JPWO2018235899A1 - 筋サテライト細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は,筋幹細胞の未分化性を保持したまま細胞を培養する方法を提供する。より具体的には、レチノイドとラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することにより,筋幹細胞の未分化性を保持したまま細胞を培養することを可能とする。レチノイドとしては例えば,atRA,AM80などが使用できる。レチノイドとラミニンを含む培地を用いて培養することにより増殖させた筋幹細胞は,細胞移植による筋ジストロフィーの治療等に利用されうる。
Description
本願は、特願2017−121787号(出願日:2017年6月22日)の優先権を主張する出願であり、これは引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
本発明は,筋幹細胞の培養方法に関する。より詳細には,筋幹細胞の未分化性を保持したまま培養する方法に関する。また,本発明は,細胞移植などに利用可能な筋幹細胞の製造方法,およびそれに用いる組成物にも関する。
骨格筋は,運動や姿勢の保持に必要であるだけでなく,最大のエネルギー利用器官として代謝調節にも重要である。また,骨格筋は再生能が高いという特徴をもつ。骨格筋は,骨格筋幹細胞(筋サテライト細胞)が活性化され,分化・融合することによって再生される(非特許文献1)。
筋ジストロフィーは筋線維の壊死と再生を繰り返しながら筋萎縮が進行する遺伝性の疾患であり,有効な治療法は未だに確立されていない。開発段階にある筋ジストロフィーの治療法としては,例えば,核酸医薬品を用いたエキソンスキッピング療法がある(非特許文献2)。核酸医薬品とならび,細胞移植治療の応用も期待されているが,in vitroで筋幹細胞を培養すると,幹細胞としての未分化性が失われ,増殖を停止してしまうことが知られている(非特許文献3)。
Comai and Tajbakhsh, Curr Top Dev Biol. 2014;110:1-73. doi: 10.1016/B978-0-12-405943-6.00001-4.
Fairclough et al., Nat Rev Genet. 2013;14(6):373-8. doi: 10. 1038/nrg3460.
Fu et al., Cell Res. 2015;25(6):655-73. doi: 10.1038/cr.2015 .58.
本発明は,筋幹細胞の未分化性を保持したまま培養する方法を提供することを目的の一つとする。また,本発明は,筋幹細胞の未分化性を保持したまま培養する方法において用いる組成物を提供することを別の目的の一つとする。
本発明者らは,レチノイドおよびラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって,筋幹細胞の未分化性を保持したまま,細胞を増殖させることが可能であることを見出した。本技術は簡便かつ安全で,高い効率で筋幹細胞の未分化性を維持できることから,筋ジストロフィーをはじめとした筋疾患に対する細胞移植治療や,化合物スクリーニング系の開発,再生医療への応用が期待される。本発明はこのような知見に基づくものであり,以下の態様を包含する:
[態様1]
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することを特徴とする,筋サテライト細胞の培養方法。
[態様2]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様1記載の培養方法。
[態様3]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様1または2記載の培養方法。
[態様4]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様1〜3のいずれか記載の培養方法。
[態様5]
培地がレチノイドおよびラミニンを含む液体培地である,態様1〜4のいずれか記載の培養方法。
[態様6]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様1〜5のいずれか記載の培養方法。
[態様7]
培地がG−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤,(R)−PFI−2およびその混合物から成る群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含む,態様1〜6のいずれか記載の培養方法。
[態様8]
筋サテライト細胞の未分化性が維持される,態様1〜7のいずれか記載の培養方法。
[態様9]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様1〜8のいずれか記載の培養方法。
[態様10]
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む液体培地を用いて細胞を培養することを特徴とする,ヒト筋サテライト細胞の培養方法であって,
レチノイドがatRAまたはAM80であり,レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mであり,
ラミニンがヒトラミニン511E8フラグメントであり,ラミニンが液体培地中に含められており,ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlであり,そして
ヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される,培養方法。
[態様11]
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む,筋サテライト細胞の筋分化を抑制するための組成物。
[態様12]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様11記載の組成物。
[態様13]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様11または12記載の組成物。
[態様14]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様11〜13のいずれか記載の組成物。
[態様15]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様11〜14のいずれか記載の組成物。
[態様16]
筋サテライト細胞の未分化性が維持される,態様11〜15のいずれか記載の組成物。
[態様17]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様11〜16のいずれか記載の組成物。
[態様18]
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む,細胞培養培地。
[態様19]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様18記載の細胞培養培地。
[態様20]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様18または19記載の細胞培養培地。
[態様21]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様18〜20のいずれか記載の細胞培養培地。
[態様22]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様18〜21のいずれか記載の細胞培養培地。
[態様23]
培地がG−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤,(R)−PFI−2およびその混合物から成る群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含む,態様18〜22のいずれか記載の細胞培養培地。
[態様24]
筋サテライト細胞の培養に用いるための態様18〜23のいずれか記載の細胞培養培地。
[態様25]
筋サテライト細胞の未分化性を維持するための態様18〜24のいずれか記載の細胞培養培地。
[態様26]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様18〜25のいずれか記載の細胞培養培地。
[態様27]
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む,細胞培養培地サプリメント。
[態様28]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様27記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様29]
細胞培養培地に加えられた際のレチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様27または28記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様30]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様27〜29のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様31]
細胞培養培地に加えられた際のラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様27〜30のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様32]
G−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤,(R)−PFI−2およびその混合物から成る群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含む,態様27〜31のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様33]
筋サテライト細胞の培養に用いるための態様27〜32のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様34]
筋サテライト細胞の未分化性を維持するための態様27〜33のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様35]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様27〜34のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様36]
細胞移植に用いるための細胞の製造方法であって,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程を含む,方法。
[態様37]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様36記載の製造方法。
[態様38]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様36または37記載の製造方法。
[態様39]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様36〜38のいずれか記載の製造方法。
[態様40]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様36〜39のいずれか記載の製造方法。
[態様41]
培地がG−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤,(R)−PFI−2およびその混合物から成る群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含む,態様36〜40のいずれか記載の製造方法。
[態様42]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様36〜41のいずれか記載の製造方法。
[態様43]
筋サテライト細胞がiPS細胞由来の細胞である,態様36〜42のいずれか記載の製造方法。
[態様44]
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である,態様36〜43のいずれか記載の製造方法。
[態様45]
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である,態様36〜44のいずれか記載の製造方法。
[態様46]
細胞が糖尿病の治療に用いるための細胞である,態様36〜45のいずれか記載の製造方法。
[態様47]
患者における疾患または傷害の治療方法であって,(i)レチノイド,および(ii)ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程,および培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を患者に移植する工程を含む,方法。
[態様48]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様47記載の治療方法。
[態様49]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様47または48記載の治療方法。
[態様50]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様47〜49のいずれか記載の治療方法。
[態様51]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様47〜50のいずれか記載の治療方法。
[態様52]
培地がG−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤,(R)−PFI−2およびその混合物から成る群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含む,態様47〜51のいずれか記載の治療方法。
[態様53]
患者がヒトである,態様47〜52のいずれか記載の治療方法。
[態様54]
疾患が筋ジストロフィー,先天性ミオパチー,遠位型ミオパチー,筋強直性疾患,炎症性筋疾患,周期性四肢麻痺,代謝性筋疾患,重症筋無力症,先天性筋無力症候群,ミトコンドリア病,サルコペニアおよび糖尿病から成る群より選択される,態様47〜53のいずれか記載の治療方法。
[態様55]
筋サテライト細胞がiPS細胞由来の細胞である,態様47〜54のいずれか記載の治療方法。
[態様56]
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である,態様47〜55のいずれか記載の治療方法。
[態様57]
少なくとも5×105個の筋サテライト細胞を含む,細胞組成物。
[態様58]
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンをさらに含む,態様57記載の細胞組成物。
[態様59]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様57または58記載の細胞組成物。
[態様60]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様57〜59のいずれか記載の細胞組成物。
[態様61]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様57〜60のいずれか記載の細胞組成物。
[態様62]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様57〜61のいずれか記載の細胞組成物。
[態様63]
筋サテライト細胞の純度が少なくとも85%である,態様57〜62のいずれか記載の細胞組成物。
[態様64]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様57〜63のいずれか記載の細胞組成物。
[態様65]
筋サテライト細胞がiPS細胞由来の細胞である,態様57〜64のいずれか記載の細胞組成物。
[態様66]
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である,態様57〜65のいずれか記載の細胞組成物。
[態様67]
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である,態様57〜66のいずれか記載の細胞組成物。
[態様68]
凍結されている,態様57〜67のいずれか記載の細胞組成物。
[態様69]
1つの容器に納められている,態様57〜68のいずれか記載の細胞組成物。
[態様70]
筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化,増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって,
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンの存在下で筋サテライト細胞を培養する工程,
培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞に試験物質を接触させる工程,
試験物質が筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化,増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む,方法。
[態様71]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様70記載のスクリーニング方法。
[態様72]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様70または71記載のスクリーニング方法。
[態様73]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様70〜72のいずれか記載のスクリーニング方法。
[態様74]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様70〜73のいずれか記載のスクリーニング方法。
[態様75]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様70〜74のいずれか記載のスクリーニング方法。
[態様76]
筋サテライト細胞がiPS細胞由来の細胞である,態様70〜75のいずれか記載のスクリーニング方法。
[態様77]
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である,態様70〜76のいずれか記載のスクリーニング方法。
[態様78]
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である,態様70〜77のいずれか記載のスクリーニング方法。
[態様1]
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することを特徴とする,筋サテライト細胞の培養方法。
[態様2]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様1記載の培養方法。
[態様3]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様1または2記載の培養方法。
[態様4]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様1〜3のいずれか記載の培養方法。
[態様5]
培地がレチノイドおよびラミニンを含む液体培地である,態様1〜4のいずれか記載の培養方法。
[態様6]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様1〜5のいずれか記載の培養方法。
[態様7]
培地がG−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤,(R)−PFI−2およびその混合物から成る群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含む,態様1〜6のいずれか記載の培養方法。
[態様8]
筋サテライト細胞の未分化性が維持される,態様1〜7のいずれか記載の培養方法。
[態様9]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様1〜8のいずれか記載の培養方法。
[態様10]
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む液体培地を用いて細胞を培養することを特徴とする,ヒト筋サテライト細胞の培養方法であって,
レチノイドがatRAまたはAM80であり,レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mであり,
ラミニンがヒトラミニン511E8フラグメントであり,ラミニンが液体培地中に含められており,ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlであり,そして
ヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される,培養方法。
[態様11]
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む,筋サテライト細胞の筋分化を抑制するための組成物。
[態様12]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様11記載の組成物。
[態様13]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様11または12記載の組成物。
[態様14]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様11〜13のいずれか記載の組成物。
[態様15]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様11〜14のいずれか記載の組成物。
[態様16]
筋サテライト細胞の未分化性が維持される,態様11〜15のいずれか記載の組成物。
[態様17]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様11〜16のいずれか記載の組成物。
[態様18]
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む,細胞培養培地。
[態様19]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様18記載の細胞培養培地。
[態様20]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様18または19記載の細胞培養培地。
[態様21]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様18〜20のいずれか記載の細胞培養培地。
[態様22]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様18〜21のいずれか記載の細胞培養培地。
[態様23]
培地がG−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤,(R)−PFI−2およびその混合物から成る群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含む,態様18〜22のいずれか記載の細胞培養培地。
[態様24]
筋サテライト細胞の培養に用いるための態様18〜23のいずれか記載の細胞培養培地。
[態様25]
筋サテライト細胞の未分化性を維持するための態様18〜24のいずれか記載の細胞培養培地。
[態様26]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様18〜25のいずれか記載の細胞培養培地。
[態様27]
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む,細胞培養培地サプリメント。
[態様28]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様27記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様29]
細胞培養培地に加えられた際のレチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様27または28記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様30]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様27〜29のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様31]
細胞培養培地に加えられた際のラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様27〜30のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様32]
G−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤,(R)−PFI−2およびその混合物から成る群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含む,態様27〜31のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様33]
筋サテライト細胞の培養に用いるための態様27〜32のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様34]
筋サテライト細胞の未分化性を維持するための態様27〜33のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様35]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様27〜34のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
[態様36]
細胞移植に用いるための細胞の製造方法であって,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程を含む,方法。
[態様37]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様36記載の製造方法。
[態様38]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様36または37記載の製造方法。
[態様39]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様36〜38のいずれか記載の製造方法。
[態様40]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様36〜39のいずれか記載の製造方法。
[態様41]
培地がG−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤,(R)−PFI−2およびその混合物から成る群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含む,態様36〜40のいずれか記載の製造方法。
[態様42]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様36〜41のいずれか記載の製造方法。
[態様43]
筋サテライト細胞がiPS細胞由来の細胞である,態様36〜42のいずれか記載の製造方法。
[態様44]
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である,態様36〜43のいずれか記載の製造方法。
[態様45]
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である,態様36〜44のいずれか記載の製造方法。
[態様46]
細胞が糖尿病の治療に用いるための細胞である,態様36〜45のいずれか記載の製造方法。
[態様47]
患者における疾患または傷害の治療方法であって,(i)レチノイド,および(ii)ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程,および培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を患者に移植する工程を含む,方法。
[態様48]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様47記載の治療方法。
[態様49]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様47または48記載の治療方法。
[態様50]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様47〜49のいずれか記載の治療方法。
[態様51]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様47〜50のいずれか記載の治療方法。
[態様52]
培地がG−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤,(R)−PFI−2およびその混合物から成る群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含む,態様47〜51のいずれか記載の治療方法。
[態様53]
患者がヒトである,態様47〜52のいずれか記載の治療方法。
[態様54]
疾患が筋ジストロフィー,先天性ミオパチー,遠位型ミオパチー,筋強直性疾患,炎症性筋疾患,周期性四肢麻痺,代謝性筋疾患,重症筋無力症,先天性筋無力症候群,ミトコンドリア病,サルコペニアおよび糖尿病から成る群より選択される,態様47〜53のいずれか記載の治療方法。
[態様55]
筋サテライト細胞がiPS細胞由来の細胞である,態様47〜54のいずれか記載の治療方法。
[態様56]
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である,態様47〜55のいずれか記載の治療方法。
[態様57]
少なくとも5×105個の筋サテライト細胞を含む,細胞組成物。
[態様58]
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンをさらに含む,態様57記載の細胞組成物。
[態様59]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様57または58記載の細胞組成物。
[態様60]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様57〜59のいずれか記載の細胞組成物。
[態様61]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様57〜60のいずれか記載の細胞組成物。
[態様62]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様57〜61のいずれか記載の細胞組成物。
[態様63]
筋サテライト細胞の純度が少なくとも85%である,態様57〜62のいずれか記載の細胞組成物。
[態様64]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様57〜63のいずれか記載の細胞組成物。
[態様65]
筋サテライト細胞がiPS細胞由来の細胞である,態様57〜64のいずれか記載の細胞組成物。
[態様66]
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である,態様57〜65のいずれか記載の細胞組成物。
[態様67]
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である,態様57〜66のいずれか記載の細胞組成物。
[態様68]
凍結されている,態様57〜67のいずれか記載の細胞組成物。
[態様69]
1つの容器に納められている,態様57〜68のいずれか記載の細胞組成物。
[態様70]
筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化,増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって,
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンの存在下で筋サテライト細胞を培養する工程,
培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞に試験物質を接触させる工程,
試験物質が筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化,増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む,方法。
[態様71]
レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびその混合物から成る群より選択される,態様70記載のスクリーニング方法。
[態様72]
レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,態様70または71記載のスクリーニング方法。
[態様73]
ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびその混合物から成る群より選択される,態様70〜72のいずれか記載のスクリーニング方法。
[態様74]
ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,態様70〜73のいずれか記載のスクリーニング方法。
[態様75]
筋サテライト細胞がヒトの細胞である,態様70〜74のいずれか記載のスクリーニング方法。
[態様76]
筋サテライト細胞がiPS細胞由来の細胞である,態様70〜75のいずれか記載のスクリーニング方法。
[態様77]
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である,態様70〜76のいずれか記載のスクリーニング方法。
[態様78]
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である,態様70〜77のいずれか記載のスクリーニング方法。
上述のとおり,レチノイドとラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって,筋幹細胞の未分化性を保持したまま,細胞を増殖させることが可能であることが見出された。以下に,本発明を詳細に説明する。
筋幹細胞(筋サテライト細胞)
骨格筋の組織幹細胞は,筋幹細胞あるいは筋サテライト細胞と呼ばれる小さな多能性の細胞であり,基底膜と筋鞘の間に存在している。筋サテライト細胞は,通常は細胞周期の静止期にとどまり未分化状態を維持しているが,骨格筋に何らかの損傷を受けると活性化して***し,筋芽細胞へと分化し,筋管を形成して筋線維を再生させる。
骨格筋の組織幹細胞は,筋幹細胞あるいは筋サテライト細胞と呼ばれる小さな多能性の細胞であり,基底膜と筋鞘の間に存在している。筋サテライト細胞は,通常は細胞周期の静止期にとどまり未分化状態を維持しているが,骨格筋に何らかの損傷を受けると活性化して***し,筋芽細胞へと分化し,筋管を形成して筋線維を再生させる。
静止期の未分化の筋サテライト細胞は,Pax7の発現を指標として同定することができる。筋サテライト細胞の活性化により筋芽細胞が分化するにつれて,Pax7の発現は減少し,MyoDの発現が上昇する。さらに,筋芽細胞が筋管を形成するのに伴い,ミオゲニンの発現が上昇する。また,筋細胞が融合した筋管は,抗ミオシン重鎖抗体による免疫染色により可視化することができる。
細胞の形態に関しては,未分化の筋サテライト細胞は丸い形態を示すのに対し,分化の進んだ細胞は扁平で巨大な形態を示すことから,未分化の筋サテライト細胞を同定することができる。
本発明において用いる筋サテライト細胞は,動物の筋サテライト細胞であることが好ましく,哺乳動物の筋サテライト細胞であることがより好ましく,マウス,ラット,ブタ,ウサギ,サルまたはヒトの筋サテライト細胞であることがさらに好ましく,ヒトまたはマウスの筋サテライト細胞であることがさらに好ましく,ヒトの筋サテライト細胞であることが特に好ましい。
本発明において用いる筋サテライト細胞は,動物の組織から単離することができる。単離方法としては,(i)0.14%プロテアーゼ(Sigma-Aldrich社)を含むDMEM培地で37°C,30分間処理し,DMEM培地による洗浄を行った後に播種する方法,(ii)酵素消化後にフローサイトメーター(BD社,AriaII)により単離する方法(Exp Cell Res. 10, 245-255, 2004; Nat Med. 20, 255-264,2014)などが挙げられるが,これらに限定はされない。組織から筋サテライト細胞を分離する方法は,当業者には公知であり,例えば,Fukada et al. Exp Cell Res2004;296:245-255.を参照してもよい。
本発明において用いる筋サテライト細胞は,動物のES細胞,iPS細胞や,他の幹細胞から作製してもよい。なお,iPS細胞等から誘導された細胞は,「サテライト細胞様」筋幹細胞であり得るが,本願においては,これも筋サテライト細胞に含まれるものとみなす。
レチノイド
レチノイドとは,ビタミンAまたはそれに化学的に関連する一群の化合物のことをいう。ビタミンAとは,レチノール,レチナール,レチノイン酸(これらをビタミンA1と呼ぶ)およびこれらの3−デヒドロ体(ビタミンA2と呼ぶ)と,その誘導体の総称で,ビタミンの中の脂溶性ビタミンに分類される。レチノイドは,上皮細胞の増殖を調節する医薬として使用されている。レチノイドは,視力における役割,細胞増殖および分化の調節,骨組織の増殖,免疫機能,および腫瘍抑制遺伝子の活性化など,全身において多くの重要な機能を有している。本発明者らは,レチノイドとラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって,筋幹細胞の未分化性を保持したまま,細胞を増殖させることが可能であることを見出した。本発明において使用されうるレチノイドには,トレチノイン,タミバロテンなどが含まれるが,これらに限定はされない。
レチノイドとは,ビタミンAまたはそれに化学的に関連する一群の化合物のことをいう。ビタミンAとは,レチノール,レチナール,レチノイン酸(これらをビタミンA1と呼ぶ)およびこれらの3−デヒドロ体(ビタミンA2と呼ぶ)と,その誘導体の総称で,ビタミンの中の脂溶性ビタミンに分類される。レチノイドは,上皮細胞の増殖を調節する医薬として使用されている。レチノイドは,視力における役割,細胞増殖および分化の調節,骨組織の増殖,免疫機能,および腫瘍抑制遺伝子の活性化など,全身において多くの重要な機能を有している。本発明者らは,レチノイドとラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって,筋幹細胞の未分化性を保持したまま,細胞を増殖させることが可能であることを見出した。本発明において使用されうるレチノイドには,トレチノイン,タミバロテンなどが含まれるが,これらに限定はされない。
トレチノイン(オールトランスレチノイン酸(atRA)ともいう)は,ビタミンA誘導体の一種であり,レチノイン酸のうち,二重結合がすべてトランス型をとった,オール・トランス異性体である。
タミバロテン(AM80,レチノ安息香酸ともいう)は,合成レチノイドであり,トレチノイン(ATRA)耐性急性前骨髄球性白血病(APL)に対する化学療法剤として用いられる経口剤である。
本発明において使用されうるレチノイドには,RARアゴニストが含まれ,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80などの他のRARアゴニストも含まれる。本発明において使用されうるレチノイドとしては他に,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003なども挙げられる。
ラミニン
ラミニンは,細胞外マトリクスの高分子量タンパク質(およそ400〜900kDa)であり,基底膜の主要な構成要素となっている。ラミニンは,基底膜の重要な成分であり,細胞の分化,遊走,および接着に影響を及ぼす。ラミニンは,α鎖,β鎖およびγ鎖を含むヘテロ三量体タンパク質であり,15種類のアイソフォームを形成しうる5種のα鎖,3種のβ鎖,および3種のγ鎖が特定されている。
ラミニンは,細胞外マトリクスの高分子量タンパク質(およそ400〜900kDa)であり,基底膜の主要な構成要素となっている。ラミニンは,基底膜の重要な成分であり,細胞の分化,遊走,および接着に影響を及ぼす。ラミニンは,α鎖,β鎖およびγ鎖を含むヘテロ三量体タンパク質であり,15種類のアイソフォームを形成しうる5種のα鎖,3種のβ鎖,および3種のγ鎖が特定されている。
ラミニン分子は各鎖の組成に従って命名される。本明細書においては,例えば,α5鎖,β1鎖及びγ1鎖から構成されるラミニンを「ラミニンα5β1γ1」または「ラミニン511」と記載する。その他の14種類のアイソフォームは,ラミニン111,ラミニン211,ラミニン121,ラミニン221,ラミニン332,ラミニン311,ラミニン321,ラミニン411,ラミニン421,ラミニン521,ラミニン213,ラミニン423,ラミニン522,ラミニン523と記載される。ラミニンは,全長であってもよいしその一部であってもよく,例えば,ラミニン511は,そのα5鎖,β1鎖及びγ1鎖のそれぞれが,互いに独立に,全長であってもよいしその一部であってもよい。ラミニンは,組換えタンパク質の製造および精製が容易であることからE8フラグメントであることが好ましく,実用化の観点からヒトラミニンのE8フラグメントであることがさらに好ましい。
本明細書においては,ラミニンのE8フラグメントのことを単に「ラミニンE8」と記載することもあり,また,例えば,ラミニン511のE8フラグメントのことを「ラミニン511E8」とも記載する(他のラミニンのアイソフォームについても同様)。なお,単に「ラミニンE8」と記載したときは,ラミニンのアイソフォームは限定されず,いずれのアイソフォームのラミニンのE8フラグメントであってもよいものとする。
ヒトラミニン511タンパク質のE8フラグメントは,ES細胞およびiPS細胞を含む幹細胞の培養用基質として,スライドガラスやシャーレなどの培養容器の表面をコーティングすることにより使用されている。本発明者らは,予想外なことに,ラミニンを培養容器底面のコーティングとして用いるのではなく,液体培養培地中にレチノイドと共に含めることによって,筋幹細胞の未分化性を保持したまま,効率的に細胞を増殖させることが可能であることを見出した。このようなレチノイドとラミニンとの組み合わせにより,予想を超える相乗的な効果を得ることができる。なお,ラミニンの液体培地への添加と培養容器表面のコーティングとの併用は,排除されない。
ラミニンのE8フラグメントは,マウスラミニンα1β1γ1(以下,「マウスラミニン111」とも記す。)をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で,強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである(Edgar D., Timpl R., Thoe nen H. The heparin-binding domainof laminin is responsible for its effects on ne urite outgrowth and neuronal survival. EMBO J., 3:1463-1468,1984.,Goodman SL.,
Deutzmann R., von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin canin dependently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105: 589-598,1987.)。例えば,ヒトラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン111のE8フラグメント(マウスラミニン111E8)に相当するフラグメントの存在が推定されるが,これらを分離・同定したことは報告されていない。したがって,本発明に用いられるヒトラミニンのE8フラグメントは,対応するヒトラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく,マウスラミニン111E8と同様の細胞接着活性を有し,同様の構造を有し,同程度の分子量を有するヒトラミニンのフラグメントであればよい。
Deutzmann R., von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin canin dependently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105: 589-598,1987.)。例えば,ヒトラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン111のE8フラグメント(マウスラミニン111E8)に相当するフラグメントの存在が推定されるが,これらを分離・同定したことは報告されていない。したがって,本発明に用いられるヒトラミニンのE8フラグメントは,対応するヒトラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく,マウスラミニン111E8と同様の細胞接着活性を有し,同様の構造を有し,同程度の分子量を有するヒトラミニンのフラグメントであればよい。
ラミニンのE8フラグメントの製造方法は特に限定されず,例えば,ラミニンの所望のアイソフォームの全長をエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し,目的のフラグメントを分取,精製する方法や,組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。製造量,品質の均一性,製造コスト等の観点から,組換えタンパク質として製造することが好ましい。
組換えヒトラミニン(全長またはその一部)は,公知の配列情報と,公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えヒトラミニン511E8の製造方法を例として以下説明する。組換えヒトラミニン511E8の製造方法としては,例えば,ヒトラミニン511E8のα鎖,β鎖およびγ鎖の各タンパク質をコードするDNAをそれぞれ取得し,これをそれぞれ発現ベクターに挿入し,得られた3種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ,3量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造できる。例えば,Idoら(Hiroyuki Ido, Aya Nakamu ra, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Se kiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position fr om the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins ” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154,2007.)に記載の方法に従って作製することができるが,これに限定されるものではない。例えばヒトラミニン511を構成するα5鎖,β1鎖,γ1鎖をそれぞれコードする遺伝子(cDNA)の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は,公知のデータベース(GenBank等)から取得することができる。ラミニンは例えば,これら特定のアミノ酸配列において,少なくとも1個のアミノ酸が欠失,置換及び/又は付加されたタンパク質であってもよい。
ラミニンは,例えば,株式会社ニッピ(東京,日本)から市販されている培養基質iMatrix511−E8またはiMatrix511−E8−silkを用いることができる。iMatrix511−E8は,ヒトラミニン511−E8フラグメントと同一の配列を有する,遺伝子組換えCHO−S細胞由来の組換えタンパク質である。iMatrix511−E8−silkは,ヒトラミニン511−E8フラグメントと同一の配列を有する,遺伝子組換えカイコ生産系由来の組換えタンパク質である。
細胞培養方法
本発明の一つの態様は,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することを特徴とする,筋サテライト細胞の培養方法に関する。細胞の培養は,例えば,増殖培地(20%ウシ胎児血清,ペニシリン・ストレプトマイシン,2〜10ng/ml最終濃度のbFGFを添加したDMEM)を用いて,5%CO2インキュベーター内で37℃にて行うことができる。培地の組成,培養条件(温度,期間等)は,当業者であれば適宜調整することができる。培地には,G−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤(例えば,Stem cell reports, 2015, 5, p621-632に記載のSB203580),または(R)−PFI−2(Cell stem cell 22, 177-190, 2018)などの他の因子がさらに含まれていてもよい。培養容器としては,例えば,シャーレ,細胞培養皿,細胞培養フラスコなどを使用することができる。
本発明の一つの態様は,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することを特徴とする,筋サテライト細胞の培養方法に関する。細胞の培養は,例えば,増殖培地(20%ウシ胎児血清,ペニシリン・ストレプトマイシン,2〜10ng/ml最終濃度のbFGFを添加したDMEM)を用いて,5%CO2インキュベーター内で37℃にて行うことができる。培地の組成,培養条件(温度,期間等)は,当業者であれば適宜調整することができる。培地には,G−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤(例えば,Stem cell reports, 2015, 5, p621-632に記載のSB203580),または(R)−PFI−2(Cell stem cell 22, 177-190, 2018)などの他の因子がさらに含まれていてもよい。培養容器としては,例えば,シャーレ,細胞培養皿,細胞培養フラスコなどを使用することができる。
また,筋サテライト細胞の培養時には,酸素濃度を適宜調整することができる。例えば,O2の濃度は,少なくとも0.5%以上,1%以上,2%以上,3%以上,4%以上,5%以上,6%以上のいずれかの濃度とすることができる。また,O2は10%以下,8%以下,6%以下,5%以下,4%以下,3%以下とすることができる。O2濃度は,上記の上限および下限の任意の組み合わせ,例えば,1%〜5%の範囲,好ましくは2%〜4%の範囲とすることができる。ヒト細胞の培養の場合,好適なO2濃度は例えば2.5〜3.5%,より具体的には3%である。よって,ヒト細胞の培養は,例えば,増殖培地(20%ウシ胎児血清,ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸,2.5ng/ml最終濃度のbFGFを添加したDMEM,High Glucoseを用いて37℃,3%O2, 5%CO2インキュベーター内で行うことができる。このように,本発明の一つの態様は,2〜4%の酸素濃度,好ましくは3%O2の存在下で細胞を培養することを特徴とする,筋サテライト細胞の培養方法に関する。
レチノイドは,少なくとも10−13M以上,10−12M以上,10−11M以上,10−10M以上,10−9M以上,10−8M以上,10−7M以上,10−6M以上,10−5M以上,10−4M以上,10−3M以上のいずれかの濃度で培地に添加することができる。また,レチノイドは,10−2M未満,10−3M未満,10−4M未満,10−5M未満,10−6M未満,10−7M未満,10−8M未満,10−9M未満,10−10M未満,10−11M未満,10−12M未満のいずれかの濃度で添加することができる。よって,レチノイドは,上記の上限および下限の任意の組み合わせ,例えば,10−11M〜10−5Mの濃度範囲,好ましくは10−10M〜10−6Mの濃度範囲,10−9M〜10−7Mの濃度範囲のいずれかの濃度で添加することができる。好適なレチノイドの添加濃度は例えば,10−8Mまたは10−7Mである。
本発明の一部の態様では,10−8Mまたは10−7MのatRAまたはAM80を使用することができる。
ラミニンは,培養容器の底面積に基づき,少なくとも0.01μg/cm2以上,0.05μg/cm2以上,0.1μg/cm2以上,0.2μg/cm2以上,0.3μg/cm2以上,0.4μg/cm2以上,0.5μg/cm2以上,0.6μg/cm2以上,0.7μg/cm2以上,0.8μg/cm2以上,0.9μg/cm2以上,1.0μg/cm2以上,1.5μg/cm2以上,2.0μg/cm2以上のいずれかの濃度で培地に添加あるいは培養容器にコーティングすることができる。また,レチノイドは,5.0μg/cm2未満,2.0μg/cm2未満,1.5μg/cm2未満,1.0μg/cm2未満,0.9μg/cm2未満,0.8μg/cm2未満,0.7μg/cm2未満,0.6μg/cm2未満,0.5μg/cm2未満,0.4μg/cm2未満,0.3μg/cm2未満,0.2μg/cm2未満,0.1μg/cm2未満,0.05μg/cm2未満のいずれかの濃度で培地に添加あるいは培養容器にコーティングすることができる。よって,レチノイドは,上記の上限および下限の任意の組み合わせ,例えば,0.01μg/cm2〜5.0μg/cm2の濃度範囲,好ましくは0.1μg/cm2〜1.0μg/cm2の濃度範囲,0.2μg/cm2〜0.5μg/cm2の濃度範囲のいずれかの濃度で培地に添加あるいは培養容器にコーティングすることができる。好適なラミニンの使用濃度は例えば,0.2μg/cm2または0.5μg/cm2である。
ラミニンは,液体培地中における濃度の観点では,少なくとも0.1μg/ml以上,0.5μg/ml以上,1.0μg/ml以上,1.5μg/ml以上,2.0μg/ml以上,3.0μg/ml以上,4.0μg/ml以上,5.0μg/ml以上,6.0μg/ml以上,7.0μg/ml以上,8.0μg/ml以上,9.0μg/ml以上,10.0μg/ml以上のいずれかの濃度で培地に添加することができる。また,レチノイドは,15.0μg/ml未満,10.0μg/ml未満,9.0μg/ml未満,8.0μg/ml未満,7.0μg/ml未満,6.0μg/ml未満,5.0μg/ml未満,4.0μg/ml未満,3.0μg/ml未満,2.0μg/ml未満,1.5μg/ml未満,1.0μg/ml未満,0.5μg/ml未満,0.1μg/ml未満,0.05μg/ml未満のいずれかの濃度で培地に添加することができる。よって,レチノイドは,上記の上限および下限の任意の組み合わせ,例えば,0.05μg/ml〜15.0μg/mlの濃度範囲,好ましくは1.0μg/ml〜10.0μg/mlの濃度範囲,1.5μg/ml〜5.0μg/mlの濃度範囲のいずれかの濃度で添加することができる。本発明において0.2μg/cm2のラミニン濃度は,1.5〜2μg/mlに相当する。よって,好適なラミニンの添加濃度は例えば,1.5μg/ml,2.0μg/mlまたは5.0μg/mlである。
本発明の一部の態様では,0.2μg/cm2または0.5μg/cm2のヒトラミニン511E8フラグメントを使用することができる。本発明の一部の態様では,1.5μg/ml,2.0μg/mlまたは5.0μg/mlのヒトラミニン511E8フラグメントを使用することができる。
分化抑制剤
本発明の一つの態様は,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含むことを特徴とする,筋サテライト細胞の筋分化を抑制するための組成物に関する。このような組成物を培地に加えて筋サテライト細胞,好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより,細胞の筋分化を抑制しながら細胞を増殖させることができる。このような組成物は,分化抑制剤と呼ぶこともできる。使用するレチノイド,ラミニンおよび組成物中の他の成分の種類,濃度等は,本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。
本発明の一つの態様は,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含むことを特徴とする,筋サテライト細胞の筋分化を抑制するための組成物に関する。このような組成物を培地に加えて筋サテライト細胞,好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより,細胞の筋分化を抑制しながら細胞を増殖させることができる。このような組成物は,分化抑制剤と呼ぶこともできる。使用するレチノイド,ラミニンおよび組成物中の他の成分の種類,濃度等は,本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。
分化誘導
本発明に係る分化抑制剤を含む培地を用いて増殖させた筋サテライト細胞をin vitroで筋肉細胞に分化させるためには,培地を本発明に係る分化抑制剤を含まない分化培地(例えば,2%ウマ血清,ペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM)に交換して,細胞を培養することができる。
本発明に係る分化抑制剤を含む培地を用いて増殖させた筋サテライト細胞をin vitroで筋肉細胞に分化させるためには,培地を本発明に係る分化抑制剤を含まない分化培地(例えば,2%ウマ血清,ペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM)に交換して,細胞を培養することができる。
培地組成物
本発明の一つの態様は,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含むことを特徴とする,細胞培養培地に関する。このような培地を用いて筋サテライト細胞,好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより,筋サテライト細胞の未分化性を維持しながら細胞を増殖させることができる。使用するレチノイド,ラミニンおよび培地組成物中の他の成分の種類,濃度等は,本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。本発明の一つの態様は,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む,ヒト筋サテライト細胞を培養するための液体細胞培養培地であって,レチノイドがatRAまたはAM80であり,レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mであり,ラミニンがヒトラミニン511E8フラグメントであり,ラミニンが液体培地中に含められており,ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlであり,そして,培地中で培養されたヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される,細胞培養培地に関する。
本発明の一つの態様は,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含むことを特徴とする,細胞培養培地に関する。このような培地を用いて筋サテライト細胞,好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより,筋サテライト細胞の未分化性を維持しながら細胞を増殖させることができる。使用するレチノイド,ラミニンおよび培地組成物中の他の成分の種類,濃度等は,本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。本発明の一つの態様は,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む,ヒト筋サテライト細胞を培養するための液体細胞培養培地であって,レチノイドがatRAまたはAM80であり,レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mであり,ラミニンがヒトラミニン511E8フラグメントであり,ラミニンが液体培地中に含められており,ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlであり,そして,培地中で培養されたヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される,細胞培養培地に関する。
培地サプリメント
本発明の一つの態様は,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含むことを特徴とする,細胞培養培地サプリメントに関する。このようなサプリメントを培養培地に加えて筋サテライト細胞,好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより,細胞の筋分化を抑制しながら細胞を増殖させることができる。使用するレチノイド,ラミニンおよびサプリメント中の他の成分の種類,濃度等は,本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。本サプリメントは,液体の形態であっても,粉末の形態であってもよい。本培地サプリメントは,筋サテライト細胞の培養に使用するキットに要素の一つとして含められてもよい。
本発明の一つの態様は,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含むことを特徴とする,細胞培養培地サプリメントに関する。このようなサプリメントを培養培地に加えて筋サテライト細胞,好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより,細胞の筋分化を抑制しながら細胞を増殖させることができる。使用するレチノイド,ラミニンおよびサプリメント中の他の成分の種類,濃度等は,本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。本サプリメントは,液体の形態であっても,粉末の形態であってもよい。本培地サプリメントは,筋サテライト細胞の培養に使用するキットに要素の一つとして含められてもよい。
本細胞培養培地サプリメントは,例えば,細胞培養培地に加えられた際のレチノイドの濃度が少なくとも10−8Mとなるように調製されうる。また,本細胞培養培地サプリメントは,例えば,細胞培養培地に加えられた際のラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlとなるように調製されうる。本細胞培養培地サプリメントは,G−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤(例えば,Stem cell reports, 2015, 5, p621-632に記載のSB203580),(R)−PFI−2(Cell stem cell 22, 177-190, 2018)およびその混合物から成る群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含んでいてもよい。
細胞製造方法
本発明の一つの態様は,細胞移植に用いるための細胞の製造方法であって,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程を含むことを特徴とする,細胞の製造方法に関する。培養する筋サテライト細胞は,当業者に公知の任意の方法を用いて調製することができる。使用する培地の組成,培養条件(温度,期間等)は,当業者であれば適宜調整することができる。
本発明の一つの態様は,細胞移植に用いるための細胞の製造方法であって,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程を含むことを特徴とする,細胞の製造方法に関する。培養する筋サテライト細胞は,当業者に公知の任意の方法を用いて調製することができる。使用する培地の組成,培養条件(温度,期間等)は,当業者であれば適宜調整することができる。
細胞の移植は,例えば,損傷した部位の再生を目的として,あるいは機能の低下した臓器・組織の再生を目的として行うことができる。移植の対象は,好ましくはヒトであるが,特に限定はされない。ヒトに対して移植を行う場合は,細胞の培養にはGMPグレードの試薬が用いられる。本製造方法において用いられる筋サテライト細胞は,CRISPR/Cas系などのゲノム編集技術等によって遺伝子を改変した細胞であってもよい。
細胞組成物
本発明の一つの態様は,少なくとも105個の筋サテライト細胞を含む細胞組成物に関する。従来,筋サテライト細胞を未分化状態を維持したまま増殖させて大量に得ることは困難であったが,このような細胞組成物は,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養することにより調製されうる。本細胞組成物は,少なくとも105個,例えば,106個以上,好ましくは107個以上,より好ましくは108個以上,さらに好ましくは109個以上の筋サテライト細胞を含む。なお,本細胞組成物には筋サテライト細胞以外の細胞が混入していても良いが,筋サテライト細胞の純度が高いことが好ましい。本細胞組成物における筋サテライト細胞の純度は,少なくとも50%以上,好ましくは80%以上,より好ましくは85%以上,90%以上,または95%以上である。本細胞組成物に含まれる細胞は,好ましくはヒトの細胞であるが,特に限定はされない。本発明の一つの態様では,筋サテライト細胞を含む細胞組成物は1つの容器に納められている。
本発明の一つの態様は,少なくとも105個の筋サテライト細胞を含む細胞組成物に関する。従来,筋サテライト細胞を未分化状態を維持したまま増殖させて大量に得ることは困難であったが,このような細胞組成物は,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養することにより調製されうる。本細胞組成物は,少なくとも105個,例えば,106個以上,好ましくは107個以上,より好ましくは108個以上,さらに好ましくは109個以上の筋サテライト細胞を含む。なお,本細胞組成物には筋サテライト細胞以外の細胞が混入していても良いが,筋サテライト細胞の純度が高いことが好ましい。本細胞組成物における筋サテライト細胞の純度は,少なくとも50%以上,好ましくは80%以上,より好ましくは85%以上,90%以上,または95%以上である。本細胞組成物に含まれる細胞は,好ましくはヒトの細胞であるが,特に限定はされない。本発明の一つの態様では,筋サテライト細胞を含む細胞組成物は1つの容器に納められている。
本細胞組成物は,例えば,治療を目的とした移植に用いることができる。細胞の移植は,例えば,損傷した部位の再生を目的として,あるいは機能の低下した組織の再生を目的として行うことができる。移植の対象は,好ましくはヒトであるが,特に限定はされない。本発明の一つの態様は,疾患または傷害の治療に用いるための,少なくとも105個,例えば,106個以上,好ましくは107個以上,より好ましくは108個以上,さらに好ましくは109個以上の筋サテライト細胞を含む細胞組成物に関する。治療の対象となる疾患は例えば,筋ジストロフィー,先天性ミオパチー,遠位型ミオパチー,筋強直性疾患,炎症性筋疾患,周期性四肢麻痺,代謝性筋疾患,重症筋無力症,先天性筋無力症候群,ミトコンドリア病,およびサルコペニアであるが,これらに限定はされない。
本細胞組成物に含まれる筋サテライト細胞は,何らかの疾患を有する患者,または疾患を発症する遺伝的素因を有する被験者に由来する細胞であってもよい。疾患は例えば,筋ジストロフィーである。このような疾患に関連する細胞組成物は,医薬品の開発を目的としたスクリーニングやアッセイに用いることができる。
筋サテライト細胞は,CRISPR/Cas系などのゲノム編集技術等によって遺伝子を改変した細胞であってもよい。筋サテライト細胞はiPS細胞由来の細胞であってもよい。
また,本発明の一つの態様は,少なくとも5×105個,例えば,106個以上,好ましくは107個以上,より好ましくは108個以上,さらに好ましくは109個以上の筋サテライト細胞の封入されたバイアルまたは容器に関する。バイアルまたは容器は,ガラス製またはプラチック製でありうる。バイアルまたは容器中の細胞は,凍結状態または反凍結状態であってもよい。
治療方法
本発明の一つの態様は,患者における疾患または傷害の治療方法であって,(i)レチノイド,および(ii)ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程,および,培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を患者に移植する工程を含む,治療方法に関する。
本発明の一つの態様は,患者における疾患または傷害の治療方法であって,(i)レチノイド,および(ii)ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程,および,培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を患者に移植する工程を含む,治療方法に関する。
培養する筋サテライト細胞は,当業者に公知の任意の方法を用いて調製することができる。筋サテライト細胞は,CRISPR/Cas系などのゲノム編集技術等によって遺伝子を改変した細胞であってもよい。筋サテライト細胞はiPS細胞由来の細胞であってもよい。筋サテライト細胞に由来する細胞とは,筋サテライト細胞から分化した細胞を含む。使用する培地の組成,培養条件(温度,期間等)は,当業者であれば適宜調整することができる。
細胞の移植は,例えば,損傷した部位の再生を目的として,あるいは機能の低下した臓器・組織の再生を目的として行うことができる。移植の対象となる患者は,好ましくはヒトであるが,特に限定はされない。治療の対象は,イヌ,ネコ,サルなどを含む非ヒト哺乳動物であってもよい。治療の対象となる疾患は例えば,筋ジストロフィー,先天性ミオパチー,遠位型ミオパチー,筋強直性疾患,炎症性筋疾患,周期性四肢麻痺,代謝性筋疾患,重症筋無力症,先天性筋無力症候群,ミトコンドリア病,およびサルコペニアであるが,これらに限定はされない。治療の対象となる疾患には例えば,糖尿病も含まれる。疾患または傷害の治療に有効な物質を分泌するように遺伝子改変した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を体内に埋め込むことにより,疾患を治療することも可能である。
移植は,例えば,移植部位に細胞を直接注入することにより行うことができる。あるいは,細胞を例えばスキャフォールド上で培養し,スキャフォールドと細胞を共に体内に移植してもよい。
スクリーニング方法
本発明の一つの態様は,筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化,増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンの存在下で筋サテライト細胞を培養する工程,培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞に試験物質を接触させる工程,試験物質が筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化,増殖または生存に影響するか否かを評価する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
本発明の一つの態様は,筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化,増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンの存在下で筋サテライト細胞を培養する工程,培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞に試験物質を接触させる工程,試験物質が筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化,増殖または生存に影響するか否かを評価する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
筋サテライト細胞の単離は,当業者に公知の任意の方法により行うことができる。筋サテライト細胞はiPS細胞由来の細胞であってもよい。
筋サテライト細胞は,何らかの疾患を有する患者,または疾患を発症する遺伝的素因を有する被験者に由来する細胞であってもよい。疾患は例えば,筋ジストロフィーである。例えば,筋ジストロフィー患者の筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の増殖または生存を改善する物質は,筋ジストロフィーの治療に有用となりうると考えられる。「細胞の分化に影響する」とは,細胞の分化を促進または抑制することを含む。「細胞の増殖に影響する」とは,細胞の増殖を促進または抑制することを含む。「細胞の生存に影響する」とは,細胞の生存期間もしくは生存率を改善する,または細胞をアポトーシスやネクローシス等により死滅させることを含む。本スクリーニング方法において用いられる筋サテライト細胞は,CRISPR/Cas系などのゲノム編集技術等によって遺伝子を改変した細胞であってもよい。試験物質には,低分子化合物,ペプチド,タンパク質,核酸などが含まれるが,特に限定はない。
以下に,実施例を示して本発明を具体的に説明するが,これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
実施例1:骨格筋幹細胞の調製
C57BL/6Jマウス(3〜10週齢)の後肢筋(大.四頭筋,前頸骨筋,腓腹筋等)より骨格筋幹細胞を単離した。単離方法としては,(i)0.14%プロテアーゼ(Sigma-Aldrich社)を含むDMEM培地で37℃,30分間処理し,DMEM培地による洗浄を行った後に播種する方法,あるいは(ii)酵素消化後にフローサイトメーター(BD社,AriaII)により単離する方法(Exp Cell Res. 10, 245-255, 2004; Nat Med. 20 , 255-264,2014)を用いた。得られた骨格筋幹細胞は増殖培地(20%ウシ胎児血清,ペニシリン・ストレプトマイシン,2〜10ng/ml最終濃度のbFGF(Peprotec社)を添加したDMEM, High Glucose, GlutaMAX,Pyruvate(Thermo FisherScientific社)で37℃,5%CO2インキュベーター内で培養した。
C57BL/6Jマウス(3〜10週齢)の後肢筋(大.四頭筋,前頸骨筋,腓腹筋等)より骨格筋幹細胞を単離した。単離方法としては,(i)0.14%プロテアーゼ(Sigma-Aldrich社)を含むDMEM培地で37℃,30分間処理し,DMEM培地による洗浄を行った後に播種する方法,あるいは(ii)酵素消化後にフローサイトメーター(BD社,AriaII)により単離する方法(Exp Cell Res. 10, 245-255, 2004; Nat Med. 20 , 255-264,2014)を用いた。得られた骨格筋幹細胞は増殖培地(20%ウシ胎児血清,ペニシリン・ストレプトマイシン,2〜10ng/ml最終濃度のbFGF(Peprotec社)を添加したDMEM, High Glucose, GlutaMAX,Pyruvate(Thermo FisherScientific社)で37℃,5%CO2インキュベーター内で培養した。
実施例2:レチノイド化合物の骨格筋幹細胞の未分化性の維持に対する作用
実施例1で調製した骨格筋幹細胞培養系において,オールトランスレチノイン酸(all-trans-Retinoicacid:以下atRA)あるいは合成レチノイド化合物Am80を増殖培地に10−11M〜10−5Mの濃度で添加し,37℃,5%CO2インキュベーター内で3日間培養した。骨格筋幹細胞の未分化性は,以下に示す免疫染色法によって解析した。まず細胞を4%パラホルムアルデヒドにより室温で10分間固定した後,3回PBSによって洗浄した。次に0.5%TritonX−100/PBSによって室温,5分間処理し,再度PBSによって3回洗浄を行った。5%BSA/PBSで室温,1時間ブロッキング処理を行った後,抗Pax7抗体(SantaCruz社)と抗MyoD抗体(Dako社)を用いて4℃,overnightで処理した。PBSによって3回洗浄を行った後,二次抗体(抗マウスIgG−Alexa Fluor594と抗ウサギIgG−Alexa Fluor488)で室温,1時間処理し,再度PBSで3回洗浄した後,Hoechst33342を用いて核染色を行い,蛍光顕微鏡(オリンパス社)によって観察した。
実施例1で調製した骨格筋幹細胞培養系において,オールトランスレチノイン酸(all-trans-Retinoicacid:以下atRA)あるいは合成レチノイド化合物Am80を増殖培地に10−11M〜10−5Mの濃度で添加し,37℃,5%CO2インキュベーター内で3日間培養した。骨格筋幹細胞の未分化性は,以下に示す免疫染色法によって解析した。まず細胞を4%パラホルムアルデヒドにより室温で10分間固定した後,3回PBSによって洗浄した。次に0.5%TritonX−100/PBSによって室温,5分間処理し,再度PBSによって3回洗浄を行った。5%BSA/PBSで室温,1時間ブロッキング処理を行った後,抗Pax7抗体(SantaCruz社)と抗MyoD抗体(Dako社)を用いて4℃,overnightで処理した。PBSによって3回洗浄を行った後,二次抗体(抗マウスIgG−Alexa Fluor594と抗ウサギIgG−Alexa Fluor488)で室温,1時間処理し,再度PBSで3回洗浄した後,Hoechst33342を用いて核染色を行い,蛍光顕微鏡(オリンパス社)によって観察した。
まず全細胞数中のMyoD陽性細胞を算出し,実験に用いた筋細胞培養系の純度を解析した。その結果,100%筋系譜のMyoD陽性細胞であることを確認した。次にMyoD陽性細胞中の,未分化性マーカーであるPax7陽性の細胞(骨格筋幹細胞)割合を解析した。その結果,atRAおよびAm80ともに10−7M〜10−5Mの濃度でPax7陽性細胞割合が有意に増加した(図1aおよびb)。
実施例3:レチノイド化合物の骨格筋幹細胞の筋管形成能に対する作用
実施例1で調製した骨格筋幹細胞培養系を分化培地(2%ウマ血清,ペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM)で培養し,筋分化を誘導した。さらに分化培地にatRAあるいはAm80を10−11M〜10−5Mの濃度で添加し,レチノイド化合物の分化能に対する作用を解析した。具体的には抗ミオシン重鎖抗体(Developmental Studies HybridomaBank)による免疫染色を実施例2と同様に行い,筋細胞が融合した筋管を可視化した。
実施例1で調製した骨格筋幹細胞培養系を分化培地(2%ウマ血清,ペニシリン・ストレプトマイシンを含むDMEM)で培養し,筋分化を誘導した。さらに分化培地にatRAあるいはAm80を10−11M〜10−5Mの濃度で添加し,レチノイド化合物の分化能に対する作用を解析した。具体的には抗ミオシン重鎖抗体(Developmental Studies HybridomaBank)による免疫染色を実施例2と同様に行い,筋細胞が融合した筋管を可視化した。
結果として,atRA,Am80ともに10−7Mおよび10−5Mの濃度で著しく筋管の形成を抑制した(図2)。
実施例4:レチノイド化合物の骨格筋幹細胞の増殖能に対する作用
実施例1で調製した骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にatRAを10−7Mの濃度で添加し,レチノイド化合物の筋細胞の増殖能に対する作用を解析した。解析にはClick-iT(登録商標) Plus EdU AlexaFluor(登録商標) 594 Imaging Kit(Thermo Fisher SCIENTIFIC社)と抗MyoD抗体を用いて,定法に従って検出した。また,免疫染色は実施例2と同様の方法で行った。
実施例1で調製した骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にatRAを10−7Mの濃度で添加し,レチノイド化合物の筋細胞の増殖能に対する作用を解析した。解析にはClick-iT(登録商標) Plus EdU AlexaFluor(登録商標) 594 Imaging Kit(Thermo Fisher SCIENTIFIC社)と抗MyoD抗体を用いて,定法に従って検出した。また,免疫染色は実施例2と同様の方法で行った。
結果として,10−7MのatRAの添加により,MyoD陽性の骨格筋細胞の増殖能(EdUを取り込んだ細胞割合)が有意に増加した(図3)。
実施例5:レチノイド化合物添加による骨格筋幹細胞の長期的な維持
実施例1で調製した骨格筋幹細胞培養を10−7MのatRAを添加あるいは無添加の増殖培地で培養し,5回経代した。これらの細胞におけるPax7,ミオシン重鎖および内在性コントロールとしてベータチューブリン(β-Tubulin)を定法に従いウェスタンブロット法によって解析した。さらに10−7MのatRAを添加した増殖培地で16回経代した骨格筋筋幹細胞培養系における未分化性を抗Pax7抗体と抗MyoD抗体を用いて,実施例2と同様に解析した。
実施例1で調製した骨格筋幹細胞培養を10−7MのatRAを添加あるいは無添加の増殖培地で培養し,5回経代した。これらの細胞におけるPax7,ミオシン重鎖および内在性コントロールとしてベータチューブリン(β-Tubulin)を定法に従いウェスタンブロット法によって解析した。さらに10−7MのatRAを添加した増殖培地で16回経代した骨格筋筋幹細胞培養系における未分化性を抗Pax7抗体と抗MyoD抗体を用いて,実施例2と同様に解析した。
結果として,5回の経代によってatRA無添加の培地で培養した骨格筋幹細胞は多くの細胞が扁平で巨大な形態を示すのに対し,atRA添加区の細胞はその多くが経代をしていない初代の骨格筋細胞と同様に丸い形態を示した(図4aおよびb)。また,atRA添加区の骨格筋細胞は,無添加区の細胞と比較して幹細胞マーカーであるPax7を高く発現し,分化マーカーであるミオシン重鎖(MyHC)の発現が減弱した(図4c)。さらに16回経代し,長期的に維持した骨格筋幹細胞においても88%の細胞が未分化マーカーであるPax7を発現し,10−7MのatRAの添加することで未分化性を長期に維持できることが明らかとなった。(図5)。また,この細胞を分化培地によって分化誘導したところ,正常にミオシン重鎖を発現する筋管を形成した(図6)。
実施例6:他のレチノイド化合物の筋分化抑制に対する作用
実施例1で調製した骨格筋幹細胞を分化培地にRARアゴニストであるatRA,Am80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,さらにRXRアゴニストであるPA024,HX630,LG268を10−6M〜10−8Mの濃度で添加して96時間培養した。その後,筋管形成能を比較することによって筋分化抑制に対するレチノイド化合物の作用を解析した。
実施例1で調製した骨格筋幹細胞を分化培地にRARアゴニストであるatRA,Am80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,さらにRXRアゴニストであるPA024,HX630,LG268を10−6M〜10−8Mの濃度で添加して96時間培養した。その後,筋管形成能を比較することによって筋分化抑制に対するレチノイド化合物の作用を解析した。
結果として,RARアゴニストは全て筋管の形成を抑制した。一方,RXRアゴニストは筋管の形成を抑制しなかった(図7)。
実施例7:培養基質iMatrix−511の骨格筋幹細胞の未分化性維持・分化抑制に対する作用
株式会社ニッピ(東京,日本)から購入した培養基質iMatrix511−E8−silkを用いて,骨格筋幹細胞の分化抑制効果を検討した。これまで,iMatrix-511によってヒトES細胞とiPS細胞の樹立から拡大まで行えることが報告されている(Sci Rep 4:3594)。また,iMatrix−511は継代時の細胞懸濁液に添加することで,培養皿にプレコーティング(pre−coating)した時と同様の効果が得られることが報告されている(Sci Rep 7:41165)。そこで,実施例1で調製した骨格筋幹細胞をMatrigelでPre−coatingした培養皿,0.5μg/cm2となるようiMatrix−511でPre−coatingした培養皿,継代時に細胞懸濁液に0.2μg/cm2,あるいは0.5μg/cm2となるよう添加し,コーティング無しの培養皿に播種し,48時間培養した。その後,MACHEREY-NAGEL社のNucleoSpin RNAを用いてRNAを抽出し,TOYOBO社のReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Removerを用いて逆転写反応を行い,cDNAを調製した。得られたcDNAをKAPABiosystems社のKAPA SYBR FAST qPCR MasterMixを用いて,Pax7,Myogenin(Myog),さらにMuscle CreatineKinase(MCK)の発現量をqRT−PCR法によって解析した。
株式会社ニッピ(東京,日本)から購入した培養基質iMatrix511−E8−silkを用いて,骨格筋幹細胞の分化抑制効果を検討した。これまで,iMatrix-511によってヒトES細胞とiPS細胞の樹立から拡大まで行えることが報告されている(Sci Rep 4:3594)。また,iMatrix−511は継代時の細胞懸濁液に添加することで,培養皿にプレコーティング(pre−coating)した時と同様の効果が得られることが報告されている(Sci Rep 7:41165)。そこで,実施例1で調製した骨格筋幹細胞をMatrigelでPre−coatingした培養皿,0.5μg/cm2となるようiMatrix−511でPre−coatingした培養皿,継代時に細胞懸濁液に0.2μg/cm2,あるいは0.5μg/cm2となるよう添加し,コーティング無しの培養皿に播種し,48時間培養した。その後,MACHEREY-NAGEL社のNucleoSpin RNAを用いてRNAを抽出し,TOYOBO社のReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Removerを用いて逆転写反応を行い,cDNAを調製した。得られたcDNAをKAPABiosystems社のKAPA SYBR FAST qPCR MasterMixを用いて,Pax7,Myogenin(Myog),さらにMuscle CreatineKinase(MCK)の発現量をqRT−PCR法によって解析した。
結果として,iMatrix−511をPre−coatingした実験区とiMatrix−511を継代時に細胞懸濁液に添加した実験区(0.2μg/cm2および0.5μg/cm2)において,Matrigelをpre−coatingした実験区と比較してMyogとMCKの発現が有意に減少した。一方,Pax7の発現量には影響しなかった。(図8)
実施例8:レチノイド化合物とiMatrix−511の骨格筋幹細胞の未分化性維持・分化抑制に対する相乗効果
実施例6と同様に,骨格筋幹細胞を下記の3通りの方法で培養した:
(1)MatrigelでPre−coatingした培養皿に播種し,増殖培地で培養する方法;
(2)iMatrix−511を継代時に細胞懸濁液に0.2μg/cm2となるように添加し,コーティング無しの培養皿に播種し,増殖培地で培養する方法;
(3)iMatrix−511を継代時に細胞懸濁液に0.2μg/cm2となるように添加し,コーティング無しの培養皿に播種し,10−7MのatRAを添加した増殖培地で培養する方法。
実施例6と同様に,骨格筋幹細胞を下記の3通りの方法で培養した:
(1)MatrigelでPre−coatingした培養皿に播種し,増殖培地で培養する方法;
(2)iMatrix−511を継代時に細胞懸濁液に0.2μg/cm2となるように添加し,コーティング無しの培養皿に播種し,増殖培地で培養する方法;
(3)iMatrix−511を継代時に細胞懸濁液に0.2μg/cm2となるように添加し,コーティング無しの培養皿に播種し,10−7MのatRAを添加した増殖培地で培養する方法。
その後,実施例2と同様の方法でPax7陽性細胞率およびMyog陽性細胞率から骨格筋幹細胞の未分化性・分化抑制に対するiMatrix−511とatRAの相乗効果を解析した。
結果として,iMatrix−511とatRAを併用した実験区が最もPax7の陽性細胞率が高く,Myog陽性細胞率が低くなり,筋分化を抑制して未分化性が維持されていることが明らかとなった(図9)。
実施例9:培養基質iMatrix−511とレチノイド化合物添加による骨格筋幹細胞の未分化性維持・分化抑制に対する作用
株式会社ニッピ(東京,日本)から購入した培養基質iMatrix511−E8−silkを用いて,骨格筋幹細胞の分化抑制効果を検討した。これまで,iMatrix−511によってヒトES細胞とiPS細胞の樹立から拡大まで行えることが報告されている(Sci Rep 4:3594)。また,iMatrix−511は継代時の細胞懸濁液に添加することで,培養皿にプレコーティング(pre−coating)した時と同様の効果が得られることが報告されている(Sci Rep 7:41165)。そこで,下記6通りの実験区に実施例1で調製した骨格筋幹細胞を播種し,培養48時間後に解析した。
(1)Matrigelをpre−coatingした培養皿に播種し,増殖培地で培養する方法
(2)Matrigelをpre−coatingした培養皿に播種し,10−7Mのオールトランス型レチノイン酸(atRA)を添加した増殖培地で培養する方法
(3)0.2μg/cm2となるようiMatrix−511でPre−coatingした培養皿に播種し、増殖培地で培養する方法
(4)0.2μg/cm2となるようiMatrix−511でPre−coatingした培養皿に播種し、10−7MのatRAを添加した増殖培地で培養する方法
(5)継代時に細胞懸濁液に0.2μg/cm2となるよう添加し,コーティング無しの培養皿に播種し,増殖培地で培養する方法
(6)継代時に細胞懸濁液に0.2μg/cm2となるよう添加し,コーティング無しの培養皿に播種し,10−7MのatRAを添加した増殖培地で培養する方法
株式会社ニッピ(東京,日本)から購入した培養基質iMatrix511−E8−silkを用いて,骨格筋幹細胞の分化抑制効果を検討した。これまで,iMatrix−511によってヒトES細胞とiPS細胞の樹立から拡大まで行えることが報告されている(Sci Rep 4:3594)。また,iMatrix−511は継代時の細胞懸濁液に添加することで,培養皿にプレコーティング(pre−coating)した時と同様の効果が得られることが報告されている(Sci Rep 7:41165)。そこで,下記6通りの実験区に実施例1で調製した骨格筋幹細胞を播種し,培養48時間後に解析した。
(1)Matrigelをpre−coatingした培養皿に播種し,増殖培地で培養する方法
(2)Matrigelをpre−coatingした培養皿に播種し,10−7Mのオールトランス型レチノイン酸(atRA)を添加した増殖培地で培養する方法
(3)0.2μg/cm2となるようiMatrix−511でPre−coatingした培養皿に播種し、増殖培地で培養する方法
(4)0.2μg/cm2となるようiMatrix−511でPre−coatingした培養皿に播種し、10−7MのatRAを添加した増殖培地で培養する方法
(5)継代時に細胞懸濁液に0.2μg/cm2となるよう添加し,コーティング無しの培養皿に播種し,増殖培地で培養する方法
(6)継代時に細胞懸濁液に0.2μg/cm2となるよう添加し,コーティング無しの培養皿に播種し,10−7MのatRAを添加した増殖培地で培養する方法
培養48時間後に細胞を4%パラホルムアルデヒドにより室温で10分間固定した後,3回PBSによって洗浄した。次に0.5%TritonX−100/PBSによって室温,5分間処理し,再度PBSによって3回洗浄を行った。5%BSA/PBSで室温,1時間ブロッキング処理を行った後,抗Pax7抗体(Santa Cruz社)と抗MyoD抗体(Dako社)を用いて4℃,overnightで処理した。PBSによって3回洗浄を行った後,二次抗体(抗マウスIgG−Alexa Fluor 594と抗ウサギIgG−Alexa Fluor 488)で室温,1時間処理し,再度PBSで3回洗浄した後,Hoechst 33342を用いて核染色を行い,蛍光顕微鏡(オリンパス社)によって観察した。Pax7陽性細胞率およびMyog陽性細胞率を解析し,iMatrix−511とレチノイド化合物の相乗効果を検討した。
結果として,iMatrix−511とatRAを併用した実験区が最もPax7の陽性細胞率が高く,Myog陽性細胞率が低くなり,筋分化を抑制して未分化性が維持されていることが明らかとなった(図10)。
実施例10:ヒト骨格筋幹細胞の調製
ヒト骨格筋検体(中臀筋)より骨格筋幹細胞を単離した。単離方法としては,筋検体を酵素消化し単離された細胞を培養後にフローサイトメーター(BD社,AriaII)により純化する方法(Methods Mol Biol. 1460:241-253, 2016)を用いた。得られた骨格筋幹細胞は増殖培地(20%ウシ胎児血清,ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸,2.5ng/ml最終濃度のbFGF(Peprotec社)を添加したDMEM,High Glucose(Thermo Fisher Scientific社)を用いて37℃,3%O2, 5%CO2インキュベーター内で培養した。
ヒト骨格筋検体(中臀筋)より骨格筋幹細胞を単離した。単離方法としては,筋検体を酵素消化し単離された細胞を培養後にフローサイトメーター(BD社,AriaII)により純化する方法(Methods Mol Biol. 1460:241-253, 2016)を用いた。得られた骨格筋幹細胞は増殖培地(20%ウシ胎児血清,ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸,2.5ng/ml最終濃度のbFGF(Peprotec社)を添加したDMEM,High Glucose(Thermo Fisher Scientific社)を用いて37℃,3%O2, 5%CO2インキュベーター内で培養した。
実施例11:レチノイド化合物のヒト骨格筋幹細胞の増殖に対する効果
実施例10で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系において,atRAあるいはAm80を増殖培地に10−8M〜10−6Mの濃度で添加し,37℃,3%O2, 5%CO2インキュベーター内で3日間培養した。骨格筋幹細胞の増殖をWST−8アッセイ(Dojindo社)により評価した。アッセイ溶液添加3時間後,Multiskan JX(Thermo Fisher Scientific社)を用いて450nmの吸光度を測定することで細胞増殖の定量を行った。
実施例10で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系において,atRAあるいはAm80を増殖培地に10−8M〜10−6Mの濃度で添加し,37℃,3%O2, 5%CO2インキュベーター内で3日間培養した。骨格筋幹細胞の増殖をWST−8アッセイ(Dojindo社)により評価した。アッセイ溶液添加3時間後,Multiskan JX(Thermo Fisher Scientific社)を用いて450nmの吸光度を測定することで細胞増殖の定量を行った。
その結果,10−6MのAm80添加によりヒト骨格筋幹細胞の増殖が抑制された(図11)。
実施例12:レチノイド化合物のヒト骨格筋幹細胞の筋管形成能に対する作用
実施例10で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系を分化培地(5%ウマ血清,ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸を含むDMEM)で培養し,筋分化を誘導した。さらに分化培地にatRAあるいはAm80を10−8M〜10−6Mの濃度で添加し,レチノイド化合物の分化能に対する作用を解析した。具体的には抗ミオシン重鎖抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank)による免疫染色を実施例2と同様に行い,筋細胞が融合した筋管を可視化した。
実施例10で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系を分化培地(5%ウマ血清,ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸を含むDMEM)で培養し,筋分化を誘導した。さらに分化培地にatRAあるいはAm80を10−8M〜10−6Mの濃度で添加し,レチノイド化合物の分化能に対する作用を解析した。具体的には抗ミオシン重鎖抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank)による免疫染色を実施例2と同様に行い,筋細胞が融合した筋管を可視化した。
結果として,atRA,Am80ともに10−7Mおよび10−6Mの濃度で筋管の形成を抑制したが、分化抑制効果はatRAの方が強かった(図12)。
実施例13:atRAのヒト骨格筋幹細胞における筋分化制御因子の発現に及ぼす影響
実施例10で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にatRAを10−7M〜10−6Mの濃度で添加し,atRAの筋分化制御因子の発現に及ぼす影響を解析した。3日間の培養後、RNeasy Micro Kit(Qiagen社)を用いてRNAを単離し、QuantiTect RT Kit(Qiagen社)を用いて逆転写反応を行った。得られたcDNAを用いてMYOD1,MYOGの遺伝子発現をリアルタイムPCR法(Thermal Cycler Dice: Takara社)で相対定量解析した。内部コントロール遺伝子としてNDUFA13を用いた。
実施例10で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にatRAを10−7M〜10−6Mの濃度で添加し,atRAの筋分化制御因子の発現に及ぼす影響を解析した。3日間の培養後、RNeasy Micro Kit(Qiagen社)を用いてRNAを単離し、QuantiTect RT Kit(Qiagen社)を用いて逆転写反応を行った。得られたcDNAを用いてMYOD1,MYOGの遺伝子発現をリアルタイムPCR法(Thermal Cycler Dice: Takara社)で相対定量解析した。内部コントロール遺伝子としてNDUFA13を用いた。
結果として,10−7M〜10−6MのatRAの添加により,MYOD1,MYOGの遺伝子発現は抑制されたが、10−6Mの方がより強く抑制された(図13)。
実施例14:atRAとiMatrix−511がヒト骨格筋幹細胞における筋分化制御因子の発現に及ぼす相乗効果
実施例10で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にatRAは10−6Mの濃度で,また,iMatrix−511は0.1〜0.5μg/cm2となるように添加し,3日間培養した。実施例13と同様の方法で,MYOD1,MYOGの遺伝子発現をリアルタイムPCR法で相対定量解析した。
実施例10で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にatRAは10−6Mの濃度で,また,iMatrix−511は0.1〜0.5μg/cm2となるように添加し,3日間培養した。実施例13と同様の方法で,MYOD1,MYOGの遺伝子発現をリアルタイムPCR法で相対定量解析した。
その結果,10−6MのatRAと0.1μg/cm2のiMatrix−511を添加した場合において,MYOD1,MYOGの遺伝子発現が最も抑制された(図14)。
実施例15:atRAとiMatrix−511がヒト骨格筋幹細胞の増殖に及ぼす相乗効果
実施例11と同様の方法で,ヒト骨格筋幹細胞を10−6MのatRAと0.1μg/cm2のiMatrix−511の存在下で3日間培養した。実施例11と同様の方法で,細胞増殖の定量を行った。
実施例11と同様の方法で,ヒト骨格筋幹細胞を10−6MのatRAと0.1μg/cm2のiMatrix−511の存在下で3日間培養した。実施例11と同様の方法で,細胞増殖の定量を行った。
その結果,10−6MのatRAと0.1μg/cm2のiMatrix−511の添加によりヒト骨格筋幹細胞の増殖が促進された(図15)。
実施例16:atRAとiMatrix−511がヒト骨格筋幹細胞の移植効率に及ぼす影響
実施例11と同様の方法で,ヒト骨格筋幹細胞を10−6MのatRAと0.1μg/cm2のiMatrix−511の存在下で培養した。5週齢のNOG−mdxマウスの前脛骨筋に,培養された細胞を移植した(細胞数4x105個)。移植4週間後,前脛骨筋の迅速凍結切片を作成し,ウサギ抗ジストロフィン抗体(Abcam社)とマウス抗ヒトスペクトリン抗体(Leica社),ラット抗ラミニンα2鎖抗体(Santa Cruz社)を用いて染色した。二次抗体(抗ウサギIgG−Alexa Fluor 488と抗マウスIgG−Cy3,抗ラットIgG−Alexa Fluor 647)による二次染色の後,蛍光顕微鏡(Leica社)によって染色像を取得した。前脛骨筋の断面の全筋線維に対するヒトスペクトリン陽性筋線維の割合を算出し,移植効率とした。
実施例11と同様の方法で,ヒト骨格筋幹細胞を10−6MのatRAと0.1μg/cm2のiMatrix−511の存在下で培養した。5週齢のNOG−mdxマウスの前脛骨筋に,培養された細胞を移植した(細胞数4x105個)。移植4週間後,前脛骨筋の迅速凍結切片を作成し,ウサギ抗ジストロフィン抗体(Abcam社)とマウス抗ヒトスペクトリン抗体(Leica社),ラット抗ラミニンα2鎖抗体(Santa Cruz社)を用いて染色した。二次抗体(抗ウサギIgG−Alexa Fluor 488と抗マウスIgG−Cy3,抗ラットIgG−Alexa Fluor 647)による二次染色の後,蛍光顕微鏡(Leica社)によって染色像を取得した。前脛骨筋の断面の全筋線維に対するヒトスペクトリン陽性筋線維の割合を算出し,移植効率とした。
その結果,10−6MのatRAと0.1μg/cm2のiMatrix−511を添加し培養されたヒト骨格筋幹細胞が最も高い移植効率を示し(図16a)、その値は細胞移植の治療効果が見込める10%を超えた(図16b)。
本明細書には,本発明の好ましい実施態様を示してあるが,そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは,当業者には明らかであり,当業者であれば,本発明から逸脱することなく,様々な変形,変更,置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が,本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また,本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む,全ての刊行物に記載の内容は,その引用によって,本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
本発明者らは,レチノイドとラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって,筋幹細胞の未分化性を保持したまま,細胞を増殖させることが可能であることを見出した。本技術は簡便かつ安全で,高い効率で筋幹細胞の未分化性を維持できることから,筋ジストロフィーをはじめとした筋疾患に対する細胞移植治療や,化合物スクリーニング系の開発,再生医療への応用が期待される。
Claims (21)
- (i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することを特徴とする,筋サテライト細胞の培養方法。
- レチノイドがatRA,AM80,AM580,Am555S,Es80,Es580,Re80,Fv80,Ch55,Az80,フェンレチニド,CD437,BMS453,タザロテン,ドコサヘキサエン酸,A1120,Ch55,EC23,A740003,およびそれらの混合物から成る群より選択される,請求項1記載の培養方法。
- レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mである,請求項1または2記載の培養方法。
- ラミニンがラミニン511,ラミニン521,ラミニン522,ラミニン523,およびそれらの混合物から成る群より選択される,請求項1〜3のいずれか一項記載の培養方法。
- 培地がレチノイドおよびラミニンを含む液体培地である,請求項1〜4のいずれか一項記載の培養方法。
- ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlである,請求項1〜5のいずれか一項記載の培養方法。
- 培地がG−CSF,bFGF,IL−1α,IL−13,IFN−γ,TNF−α,GSK3阻害剤,sal003,p38阻害剤,(R)−PFI−2およびそれらの混合物から成る群より選択される少なくとも1つの因子をさらに含む,請求項1〜6のいずれか一項記載の培養方法。
- 筋サテライト細胞の未分化性が維持される,請求項1〜7のいずれか一項記載の培養方法。
- 筋サテライト細胞がヒトの細胞である,請求項1〜8のいずれか一項記載の培養方法。
- (i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む液体培地を用いて細胞を培養することを特徴とする,ヒト筋サテライト細胞の培養方法であって,
レチノイドがatRAまたはAM80であり,レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mであり,ラミニンがヒトラミニン511E8フラグメントであり,
ラミニンが液体培地中に含められており,ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlであり,そして
ヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される,培養方法。 - 2〜4%のO2の存在下で細胞を培養することを特徴とする,請求項1〜10のいずれか一項記載の培養方法。
- (i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む,筋サテライト細胞の筋分化を抑制するための組成物。
- (i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む,細胞培養培地。
- (i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む,ヒト筋サテライト細胞を培養するための液体細胞培養培地であって,
レチノイドがatRAまたはAM80であり,レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mであり,
ラミニンがヒトラミニン511E8フラグメントであり,ラミニンが液体培地中に含められており,ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlであり,そして
培地中で培養されたヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される,細胞培養培地。 - (i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む,細胞培養培地サプリメント。
- 細胞移植に用いるための細胞の製造方法であって,(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程を含む,方法。
- 筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化,増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって,
(i)レチノイドおよび(ii)ラミニンの存在下で筋サテライト細胞を培養する工程,培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞に試験物質を接触させる工程,
試験物質が筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化,増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む,方法。 - 患者における疾患または傷害の治療方法であって,(i)レチノイド,および(ii)ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程,および培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を患者に移植する工程を含む,方法。
- レチノイドがatRAまたはAM80であり,レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mであり,ラミニンがヒトラミニン511E8フラグメントであり,ラミニンが液体培地中に含められており,ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlであり,患者がヒトであり,疾患が筋ジストロフィー,先天性ミオパチー,遠位型ミオパチー,筋強直性疾患,炎症性筋疾患,周期性四肢麻痺,代謝性筋疾患,重症筋無力症,先天性筋無力症候群,ミトコンドリア病,サルコペニアおよび糖尿病から成る群より選択される,請求項18記載の治療方法。
- 少なくとも5×105個の筋サテライト細胞を含む,細胞組成物。
- (i)レチノイドおよび(ii)ラミニンをさらに含み,レチノイドがatRAまたはAM80であり,レチノイドの濃度が少なくとも10−8Mであり,ラミニンがヒトラミニン511E8フラグメントであり,ラミニンの濃度が少なくとも1.5μg/mlであり,筋サテライト細胞の純度が少なくとも85%であり,筋サテライト細胞がヒトの細胞である,請求項20記載の細胞組成物。
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