認して選別する工程を行って、目的蛋白質を同定(identification)することができる。
(1)宿主細胞、特に大腸菌細胞質で目的蛋白質、特にヒト可変ドメインライブラリーを融合蛋白質形態で発現する。ここで、それぞれの宿主細胞、特に大腸菌は、一つの特定融合蛋白質だけ発現する。ここで融合蛋白質は、Tat経路信号配列が目的蛋白質、例えば、ヒ
ト免疫グロブリン可変ドメイン、特にVHのN-末端に機能的に連結されておりC-末端には成熟した(自体Sec経路信号配列が除外された) TEM-1ベータ-ラクタマーゼ(betalactamase)等の抗生剤耐性を与える蛋白質が機能的に連結されている。
はカルベニシリン(carbenicillin)等を用いても良いが、これらに制限されるのではなく、前記工程(1)で用いられる抗生剤耐性蛋白質に応じて用いられることができる適切な抗生剤ならばいずれも制限なしに使用可能である。発現した融合蛋白質は、目的蛋白質の特性に応じてTat経路を経て細胞膜間に移動するか、目的蛋白質の特性上移動に失敗した、
すなわち水溶性を持たない融合蛋白質は、封入体(inclusion body)を形成するか、またはTatプルーフリーディング(proof reading)機序によって細胞質内で消滅(degradation)される。Tat経路のフォールディング検索機能を通過して周辺細胞質(periplasm)に融合蛋白質が移動した大腸菌だけが目的蛋白質のC-末端に機能的に連結されたTEM-1ベータ-ラクタマーゼなどの抗生剤耐性付与蛋白質の作用によって抗生剤が含まれた液体選別培地で耐性を獲得することができる。
けを電気泳動及びゲル抽出方法などで回収するか、または
(3‘)液体選別培地で生き残った大腸菌を回収してプラスミドDNAを回収した後、これを実施例5で記述した通り直ちに大腸菌に形質転換して、次のラウンドに進行する。
(4)回収された核酸を再びTat経路信号配列の部分と再び機能的に連結するためにモック(mock)ベクター(pET-TAPE)にクローニングする。
選別は、以前のラウンドよりさらに高い抗生剤濃度で実施してもよい。
質、特にTCR(T-cell receptor)または受容体リガンドなどが利用されるが、これらに限定されるのではなく、特に好ましくはドメイン抗体、例えばVHドメイン抗体またはVLドメイン抗体である。
するかDNAポリメラーゼ(polymerase)のエラー(error)比を人為的に増加させた重合反応条件で無作為部位の無作為変異を誘発する方法(error-prone PCR)のような増幅を基盤とする突然変異方法が利用されるが、これらに限定されない。
限定されない。また、精製工程は可変ドメインの種類、例えばVH3によるタンパク質A新化度カラムを使用して行われる。
Using an L-arabinose Promoter System in a High-cell-density Culture. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53(2): 201-208.)等がある。 プロモーターとして
は、lacプロモーター(promoter)、T7プロモーター、アラビノース(arabinose)プロモーターなどが融合蛋白質の発現誘導のために用いられてもよい。
グ(Flag tag)、c-mycタグなどから選択されるが、これらに限定されない。
本発明のTAPE方法を通して収得されたリガンド、例えば、生殖ライン塩基配列で選別した野生型リガンドまたは突然変異リガンドは、結合蛋白質として好ましい物理化学的特性を示すことを確認した。特に、水溶性、長期保存安定性、還元環境の細胞質内で自主的にフォールディングできる能力、熱力学的安定性が向上されることを確認することができた。
メイン抗体の骨格を持つ場合、依然として水溶性であり熱力学的安定性を維持する。
する特定リガンド、すなわちドメイン抗体を収得するためのライブラリーの骨格構造(scaffold)として活用することができる。具体的に、選別された突然変異VHドメイン抗体の骨格を維持しながら、無作為CDR配列を挿入して、ライブラリーを構築して、これからパニ
ング(panning)等の常法を用いて目的とするターゲット、すなわち抗原に結合能を持つ抗体を選別することができる。
て選別することができ、前記固定された目的とする抗原に結合しないVHドメイン抗体を湧出する過程を二回以上繰り返してより高い目的とする抗原に対する結合能を持つVHドメイン抗体を選別することができる。
region)のいくつかの特定部位だけを無作為に変形してもよい。
イブラリーを利用して所望のターゲット蛋白質に結合能を持つVHまたはVLドメイン抗体を選別する方法及びそのような方法によって選別されたVHまたはVLドメイン抗体を提供して、選別されたドメイン抗体のアミノ酸配列及びこれをエンコードするポリヌクレオチドを提供する。
従って、選別されたヒトVHまたはVLドメイン抗体の骨格を利用してCDR配列を無作為または論理的(rational)に突然変異させたライブラリー構築が可能で、構築されたライブラリーから治療用薬品に利用することができる優れた特性を持ったドメイン抗体を選別することができる。
Tat(Twin-arginine transport)システム基盤蛋白質水溶性スクリーニングシステムを構築するために、pET9aベクターに目的蛋白質N-末端にTat気質蛋白質であるTorA (E.coli trimethylamine N-oxide reductase)の経路信号配列(signal sequence)のssTorAを連結してC-末端にTEM-1ベータ-ラクタマーゼを連結してpET-TAPEを製作した。
ヒト肝(Liver)、末梢血液単核細胞(peripheral blood mononuclear cell:PBMC)、脾臓(Spleen)、甲状腺(Thyroid)で得たmRNAから逆転写(reverse transcription)を介してcDNAライブラリーを確保した。
(1)ヒト生殖細胞由来VHライブラリー構築
大腸菌T7 Express LysY/Iqを電気穿孔法(electroporation)方法でpET-TAPEライブラリーで形質転換した。以後SOC培養液で37℃、一時間培養後、50μg/ml (1X)カバニシリンが含まれたLB培養液に接種、培養した。大腸菌のOD値が0.6になった時遠心分離を利用して大腸菌を回収して、プラスミドDNA精製キット(QIAGEN、Valencia、CA、USA)を利用して分離後、制限酵素NcoIとBamHIで切断した。切断された遺伝子は、VHライブラリーとβ-lactamase遺伝子を含んでおり、これは以後液状パニング過程で誘発される可能性がある肯定的エラー(false positive)を排除するためである。pET-TAPEプラスミドも制限酵素NcoIとBamHIで切断した。切断後、各DNAは、ゲル抽出キット(QIAGEN)で精製した。カバニシリンLB培養液で選別されたpET9a-TAPEライブラリーから収得したVH遺伝子をpET-TAPEのNcoIとBamHI切断位置に挿入して、これを再び大腸菌T7 Express LysY/Iqに電気トランスフォーメーションした。以後、液状パニングは、培養液上のカバニシリン濃度を250μg/ml (5X)、500μg/ml (10X)で高めながら前記過程を繰り返し実行した。各過程の模式図は、図2に示された通りである。
前記記述した通り作ったヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン遺伝子ライブラリーから前記TAPEシステムを利用してスクリーニングされた自然型ヒトVHドメイン抗体のアミノ酸配列を図3に示して、表1にスクリーニングされた自然型ヒトVHドメイン抗体の骨格、すなわち、FR1乃至FR4の配列を記載した。
その結果、最終3次液状パニングから分離した合計154個のVH配列のうち繰り返し出てきた同じ配列は、一度だけ表示した場合、合計54個の独特の(unique)配列を確保することができた。合計154個の配列のうち96%に該当する148の配列がVH3ファミリータイプと判明した。VH3ファミリーは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン7個のファミリーのうち最も水溶性が相対的に高いと知られてきたので、これは本発明のTAPEシステムを利用したスクリーニングが統計的に有意に水溶性に基づいた選別能力を見せることを証明する結果である。
選別された個別VH遺伝子をレポーター遺伝子であるTEM-1ベータ-ラクタマーゼなしに単独で大腸菌で発現させた時、果たして水溶性発現水準がどの程度になるのか調べるために、VH発現誘導後水溶性画分(soluble fraction)と非水溶性画分(insoluble fraction)を分離した後、SDS-PAGEを介して各種対照群VHドメインと比較してみた(図4参照)。
TAPE方法によって選別された最適な自然型ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VH)候補群のうちM2X1 VH骨格を基盤に追加的な溶解性と安定性を与えるために、VHの構造的な分析に基づいて戦略的(rational)に選択された特定7ヶ所のアミノ酸部位に突然変異を導入する「フレーム変形合成ライブラリー」を構築した。
具体的に、TAPE方法で1次選別したMG2X1骨格を基盤として、M2X1 VH骨格配列に突然変異を誘発したが、具体的に突然変異を誘発するための連鎖重合反応戦略は次のとおりである。
基盤変形VHドメインの選別
前記記述した通り、本発明のTAPEシステムを利用して溶解性と安定性を向上した新しい合成VH骨格を選別した。TAPEを行う際に、ラクタム系抗生剤カバニシリン(Carbenicillin)は、50μg/ml (以下「1X TAPE」という)、100μg/ml (以下「2X TAPE」という)、200μg/ml (以下「4X TAPE」という)、400μg/ml (以下「8X TAPE」という)の順に濃度を高めながら各工程を行った。
選別したヒト由来のVH骨格候補群(図3参照)と合成突然変異を介したVH骨格候補群(図6参照)の物理化学的性質を調べるために三種類の分析を実施した。
選別された遺伝子を大腸菌発現ベクターに移して単独で発現した。NcoI制限酵素塩基配列を含む5’プライマー(表6の配列20)とXhoIを含む3’プライマー(表6の配列21)を利用して、pET-TAPE-VH候補群プラスミドを鋳型でPCRを行った。PCRで増幅して分離したDNAの断片をNcoIとXhoI制限酵素で処理した後、pET22b(+)プラスミド ベクターのNcoIとXhoI切断位置に挿入することによって、pET22b-VHプラスミドを製作した。製作されたプラスミドは、大腸菌T7 Express LysY/Iqに形質転換した後、単一コロニーを分離して、それぞれ100μg/mLアンピシリン、20mM MgCl2、2%(w/v)グルコースが含まれたSB培養液に接種した。培養液の吸光度(Optical Density)が0.6になった時、1mM IPTGを添加して、蛋白質発現のために25℃で4時間培養した。培養液は遠心分離して大腸菌を回収した後、リン酸塩緩衝食塩水(Phosphate-buffered Saline、PBS)に再懸濁(resuspension)した。浮遊された大腸菌は細胞壁粉砕のために4回凍らせて溶かす過程を経て、遠心分離を行って上澄み液を回収した。回収した上澄み液にNaClを0.5Mになるべく添加して、5N NaOHを利用してpHを7.4にした後、0.22μmフィルターでろ過した。蛋白質の分離は、Ni-NTA親和クロマトグラフィーを利用して行って、洗浄過程は100 mMイミダゾール(imidazole)で、溶離は300 mMイミダゾールで実施した。精製された蛋白質は、インビトロゼンから購入したNuPAGE 4-12% Bis-Trisゲルで電気泳動した後、クマシーブルー(Coomassie blue)染色を通して分離した蛋白質を確認した。溶離された蛋白質は、PD-10脱塩(desalting)コラム(GE Healthcare Life Science、Piscataway、NJ、USA)を介してリン酸塩緩衝食塩水(PBS)で緩衝液交換を行った。
MG2X1 VH骨格を基盤としたフレーム変形ライブラリーからTAPEを介して一次に選別したVHの大腸菌での水溶性発現様子を確認するために、前記実施例3の(2)のような方法で該当VHを単独で発現した後、水溶性画分と非水溶性画分を分離して、SDS-PAGEで分析した。
その結果、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインライブラリーから分離した自然型MG2X1と比較して水溶性発現が向上したVH骨格候補を得ることができた。図7に示された通り、多くの選別されたVHは、大腸菌で水溶性として発現した
VH骨格候補群に対する二次元蛋白質構造を分析を介した熱力学的安定性を調べるために、TAPE過程を経て選別した後精製したVH骨格候補群に対して円偏光二色性分光測定法(Circular Dichroism、CD)でTm(Temperature melting;全水溶液状蛋白質の50%が熱変性を起こす温度)を計算した。
凝集現象が起きない特異なVH、例えば、 MG3-10 (表7参照)のような自然型VHの場合、一般にCD分析によるTm値は、約45℃を示す。これを基準として比較した時、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインライブラリーからTAPEシステムを経て選別された自然型 MG4x4-44、 MG4x4-25、 MG10-10、及び MG2x1の場合、Tm値が55℃〜60℃の 間で測定されて、平均的な自然型VHと比較すると、約10℃以上熱力学的安定性が向上したことを確認した(図8及び表7参照)。
長期保管(long-term incubation)による候補VHフレームの凝集(aggregation)を測定することによって蛋白質安定性を調べた。0.2〜0.8 mg/mLの濃度で精製されたVH骨格候補群を37℃で60%の湿度で保管した。約20日間の保管中一定間隔でサンプルを取って遠心分離して凝集した蛋白質を除去した後、水溶液状態として残っている蛋白質の濃度を測定してその比を計算した。
ヒト生殖細胞由来VHライブラリーからTAPE方法で選別されたMG2x1と、フレーム変形ライブラリーからTAPEで選別されたMG8-4とMG8-14の骨格構造に抗原結合力の多様性を与えるために、該当骨格のCDRH3部分にアミノ酸の長さ別(7個〜 13個) CDR3変形ライブラリーを構築した。これは従来の研究を通して、ヒトVHドメインの安定性に最も適して標的蛋白質との結合能を有しているVHドメインのCDR3長さが7個〜13個とのことから類推した(Christoper J Bond. et al., J. Mol. Biol. 2005 348: 699-709)。また、アミノ酸をNNKヌクレオチド(nucleotide)でコードすることによって、NNNとNNSより終止コドンの比を低くしながらも20個すべてのアミノ酸をコードできるようにした。さらに、R94SNNKライブラリーは前記載した方法により、構造化されることによりセリンからアルギニンに置換されたCDR3の柔軟性が強化された。
実施例7と同じ目的でMG2x1またはMG8-4または MG8-14基盤骨格VHに抗原結合力多様性を与えるためのCDR変形ライブラリーを構築した。実施例7でCDRH3長さ別多様性を与えたのとは異なって、CDR長さは維持したまま突然変異を誘発させた時、抗原結合力を持つようになると予想される配列だけを戦略的(rational)に選択して該当遺伝子に無作為突然変異を導入した。三つのCDRの長さは、固定したまま、構造分析を通して抗原と結合する可能性を示す位置(SDRs:Specific Determining Residues)にだけ選択的に突然変異を誘導した。これは、CDR中最小限の位置にだけ突然変異を誘導させることによって、CDR変形による安定性変化と免疫原性(immunogenecity)問題を最小化させることができる長所がある。SDRは、先にCDR1とCDR2はカノニカル(canonical)構造の把握を通して選定して、カノニカル構造が知られていないCDR3の場合には配列整列(sequence alignment)を介して同じCDR3を持っているHEL4蛋白質(PDBコード:1OHQ)のCDR3構造を利用して選定した。
DNA短編の合成プライマーはそれぞれ10 pmolar、0.5 Uのvent DNA重合酵素、各10 mMの4種類dNTP、5μLの10Xバッファーを利用してPCRを通して合成した。PCRは、94℃で2分露出後、94℃で15秒、56℃で20秒、72℃で25秒露出を25回繰り返して、最後に72℃で5分間反応させた。前記反応を介して得られた鋳型断片3個と5’プライマー(配列番号23)と3’プライマー(配列番号44)を利用した重複PCR(Overlapping PCR)を通して全体の大きさの戦略的CDR変形ライブラリーを完成した。PCRは、94℃で2分露出後、94℃で20秒、56℃で20秒、72℃で40秒露出を25回繰り返して、最後に72℃で5分間反応条件で行った。図13は、抗原結合力の多様性を与えるための戦略的(rational) CDR変形ライブラリー構築模式図を示す。
CDR変形がVH骨格構造の安定性に及ぼす影響の確認のために、CDRH3長さ7〜13個の合成ライブラリー及びCDRH1、CDRH2及びCDRH3の特定位置に戦略的に突然変異を導入したライブラリーで無作為に遺伝子を選別して(各CDR変形ライブラリー当たり約8個の遺伝子を選別)、単独発現ベクターにクローニングした。発現ベクターは、pET-22b(+)を利用して、これを宿主細胞であるE.coli DH5aに形質転換(transformation)した。形質転換されたコロニー(colony)を無作為に選別した後、配列を分析して、終止コドン(Stop codon)なしに全体の遺伝子を良好に保存しているプラスミドを分離して、宿主細胞であるE.coli NEBT7に再び形質転換させて該当遺伝子の発現を誘導した。発現条件としては、37℃、200rpm条件で培養をした後、ODが0.6〜0.8になった時1 mM IPTGに誘導して、25℃、180rpm条件で3.5時間後収穫した。蛋白質の水溶性及び非水溶性の部分の分離は、実施例3と同じ方法で行った。
戦略的CDR変形ライブラリーの場合、すべての試料が水溶性に発現することを確認した。まとめると、TAPE方法で選別したVHドメイン抗体のフレームを基盤に作ったCDR変形ライブラリーでCDR変形にもかかわらず、全般的に水溶性発現が安定することを確認した(図14及び表8参照)。
本発明でTAPE方法で選別されたVH骨格を持つVHドメイン抗体ライブラリーを利用してVHドメイン抗体候補群の選別するために用いることができるディスプレイ技術は、ファージディスプレー(Phage Display)、イーストディスプレイ(Yeast Display)、及びリボソームディスプレイ(Ribosome Display)等が好ましいが、これらに制限されない。
ファージベクター(pComb3X)中にクロニングーさらたVHライブラリークロニングー(実施例7及び8);
VHドメインはファージ段部に発見;
目的タンパク質と発現さらたVHドメインを接触;
目的タンパク質に優秀な結合能を有するVHドメインを選別する。
ファージ段部に発現されたVHドメインと目的ドメインを接触させた後、非結合ファージを清浄してVHドメインー目的段パク質複合体を溶出させる。結果的に発現されたVHドメインファージだけを濃縮する。
前記述したパニングー(Panning)過程を5〜6回反復して、標的抗原に強く結合するVHドメイン抗体を選別することができる。
配列番号 1 〜 48は本発明に使用されたプライマー配列である。
配列番号 49は骨格名MG1X8に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 50は骨格名MG2X1に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 51は骨格名MG2X1-34に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 52は骨格名MG2X2-12に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 53は骨格名MG2X2-13に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 54は骨格名MG3X1に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 55は骨格名MG3X10に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 56は骨格名MG4X1-8に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 57は骨格名MG4X1-33に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 58は骨格名MG4X1-35に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 59は骨格名MG4X3-27に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 60は骨格名MG4X4-2に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 61は骨格名MG4X4-4に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 62は骨格名MG4X4-25に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 63は骨格名MG4X4-44に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 64は骨格名MG4X5-30に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 65は骨格名MG4X6-27に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 66は骨格名MG4X6-48に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 67は骨格名MG4X7-15に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 68は骨格名MG4X8-24に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 69は骨格名MG0.5X-1に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 70は骨格名MG0.5X-3に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 71は骨格名MG0.5X-4に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 72は骨格名MG0.5X-14に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 73は骨格名MG0.75X-4に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 74は骨格名MG2X-5に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 75は骨格名MG2X-15に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 76は骨格名MG4X-5に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 77は骨格名MG1-4に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 78は骨格名MG1-6に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 79は骨格名MG1-7に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 80は骨格名MG1-8に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 81は骨格名MG1-9に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 82は骨格名MG1-10に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 83は骨格名MG5-1に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 84は骨格名MG5-2に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 85は骨格名MG5-4に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 86は骨格名MG5-5に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 87は骨格名MG5-6に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 88は骨格名MG5-7に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 89は骨格名MG5-9に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 90は骨格名MG10-1に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 91は骨格名MG10-2に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 92は骨格名MG10-4に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 93は骨格名MG10-5に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 94は骨格名MG10-6に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 95は骨格名MG10-8に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 96は骨格名MG10-10に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 97は骨格名MG2に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 98は骨格名MG5に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 99は骨格名MG6に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 100は骨格名MG7に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 101は骨格名MG10に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 102は骨格名MG8-21に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 103は骨格名MG2-12Lに対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 104は骨格名MG2-7Iに対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 105は骨格名MG2-9Iに対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 106は骨格名MG2-10Iに対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 107は骨格名MG2-11Iに対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 108は骨格名MG2-12Iに対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 109は骨格名MG2-32に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 110は骨格名MG2-34に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 111は骨格名MG2-40に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 112は骨格名MG2-46に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 113は骨格名MG2-47に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 114は骨格名MG2-48に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 115は骨格名MG2-51に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 116は骨格名MG2-53に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 117は骨格名MG2-55に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 118は骨格名MG2-57に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 119は骨格名MG2-58に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 120は骨格名MG2-59に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 121は骨格名MG2-60に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 122は骨格名MG2-64に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 123は骨格名MG4-12に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 124は骨格名MG4-13に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 125は骨格名MG4-17に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 126は骨格名MG4-18に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 127は骨格名MG4-20に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 128は骨格名MG4-28に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 129は骨格名MG4-2に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 130は骨格名MG4-32に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 131は骨格名MG4-33に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 132は骨格名MG4-34に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 133は骨格名MG4-5に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 134は骨格名MG4-6に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 135は骨格名MG4-7に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 136は骨格名MG8-11に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 137は骨格名MG8-12に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 138は骨格名MG8-13に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 139は骨格名MG8-14に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 140は骨格名MG8-4に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 141は骨格名MG8-5に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 142は骨格名MG8-6に対するVH領域のアミノ酸配列である。
配列番号 143は骨格名MG8-8に対するVH領域のアミノ酸配列である。
Claims (16)
- FR1乃至FR4のアミノ酸配列を持つ水溶性VHドメイン抗体骨格であって、前記Hドメイン抗体骨格が、下記FR1乃至FR4のアミノ酸配列を持つ骨格中から選択されることを特徴とする水溶性VHドメイン抗体骨格。
- FR1乃至FR4のアミノ酸配列を持つ水溶性VHドメイン抗体骨格であって、前記Hドメイン抗体骨格が、下記FR1乃至FR4のアミノ酸配列を持つ骨格中から選択されることを特徴とする水溶性VHドメイン抗体骨格。
- FR1乃至FR4のアミノ酸配列を持つVHドメイン抗体骨格が以下のものである、請求項1又は2に記載のVHドメイン抗体骨格。
- 配列番号50、62、63、96、103、104、107、108、117、124、133、139、及び140からなる群から選択される一つ以上の配列を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載のVHドメイン抗体骨格。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のVHドメイン抗体骨格をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のVHドメイン抗体骨格を持つVHドメイン抗体。
- 請求項6に記載のVHドメイン抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のVHドメイン抗体骨格にヒト由来無作為(random)CDRH1、CDRH2及びCDRH3が挿入されたVHドメイン抗体ライブラリー。
- 前記挿入されたCDRH3のアミノ酸残基の個数は、5〜15であることを特徴とする請求項8に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
- 前記挿入されたCDRH3のアミノ酸残基の個数は、7〜13であることを特徴とする請求項8に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
- 前記ヒト由来無作為(random)CDRH1、CDRH2及びCDRH3は、突然変異か誘発されたことを特徴とする請求項8〜10のいずれか一項に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
- カバット(Kabat)配列順番体系を基準に、CDRH1の30番及び31番、CDRH2の53番及びCDRH3の97番、99番、100番、100a番位置で選択された一つ以上の位置で突然変異が誘発されたことを特徴とする請求項11に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
- 前記ライブラリーは未感作(naive)、合成または免疫ライブラリーであることを特徴とする請求項8〜12のいずれか一項に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
- 請求項8〜13のいずれか一項に記載のVHドメイン抗体ライブラリーを利用した目的とする抗原に対する結合能を持つVHドメイン抗体の選別方法。
- 前記目的とする抗原に対する結合能を持つVHドメイン抗体の選別は、固定された目的とする抗原に結合したVHドメイン抗体を除いて固定された目的抗原に結合しないVHドメイン抗体を溶出(elution)して行うことを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記固定された目的抗原に結合しないVHドメイン抗体を溶出する過程は二回以上繰り返すことを特徴とする請求項14又は15に記載の方法。
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