KR101727972B1 - 히아루론산을 포함하는 천연리포좀, 그 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 1종 이상의 천연 유화제, 용매 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질 및 포집물질로서 히아루론산을 포함하는 천연리포좀으로서, 상기 천연 리포좀 전체 중량을 기준으로 상기 천연 유화제 0.5 내지 17 중량%, 상기 천연 방부제 1 내지 5 중량%, 상기 히아루론산 1 내지 20 중량% 및 상기 용매 잔량을 포함하며, 상기 천연 유화제, 상기 용매, 상기 히아루론산을 초음파 처리하여 혼합함으로써 형성되는 천연리포좀, 그 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

Description

히아루론산을 포함하는 천연리포좀, 그 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물{Natural liposome comprising hyaluronic acid, process for the preparation thereof, and cosmetic composition comprising the same}

본 발명은 히아루론산 천연리포좀, 그 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 신체의 외부를 덮고 있는 기관으로, 바깥쪽으로부터 표피, 진피, 피하지방층의 3개의 부분으로 구성되어 있다.

이들 중 가장 안쪽의 피하지방층은 지방세포로 이루어져 있다. 피하지방층 위의 진피는 콜라겐 섬유와 같은 기질 단백질로 이루어져 있으며 혈관, 신경, 땀샘 등이 있다. 또한 표피는 외부로부터의 여러 가지 자극에 대하여 장벽으로서의 역할을 한다. 특히 표피의 각질층은 표피의 가장 바깥쪽에 존재하여 자외선, 세균, 유해물질을 차단하는 역할을 한다.

피부를 이루는 구성물질은 크게 수분이 70%, 단백질이 25%를 차지하고, 지질, 탄수화물, 미네랄, 무기질과 같은 기타물질이 나머지를 이루고 있는 것으로 알려져 있다. 위 구성 물질 중 건강한 피부를 유지하고 가꾸기 위해서는 수분을 얼마나 보유하고 있는지가 매우 중요하다. 표피의 수분 보유능력은 외관상 매끄럽고 유연하며 고운 피부를 유지하는 것과 밀접한 연관성을 가지고 있다. 피부가 함유하고 있는 70%의 수분 중, 표피가 13%, 진피가 57%를 차지하고 있으며, 표피의 각질층의 경우 10% 이상의 수분을 가지고 있을 때 건강하고 탄력 있는 피부를 유지하는 것으로 알려져 있다.

여러 가지 원인에 의해 약화된 각질층의 보습능력을 보완하기 위해 가장 보편적으로 사용되고 있는 방법은 보습제를 이용하는 방법이다. 보습제는 피부의 건조를 막아 피부를 촉촉하고 부드럽게 하는 물질을 말하는데 크게 폴리올류, 천연보습인자, 고분자 보습제로 나눌 수 있다. 이중 대표적인 고분자 보습제인 히아루론산은 생체 적합성으로 인해 피부에 자극 및 독성을 주지 않아 안전하면서도 자신의 부피보다 1000배 정도의 수분을 함유할 수 있는 뛰어난 수화능력이 있는 것으로 알려져 있어서 효과적인 보습제로 사용될 수 있다고 기대되고 있다. 그러나 히아루론산은 고분자로 되어 있다는 점으로 인하여 피부로의 흡수가 어렵다는 문제점이 있다.

한편 피부는 유해물질 또는 유해작용에 대한 보호막으로서의 기능도 하지만 한편으로는 효능물질에 대한 장벽으로서 작용하기도 한다. 그러므로 효능물질을 선택적으로 피부에 침투시키기 위해서는 특수한 피부 흡수 전달 시스템이 필요하며 이를 위하여 가장 많이 연구되고 있는 것 중 하나가 리포좀(liposome)이다.

리포좀은 인지질을 수용액에 현탁할 때 생기는 소포로서 지질 이중충으로 구성된 막에 의해 외막과 격리되어 있으며 막 내에 콜레스테롤 당지질 등의 지질이나 막 단백질을 이입시킬 수 있다.

리포좀은 수용성 또는 유용성 물질을 포집할 수 있어 이들 원료의 운반을 도와주는 역할을 한다. 예를 들면 민감하고 피부에 흡수되기 어려운 원료들을 리포좀에 포집시켜 운반하면 이들 원료성분이 깨지지 않고 그대로 피부에 흡수될 수 있다.

기존의 여러 경피전달 시스템(transdermal delivery system)들 중에서 리포좀(liposome)은 생체막의 주요성분인 인지질로 구성되어 생체 친화적이며 수용성 또는 지용성 성분 모두를 리포좀의 지질 이중층으로 구성된 내부로 포집할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 리포좀은 이러한 장점에도 불구하고 제형이 불안정하고, 포집효율이 매우 낮다는 등의 문제를 안고 있다. 또한 리포좀의 원료로 사용되는 콜레스테롤은 리포좀의 지질막 형성이 견고해지면서 포집물질의 피부 투과율이 낮아지고 활성물질의 방출이 어렵다는 문제점이 있었다. 뿐만 아니라 리포좀 제조에 사용되는 용매, 방부제 등이 피부 자극을 유발하는 경우도 발생하였다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 다양한 종류의 리포좀이 연구되어 오고 있다.

예를 들면 한국등록특허 제225314호에는 히아루론산을 보습 성분으로 함유하는 리포좀형 화장료 조성물이 개시되어 있다. 그러나 상기 문헌에는 천연리포좀에 대하여 구체적으로 개시되어 있지 않으며 천연리포좀의 피부흡수 효과에 대하여도 구체적으로 개시되어 있지 않다.

한국등록특허 제225314호

전세열, 홍란희, 오유경, 김문주, 김봉인, 조소은, 미용해부 생리학, 광문각, 2004 한승겸, 한영숙, 최태부, 이연희, 김춘자, 김주연, 에스테티션을 위한 피부학, 정담미디어, 2004 서은경, 해양심층수를 이용한 화장품의 피부보습 효과에 관한 연구, 건양대학교대학원, 2008 하병조, 김주덕, 양현옥, 최은영, 고원배, 화장품, 수문사, 2002

본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하여 피부 자극 등의 문제를 일으키지 않으면서도 체내에 흡수가 용이하게 이루어지는 새로운 히아루론산 천연리포좀, 그 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 구현예는 1종 이상의 천연 유화제, 용매 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질 및 포집물질로서 히아루론산을 포함하는 천연리포좀으로서, 상기 천연 리포좀 전체 중량을 기준으로 상기 천연 유화제 0.5 내지 17 중량%, 상기 천연 방부제 1 내지 5 중량%, 상기 히아루론산 1 내지 20 중량% 및 상기 용매 잔량을 포함하며, 상기 천연 유화제, 상기 용매, 상기 히아루론산을 초음파 처리하여 혼합함으로써 형성되며, 상기 천연 유화제는 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 하이드로지네이티드포스파티딜콜린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인지질과 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산(콩유래)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지방산을 포함하고, 상기 용매는 증류수이고, 상기 방부제는 초피나무열매추출물, 할미꽃추출물 및 어스니어추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연유래추출물인 천연리포좀을 제공한다.

본 발명의 다른 일 구현예는 천연리포좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 다른 일 구현예는 1종 이상의 유화제를 용매와 혼합한 다음 50~80℃에서 초음파 처리하는 제1단계, 상기 제1단계의 생성물에 히아루론산을 첨가한 후 초음파 처리하여 혼합하는 제2단계, 상기 제2단계의 생성물에 40~60℃로 가온된 용매와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리하여 리포좀을 형성하는 제3단계를 포함하는 천연리포좀의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명의 다른 일 구현예는 천연리포좀을 포함하는 피부 흡수 촉진제를 제공한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 피부 자극 등의 문제를 일으키지 않으면서 포집물질의 포집효율, 피부흡수율이 우수한 천연리포좀을 제공할 수 있다. 이에 따라 본 발명에 따른 화장료 조성물은 보습력 증진, 탄력 증진 및 피부 주름 개선 등의 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 천연리포좀의 제조방법을 나타낸다.
도 2a, 도 2b, 도 2c는 각각 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀, 비교예 1의 히아루론산 혼합물, 비교예 2의 합성리포좀의 SEM 사진(5만배 배율)이다.
도 3a, 도 3b, 도 3c는 각각 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀, 비교예 1의 히아루론산 혼합물, 비교예 2의 합성리포좀의 입도 분포 그래프를 나타낸다.
도 4는 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀과 비교예 1의 히아루론산 혼합물, 비교예 2의 합성리포좀의 히아루론산 흡수율 그래프를 나타낸다.
도 5는 증류수, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀, 비교예 1의 히아루론산 혼합물, 비교예 2의 합성리포좀의 세포증식율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 증류수, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀, 비교예 1의 히아루론산 혼합물의 100배 확대 광학 현미경 사진이다.
도 7는 증류수, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀, 비교예 1의 히아루론산 혼합물의 200배 확대 광학 현미경 사진이다.
도 8은 증류수, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀, 비교예 1의 히아루론산 혼합물의 500배 확대 전자 주사 현미경 사진이다.
도 9는 증류수, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀, 비교예 1의 히아루론산 혼합물의 진피세포에 흡수된 히아루론산 함량을 비교한 그래프이다.
도 10은 증류수, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀, 비교예 1의 히아루론산 혼합물의 생체 외 피부흡수 비교 그래프이다.
도 11은 증류수, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀, 비교예 1의 히아루론산 혼합물의 생체 내 피부흡수 비교 그래프이다.
도 12a, 12b, 12c는 각각 증류수, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀, 비교예 1의 히아루론산 혼합물의 흡수 관찰 시험 결과 피부흡수사진이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 천연리포좀을 보다 상세하게 설명한다.

그러나 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

1. 유화제

유화제는 인지질과 지방산으로 이루어져 있다. 인지질로는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스타티딜콜린 (lysophosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 팔미트산(palmitic acid), 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린(hydrogenated phophatidylcholine - 콩유래), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인지질이 사용될 수 있다.

지방산으로는 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid - 콩유래)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지방산이 사용될 수 있다.

기타 유화제로서 세테아릴 올리베이트(Cetearyl olivate), 소르비탄 올리베이트(Sobitan olivate - 올리브유래)이 사용될 수 있다.

유화제로는 2 이상의 유화제가 함께 사용될 수 있다. 예를 들면 제1 유화제로서 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스타티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid - 콩유래)의 조성물이, 제2 유화제로서 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린(hydrogenated phosphatidylcholine - 콩유래)이 사용될 수 있다. 이 경우 제1 유화제 성분은 1 내지 5 중량 %, 제2 유화제 성분은 0.5 내지 2 중량 % 포함될 수 있다.

또한 이들과 함께 천연 지방산이 사용될 수 있다. 바람직하게는 달맞이꽃 오일이 천연 지방산으로 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연 지방산은 1 내지 10 중량% 포함될 수 있다.

유화제 성분은 천연 리포좀 전체 중량을 기준으로 0.5 내지 17 중량%, 바람직하게는 1.5 내지 7 중량% 포함될 수 있다.

2. 포집물질

리포좀의 인지질층 내부에 포집될 수 있는 포집물질로는 하아루론산 (히아루론산 1% solution)으로 이루어진 물질이 사용될 수 있다. 하아루론산(히아루론산 1% solution)은 1 내지 20 중량 %의 함량으로 포함할 수 있다. 히아루론산은 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 고분자 화합물로서 동물 등의 피부에 많이 존재하는 생체 합성 천연 물질이다. 히아루론산은 수산화기가 많기 때문에 친수성 물질로서 피부에 보습 작용을 한다. 의료용으로는 눈조직 보호제, 외상 피복제, 관절염 치료제 등으로 사용되며 화장품용으로는 보습, 피부 보호제 등에 사용될 수 있다.

3. 용매

용매로는 증류수, 천연유래의 부틸렌 글리콜, 프로판디올, 글리세린, 발효주정 사용될 수 있으며, 바람직하게는 증류수, 글리세린이, 더 바람직하게는 증류수가 사용될 수 있다. 용매의 함량은 유화제, 포집물질 및 방부제 함량의 잔량이다.

4. 방부제

방부제로는 초피나무열매추출물, 할미꽃추출물, 어스니어추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연추출물이 사용될 수 있다. 천연추출물이라는 점에서 통상적으로 사용되는 방부제인 벤조산, 파라옥시벤조산 에스테르, 메틸클로로이소티아졸리논의 혼합물, 페녹시에탄올 등과는 구별된다. 방부제는 일반적으로 1 내지 5 중량 % 포함될 수 있다.

5. 리포좀의 제조

본 발명에 따른 리포좀은 초음파를 이용하여 제조될 수 있다.

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1종 이상의 유화제를 증류수 일부와 혼합한 후 초음파 파쇄기(Ultrasonic Liquid Processor)를 이용하여 50~80℃에서 초음파 파쇄한다. 초음파 파쇄는 혼합물을 균질화하기 위한 작업이다. 유화제가 균질화되면 포집물질을 첨가한 후 초음파 파쇄하여 혼합한다. 유화제와 포집물질이 완전히 균질화되면 40~60℃로 가온된 나머지 증류수와 천연추출물(방부제)을 넣고 초음파 파쇄를 통하여 혼합하여 리포좀 형태의 입자를 형성한다. 이후 온도를 서서히 낮추면서 최종적으로 5분간 초음파 파쇄를 하여 상기 입자를 보다 작고 균일하게 만들어 최종적으로 천연리포좀을 제조한다. 그 제조공정을 도 1에 도시하였다.

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본 발명에 의한 리포좀은 피부투과율을 높여 흡수율을 개선할 수 있어 유효성분이 피부에 효과적으로 작용할 수 있도록 한다. 따라서 본 발명에 의한 리포좀은 화장료 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클린싱, 오일, 파운데이션, 스프레인 등의 형태로 화장료 조성물에 사용될 수 있다. 더 구체적으로 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디오일, 보디에센스, 메이컵베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스, 보디세정제, 마스크시트 형태의 화장료 조성물에 사용될 수 있다.

<실시예>

하기 표 1의 조성에 따라 리포좀을 제조하였다.

	원료	실시예 1 (중량%)	비교예 1 (중량%)
유화제	유화제1	2.5	0.0
	유화제2	1.0	0.0
방부제		1.0	1.0
용매	증류수 (D. I. WATER)	잔량	잔량
포집물질	HA	10.0	10.0

유화제1: 유화제1 전체 100중량%를 기준으로, 포스파티딜콜린 67중량%, 리소포스파티딜콜린 8중량%, 포스파티딜에탄올아민 8 중량%, 팔미트산 3 중량%, 스테아르산 1 중량%, 올레산 3 중량%, 리놀레산 7 중량%, 리놀렌산 3 중량%

유화제 2: 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린(hydrogenated phophatidylcholine - 콩유래)

방부제: 초피나무열매추출물: 할미꽃추출물: 어스니어추출물이 1:1:1의 비율로 포함됨

HA: 히아루론산(1% 용액)

구체적인 제조과정은 다음과 같다.

유화제 1과 유화제 2를 증류수의 1/3과 혼합한 후 초음파 파쇄기(Ultrasonic Liquid Processor, QSONICA, USA)를 이용하여 65℃에서 초음파 파쇄하였다. 유화제가 균질화되면 포집물질(히아루론산)을 첨가한 후 초음파 파쇄하여 혼합하였다. 유화제와 포집물질이 완전히 균질화되면 50℃로 가온된 나머지 증류수(2/3)와 천연추출물(방부제)을 넣고 초음파 파쇄를 통하여 혼합하여 리포좀 형태의 입자를 형성하였다. 이후 온도를 서서히 낮추면서 최종적으로 5분간 초음파 파쇄를 하여 상기 입자를 보다 작고 균일하게 만들어 최종적으로 히아루론산 천연리포좀을 제조하였다. 제조공정을 도 1에 도시하였다.

<비교예 1>

실시예 1과 동일한 농도의 히아루론산과 방부제, 그리고 잔량의 증류수를 혼합하여 리포좀화되지 않은 히아루론산 혼합물을 제조하였다.

<비교예 2>

실리콘오일(4%)과 1,3-butylene glycol(11%)에 인지질(포스파티딜콜린 - 1.5%)을 혼합하여 65℃까지 가온하였다. 인지질이 완전히 용해되면 히아루론산 10%를 넣고 homogenizer로 균질화하였다. 잔량의 물과 방부제(파라벤 0.02%)를 혼합하여 입자를 형성시켰고, 초음파 처리를 통해 입자를 균질화시켰다. 이에 따라 히아루론산 합성리포좀을 제조하였다.

<시험예 1> 전자주사현미경에 의한 리포좀의 형태 및 크기 분석

전자주사현미경(Scanning Electron microscope S-1700, hitachi)을 이용하여 상기 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀, 비교예 1의 리포좀화 하지 않은 상태의 히아루론산 혼합물, 비교예 2의 종래기술에 따른 하아루론산 합성리포좀의 입자형태와 크기를 분석하였다. 측정은, 제조된 시료를 동결 건조한 다음 이를 얇게 펴서 PdPt 촉매로 1회 코팅한 후 이루어졌다.

히아루론산을 포집한 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀, 비교예 1의 히아루론산 혼합물, 비교예 2의 히아루론산 합성리포좀을 전자주사현미경(SEM)으로 확인한 다음 SEM 사진을 찍어 그 결과를 각각 도 2a, 도 2b, 도 2c에 나타내었다(5만배 배율).

도시된 바와 같이 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀 입자는 구형의 형태를 나타내었다(도 2a). 리포좀화 하지 않은 비교예 1의 리포좀 혼합물의 경우 입자 모양이 불규칙하며 입자크기가 큰 것을 확인할 수 있었다(도 2b). 비교예 2의 리포좀은 입자가 타원형이며 실시예 1에 비하여 입자크기가 상대적으로 큰 것을 확인할 수 있었다(도 2c).

<시험예 2> 리포좀 입자의 크기 분석

레이저 입도분석기(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer ELS-8000, Otsuka)의 빛의 산란을 이용하여 시료의 입자의 크기를 측정하고 입도 분포를 분석하였다. 평균입자크기를 하기 표 2에 나타내었고, 입자크기의 분포도를 도 3에 나타내었다.

	평균입자크기 (nm)
실시예 1	148.3
비교예 1	26596.0
비교예 2	401.2

상기 표 2, 도 3에서 보듯이 비교예 1의 히아루론산 혼합물과 비교예 2의 히아루론산 리포좀에 비해 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀은 평균입자크기가 작고(표 2) 입자 분포도도 더 균일한 것으로 나타났다(도 3).

<시험예 3> 포집율 측정

완성된 리포좀 현탁액의 일정량을 취하고 1.2㎛ syringe filter를 이용하여 리포좀 내 포집되지 않은 물질을 제거하였다. 필터를 통과한 현탁액에 에탄올을 첨가하여 리포좀 막을 파괴시켰다. 히아루론산의 최대 흡수파장을 확인하여 포집된 히아루론산의 포집율을 확인하였다. 포집율은 아래 식으로 환산하였다.

포집율(%) = 필터를 통과한 히아루론산의 흡광도/처음 넣어준 히아루론산의 흡광도*100

포집율을 하기 표 3에 나타내었다.

	포집율(%)
실시예 1	91.0
비교예 2	86.6

측정결과, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀은 91%의 높은 포집율을 나타냈으며, 비교예 2의 종래기술의 히아루론산 리포좀보다 높은 것으로 확인되었다. 비교예 1은 리포좀화하지 않은 원료이므로 포집율을 측정하지 않았다.

<시험예 4> 피부 흡수력 확인

제조된 히아루론산 천연리포좀이 피부 투과 증진에 어떠한 효과를 주는지 확인하기 위해 Franz diffusion cell을 이용하여 피부 흡수력 실험을 진행하였다. 피부 흡수력 실험에서는 피부 유사막(Strat-M membrane Millipore사)을 이용하여 흡수 정도를 확인하였다. 실험에는 흑색 마우스 피부 조직(C57BL/60)을 털을 제거하여 사용하였다. donor와 receptor phase 사이에 흑색 마우스 피부조직을 고정하였으며 준비된 Franz diffusion cell의 donor에 1ml의 시료를 투여하고 항온수조를 이용해 온도를 약 32.5℃로 유지하였다. 일정 시간의 간격을 두고 매 회 0.25~0.5ml의 receptor phase을 sampling port를 통해 파스퇴르 피펫으로 채취하여 튜브에 보관하였다. 히아루론산 혼합물(비교예 1), 히아루론산 합성리포좀(비교예 2)과 히아루론산 천연리포좀(실시예 1)의 흡수력을 비교한 결과, 6시간 이후부터 히아루론산 천연리포좀의 흡수율이 증가하는 것으로 나타났다(도 4).

<시험예 5> 세포 증식

6 well에 Fibroblast 세포 5 × 10⁴개를 분주하고, 24시간 뒤에 새 배지로 교체한 후 각각 증류수, 비교예 1의 히아루론산 혼합물, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀, 비교예 2의 종래기술의 히아루론산 합성리포좀 0.05% 농도로 48시간 동안 처리하였다. 샘플을 처리한 후 24시간마다 광학현미경(100배, 200배)과 주사전자현미경(500배)으로 각 샘플의 진피세포의 세포증식과정을 관찰하였다. 동일한 방식으로 0.1% 농도로 처리하여 세포증식과정을 관찰하였다.

(1) 세포 증식률 비교

실험 결과, 진피세포에 0.05%, 0.1% 농도로 시료를 처리하였을 때 모두 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀을 처리한 샘플의 세포 증식율이 가장 높은 것으로 나타났다(도 5).

(2) 광학현미경 (100배) 관찰 결과 (0.05% 농도로 처리한 경우)

실시예 1의 히아루론산 천연리포좀으로 처리한 세포가 증류수와 비교예 1의 히아루론산 혼합물로 처리한 세포보다 세포 밀도가 증가한 것으로 나타났다. 샘플 처리 48시간 경과 후, 증류수, 비교예 1의 히아루론산 혼합물로 처리한 경우는 세포 사이에 공간이 남아있었으나 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀으로 처리한 경우는 세포 사이에 공간이 거의 나타나지 않았다(도 6).

(3) 광학현미경 (200배) 관찰 결과 (0.05% 농도로 처리한 경우)

증류수, 비교예 1의 히아루론산 혼합물, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀을 처리한 진피세포를 200배로 확대하여 광학현미경으로 관찰하였다. 비교예 1의 히아루론산 혼합물로 처리한 진피세포는 증류수를 처리한 세포와 큰 차이를 보이지 않았으나 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀으로 처리한 세포는 세포 내부에 히아루론산으로 추정되는 물질을 볼 수 있으며 세포크기가 커진 것을 관찰할 수 있었다(도 7).

(4) 주사전사현미경 (500배) 관찰 결과 (0.05% 농도로 처리한 경우)

증류수, 비교예 1의 히아루론산 혼합물, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀을 처리한 진피세포 각각에 대하여 주사전사현미경을 이용하여 세포의 크기와 굴곡도를 관찰하였다. 증류수<히아루론산<히아루론산 천연리포좀 순으로 부피가 커지는 것을 확인할 수 있었다(도 8).

<시험예 6> 히아루론산 천연리포좀을 처리한 세포의 히아루론산 함유량

6 well에 Fibroblast 세포 5 × 10⁴개를 분주하고, 24시간 뒤에 새 배지로 교체한 후 각각 증류수, 비교예 1의 히아루론산 혼합물, 실시예 1의 히아루론산 천연 리포을 15% 농도로 48시간 동안 처리하였다. 샘플을 처리한 후 처리한 세포의 배지를 제거하고 세포만 회수한 다음 초음파로 파쇄하여 cell lysate를 얻었다. 히아루론산의 함량은 Hyaluronan enzyme-linked immunosorbent assay kit(echelon)를 사용하여 cell lysate에 함유된 히아루론산 양을 확인하였다.

증류수와 비교예 1의 히아루론산 혼합물, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀으로 진피세포를 처리한 후 회수한 세포내부의 히아루론산 함량을 측정하였다. 세포내의 히아루론산 함량은 비교예 1의 히아루론산 혼합물 처리군이 1.85mg/g, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀 처리군이 5.63mg/g인 것으로 확인되었다. 비교예 1의 히아루론산 혼합물로 처리한 세포는 증류수를 처리한 세포와 유사한 히아루론산 함량을 보여 세포 내부로 히아루론산이 거의 흡수되지 않았음을 알 수 있었다. 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀을 처리한 세포는 세포내부로 히아루론산이 흡수되어 증류수 처리군보다 히아루론산 함량이 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 9).

<시험예 7> 생체 외 피부흡수 시험

제조된 히아루론산 천연리포좀이 피부 투과 증진에 어떠한 효과를 주는지 확인하기 위해 Franz diffusion cell을 이용하여 피부 흡수력 실험을 진행하였다. 피부 흡수력 실험에서는 흑색 마우스 피부조직(C57BL/60)을 이용하여 흡수 정도를 확인하였다. donor와 receptor phase 사이에 흑색 마우스 피부조직(C57BL/60)을 고정하였으며 준비된 Franz diffusion cell에 1ml의 천연리포좀을 투여하고 항온수조를 이용해 온도를 약 32.5℃로 유지하였다. 24시간동안 흡수되는 시간을 두고 24시간 경과 후 receptor phase을 회수하여 히아루론산 정량분석을 진행하였다. 정량분석은 Hyaluron enzyme-linked immunosorbent assay kit(HA-ELISA Echelon)를 이용하여 확인하였다.

증류수군에서 227.9 mg/g의 히아루론산이 검출되었고, 비교예 1의 히아루론산군에서는 히아루론산 함량이 175.4 mg/g으로 증류수군에서 보다 오히려 더 낮은 것으로 나타났다. 반면 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀군은 407.8 mg/g으로 증류수군에 비해 약 1.79배 이상 많은 양의 히아루론산이 검출되었다. 이를 통하여 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀이 히아루론산의 흡수를 도왔음을 확인할 수 있었다(도 10).

<시험예 8> 생체 내 피부흡수 시험

Hos:HR-1(Hairless mice)의 등 피부에 증류수, 비교예 1의 히아루론산 혼합물, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀을 30분간 흡수시킨 후 피부조직을 회수하였다. 회수한 피부조직은 homogenate buffer를 첨가하여 균일하게 파쇄하였다. 균질화된 조직파쇄액은 8,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액만 실험에 사용하였다. 상등액에 함유된 히아루론산을 Hyaluron enzyme-linked immunosorbent assay kit(HA-ELISA Echelon)를 이용하여 정량하였다.

피부에 흡수된 히아루론산의 함량을 확인한 결과를 도 11에 나타내었다. 증류수를 흡수시킨 피부에서는 히아루론산이 확인되지 않았고, 비교예 1의 히아루론산 혼합물을 흡수시킨 피부에서는 히아루론산 함량이 15 ng/ml로, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀을 흡수시킨 피부에서는 30.62 ng/ml 로 확인되었다. 히아루론산 천연리포좀은 30분 동안 약 2배 이상의 히아루론산을 흡수시킨 것으로 나타났다(도 11).

<시험예 9> 생체 조직 내 히아루론산 천연리포좀의 흡수 관찰 시험

플루오레세인(Fluorecein)을 함께 혼합한 비교예 1의 히아루론산 혼합물과 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀을 Hos:HR-1(Hairless mice)의 등 피부에 30분간 흡수시킨 후 피부조직을 회수하였다. 회수한 피부를 10% 포르말린에 24시간 동안 침지시킨 후, 다시30% 수크로스에서 12시간 동안 침지하였다. 고정된 피부조직의 단면을 절단하여 공초점주사현미경(CLSM)으로 관찰하였다.

히아루론산이 흡수된 피부조직을 공초점주사현미경으로 확인한 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12a는 플루오레세인과 증류수를 혼합하여 처리한 피부에 대한 피부조직사진을, 도 12b는 플루오레세인과 비교예 1에 따라 히아루론산을 혼합한 시료를 처리한 피부에 대한 피부조직사진을, 도 12c는 실시예 1에 따라 플루오레세인과 히아루론산 천연리포좀을 혼합하여 담지한 천연리포좀을 처리한 피부에 대한 피부조직사진을 나타내었다. 도시된 바와 같이 증류수와 히아루론산을 처리하였을 때, 형광물질이 피부 내부로 흡수되지 않고 표면에 미량 남아있음을 확인할 수 있었다(도 12a, 12b , 12c). 실시예 1의 리포좀으로 처리한 피부조직은 피부 표피와 진피까지 형광물질이 흡수된 것으로 나타났다.

<시험예 10> 천연리포좀 원료의 가변형성 확인

천연리포좀 막의 피부투과 전후의 가변형성을 확인하기 위해 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀이 인공투과장벽을 통과하는 정도를 측정하였다.

구체적으로, 실시예 1의 히아루론산 천연리포좀에 1분동안 0.2MPa의 압력을 가했을 때 폴리카보네이트 막(0.08 μm 크기의 기공 보유)을 통과한 천연리포좀의 양과 막을 통과한 리포좀 입자의 크기를 MINI-EXTRUDER(Avanti polar lipids, inc., USA), Syringe pump(KDS330 Revodix, Korea)를 사용하여 측정하였다. 가변형성지수 측정결과를 하기 표 4에 나타내었다. 제형의 입자 크기는 레이저 입도분석기(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer ELS-8000, Otsuka)를 이용하여 측정하였다. 천연리포좀 막의 가변형성은 다음 식에 비례한다

가변 지수 = J_flux × (rv/rp)²

J_flux = 1분 동안 압출된 천연리포좀의 양

rv = 압출 후의 천연리포좀의 입자크기

rp = filter membrane의 기공 크기

No.	원료	압출전 크기 (nm)	압출후 크기 (nm)	Extradability (%)	가변형성지수
실시예 1	HA	159.9	148.3	95	12.65084

<시험예 11> 천연리포좀 원료의 안정도 평가

실시예 1의 히아루론산 천연리포좀의 시간경과에 따른 안정도를 측정하였다. 상온(25℃)에서 30일 동안 pH, 색상, 향, 가라앉는 정도를 측정하여 안정도를 평가하였다. 평가 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

구분	25℃ pH	색상	향	가라앉은 정도
0일	5.99	불투명한노란 빛	없음	조금 가라앉음
1일경과	5.94	불투명한노란 빛	없음	조금 가라앉음
2일경과	6.09	불투명한노란 빛	없음	조금 가라앉음
7일경과	6.12	불투명한노란 빛	없음	조금 가라앉음
10일경과	5.89	불투명한노란 빛	없음	조금 가라앉음
15일경과	6.18	불투명한노란 빛	없음	조금 가라앉음
20일경과	6.26	불투명한노란 빛	없음	조금 가라앉음
30일경과	6.12	불투명한노란 빛	없음	조금 가라앉음

<시험예 12> 돼지피부를 이용한 생체외 보습력 실험

돼지 피부의 피하지방을 제거하고 이를 가로X세로, 2cm X 2cm 크기로 절개한 후 시료 도포 전에 무게를 측정하였다. 피부 표면에 증류수, 글리세린, 비교예 1인 히아루론산, 비교예 2인 종래기술의 히아루론산 리포좀, 실시예 1인 히아루론산 천연리포좀을 고르게 도포하였다. 시간경과에 따른 무게 변화를 측정하였다. 보습력은 아래 식으로 환산하였다.

보습력(%) = 시간 경과 후 피부 무게/(시료+처음 피부 무게) X 100

시간 경과에 따른 각 샘플의 보습력 측정 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

	0 시간	1 시간	3 시간	6 시간
증류수	100.0	91.4	77.1	63.5
글리세린	100.0	92.0	80.1	67.7
비교예 1	100.0	90.5	79.6	68.8
비교예 2	100.0	91.3	80.3	70.2
실시예 1	100.0	92.3	82.3	73.3

실험 결과, 1시간 이후부터 실시예 1인 히아루론산 천연리포좀을 도포한 피부의 보습력이 가장 높은 것으로 나타났다.

이상에서 설명한 본 발명은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하므로 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 한정되는 것이 아니다.

Claims (13)

1종 이상의 천연 유화제, 용매 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질 및 포집물질로서 히아루론산을 포함하는 천연리포좀으로서,
상기 천연 리포좀 전체 중량을 기준으로 상기 천연 유화제 0.5 내지 17 중량%, 상기 천연 방부제 1 내지 5 중량%, 상기 히아루론산 1 내지 20 중량% 및 상기 용매 잔량을 포함하며,
상기 천연 유화제, 상기 용매, 상기 히아루론산을 초음파 처리하여 혼합함으로써 형성되며,
상기 천연 유화제는 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 하이드로지네이티드포스파티딜콜린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인지질과 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산(콩유래)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지방산을 포함하고,
상기 용매는 증류수이고,
상기 천연 방부제는 초피나무열매추출물, 할미꽃추출물 및 어스니어추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연유래추출물인 천연리포좀.

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제1항에 있어서,
상기 천연 유화제는 1종 이상의 지방산과 1종 이상의 인지질을 함유하는 제1 천연 유화제와 1종 이상의 인지질을 함유하는 제2 천연 유화제를 포함하는 천연리포좀.

제1항에 있어서,
피부 흡수 촉진용 천연리포좀.

제1항의 천연리포좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.

1종 이상의 천연 유화제를 용매와 혼합한 다음 50~80℃에서 초음파 처리하는 제1단계,
상기 제1단계의 생성물에 히아루론산을 첨가한 후 초음파 처리하여 혼합하는 제2단계,
상기 제2단계의 생성물에 40~60℃로 가온된 용매와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리하여 리포좀을 형성하는 제3단계
를 포함하는 제1항, 제7항, 제8항 중 어느 한 항의 천연리포좀의 제조방법.

제10항에 있어서,
상기 제3단계 이후에 온도를 서서히 낮추면서 초음파 처리하는 제4단계
를 추가로 포함하는 천연리포좀의 제조방법.

제1항의 천연리포좀을 포함하는 피부 흡수 촉진제.

제1항의 천연리포좀을 유효성분으로 포함하는 보습제.

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