CN102803286A - 肽硫酯的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种将肽链以化学方式转换成肽硫酯的新颖方法。本发明人在肽链中着眼于半胱氨酸残基，结果发现：在半胱氨酸残基的硫醇基上导入-C(＝X)-R1基，然后在有机溶剂中使所得肽与具有以-NH-C(＝Y)NHR3表示的离去基团的化合物反应，在半胱氨酸残基的N末端侧肽键的羧基上附加-NH-C(＝Y)NHR3基，由此将上述肽键切断且将C末端侧的肽片段切除。更进一步，当使所得的具有此-NH-C(＝Y)NHR3基的肽链与硫醇在缓冲溶液中反应，则会发生硫醇交换反应，即，硫醇的硫醇基将键合至已键合有-NH-C(＝Y)NHR3基的羰基碳，而使上述-NH-C(＝Y)NHR3基脱离。由此即可转换成肽硫酯。
Description
技术领域
本发明涉及肽硫酯的制造方法。
背景技术
在蛋白质的合成上，已知有生物合成、化学合成、无细胞合成等各种方法。在生物合成方法中，通过利用大肠杆菌等的细胞内部，将编码所要合成的蛋白质的DNA导入细胞内部来表达而制得蛋白质。在化学合成中，将氨基酸以有机化学方式依序键合来合成目的蛋白质。无细胞合成则利用存在于大肠杆菌等各种细胞内的酶等，以无细胞方式来合成蛋白质。此等方法可依据蛋白质的使用目的、尺寸、或所附加之性质等来适当地分开使用或组合。
为了合成在氨基酸序列的中间部分均匀地具有糖链或脂质等特定修饰的蛋白质，目前已采用使用预先以糖链或脂质等修饰的氨基酸，对其周边的肽链进行化学合成的方法。
作为对肽链进行化学合成的方法主要是采用固相合成法。然而，由固相合成法所得之肽链一般为短链，最长也只是50个残基左右而已。
因此，为了合成具有修饰物的长肽链，主要是采用分别制备短肽链后再将它们连接的方法。作为肽链连接方法虽报导有各种方法，但广泛采用的方法之一为自然化学连接法(Native Chemical Ligation，NCL法)。已知的是，即使是无保护的这些肽链，彼此也可进行NCL法，且NCL法已知为用于在连接部位(ligation部位)生成天然酰胺键(肽键)的有用方法(例如专利文献1)。NCL法为在C末端上具有α羧基硫酯部分的第1肽与在N末端上具有半胱氨酸残基的第2肽之间的化学选择反应，半胱氨酸之侧链的硫醇基(SH基，亦称为硫氢基)与硫酯基的羰基碳有选择地进行反应，再经由硫醇交换反应即生成硫酯键初期中间体。此中间体自发性地进行分子内重排(intramolecular rearragement)而在连接部位上提供天然酰胺键合，另一方面使半胱氨酸侧链硫醇再次产生。
此方法为能够仅通过使无保护之肽在缓冲溶液中混合而经由肽键将两个肽链连接的方法。NCL法中，即使当例如肽等具有许多官能基之化合物彼此间发生反应，亦可有选择地将其中一者的肽C末端与另一者的肽N末端连接。由此观点而言，为了对蛋白质进行化学合成，重要的是如何来利用NCL法。
然而，利用NCL法的问题包括：制备C末端上具有α羧基硫酯部分的肽硫酯来作为所需原料。肽硫酯的制备法虽报导有各种方法，但一般可分成基于固相合成法的两种类型。
第一种为在树脂上建构肽硫酯的方法。此方法中，可将肽链从建构此肽后之树脂切断而制得肽硫酯(例如Boc固相合成法、Fmoc固相合成法)。第二种为经由与硫酯等同的连接物(linker)将肽链建构于固相上的方法(Safety Catch linker、Fujii法、Dawson法、Mercapto propanol法、Kawakami法、Danishefsky法、Hojo法、Aimoto法等)。该方法中，将由连接物进行适当处理所建构的肽链C末端活性化后，对肽链进行硫解(thiolysis)而制得硫酯(非专利文献1)。
在这些之外，还报导有在合成由固相合成对侧链进行保护，且仅C末端之羧基为游离的保护肽之后，再以适当的缩合条件进行硫酯化之方法(例如专利文献2)。以上任何方法皆为已确立之方法，并且在过去的各种蛋白质合成中被采用。然而，由于任一种方法皆受限于固相合成法的限制，因此能够合成出来的肽硫酯的尺寸便会受到限制。再者，在使用连接物的方法中，必须对非天然氨基酸衍生物或特别的衍生物进行单独的化学合成，因而其步骤未必称得上是简便。
在解决采用固相合成法之硫酯化的限制的方法上已有内含肽法(Intein法)(非专利文献2)。此为可制得由细胞进行生物合成之多肽片段作为硫酯的方法。在Intein法中，通过利用在特定蛋白质序列中所产生之蛋白质剪接(splicing)功能进行肽链的硫酯化，从而制得多肽链作为硫酯。此方法的有用之处在于可制得长链的肽硫酯。通过将此方法与化学合成法组合，可合成即使是到目前为止被认为是难以合成的大型被修饰蛋白质(非专利文献3)。表达并获得多肽链的方法已有大量研究，充分被确立为生物学上的基本技术。
然而，在采用Intein法时，不仅要表达多肽，还要使蛋白质剪接发挥功能，这就需要有作为标的之肽序列，且所表达之内含肽复合蛋白质必须发生折叠而呈现固有的三维结构。因此，依赖于所要表达的多肽序列，未必能制得肽硫酯，通常会伴随着充分条件的优化，作业上的麻烦便会跟随而至。
另一方面，作为肽的切断方法，已知有使化合物与肽中之半胱氨酸残基的SH基反应，借此在上述半胱氨酸残基的位置处切断肽链的方法(非专利文献4、5)、或使用连接物切断与固相键合的肽的方法(非专利文献6、7)。此外，已知有使用溴化氰(CNBr)切断甲硫氨酸(methionine)残基的C末端之一侧的肽键的方法。然而，这些方法并非为制得作为硫酯的肽片段的方法。
相关技术文献
[专利文献1]国际公开WO96/34878
[专利文献2]国际公开WO2007/114454
[非专利文献]
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[非专利文献7]Pascal et al.，Tetrahedron Letters，1994，Vol.35，No.34，6291-6294
发明内容
本发明所要解决的问题
在如上述背景技术所示的肽硫酯化法中，可进行硫酯化之肽仅限于固相合成的肽链或作为蛋白质剪接的标的之肽链。此为任何这些方法皆需要有非天然氨基酸衍生物、连接物、特定三维结构等之故。
因此，本发明的一个目的在于提供一种将多肽链以化学方式转换成肽硫酯的新颖方法。
用以解决问题的方式
本发明人考虑到须有将肽序列中的天然氨基酸残基作为目标，有选择地使肽C末端活性化的方法。只要为此种方法，即使是以生物合成等任何方法所得之肽，亦可有选择地使肽链活性化而进行硫酯化。
因此，本发明人着眼于天然氨基酸中作为特殊含硫氨基酸的半胱氨酸残基。尔后发现：如下图所示在半胱氨酸残基的硫醇基上导入-C(＝X)-R1基，在有机溶剂中使具有以-NH-C(＝Y)NHR3表示之离去基团的化合物与之反应，以在半胱氨酸残基之N末端侧的肽键的羧基上附加-NH-C(＝Y)NHR3基，由此将上述肽键切断且C末端之一侧的肽片段被切除。更进一步发现通过下述与硫醇的交换反应即可将所得肽链转换成肽硫酯：使硫醇化合物与附加有此-NH-C(＝Y)NHR3基的肽链在缓冲溶液中反应，由此使上述硫醇的硫醇基与已键合有-NH-C(＝Y)NHR3基的羰基碳键合，上述-NH-C(＝Y)NHR3基则脱离。
作为上述一例，具体而言，首先在半胱氨酸残基的硫醇基上导入硫代甲酸酯(thionoformate)基。然后，在有机溶剂中使此硫代甲酸酯基与N-乙酰胍(N-acetyl guanidine)反应，以在半胱氨酸残基的N末端侧发生肽链的切断，即制得C末端附加有N-乙酰胍基的肽链。再者，使此附加有N-乙酰胍基之肽链在缓冲溶液中与硫醇R4-SH反应，即转换为肽硫酯。
又发现由上述所得之对C末端进行N-乙酰胍化反应之肽链及肽硫酯可利用于NCL法中。
即，本发明具体而言提供以下〔1〕～〔14〕。
〔1〕肽硫酯的制造方法，包括以下步骤(a)～(c)：
(a)步骤：在具有半胱氨酸残基的肽链中，使由以下式(I)表示的化合物A与上述半胱氨酸残基的硫醇基反应而使R2脱离，以制造第1中间体：
[式中，X为硫原子或氧原子，R1及R2为离去基团]；
(b)步骤：在有机溶剂中，使由以下式(II)表示的化合物B与上述第1中间体反应，以在半胱氨酸残基与邻接于所述半胱氨酸残基之N末端侧的氨基酸之间形成肽键的羧基上附加-NH-C(＝Y)NHR3基，并切断上述肽键，从而制得作为第2中间体的比被切断的上述肽键更靠近N末端侧的肽片段：
[式中，Y为氧原子、硫原子或NH基，R3为氢原子、酰基或烷氧羰基]；以及
(c)步骤：使硫醇与上述第2中间体反应，以使C末端的-NH-C(＝Y)NHR3基与硫醇基进行交换，从而对第2中间体的C末端进行硫酯化。
〔2〕如上述〔1〕所述的方法，其中，X为硫原子。
〔3〕如上述〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，R1为-O-C6芳基。
〔4〕如上述〔1〕至〔3〕中任一项所述的方法，其中，R2为卤素原子、取代或未取代之-S-C6-10芳基。
〔5〕如上述〔1〕至〔4〕中任一项所述的方法，其中，Y为NH基。
〔6〕如上述〔1〕至〔5〕中任一项所述的方法，其中，R3为乙酰基。
〔7〕如上述〔1〕至〔6〕中任一项所述的方法，其中，在上述步骤(C)中，上述硫醇为由以下式(III)表示之硫醇：
R4-SH (式III)
[式中，R4为选自取代或未取代之苯甲基、取代或未取代之芳基、及取代或未取代之烷基中的任一种基团]。
〔8〕如上述〔1〕至〔7〕中任一项所述的方法，其中，肽链为重组蛋白质。
〔9〕如上述〔1〕至〔8〕中任一项所述的方法，其中，肽链为含有精制用标记物之重组蛋白质。
〔10〕一种多肽的制造方法，包括将由上述〔1〕至〔9〕中任一项所述的方法而得到的肽硫酯与N末端上具有半胱氨酸的肽链通过连接法结合的步骤。
〔11〕第2中间体的制造方法，所述第2中间体用于上述〔1〕至〔9〕中任一项所述的肽硫酯的制造方法，第2中间体的制造方法包括以下步骤(a)或(b)：
(a)步骤：在具有半胱氨酸残基的肽链中，使由以下式(I)表示的化合物A与上述半胱氨酸残基的硫醇基反应而使R2脱离，以制造第1中间体：
[式中，X为硫原子或氧原子，R1及R2为离去基团]；
(b)步骤：在有机溶剂中，使由以下式(II)表示的化合物B与上述第1中间体反应，以在半胱氨酸残基与邻接于所述半胱氨酸残基之N末端侧的氨基酸之间形成肽键的羧基上附加-NH-C(＝Y)NHR3基，并切断上述肽键，从而制得作为第2中间体的比被切断的上述肽键更靠近N末端侧的肽片段：
[式中，Y为氧原子、硫原子或NH基，R3为氢原子、酰基或烷氧羰基]。
〔12〕肽链，该肽链在C末端上具有-NH-C(＝Y)NHR3基，
[式中，Y为氧原子或NH基，R3为氢原子、酰基或烷氧羰基]。
〔13〕多肽的制造方法，包括将上述〔12〕所述的C末端上具有-NH-C(＝Y)NHR3基的肽链与N末端上具有半胱氨酸的肽链通过连接法结合的步骤。
〔14〕除去附加于重组蛋白质的C末端侧的精制用标记物的方法，包括以下步骤(a)～(c)：
(a)步骤：在C末端上含有精制用标记物的重组蛋白质中，使由以下式(I)表示的化合物A与半胱氨酸残基的硫醇基反应而使R2脱离，以制造第1中间体：
式中，X为硫原子或氧原子，R1及R2为离去基团；
(b)步骤：在有机溶剂中，使由以下式(II)表示的化合物B与上述第1中间体反应，以在半胱氨酸残基与邻接于所述半胱氨酸残基之N末端侧的氨基酸之间形成肽键的羧基上附加-NH-C(＝Y)NHR3基，并切断上述肽键，从而制得作为第2中间体的比被切断的上述肽键更靠近N末端侧的肽片段：
[式中，Y为氧原子、硫原子或NH基，R3为氢原子、酰基或烷氧羰基]；以及
(c)步骤：使硫醇与上述第2中间体反应，以使C末端的-NH-C(＝Y)NHR3基与硫醇基进行交换，从而对第2中间体的C末端进行硫酯化。
[发明效果]
根据本发明，提供了一种将多肽链以化学方式转换成肽硫酯的新颖方法。
就本发明的方法而言，即使不具有在传统硫酯化法中必需之非天然氨基酸衍生物、连接物或特定三维结构等的肽链亦可进行硫酯化。因此，即使为经由生物合成等所得之长链多肽片段，亦可简易地进行硫酯化。
再者，通过将本发明之方法与传统肽合成法并用，即便是到目前为止难以合成的在肽一部分上具有修饰的长链肽，例如对不具有修饰之部分采用易于合成较长链之生物合成(生合成)法来制造片段，对具修饰之部分采用固相合成法来制造片段，再将这些片段连接，借此即可简便地制造。
更具体而言，只要为糖链之修饰，通过仅对包含附加有天然结合型糖链之氨基酸的片段进行化学合成，对其他部分经由生物合成来制备，再以本发明方法进行硫酯化并予以连接，即可简便地制造更为长链之糖链肽。
经由连接物将糖链等后续附加于肽链的方法是已知的，其即使在生物合成之长链肽上亦可进行糖链之后续附加。然而，此经由连接物之糖链结合方法是利用特定的氨基酸或其结构来结合糖链等。因此，例如当糖链于肽中存在多个可结合的部位时，亦可通过在经由生物合成制得长链肽后，从该长链肽切割出仅含所需结合部位的肽片段并附加糖链，使用本发明的硫酯化方法对该糖链附加肽片段进行硫酯化，再与其余部分重新连接，其较以往更为简便且可部位特异性地附加糖链。
再者，在生物合成中即使全长蛋白质正常地表达，其肽片段在细胞中仍会有错误处(miss)，亦可能被分解等而未正常地表达。也可对全长蛋白质进行生物合成后，切割出仅欲修饰之部分的片段进行必要的修饰等处理，并且可使用本发明方法对被修饰肽片段进行硫酯化，再与其余部分重新连接，以制得所要求之被修饰蛋白质。
如以上所述，本发明的肽硫酯化方法可通用于蛋白质的整体合成。
具体实施方式
以下就本发明的优选实施方式进行说明。
本发明提供一种新颖的肽硫酯制造方法，包括以下步骤(a)～(c)：
(a)步骤：在具有半胱氨酸残基的肽链中，使由以下式(I)表示的化合物A与上述半胱氨酸残基的硫醇基反应而使R2脱离，以制造第1中间体：
[式中，X为硫原子或氧原子，R1及R2为离去基团。]；
(b)步骤：在有机溶剂中，使由以下式(II)表示的化合物B与上述第1中间体反应，以在半胱氨酸残基与邻接于所述半胱氨酸残基之N末端侧的氨基酸之间形成肽键的羧基上附加-NH-C(＝Y)NHR3基，并切断上述肽键，从而制得作为第2中间体的比被切断的上述肽键更靠近N末端侧的肽片段：
[式中，Y为氧原子、硫原子或NH基，R3为氢原子、酰基或烷氧羰基。]；以及
(C)步骤：使硫醇与上述第2中间体反应，以使C末端的-NH-C(＝Y)NHR3基与硫醇基进行交换，从而对第2中间体的C末端进行硫酯化。
本发明中所谓“肽”并无特殊限定，只要是2个以上的氨基酸经由酰胺键结合即可，并包括公知的肽与新颖的肽、以及肽变体(peptide variant)。在本发明中，统称为“蛋白质”的物质也包括在肽中。而且，本发明中，“多肽”同样地包括于肽中。用于本发明方法的肽链既可为天然蛋白质，也可为经由生物合成、化学合成或无细胞合成等方法所得的肽链。
本发明中“肽变体”是包括肽的自然变异体、转译后修饰肽或以人工修饰(artificially modified)的化合物。作为此种修饰可例举如肽的一个或多个氨基酸残基被烷基化(alkylation)、酰基化(例如乙酰化)、酰胺化(例如肽C末端被酰胺化)、羧基化(carboxylation)、酯形成、双硫键形成、糖基化(glycosylation)、脂质化、磷酸化、氢氧化、标记成分之结合等。
本发明中“氨基酸”是以其最宽泛意义来使用，不仅包括天然氨基酸例如丝氨酸(Ser)、天门冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)，亦包括氨基酸变体及衍生物之类的非天然氨基酸。本领域技术人员在考虑该宽泛定义时可理解为：作为本说明书中的氨基酸，可例举如L-氨基酸、D-氨基酸、氨基酸变体及衍生物等经化学修饰之氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等在生物体内不作为蛋白质之构成材料的氨基酸；及具有本领域技术人员已知的氨基酸特性且以化学方式合成的化合物等。
本发明中经硫酯化之肽链，只要是含有半胱氨酸残基的肽链并无特殊限定，并未限定于例如肽链之来源或合成方法、尺寸等。而且，肽链还可具有修饰或保护基。
本发明中使用之肽链所含的半胱氨酸残基数并无特殊限定，只要能够以半胱氨酸残基作为目标来切断肽链即可。因此，虽有必要依据具有半胱氨酸残基的部位对最终所合成的蛋白质的基本骨架进行设计，但只要是本领域技术人员即可轻易地完成此种设计。此外，还可在含有多个半胱氨酸残基的肽链中，预先对除所需半胱氨酸残基以外的半胱氨酸残基以保护基等予以保护，以便仅于所需半胱氨酸残基的位置处进行硫酯化，以免使其余半胱氨酸残基受到反应的影响。作为此种保护基的例子可例举Acm基等。
此外，本发明中所使用之肽链亦可于N末端侧具有脂溶性的保护基。作为优选保护基可例举乙酰(Ac)基等酰基、叔丁氧羰(Boc)基、9-芴甲氧羰(Fmoc)基、芳氧羰(Alloc)基等含有羰基之基团、芳基、苯甲基等，但并非限定于此。
用于本发明方法的肽链可为天然蛋白质，亦可为经由生物合成、化学合成或无细胞合成等方法所得之肽链，但优选为在菌体或细胞内表达之重组蛋白质。重组蛋白质只要以人工方式在菌体内或细胞内表达，则既可含有与天然蛋白质相同之肽序列，也可含有具有突变或精制用标记物等修饰之肽序列。
本发明中所采用之重组蛋白质可由本领域技术人员已知的方法来制备。例如可在重组载体(vector)上导入靶基因而表达。作为本发明中所采用的重组载体，只要是能够对宿主细胞进行转化者即可，可依据宿主细胞使用大肠杆菌用质粒、枯草杆菌(Bacillus subtilis)用质粒、酵母用质粒、反转录病毒(retrovirus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、杆状病毒(baculovirus)等动物病毒载体等。优选其具有可于其宿主细胞中适当表达蛋白质的启动子(promoter)等的调控序列。而且，作为宿主细胞只要是能够在重组载体表达外来基因的物质即可，一般而言可使用大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。
作为将重组载体转染至宿主细胞内的方法，可使用一般常用的方法，例如大肠杆菌的情况可利用氯化钙法或电穿孔(electroporation)法、酵母的情况可利用氯化锂法或电穿孔法。动物细胞的转化可采用电穿孔等物理方法、核糖体法或磷酸钙法等化学方法、或反转录病毒等病毒载体来进行。作为转化体(transformant)之宿主细胞的培养型态可考虑宿主的营养生理学上的性质来选择培养条件。
本发明中所使用之肽优选经过精制，肽的精制可依普通精制方法来进行。例如为重组蛋白质时，则对表达本发明中所使用之重组蛋白质的菌体或细胞进行培养后，以已知方法收集菌体或细胞，使其悬浮于适当的缓冲液中，再通过超音波、溶菌酶(lysozyme)和/或冷冻融解等破坏菌体或细胞后，以离心分离或过滤制备肽的粗萃取液。在缓冲液中亦可含有尿素或盐酸胍等蛋白质变性剂或Triton X-100TM等表面活性剂。由此所得之萃取液或培养上清液中包含的肽的精制可由已知精制方法来进行。例如能够通过适当选择、组合亲和色谱法、离子交换色谱法、过滤、超过滤、凝胶过滤(gel filtration)、电泳、盐析、透析等来进行肽的分离、精制。
此外，为使重组蛋白质的精制简单化，亦可预先在表达载体中掺入精制用标记物。作为精制用标记物的例子，可例举如His标记物、GST标记物、Myc标记物、FLAG标记物、麦芽糖结合蛋白(MBP)等。本发明中由于针对比配置于肽链内的Cys更靠近N末端一侧进行硫酯化，并在肽的C末端一侧附加精制用标记物，在精制后对肽进行硫酯化，由此将比肽链中的Cys更靠近C末端一侧(连带标记物)切除，可高效率地制得肽硫酯。因可通过将Cys的位置配置于肽链上所需位置，故本发明方法可用于除去C末端侧的标记物。
因此，通过采用本发明的用于制造肽硫酯的方法，除去附加于重组蛋白质之C末端的精制用标记物的方法，也进一步包括于本发明中。
本发明中，所谓“肽硫酯”(以下有时亦仅记载为“硫酯”)是指在C末端具有羧基硫酯部分(-C＝O-SR)的肽。本发明中所使用之肽硫酯，只要是能够发生与其他硫醇基的交换反应的硫酯，并无特殊限定。R基可例举如下述R4所例示的基团。
本发明的方法中，首先进行(a)在具有半胱氨酸残基的肽链中，通过使化合物A与上述半胱氨酸残基的硫醇基反应而制造第1中间体的步骤。
本发明中化合物A由以下式(I)表示。
式中，X为硫原子或氧原子，但优选为硫原子。
R1及R2则作为离去基团，只要在下述步骤(a)的反应条件下相较于被取代之原子或原子团，其亲核性较低且具有离去功能者，并无特殊限定，但优选R1及R2为各自相异的离去基团。作为R1及R2，具体而言可例举卤素原子、取代或未取代之-O-烷基、取代或未取代之-O-烯基、取代或未取代之-O-炔基、取代或未取代之-O-芳基、取代或未取代之-O-杂芳基(heteroaryl groups)、取代或未取代之-S-烷基、取代或未取代之-S-烯基、取代或未取代之-S-炔基、取代或未取代之-S-芳基、或取代或未取代之-S-杂芳基。更优选的是，作为R1及R2，可例举下述组合：R1是选自由取代或未取代之-O-C6-10芳基、及取代或未取代之-S-C1-8烷基构成之组中的离去基团，及R2是选自由卤素原子、取代或未取代之-S-C1-8烷基、取代或未取代之-S-C6-10芳基构成之组中的离去基团。
本发明中“烷基”是指自脂肪族碳氢化合物(烃)除去任意一个氢原子所衍生之单价基团，并具有含氢及碳原子之烃基(hydrocarbyl)或碳氢化合物的部分集合。烷基包括直链状或支链状的结构。作为本发明的烷基，可优选例举碳原子数为1至8的烷基。再者，“C1-8烷基”是表示碳原子数为1至8的烷基，具体例可例举甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基等。
本发明中“烯基”是指具有至少一个双键的单价基团。根据双键及取代基的构型，双键于几何学上的形态可呈现异侧(Entgegen，E)或同侧(Zusammen，Z)、顺式(cis)或反式(trans)的构型。烯基包括直链状或支链状。作为本发明的烯基，可优选例举碳原子数为2至8的烯基。“C2-8烯基”是表示碳原子数为2至8的烯基，具体例可例举乙烯基、烯丙基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基等。
本发明中“炔基”是指具有至少一个三键的单价基团。炔基包括直链状或支链状的炔基。作为本发明的炔基，可优选例举碳原子数为2至8的炔基。“C2-8炔基”表示碳原子数为2至8的炔基，具体例可例举乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基等。
本发明中“芳基”是指芳香烃环基。作为本发明的芳基，可优选例举碳原子数为6至10的芳基。“C6-10芳基”表示碳原子数为6至10的芳基，具体而言可例举如苯基、1-萘基、2-萘基等。
本发明中“杂芳基”是指自杂芳环除去一或两个任意位置之氢原子所衍生的单价或二价基团。本发明中“杂芳环”是指在构成环的原子中含有一或多个杂原子的芳香环，优选为5-9元环。环既可为单环，亦可为与苯环或单环杂芳环稠合的双环式杂芳基。具体例可例举呋喃基、苯硫基、吡咯基、苯并呋喃基、噻吩联二苯基(benzothiophenyl)、吲哚基、吡啶基、喹啉基等。
上述离去基团所具有之取代基的种类、个数、取代位置并无特殊限定，但作为取代基可例举如烷基、烯基、烷氧基、芳基、甲酰基、羰基、羧基、烷羧基、烷氧羰基、卤素、磺酸基、或硝基等。
作为本发明的化合物A，更具体而言可举出
此外，亦可采用使MPAA((4-羧甲基)苯硫酚)与上述的
反应而产生的下述硫代甲酸酯化试剂：
如下图所示，通过使本发明的化合物A与肽中的半胱氨酸残基反应，即可制得在半胱氨酸残基中的SH基上键合有-C(＝X)-R1基的第1中间体。
本发明中步骤(a)优选在酸性条件下，特别优选在pH3～5下进行。反应优选在缓冲液与乙腈的混合溶剂中、0～50℃、最好为15～25℃下进行约0.1～3小时、最好为10分钟～1小时，但不限定于此。
然后，在本发明的方法中实施(b)步骤：在有机溶剂中，通过使化合物B与上述第1中间体反应，以在半胱氨酸残基与邻接于所述半胱氨酸残基之N末端侧的氨基酸之间形成肽键的羧基上附加-NH-C(＝Y)NHR3基，并切断上述肽键，从而制得作为第2中间体的比被切断的上述肽键更靠近N末端一侧的肽片段。
本发明中，化合物B由以下式(II)表示。
式中，Y为氧原子、NH基、或硫原子，R3为氢原子、酰基或烷氧羰基。
本发明中“酰基”是指自羧酸的羧基除去OH基而获得的原子团。作为本发明的酰基，优选可例举碳原子数为1-4的酰基。具体而言可例举如乙酰基、丙酰基、丁酰基等。
本发明中“烷氧基”是指键合有“烷基”的氧基(oxy)。本发明的烷氧基可为直链状亦可为支链状。作为本发明的烷氧基，优选可例举碳原子数为1至14的直链状烷氧基或碳原子数为3至14个的支链状烷氧基。具体而可例举如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、2-甲基-2-丙氧基、正戊氧基、正己氧基等。
此外，“C2-n烷氧羰基”是指具有C1-(n-1)烷氧基的羰基。作为本发明的烷氧羰基，优选可例举碳原子数为2至15的烷氧羰基。具体而言可例举如甲氧羰基、乙氧羰基、正丙氧羰基、异丙氧羰基、正丁氧羰基、2-甲基-2-丙氧羰基、正戊氧羰基、正己氧羰基等。
作为酰基，优选可例举乙酰基。作为烷氧羰基优选可例举叔丁氧羰基(Boc基)。
作为本发明之化合物B，更具体而言可例举：
本发明中步骤(b)优选在有机溶剂的存在下进行。有机溶剂优选为溶解性高且亲核性低的物质。作为此种有机溶剂，可例举如二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二噁烷(dioxane)等。反应优选在0～50℃、最好为15～25℃下进行约1～24小时、最好为5～10小时，但不限定于此。
如下图所示，通过在半胱氨酸残基与邻接于所述半胱氨酸残基之N末端侧的氨基酸之间形成肽键的羧基上附加-NH-C(＝Y)NHR3基，在半胱氨酸残基之N末端侧的肽链即被切断。
此外，当肽的侧链上具有氨基时，在进行本发明之步骤(b)前亦可在侧链的氨基上导入脂溶性保护基。作为脂溶性保护基可例举如9-芴甲氧羰(Fmoc)基、叔丁氧羰(Boc)基、芳氧羰(Alloc)基等含有羰基的基团、乙酰(Ac)基等酰基、芳基、苯甲基等保护基，但并未特别限定于此。
在导入脂溶性保护基方面，例如在导入Fmoc基时可通过添加9-芴甲基-N-琥珀酰亚氨基碳酸酯(9-fluorenylmethyl-N-succinimidyl carbonate)与碳酸氢钠进行反应而导入。反应可于0～50℃、优选为室温下进行约1～5小时左右，但不限定于此。
步骤(b)中可制得比被切断的肽链的切断部位更靠近N末端侧的肽片段作为下述式(1)的第2中间体。
本发明的肽硫酯制造方法进一步包括：(c)使硫醇与上述第2中间体反应，以使C末端的-NH-C(＝Y)NHR3基与硫醇基进行交换，从而对第2中间体的C末端进行硫酯化的步骤。
在步骤(b)后，用于步骤(c)的第2中间体可经分离也可不经分离。
就优选的实施方案而言，在上述步骤(c)中使用由以下式(III)表示的硫醇。
R4-SH (式III)
R4只要不阻碍硫醇交换反应，且为在羰基碳上的取代反应中作为离去基团的基团，并无特殊限定。R4优选为从取代或未取代之苯甲基、取代或未取代之芳基及取代或未取代之烷基中选择的任何一种基团，更优选为从取代或未取代之苯甲基、取代或未取代之C6-10芳基及取代及未取代之C1-8烷基中选择的任何一种基团。更具体而言，可从苯甲硫醇(benzylmercaptan)等苯甲基型的离去基团、苯硫酚、4-(羧甲基)-苯硫酚等芳基型的离去基团、2-巯基乙磺酸基、3-巯基丙酰胺等烷基型的离去基团等中选择。这些离去基团所具有的取代基的种类、个数、取代位置并无特殊限定。
通过步骤(c)的进行，第2中间体即如下图所示完全地转换成硫酯。
可将如上所示制得的肽硫酯、与肽或被修饰肽中在N末端上包含具有-SH基之氨基酸残基的肽(或被修饰肽)使用连接法来予以连接。因此，本发明还提供了一种包括将经由本发明的方法所得的肽硫酯、与在N末端上具有半胱氨酸的肽链通过连接法来结合的步骤的多肽制造方法。
此外，亦可将以上述步骤(b)所得的第2中间体取代上述肽硫酯而使用于连接法中。
本发明中所谓“连接法”不仅包括专利文献1中所述之自然化学连接法(Native Chemical Ligation，NCL法)，亦包括对含有非天然氨基酸、氨基酸衍生物(例如苏氨酸衍生物A、保护甲硫氨酸、附加糖链的氨基酸等)的肽应用上述自然化学连接法的情形。经由连接法，可制造在连接部位上具有天然酰胺键(肽键)的肽。
采用连接法的连接可在肽与肽之间、肽与被修饰肽之间、被修饰肽与被修饰肽之间的任一种情形下进行。
此外，本说明书中所使用的术语是为了说明特定实施方案而用，并非意图限定本发明。
而且，本说明书中所使用的术语“包含(包括)”，除与上下文中意义明显相异的情形之外，是指具有所记述的存在事项(部件、步骤、要素、数字等)，且除具有所记述的存在事项外，并不排除具有除所记述的存在事项之外的其他可能存在事项(部材、步骤、要素、数字等)。
除非另有说明，此处所使用的所有术语(含技术术语及科学术语)的意思与从事本发明所属技术领域的技术人员所广泛理解的意思相同。此处所使用的术语，只要没有明示相异定义，否则应作为具有与本说明书及相关技术领域中的意义之整合的意义来解释，不应就理想化或过度形式化的意义来解释。
本发明的实施方案虽有参照示意图的同时进行说明的情形，但以示意图进行说明时，为了明确说明亦有夸张表现的情形。
“第一”、“第二”等术语是为了表现各种要素而使用，但可理解该等要素不应受到此类术语的限定。该类术语是仅为了将一个要素与其他要素区分而使用，例如，在不背离本发明的范围的情况下，可将第一要素记为“第二要素”，同样将“第二要素”记为“第一要素”。
以下，参照实施例更详细说明本发明。然而，本发明可依各种方案而具体化，不应解释成局限于此处记载的实施例。
实施例
实施例1.硫代甲酸酯基的导入
(MPAA硫代甲酸苯酯的合成)
将MPAA((4-羧甲基)苯硫酚)(98mg，0.583mmol)、硫代氯甲酸苯酯(Phenyl chloro thionoformate)(103μL，0.76mmol)溶于二氯甲烷(400μL)中，在室温下搅拌1小时。1小时后，在室温下将反应溶液以2.0mL氯仿稀释，添加1.0mL饱和碳酸氢钠水溶液，并将此混合物以氯仿萃取、洗净。将氯仿层以饱和食盐水洗净，以硫酸镁干燥后进行减压浓缩即制得黄色透明的糖浆状残留物。将此用作后续的硫代甲酸酯化试剂(MPAA硫代甲酸苯酯)(MW：305.3，无MS数据)。
(采用MPAA硫代甲酸苯酯试剂之硫代甲酸酯基的导入)
将肽(Ac-Val Tyr Ala Xaa Cys Gly-OH(序列识别号：1)，Xaa＝Lys(序列识别号：2)，Ser(序列识别号：3)，Asp(序列识别号：4)，Ala(序列识别号：5)，Val(序列识别号：6)，粗制(Lys，Ser，Asp，Ala，Val之混合物)，6mg)溶于pH5.5之缓冲溶液(1.0mL，0.2M Na2HPO4，6M Gn-HCl)后，添加溶于乙腈(230μL)的MPAA硫代甲酸苯酯(15μL)全部量。1小时后以Et2O将反应溶液洗净，使用HPLC进行精制即制得目标化合物。此反应以HPLC结果定量。
(Xaa＝Lys，ESIMS计算值[M+H]+ 818.3，实际值[M+H]+ 818.4).
(Xaa＝Ser，ESIMS计算值[M+H]+ 777.3，实际值[M+H]+ 777.3).
(Xaa＝Asp，ESIMS计算值[M+H]+ 805.3，实际值[M+H]+ 805.3).
(Xaa＝Ala，ESIMS计算值[M+H]+ 761.3，实际值[M+H]+ 761.3).
(Xaa＝Val，ESIMS计算值[M+H]+ 789.3，实际值[M+H]+ ---).
将肽(Ac-Val Tyr Ala Xaa Cys Gly-OH(序列识别号：1)，Xaa＝Ser(序列识别号：3)，Phe(序列识别号：8)，Leu(序列识别号：7)，粗制(Ser，Phe，Leu之混合物)，10mg)溶于pH5.0之缓冲溶液(2.0mL，0.2MNa2HPO4，6M Gn-HCl)，添加溶于乙腈(700μL)的MPAA硫代甲酸苯酯(5μL)。1.5小时后以Et2O将反应溶液洗净，使用HPLC进行精制即制得目标化合物。此反应以HPLC结果定量。
(Xaa＝Ser，ESIMS计算值[M+H]+777.3，实际值[M+H]+ 777.3).
(Xaa＝Leu，ESIMS计算值[M+H]+803.4，实际值[M+H]+ 803.3).
(Xaa＝Phe，ESIMS计算值[M+H]+837.4，实际值[M+H]+ 837.3).
邻接于半胱氨酸之N末端侧的氨基酸不论为何种类型，皆可在半胱氨酸之-SH基上导入硫代甲酸酯基。
实施例2.N-乙酰胍基化(N-acetyl guanidylation)反应
(以Xaa＝Ala，Leu，Phe，Ser，Lys来实施)
(Xaa＝Ala的情形)
将Ac-Val Tyr Ala Ala Cys(C(S)OPh)Gly-OH(序列识别号：9)(0.2mg，0.28μmol)溶于250mM的N-乙酰胍/DMSO溶液(260μL)。2小时后以Et2O将化合物沉淀、洗净。使用HPLC对标的物进行精制即制得作为目标的N-乙酰胍化物(N-acetylguanidido)(Ac-Val Tyr Ala Ala-NHC(NH)NHAc(序列识别号：10))(产率：80％，计算自HPLC面积强度)。
(ESIMS计算值[M+H]+ 548.3，实际值[M+H]+ 548.4)
(Xaa＝Ler或Phe的情形)
将Ac-Val Tyr Ala Leu Cys(C(S)OPh)Gly-OH(序列识别号：11)(0.1mg，0.12μmol)、Ac-Val Tyr Ala Phe Cys(C(S)OPh)Gly-OH(序列识别号：12)(0.1mg，0.12μmol)的混合物溶于250mM N-乙酰胍/DMSO溶液(100μL)。4.5小时后以Et2O将化合物沉淀、洗净。使用HPLC对标的物进行精制，即制得作为目标的N-乙酰胍化物(Ac-Val Tyr Ala Leu-NHC(NH)NHAc(序列识别号：13)、及Ac-Val Tyr Ala Phe-NHC(NH)NHAc(序列识别号：14))(产率：80％，计算自HPLC面积强度)。
(Xaa＝Leu，ESIMS计算值[M+H]+590.3，实际值[M+H]+590.3).
(Xaa＝Phe，ESIMS计算值[M+H]+624.3，实际值[M+H]+624.3).
(Xaa＝Ser的情形)
将Ac-Val Tyr Ala Ser Cys(C(S)OPH)Gly-OH(序列识别号：15)(0.2mg，0.26μmol)溶于250mM N-乙酰胍/DMSO溶液(100μL)。3.5小时后以Et2O将化合物沉淀、洗净。使用HPLC对标的物进行精制，即制得作为目标的N-乙酰胍化物(Ac-Val Tyr Ala Ser-NHC(NH)NHAc(序列识别号：16))(产率：70％，来自HPLC面积强度)。
(Xaa＝Lys的情形)
将肽(Ac-Val Tyr Ala Lys Cys(C(S)OPH)Gly-OH(序列识别号：17)，0.1mg)溶于含有Boc2O(0.3mg)、三乙胺(0.14μL)的DMSO(30μL)。1.5小时后将反应溶液以Et2O沉淀、洗净。将所得之残留物溶于250mM N-乙酰胍/DMSO溶液(100μL)。2.5小时后，使用HPLC对标的物进行精制，即制得作为目标的N-乙酰胍化物(Ac-Val Tyr Ala Lys(Boc)-NHC(NH)NHAc(序列识别号：18))(产率：70％，计算自HPLC面积强度)。
已确认，邻接于半胱氨酸之N末端侧的氨基酸不论为何种类型，对已硫代甲酸酯化的半胱氨酸残基而言，均存在胍对N末端肽键的反应性。
实施例3.24aa肽的硫酯化
将肽(H2N-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu LeuGlu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Gly-OH(序列识别号：19)(粗制(未精制))适量(推定为1mg左右)溶于pH5.0之缓冲溶液(300μL，0.2M Na2HPO4，6M Gn-HCl)，添加溶于乙腈(100μL)的MPAA硫代甲酸苯酯(1μL)全部量。50分钟后以Et2O将反应溶液洗净。使用HPLC进行精制即制得目标化合物(H2N-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu GluArg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr GlyCys(C(S)OPh)Gly-OH(序列识别号：20))。此外，预先以Acm保护第3位之Cys，以勿使其受到硫代甲酸酯试剂的影响。
(ESIMS计算值[M+2H]2+1553.8，[M+3H]3+1035.8，实际值[M+2H]2+1552.9，[M+3H]3+1035.7))
将肽(H2N-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu LeuGlu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys(C(S)OPh)Gly-OH(序列识别号：20)，约0.3mg)溶于含有Boc2O(0.4mg)、三乙胺(0.03μL)之DMSO(20μL)。1.5小时后将反应溶液以Et2O沉淀、洗净。将所得之残留物溶于250mM之N-乙酰胍/DMSO溶液(50μL)。2.5小时后，使用HPLC对标的物进行精制即制得作为目标的N-乙酰胍化物(BocHN-Leu IleCys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys(Boc)Glu AlaGlu Asn Ile Thr Thr Gly-NHC(NH)NHAc(序列识别号：21))。
(ESIMS计算值[M+2H]2+1546.8，[M+3H]3+1031.5，实际值[M+2H]2+1547.0，[M+3H]3+1031.4))
将24aa肽(BocHN-Leu Ile Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg TyrLeu Leu Glu Ala Lys(Boc)Glu Ala Glu Asn Ile Thr ThrGly-NHC(NH)NHAc(序列识别号：21)，约0.1mg＞)溶于含有MESNa(2-磺酰乙烷磺酸钠)(1mg，2％v/v)的pH7.05的缓冲溶液(0.2M磷酸，6M胍，50μl)。3.5小时后，使用HPLC对标的物进行精制即制得硫酯(BocHN-LeuIle Cys(Acm)Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys(Boc)GluAla Glu Asn Ile Thr Thr Gly-SCH2CH2SO3(序列识别号：22))(产率不明，在HPLC上约70％)。
(ESIMS计算值[M+2H]2+1567.3，实际值[M+2H]2+1566.8).
实施例4.采用硫代氯甲酸苯酯试剂的硫代甲酸酯基的导入
将肽(Ac-Val Tyr Ala Ala Cys Gly-OH(序列识别号：5)，6mg)溶于pH5.0之缓冲溶液(961μL，0.2M Na2HPO4，6M Gn-HCl)，添加溶于乙腈(320μL)的硫代氯甲酸苯酯(6.5μL)。1小时后以Et2O将反应溶液洗净。使用HPLC进行精制即制得作为目标的硫代甲酸酯化肽(序列识别号：9)(6.4mg，88％)。
(Xaa＝Ala，ESIMS计算值[M+H]+761.3，实际值[M+H]+ 761.3).
将肽(Ac-Val Tyr Ala Leu Cys Gly-OH(序列识别号：7)，3.4mg)溶于pH5.0的缓冲溶液(510μL，0.2M Na2HPO4，6M Gn-HCl)，添加溶于乙腈(170μL)的硫代氯甲酸苯酯(3.5μL)。1小时后以Et2O将反应溶液洗净。使用HPLC进行精制即制得作为目标的硫代甲酸酯化肽(序列识别号：11)(3.8mg，92％)。
(Xaa＝Leu，ESIMS计算值[M+H]+ 803.4，实际值[M+H]+ 803.3).
将肽(Ac-Val TyrAla Phe Cys Gly-OH(序列识别号：8)，5.1mg)溶于pH5.0的缓冲溶液(729μL，0.2M Na2HPO4，6M Gn-HCl)，添加溶于乙腈(243μL)的硫代氯甲酸苯酯(5.0μL)。1小时后以Et2O将反应溶液洗净。使用HPLC进行精制即制得作为目标的硫代甲酸酯化肽(序列识别号：12)(5.1mg，84％)。
(Xaa＝Phe，ESIMS计算值[M+H]+ 837.4，实际值[M+H]+ 837.3).
将肽(Ac-Val Tyr Ala Ser Cys Gly-OH(序列识别号：3)，4.9mg)溶于pH5.0的缓冲溶液(766μL，0.2M Na2HPO4，6M Gn-HCl)，添加溶于乙腈(265μL)的硫代氯甲酸苯酯(5.2μL)。1小时后以Et2O将反应溶液洗净。使用HPLC进行精制即制得作为目标的硫代甲酸酯化肽(序列识别号：15)(5.5mg，92％)。
(Xaa＝Ser，ESIMS计算值[M+H]+ 777.3，实际值[M+H]+ 777.3).
将肽(Ac-Val Tyr Ala Lys Cys Gly-OH(序列识别号：2)，5.5mg)溶于pH5.0的缓冲溶液(810μL 0.2M Na2HPO4，6M Gn-HCl)，添加溶于乙腈(270μL)的硫代氯甲酸苯酯(5.5μL)。1小时后以Et2O将反应溶液洗净。使用HPLC进行精制即制得作为目标的硫代甲酸酯化肽(序列识别号：17)(6.1mg，94％)。
(Xaa＝Lys，ESIMS计算值[M+H]+818.3，实际值[M+H]+818.4).
采用硫代氯甲酸苯酯试剂亦可制得与实施例1中所得之物质相同的经硫代甲酸酯化后的肽链。因此，自采用硫代氯甲酸苯酯试剂来导入硫代甲酸酯基的肽链而言，亦可明了：通过使用与上述实施例1及3中导入硫代甲酸酯基之肽链相同的方法进行N-乙酰胍化，接着进行硫酯化即可制得肽硫酯。
工业实用性
根据本发明，提供了一种将多肽链以化学方式转换成肽硫酯的新颖方法。
本发明的方法中，即使在不具有传统硫酯化法中所必需的非天然氨基酸衍生物、连接物或特定三维结构等的肽链上亦可进行硫酯化，且即便为经由生物合成等所得的长链多肽片段，亦可简易地进行硫酯化。因此，本发明的肽硫酯化方法可通用于蛋白质的整体合成中。
Claims (14)
1.肽硫酯的制造方法，包括以下步骤(a)～(c)：
(a)步骤：在具有半胱氨酸残基的肽链中，使由以下式(I)表示的化合物A与所述半胱氨酸残基的硫醇基反应而使R2脱离，以制造第1中间体：
式中，X为硫原子或氧原子，R1及R2为离去基团；
(b)步骤：在有机溶剂中，使由以下式(II)表示的化合物B与所述第1中间体反应，以在所述半胱氨酸残基与邻接于所述半胱氨酸残基之N末端侧的氨基酸之间形成肽键的羧基上附加-NH-C(＝Y)NHR3基，并切断所述肽键，从而制得作为第2中间体的比被切断的所述肽键更靠近N末端侧的肽片段：
式中，Y为氧原子、硫原子或NH基，R3为氢原子、酰基或烷氧羰基；以及
(c)步骤：使硫醇与所述第2中间体反应，以使C末端的-NH-C(＝Y)NHR3基与硫醇基进行交换，从而对所述第2中间体的C末端进行硫酯化。
2.如权利要求1所述的方法，其中，X为硫原子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，R1为-O-C6芳基。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，R2为卤素原子或者取代或未取代的-S-C6-10芳基。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，Y为NH基。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，R3为乙酰基。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，在所述步骤(c)中，所述硫醇为由以下式(III)表示的硫醇：
R4-SH (式III)
式中，R4为选自取代或未取代之苯甲基、取代或未取代之芳基、及取代或未取代之烷基中的任一种基团。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述肽链为重组蛋白质。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述肽链为含有精制用标记物的重组蛋白质。
10.多肽的制造方法，包括将由权利要求1至9中任一项所述的方法而得到的肽硫酯与N末端上具有半胱氨酸的肽链通过连接法结合的步骤。
11.第2中间体的制造方法，所述第2中间体用于权利要求1至9中任一项所述的肽硫酯的制造方法，所述第2中间体的制造方法包括以下步骤(a)或(b)：
(a)步骤：在具有半胱氨酸残基的肽链中，使由以下式(I)表示的化合物A与所述半胱氨酸残基的硫醇基反应而使R2脱离，以制造第1中间体：
式中，X为硫原子或氧原子，R1及R2为离去基团；
(b)步骤：在有机溶剂中，使由以下式(II)表示的化合物B与所述第1中间体反应，以在所述半胱氨酸残基与邻接于所述半胱氨酸残基之N末端侧的氨基酸之间形成肽键的羧基上附加-NH-C(＝Y)NHR3基，并切断所述肽键，从而制得作为第2中间体的比被切断的所述肽键更靠近N末端侧的肽片段：
式中，Y为氧原子、硫原子或NH基，R3为氢原子、酰基或烷氧羰基。
12.在C末端上具有-NH-C(＝Y)NHR3基的肽链，其中，Y为氧原子或NH基，R3为氢原子、酰基或烷氧羰基。
13.多肽的制造方法，包括将权利要求12所述的在C末端上具有-NH-C(＝Y)NHR3基的肽链与N末端上具有半胱氨酸的肽链通过连接法结合的步骤。
14.除去附加于重组蛋白质的C末端侧的精制用标记物的方法，包括以下步骤(a)～(c)：
(a)步骤：在C末端上含有精制用标记物的重组蛋白质中，使由以下式(I)表示的化合物A与半胱氨酸残基的硫醇基反应而使R2脱离，以制造第1中间体：
式中，X为硫原子或氧原子，R1及R2为离去基团；
(b)步骤：在有机溶剂中，使由以下式(II)表示的化合物B与所述第1中间体反应，以在所述半胱氨酸残基与邻接于所述半胱氨酸残基之N末端侧的氨基酸之间形成肽键的羧基上附加-NH-C(＝Y)NHR3基，并切断所述肽键，从而制得作为第2中间体的比被切断的所述肽键更靠近N末端侧的肽片段：
式中，Y为氧原子、硫原子或NH基，R3为氢原子、酰基或烷氧羰基；以及
(c)步骤：使硫醇与所述第2中间体反应，以使C末端的-NH-C(＝Y)NHR3基与硫醇基进行交换，从而对所述第2中间体的C末端进行硫酯化。
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