KR101644635B1 - Microfluidic chip for generating microvessel and a method for analyzing cancer metastasis using thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈관형성을 위한 미세유체칩에 관한 것이다. 본 발명의 미세유체칩은, 기판 위에 일련의 순서로 인접하도록 배치된 제 1채널, 제 2 채널, 제 3 채널, 제 4채널, 및 제 5채널로 구성되며, 각 채널이 인접하는 채널과 접하여 형성하는 경계면 상에 그 사이에 간극(gap)이 있는 2개 이상의 미세구조물 또는 마이크로포스트가 배치된다. 각 채널들은 미세구조물이 형성하는 간극을 통해 다른 채널과 유체 상호작용하며 생화학물질이 이동할 수 있다. 본 발명에 따른 미세유체칩은 생체 외에서 평활하고 연속적인 혈관 경계면을 갖는 미세혈관을 제공한다. 또한, 본 발명의 미세유체칩은 이를 이용하여 암 혈관신생, 암 혈관내유입, 및 암 혈관외유출을 모델링 할 수 있다. 또한, 본 발명의 미세유체칩은 항암제 약물 후보물질을 스크리닝 하는데 이용될 수 있다.The present invention relates to a microfluidic chip for angiogenesis. The microfluidic chip of the present invention is composed of a first channel, a second channel, a third channel, a fourth channel and a fifth channel arranged adjacent to each other in a sequential order on a substrate, and each channel is in contact with an adjacent channel Two or more microstructures or microposts with a gap therebetween are disposed on the forming boundary surface. Each channel interacts fluidly with the other channel through the interstices formed by the microstructures and biochemicals can migrate. The microfluidic chip according to the present invention provides a microvessel with a smooth and continuous vascular interface in vitro. In addition, the microfluidic chip of the present invention can be used to model cancer angiogenesis, intracavitary inflow, and extracellular infiltration. In addition, the microfluidic chip of the present invention can be used for screening anticancer drug candidate substances.

Description

혈관형성을 위한 미세유체칩 및 이를 이용한 암전이 분석방법 {Microfluidic chip for generating microvessel and a method for analyzing cancer metastasis using thereof}Technical Field [0001] The present invention relates to a microfluidic chip for blood vessel formation and a method for analyzing cancer metastasis using the microfluidic chip.

본 발명은 혈관형성을 위한 미세유체칩에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생체 외에서 형성된, 평활하고 연속적인 혈관 경계면을 갖는 미세혈관 및 이를 이용하여 암 전이 메커니즘을 분석하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 미세유체칩을 이용하여 약물 후보물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a microfluidic chip for angiogenesis. The present invention also relates to microvessels formed in vitro, with smooth, continuous vascular interface, and methods for analyzing cancer metastasis mechanisms using the same. The present invention also relates to a method for screening drug candidates using a microfluidic chip.

암 전이에 있어 각 단계별 메커니즘을 밝히고자 하는 노력이 있어 왔다. 대부분의 암 전이 메커니즘은 암세포와 내피세포 (EC, endothelial cell) 상호작용을 포함하며, 다수의 시험관 내 (in vitro) 모델들이 이러한 상호작용 패턴을 모방하기 위해 개발되었다. 그러나, 현재까지, 자연적 형태발생과정에 의해 생성된 미세혈관을 이용하여 전이과정 중의 암-내피세포 상호작용(예를 들어, 혈관신생, 혈관내유입 및 혈관외유출)을 실질적으로 모방할 수 있는 적합한 세포 외 모델은 보고된 바 없었다.Efforts have been made to elucidate the mechanism of each stage in cancer metastasis. Most of cancer metastasis mechanisms within (in includes cancer cells and endothelial cells (EC, endothelial cell) interaction, a number of test tubes vitro models were developed to mimic these interaction patterns. However, up to now, it has been shown that microvessels produced by the natural morphogenesis process can be used to substantially mimic cancer-endothelial cell interactions (e.g., angiogenesis, vascular and extravasation) during metastasis Appropriate extracellular models have not been reported.

암세포는 암 성장 및 전이과정 중에 주위의 혈관과 지속적으로 상호작용을 하는 것으로 알려졌다(비특허문헌 1: Bergers and Benjamin 2003; 비특허문헌 2: Carmeliet and Jain 2000). 암세포 군집은 증식하면서 주위 혈관이 군집을 향해 뻗어 오도록 자극하는 인자들을 분비한다. 이러한 현상은 암 혈관신생으로 알려져 있다. 암 혈관신생은 혈관으로부터 암세포에 영양소 및 산소를 공급하여 암이 악성종양으로 성장하게 한다. 완전히 성장한 타원체로 구성된 암세포는 주위 혈관세포를 관통하여, 혈액 내를 순환하고, 혈관 주위 영역 내의 제 2차 부위를 관통한다 (비특허문헌 3: Sahai 2007). 이러한 혈관외유출 되는 암세포는 성장하여 2차 암 군집을 형성한다. 대부분의 암 사망은 이러한 반복적인 암 전이에 의해 발생한다. 따라서, 암 전이의 진행에 관련된 단계로서, 주로 암 혈관신생 및 내피세포를 통한 이동에 대한 연구가 광범위하게 진행되고 있다. 따라서, 용이하게 조절되는 미세환경 내에서 전이 단계를 모방할 수 있는 세포 외 모델이 암 전이에 대한 깊은 이해를 위해 요구된다. 트랜스웰 실험에서, 암세포는 하부 챔버에서 성장하고, 상부 챔버에서는 콜라겐 또는 매트리젤 (Martrigel)과 같은 세포 외 기질 내에서 내피세포가 배양되었다. 튜브 형성 (비특허문헌 4: Tsujii et al. 1998) 및 내피세포의 이동 (비특허문헌 5: Abdollahi et al. 2005)을 암-유래인자에 대한 반응에서 관찰할 수 있다. 암세포의 내피세포를 통한 이동에 대한 모델에서, 내피세포는 페트리디쉬 또는 다공성막에서 컨플루언스 (confluence) 상태에 이르기까지 배양되고, 수시간 내지 수일간의 배양 후에 내피 단일 층의 투과를 관찰할 수 있었다(비특허문헌 6: Jin et al. 2012; 비특허문헌 7: Kramer and Nicolson 1979; 비특허문헌 8: Kusama et al. 2006; 비특허문헌 9: Lee et al. 2003; 비특허문헌 10: Roetger et al. 1998; 비특허문헌 11: Zabel et al. 2011).Cancer cells are known to continuously interact with surrounding blood vessels during cancer growth and metastasis (Non-Patent Document 1: Bergers and Benjamin 2003; Non-Patent Document 2: Carmeliet and Jain 2000). Cancer cell populations proliferate and secrete factors that stimulate the surrounding blood vessels to extend toward the cluster. This phenomenon is known as cancer angiogenesis. Cancer angiogenesis causes nutrients and oxygen to be supplied to cancer cells from blood vessels, causing cancer to grow into malignant tumors. Cancer cells composed of fully grown ellipsoids circulate around the blood vessels through the surrounding blood vessel cells and pass through the secondary site in the peripheral blood vessel region (Non-Patent Document 3: Sahai 2007). These extravasated cancer cells grow to form secondary cancer clusters. Most cancer deaths are caused by these recurrent cancer metastases. Therefore, as a stage involved in the progression of cancer metastasis, studies on cancer angiogenesis and migration through endothelial cells have been extensively conducted. Thus, an extracellular model capable of mimicking the metastasis stage within an easily controlled microenvironment is required for a deeper understanding of cancer metastasis. In the transwell experiment, cancer cells grew in the lower chamber and in the upper chamber endothelial cells were cultured in extracellular matrix such as collagen or Martrigel. Tube formation (Non-Patent Document 4: Tsujii et al. 1998) and migration of endothelial cells (Non-Patent Document 5: Abdollahi et al. 2005) can be observed in response to cancer-derived factors. In a model for migration of cancer cells through endothelial cells, the endothelial cells are cultured to confluence in a petri dish or a porous membrane, and the permeation of the endothelial monolayer is observed after several hours to several days of culture Non-Patent Document 6: Jin et al. 2012; Non-Patent Document 7: Kramer and Nicolson 1979; Non-Patent Document 8: Kusama et al. 2006; Non-Patent Document 9: Lee et al. 2003; : Roetger et al. 1998; Non-Patent Document 11: Zabel et al. 2011).

마이크로 단위의 미세제조 기술의 발전은 암 생물학 연구를 위한 세포 외 모델의 발전을 가져왔다. 미세유체 기술은 미세환경 인자의 정밀한 조절, 세포 이동성 또는 세포 대 세포 상호작용의 고해상도 이미징 조절에 있어, 종래 방법에 비해 다양한 장점을 갖는다(비특허문헌 12: Chung et al. 2010; 비특허문헌 13: Lee et al. 2014a). 많은 연구들은 미세유체 기술을 이용하여 암 전이과정의 각 단계들을 모델링 하였다. 암 혈관신생 과정은, 내피세포를 하이드로젤 벽에 부착시키고, 암 세포와 공동-배양함으로써 내피세포를 자극하여 모델링 하였다(비특허문헌 14: Kim et al. 2013). 이러한 실험의 단점은 적절한 세포-세포 연결이 결핍된 내피세포 군집으로부터 발생과정 시작된다는 점이다. 혈관신생은 암 군집 근처의 완전하게 확립된 혈관으로부터 발생되기 때문에, 이러한 특징은 실제 생체 내 (in vivo) 암 혈관신생과 생리학적으로 관련되어 있지 않다. 다른 연구에서, 혈관 벽은 미세유체 채널 내에서 내피세포 단일층을 배양함으로써 모델링 되었다(비특허문헌 15: Jeon et al. 2013; 비특허문헌 16: Zervantonakis et al. 2012). 내피세포를 통한 이동은 상기 시스템에 암세포를 유입함으로써 모델링 될 수 있다. 그러나, 이러한 혈관모델은 혈관신생 과정 또는 혈관형성 (vasculogenic) 과정 없이, 내피세포 단일층을 하이드로젤 상에 부착시키는 것을 포함한다. 최근, 암의 혈관외유출을 분석하기 위해, 혈관형성 과정에 의해 혈관 네트워크를 생성하는 미세유체 모델이 개발된 바 있다(비특허문헌 17: Chen et al. 2013). 그러나, 이러한 모델은 암세포의 주화성 이동을 유발하는 케모카인의 농도 구배 방향성을 허용하지 않으며, 혈관 네트워크의 예측 불가능한 기하학적 구조는 실험의 복잡성을 증가시켰다. The development of micro-fabrication techniques has led to the development of extracellular models for cancer biology research. Microfluidic technology has a variety of advantages over conventional methods for precise regulation of microenvironmental factors, cell migration or high resolution imaging control of cell-cell interactions (Non-Patent Document 12: Chung et al. 2010; : Lee et al. 2014a). Many studies have modeled each stage of the cancer metastasis process using microfluidic technology. The cancer angiogenesis process was modeled by stimulating endothelial cells by attaching endothelial cells to the walls of hydrogels and co-culturing with cancer cells (Non-Patent Document 14: Kim et al. 2013). The disadvantage of these experiments is that the development begins from endothelial cell clusters deficient in appropriate cell-cell connections. Because angiogenesis originates from fully established blood vessels near the cancer community, this characteristic is in vivo ( in vivo ) is not physiologically related to angiogenesis. In another study, vessel walls were modeled by culturing a monolayer of endothelial cells in the microfluidic channel (Non-Patent Document 15: Jeon et al. 2013; Non-Patent Document 16: Zervantonakis et al. 2012). Migration through endothelial cells can be modeled by introducing cancer cells into the system. However, this vascular model involves attaching a single layer of endothelial cells to the hydrogel without an angiogenic or vasculogenic process. Recently, a microfluidic model has been developed to produce a vascular network by an angiogenic process in order to analyze extracellular efflux of cancer (Non-Patent Document 17: Chen et al. 2013). However, this model does not allow the concentration gradient direction of chemokines to induce chemotactic migration of cancer cells, and the unpredictable geometry of the vascular network has increased the complexity of the experiment.

이에, 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자 본 발명자들은 노력하였으며, 그 결과 본 발명의 미세유체칩을 이용함으로써, 놀랍게도 평활하고 연속적인 혈관 경계면을 갖는 미세혈관을 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
The present inventors have made efforts to solve the problems of the prior art. As a result, it has been found that, by using the microfluidic chip of the present invention, it is surprisingly possible to produce microvessels having a smooth and continuous blood vessel interface, Completed.

Bergers and Benjamin 2003, Nature Reviews Cancer, 3(6), 401-410. Bergers and Benjamin 2003, Nature Reviews Cancer, 3 (6), 401-410. Carmeliet and Jain 2000, Nature, 407(68010, 249-257.Carmeliet and Jain 2000, Nature, 407 (68010, 249-257). Sahai E. 2007, Nature Reviews Cancer 7(10):737-749.Sahai E. 2007, Nature Reviews Cancer 7 (10): 737-749. Tsujii et al. 1998, Cell 93(5):705-716.Tsujii et al. 1998, Cell 93 (5): 705-716. Abdollahi et al. 2005, Clinical Cancer Research 11(17):6270-6279.Abdollahi et al. 2005, Clinical Cancer Research 11 (17): 6270-6279. Jin et al. 2012, Molecular Cancer Research 10(8):1021-1031.Jin et al. 2012, Molecular Cancer Research 10 (8): 1021-1031. Kramer and Nicolson 1979, Proceedings of the National Academy of Sciences 76(11):5704-5708.Kramer and Nicolson 1979, Proceedings of the National Academy of Sciences 76 (11): 5704-5708. Kusama et al. 2006, International journal of oncology 29(1):217-223.Kusama et al. 2006, International journal of oncology 29 (1): 217-223. Lee et al. 2003, Journal of Biological Chemistry 278(7):5277-5284.Lee et al. 2003, Journal of Biological Chemistry 278 (7): 5277-5284. Roetger et al. 1998, The American journal of pathology 153(6):1797-1806.Roetger et al. 1998, The American Journal of pathology 153 (6): 1797-1806. Zabel et al. 2011, Mol Cancer 10(73):10.1158.Zabel et al. 2011, Mol Cancer 10 (73): 10.1158. Chung et al. 2010, Annals of Biomedical Engineering 38(3):1164-1177.Chung et al. 2010, Annals of Biomedical Engineering 38 (3): 1164-1177. Lee et al. 2014a, MRS Bulletin 39(01):51-59.Lee et al. 2014a, MRS Bulletin 39 (01): 51-59. Kim et al. 2013, Lab Chip 13(8):1489-1500.Kim et al. 2013, Lab Chip 13 (8): 1489-1500. Jeon et al. 2013, Integrative Biology 5(10):1262-1271.Jeon et al. 2013, Integrative Biology 5 (10): 1262-1271. Zervantonakis et al. 2012, Proc Natl Acad Sci U S A 109(34):13515-13520.Zervantonakis et al. 2012, Proc Natl Acad Sci U SA 109 (34): 13515-13520. Chen et al. 2013, Integrative Biology 5(10):1262-1271.Chen et al. 2013, Integrative Biology 5 (10): 1262-1271. Xia, Y. et al. 1998, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.　37　(5): 551-575.Xia, Y. et al. 1998, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 37 (5): 551-575. Lee et al. 2014b, Microvasc Res 91:90-98.Lee et al. 2014b, Microvasc Res 91: 90-98. Flament et al. 2013, Magnetic Resonance in Medicine 69(1):179-187.Flament et al. 2013, Magnetic Resonance in Medicine 69 (1): 179-187. Yuan et al. 1996, Proceedings of the National Academy of Sciences 93(25):14765-14770.Yuan et al. 1996, Proceedings of the National Academy of Sciences 93 (25): 14765-14770. Pechman et al. 2011, Journal of neuro-oncology 105(2):233-239.Pechman et al. 2011, Journal of neuro-oncology 105 (2): 233-239. Wu et al/ 2001, American Journal of Physiology-Cell Physiology 280(4):C814-C822.Wu et al / 2001, American Journal of Physiology-Cell Physiology 280 (4): C814-C822. Zen et al. 2008, PloS one 3(3):e1826.Zen et al. 2008, PloS one 3 (3): e1826. Brett et al. 1989, The Journal of experimental medicine 169(6):1977-1991.Brett et al. 1989, The Journal of experimental medicine 169 (6): 1977-1991. Burke-Gaffeyy and Keenan 1993, Immunopharmacology 25(1):1-9.Burke-Gaffeyy and Keenan 1993, Immunopharmacology 25 (1): 1-9. Horvath et al. 1988, Proceedings of the National Academy of Sciences 85(23):9219-9223.Horvath et al. 1988, Proceedings of the National Academy of Sciences 85 (23): 9219-9223. Johrer et al. 2004, Clinical cancer research 10(6):1901-1910.Johrer et al. 2004, Clinical cancer research 10 (6): 1901-1910. Liang et al. 2007, Cancer letters 258(1):31-37.Liang et al. 2007, Cancer letters 258 (1): 31-37. Zervantonakis et al. 2012, Proc Natl Acad Sci U S A 109(34):13515-13520.Zervantonakis et al. 2012, Proc Natl Acad Sci U SA 109 (34): 13515-13520.

이와 같이, 본 발명의 목적은 평활하고 연속적인 혈관 경계면을 갖는 미세혈관을 생체 외에서 형성하는 미세유체칩을 제공하는 것이다. Thus, it is an object of the present invention to provide a microfluidic chip that forms a microvessel having smooth and continuous vascular interface in vitro.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 미세유체칩으로부터 평활하고 연속적인 혈관 경계면을 갖는 미세혈관을 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a microvessel having a smooth and continuous vascular interface from a microfluidic chip according to the present invention.

본 발명의 다른 목적은 암 혈관신생을 생성하는 미세유체칩을 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a microfluidic chip that produces cancer angiogenesis.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 미세유체칩으로부터 생체 외에서 생성된 암 혈관신생을 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a cancer angiogenesis generated ex vivo from a microfluidic chip according to the present invention.

본 발명의 다른 목적은 암 혈관내유입을 유도하는 미세유체칩을 제공하고자 한다.It is another object of the present invention to provide a microfluidic chip for inducing intravascular inflow.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 미세유체칩으로부터 생체 외에서 암 혈관내유입을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide an intravascular inflow of cancerous microvessels from the microfluidic chip according to the present invention.

본 발명의 다른 목적은 암 혈관외유출을 유도하는 미세유체칩을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a microfluidic chip that induces extracellular leakage.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 미세유체칩으로부터 생체 외에서 암 혈관외유출을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide an extracorporeal vascular outflow from a microfluidic chip according to the present invention.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 미세유체칩을 이용하여 약물 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a method for screening drug candidates using a microfluidic chip according to the present invention.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 미세유체칩을 이용하여 스크리닝 된 약물 후보물질을 제공하고자 한다.
It is another object of the present invention to provide a drug candidate substance screened using the microfluidic chip according to the present invention.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 일 구체예에서, 미세혈관 생성을 위한 미세유체칩으로서, 기판 위에 제 1 채널 (100), 제 2 채널 (200), 제 3 채널 (300), 제 4 채널 (400), 및 제 5 채널 (500)이 일련의 순서로 배치되고; 제 1 채널은 제 2 채널과 일 측면부에서 인접하고, 제 2 채널의 다른 일 측면부는 제 3채널의 일 측면부와 인접하며, 제 3 채널의 다른 일 측면부는 제 4 채널의 일 측면부와 인접하고, 제 4 채널의 다른 일 측면부의 일부 또는 전부는 하나 이상의 제 5 채널의 일 측면부와 인접하며; 상기 인접하는 두 개의 채널에 의해 형성되는 경계면 상에 두 개 이상의 미세구조물 (610)이 간극 (gap) (620)을 두고 배치되며; 상기 각 채널이 상기 간극을 통해 각 채널에 포함된 생화학 물질들 간의 상호작용을 허용하는, 혈관형성을 위한 미세유체칩 (10)을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, in one embodiment, the present invention provides a microfluidic chip for microvessel generation, comprising a first channel 100, a second channel 200, a third channel 300, The fourth channel 400, and the fifth channel 500 are arranged in a sequential order; The first channel is adjacent one side of the second channel and the other side of the second channel is adjacent to one side of the third channel and the other side of the third channel is adjacent to one side of the fourth channel, Some or all of the other one side portion of the fourth channel is adjacent to one side portion of the at least one fifth channel; Two or more microstructures 610 are disposed on a boundary surface formed by the adjacent two channels with a gap 620 therebetween; Wherein each channel permits interaction between biochemicals contained in each channel through the gap. The microfluidic chip (10) for angiogenesis is provided.

본 발명의 미세유체칩에서 채널의 높이와 폭은 특별히 제한되지 않고, 채널에 주입되는 물질의 종류나 실험의 목적 및 조건에 따라 유동적으로 결정될 수 있다. 일 구체예에서, 채널의 높이는 10 ㎛ 내지 100 ㎛이고, 30 ㎛ 내지 80 ㎛가 바람직하고, 40 ㎛ 내지 60 ㎛가 더 바람직하다. In the microfluidic chip of the present invention, the height and width of the channel are not particularly limited and can be determined flexibly according to the kind of the material to be injected into the channel, and the purpose and condition of the experiment. In one embodiment, the height of the channel is from 10 탆 to 100 탆, preferably from 30 탆 to 80 탆, more preferably from 40 탆 to 60 탆.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 상기 미세유체칩을 이용하여 생성된 미세혈관을 제공한다. 구체적으로, 미세혈관의 생성은, 섬유아세포, 예를 들어, 폐 섬유아세포 (Lung Fibroblasts, LF)와 피브린 (fibrin)의 혼합물을 제 5 채널 (500)로 제공하고, 내피세포와 피브린의 혼합물은 제 3 채널 (300)로 제공하는 것으로 수행되며, 미세혈관형성 동안에 제 1 채널 (100) 및 제 2 채널 (200)은 비어 있는 상태를 유지한다. 이와 같이, 제 2 채널 (200)은 미세혈관이 형성되는 동안 공기만을 포함하고 있어야 하며, 이는 제 2 채널 (200)로부터 성장인자의 농도구배 형성을 억제하며, 내피세포가 비어 있는 채널을 향해 이동하거나 발아체를 생성하는 것을 억제한다. 보다 더 평활하고 연속적인 경계면을 갖는 미세혈관 세포를 형성하기 위해, 내피세포는 2 ~ 10 x 106 HUVECs/ml의 농도, 바람직하게는 4 ~ 8 x 106 HUVECs/ml 농도, 가장 바람직하게는, 6 x 106 HUVECs/ml의 농도로 주입된다. 낮은 HUVEC 농도, 3 x 106/ml 조건 (도 2A)에서, 내피세포는 하부 영역에서 보다 더 두꺼운 혈관을 형성한다. 이와 반대로, HUVEC 농도가 지나치게 높으면, 예를 들어, 9 x 106/ml 조건 (도 2A)에 나타낸 것과 같이, 과다의 내피세포가 혈관 채널 내에 존재하고, 이는 내피세포의 이동 및 평활한 혈관 경계면 생성을 저해한다. 따라서, 최적의 HUVEC 농도는 6 x 106/ml이다. 동시에, 배지는 제 4채널 (400)으로부터 공급되며, 이는 내피세포를 하부 영역으로 이동시키는 동력이 되고, 미세혈관이 제 4 채널 (400)에 보다 더 가까워 지게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 미세혈관형성 시 마이크로포스트 사이의 갭에 존재하는 내피세포는 배지 채널이 있는 보다 더 낮은 방향으로 이동하려는 경향을 보이며, 이로 인해 평활한 혈관 경계면 형성이 이뤄진다 (도 2C).In another embodiment of the present invention, microvessels produced using the microfluidic chip are provided. Specifically, the production of microvessels provides a mixture of fibroblasts, for example, Lung Fibroblasts (LF) and fibrin, in a fifth channel 500, and a mixture of endothelial cells and fibrin To the third channel 300, while the first channel 100 and the second channel 200 remain empty during microvascular formation. As such, the second channel 200 must contain air only during the formation of the microvessels, which inhibits the concentration gradient of the growth factor from the second channel 200 and moves toward the channel in which the endothelial cells are empty Or inhibit the generation of germ. In order to form microvascular cells with a smoother, more continuous interface, the endothelial cells have a concentration of 2 to 10 x 10 6 HUVECs / ml, preferably 4 to 8 x 10 6 HUVECs / ml, , 6 x 10 < 6 > HUVECs / ml. At low HUVEC concentrations, 3 x 10 6 / ml conditions (FIG. 2A), endothelial cells form thicker blood vessels than in the lower region. Conversely, if the HUVEC concentration is too high, for example, as shown in the condition of 9 x 10 6 / ml (FIG. 2A), excess endothelial cells are present in the vascular channel, which is responsible for endothelial cell migration and smooth vascular interface It inhibits generation. Thus, the optimal HUVEC concentration is 6 x 10 6 / ml. At the same time, the medium is supplied from the fourth channel 400, which is the power to move the endothelial cells to the lower region, causing the microvessels to be closer to the fourth channel 400. Accordingly, the endothelial cells existing in the gap between the microposts in the microvessel formation according to the present invention tend to move in a lower direction with the medium channel, thereby forming a smooth vascular interface (FIG. 2C).

본 발명은 다른 일 구체예에서, 상기 미세유체칩 (10)을 이용한 암 혈관신생을 제공한다. 구체적으로, 먼저 본 발명의 따라 미세혈관을 생성시킨 후, 혈관형성 능력이 있는 세포주, 예를 들어, U87MG 세포주와 피브린의 혼합물을 제 1 채널에 주입한 다음, 피브린을 제 2 채널에 주입한다. The present invention provides cancer angiogenesis using the microfluidic chip 10 in another embodiment. Specifically, first, a microvessel is generated according to the present invention, and then a mixture of a cell line capable of angiogenesis, for example, a U87MG cell line and fibrin is injected into the first channel, and fibrin is injected into the second channel.

본 발명은 다른 일 구체예에서, 항암제 약물 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에 암 혈관신생을 유도함에 있어, 혈관형성 형성 능력이 있는 세포주와 시료를 함께 처리한 경우, 암 혈관신생이 생성되지 않은 경우, 시료를 항암제 후보물질로서 판별하는 것을 포함한다. In another embodiment, the present invention provides a method for screening anticancer drug candidate substances. Specifically, in the present invention, when a cell line having an angiogenesis-forming ability is treated together with a sample to induce cancer angiogenesis, if cancer angiogenesis is not generated, the sample may be discriminated as an anticancer drug candidate.

본 발명은 다른 일 구체예에서, 미세유체칩 (10)을 이용한 암 혈관내유입을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에 따라 암 혈관신생을 생성시킨 후, 제 2 채널의 피브린 젤에 암세포, 예를 들어, MDA-MB-231 세포를 부착하고, 제 1 채널에 암세포 성장을 위한 배지를 공급한다. 다음, 성장인자-결핍 배지(EBM)를 제 1 채널에 공급하면, 미세혈관 벽으로의 암세포의 주화성 이동에 의해 암 혈관내유입이 유도된다. The present invention provides, in another embodiment, intracavitary infusion with the microfluidic chip 10. Specifically, after cancer angiogenesis is generated according to the present invention, cancer cells, for example, MDA-MB-231 cells are attached to the fibrin gel of the second channel, and a medium for cancer cell growth is supplied to the first channel . Next, when growth factor-deficient medium (EBM) is supplied to the first channel, intracavitary inflow is induced by chemotactic migration of cancer cells to the microvascular wall.

이와 같이, 본 발명의 미세유체칩은 생체 외 미세혈관 생성, 암 혈관신생, 암 혈관내유입 및 혈관외유출을 모델링 하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 미세유체칩의 공간적인 공동-배양 유연성은 폐섬유아세포가 내피세포를 자극하여 분화된 미세혈관이 수득되고, 후속하여 암세포가 도입되어 암-내피세포 상호작용을 모델링 하는 것을 허용한다. 본 발명의 일 구체예에서, 내피세포는 적절한 세포-세포 연결을 지니고 생체 내에서와 같이 길어진 형태를 보이며, 혈관 내강을 통해 배지가 관류 될 수 있으며, 제 4 채널 (400)에 대해 2개의 개방된 3차원 혈관구조를 갖는다. 또한, 본 발명은 암 혈관신생 및 항-혈관 내피 성장인자 (anti-VEGF; 베바시주맙) 처리에 의한 혈관신생 경로의 저해가 성공적으로 모델링 된다. 또한, 본 발명의 일 구체예는 종양괴사인자-알파(TNF-α) 처리에 의한 암 혈관내유입 속도 조절을 보여준다.As such, the microfluidic chip of the present invention can be used to model in vitro microvascular production, cancer angiogenesis, intracavitary inflow, and extravasation. The spatial co-culture flexibility of the microfluidic chip of the present invention allows pulmonary fibroblasts to stimulate endothelial cells to differentiate into microvessels and subsequently introduce cancer cells to model cancer-endothelial cell interactions. In one embodiment of the invention, the endothelial cells have appropriate cell-cell connections and are elongated as in vivo, the medium can be perfused through the lumen of the vessel, and two openings for the fourth channel 400 Dimensional vascular structure. In addition, the present invention successfully models inhibition of the angiogenic pathway by treatment of cancer angiogenesis and anti-VEGF (bevacizumab) treatment. In addition, one embodiment of the present invention shows the regulation of the rate of intracoronary inflow by tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) treatment.

본 발명에서 사용되는 용어 "미세구조물"은 마이크로 단위의 구조물로서, 경계면 상의 미세구조물 (610), 간극 (620), 및 각 채널 (100, 200, 300, 400, 및 500) 및 이들에 이해 규정되는 구조물을 총칭하는 개념으로 정의된다. 각 채널이 서로 접하는 경계면상에 형성되는 미세구조물 (610)의 형태는 특별히 제한되지 않지만, 마이크로포스트 (micropost)의 형태일 수 있다. 일 구체예에서, 미세구조물이 형성하는 갭의 크기(폭)는 10 ㎛ 내지 100 ㎛이고, 바람직하게는 50 ㎛ 내지 90 ㎛이며, 보다 더 바람직하게는 60 ㎛ 내지 80 ㎛이다. 미세구조물 (610)의 단면의 형태는 원형 또는 삼각형 일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서, 제 1 채널 (100)은 상부 채널, 제 2 채널 (200)은 브릿지 채널, 제 3 채널 (300)은 혈관 채널, 제 4 채널 (400)은 배지 채널, 및 제 5 채널 (500)은 LF 채널로 언급되며 동일한 의미를 갖는 것으로 이해된다.As used herein, the term "microstructure" is a microstructure that includes microstructures 610 on the interface, gaps 620, and channels 100, 200, 300, 400, and 500, The structure is defined as a general term. The shape of the microstructure 610 formed on the boundary surface where the respective channels are in contact with each other is not particularly limited, but may be in the form of a micropost. In one embodiment, the size (width) of the gaps formed by the microstructures is 10 占 퐉 to 100 占 퐉, preferably 50 占 퐉 to 90 占 퐉, and even more preferably 60 占 퐉 to 80 占 퐉. The shape of the cross section of the microstructure 610 may be circular or triangular, but is not limited thereto. In the present invention, the first channel 100 is an upper channel, the second channel 200 is a bridge channel, the third channel 300 is a blood vessel channel, the fourth channel 400 is a delivery channel, and the fifth channel 500 ) Are referred to as LF channels and are understood to have the same meaning.

본 발명에서 사용된 용어, "빈 채널" 또는 "공(empty) 채널"은 같은 의미를 가지며, 채널 내에 기체(gas)의 존재는 허용하나 액체 및 고체의 존재를 허용하지 않는 채널을 의미한다.The term "empty channel" or "empty channel" as used in the present invention means the channel having the same meaning and allowing the presence of gas in the channel but not allowing the presence of liquid and solid.

본 발명에서 사용된 용어 "생화학 물질"은 세포, 단백질, 펩티드, 아미노산, 보조인자, 신경전달물질, 산화방지제, 보조인자, 지질, 탄수화물, 호르몬, 항체, 또는 항원 등 생화학 분야에서 생체 기능 및 활동을 위해 요구되는 다양한 물질을 모두 포함하는 것으로 이해되며, 일반 화학 화합물(chemical compound) 또한 포함되는 것을 이해된다.
The term "biochemical" as used in the present invention refers to biological functions and activities in the biochemistry such as cells, proteins, peptides, amino acids, cofactors, neurotransmitters, antioxidants, cofactors, lipids, carbohydrates, hormones, , And it is understood that common chemical compounds are also included.

본 발명의 미세유체칩을 이용하여, 자연적인 혈관형성과정에 의해 형성된 평활하고 연속적인 경계면을 갖는 미세혈관을 수득할 수 있다. 또한, 상기 수득한 미세혈관으로 암 혈관신생 및 혈관내유입을 모델링 할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 혈관구조를 형성하는 보다 더 실질적인 수단을 제공하며, 이는 암세포 또는 백혈구의 혈관외유출 모델, 혈관 내강을 통과하는 유체이동에서의 기계적전달(mechanotransduction) 실험을 포함하여 다양한 실험 모델에 적용할 수 있는 가능성을 제시한다. 본 발명의 미세유체칩은 기초 암 생물학 및 약물후보 스크리닝 분야 등에서도 폭넓게 활용될 수 있을 것이며, 암 연구를 촉진할 수 있을 것이다.
Using the microfluidic chip of the present invention, it is possible to obtain microvessels having a smooth, continuous interface formed by the natural angiogenesis process. In addition, the obtained microvessels can model cancer angiogenesis and intravascular inflow. Thus, the present invention provides a more substantial means of forming the vasculature, including a model of extracellular efflux of cancer cells or leukocytes, a variety of experimental models including mechanotransduction experiments in fluid movement through the lumen of the vessel The possibility of applying to The microfluidic chip of the present invention can be widely used in the fields of basic cancer biology and drug candidates screening, and can promote cancer research.

도 1은 본 발명의 미세유체칩의 구조 및 실험 순서의 설계를 나타낸 것으로서, 도 1A는 본 발명의 미세유체칩의 구조를 나타낸 개략도이다.
도 1B는 본 발명에 따라 생성되는 미세혈관을 개략적으로 도시한 것이다.
도 1C는 본 발명에 따라 생성되는 암 혈관신생을 개략적으로 도시한 것이다.
도 1D는 본 발명에 따라 생성되는 암 혈관내유입을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 평활하고 연속적인 혈관 벽을 생성하기 위한, HUVEC 농도의 최적화 결과를 나타낸 것이다.
도 2A는 초기 HUVEC 농도에 의존하여 생성된 미세혈관에 대한 공초점 현미경 사진이다(HUVEC 접종 후 7일 째). HUVEC 농도가 6 x 106/ml인 경우, 평활하며 연속적인 미세혈관 벽을 생성한다.
도 2B는 평활한 미세혈관 벽 형성의 성공률을 나타낸 것이다. HUVEC 농도가 6 x 106/ml인 경우, 평활한 미세혈관 벽 형성이 가장 높은 성공률을 보였다.
도 2C는 HUVEC 농도 6 x 106/ml에서의 미세혈관형성에 대한 시간차 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 완전히 발달된 미세혈관의 형광 현미경 사진을 나타낸 것으로서, 도 3A는 미세혈관 내에 형성된 내강을, 미세혈관에 대한 3차원(3D) 투사 및 횡단면 이미지를 통해 나타낸 것이다.
도 3B는 FITC-덱스트란 용액이 미세혈관 내로 주입되기 전후의 현미경 사진이다.
도 3C 및 3D는 미세혈관이 연결된 것을 나타낸 것이다. 클라우딘-5 및 ZO-1의 평활하고 선명한 라인이 적절한 연결이 형성되었음을 제시한다. 2일째, 분산된 HUVEC 세포가 길어지면서 튜브 형태로 분화를 시작하였다. 4일째, HUVEC 세포는 서로 융합하여 내강 내부를 형성하기 시작한다. 7일째, HUVEC 세포는 충분히 융합되어 실질적인 내강 및 평활한 혈관벽을 갖춘 미세혈관을 형성하였다.
도 4는 암 혈관신생 실험 결과 현미경 사진 및 정량화 결과를 나타낸 것으로서, 도 4A는 암세포 주입 전 및 주입 후 3일째의 미세혈관 벽의 현미경 이미지를 비교한 것이다. 암에 의해 유발된 미세혈관 발아체는 베바시주맙 처리에 의해 크게 감소되었다.
도 4B 및 4C는 다양한 조건에서 발아체의 수와 분포 면적을 정량환 결과를 나타낸다. 미세혈관 벽으로부터의 혈관신생 발아체는 상부 채널을 향해 형성되었고, 암세포의 분비에 의해 촉진되었다. 베바시주맙 처리는 발아체의 분포 면적 및 수를 크게 감소시켰으며, 이는 암 치료에 있어 베바시주맙의 항-혈관신생 가능성을 나타낸 것이다 (***p < 0.0005). 오차 막대는 SEM를 나타낸다.
도 5는 암의 혈관내유입 실험에 대한 현미경 사진 및 정량화 결과를 나타낸 것으로서, 도 5A는 미세혈관 벽을 통해 이동하는 암세포의 3차원 현미경 사진. 을 나타낸다(적색: CD31, 녹색: MDA-MB-231, 청색: 핵). 형광 및 DIC 현미경 사진은 암세포가 미세혈관 벽을 향해 침투되어 있음을 보여준다.
도 5B는 미세혈관 내 세포-세포 연결면에서 발현되는 VE-캐드헤린의 현미경 사진을 나타낸 것이다. 정상 조건에서의 미세혈관 (좌측)과 비교하여, TNF-α 처리된 미세혈관 내 VE-캐드헤린은 분쇄되고 주름진 형태 (우측)를 나타내는데, 이는 TNF-α 효과에 의해 연결면이 분쇄되었음을 제시한다. 대조군 실험과 비교하여, TNF-α 처리된 미세혈관은 암의 혈관내유입에 있어 매우 높은 비율을 나타내는데, 이는 미세혈관 및 암의 혈관내유입에서의 연결 기능에 대한 TNF-α의 효과를 보여주는 것이다(대조군과 비교시 *p < 0.0005). 오차 막대는 SEM를 나타낸다.
도 6, 도 7 및 도 8은 도 1A의 여러 가지 활용 형태를 간략히 나타낸 것이다.FIG. 1 is a schematic view showing a structure of a microfluidic chip of the present invention and a design of an experimental procedure. FIG. 1A is a schematic view showing the structure of a microfluidic chip of the present invention.
Figure 1B schematically illustrates microvessels produced in accordance with the present invention.
Figure 1C schematically illustrates the angiogenesis produced in accordance with the present invention.
Figure 1D schematically illustrates the intracorporeal inflow produced according to the present invention.
Figure 2 shows the optimization results of the HUVEC concentration to produce a smooth, continuous blood vessel wall.
Figure 2A is a confocal microscope photograph of the microvessels generated in dependence on the initial HUVEC concentration (day 7 after HUVEC inoculation). At a HUVEC concentration of 6 x 10 6 / ml, smooth, continuous microvascular wall formation occurs.
Figure 2B shows the success rate of smooth microvascular wall formation. When HUVEC concentration was 6 × 10 6 / ml, smooth microvascular wall formation showed the highest success rate.
Figure 2C is a time-lapse micrograph of microvascular formation at a HUVEC concentration of 6 x 10 6 / ml.
FIG. 3 is a fluorescence microscope photograph of a fully developed microvessel. FIG. 3A shows a lumen formed in a microvessel through a three-dimensional (3D) projection and a cross-sectional image of a microvessel.
Figure 3B is a micrograph of the FITC-dextran solution before and after injection into the microvessel.
Figures 3C and 3D show microvascular connections. Smooth and clear lines of claudin-5 and ZO-1 suggest that proper connections have been made. On day 2, the dispersed HUVEC cells became longer and began to differentiate into tubular forms. On day 4, HUVEC cells begin to fuse together to form the lumenal interior. On day 7, HUVEC cells were fully fused to form microvessels with substantial luminal and smooth vessel walls.
FIG. 4 shows microscopic photographs and quantification results as a result of cancer angiogenesis test. FIG. 4A compares microscopic images of microvascular walls before and 3 days after the injection of cancer cells. Microvascular germination induced by cancer was greatly reduced by treatment with bevacizumab.
Figures 4B and 4C show the results of quantitative analysis of the number and distribution area of germs under various conditions. Angiogenic germs from the microvascular wall were formed toward the upper channel and promoted by the secretion of cancer cells. Treatment with bevacizumab significantly reduced the area and number of germination areas, indicating the anti-angiogenic potential of bevacizumab in the treatment of cancer (*** p <0.0005). The error bars represent SEM.
FIG. 5 shows microscopic photographs and quantification results of an intravascular inflow experiment of cancer, and FIG. 5A is a three-dimensional microscopic photograph of cancer cells moving through a microvascular wall. (Red: CD31, green: MDA-MB-231, blue: nuclear). Fluorescence and DIC micrographs show that cancer cells are penetrating toward the microvascular wall.
5B is a microscopic photograph of VE-cadherin expressed on the microvessel cell-cell junction surface. Compared with microvessels (left) in normal conditions, TNF-α-treated microvascular VE-cadherin exhibits pulverized and wrinkled morphology (right), suggesting that the TNF- . Compared to the control experiment, TNF-a treated microvessels show a very high rate of intravascular inflow of cancer, demonstrating the effect of TNF- [alpha] on the connectivity function in microvessels and intravascular inflow of cancer (* P < 0.0005 in comparison with control). The error bars represent SEM.
Figures 6, 7 and 8 show a simplified representation of the various modes of use of Figure 1A.

이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the components and technical features of the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention and are not intended to limit the scope of the invention.

실험 재료Experimental material

세포 배양, 면역 염색 및 제제Cell culture, immunostaining and preparation

인간 제대정맥 혈관 내피세포 (HUVEC, Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Lonza)를 내피세포 성장배지 (EGM-2, Lonza)에서 배양하였다. 정상 인간 폐섬유아세포 (LF, Lonza)는 섬유아세포 성장배지 (FGM-2, Lonza)에서 배양하였다. 인간 교아세포종 다형성세포, U87MG (ATCC, 버지니아)는 10% 우태아혈청 (FBS), 페니실린 (100 U/ml) 및 스트렙토마이신 (100 U/ml)을 보충한 DMEM 배지에서 배양하였다. MDA-MA-231 세포는 ATCC (Manassas, VA)로부터 구입하였다. MDA-MB-231 세포는 pEGFP 플라스미드로 형질감염시켰고, 1 mg/ml G418 (A.G. scientific, Inc.)를 사용하여 세포를 선별하였다. 단일클론으로부터 수득된 MDA-MA-231 GFP 세포는 10% 우태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, BRL) 및 250ug/ml G418(A.G. scientific, Inc.)을 보충한 RPMI1640(WELGENE, Korea)에서 유지하였다. 모든 세포는 37℃, 5% CO2 조건의 가습화된 인큐베이터에서 배양하였다. 면역염색에 대하여, 인간 ZO-1 (Alexa Fluor594, 클론 ZO1-1A12, molecular probe), CD31 (AlexaFluor1647, 클론 WM59, Biolegends), VE-캐드헤린 (eBioscience) 및 클라우딘-5 (Invitrogen)에 특이적인 마우스 단일클론 항체를 사용하여 내피세포를 이미지화하였고, Hoechst 33342 (molecular probe)를 사용하여 핵을 염색하였다. 베바시주맙 (Avastin, Genentech)은 500 ug/ml로 희석하고 암 혈관신생 실험에서 암이 도입된 미세혈관에 처리하였다. 재조합 인간 TNF-α(PetroTech)를 5 ng/ml로 희석하여 암 도입 24시간 전에 미세혈관 내로 처리하였다.
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC, Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Lonza) were cultured in endothelial cell growth medium (EGM-2, Lonza). Normal human lung fibroblasts (LF, Lonza) were cultured in fibroblast growth medium (FGM-2, Lonza). Human glioblastoma polymorphic cells, U87MG (ATCC, Va.) Were cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 U / ml) and streptomycin (100 U / ml). MDA-MA-231 cells were purchased from ATCC (Manassas, Va.). MDA-MB-231 cells were transfected with pEGFP plasmid and cells were selected using 1 mg / ml G418 (AG scientific, Inc.). MDA-MA-231 GFP cells obtained from monoclonal cells were grown in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin (Gibco, BRL) and 250 ug / ml G418 (AG scientific, Inc., WELGENE, ). All cells were cultured in a humidified incubator at 37 ° C, 5% CO 2 . For immunological staining, mice specific for human ZO-1 (Alexa Fluor 594, clone ZO1-1A12, molecular probe), CD31 (AlexaFluor1647, clone WM59, Biolegends), VE-cadherin and Claudin-5 (Invitrogen) Endothelial cells were imaged using monoclonal antibodies and stained with Hoechst 33342 (molecular probe). Bevacizumab (Avastin, Genentech) was diluted to 500 ug / ml and treated with cancer-induced microvessels in a cancer angiogenesis experiment. Recombinant human TNF-alpha (PetroTech) was diluted to 5 ng / ml and microinvasively treated 24 hours before cancer introduction.

미세유체칩Microfluidic chip 제조 Produce

마스터 몰드는 실리콘 웨이퍼 상에 포토레지스트를 캐스팅하여 제조하였다. SU-8100 (Microchem, US) 포토레지스트에 대한 표준 포토리소그래피 프로토콜(비특허문헌 18: Xia, Y. et al. 1998)을 사용하여 80 um 두께의 몰드를 제조하였다. PDMS (Dow Corning, US)를 완성된 마스터 몰드에 붓고, 80℃ 드라이 오븐 내에서 경화시켰다. PDMS 및 세척된 커버슬립을 플라즈마 처리 (Femto Science, KR)로 결합시켰다. 소수성 형성을 위해, 결합된 장치를 80℃ 드라이 오븐 내에서 48시간 이상 유지하였다.
The master mold was prepared by casting a photoresist on a silicon wafer. A mold of 80 um thick was prepared using a standard photolithography protocol for SU-8100 (Microchem, US) photoresist (non-patent document 18: Xia, Y. et al. PDMS (Dow Corning, US) was poured into the finished master mold and cured in a dry oven at 80 占 폚. PDMS and cleaned cover slips were combined with plasma treatment (Femto Science, KR). For hydrophobic formation, the combined devices were maintained in a 80 DEG C dry oven for at least 48 hours.

하이드로젤Hydrogel 및 세포 로딩 And cell loading

HUVECs(대부분의 실험에서 6 x 106/ml, 일부 실험에서 3 또는 9 x 106/ml 사용함) 및 LFs (7 x 106/ml)를 피브리노겐 용액 (2.5 mg/ml 피브리노겐, 0.15 U/ml 아프로티닌 및 0.5 U/ml 트롬빈)과 혼합하고, 제 3 채널 (혈관 채널) 및 제 5 채널 (LF 채널)에 각각 주입하였다(도 1A). 피브린 중합화를 위해 2 분간 배양한 후, EGM-2 배지를 배지 채널에 채웠다. 장치는 7 ~ 8일간 배양하여 각각의 배지 채널에 대해 개방된 말단을 갖춘 완전히 내강을 갖는 루멘화 된(lumenized) 미세혈관을 형성하였다(도 1B). 혈관이 성숙된 후에, U87MG 및 MDA-MA-231 세포를 조직배양 디쉬로부터 회수하였다. 암 혈관신생을 위해, 피브리노겐 용액을 처리한 U87MG 세포는 제 1 채널 (상부 채널)에 주입하고, 제 2 채널 (브릿지 채널)은 피브리노겐 용액으로 채웠다. 암세포 혈관내유입을 위해, MDA-MB-231 세포 (1x106/ml)를 배지와 함께 제 2 채널로 주입하고, 40분간 기울여서 제 2 채널 및 제 3 채널 (혈관 채널) 사이의 피브린 벽에 부착시켰다. 암세포의 주화성 이동을 유발시키기 위해, EBM-2 (추가적인 성장인자 보충이 없는 배지)를 제 2 채널 및 제 1 채널에 채우고, EGM-2 배지는 제 4 채널에 채웠다.
HUVECs (6 x 10 6 / ml for most of the experiments, in some experiments 3 and 9 x 10 6 / ml using) and LFs (7 x 10 6 / ml ) fibrinogen solution (2.5 mg / ml fibrinogen, 0.15 U / ml Aprotinin and 0.5 U / ml thrombin) and injected into the third channel (vascular channel) and the fifth channel (LF channel), respectively (FIG. 1A). After 2 minutes of incubation for fibrin polymerization, EGM-2 medium was filled into the culture channel. The device was incubated for 7-8 days to form fully lumenized lumenized microvessels with open ends for each delivery channel (FIG. 1B). After the vessels were matured, U87MG and MDA-MA-231 cells were recovered from tissue culture dishes. For cancer angiogenesis, U87MG cells treated with fibrinogen solution were injected into the first channel (upper channel) and the second channel (bridge channel) with the fibrinogen solution. MDA-MB-231 cells (1x10 6 / ml) were injected into the second channel along with the medium for 40 minutes to attach to the fibrin wall between the second channel and the third channel (blood vessel channel) . To induce chemotactic migration of cancer cells, EBM-2 (medium without supplemental growth factor supplementation) was filled in the second channel and the first channel, and EGM-2 medium was filled in the fourth channel.

현미경microscope

미세혈관 DIC(Differential Interference Contrast Microscope) 이미징을 위해, Nikon AE31 현미경을 사용하였다. 3D z-stack 및 횡단면의 이미징을 위해, 염색된 시료는 공초점 현미경 (Olympus FV1000)을 사용하여 이미징 하였다. 공초점 이미지는 IMARIS 소프트웨어 (Bitplane, Switzland)를 사용하여 분석하였다. 형광 이미지를 위해, FITC-덱스트란 주입된 시료를 IX81 역상 현미경 (Olympus)를 사용하여 이미징 하였다.
For microvascular Differential Interference Contrast Microscope (DIC) imaging, a Nikon AE31 microscope was used. For 3D z-stack and cross-sectional imaging, the dyed samples were imaged using a confocal microscope (Olympus FV1000). Confocal images were analyzed using IMARIS software (Bitplane, Switzland). For fluorescent images, FITC-dextran injected samples were imaged using an IX81 reverse-phase microscope (Olympus).

자료 분석Data analysis

미세혈관의 평활하고 연속적인 경계의 성공률을 정량화하기 위해, 혈관 경계의 길이를 측정하였고, Image J를 사용하여 미세혈관에 따른 혈관 채널의 직선 길이와 비교하였다. 경계 길이 값이 혈관 채널의 직선 길이에 비해 ± 10% 범위 내에 있다면 칩이 성공한 것으로 간주하였다. 연결되지 않은 혈관 벽을 갖는 모든 미세혈관은 실패한 것으로 간주하였다.To quantify the success rate of the smooth and continuous border of microvessels, the length of the vascular boundary was measured and compared with the linear length of the vascular channels according to microvessels using Image J. If the boundary length value was within ± 10% of the linear length of the vascular channel, the chip was considered successful. All microvessels with unconnected vessel walls were considered as failed.

투과성 계수의 계산은 선행 기술 (비특허문헌 19: Lee et al. 2014b)에 게시된 방법을 사용하여 수행하였다. 요약하면, FITC-덱스트란 용액을 미세혈관에 도입하였고 메타모프 (Metamorph) 내 다단계 시간-차 모드를 사용하여 매 15초마다 형광 이미징 하였다. 획득한 시간-차 이미지를 Image J로 분석하고 투과성 계수를 하기의 [수식 1]로 계산하였다:Calculation of the permeability coefficient was performed using the method published in the prior art (non-patent document 19: Lee et al. 2014b). Briefly, FITC-dextran solution was introduced into microvessels and fluorescence imaged every 15 seconds using a multistep time-difference mode in Metamorph. The acquired time-difference image was analyzed with Image J and the permeability coefficient was calculated by [Equation 1]

Figure 112014051727797-pat00001
Figure 112014051727797-pat00001

상기 식에서, lw는 혈관 주변영역 및 미세혈관 영역 사이를 구분하는 혈관 벽의 길이이고, li는 미세혈관 영역 내 평균 광도 (intensity)이며 l은 혈관 주변영역의 전체 광도이다. Where lw is the length of the blood vessel wall that separates the peripheral blood vessel area and the microvascular area, li is the average light intensity in the microvascular region, and 1 is the total luminous intensity of the peripheral blood vessel region.

암 혈관신생을 정량화하기 위해, 발아 영역 및 발아체 수를 Image J를 사용하여 직접 정량화하였다. 암의 혈관내유입을 정량화하기 위해, 미세혈관은 CD31로 염색하였고 형광 이미징 하였으며, 미세혈관의 말단 측면에 있는 암세포는 IMARIS 소프트웨어를 사용하여 직접 계수하였다.
To quantify cancer angiogenesis, germination area and germination number were directly quantified using Image J. To quantify the intravascular inflow of cancer, microvessels were stained with CD31 and fluorescently imaged, and cancer cells at the distal side of the microvessels were directly counted using IMARIS software.

실시예Example

미세유체칩의Microfluidic chip 제작 making

본 발명자들은 선행연구에서 HUVEC 및 LF의 공동-배양 시스템을 사용하여 관류 가능한 미세혈관 네트워크-제조 계획을 상세히 기술한 바 있다(비특허문헌 14: Kim et al. 2013). HUVEC 발아 (sprout)는 LF에 의해 자극을 받고, 채널의 양 측면에 대한 내강을 개방하여, 내강으로 유체가 흐르게 했다. 그러나, 기존 모델 내 미세혈관 구조는 예측이 불가능하고, 내피세포의 로딩 후에 혈관주위 영역이 젤 또는 PDMS 벽으로 채워져 있기 때문에 다른 세포 형태는 혈관주위 영역으로 도입될 수 없었다. 따라서, 본 발명자들은 보다 더 예측 가능한 기하학적 특징 및 미세혈관 제조 후에 다른 세포 형태로 채워질 수 있는 혈관 주위 영역을 갖춘 미세혈관을 제조하였다. 기존의 연구는 혈관 채널을 통해 횡단하고 말단과 말단을 연결하는 미세혈관을 만들었지만, 본 실시예에서 본 발명자들은 두 개의 제 3 채널 (혈관 채널) 개구부를 동일한 측면 (낮은 측면)에 배치하고, 제 3 채널 (혈관 채널)의 상부를 비어 있는 채널과 접하게 하였다 (도 1A). 이러한 구조는, 동일 측면 상에 두 개의 개구부가 배치된 미세혈관을 생성하고, 상기 미세혈관의 다른 측면이 도 1A에서 "브릿지 채널 (bridge channel)"로 명명된 제 2 채널과 접하도록 한다. 제 1 채널 (상부 채널) 및 제 2 채널 (브릿지 채널)은 미세혈관 성장 시 비어 있고, 비어 있는 채널을 갖춘 경계면은 상부 내 HUVEC가 제 3 채널 (혈관 채널)의 상부 방향으로의 이동 또는 발아체 생성을 억제하였고, 경계면에 평행인 평활한 경계의 생성을 가져왔다.The present inventors have described in detail a microvascular network-manufacturing plan that can be perfused using a co-culture system of HUVEC and LF in a previous study (Non-Patent Document 14: Kim et al. 2013). The HUVEC sprout was stimulated by LF, opening the lumens to both sides of the channel and allowing fluid to flow through the lumen. However, the microvessel structure in the existing model can not be predicted, and other cell types could not be introduced into the peri-vascular region because the peripheral vascular region was filled with gel or PDMS walls after endothelial cell loading. Thus, the present inventors have produced microvessels with more predictable geometric features and peripheral vascular regions that can be filled with other cell types after preparation of microvessels. Although conventional studies have created microvessels that traverse through the vascular channels and connect the ends to the ends, the present inventors have arranged the two third channel (vascular channel) openings on the same side (lower side) The upper part of the third channel (blood vessel channel) was brought into contact with an empty channel (FIG. 1A). This structure creates microvessels in which two openings are disposed on the same side and the other side of the microvessel is in contact with a second channel, referred to as "bridge channel" in FIG. 1A. The first channel (upper channel) and the second channel (bridge channel) are empty during the microvascular growth, and the interface with the empty channel is formed such that the HUVEC in the upper part moves to the upper direction of the third channel Suppressed the generation and produced a smooth boundary parallel to the interface.

도 1B 내지 1D는 미세혈관 생성의 개략도 및 미세유체칩 (10)을 사용한 암 혈관신생 및 혈관내유입 실험의 수행을 개략적으로 제시한다. 먼저, 본 발명자들은 LF-피브린 혼합물을 제 5 채널 (LF 채널) 내로 주입하고, HUVEC-피브린 혼합물을 제 3 채널 (혈관 채널)로 주입하여 미세혈관을 제조하였다. 배지를 추가하여 세포를 로딩한 채널을 연결하였다. 제 4 채널 (배지 채널)에 대한 2개의 개구부를 지닌 미세혈관이 7 ~ 8일 배양 후에 생성되었다(도 1B). 1B-1D schematically illustrate the microvessel generation and the performance of the cancer angiogenesis and intravascular infusion experiments using the microfluidic chip 10. First, we injected the LF-fibrin mixture into the fifth channel (LF channel) and injected the HUVEC-fibrin mixture into the third channel (vascular channel) to produce microvessels. The medium was added to connect the channels loaded with the cells. Microvessels with two openings for the fourth channel (culture channel) were generated after 7 to 8 days of culture (Fig. 1B).

다음, 미세혈관으로부터 암 발생 유발인자로서 높은 혈관형성 능력을 갖는 것으로 알려진 U87MG 세포주를 사용하여 암 혈관신생을 모델링 하였다(비특허문헌 20: Flament et al. 2013; 비특허문헌 21: Yuan et al. 1996). 본 발명자들은 U87MG-피브린 혼합물을 제 1 채널 (상부 채널)에 주입하고, 이어서 제 2 채널 (브릿지 채널)에 피브린을 주입하였다(도 1C). 본 발명자들은 암 부위를 향하는 이미 존재하는 미세혈관으로부터 암 발아체의 형성을 관찰하였는데, 이는 U87MG 세포로부터의 혈관신생유발전구인자의 분비에 의해 촉진되었다. 본 발명자들은 제 2 채널 (브릿지 채널)에 노출된 피브린 젤에 MDA-MB-231 세포를 부착하고, 암의 혈관내유입 실험을 위해 제 1 채널 (상부 채널)에 배지를 공급하였다(도 1D). 성장인자-결핍 배지 (EBM)를 제 1 배지 (상부 채널)에 공급하여 미세혈관 벽으로의 암세포의 주화성 이동을 유도하였다. 2 ~ 3일 배양 후, 혈관내 삽입된 암세포가 미세혈관 내부에서 관찰되었고, 이는 암의 혈관내유입 과정의 성공적인 모델링을 제시한다.
Next, cancer angiogenesis was modeled using a U87MG cell line known to have high angiogenic potential as a cancer inducing factor from microvessels (Non-Patent Document 20: Flament et al. 2013; Non-Patent Document 21: Yuan et al. 1996). We injected the U87MG-fibrin mixture into the first channel (upper channel) and then the fibrin into the second channel (bridge channel) (Fig. 1C). We observed the formation of cancer germs from pre-existing microvessels facing the cancer site, which was stimulated by the secretion of angiogenic precursors from U87MG cells. The present inventors adhered MDA-MB-231 cells to a fibrin gel exposed to a second channel (bridge channel) and supplied a medium to the first channel (upper channel) for intravascular infusion of cancer (FIG. 1D) . Growth factor-deficient medium (EBM) was fed to the first medium (upper channel) to induce chemotactic migration of cancer cells to the microvascular wall. After 2 to 3 days of culture, intravascularly inserted cancer cells were observed inside the microvessels, which suggests a successful modeling of the intravascular inflow of cancer.

평활하고(Smooth ( smoothsmooth ) 연속적인 경계면을 갖는 ) Having a continuous interface 관류성Perfusionism 미세혈관의 형성 Formation of microvessels

평활하고 연속적인 혈관 경계면을 제조하는 것은, 재현성 있는 자료 분석 및 추후 연구에서 미세혈관의 용도에 있어 중요하다. 따라서, 본 발명자들은 평활하고 연속적인 경계를 갖춘 미세혈관을 제조하기 위해 HUVEC 접종 농도를 최적화하였다. 본 발명자들은 각 조건마다 4 ~ 5개의 칩을 사용하여 3가지 조건 (3, 6 및 9 x 106 HUVECs/ml 및 7 x 106 LF/ml)을 시험하였고, 그 결과는 3회의 독립적인 측정의 평균 값으로 나타내었다. 도 2A는 각 조건에서 7일째의 미세혈관 형태를 나타낸 것이다. 미세혈관 경계 형성은 HUVEC 농도에 크게 의존하였다. 3 x 106 HUVECs/ml로 형성된 미세혈관이 분산된, 작은 발아체를 포함하는 불규칙적이고 불연속적인 경계면을 보였다. 9 x 106 HUVECs/ml로 형성된 미세혈관은 드물고, 분산된 작은 발아체를 포함하는 연속적인 경계면을 보였다. 그러나, 미세혈관은 상부 영역에서 마이크로포스트 사이의 대부분의 영역에 분포하였고, 불규칙적인 경계면 형태를 나타냈다. 대조적으로, 6 x 106 HUVECs/ml로 형성된 미세혈관은 분산된 작은 발아체가 없는 연속적인 경계면 뿐만 아니라 제 3 채널 (혈관 채널) 상부 영역을 향하여 돌출된 작은 발아체를 지닌, 가장 평활한 경계면 형태를 보여주었다. 도 2B는 각각의 조건 하에서 미세혈관형성에 대한 자료를 나타낸다. 다른 조건과 비교하여, 6 x 106 HUVECs/ml의 접종은 평활하고 연속적인 경계면 형태 관점에서, 가장 높은 성공률 (~77%)의 결과를 나타냈다. 따라서, 6 x 106 HUVECs/ml를 이용하여 형성된 미세혈관이 본 발명에 따른 가장 적절한 경계면 형태를 나타내었고, 이 조건을 이후의 모든 실험에서 사용하였다. 도 2C는 혈관 채널 내 미세혈관형성에 대한 일련의 현미경 사진이다. HUVEC는 칩 내 접종 2일 후에 작은 액포를 가진 길어진 형태를 나타내기 시작하였다. 이 시기에, 미세혈관은 완전히 연결되지 않았고 어떠한 확실한 내강 (patent lumen)도 관찰되지 않았다. HUVEC 발아체는 4일째에 확실한 내강을 형성하기 시작하였고, 길어진 형태를 나타내었다. 다음, HUVEC 발아체는 상호 연결되기 시작하면서 제 3 채널 (혈관 채널) 내에서 미세혈관을 형성하였다. 또한, 마이크로포스트 (610) 사이의 상부 영역 내 HUVECs는 하부 방향으로 이동하기 시작하였고, 편평하고 평활한 미세혈관 경계면을 형성하였다. HUVEC 발아체는 융합되기 시작하여 7일째에 완전한 내강을 지닌 미세혈관을 생성하였고, 마이크로포스트 (610) 사이의 상부 영역 내 HUVECs는 4일째에 상대적으로 하부로 이동하여 평활한 미세혈관 경계면을 형성하였다. 미세혈관은 14일 이상 형태적 특성을 유지하였다.
The production of smooth, continuous vascular interfaces is important for microvascular applications in reproducible data analysis and further studies. Thus, the present inventors optimized the HUVEC inoculation concentration to produce microvessels with smooth, continuous boundaries. We tested three conditions (3, 6 and 9 x 10 6 HUVECs / ml and 7 x 10 6 LF / ml) using 4 to 5 chips per condition, and the results were obtained by three independent measurements As shown in Fig. Figure 2A shows microvascular morphology on day 7 under each condition. Microvascular boundary formation was highly dependent on HUVEC concentration. An irregular and discontinuous interface with small germs dispersed microvessels formed with 3 x 10 6 HUVECs / ml was shown. Microvessels formed with 9 x 10 6 HUVECs / ml were uncommon and showed a continuous interface containing small dispersed germs. However, microvessels were distributed in most regions between micropores in the upper region and showed irregular boundary shape. In contrast, the microvessels formed with 6 x 10 6 HUVECs / ml consisted of the smoothest interface with a small germ that protruded toward the upper third channel (vascular channel) as well as a continuous interface with no dispersed germ germs Respectively. Figure 2B shows data for microvascular formation under each condition. Compared with other conditions, the inoculation of 6 x 10 6 HUVECs / ml resulted in the highest success rate (~ 77%) in terms of smooth and continuous interface form. Thus, microvessels formed using 6 x 10 6 HUVECs / ml showed the most appropriate interface shape according to the present invention, and this condition was used in all subsequent experiments. Figure 2C is a series of micrographs of microvascular formation in the vascular channels. HUVEC began to show elongated form with small vacuoles 2 days after inoculation of the chip. At this time, the microvessels were not fully connected and no definite patent lumen was observed. HUVEC germination began to form a definite lumen on the fourth day and showed a long form. Next, the HUVEC germs began to interconnect and formed microvessels in the third channel (blood vessel channel). In addition, the HUVECs in the upper region between the microposts 610 began to move downward and formed a flat and smooth microvascular interface. HUVEC germs began to fuse, producing microvessels with complete lumen on day 7, and HUVECs in the upper area between microposts 610 were relatively lowered on day 4 to form a smooth microvascular interface . Microvessels maintained morphological characteristics over 14 days.

HUVEC 채널 내 미세혈관을 형성한 후 (7 ~ 8일째), 핵 (청색) 및 CD31 (적색)을 면역염색 하여 공초점 현미경으로 이미지를 수득하였다 (도 3A). 다양한 위치에서의 미세혈관 횡단면 이미지는 개방된 3차원 내강을 보여준다. 미세혈관은 제 4 채널 (배지 채널)로 향하는 두 개의 개구부를 연결하는 개방된 내강으로 구성된다. 본 발명자들은 미세혈관으로 마이크로비드(Sigma)를 도입하여 측정한 것으로서, 배지 채널을 향해 개방된 미세혈관이 94% 수준으로 (108 칩 중 101 칩) 형성 되고, 배지가 혈관 내강을 통해 관류될 수 있음을 확인하였다.After formation of microvessels in the HUVEC channels (days 7-8), nuclear (blue) and CD31 (red) were immunostained and images were obtained by confocal microscopy (FIG. 3A). Microvessel cross-sectional images at various locations show an open three-dimensional lumen. The microvessel consists of an open lumen connecting two openings to the fourth channel (the delivery channel). The present inventors measured by introducing microbeads (Sigma) into microvessels. Microvessels opened to the culture channel were formed at 94% level (101 chips out of 108 chips), and the culture medium was perfused through the lumen Respectively.

본 발명자들은 20 kDa FITC-덱스트란 용액을 미세혈관으로 도입하여 내강의 개방성을 입증하였고 형광현미경을 사용하여 내강의 작동을 시각화 하였다. FITC-덱스트린은 벽을 통한 심각한 국소 누출 (focal leakage) 없이 미세혈관 내강을 채웠다(도 3B). 미세혈관의 투과성 계수는 FITC-덱스트란 강도 프로파일의 시간차 획득에 의해 측정하여, 1.58 ± 0.32 × 10-6cm/s (평균 ± 표준 편차, n = 5)이었다. 투과성 계수는 다른 세포 외 혈관 모델에 대한 수치의 범위 내에 있었으며, 이는 미세혈관이 적절한 세포-세포 연결을 포함하고 있음을 나타낸다. 본 발명자들은 클라우딘-5 및 ZO-1에 대한 형광 면역염색을 사용하여 연결을 분석하였다(도 3C 및 3D). 두 세포-세포 연결의 형광 이미지는, 어떠한 훼손되거나 주름진 위치가 없이 부드럽고, 분명한 길어진 형태를 보여주는데, 이것은 생체 내 정상적인 혈관의 세포-세포 연결의 기본적인 특징이다. The present inventors have demonstrated the openness of the lumen by introducing a 20 kDa FITC-dextran solution into the microvessel and visualized the operation of the lumen using a fluorescence microscope. FITC-dextrin filled the microvascular lumen without severe focal leakage through the wall (FIG. 3B). The permeability coefficient of microvessels was 1.58 +/- 0.32 x 10 -6 cm / s (mean ± standard deviation, n = 5), as measured by time difference acquisition of the FITC-dextran intensity profile. The permeability coefficient was within the range of values for other extracellular blood vessel models, indicating that microvessels contain appropriate cell-cell connections. We have analyzed the connections using fluorescent immunostaining for claudin-5 and ZO-I (Figures 3C and 3D). The fluorescence image of the two cell-cell connections shows a smooth, distinctly elongated morphology without any damaged or corrugated location, which is a fundamental feature of cell-cell connections in normal vascular vessels in vivo.

암 혈관신생 분석Cancer angiogenesis analysis

본 발명자들은 평활한 혈관 벽을 갖는 미세혈관을 사용하여 암세포의 혈관신생 가능성을 분석하였다. 채널 내 미세혈관형성 후 (7 ~ 8일), 본 발명자들은 높은 혈관신생 능력을 지닌 신경 교아종 세포주인 U87MG 및 피브린 혼합물을 제 1 채널 (상부 채널)에 도입하고, 제 2 채널 (브릿지 채널)은 피브린 젤만을 사용하여 채웠다. 혈관 주위 영역 내 U87MG 세포는 혈관신생 인자를 분비하여 미세혈관으로 혈관신생 발아체의 생성을 유발한 반면, 미세혈관이 암 부위에 이미 존재하는 것으로 간주하였다. 베바시주맵 (bevacizumab, bev)과 함께 또는 베바시주맵 없이 세 가지 농도 (대조군인 0/ml, 2.5 x 106 및 5 x 106)의 U87MG 세포주를 사용하였고, 혈관신생을 표적화하기 위해 널리 이용하는 항-VEGF 항체를 사용하였다. 미세혈관으로부터의 혈관신생 발생을 분석하고 조건마다 6개 칩의 평균 수치를 계산하였다.The present inventors analyzed the possibility of angiogenesis of cancer cells using microvessels having smooth blood vessel walls. After the microvascularization in the channel (7-8 days), we introduce the U87MG and fibrin mixture, a neuroblastoma cell line with high angiogenic potential, into the first channel (upper channel) and the second channel (bridge channel) Was filled with only fibrin gel. U87MG cells in the perivascular area secrete angiogenic factors to induce the production of angiogenic germs into microvessels, while microvessels are considered to already exist in the cancerous areas. Bevacizumab map was used for U87MG cell line (bevacizumab, bev) with or bevacizumab three concentrations without dole map (control of 0 / ml, 2.5 x 10 6 and 5 x 10 6), widely used for targeting angiogenesis Anti-VEGF antibody was used. Angiogenesis from microvessels was analyzed and the mean value of 6 chips was calculated for each condition.

U87MG 세포를 칩에 도입한 후 3일째, 미세혈관을 이미징 하여 각 조건에서의 혈관신생 발아체 수 및 분포 면적을 정량화하였다. 도 4A에 나타낸 것처럼, U87MG 세포가 없는 대부분의 미세혈관은 혈관신생 발생이 나타나지 않았으나, U87MG 세포가 있는 미세혈관은 상당한 수의 혈관신생 발아체를 나타냈다. 또한, 베바시주맵을 처리한 대부분의 미세혈관은 혈관신생 발아체가 없는 편평한 경계를 갖고 있었다. 일부의 베바시주맵 처리 시료에서, 암세포 및 베바시주맵의 도입 이전에 존재했던 발아체의 퇴행이 관찰되었다(도 4A). 이러한 현상은 베바시주맵의 항-혈관신생 효과에 의한 것으로 추정되었다. On day 3 after introducing U87MG cells into the chip, microvessels were imaged to quantify the number and distribution area of angiogenic germ in each condition. As shown in FIG. 4A, most microvessels without U87MG cells did not show angiogenesis, but microvessels with U87MG cells showed a significant number of angiogenic germs. In addition, most of microvessels treated with bevacizum map had a flat boundary with no angiogenic germs. In some bevacizum map treated samples, degeneration of germs that were present prior to the introduction of cancer cells and bevacizum maps was observed (Fig. 4A). This phenomenon was presumed to be due to the anti-angiogenic effect of the bevacizumab map.

다음, 발아체의 수와 분포 면적을 정량화하였다. 암세포를 갖는 미세혈관은 대조군에 비해 현저히 증가된 발아체 수 및 분포 면적을 나타내었다(도 4B 및 4C). 또한, 베바시주맵 처리는 U87MG 세포의 혈관신생 능력을 약화시켰고, 미세혈관 발아체의 수와 분포 면적을 크게 감소시켰다. 암세포에 의한 발아 유도 및 항-VEGF 처리에 의한 발아 약화와 같은 경향성은, 기존의 생체 내 보고와 일치하는 것이고 (비특허문헌 21: Yuan et al. 1996; 비특허문헌 22: Pechman et al. 2011), 이는 이러한 미세혈관 모델이 항-혈관신생 약물의 평가에 적합하다는 것을 입증한다.
Next, the number and distribution area of germination were quantified. Microvessels with cancer cells showed significantly increased number and area of germination compared to the control group (Figs. 4B and 4C). In addition, bevacizumab treatment weakened the angiogenic potential of U87MG cells and greatly reduced the number and distribution area of microvascular germs. The trends such as induction of germination by cancer cells and attenuation of germination by anti-VEGF treatment are consistent with the existing in vivo reports (Non-Patent Document 21: Yuan et al. 1996; Non-Patent Document 22: Pechman et al. ), Demonstrating that this microvessel model is suitable for the evaluation of anti-angiogenic drugs.

암의 Cancer 혈관내유입Intravascular inflow 시험 exam

MDA-MB-231 암세포의 내피세포를 통한 이동을 측정하기 위한 기존 혈관으로서 본 발명의 미세혈관을 사용하였다. 상기 세포는 내피세포를 통한 이동 실험에 통상적으로 사용되고 악성의 전이 능력을 갖고 있다(비특허문헌 9: Lee et al. 2003; 비특허문헌 23: Wu et al/ 2001; 비특허문헌 24: Zen et al. 2008). 도 1D에 제시된 바와 같이, 암세포는 피브린 젤과 제 2 채널 (브릿지 채널) 사이의 접촉면에 부착되었고, 2 ~ 3일간 배양하여 암세포가 미세혈관 벽으로 이동하여 관통하는 것이 허용되었다. 도 5A는 미세혈관 벽 (적색)을 통한 혈관내유입 과정에서 암세포 (녹색)에 대한 형광 및 격차간섭대조현미경 (DIC) 사진을 보여준다. 미세혈관으로 혈관내유입 되는 암세포를 직접 계수하였다. 본 실시예에서, 미세혈관은 암세포 도입 24시간 전에 5 ng/ml의 TNF-α처리하였고, 암의 혈관내유입 속도를 대조군의 속도와 비교하였다. TNF-α 처리한 미세혈관 내 접착대 (adheren junction) VE-캐드헤린(cadherin)은 대조군인 미세혈관과 비교하여, 붕괴된 연속성 및 주름진 형태를 나타내었다(도 5B). 24시간 이상 TNF-α처리한 미세혈관의 투과성은 2.22 ±0.67 × 10-6cm/s (평균 ± 표준 편차, n = 5)이고, 이는 정상 조건에서의 수치보다 1.4배 이상 큰 수치이다. 이러한 결과는 내피세포의 결합 분쇄에 대한 TNF-α 효과를 입증하였고, 기존의 보고와 일치하였다(비특허문헌 25: Brett et al. 1989; 비특허문헌 26: Burke-Gaffeyy and Keenan 1993; 비특허문헌 27: Horvath et al. 1988).The microvessels of the present invention were used as existing blood vessels for measuring the migration of MDA-MB-231 cancer cells through endothelial cells. The cells are commonly used for endothelial migration experiments and have malignant metastasis (Non-Patent Document 9: Lee et al. 2003; Non-Patent Document 23: Wu et al / 2001; Non-Patent Document 24: Zen et al., 2008). As shown in Figure 1D, the cancer cells were attached to the contact surface between the fibrin gel and the second channel (bridge channel) and allowed to pass through the microvascular wall through the cancer cells by incubating for 2-3 days. FIG. 5A shows fluorescence and interfering contrast microscopy (DIC) photographs of cancer cells (green) during intravascular inflow through the microvascular wall (red). Cancer cells entering the blood vessel into microvessels were directly counted. In this example, microvessels were treated with TNF-a at 5 ng / ml 24 hours before the introduction of cancer cells and the rate of intravascular inflow of cancer was compared with that of the control group. The TNF-a-treated adherent junction VE-cadherin showed collapsed continuity and corrugated morphology compared to the control microvasculature (Fig. 5B). The permeability of TNF-α treated microvessels over 24 h was 2.22 ± 0.67 × 10 -6 cm / s (mean ± SD, n = 5), which is 1.4 times greater than the value at normal conditions. These results demonstrate the TNF-alpha effect on endothelial cell binding and were consistent with previous reports (Non-Patent Document 25: Brett et al. 1989; Non-Patent Document 26: Burke-Gaffeyy and Keenan 1993; Document 27: Horvath et al. 1988).

또한, 암세포의 혈관내유입에 대한 TNF-α 효과를 분석하였다. TNF-α 처리 유무에 따른 혈관내유입 속도를 비교하였다(조건 당 n=7 칩). TNF-α 처리한 미세혈관에서 암의 혈관내유입 속도는 대조군의 속도에 비해 3배 이상 높았다(도 5C). 이러한 결과는 TNF-α 처리가 암세포의 혈관내유입에 대해 현저한 효과를 가지며, 이는 기존의 보고와 일치하였다(비특허문헌 28: Johrer et al. 2004; 비특허문헌 29: Liang et al. 2007; 비특허문헌 30: Zervantonakis et al. 2012).
In addition, the TNF-α effect on the intravascular inflow of cancer cells was analyzed. Intravenous inflow rates with and without TNF-α treatment were compared (n = 7 chips per condition). The rate of intravascular inflow of cancer into the microvessels treated with TNF-α was three times higher than that of the control group (FIG. 5C). These results indicate that TNF-a treatment has a significant effect on the intravascular inflow of cancer cells, consistent with previous reports (Non-Patent Document 28: Johrer et al. 2004; Non-Patent Document 29: Liang et al. 2007; Non-patent document 30: Zervantonakis et al. 2012).

본 발명의 미세유체칩을 이용하여, 자연적인 혈관형성과정에 의해 형성된 평활하고 연속적인 경계면을 갖는 미세혈관을 수득할 수 있다. 또한, 상기 수득한 미세혈관으로 암 혈관신생 및 혈관내유입을 모델링 할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 미세유체칩은 기초 암 생물학 및 약물후보 스크리닝 분야 등에서도 폭넓게 활용될 수 있을 것이다.
Using the microfluidic chip of the present invention, it is possible to obtain microvessels having a smooth, continuous interface formed by the natural angiogenesis process. In addition, the obtained microvessels can model cancer angiogenesis and intravascular inflow. As described above, the microfluidic chip of the present invention can be widely used in the fields of basic cancer biology and drug candidates screening.

100: 제 1 채널
200: 제 2 채널
300: 제 3 채널
400: 제 4 채널
500: 제 5 채널
610: 미세구조물
620: 간극
10: 미세유체칩100: 1st channel
200: Second channel
300: Third channel
400: fourth channel
500: fifth channel
610: Microstructure
620: Clearance
10: Microfluidic chip

Claims (18)

기판 위에 제 1 채널, 제 2채널, 제 3채널, 제 4채널, 및 제 5채널이 일련의 순서로 배치되고;
제 1채널의 일 측면부는 제 2채널과 일 측면부와 인접하고, 제 2채널의 다른 일 측면부는 제 3채널의 일 측면부와 인접하며, 제 3채널의 다른 일 측면부는 제 4채널의 일 측면부와 인접하고, 제 4채널의 다른 일 측면부의 일부 또는 전부는 하나 이상의 제 5채널의 일 측면부와 인접하며;
상기 인접하는 두 개의 채널에 의해 형성되는 경계면 상에 두 개 이상의 미세구조물이 그 사이에 간극(gap)을 두고 배치되고;
상기 각 채널이 상기 간극을 통해 각 채널에 포함된 생화학 물질들 간의 상호작용을 허용하며,
혈관형성 시에 제 1채널 및 제 2채널이 공(empty) 채널 상태를 유지하는,
생체 외에서 혈관형성을 위한 미세유체칩.
The first channel, the second channel, the third channel, the fourth channel, and the fifth channel are arranged in a sequential order on the substrate;
One side portion of the first channel is adjacent to the second channel and one side portion, the other side portion of the second channel is adjacent to one side portion of the third channel, and the other side portion of the third channel is connected to one side portion of the fourth channel And a part or all of the other one side surface of the fourth channel is adjacent to one side surface of the at least one fifth channel;
Two or more microstructures are disposed on a boundary surface formed by the adjacent two channels with a gap therebetween;
Each channel allowing interaction between biochemicals contained in each channel through the gap,
Wherein the first channel and the second channel maintain an empty channel state at the time of blood vessel formation,
Microfluidic chip for vascular formation in vitro.
제 1항에 있어서,
상기 제 1채널 내지 제 5채널 및 미세구조물의 높이가 10 ㎛ 내지 100 ㎛인 것을 특징으로 하는, 생체 외에서 혈관형성을 위한 미세유체칩.
The method according to claim 1,
Wherein the first channel to the fifth channel and the microstructure have a height of 10 mu m to 100 mu m.
제 1항의 미세유체칩에서 미세혈관을 형성시키는 방법으로서,
(ⅰ) 섬유아세포(fibroblasts)와 피브린(fibrin)의 혼합물을 제 5채널에 가하고; 내피세포와 피브린의 혼합물을 제 3채널에 가하여 배양하며,
(ⅱ) 상기 배양 중에, 제 1채널 및 제 2채널이 공(empty) 채널 상태를 유지하는 것을 특징으로 하는, 생체 외에서 미세혈관을 형성하는 방법.
A method for forming microvessels in a microfluidic chip according to claim 1,
(I) adding a mixture of fibroblasts and fibrin to the fifth channel; A mixture of endothelial cells and fibrin was added to the third channel,
(Ii) during the incubation, the first channel and the second channel maintain an empty channel state.
제 3항에 있어서,
내피세포의 농도가 4x106 ~ 8x106 cells/ml인 것을 특징으로 하는, 생체 외에서 미세혈관을 형성하는 방법.
The method of claim 3,
The density of endothelial cells, characterized in that 4x10 6 ~ 8x10 6 cells / ml , in vitro method of forming a fine blood vessel.
제 3항 또는 제 4항에 있어서,
섬유아세포가 폐섬유아세포(lung fibroblasts, LF)이고, 내피세포가 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)인 것을 특징으로 하는, 생체 외에서 미세혈관을 형성하는 방법.
The method according to claim 3 or 4,
Wherein the fibroblasts are lung fibroblasts (LF), and the endothelial cells are HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cells).
삭제delete 삭제delete 제 1항의 미세유체칩에서 암 혈관신생을 형성시키는 방법으로서,
(ⅰ) 섬유아세포와 피브린의 혼합물을 제 5채널에 가하고; 내피세포와 피브린의 혼합물을 제 3채널에 가하여 배양하며,
(ⅱ) 상기 배양 중에, 제 1채널 및 제 2채널이 공 채널 상태를 유지하여, 미세혈관을 형성시키고,
(ⅲ) 혈관신생 세포주를 제 1채널에 주입하고, 피브린을 제 2 채널에 주입한 후, 배양하는 것을 특징으로 하는,
생체 외에서 암 혈관신생(angiogenesis)을 형성하는 방법.
A method for forming cancer angiogenesis in a microfluidic chip according to claim 1,
(I) adding a mixture of fibroblasts and fibrin to the fifth channel; A mixture of endothelial cells and fibrin was added to the third channel,
(Ii) during the culturing, the first channel and the second channel maintain a cochannel state to form microvessels,
(Iii) an angiogenic cell line is injected into the first channel and fibrin is injected into the second channel and then cultured.
A method of forming cancer angiogenesis in vitro.
제 8항에 있어서,
내피세포의 농도가 4x106 ~ 8x106 cells/ml인 것을 특징으로 하는, 생체 외에서 암 혈관신생을 형성하는 방법.
9. The method of claim 8,
The density of endothelial cells, characterized in that 4x10 6 ~ 8x10 6 cells / ml , the method of forming the in vitro cancer angiogenesis.
제 8항 또는 제 9항에 있어서,
섬유아세포가 폐섬유아세포(lung fibroblasts, LF)이고, 내피세포가 HUVEC이며, 혈관신생 세포주가 U87MG 세포주(ATCC HTB-14TM)인 것을 특징으로 하는, 생체 외에서 암 혈관신생을 형성하는 방법.
10. The method according to claim 8 or 9,
Wherein the fibroblast is lung fibroblasts (LF), the endothelial cells are HUVECs, and the angiogenic cell line is the U87MG cell line (ATCC HTB-14 TM ).
삭제delete 삭제delete 제 1항의 미세유체칩에서 암 혈관내유입을 형성시키는 방법으로서,
(ⅰ) 섬유아세포와 피브린의 혼합물을 제 5채널에 가하고; 내피세포와 피브린의 혼합물을 제 3채널에 가하여 배양하며,
(ⅱ) 상기 배양 중에, 제 1채널 및 제 2채널이 공 채널 상태를 유지하여, 미세혈관을 형성시키고,
(ⅲ) 혈관신생 세포주를 제 1채널에 주입하고, 피브린을 제 2 채널에 주입한 후 배양하여, 암 혈관신생을 형성하며,
(iv) 상기 제 2채널의 피브린 젤에 암세포를 부착하고,
(v) 암세포 성장을 위한 배지를 제 1채널에 공급한 후, 성장인자-결핍 배지를 제 1채널에 첨가하는 것을 특징으로 하는,
생체 외에서 암 혈관내유입을 형성시키는 방법.
11. A method of forming a cancer intravascular inflow in a microfluidic chip of claim 1,
(I) adding a mixture of fibroblasts and fibrin to the fifth channel; A mixture of endothelial cells and fibrin was added to the third channel,
(Ii) during the culturing, the first channel and the second channel maintain a cochannel state to form microvessels,
(Iii) an angiogenic cell line is injected into the first channel, fibrin is injected into the second channel and then cultured to form cancer angiogenesis,
(iv) attaching cancer cells to the fibrin gel of the second channel,
(v) supplying a medium for cancer cell growth to the first channel, and then adding a growth factor-deficient medium to the first channel.
A method of forming a cancer intravascular inflow in vitro.
제 13항에 있어서,
상기 내피세포의 농도는 4x106 ~ 8x106 cells/ml인 것을 특징으로 하는, 생체 외에서 암 혈관내유입을 형성시키는 방법.
14. The method of claim 13,
Wherein the concentration of the endothelial cells is 4 x 10 6 to 8 x 10 6 cells / ml.
제 13항 또는 제 14항에 있어서,
섬유아세포가 폐섬유아세포이고, 내피세포가 HUVEC이며, 혈관신생 세포주가 U87MG 세포주(ATCC 입수)인 것을 특징으로 하는, 생체 외에서 암 혈관내유입을 형성시키는 방법.
The method according to claim 13 or 14,
Wherein the fibroblast is lung fibroblast, the endothelial cell is HUVEC, and the angiogenic cell line is U87MG cell line (ATCC obtained).
제 1항의 미세유체칩에서 항암제 약물후보물질을 스크리닝 하는 방법으로서,
(ⅰ) 섬유아세포와 피브린의 혼합물을 제 5채널에 가하고; 내피세포와 피브린의 혼합물을 제 3채널에 가하여 배양하며,
(ⅱ) 상기 배양 중에, 제 1채널 및 제 2채널이 공 채널 상태를 유지하여, 미세혈관을 형성시키고,
(ⅲ) 혈관신생 세포주 및 분석하고자 하는 시료를 제 1채널에 주입하고, 피브린을 제 2채널에 주입한 후, 배양하며,
(iv) 암 혈관신생이 형성되지 않는 경우, 상기 시료가 항암제 약물후보물질로 판단하는 것을 특징으로 하는,
생체 외에서 항암제 약물후보물질을 스크리닝하는 방법.
A method for screening an anticancer drug candidate substance in the microfluidic chip of claim 1,
(I) adding a mixture of fibroblasts and fibrin to the fifth channel; A mixture of endothelial cells and fibrin was added to the third channel,
(Ii) during the culturing, the first channel and the second channel maintain a cochannel state to form microvessels,
(Iii) injecting an angiogenic cell line and a sample to be analyzed into a first channel, injecting fibrin into a second channel,
(iv) when cancer angiogenesis is not formed, the sample is judged to be an anticancer drug candidate substance.
A method for screening an anticancer drug candidate substance in vitro.
기판 위해 배치된 혈관형성을 위한 채널, 및 상기 혈관형성을 위한 채널의 일 측면부에 인접하여 배치된 채널 및 혈관형성을 위한 채널의 다른 측면부에 인접하여 배치된 채널을 포함하는 생체 외에서 혈관형성을 위한 미세유체칩으로서,
상기 인접하는 두 개의 채널에 의해 형성되는 경계면 상에 두 개 이상의 미세구조물이 그 사이에 간극(gap)을 두고 배치되어, 각 채널이 상기 간극을 통해 각 채널에 포함된 생화학 물질들 간의 상호작용을 허용하며,
혈관형성을 위한 채널 내에서 혈관의 형성 중에, 혈관형성 채널에 인접한 다른 두 개의 채널은 공 채널 상태를 유지하는 것인,
생체 외에서 혈관형성을 위한 미세유체칩.
A channel for angiogenesis arranged for the substrate and a channel disposed adjacent one side of the channel for angiogenesis and a channel disposed adjacent to the other side of the channel for angiogenesis, As a microfluidic chip,
Two or more microstructures are disposed on a boundary surface formed by the adjacent two channels with a gap therebetween so that each channel is capable of interacting with biochemical substances included in each channel through the gap Allowed,
Wherein during angiogenesis in the channel for angiogenesis, the other two channels adjacent to the angiogenic channel maintain a cochannel state.
Microfluidic chip for vascular formation in vitro.
제 17항에 있어서,
상기 채널들 및 미세구조물의 높이가 10 ㎛ 내지 100 ㎛인 것을 특징으로 하는, 생체 외에서 혈관형성을 위한 미세유체칩.18. The method of claim 17,
Characterized in that the height of the channels and the microstructure is from 10 탆 to 100 탆.
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