KR101684790B1 - 비표면적이 다른 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인 및 그 제조방법 - Google Patents

비표면적이 다른 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인 및 그 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101684790B1
KR101684790B1 KR1020150095938A KR20150095938A KR101684790B1 KR 101684790 B1 KR101684790 B1 KR 101684790B1 KR 1020150095938 A KR1020150095938 A KR 1020150095938A KR 20150095938 A KR20150095938 A KR 20150095938A KR 101684790 B1 KR101684790 B1 KR 101684790B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gelatin
collagen
prepare
porous membrane
sodium alginate
Prior art date
Application number
KR1020150095938A
Other languages
English (en)
Inventor
김영진
박진영
Original Assignee
대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대구가톨릭대학교산학협력단 filed Critical 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority to KR1020150095938A priority Critical patent/KR101684790B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101684790B1 publication Critical patent/KR101684790B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/222—Gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

본 발명은 비표면적이 다른 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인 및 그 제조방법에 관한 것으로 다공성지지체위에 나노섬유를 전기방사하여 비표면적이 다른 이중층을 형성함으로써 골유도재생술 시 생분해성을 가지며 경조직과 연조직의 재생속도를 일정하게 조절가능한 생분해성인 경조직 재생용 이중층 다공성 멤브레인을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

비표면적이 다른 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인 및 그 제조방법{A porous membrane having different specific surface double layer for hard tissue regeneration and method for preparing the same}
본 발명은 비표면적이 다른 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연고분자로 마이크로 크기의 다공성 지지체를 만들고 상기 지지체에 콜라겐을 전기방사하여 콜라겐 나노섬유층을 형성함으로써 마이크로와 나노 크기의 다공성 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
최근 임플란트 시술이 대중화대면서 임츨란트에 대한 관심이 증대되고 있는 추세이다. 임플란트의 성공적인 시술을 위해서는 식립되어질 임플란트의 강도를 견딜수 있는 치아의 골 성장이 중요한 요소가 된다. 그러나 치아 결손 후에는 골조직의 성장에 비해 연조직의 성장이 빨라 골 생성을 방해하며 이는 임플란트 식립에 큰 문제점이 될 수 있다. 따라서 상기 문제를 해결하기 위해서 골유도재생술(Guided bone regeneration, GBR)이 급증하고 있으며 이는 생체적합성 차폐막을 이용하여 연조직의 침입을 막아 경조직이 충분히 재생할 수 있는 공간을 마련해 주는 술식이다.
현재 골유도재생술에 이용되는 차폐막은 연조직의 침입을 막고 경조직의 성장을 촉진하는 역활을 하지만 연조직에 대한 생체적합성에 대하여는 적합하지 않은 실정이다. 하지만 골유도재생술 술식 이후에 일차봉합을 위한 연조직의 양과 질이 확보되어야 한다는 점에서 경조직과 연조직의 성장을 모두 고려한 차폐막이 필요한 실정이다.
알긴산나트륨(Alginic acid sodium salt)은 주로 다시마와 해초류에 많이 들어있는 알긴산(alginic acid)이 나트륨과 결합하여 염의 형태로 존재하는 것으로 이는 생분해성 및 생체친화성이 뛰어난 바이오 고분자로 알려져 있다. 또한 젤라틴(Gelatin)은 알긴산과 같은 천연고분자로서 콜라겐의 삼중나선구조를 변형시킨 단일나선 형태로 존재하며 가공의 용이함과 뛰어난 생체적합성으로 생체조직공학 분야에서 널리 이용되는 고분자이다. 또한 제 1형 아텔로 콜라겐은 세포 외 매트릭스 중 일부인 천연고분자로 특히 골 조직에 많이 존재하여 뼈, 인대 등의 골재생시 많이 활용된다.
본 발명의 선행기술로 다중층 흡수성 치주조직재생유도막이 국내등록특허 제 10-1260757호에 공지되어 있으나 이는 생분해성 차폐막에 수화젤을 결합하여 급격한 분해방지를 목적으로하는 치주조직재생유도막에 관한 것이다. 또 골재생 유도막 및 이의 제조방법이 국내등록특허 제 10-0946268호에 공지되어 있으나 이는 생분해성 고분자와 양극성고분자로 제조된 외층과 인산칼슘 혼합물로 제조된 내층을 포함하여 경조직 재생이 개선된 골재생 유도막에 관한 것이다.
따라서 상기 특허문헌 어디에도 경조직과 연조직의 성장을 일정하게 조절가능한 경조직 재생용 다공성 멤브레인에 관해서는 공지된 바 없다.
따라서 본 발명의 목적은 천연고분자인 알긴산나트륨 및 젤라틴과 블록공중합체를 이용하여 다공성 지지체를 만들고 그 지지체 위에 콜라겐 나노섬유를 전기방사 하여 비표면적이 서로 다른 이중층이 형성되는 것이 특징인 경조직 재생용 이중층 다공성 멤브레인의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조되어 골유도재생술 시 경조직과 연조직의 재생속도를 일정하게 조절가능한 생분해성인 경조직 재생용 이중층 다공성 멤브레인을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기목적은 (a)증류수에 알긴산나트륨과 젤라틴을 용해하여 알긴산나트륨젤라틴 용액을 제조하는 단계와; (b)상기단계에서 얻은 용액에 블록 공중합체인 PPG-PEG-PPG를 첨가하고 균질화 하여 다공성지지체 혼합액을 제조하는 단계와; (c)상기단계에서 얻은 혼합액을 동결건조하여 박막을 제조하는 단계와; (d)상기단계에서 얻은 박막을 염화칼슘 무수물 수용액으로 가교시키고 초음파 세척하여 비표면적 2.0 m2/g 이상의 마이크로 크기의 다공성 지지체를 제조하는 단계와; (e)제1형 아텔로 콜라겐을 헥사플루오르이소프로판올에 용해하여 콜라겐 전기방사용액을 제조하는 단계와; (f)상기 단계에서 얻은 콜라겐 전기방사용액을 상기 (d)단계에서 얻은 다공성 지지체 위에 전기방사하여 비표면적 9.0 m2/g 이상의 나노 크기의 콜라겐 나노섬유를 제조하는단계와; (g)상기단계에서 얻은 콜라겐 나노섬유를 글루탈알데하이드로 가교하고 글리이신 완충액으로 세척하여 본 발명 경조직 재생용 이중층 다공성 멤브레인을 제조하는 단계;로 이루어지고, 상기 경조직 재생용 이중층 다공성 멤브레인의 표면 분석과 조골세포와 섬유아세포의 세포증식능력을 비교평가하는 단계를 통하여 달성하였다.
본 발명은 다공성지지체위에 나노섬유를 전기방사하여 비표면적이 다른 이중층을 형성함으로써 골유도재생술 시 생분해성을 가지며 경조직과 연조직의 재생속도를 일정하게 조절가능한 생분해성인 경조직 재생용 이중층 다공성 멤브레인을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명 경조직 재생용 다공성 멤브레인의 제조방법을 도식화 한 그림이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 제조예 1 내지 제조예 3의 다공성 지지체의 표면을 주사전자현미경으로 500배율과 3000배율에서 관찰한 사진이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 제조예 3의 콜라겐 나노섬유의 가교 전과 가교 후의 표면을 주사전자현미경으로 5000배율에서 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 제조예 3의 경조직 재생용 다공성 멤브레인 단면사진을 주사전자현미경으로 200배율과 1000배율에서 관찰한 사진이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 제조예1 내지 제조예3의 다공성 지지체 및 다공성 멤브레인을 ATR-FTIR을 이용해 표면분석한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 제조예 3의 경조직 재생용 다공성 멤브레인에서의 조골세포와 섬유아세포의 증식율을 확인한 그래프이다
도 7은 본 발명에 따라 제조된 제조예 3의 경조직 재생용 다공성 멤브레인에서의 조골세포와 섬유아세포의 증착을 주사전사현미경으로 500배율로 관찰한 사진이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 제조예 3의 콜라겐 나노섬유에서의 조골세포의 골 형성 활성을 확인한 그래프이다.
본 발명 경조직 재생용 이중층 다공성 멤브레인은 (a)증류수에 알긴산나트륨과 젤라틴을 용해하여 알긴산나트륨젤라틴 용액을 제조하는 단계와; (b)상기단계에서 얻은 용액에 블록 공중합체인 PPG-PEG-PPG를 첨가하고 균질화 하여 다공성지지체 혼합액을 제조하는 단계와; (c)상기단계에서 얻은 혼합액을 동결건조하여 박막을 제조하는 단계와; (d)상기단계에서 얻은 박막을 염화칼슘 무수물 수용액으로 가교시키고 초음파 세척하여 비표면적 2.0 m2/g 이상의 마이크로 크기의 다공성 지지체를 제조하는 단계와; (e)제1형 아텔로 콜라겐을 헥사플루오르이소프로판올에 용해하여 콜라겐 전기방사용액을 제조하는 단계와; (f)상기 단계에서 얻은 콜라겐 전기방사용액을 상기 (d)단계에서 얻은 다공성 지지체 위에 전기방사하여 비표면적 9.0 m2/g 이상의 나노 크기의 콜라겐 나노섬유를 제조하는단계와; (g)상기단계에서 얻은 콜라겐 나노섬유를 글루탈알데하이드로 가교하고 글리이신 완충액으로 세척하는 단계로 제조된다.
본 발명에 따르면 상기 (a)단계에서 알긴산나트륨 이외에 알긴산암모늄 (Ammonium alginate), 알긴산 칼슘 (Calcium alginate), 알긴산 칼륨 (Potassium alginate), 알긴산나트륨 (Sodium alginate) 중 어느하나 이상의 것을 사용하여도 좋다.
상기 (a) 단계에서 용매는 증류수 이외에 염화 메틸렌(methylene chloride), 클로로포름(chloroform), 아세톤(acetone), 아니솔(anisole), 아세트산 에틸(ethyl acetate), 아세트산 메틸(methyl acetate), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone), 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), 2-피롤리돈(2-pyrollidone), 구연산 트리에틸(triethyl citrate), 유산 에틸(ethyl lactate), 프로필렌 카보네이트(propylene carbonate), 벤질 알코올(benzyl alcohol), 벤조산 벤질(benzyl benzoate), 미글리올810(Miglyol810), 이소프로판올(isopropanol), 에탄올(ethanol), 초임계 이산화탄소(super critical carbon dioxide), 아세토니트릴(acetonitrile) 중 어느하나 이상의 것을 사용하여도 좋다.
상기 (a)단계의 젤라틴과 (e)단계의 콜라겐의 제형은 스펀지 (Sponge), 피막 (film), 막 (membrane), 파우더 (Powder) 중 어느하나 이상의 것이어도 무관하며,물고기, 소, 돼지 중 어느하나에서 추출된 콜라겐과 이들 콜라겐으로부터 가공되어진 젤라틴을 사용할 수 있다.
상기 (a)단계의 젤라틴과 (e)단계의 콜라겐의 용매는 증류수와 헥사플루오르이소프로판올 이외에 프로판올 (propanol), 부탄올 (butanol), 아세톤 (acetone), 트리플루오로에틸렌 (TFE : trifluoro ethylene), 트리플루오로아세트산 (TFA : trifluoro acetic acid), 테트라하이드로퓨란 (THF : tetra hydro furan), 디클로로메탄 (DCM : dichloro methane), 디메틸포름아마이드 (DMF : dimethyl formamide), 디메틸아세트아마이드 (DMA : dimethyl acetamide), 디메틸설폭시드 (dimethyl sulfoxide), 헥산 (hexane), 벤젠 (benzene), 아세트산 (acetic acid), 포름산 (formic acid) 중 어느하나 이상의 것을 사용하여도 좋다.
상기 (f)단계의 전기방사법은 고분자 용액에 고전압(>10kV)을 가해 수백 nm로 매우작은 미세 나노섬유를 제조하는 방법으로 이 섬유들은 가볍고 유연성이 좋으며 비표면적이 큰 다공성 네트워크를 구성해 생체조직공학에서 활용되는 방법이다.
본 명세서에 달리 정의하지 않는 한 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 달리 언급되지 않는 한 "또는"은 "및/또는"을 의미한다. 더욱이 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 다른 형태 예를 들어 "가지는", “이루어지는” 및 "구성되는"는 제한적이지 않다.
이하, 본 발명의 구체적인 내용을 실시예 및 제조예를 들어 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 발명이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1. 본 발명 마이크로와 나노 크기의 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인 제조
공시재료
15-20 cP의 점도를 가지는 파우더 형태의 알긴산나트륨(Alginic acid sodium salt), 파우더 형태의 물고기 껍질에서 추출한 젤라틴(Gelatin), 리에틸렌클리콜(PEG)을 40 중량% 포함하고 분자량이 2,700인 PPG-PEG-PPG(polypropylene glycol-polyethylene glycol-polypropylene glycol), 헥사플루오르프로판올(hexa fluoro isopropanol), 25% 글루탈알데히드(Glutaraldehyde solution), 0.1M 글라이신 버퍼용액(Glycine buffer solution)은 시그마알드리치(Sigma-Aldrich Co.)에서 구매하였고 염화칼슘(Cacl2)은 덕산(Duksan Co.)에서 구매 하였고 제 1형 아텔로 돈피 콜라겐(Type 1 atel-collagen from porcine skin)은 바이오랜드(Bioland Co.)에서 구매하여 이를 하기 공시재료로 사용하였다.
본 발명 마이크로 크기의 다공성 지지체 제조
25 중량%의 알긴산나트륨과 75 중량%의 젤라틴을 증류수에 용해하여 알긴산나트륨젤라틴용액을 제조하였다. 상기단계에서 얻은 용액에 기공을 형성하기 위해 블록 공중합체인 PPG-PEG-PPG를 알긴산나트륨젤라틴용액 대비 25 중량% 첨가하고 상온에서 24시간 교반한 후 호모지나이저(homogenizer)를 사용하여 20,000rpm으로 균질화하여 알긴산나트륨젤라틴-PPG-PEG-PPG 혼합물을 제조하였다. 상기단계에서 얻은 혼합물을 동결건조하여 박막을 만들고 이를 0.1M의 염화칼슘 무수물 수용액 30mL에 처리하여 8시간 가교반응시킨다. 상기 가교반응 완료 후 초음파 세척을 통해 증류수와 PPG-PEG-PPG를 제거하여 비표면적 2.0 m2/g 이상의 마이크로 단위의 다공성 지지체를 제조하였다.
본 발명 마이크로와 나노 크기의 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인 제조
제 1형 아텔로 콜라겐을 헥사플루오르이소프로판올에 용해하여 7 중량% 콜라겐 용액을 제조하였다. 상기 단계에서 얻은 콜라겐 용액을 실린지에 넣고 상기 실시예1에서 제조한 마이크로 단위의 다공성지지체의 한쪽면에 전압 15kV, 방사거리 15cm, 방사속도 0.5mL/h로 전기방사한다. 상기의 콜라겐 나노섬유가 방사된 다공성지지체를 25% 글루탈알데히드 10mL이 들어있는 데시케이터(desiccator)에 넣고 80℃에서 8분 기상가교 시킨다. 가교반응 완료 후 상기 콜라겐 나노섬유가 방사된 다공성지지체를 0.1M의 글라이신 완충용액에 4시간 반응시켜주고 반응 후에 증류수로 세척하여 도 1과 같이 본 발명 마이크로(비표면적 2.0 m2/g 이상, 내측)와 나노(비표면적 9.0 m2/g 이상, 외측) 크기의 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인을 제조하였다.
실시예2. 본 발명 마이크로와 나노 크기의 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인의 특성 분석
상기 실시예 1의 제조방법 중 마이크로 단위의 다공성 지지체 제조시 알긴산나트륨과 젤라틴의 중량비를 달리한 제조예 1 내지 제조예 3을 하기와 같이 제조하였다.
제조예 1. 알긴산나트륨과 젤라틴의 중량비를 3:1로 제조한 다공성 지지체
상기 실시예 1의 마이크로 단위의 다공성 지지체 제조방법 중 알긴산나트륨젤라틴-PPG-PEG-PPG 혼합물의 혼합방법을 증류수 10mL에 알긴산나트륨 0.75g과 젤라틴 0.25g과 PPG-PEG-PPG 0.25g을 혼합하여 마이크로 단위의 다공성 지지체를 제조하였다.
제조예 2. 알긴산나트륨과 젤라틴의 중량비를 1:1로 제조한 다공성 지지체
상기 실시예 1의 마이크로 단위의 다공성 지지체 제조방법 중 알긴산나트륨젤라틴-PPG-PEG-PPG 혼합물의 혼합방법을 증류수 10mL에 알긴산나트륨 0.5g과 젤라틴 0.5g과 PPG-PEG-PPG 0.25g을 혼합하여 마이크로 단위의 다공성 지지체를 제조하였다.
제조예 3. 알긴산나트륨과 젤라틴의 중량비를 1:3으로 제조한 본 발명 마이크로와 나노 크기의 이중층 구조를 가지는 다공성 멤브레인
상기 실시예 1의 마이크로 단위의 다공성 지지체 제조방법 중 알긴산나트륨젤라틴-PPG-PEG-PPG 혼합물의 혼합방법을 증류수 10mL에 알긴산나트륨 0.25g과 젤라틴 0.75g과 PPG-PEG-PPG 0.25g을 혼합하여 마이크로 단위의 다공성 지지체를 제조하였다. 상기에서 얻은 다공성 지지체의 한쪽면에 7 중량% 제1형 아텔로 콜라겐 전기방사 용액4mL을 전기방사하고 실시예 1의 제조방법에 따라 본 발명 마이크로와 나노 단위의 이중층 구조를 가지는 다공성 멤브레인을 제조하였다.
본 발명 다공성 지지체의 표면 분석
상기 제조예 1 내지 제조예 3의 다공성 지지체 표면을 주사전자현미경(SEM,S-4300,15.0kV)을 사용하여 확인하였다.
도 2와 같이, 제조예 1의 경우 지지체 표면에서 소수의 기공이 관찰되었지만 뚜렷한 형태를 나타내지 않았으며 그 크기는 30um~100um 으로 다양한 크기의 기공이 관찰되었고 다공성을 나타내지 않는 필름형태의 지지체가 나타났다. 또 제조예 2의 경우 제조예 1과 같이 다공성을 나타내지 않은 필름형태의 지지체가 나타났다. 이는 알긴산나트륨의 중량비가 줄어들고 젤라틴의 중량비가 늘어날수록 기공의 형성은 많아지지만 대부분 필름 형태의 다공성이 없는 지지체가 형성되는 것으로 확인되었다. 한편 제조예 3의 경우 지지체는 대략 3um~10um 크기의 다공성을 가지며 이는 일정한 기공 크기와 연결도를 보이는 역오팔 구조를 나타냈다. 상기 역오팔 구조는 세포성장에 적합한 구조로서 조직공학 분야에서 많이 활용되고 있는 기공의 형태이다.
이를통해 본 발명 다공성 지지체 제조시 알긴산나트륨과 젤라틴의 중량비는 알긴산나트륨이 젤라틴에 비해 적은것이 바람직하였고 가장 바람직하기로는 제조예 3과 같이 알긴산나트륨과 젤라틴의 중량비가 1:3 이었다.
본 발명 콜라겐 나노섬유 표면 분석
제조예 3의 방법으로 제조된 본 발명 다공성 지지체 위에 콜라겐 나노섬유의 가교 전과 후의 표면을 주사전자현미경을 이용하여 확인하였다.
도 3과 같이, 가교 전의 콜라겐 나노섬유는 평균적으로 350nm의 직경을 나타내고 대략 3um~10um의 기공이 관찰되었으나 가교 후의 콜라겐 나노섬유는 평균적으로 600nm의 직경을 가지며 대략 1um의 기공으로 이루어진 다공성 네트워크가 형성됨을 확인하였다.
또한 도 4와 같이, 가교작업과 글라이신의 세척작업 뒤에도 콜라겐 나노섬유는 그 형태를 잘 유지하며 다공성지지체 위에 골고루 방사되어 있는 것을 X1000 배율의 단면 사진에서 확인 하였다.
전반사 측정 푸리에 변환 적외선 분광법(ATR-FTIR)
제조예 1 내지 제조예 3에 따라 제조된 다공성지지체 및 다공성멤브레인의 표면을 ATR-FTIR(ALPHA,Bruker optics, 400-4000nm)을 이용하여 분석하였다.
도 5와 같이, 제조예 1 내지 제조예3에 따라 제조된 다공성지지체 및 다공성멤브레인의 특정 피크가 확인되었다. 알긴산나트륨의 경우 1590cm-1와 14140cm-1 부근에서 0.1M 염화칼슘 무수물 수용액에 의해 알긴산나트륨의 카르복실기가 가교된 peak를 확인할 수 있으며 젤라틴의 경우 1590cm-1부근에서 알긴산나트륨과 가교된 peak와 함께 Amide Ⅰ peak가 중첨되어 나오는 것을 확인하였다. 또한 400cm-1~900cm-1 의 Amide Ⅳ~Ⅵ에 따른 peak를 확인함으로써 다공성 지지체에 젤라틴이 여과없이 포함되어 있음을 확인하였으며 알긴산나트륨과 젤라틴의 중량비에 따른 흡광도의 차이는 크지 않았다. 또한 젤라틴과 제조예3의 콜라겐 나노섬유에서 1640cm-1,1540cm-1,1250cm-1 에 따른 Amide Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ peak를 확인하였다.
실시예3. 본 발명 마이크로와 나노 단위의 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인의 생체적합성 확인
본 발명 마이크로와 나노 단위의 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인의 생체적합성은 조골세포(Osteoblast)와 섬유아세표(Fibroblast)을 이용한 세포실험을 통해 확인하였다.
세포배양 및 본 발명 다공성 멤브레인 준비
조골세포(MC3T3-E1,ATCC)는 10% 우태아혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 α-MEM 배지에서, 섬유아세포(CCD-986sk,ATCC)는 10% 우태아혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 D-MEM 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
상기 제조예 3에 따라 제조된 본 발명 다공성 메브레인을 UV를 조사하여 멸균처리하고 무균상태에서 75%, 50%, 25% 에탄올로 각각 2분간 소독하고 인산완충식염수(PBS)를 이용하여 5회 세척후 세포실험에 사용하였다.
세포의 증식력과 부착력 확인
본 발명 제조예 3의 다공성 멤브레인에서 조골세포와 섬유아세포의 세포증식력과 부착력을 MTT assay를 통해 확인하였다. 본 발명 다공성 멤브레인을 24 well 플레이트 바닥에 밀착시킨 다음 그 위에 유리링을 올려놓고 조골세포 또는 섬유아세포를 분주하여 상기 세포가 다공성 멤브레인 표면에서만 접착할 수 있게 했다. 상기 단계에서 조골세포는 다공성 멤브레인의 외측인 콜라겐 나노섬유 위에 분주하였고 섬유아세포는 상기 다공성 멤브레인의 내측인 알긴산나트륨젤라틴 다공성 지지체 위에 분주하였다. 상기 조골세포와 섬유아세포의 세포수는 5X105 cell/well로 분주하였으며 37℃, 5% CO2 조건으로 1,3,5,7 일 배양후 배양액에 200ul의 MTT 시약(5 mg/ml) 넣고 4시간 배양하면서 환원반응을 유도하였다. 반응 후 배지를 조심스럽게 제거하고 DMSO 용액을 첨가하여 상기 단계에서 형성된 MTT formazan을 용해하였다. 각각의 well의 흡광도는 ELISA microplate reader를 이용하여 570nm 흡광도에서 측정하였다.
도 6과 같이, 본 발명 다공성 멤브레인의 외측(콜라겐나노섬유)에 분주한 조골세포와 내측(알긴산나트륨젤라틴)에 분주한 섬유아세포의 세포증식률은 세포배양 5일과 7일에 일치하는 것을 확인할 수 있는데 이는 실제 임상에서의 치아 결손 시 골조직의 성장보다 연조직의 성장이 증대되는 점에 대한 반박으로 본 발명 다공성 멤브레인은 경조직과 연조직의 재생속도를 조절할 수 있음을 알수 있다.
또한 도 7과 같이, 본 발명 다공성 멤브레인의 외측(콜라겐나노섬유)과 내측(알긴산나트륨젤라틴)에 증착한 조골세포와 섬유아세포를 주사전자현미경으로 관찰시 상기 세포가 안정적으로 증착되었음을 확인하였다.
조골세포의 골 형성 활성 확인
본 발명 다공성 멤브레인의 콜라겐 나노섬유에서의 조골세포의 골 형성 활성을 확인하기 위해서 알칼린 포스파타제(ALP) 활성 실험을 진행하였다. 상기 ALP 활성시험은 p-nitrophenyl phosphate의 가수분해 반응에 ALP가 촉매로 작용하는 원리를 이용하여 가수분해 산물인 p-nitrophenyl phosphate의 양을 측정하여 ALP의 활성도 확인하였다. 자세하게는 상기 MTT assay와 동일한 조건으로 10X105의 조골세포를 다공성 멤브레인의 외측(콜라겐나노섬유)과 내측(알긴산나트륨젤라틴)에 분주하고 3,5,7,14일 배양하였다. 세포 배양 후 배지를 제거하고 다공성 멤브레인에 있는 조골세포에 계면활성제인 0.1% Triton-X 100을 처리하여 세포용해물을 얻었다. 상기에서 얻은 세포용해물을 12,000g에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻고 이를 시료로 하여 ALP Assay kit(GENTAUR)로 분석하였다. ALP 활성은 ELISA microplate reader를 이용하여 405nm 흡광도를 측정하여 수치화하였다.
도 8과 같이, 본 발명 다공성 멤브레인의 외측(콜라겐나노섬유)과 내측(알긴산나트륨젤라틴)에서의 조골세포의 ALP 활성은 세포 배양 5일째 부터 뚜렷한 차이를 나타냈으며 14일째는 그 차이가 2배이상 나타났다. 이를 통해 조골세포는 콜라겐 나노섬유에서 골 형성 활성이 뛰어난 것을 확인하였다.
이상 설명한 바와 본 발명은 생분해성이 있는 천연고분자를 사용하여 다공성 지지체를 만들고 전기방사법을 이용하여 나노섬유층을 형성해 비표면적이 다른 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인을 제공함으로써 골유도재생술 시 경조직과 연조직의 재생속도를 일정하게 조절할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 생체소재산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (7)

  1. (a)증류수에 알긴산나트륨과 젤라틴을 용해하여 알긴산나트륨젤라틴 용액을 제조하는 단계와; (b)상기단계에서 얻은 용액에 기공 형성제인 블록 공중합체를 첨가하고 균질화 하여 다공성지지체 혼합액을 제조하는 단계와; (c)상기단계에서 얻은 혼합액을 동결건조하여 박막을 제조하는 단계와; (d)상기단계에서 얻은 박막을 염화칼슘 무수물 수용액으로 가교시키고 초음파 세척하여 비표면적 2.0 m2/g 이상의 마이크로 크기의 다공성 지지체를 제조하는 단계와; (e)제1형 아텔로 콜라겐을 헥사플루오르이소프로판올에 용해하여 콜라겐 전기방사용액을 제조하는 단계와; (f)상기 단계에서 얻은 콜라겐 전기방사용액을 상기 (d)단계에서 얻은 다공성 지지체 위에 전기방사하여 비표면적 9.0 m2/g 이상의 나노 크기의 콜라겐 나노섬유를 제조하는단계와; (g)상기단계에서 얻은 콜라겐 나노섬유를 글루탈알데하이드로 가교하고 글리이신 완충액으로 세척하는 단계를 포함하는 것이 특징인 경조직 재생용 다공성 멤브레인 제조방법
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 (a)단계의 젤라틴의 제형은 스펀지, 막, 파우더 중 어느 하나 이상인 것이 특징인 방법
  4. 제 1항에 있어서, 상기 (a)단계의 알긴산나트륨과 젤라틴의 중량비는 1:2 ~ 1:5인 것이 특징인 방법
  5. 제 1항에 있어서, 상기 (e)단계의 제 1형 아텔로 콜라겐은 물고기, 소, 돼지 중 어느 하나 이상의 것에서 추출되어 가공된 것이 특징인 방법
  6. 제 1항에 있어서, 상기 (e)단계의 콜라겐 전기방사용액은 용매 대비 7 중량%의 제1형 아텔로 콜라겐 용액인 것이 특징인 방법
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 방법으로 제조된 경조직 재생용 다공성 멤브레인






KR1020150095938A 2015-07-06 2015-07-06 비표면적이 다른 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인 및 그 제조방법 KR101684790B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150095938A KR101684790B1 (ko) 2015-07-06 2015-07-06 비표면적이 다른 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인 및 그 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150095938A KR101684790B1 (ko) 2015-07-06 2015-07-06 비표면적이 다른 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인 및 그 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101684790B1 true KR101684790B1 (ko) 2016-12-08

Family

ID=57576835

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150095938A KR101684790B1 (ko) 2015-07-06 2015-07-06 비표면적이 다른 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인 및 그 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101684790B1 (ko)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107296978A (zh) * 2017-08-04 2017-10-27 北京化工大学常州先进材料研究院 一种生物体海绵状医用止血材料
CN108042854A (zh) * 2017-12-16 2018-05-18 诺迈尔（苏州）医学科技有限公司 用于牙种植手术的明胶纤维引导组织再生膜的生产工艺
CN108956221A (zh) * 2018-04-10 2018-12-07 上海交通大学附属第人民医院松江分院 一种采用海藻酸钠进行病理制片的方法
KR101947314B1 (ko) * 2018-05-08 2019-02-12 선우윤 액체내에서 모형틀을 이용하여 완구를 제조하는 방법 및 그 방법을 구현하기 위한 장치
CN109481735A (zh) * 2018-12-28 2019-03-19 北京大学口腔医学院 一种常温可塑形的多功能可吸收膜制作方法
KR20190062067A (ko) 2017-11-28 2019-06-05 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 다공성 생체친화성 폴리머 구조체의 제조방법 및 이에 의해 제조된 다공성 생체친화성 폴리머 구조체
CN110227356A (zh) * 2019-04-29 2019-09-13 西南石油大学 一种海藻酸钙复合滤膜、及其制备方法和应用
CN111330083A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 诺一迈尔（苏州）医学科技有限公司 用于引导骨再生术的屏障膜及其制备方法
CN111407925A (zh) * 2020-04-13 2020-07-14 安徽徽科生物工程技术有限公司 仿生组织引导膜及其制备方法
KR20200112256A (ko) * 2019-03-21 2020-10-05 순천향대학교 산학협력단 전기방사 폴리카프로락톤/젤라틴/β-TCP 매트와 알지네이트/젤라틴 하이드로젤로 구성된 골 유도형 이중막 제조방법
KR102236212B1 (ko) 2019-11-13 2021-04-05 주식회사 메가젠임플란트 골조직 광열치료용 이중층 구조의 복합 멤브레인 및 그 제조방법
CN112870447A (zh) * 2021-01-08 2021-06-01 东华大学 一种骨再生多重仿生支架材料及其制备方法
CN114797485A (zh) * 2021-01-27 2022-07-29 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 一种油水分离与重金属离子吸附的气凝胶膜及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050040187A (ko) * 2003-10-28 2005-05-03 이승진 조직 재생을 유도하기 위한 생체 모방형태의 나노섬유와마이크로 섬유의 복합지지체 및 그의 제조방법
KR20050048360A (ko) * 2003-11-19 2005-05-24 재단법인서울대학교산학협력재단 나노 섬유형 부직포를 이용한 조직 재생용 차폐막 및 그의제조 방법
KR20060095687A (ko) * 2005-02-28 2006-09-01 재단법인서울대학교산학협력재단 내구성이 우수한 층상 코팅의 조직재생 유도용 차폐막의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조된 차폐막
KR20090071982A (ko) * 2007-12-28 2009-07-02 한양대학교 산학협력단 골조직유도 재생용 차폐막 및 이의 제조방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050040187A (ko) * 2003-10-28 2005-05-03 이승진 조직 재생을 유도하기 위한 생체 모방형태의 나노섬유와마이크로 섬유의 복합지지체 및 그의 제조방법
KR20050048360A (ko) * 2003-11-19 2005-05-24 재단법인서울대학교산학협력재단 나노 섬유형 부직포를 이용한 조직 재생용 차폐막 및 그의제조 방법
KR20060095687A (ko) * 2005-02-28 2006-09-01 재단법인서울대학교산학협력재단 내구성이 우수한 층상 코팅의 조직재생 유도용 차폐막의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조된 차폐막
KR20090071982A (ko) * 2007-12-28 2009-07-02 한양대학교 산학협력단 골조직유도 재생용 차폐막 및 이의 제조방법

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107296978A (zh) * 2017-08-04 2017-10-27 北京化工大学常州先进材料研究院 一种生物体海绵状医用止血材料
KR20190062067A (ko) 2017-11-28 2019-06-05 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 다공성 생체친화성 폴리머 구조체의 제조방법 및 이에 의해 제조된 다공성 생체친화성 폴리머 구조체
CN108042854A (zh) * 2017-12-16 2018-05-18 诺迈尔（苏州）医学科技有限公司 用于牙种植手术的明胶纤维引导组织再生膜的生产工艺
CN108956221A (zh) * 2018-04-10 2018-12-07 上海交通大学附属第人民医院松江分院 一种采用海藻酸钠进行病理制片的方法
KR101947314B1 (ko) * 2018-05-08 2019-02-12 선우윤 액체내에서 모형틀을 이용하여 완구를 제조하는 방법 및 그 방법을 구현하기 위한 장치
CN111330083A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 诺一迈尔（苏州）医学科技有限公司 用于引导骨再生术的屏障膜及其制备方法
CN111330083B (zh) * 2018-12-18 2022-01-11 诺一迈尔（苏州）医学科技有限公司 用于引导骨再生术的屏障膜及其制备方法
CN109481735A (zh) * 2018-12-28 2019-03-19 北京大学口腔医学院 一种常温可塑形的多功能可吸收膜制作方法
KR20200112256A (ko) * 2019-03-21 2020-10-05 순천향대학교 산학협력단 전기방사 폴리카프로락톤/젤라틴/β-TCP 매트와 알지네이트/젤라틴 하이드로젤로 구성된 골 유도형 이중막 제조방법
KR102552694B1 (ko) * 2019-03-21 2023-07-05 순천향대학교 산학협력단 폴리카프로락톤 및 젤라틴을 포함하는 골유도형 이중층 막의 제조방법
CN110227356A (zh) * 2019-04-29 2019-09-13 西南石油大学 一种海藻酸钙复合滤膜、及其制备方法和应用
KR102236212B1 (ko) 2019-11-13 2021-04-05 주식회사 메가젠임플란트 골조직 광열치료용 이중층 구조의 복합 멤브레인 및 그 제조방법
CN111407925A (zh) * 2020-04-13 2020-07-14 安徽徽科生物工程技术有限公司 仿生组织引导膜及其制备方法
CN112870447A (zh) * 2021-01-08 2021-06-01 东华大学 一种骨再生多重仿生支架材料及其制备方法
CN112870447B (zh) * 2021-01-08 2022-03-11 东华大学 一种骨再生多重仿生支架材料及其制备方法
CN114797485A (zh) * 2021-01-27 2022-07-29 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 一种油水分离与重金属离子吸附的气凝胶膜及其制备方法和应用
CN114797485B (zh) * 2021-01-27 2023-03-10 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 一种油水分离与重金属离子吸附的气凝胶膜及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101684790B1 (ko) 비표면적이 다른 이중층 구조를 가지는 경조직 재생용 다공성 멤브레인 및 그 제조방법
Wu et al. Resorbable polymer electrospun nanofibers: History, shapes and application for tissue engineering
US20220054704A1 (en) Concentrated aqueous silk fibroin solution and use thereof
Tan et al. Electrospun cellulose acetate butyrate/polyethylene glycol (CAB/PEG) composite nanofibers: A potential scaffold for tissue engineering
Hoque et al. Gelatin based scaffolds for tissue engineering-a review
JP5855151B2 (ja) 絹糸生体材料およびその使用方法
Bhattarai et al. Alginate‐based nanofibrous scaffolds: Structural, mechanical, and biological properties
Ng et al. Evaluation of ultra-thin poly (ε-caprolactone) films for tissue-engineered skin
Rossi et al. Polymeric scaffolds as stem cell carriers in bone repair
Jia et al. Preparation and immobilization of soluble eggshell membrane protein on the electrospun nanofibers to enhance cell adhesion and growth
US20060095137A1 (en) Nanofibrous nonwoven membrane of silk fibroin for guided bone tissue regeneration and manufacturing method thereof
Chen et al. A three-dimensional dual-layer nano/microfibrous structure of electrospun chitosan/poly (d, l-lactide) membrane for the improvement of cytocompatibility
Jeong et al. Electrospun gelatin/poly (L-lactide-co-ε-caprolactone) nanofibers for mechanically functional tissue-engineering scaffolds
CN109876186B (zh) 一种用于神经修复的生物医用可降解双层支架及其制备方法
CN102277737A (zh) 聚己内酯/天然高分子复合多孔支架的制备方法及应用
Khang et al. A manual for biomaterials/scaffold fabrication technology
US20150266225A1 (en) Facile Methods for Fabricating a Uniformly Patterned and Porous Nanofibrous Scaffold
Ross et al. Novel 3D porous semi-IPN hydrogel scaffolds of silk sericin and poly (N-hydroxyethyl acrylamide) for dermal reconstruction
WO2016123207A1 (en) Composite fibers and matrices thereof
KR20150082757A (ko) 골유도재생술용 폴리테트라플루오르에틸렌 나노섬유 멤브레인 및 그 제조방법
Huang et al. Carbodimide cross-linked and biodegradation-controllable small intestinal submucosa sheets
US11168412B2 (en) Facile methods for fabricating a uniformly patterned and porous nanofibrous scaffold
Balusamy et al. Design and development of electrospun nanofibers in regenerative medicine
WO2015079278A1 (en) Artificial tissue
WO2017116355A1 (en) Tissue scaffold with enhanced biocompatibility and mechanical properties and a method for producing it

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant