KR101638490B1 - 암의 치료 및 예방용 의약 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CAPRIN-1 단백질, 또는 연속되는 7 이상의 아미노산을 포함하는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.

Description

암의 치료 및 예방용 의약 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER}
본 발명은 CAPRIN-1에 대한 항체 또는 그 프래그먼트의 암의 치료 및/또는 예방제 등으로서의 새로운 의약 용도에 관한 것이다.
암은 전체 사망 원인의 제1위를 차지하는 질환이며, 현재 행해지고 있는 치료는 수술 요법을 주체로 방사선 요법과 화학 요법을 조합한 것이다. 최근의 새로운 수술법의 개발이나 새로운 항암제의 발견에도 불구하고, 일부의 암을 제외하고 암의 치료 성적은 그다지 향상되어 있지 않은 것이 현상황이다. 최근, 분자생물학이나 암면역학의 진보에 의해 암에 특이적으로 반응하는 항체류, 세포 장해성 T세포에 의해 인식되는 암항원류, 암항원을 코딩하는 유전자류 등이 동정되어 있고, 암항원류를 타겟으로 한 특이적 암치료법에의 기대가 높아지고 있다(비특허문헌 1).
암치료법에 있어서는 부작용을 경감하기 위해서 그 항원으로서 인식되는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 정상 세포에는 거의 존재하지 않고, 암 세포에 특이적으로 존재하고 있는 것이 바람직하다. 1991년, 벨기에 Ludwig 연구소의 Boon들은 자기암 세포주와 암 반응성 T세포를 사용한 cDNA 발현 클로닝법에 의해 CD8 양성 T세포가 인식하는 인간 멜라노마 항원 MAGE1을 단리시켰다(비특허문헌 2). 그 후, 암환자의 생체 내에서 자기의 암에 반응해서 산생되는 항체가 인식하는 종양항원을 유전자의 발현 클로닝의 방법을 받아 들여서 동정하는 SEREX(serological identification of antigens by recombinant expression cloning)법이 보고되고(비특허문헌 3 및 특허문헌 1), 이 방법에 의해, 정상세포에는 거의 발현이 없고, 암에 특이적으로 발현되는 몇개의 암항원이 단리되어 있다(비특허문헌 4∼9). 또한, 그 일부를 타겟으로 해서 암항원에 특이적으로 반응하는 면역 세포를 사용한 세포 요법이나, 암항원을 포함하는 백신 등의 암 특이적 면역요법의 임상시험이 실시되고 있다.
한편, 최근, 암 세포 상의 항원 단백질을 표적으로 한 암을 치료하기 위한 각종 항체의약이 세상에 대두되고 있다. 암 특이적 치료약으로서 일정한 약효가 얻어져서 주목받고 있지만, 표적이 되는 항원 단백질의 대부분은 정상세포에도 발현되는 것이며, 항체 투여의 결과, 암 세포 뿐만 아니라, 항원이 발현되는 정상세포도 장해되어 버려, 그 결과 생기는 부작용이 문제로 되고 있다. 따라서, 암 세포 표면에 특이적으로 발현되는 암항원을 동정하고, 그것을 표적으로 한 항체를 의약품으로서 사용할 수 있으면, 보다 부작용이 적은 항체의약에 의한 치료가 가능하게 된다라고 기대된다.
Cytoplasmic-and proliferation-associateed protein 1(CAPRIN-1)은 휴지기의 정상세포가 활성화나 세포분열을 일으킬 때에 발현되고, 또 세포 내에서 RNA와 세포 내 스트레스 과립을 형성해서 mRNA의 수송, 번역의 제어에 관여하는 것 등이 알려져 있는 세포 내 단백질이다. 한편, CAPRIN-1에는 여러가지 별명이 존재하고 있으며, 그 일례로서 GPI-anchored membrane protein 1이나 Membrane component surface marker 1 protein(M11S1) 등이 있고, 마치 본 단백질이 세포막 단백질인 것이 알려져 있었던 것 같은 명칭이 있다. 이들의 별명은 원래, CAPRIN-1의 유전자 서열이 GPI 결합 영역을 갖고, 대장암 세포에 발현되는 막 단백질이다라는 보고(비특허문헌 10)로부터 유래되지만, 후에 이 보고에서의 CAPRIN-1의 유전자 서열은 잘못된 것이며, 현재 GenBank 등에 등록되어 있는 CAPRIN-1의 유전자 서열이 1염기 결손되는 것에 의해 프레임 시프트가 일어남으로써 C말단으로부터 80아미노산이 결손되고, 그 결과 발생되는 artifact(74아미노산)이 전(前) 보고에서의 GPI 결합 부분이며, 또한 5'측에도 유전자 서열의 에러가 있고, N말단으로부터 53아미노산이 결손되어 있는 것이 보고되고 있다(비특허문헌 11). 또한, 현재 GenBank 등에 등록되어 있는 CAPRIN-1의 유전자 서열이 코딩하는 단백질은 세포막 단백질이 아닌 것이 보고되고 있다(비특허문헌 11).
또한, CAPRIN-1이 세포막 단백질이라고 하면 비특허문헌 10의 보고에 의거해서 특허문헌 2 및 3에는 M11S1의 명칭으로 CAPRIN-1이 세포막 단백질의 하나로서 항체 의약 표적으로서 암치료에 사용될 수 있는 것이 기재되어 있다(실시예에는 본 단백질에 대한 항체를 사용한 치료에 관한 기재는 일체 없다). 그러나, 비특허문헌 11의 보고와 같이 특허문헌 2의 출원 당시부터 현재까지 CAPRIN-1은 세포 표면에는 발현되어 있지 않은 것이 통설로 되어 있고, CAPRIN-1이 세포막 단백질이라는 잘못된 정보에만 의거한 특허문헌 2 및 3의 내용은 당업자의 기술상식으로서 이해되어야 하는 것이 아닌 것은 명백하다.
미국 특허 제5698396호 US 2008/0075722 WO 2005/100998
아키요시 쯔요시, 「암과 화학 요법」, 1997년, 제24권, p551-519(암과 화학 요법사, 일본) Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813(1995) Int. J. Cancer, 72:965-971(1997) Cancer Res., 58:1034-1041(1998) Int. J. Cancer, 29:652-658(1998) Int. J. Oncol., 14:703-708(1999) Cancer Res., 56:4766-4772(1996) Hum. Mol. Genet 6:33-39, 1997 J. Biol. Chem., 270:20717-20723, 1995 J. Immunol., 172:2389-2400, 2004
본 발명의 목적은 암 세포의 표면에 특이적으로 발현되는 암항원 단백질을 동정하고, 그것을 표적으로 한 항체의 암의 치료 및/또는 예방제로서의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 예의 연구의 결과, 개의 정소조직 유래 cDNA 라이브러리와 유방암 환견의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해 담암 생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체와 결합하는 단백질을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 취득한 유전자 및 그 인간, 소, 말, 마우스, 닭 상동성 유전자를 기초로 해서 서열 번호 2∼30 중 짝수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 CAPRIN-1 및 이들 CAPRIN-1에 대한 항체를 제작했다. 그리고 CAPRIN-1이 유방암, 뇌종양, 백혈병, 림프종, 폐암, 식도암, 대장암, 위암 및 신장암 세포에 특이적으로 발현되어 있는 것, 그리고 CAPRIN-1 단백질의 일부가 이들 암 세포의 세포 표면에 특이적으로 발현되어 있는 것을 찾아냈다. 그리고, 이들 CAPRIN-1의 각 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분에 대한 항체가 CAPRIN-1을 발현하는 암 세포를 장해하는 것을 찾아내어 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 이하의 특징을 갖는다.
본 발명은 서열 번호 2∼30 중 짝수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CAPRIN-1 단백질, 또는 연속되는 7 이상의 아미노산을 포함하는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다.
그 실시형태에 있어서, 상기 암은 유방암, 뇌종양, 백혈병, 림프종, 폐암, 식도암, 대장암, 위암 또는 신장암이다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 또는 2중 특이 항체이다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 37 또는 136으로 나타내어지는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또한 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체이다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 항체는 이하의 (a)∼(k) 중 어느 하나의 항체로서, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체, 또는 상기 항체를 유효성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물이다
(a) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 44, 45 및 46을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
(b) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 50, 51 및 52를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
(c) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 55, 56 및 57을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
(d) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 60, 61 및 62를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
(e) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 65, 66 및 67을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
(f) 서열 번호 70, 71 및 72를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 74, 75 및 76을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
(g) 서열 번호 80, 81 및 82를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 84, 85 및 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
(h) 서열 번호 90, 91 및 92를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 94, 95 및 96을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
(i) 서열 번호 100, 101 및 102를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 104, 105 및 106을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
(j) 서열 번호 110, 111 및 112를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 114, 115 및 116을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
(k) 서열 번호 120, 121 및 122를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 124, 125 및 126을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
(발명의 효과)
본 발명에서 사용되는 CAPRIN-1에 대한 항체는 암 세포를 장해한다. 따라서, CAPRIN-1에 대한 항체는 암의 치료나 예방에 유용하다.
도 1은 CAPRIN-1 단백질을 코딩하는 유전자의 정상조직 및 종양 세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. 참조 번호 1; CAPRIN-1 단백을 코딩하는 유전자의 발현 패턴, 참조 번호 2; GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
도 2는 CAPRIN-1에 대한 항체(항CAPRIN-1 항체)에 의한 CAPRIN-1 유전자를 발현시키는 유방암 세포주(T47D)에 대한 세포 장해 활성을 나타내는 도면이다. 참조 번호 3; 항CAPRIN-1 항체를 첨가했을 때의 활성, 참조 번호 4; 컨트롤 항체를 첨가했을 때의 활성, 참조 번호 5; 항체가 없는 경우의 활성을 나타낸다.
도 3은 CAPRIN-1에 대한 항체(항CAPRIN-1 항체)에 의한 CAPRIN-1 유전자를 발현시키는 유방암 세포주(MDA-MB-157)에 대한 세포 장해 활성을 나타내는 도면이다. 참조 번호 6; 항CAPRIN-1 항체를 첨가했을 때의 활성, 참조 번호 7; 컨트롤 항체를 첨가했을 때의 활성, 참조 번호 8; 항체가 없는 경우의 활성을 나타낸다.
도 4는 암 세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체(#1∼#11)에 의한 CAPRIN-1을 발현시키는 유방암 세포주 MDA-MB-157에 대한 세포 장해성을 나타내는 도면이다. 참조 번호 9; #1의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 10; #2의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 11; #3의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 12; #4의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 13; #5의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 14; #6의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 15; #7의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 16; #8의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 17; #9의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 18; #10의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 19; #11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체를 첨가했을 때의 활성, 참조 번호 20; CAPRIN-1 단백 자체에는 반응하지만, 암 세포의 세포 표면에 반응하지 않는 모노클로날을 첨가했을 때의 활성, 참조 번호 21; 항체 대신에 PBS를 첨가했을 때의 활성을 나타낸다.
도 5는 암 세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체(#1∼#11)의 CAPRIN-1을 발현시키는 마우스 암 세포주 CT26이 이식된 Balb/c 마우스에 대한 항종양 효과를 나타내는 도면(5a∼5c)이다. 참조 번호 22; #1의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 23; #2의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 24; #3의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 25; #4의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 26; #5의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 27; #6의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 28; #7의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 29; #8의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 30; #9의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 31; #10의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 32; #11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체 CAPRIN-1을 투여받은 마우스의 종양의 크기를, 참조 번호 33; CAPRIN-1 단백 자체에는 반응하지만 암 세포의 세포 표면에 반응하지 않는 모노클로날을 투여받은 마우스의 종양의 크기를, 참조 번호 34; 항체 대신에 PBS를 투여받은 마우스의 종양의 크기를 나타낸다.
도 6은 암 세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체(#1∼#11)의 CAPRIN-1을 발현시키는 마우스 암 세포주 N1E가 이식된 Balb/c 마우스에 대한 항종양 효과를 나타내는 도면(6a∼6c)이다. 참조 번호 35; #1의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 36; #2의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 37; #3의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 38; #4의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 39; #5의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 40; #6의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 41; #7의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 42; #8의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 43; #9의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 44; #10의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체, 참조 번호 45; #11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체 CAPRIN-1을 투여받은 마우스의 종양의 크기를, 참조 번호 46; CAPRIN-1 단백 자체에는 반응하지만 암 세포의 세포 표면에 반응하지 않는 모노클로날을 투여받은 마우스의 종양의 크기, 참조 번호 47; 항체 대신에 PBS를 투여받은 마우스의 종양의 크기를 나타낸다.
본 발명에서 이용되는 서열 번호 2∼30 중 짝수의 서열 번호의 폴리펩티드에 대한 항체의 항종양 활성은 후술하는 바와 같이 생체 내에서 담암동물에 대한 종양 증식의 억제를 조사함으로써, 또는 생체 외에서 상기 폴리펩티드를 발현시키는 종양 세포에 대해서 면역 세포 또는 보체를 통한 세포 장해 활성을 나타내는지의 여부를 조사함으로써 평가할 수 있다.
또한, 서열 번호 2∼30 중 짝수의 서열 번호(즉, 서열 번호 2, 4, 6‥28, 30)의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은 각각 서열 번호 1∼29 중 홀수의 서열 번호(즉, 서열 번호 1, 3, 5‥27, 29)에 나타내어져 있다.
본 발명이 개시하는 서열표의 서열 번호 6, 8, 10, 12 및 14로 나타내어지는 아미노산 서열은 개 정소 조직 유래 cDNA 라이브러리와 유방암 환견의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해 담암견 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체와 결합하는 폴리펩티드로서, 또한 서열 번호 2 및 4로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 인간 상동 인자(호모로그)로서, 서열 번호 16으로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 소 상동 인자로서, 서열 번호 18로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 말 상동 인자로서, 서열 번호 20∼28로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 마우스 상동 인자로서, 서열 번호 30으로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 닭 상동 인자로서 단리된 CAPRIN-1의 아미노산 서열이다(후술의 실시예 1 참조). CAPRIN-1은 휴지기의 정상 세포가 활성화나 세포분열을 일으킬 때에 발현되는 것이 알려져 있다.
CAPRIN-1은 세포 표면에는 발현되지 않는 것이 알려져 있었지만, 본 검토에 의해 CAPRIN-1 단백질의 일부가 각종 암 세포의 세포 표면에 발현되는 것이 명백해졌다. 본 발명에서는 CAPRIN-1 단백질 중 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분에 결합하는 항체가 바람직하게 사용된다. 암 세포의 세포 표면에 발현되는 CAPRIN-1 단백질 중의 부분 펩티드로서 서열표의 서열 번호 2∼30 중 서열 번호 6 및 서열 번호 18을 제외한 짝수번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중 아미노산 잔기 번호 (aa) 50-98 또는 아미노산 잔기 번호 (aa) 233-305의 영역 내의 연속되는 7개 이상의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 들 수 있고, 구체적으로는 예를 들면, 서열 번호 37 또는 서열 번호 136(서열 번호 136으로 나타내어지는 아미노산 서열 중에서도 서열 번호 137 또는 서열 번호 138로 나타내어지는 아미노산 서열의 영역이 바람직하다.)으로 나타내어지는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 들 수 있고, 본 발명의 항체는 이들 펩티드에 결합되는 또한 항종양 활성을 나타내는 모든 항체가 포함된다.
본 발명에서 사용되는 상기 CAPRIN-1에 대한 항체는 항종양 활성을 발휘할 수 있는 한 어떠한 종류의 항체이어도 좋고, 예를 들면, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 합성 항체, 다중 특이성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체(scFV), 항체 프래그먼트, 예를 들면 Fab나 F(ab')2 등을 포함한다. 이들 항체 및 그 프래그먼트는 또 당업자에게 공지의 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다. 본 발명에 있어서는 CAPRIN-1 단백질과 특이적으로 결합하는 것이 가능한 항체가 바람직하고, 모노클로날 항체인 것이 바람직하지만, 균질한 항체를 안정되게 생산할 수 있는 한, 폴리클로날 항체이어도 좋다. 또한, 피험자가 인간인 경우에는 거절반응을 회피 또는 억제하기 위해서 인간 항체 또는 인간화 항체인 것이 바람직하다.
여기서, 「CAPRIN-1 단백질과 특이적으로 결합한다」란 CAPRIN-1 단백질에 특이적으로 결합하고, 그 이외의 단백질과 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 항체의 항종양 활성은 후술하는 바와 같이, 생체 내에서 담암동물에 대한 종양 증식의 억제를 조사함으로써, 또는 생체 외에서 상기 폴리펩티드를 발현시키는 종양 세포에 대해서 면역 세포 또는 보체를 통한 세포 장해 활성을 나타낼지의 여부를 조사함으로써 평가할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 암의 치료 및/또는 예방의 대상인 피험자는 인간, 펫 동물, 가축류, 경기용 동물 등의 포유 동물이며, 바람직한 피험자는 인간이다.
이하에, 본 발명에 관한 항원의 제작, 항체의 제작, 및 의약 조성물에 대해서 설명한다.
<항체 제작용 항원의 제작>
본 발명에서 사용되는 CAPRIN-1에 대한 항체를 취득하기 위한 감작항원으로서 사용되는 단백질 또는 그 단편은 인간, 개, 소, 말, 마우스, 래트, 닭 등, 그 유래가 되는 동물종에 제한되지 않는다. 그러나 세포 융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려해서 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 포유 동물 유래의 단백질이 바람직하고, 특히 인간 유래의 단백질이 바람직하다. 예를 들면, CAPRIN-1이 인간 CAPRIN-1인 경우, 인간 CAPRIN-1 단백질이나 그 부분 펩티드, 인간 CAPRIN-1을 발현시키는 세포 등을 사용할 수 있다.
인간 CAPRIN-1 및 그 호모로그의 염기 서열 및 아미노산 서열은 예를 들면 GenBank(미국 NCBI)에 액세스하고, BLAST, FASTA 등의 알고리즘(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)을 이용함으로써 입수할 수 있다.
본 발명에서는 인간 CAPRIN-1의 염기 서열(서열 번호 1 또는 3) 또는 아미노산 서열(서열 번호 2 또는 4)을 기준으로 한 경우, 이들의 ORF 또는 성숙 부분의 염기 서열 또는 아미노산 서열과 70%∼100%, 바람직하게는 80%∼100%, 보다 바람직하게는 90%∼100%, 더욱 바람직하게는 95%∼100%, 예를 들면 97%∼100%, 98%∼100%, 99%∼100% 또는 99.5%∼100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 핵산 또는 단백질이 타겟이 된다. 여기에서, 「% 서열 동일성」은 2개의 서열을 갭을 도입하거나 또는 갭을 도입하지 않고, 최대의 유사도가 되도록 얼라인먼트(정렬)했을 때, 아미노산(또는 염기)의 총수에 대한 동일 아미노산(또는 염기)의 퍼센티지(%)를 의미한다.
CAPRIN-1 단백질의 단편은 항체가 인식하는 최소 단위인 에피토프(항원 결정기)의 아미노산 길이로부터 상기 단백질의 전체 길이 미만의 길이를 갖는다. 에피토프는 포유 동물, 바람직하게는 인간에 있어서 항원성 또는 면역 원성을 갖는 폴리펩티드 단편을 가리키며, 그 최소 단위는 약 7∼12 아미노산, 예를 들면 8∼11 아미노산으로 이루어진다. 구체예로서는 서열 번호 37, 서열 번호 137 또는 서열 번호 138로 나타내어지는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 들 수 있다.
상기한 인간 CAPRIN-1 단백질이나 그 부분 펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 예를 들면, Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 따라서 합성할 수 있다(일본 생화학회 편, 생화학 실험 강좌 1, 단백질의 화학 IV, 화학수식과 펩티드 합성, 도쿄 카가쿠 도우진(일본), 1981년). 또한, 각종 시판의 펩티드 합성기를 이용해서 상법에 의해 합성할 수도 있다. 또한, 공지의 유전자 공학적 방법(Sambrook들, Molecular Cloning, 제2판, Current Protocols in Molecular Biology(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel들, Short Protocols in Molecular Biology, 제3판, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons 등)을 사용하고, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조제하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 도입하고, 그 숙주 세포 중에서 폴리펩티드를 생산시킴으로써 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 공학적 방법이나 시판의 핵산 합성기를 사용한 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 서열 번호 1의 염기 서열을 포함하는 DNA는 인간 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하고, 서열 번호 1에 기재된 염기 서열을 증폭시킬 수 있도록 설계한 한쌍의 프라이머를 사용해서 PCR을 행함으로써 조제할 수 있다. PCR 의 반응 조건은 적당히 설정할 수 있고, 예를 들면, 내열성 DNA 폴리머라아제(예를 들면 Taq 폴리머라아제 등) 및 Mg2+ 함유 PCR 버퍼를 사용하고, 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초∼1분간(어닐링), 72℃에서 2분간(신장)으로 이루어지는 반응 행정을 1사이클로 해서, 예를 들면 30사이클 행한 후, 72℃에서 7분간 반응시키는 조건 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. PCR의 방법, 조건 등에 대해서는 예를 들면 Ausubel들, Short Protocols in Molecular Biology, 제3판, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons(특히 제15장)에 기재되어 있다.
또한, 본 명세서 중의 서열표의 서열 번호 1∼30에 나타내어지는 염기 서열 및 아미노산 서열의 정보에 의거해서 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 이것을 사용해서 인간 등의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 소망의 DNA를 단리할 수 있다. cDNA 라이브러리는 서열 번호 2∼30 중 짝수의 서열 번호의 단백질을 발현시키고 있는 세포, 기관 또는 조직으로부터 제작하는 것이 바람직하다. 그러한 세포나 조직의 예는 정소, 백혈병, 유방암, 림프종, 뇌종양, 폐암, 대장암 등의 암 또는 종양으로부터 유래되는 세포 또는 조직이다. 상기한 프로브 또는 프라이머의 조제, cDNA 라이브러리의 구축, cDNA 라이브러리의 스크리닝, 및 목적 유전자의 클로닝 등의 조작은 당업자에게 기지이며, 예를 들면, Sambrook들, Molecular Cloning, 제2판, Current Protocols in Molecular Biology(1989), Ausbel들(상기) 등에 기재된 방법에 준해서 행할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 DNA로부터 인간 CAPRIN-1 단백질이나 그 부분 펩티드를 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다.
상기 숙주 세포로서는 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 세포이면 어떠한 것이어도 좋고, 원핵 세포의 예로서는 대장균 등, 진핵 세포의 예로서는 원숭이 신장 세포 COS1, 중국 햄스터 난소 세포 CHO 등의 포유 동물 세포, 인간 태아 신장 세포주 HEK293, 마우스 태자 피부 세포주 NIH3T3, 출아 효모, 분열 효모 등의 효모 세포, 누에 세포, 손톱개구리속 난세포 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
숙주 세포로서 원핵 세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 원핵 세포 중에서 복제 가능한 오리진, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 멀티클로닝 사이트, 터미네이터, 약제 내성 유전자, 영양 요구성 상보 유전자 등을 갖는 발현 벡터를 사용한다. 대장균용 발현 벡터로서는 pUC계, pBluescriptII, pET 발현 시스템, pGEX 발현 시스템 등을 예시할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 도입하고, 상기 벡터에 의해 원핵 숙주 세포를 형질 전환한 후, 얻어진 형질 전환체를 배양하면 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 원핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드를 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다.
숙주 세포로서 진핵 세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 프로모터, 스플라이싱 영역, 폴리(A) 부가 부위 등을 갖는 진핵 세포용 발현 벡터를 사용한다. 그러한 발현 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV 벡터, pRS, pcDNA3, pYES2 등을 예시할 수 있다. 상기와 마찬가지로, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 도입하고, 상기 벡터에 의해 진핵 숙주 세포를 형질 전환한 후, 얻어진 형질 전환체를 배양하면, 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 진핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 발현 벡터로서 pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 등을 사용한 경우에는 His 태그(예를 들면 (His)6∼(His)10), FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, GFP 등 각종 태그를 부가한 융합 단백질로서 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.
발현 벡터의 숙주 세포에의 도입은 전기 천공법, 인산 칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법, 마이크로 인젝션, 바이러스 감염, 리포펙션, 세포막 투과성 펩티드와의 결합 등의 주지의 방법을 사용할 수 있다.
숙주 세포로부터 원하는 폴리펩티드를 단리 정제하기 위해서는 공지의 분리 조작을 조합해서 행할 수 있다. 예를 들면 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파 처리, 효소 소화, 염석이나 용매 분별 침전법, 투석, 원심 분리, 한외 여과, 겔 여과, SDS-PAGE, 등전점 전기 영동, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
<항체의 구조>
항체는 통상 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 헤테로 다량체 당단백질이다. IgM은 별도로 하고, 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성되는 약 150kDa의 헤테로 4량체 당단백질이다. 전형적으로는 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되어 있지만, 각종 면역 글로블린 아이소타입의 중쇄간의 디술피드 결합의 수는 변동된다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 쇄 내 디술피드 결합도 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 단에 가변 도메인(VH 영역)을 갖고, 그것에 몇개의 정상 영역이 계속된다. 각각 경쇄는 가변 도메인(VL 영역)을 갖고, 그 반대의 단에 1개의 정상영역을 갖는다. 경쇄의 정상영역은 중쇄의 최초의 정상영역과 정렬하고 있고, 또한 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬하고 있다. 항체의 가변 도메인은 특정의 영역이 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 특정의 가변성을 나타내며 항체에 결합 특이성을 부여한다. 가변 영역의 상대적으로 보존되어 있는 부분은 프레임 워크 영역(FR)이라고 부르고 있다. 완전한 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 3개 의 CDR은 중쇄에서는 그 N말로부터 순서대로 CDRH1, CDRH2, CDRH3, 마찬가지로 경쇄에서는 CDRL1, CDRL2, CDRL3이라고 부르고 있다. 항체의 항원에의 결합 특이성에는 CDRH3이 가장 중요하다. 또한, 각 쇄의 CDR은 FR영역에 의해 근접한 상태로 함께 유지되고, 다른쪽 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 정상영역은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접 기여하지 않지만, 각종 이펙터 기능, 예를 들면, 항체 의존성 세포성 세포 장해 활성(ADCC)에의 관여, Fcγ 수용체에의 결합을 개재한 식작용, 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통한 반감기/클리어런스 속도, 보체 캐스케이드의 C1q 구성 요소를 통한 보체 의존성 세포 장해(CDC)를 나타낸다.
<항체의 제작>
본 발명에 있어서의 항CAPRIN-1 항체란 CAPRIN-1 단백질의 전체길이는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체를 의미한다.
여기서, 「면역학적 반응성」이란 생체 내에서 항체와 CAPRIN-1 항원이 결합하는 특성을 의미하고, 이러한 결합을 통해 종양을 장해(예를 들면, 사멸, 억제 또는 퇴축)하는 기능이 발휘된다. 즉, 본 발명에서 사용되는 항체는 CAPRIN-1 단백질과 결합해서 종양, 예를 들면 백혈병, 림프종, 유방암, 뇌종양, 폐암, 식도암, 위암, 신장암, 대장암 등을 장해할 수 있으면, 그 종류를 묻지 않는다.
항체의 예는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 합성 항체, 다중 특이성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 항체 프래그먼트(예를 들면 Fab나 F(ab')2) 등을 포함한다. 또한, 항체는 면역 글로블린 분자의 임의의 클래스, 예를 들면 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 IgY, 또는 임의의 서브 클래스, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등이다.
항체는 또한 글리코실화 외에 아세틸화, 포르밀화, 아미드화, 인산화, 또는 페그(PEG)화 등에 의해 수식되어 있어도 좋다.
이하에, 각종 항체의 제작예를 나타낸다.
항체는 모노클로날 항체일 때에는 예를 들면, CAPRIN-1을 발현시키는 유방암 세포주 SK-BR-3 등을 마우스에 투여해서 면역하고, 동 마우스로부터 비장을 추출하고, 세포를 분리한 후, 상기 세포와 마우스 미엘로마 세포를 융합시켜, 얻어진 융합 세포(하이브리도마) 중에서 암 세포 증식 억제 작용을 갖는 항체를 산생하는 클론을 선택한다. 암 세포 증식 억제 작용을 갖는 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 단리하고, 상기 하이브리도마를 배양하고, 배양 상청으로부터 일반적인 어피니티 정제법에 의해 항체를 정제함으로써 조제하는 것이 가능하다.
모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마는 예를 들면 이하와 같이 해서 제작할 수 있다. 우선, 공지의 방법에 따라 감작항원을 동물에게 면역한다. 일반적 방법으로서 감작항원을 포유 동물의 복강내 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 구체적으로는 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당량 희석, 현탁한 것에 소망에 의해 통상의 애쥬벤트, 예를 들면 프로인트 완전 애쥬벤트를 적량 혼합하고, 유화후, 포유 동물에게 4∼21일 마다 수회 투여한다. 또한, 감작항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수도 있다.
이와 같이 포유 동물을 면역하고, 혈청 중에 소망의 항체 레벨이 상승하는 것을 확인한 후에, 포유 동물로부터 면역 세포를 채취하고, 세포 융합에 제공하지만, 바람직한 면역 세포로서는 특히 비세포를 들 수 있다.
상기 면역 세포와 융합되는 다른쪽 친세포로서 포유 동물의 미엘로마 세포를 사용한다. 이 미엘로마 세포는 공지의 각종 세포주, 예를 들면, P3U1(P3-X63Ag8U1), P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol.(1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978) 81, 1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976) 6, 511-519), MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO(deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194(Trowbridge, I.S. J.Exp.Med. (1978) 148, 313-323), R210(Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) 등이 바람직하게 사용된다.
상기 면역 세포와 미엘로마 세포의 세포 융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면, 콜러와 밀스테인들의 방법(Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol.(1981) 73, 3-46) 등에 준해서 행할 수 있다.
보다 구체적으로는 상기 세포 융합은 예를 들면 세포 융합 촉진제의 존재 하에 통상의 영양 배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로서는 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 또한 소망에 의해 융합 효율을 향상시키기 위해서 디메틸술폭시드 등의 보조제를 첨가 사용할 수도 있다.
면역 세포와 미엘로마 세포의 사용 비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면, 미엘로마 세포에 대해서 면역 세포를 1∼10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포 융합에 사용하는 배양액으로서는 예를 들면, 상기 미엘로마 세포주의 증식에 바람직한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 그 외에, 이 종류의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용 가능하며, 또한, 소태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 병용할 수도 있다.
세포 융합은 상기 면역 세포와 미엘로마 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액(예를 들면 평균 분자량 1000∼6000 정도)을 통상 30∼60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합함으로써 목적으로 하는 하이브리도마를 형성한다. 계속해서, 적당한 배양액을 순차 첨가하고, 원심해서 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 못한 세포 융합제 등을 제거한다.
이렇게 하여 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는데에 충분한 시간(통상, 수일∼수주일) 계속된다. 이어서, 통상의 한계희석법을 실시하고, 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 행한다.
또, 인간 이외의 동물에게 항원을 면역해서 상기 하이브리도마를 얻는 것 외에 인간 림프구, 예를 들면 EB 바이러스에 감염된 인간 림프구를 in vitro에서 단백질, 단백질 발현 세포 또는 그 용해물로 감작하고, 감작 림프구를 인간 유래의 영구 분열능을 갖는 미엘로마 세포, 예를 들면 U266(등록 번호 TIB196)과 융합시켜, 소망의 활성(예를 들면, 세포 증식 억제 활성)을 갖는 인간 항체를 산생하는 하이브리도마를 얻을 수도 있다.
이렇게 하여 제작되는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양하는 것이 가능하며, 또한, 액체 질소 중에서 장기보존하는 것이 가능하다.
즉, 소망의 항원이나 소망의 항원을 발현시키는 세포를 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라서 면역하고, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의해 모노클로날 항체 산생 세포(하이브리도마)를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 항체의 다른 예가 폴리클로날 항체이다. 폴리클로날 항체는 예를 들면, 다음과 같이 해서 얻을 수 있다.
천연의 CAPRIN-1 단백질, 또는 GST 등과의 융합 단백질로서 대장균 등의 미생물에 있어서 발현시킨 재조합 CAPRIN-1 단백질, 또는 그 부분 펩티드를 마우스, 인간 항체 산생 마우스, 토끼 등의 소동물에게 면역하여 혈청을 얻는다. 이것을, 예를 들면, 유안 침전, 프로틴A, 프로틴G 컬럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피, CAPRIN-1 단백질이나 합성 펩티드를 커플링한 어피니티 컬럼 등에 의해 정제함으로써 조제한다. 후술의 실시예에서는 CAPRIN-1 단백질의 아미노산 서열 중 암 세포의 세포 표면에 발현되는 영역의 일부의 펩티드(서열 번호 37로 표현됨)에 대한 토끼 폴리클로날 항체가 제작되고, 항종양 효과가 확인되었다.
여기서, 인간 항체 산생 마우스로서는 예를 들면 KM 마우스(키린 파마/Medarex) 및 Xeno 마우스(Amgen)가 알려져 있다(예를 들면, 국제 공개 제WO02/43478호, 동 제WO02/092812호 등). 이러한 마우스를 CAPRIN-1 단백질 또는 그 단편으로 면역할 때에는 완전 인간 폴리클로날 항체를 혈액으로부터 얻을 수 있다. 또한, 면역후의 마우스로부터 비장 세포를 꺼내고, 미엘로마 세포와의 융합법에 의해 인간형 모노클로날 항체를 제작할 수 있다.
항원의 조제는 예를 들면, 동물 세포를 사용한 방법(일본 특허 공표 2007-530068)이나 바큐로 바이러스를 사용한 방법(예를 들면, 국제 공개 제WO98/46777호 등) 등에 준해서 행할 수 있다. 항원의 면역 원성이 낮은 경우에는 알부민 등의 면역 원성을 갖는 거대 분자와 결합시켜 면역을 행하면 좋다.
또한, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고, 적당한 벡터에 도입하고, 이것을 숙주에게 도입하고, 유전자 재조합 기술을 사용해서 산생시킨 유전자 재조합형 항체를 사용할 수 있다(예를 들면, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조). 구체적으로는 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사 효소를 사용해서 항체의 가변 영역(V영역)의 cDNA를 합성한다. 목적으로 하는 항체의 V영역을 코딩하는 DNA가 얻어지면 이것을 소망의 항체 정상영역(C영역)을 코딩하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 도입한다. 또는 항체의 V영역을 코딩하는 DNA를 항체 C영역의 DNA를 포함하는 발현 벡터에 도입해도 좋다. 발현 제어 영역, 예를 들면, 앤핸서, 프로모터의 제어하에서 발현되도록 발현 벡터에 도입한다. 이어서, 이 발현 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환하여 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명의 항CAPRIN-1 항체는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 그러나, 폴리클로날 항체, 유전자 개변 항체(키메라 항체, 인간화 항체 등) 등이어도 좋다.
모노클로날 항체에는 인간 모노클로날 항체, 비인간 동물 모노클로날 항체(예를 들면 마우스 모노클로날 항체, 래트 모노클로날 항체, 토끼 모노클로날 항체, 닭 모노클로날 항체 등) 등이 포함된다. 모노클로날 항체는 CAPRIN-1 단백질을 면역한 비인간 포유 동물(예를 들면, 마우스, 인간 항체 산생 마우스 등)로부터의 비세포와 미엘로마 세포의 융합에 의해 얻어진 하이브리도마를 배양함으로써 제작될 수 있다. 후술의 실시예에서는 마우스 모노클로날 항체가 제작되어 항종양 효과가 확인되었다. 이들 모노클로날 항체는 서열 번호 43, 서열 번호 73, 서열 번호 83, 서열 번호 93, 서열 번호 103, 서열 번호 113 또는 서열 번호 123의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변(VH) 영역과, 서열 번호 47, 서열 번호 53, 서열 번호 58, 서열 번호 63, 서열 번호 68, 서열 번호 77, 서열 번호 87, 서열 번호 97, 서열 번호 107, 서열 번호 117 또는 서열 번호 127의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고, 여기에서, 상기 VH 영역에 서열 번호 40, 서열 번호 70, 서열 번호 80, 서열 번호 90, 서열 번호 100, 서열 번호 110 또는 서열 번호 120의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR1, 서열 번호 41, 서열 번호 71, 서열 번호 81, 서열 번호 91, 서열 번호 101, 서열 번호 111 또는 서열 번호 121의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR2 및 서열 번호 42, 서열 번호 72, 서열 번호 82, 서열 번호 92, 서열 번호 102, 서열 번호 112 또는 서열 번호 122의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR3이 포함되고, 상기 VL 영역에 서열 번호 44, 서열 번호 50, 서열 번호 55, 서열 번호 60, 서열 번호 65, 서열 번호 74, 서열 번호 84, 서열 번호 94, 서열 번호 104, 서열 번호 114 또는 서열 번호 124의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR1, 서열 번호 45, 서열 번호 51, 서열 번호 56, 서열 번호 61, 서열 번호 66, 서열 번호 75, 서열 번호 85, 서열 번호 95, 서열 번호 105, 서열 번호 115 또는 서열 번호 125의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR2 및 서열 번호 46, 서열 번호 52, 서열 번호 57, 서열 번호 62, 서열 번호 67, 서열 번호 76, 서열 번호 86, 서열 번호 96, 서열 번호 106, 서열 번호 116 또는 서열 번호 126의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR3이 포함된다.
키메라 항체는 다른 동물 유래의 서열을 조합해서 제작되는 항체이며, 예를 들면, 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변 영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상영역으로 이루어지는 항체 등이다. 키메라 항체의 제작은 공지의 방법을 사용해서 행할 수 있고, 예를 들면, 항체 V영역을 코딩하는 DNA와 인간 항체 C영역을 코딩하는 DNA를 연결하고, 이것을 발현 벡터에 도입하고 숙주에 도입하여 산생시킴으로써 얻어진다.
폴리클로날 항체에는 인간 항체 산생 동물(예를 들면, 마우스)에 CAPRIN-1 단백질을 면역해서 얻어지는 항체가 포함된다.
인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해지는 개변 항체이다. 인간화 항체는 면역 동물 유래의 항체의 CDR을 인간 항체의 상보성 결정 영역으로 이식함으로써 구축된다. 그 일반적인 유전자 재조합 방법도 알려져 있다.
구체적으로는 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임 워크 영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을 말단부에 오버랩되는 부분을 갖도록 제작한 몇 개의 올리고 뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 정상 영역을 코딩하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 도입하고, 이것을 숙주에 도입해서 산생시킴으로써 얻어진다(유럽 특허 출원 공개 제EP239400호, 국제 공개 제WO96/02576호 참조). CDR을 통해서 연결되는 인간 항체의 FR은 상보성 결정 영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역에 있어서의 프레임 워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). 또한, 여러가지 인간 항체 유래의 프레임 워크 영역으로 치환해도 좋다(국제 공개 제WO99/51743호 참조).
CDR을 통해 연결되는 인간 항체의 프레임 워크 영역은 상보성 결정 영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역에 있어서의 프레임 워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).
키메라 항체나 인간화 항체를 제작한 후에, 가변 영역(예를 들면, FR)이나 정상영역 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하거나 해도 좋다.
아미노산의 치환은 예를 들면 15 미만, 10 미만, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하의 아미노산, 바람직하게는 1∼5 아미노산, 보다 바람직하게는 1 또는 2 아미노산의 치환이며, 치환 항체는 미치환 항체와 기능적으로 동등해야 한다. 치환은 보존적 아미노산 치환이 바람직하고, 이것은 전하, 측쇄, 극성, 방향족성 등의 성질이 유사한 아미노산간의 치환이다. 성질이 유사한 아미노산은 예를 들면, 염기성 아미노산(아르기닌, 리신, 히스티딘), 산성 아미노산(아스파라긴산, 글루탐산), 무전 하극성 아미노산(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신), 무극성 아미노산(류신, 이소류신, 알라닌, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌), 분기쇄 아미노산(트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘) 등으로 분류할 수 있다.
항체 수식물로서는 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항체 수식물에 있어서는 결합되는 물질은 한정되지 않는다. 이러한 항체 수식물을 얻기 위해서는 얻어진 항체에 화학적인 수식을 실시함으로써 얻을 수 있다. 이들의 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.
여기서 「기능적으로 동등」이란 대상이 되는 항체가 본 발명의 항체와 동일한 생물학적 또는 생화학적 활성, 구체적으로는 종양을 장해하는 기능을 갖는 것, 인간에의 적용시에 거절반응을 본질적으로 일으키지 않는 것 등을 가리킨다. 이러한 활성으로서는 예를 들면, 세포 증식 억제 활성, 또는 결합 활성을 예시할 수 있다.
소정 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하기 위한 당업자에게 잘 알려져진 방법으로서는 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면, 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al.,(1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ., and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al.,(1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer, W. and Fritz, HJ.,(1987) Methods Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA.,(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492, Kunkel(1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 사용하고, 본 발명의 항체에 적당히 변이를 도입함으로써 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체를 조제할 수 있다.
상기 항CAPRIN-1 항체가 인식하는 CAPRIN-1 단백질의 에피토프를 인식하는 항체는 당업자에게 공지의 방법에 의해 얻는 것이 가능하다. 예를 들면, 항CAPRIN-1 항체가 인식하는 CAPRIN-1 단백질의 에피토프를 통상의 방법(예를 들면, 에피토프 매핑 등)에 의해 결정하고, 상기 에피토프에 포함되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 면역원으로 해서 항체를 제작하는 방법이나, 통상의 방법으로 제작된 항체의 에피토프를 결정하고, 항CAPRIN-1 항체와 에피토프가 같은 항체를 선택하는 방법 등에 의해 얻을 수 있다. 여기에서, 「에피토프」는 포유 동물, 바람직하게는 인간에게 있어서 항원성 또는 면역 원성을 갖는 폴리펩티드 단편을 가리키고, 그 최소 단위는 약 7∼12 아미노산, 바람직하게는 8∼11 아미노산으로 이루어진다.
본 발명의 항체의 친화 정수[Ka(kon/koff)]는 바람직하게는 적어도 107M-1, 적어도 108M-1, 적어도 5×108M-1, 적어도 109M-1, 적어도 5×109M-1, 적어도 1010M-1, 적어도 5×1010M-1, 적어도 1011M-1, 적어도 5×1011M-1, 적어도 1012M-1, 또는 적어도 1013M-1이다.
본 발명의 항체는 항종양제와 콘주게이트할 수 있다. 항체와 항종양제의 결합은 아미노기, 카르복실기, 히드록시기, 티올기 등과 반응성의 기(예를 들면, 숙신산 이미딜기, 포르밀기, 2-피리딜디티오기, 말레이이미딜기, 알콕시카르보닐기, 히드록시기 등)을 갖는 스페이서를 통해 행할 수 있다.
항종양제의 예는 문헌 등에서 공지의 하기의 항종양제, 즉, 파클리탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉사이트, 5-플루오로우라실, 티오테파, 부술판, 임프로술판, 피포술판, 벤조도파(benzodopa), 카르보콘, 메투레도파((meturedopa), 우레도파(uredopa), 알트레트아민(altretamine), 트리에틸렌 멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드(triethilenethiophosphoramide), 트리메틸롤멜라민(trimethylolomelamine), 불라타신, 불라타시논, 캄프토세신, 브리오스타틴, 칼리스타틴(callystatin), 크립토피신1, 크리토피신8, 돌라스타틴, 두오카르마이신, 엘레우테로빈, 판크라티스타틴, 사르코딕틴(sarcodictyin), 스폰지스타틴, 클로람부실, 클로르나파진(chlornaphazine), 콜로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민옥시드히드로클로리드, 멜팔란, 노벰비친(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실무스타드, 카르무스틴, 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 칼리케아마이신(calicheamicin), 다이네마이신, 크로드로네이트, 에스페라마이신, 아쿠라시노마이신, 악티노마이신, 오스라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신, 카르지노피린(carzinophilin), 크로모마이신, 닥티노마이신, 데토르비신(detorbicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신(marcellomycin), 마이토마이신C, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신, 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신, 켈라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스, 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 데노프테린(denopterin), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌, 안시타빈, 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈(enocitabine), 플록시우리딘(floxuridine); 안드로겐류, 예를 들면 칼루스테론(calusterone), 프로피온산 드로모스타놀론, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄, 프롤린산(frolinic acid), 아세글라톤, 알도포스파미드글리코시드, 아미노레불린산, 에닐루라실, 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트랙세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 데메콜신(demecolcine), 디아지콘(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 아세트산엘립티늄(elliptinium), 에포틸론(epothilone), 에토글루시드(etoglucid), 렌티난, 로니다민(lonidamine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocine), 미토구아존(mitoguazone), 미톡산트론, 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴, 페나멧(phenamet), 피라루비신, 로속산트론(losoxantrone), 포도필린산(podophyllinic acid), 2-에틸히드라지드, 프로카르바진, 라족산(razoxane), 리족신, 시조필란, 스피로게르마늄(spirogermanium), 테뉴아존산(tenuazonic acid), 트리아지콘(triaziquone), 로리딘(roridine)A, 안구이딘(anguidine), 우레탄, 빈데신, 다카르바진, 만노무스틴(mannomustine), 미토브로니톨, 미톨락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(gacytosine), 도세탁셀, 클로람부실, 겜시타빈(gemcitabine), 6-티오구아닌, 메르캅토푸린, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 이포스파미드, 마이톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 노반트론(novantrone), 테니포시드, 에다트렉세이트(edatrexate), 다우노마이신, 아미노프테린, 크셀로다(xeloda), 이반드로네이트(ibandronate), 이리노테칸, 토포이소메라세 인히비터, 디플루오로메틸로르니틴(DMFO), 레티노인산, 카페시타빈(capecitabine), 및 그것들의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 유도체를 포함한다.
또는 본 발명의 항체에는 문헌 등에서 공지의 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153SM, 212Bi, 32P, 175Lu, 176Lu 등의 방사성 동위체를 결합하는 것도 가능하다. 방사성 동위체는 종양의 치료나 진단을 위해 유효한 것이 바람직하다.
본 발명의 항체는 CAPRIN-1과 면역학적 반응성을 갖는 항체, 또는 CAPRIN-1을 특이적으로 인식하는 항체이다. 상기 항체는 그것을 투여하는 대상동물에 있어서 거절반응이 거의 또는 전혀 회피되는 구조를 갖는 항체이어야 한다. 그러한 항체로서는 예를 들면 대상동물이 인간일 경우, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체(예를 들면 인간-마우스 키메라 항체), 단쇄 항체, 2중 특이성 항체 등을 들 수 있다. 이들의 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 인간 항체 유래의 것이거나, 또는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 비인간 동물 항체 유래의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)과 인간 항체 유래의 프레임 워크 영역으로 이루어지거나, 또는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 비인간 동물 항체 유래의 것이고, 또한, 중쇄 및 경쇄의 정상영역이 인간 항체 유래가 것인 재조합형 항체이다. 바람직한 항체는 앞 2개의 항체이다.
이들 재조합형 항체는 다음과 같이 해서 제작할 수 있다. 하이브리도마 등의 항체 산생 세포로부터 인간 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체(예를 들면, 인간 모노클로날 항체, 마우스 모노클로날 항체, 래트 모노클로날 항체, 토끼 모노클로날 항체, 닭 모노클로날 항체 등)를 코딩하는 DNA를 클로닝하고, 이것을 주형으로 해서 상기 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 RT-PCR법 등에 의해 제작하고, Kabat EU numbering system(Kabat들, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991))에 의거해서 경쇄 및 중쇄의 각 가변 영역의 서열 또는 각 CDR1, CDR2, CDR3의 서열을 결정한다.
또한, 이들의 각 가변 영역을 코딩하는 DNA 또는 각 CDR을 코딩하는 DNA를 유전자 재조합 기술(Sambrook들, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) 또는 DNA 합성기를 사용해서 제작한다. 여기에서, 상기 인간 모노클로날 항체 산생 하이브리도마는 인간 항체 산생 동물(예를 들면, 마우스)에 인간 CAPRIN-1을 면역한 후, 상기 면역동물로부터 절제한 비세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 제작할 수 있다. 이것과는 달리, 필요에 따라 유전자 재조합 기술 또는 DNA 합성기를 사용해서 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역 및 정상영역을 코딩하는 DNA를 제작한다.
인간화 항체의 경우에는 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA 중의 CDR 코딩 서열을 이들에 대응하는 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스, 래트, 닭 등) 유래의 항체의 CDR 코딩 서열과 치환한 DNA를 제작하고, 그것에 의해서 얻어진 DNA를 각각 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 정상영역을 코딩하는 DNA와 연결함으로써 인간화 항체를 코딩하는 DNA를 제작할 수 있다.
키메라 항체의 경우에는 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스, 래트, 닭 등) 유래의 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 각각 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 정상영역을 코딩하는 DNA와 연결함으로써 키메라 항체를 코딩하는 DNA를 제작할 수 있다.
단쇄 항체의 경우에는 이 항체는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 링커를 통해 직선형상으로 연결한 항체이며, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 링커를 코딩하는 DNA, 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 결합함으로써 단쇄 항체를 코딩하는 DNA를 제작할 수 있다. 여기에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 모두 인간 항체 유래의 것이거나, 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스, 래트, 닭 등) 유래의 항체의 CDR에 의해 치환된 인간 항체 유래의 것이다. 또한, 링커는 12∼19 아미노산으로 이루어지고, 예를 들면 15 아미노산의 (G4S)3(G. B. Kim들, Protein Engineering Design and Selection 2007, 20(9): 425-432)을 들 수 있다.
2중 특이성 항체(diabody)의 경우에는 이 항체는 2개의 다른 에피토프와 특이적으로 결합 가능한 항체이며, 예를 들면 중쇄 가변 영역A를 코딩하는 DNA, 경쇄 가변 영역B를 코딩하는 DNA, 중쇄 가변 영역B를 코딩하는 DNA, 및 경쇄 가변 영역A를 코딩하는 DNA를 이 순서로 결합(단, 경쇄 가변 영역B를 코딩하는 DNA와 중쇄 가변 영역B를 코딩하는 DNA는 상기와 같은 링커를 코딩하는 DNA를 통해 결합된다.)함으로써 2중 특이성 항체를 코딩하는 DNA를 제작할 수 있다. 여기에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 모두 인간 항체 유래의 것이거나, 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스, 래트, 닭 등) 유래의 항체의 CDR에 의해 치환된 인간 항체 유래의 것이다.
상기한 바와 같이 해서 제작된 재조합 DNA를 1개 또는 복수의 적당한 벡터에 도입하고, 이것을 숙주 세포(예를 들면, 포유 동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 등)에 도입하고, (공)발현시킴으로써 재조합형 항체를 제작할 수 있다(P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J. W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).
상기의 방법에 의해 제작되는 본 발명의 항체는 예를 들면 이하의 (a)∼(k)의 항체를 들 수 있다.
(a) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 44, 45 및 46을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 47의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).
(b) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 50, 51 및 52를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 53의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).
(c) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 55, 56 및 57을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 58의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).
(d) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 60, 61 및 62를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 63의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).
(e) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 65, 66 및 67을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 68의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).
(f) 서열 번호 70, 71 및 72를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 74, 75 및 76을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 73의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 77의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).
(g) 서열 번호 80, 81 및 82를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 84, 85 및 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 83의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 87의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).
(h) 서열 번호 90, 91 및 92를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 94, 95 및 96을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 93의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 97의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).
(i) 서열 번호 100, 101 및 102를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 104, 105 및 106을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 103의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 107의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체)
(j) 서열 번호 110, 111 및 112를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 114, 115 및 116을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 113의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 117의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).
(k) 서열 번호 120, 121 및 122를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 124, 125 및 126을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 123의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 127의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).
여기서, 서열 번호 40, 41 및 42, 서열 번호 70, 71 및 72, 서열 번호 80, 81 및 82, 서열 번호 90, 91 및 92, 서열 번호 100, 101 및 102, 서열 번호 110, 111 및 112, 서열 번호 120, 121 및 122에 나타내는 아미노산 서열은 각각 마우스 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이며, 또한, 서열 번호 44, 45 및 46, 서열 번호 50, 51 및 52, 서열 번호 55, 56 및 57, 서열 번호 60, 61 및 62, 서열 번호 65, 66 및 67, 서열 번호 74, 75 및 76, 서열 번호 84, 85 및 86, 서열 번호 94, 95 및 96, 서열 번호 104, 105 및 106, 서열 번호 114, 115 및 116, 서열 번호 124, 125 및 126에 나타내는 아미노산 서열은 각각 마우스 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이다.
또한, 본 발명의 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 2중 특이성 항체는 예를 들면 이하의 항체이다(항체(a)에서 예시함).
(i) 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 40, 41 및 42의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임 워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 44, 45 및 46의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임 워크 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체(바람직하게는 중쇄 가변 영역에 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 경쇄 가변 영역에 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 항체).
(ii) 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 40, 41 및 42의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임 워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 중쇄의 정상영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하고, 및, 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 44, 45 및 46의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임 워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 경쇄의 정상영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 항체(바람직하게는 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 중쇄의 정상영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하고, 또 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 경쇄의 정상영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 항체).
또한, 인간 항체 중쇄 및 경쇄의 정상영역 및 가변 영역의 서열은 예를 들면 NCBI(미국:GenBank, UniGene 등)로부터 입수 가능하며, 예를 들면 인간 IgG1 중쇄 정상영역에 대해서는 등록 번호 J00228, 인간 IgG2 중쇄 정상영역에 대해서는 등록 번호 J00230, 인간 IgG3 중쇄 정상영역에 대해서는 등록 번호 X03604, 인간 IgG4 중쇄 정상영역에 대해서는 등록 번호 K01316, 인간 경쇄 κ정상영역에 대해서는 등록 번호 V00557, X64135, X64133 등, 인간 경쇄 λ정상영역에 대해서는 등록 번호 X64132, X64134 등의 서열을 참조할 수 있다.
상기 항체는 바람직하게는 세포 장해 활성을 갖고 있고, 이것에 의해 항종양 효과를 발휘할 수 있다.
또한, 상기 항체에 있어서의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이나 CDR의 특정의 서열은 단지 예시를 목적으로 한 것이며, 특정의 서열에 한정되지 않는 것은 명백하다. 인간 CAPRIN-1에 대한 다른 인간 항체 또는 비인간 동물 항체(예를 들면 마우스 항체)를 산생할 수 있는 하이브리도마를 제작하고, 하이브리도마가 산생하는 모노클로날 항체를 회수하고, 인간 CAPRIN-1과의 면역학적 결합성 및 세포 장해 활성을 지표로 해서 목적의 항체인지의 여부를 판정한다. 그것에 의해서 원하는 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 식별한 후, 상기와 같이 상기 하이브리도마로부터 목적의 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 제작하여 서열 결정하고, 상기 DNA를 다른 항체의 제작을 위해서 이용한다.
또한, 본 발명의 상기 항체는 CAPRIN-1을 특이적으로 인식한다는 특이성을 갖는 한, 상기 (i)부터 (iv)의 각 항체의 특히 프레임 워크 영역의 서열 및/또는 정상영역의 서열에 있어서, 1 또는 수개(바람직하게는 1 또는 2개)의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가가 있어도 좋다. 여기서 수개란 2∼5개, 바람직하게는 2개 또는 3개를 의미한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 상기 항체를 코딩하는 DNA, 또는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 DNA, 또는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA도 제공한다. 그러한 DNA는 예를 들면 항체(a)의 경우, 서열 번호 40, 41 및 42의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 서열 번호 44, 45 및 46의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 등을 포함한다.
이들 서열의 DNA에 의해 코딩되는 상보성 결정 영역(CDR)은 항체의 특이성을 결정하는 영역이기 때문에, 항체의 그 이외의 영역(즉, 정상영역 및 프레임 워크 영역)을 코딩하는 서열은 다른 항체 유래의 서열이어도 좋다. 여기에서 다른 항체란 인간 이외의 생물 유래의 항체도 포함하지만, 부작용 저감의 관점에서는 인간 유래의 것이 바람직하다. 즉, 상기의 DNA에서는 중쇄 및 경쇄의 각 프레임 워크 영역 및 각 정상영역을 코딩하는 영역이 인간 항체 유래의 대응 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA의 다른 예는 예를 들면 항체(a)의 경우, 서열 번호 43의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 영역이 서열 번호 47의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA 등이다. 여기에서, 서열 번호 43의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열의 예는 서열 번호 48의 염기 서열이다. 또한, 서열 번호 47의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열의 예는 서열 번호 49의 염기 서열이다. 이들 DNA에서도 중쇄 및 경쇄의 각 정상영역을 코딩하는 영역이 인간 항체 유래의 대응 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 DNA는 예를 들면 상기의 방법 또는 이하의 방법으로 얻을 수 있다. 우선, 본 발명의 항체에 관한 하이브리도마로부터 시판의 RNA 추출 키트를 사용해서 전체 RNA를 조제하고, 랜덤 프라이머 등을 사용해서 역전사 효소에 의해 cDNA를 합성한다. 이어서 기지의 마우스 항체 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자의 각 가변 영역에 있어서 각각 보존되어 있는 서열의 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR법에 의해 항체를 코딩하는 cDNA를 증폭시킨다. 정상영역을 코딩하는 서열에 대해서는 기지의 서열을 PCR법으로 증폭시킴으로써 얻을 수 있다. DNA의 염기 서열은 서열 결정용 플라스미드 또는 파지에 도입하거나 해서 상법에 따라 결정할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항CAPRIN-1 항체에 의한 CAPRIN-1 발현 암 세포에 대한 항종양 효과는 이하의 기서에 의해 일어난다고 생각된다.
CAPRIN-1 발현 세포의 이펙터 세포 항체 의존적 세포 장해성(ADCC), 및 CAPRIN-1 발현 세포의 보체 의존적 세포 장해성(CDC).
따라서, 본 발명에서 사용되는 항CAPRIN-1 항체의 활성평가는 이하 실시예에 구체적으로 나타내어지는 바와 같이 생체 외에서 CAPRIN-1을 발현시키는 암 세포에 대해서 상기 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항CAPRIN-1 항체는 암 세포 상의 CAPRIN-1 단백질과 결합해서 상기 활성에 의해 항종양 작용을 나타내는 점에서 암의 치료 또는 예방에 유용하다고 생각된다. 즉 본 발명은 항CAPRIN-1 항체를 유효성분으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다. 항 CAPRIN-1 항체를 인체에 투여할 목적(항체치료)으로 사용할 경우에는 면역 원성을 저하시키기 때문에 인간 항체나 인간화 항체로 하는 것이 바람직하다.
또한, 항CAPRIN-1 항체와 암 세포 표면 상의 CAPRIN-1 단백질의 결합 친화성이 높을수록 항CAPRIN-1 항체에 의한 보다 강한 항종양 활성이 얻어진다. 따라서, CAPRIN-1 단백질과 높은 결합 친화성을 갖는 항CAPRIN-1 항체를 획득할 수 있으면, 보다 강한 항종양 효과를 기대할 수 있고, 암의 치료 및/또는 예방을 목적으로 한 의약 조성물로서 적응하는 것이 가능하게 된다. 높은 결합 친화성으로서 상술한 바와 같이, 결합 정수(친화 정수)[Ka(kon/koff)]가 바람직하게는 적어도 107M-1, 적어도 108M-1, 적어도 5×108M-1, 적어도 109M-1, 적어도 5×109M-1, 적어도 1010M-1, 적어도 5×1010M-1, 적어도 1011M-1, 적어도 5×1011M-1, 적어도 1012M-1, 또는 적어도 1013M-1인 것이 바람직하다.
<항원 발현 세포에의 결합>
항체가 CAPRIN-1에 결합하는 능력은 실시예에서 설명되는 예를 들면 ELISA, 웨스턴 블롯법, 면역형광 및 플로우사이토메트리 분석 등을 사용한 결합 어세이를 이용해서 특정할 수 있다.
<면역 조직 화학 염색>
CAPRIN-1을 인식하는 항체는 당업자에게 주지의 방법에서의 면역 조직 화학에 의해 외과수술 사이에 환자로부터 얻은 조직이나, 자연히 또는 트랜스펙션후에 CAPRIN-1을 발현시키는 세포계를 접종한 이종 이식 조직을 담지하는 동물로부터 얻은 조직으로부터 파라포름알데히드 또는 아세톤 고정된 동결 절편 또는 파라포름알데히드로 고정한 파라핀 포매된 조직 절편을 사용해서 CAPRIN-1과의 반응성에 관해서 시험할 수 있다.
면역 조직 화학 염색을 위해서 CAPRIN-1에 대해서 반응성이 있는 항체를 여러가지 방법으로 염색시킬 수 있다. 예를 들면, 겨자무과산화효소 복합 염소 항마우스 항체나 염소 항토끼 항체를 반응시킴으로써 가시화할 수 있다.
<의약 조성물>
본 발명의 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물의 표적은 CAPRIN-1 유전자를 발현시키는 암(세포)이면 특별히 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 「종양」 및 「암」이라는 용어는 악성 신생물을 의미하고, 호환적으로 사용된다.
본 발명에 있어서 대상이 되는 암으로서는 서열 번호 2∼30 중 짝수의 서열 번호의 아미노산 서열 또는 7 이상의 연속 아미노산으로 이루어지는 그 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현시키고 있는 암이며, 바람직하게는 유방암, 뇌종양, 백혈병, 폐암, 림프종, 비만 세포종, 식도암 및 대장암이다.
이들 특정의 암에는 예를 들면, 유선암, 복합형 유선암, 유선 악성 혼합 종양, 유관내 유두상선암, 폐선암, 편평상피암, 소세포암, 대세포암, 신경상피조직성 종양인 신경교종, 뇌실상의종, 신경세포성 종양, 태아형의 신경외배엽성 종양, 신경초종, 신경섬유종, 수막종, 만성형 림프구성 백혈병, 림프종, 소화관형 림프종, 소화기형 림프종, 소∼ 중 세포형 림프종, 맹장암, 상행 결장암, 하행 결장암, 횡행 결장암, S상 결장암, 직장암이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다.
또, 대상이 되는 동물은 포유 동물이며, 예를 들면 영장류, 펫동물, 가축류, 경기용 동물 등을 포함하는 포유 동물이며, 특히 인간, 개 및 고양이가 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 항체를 의약 조성물로서 사용할 경우에는 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사 제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비이클, 방부제, 결합제 등과 적당히 조합해서 일반적으로 확인된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것이 고려된다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비이클을 사용해서 통상의 제제 실시에 따라서 처방할 수 있다.
주사용의 수용액으로서는 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 그 밖의 보조약을 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알콜, 구체적으로는 에탄올, 폴리알콜, 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트80(TM), HCO-60과 병용해도 좋다.
유성액으로서는 참깨유, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 벤조산 벤질, 벤질알콜과 병용해도 좋다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 아세트산 나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면, 염산 프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알콜, 페놀, 산화 방지제와 배합해도 좋다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전시킨다.
투여는 경구 또는 비경구이며, 바람직하게는 비경구 투여이며, 구체적으로는 주사제형, 경비투여제형, 경폐투여제형, 경피투여형 등을 들 수 있다. 주사제형의 예 로서는 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.
또, 환자의 연령, 체중, 성별, 증상 등에 따라 적당히 투여 방법을 선택할 수 있다. 항체 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 조성물의 투여량으로서는 예를 들면, 1회에 대해서 체중 1kg당 0.0001mg~1000mg의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또는 예를 들면, 환자당 0.001∼100000mg/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있지만, 이들의 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량, 투여 방법은 환자의 체중, 연령, 성별, 증상 등에 따라 변동하지만, 당업자이면 적당히 선택하는 것이 가능하다.
<폴리펩티드 및 DNA>
본 발명은 또한 상기 항체(a)∼(k)에 관한 이하의 폴리펩티드 및 DNA도 제공한다.
(i) 서열 번호 43, 서열 번호 73, 서열 번호 83, 서열 번호 93, 서열 번호 103, 서열 번호 113 및 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
(ii) 서열 번호 47, 서열 번호 53, 서열 번호 58, 서열 번호 63, 서열 번호 68, 서열 번호 77, 서열 번호 87, 서열 번호 97, 서열 번호 107, 서열 번호 117 및 서열 번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
(iii) 서열 번호 48, 서열 번호 78, 서열 번호 88, 서열 번호 98, 서열 번호 108, 서열 번호 118 및 서열 번호 128의 염기 서열을 포함하는 DNA.
(iv) 서열 번호 49, 서열 번호 54, 서열 번호 59, 서열 번호 64, 서열 번호 69, 서열 번호 79, 서열 번호 89, 서열 번호 99, 서열 번호 109, 서열 번호 119 및 서열 번호 129의 염기 서열을 포함하는 DNA.
(v) 서열 번호 40, 41 및 42, 서열 번호 70, 71 및 72, 서열 번호 80, 81 및 82, 서열 번호 90, 91 및 92, 서열 번호 100, 101 및 102, 서열 번호 110, 111 및 112, 서열 번호 120, 121 및 122에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 중쇄 CDR 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
(vi) 서열 번호 44, 45 및 46, 서열 번호 50, 51 및 52, 서열 번호 55, 56 및 57, 서열 번호 60, 61 및 62, 서열 번호 65, 66 및 67, 서열 번호 74, 75 및 76, 서열 번호 84, 85 및 86, 서열 번호 94, 95 및 96, 서열 번호 104, 105 및 106, 서열 번호 114, 115 및 116, 서열 번호 124, 125 및 126에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 경쇄 CDR 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
이들 폴리펩티드 및 DNA는 상기와 같이 유전자 재조합 기술을 사용해서 제작할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들의 구체예에 의해 제한되지 않는 것으로 한다.
실시예 1 SEREX법에 의한 신규 암항원 단백의 동정
(1) cDNA 라이브러리의 제작
건강한 개의 정소조직으로부터 산구아니듐-페놀-클로로포름법(Acid guanidium-Phenol-Chloroform법)에 의해 전체 RNA를 추출하고, Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(다카라 슈조사 제)를 사용해서 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 폴리A RNA를 정제했다.
이 얻어진 mRNA(5μg)를 사용해서 개 정소 cDNA 파지 라이브러리를 합성했다. cDNA 파지 라이브러리의 제작에는 cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Clonig Kit(STRATAGENE사 제)를 사용하고, 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 라이브러리를 제작했다. 제작한 cDNA 파지 라이브러리의 사이즈는 7.73×105pfu/㎖였다.
(2) 혈청에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝
상기 제작한 개 정소 cDNA 파지 라이브러리를 사용해서 이뮤노스크리닝을 행했다. 구체적으로는 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트에 2210클론이 되도록 숙주대장균(XL1-Blue MRF')에 감염시켜, 42℃, 3∼4시간 배양하고, 용균반(플라크)을 제작하고, IPTG(이소프로필-β-D-티오글락토시드)를 침투시킨 니트로셀룰로스 멤브레인(Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Scinece사 제)으로 플레이트를 37℃에서 4시간 덮음으로써 단백질을 유도·발현시켜 멤브레인에 단백질을 전사했다. 그 후 멤브레인을 회수해서 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl pH7.5)에 담궈 4℃에서 하룻밤 진탕함으로써 비특이반응을 억제했다. 이 필터를 500배 희석한 환견 혈청과 실온에서 2∼3시간 반응시켰다.
상기 환견 혈청으로서는 유방암의 환견으로부터 채취한 혈청을 사용했다. 이들 혈청은 -80℃에서 보존하고, 사용 직전에 전처리를 행했다. 혈청 전처리 방법은 이하의 방법에 의한다. 즉, 외래 유전자를 삽입하고 있지 않은 λ ZAP Express 파지를 숙주대장균(XL1-Blure MRF')에 감염시킨 후, NZY 플레이트 배지 상에서 37℃, 하룻밤 배양했다. 이어서 0.5M NaCl을 포함하는 0.2M NaHCO3 pH8.3의 버퍼를 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 15시간 정치후, 상청을 대장균/파지 추출액으로서 회수했다. 이어서, 회수한 대장균/파지 추출액을 NHS-컬럼(GE Healthcare Bio-Science사 제)에 통액해서 대장균·파지 유래의 단백질을 고정화했다. 이 단백 고정화 컬럼에 환견 혈청을 통액·반응시켜 대장균 및 파지에 흡착하는 항체를 혈청으로부터 제거했다. 컬럼을 그냥 지나친 혈청 획분은 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 500배 희석하고, 이것을 임노스크리닝 재료로 했다.
이러한 처리 혈청과 상기 융합 단백질을 블롯한 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween20/TBS)로 4회 세정을 행한 후, 2차 항체로서 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 5000배 희석을 행한 염소 항개 IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories사 제)를 실온에서 1시간 반응시키고, NBT/BCIP 반응액(Roche사 제)을 사용한 효소 발색 반응에 의해 검출하고, 발색 반응 양성 부위에 일치하는 콜로니를 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트 상으로부터 채취하고, SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgClSO4, 50mM Tris-HCl, 0.01% 젤라틴 pH7.5) 500㎕에 용해시켰다. 발색 반응 양성 콜로니가 단일화될 때까지 상기와 동일한 방법으로 2차, 3차 스크리닝을 반복하고, 혈청 중의 IgG와 반응하는 30940개의 파지 클론을 스크리닝해서 5개의 양성 클론을 단리했다.
(3) 단리 항원 유전자의 상동성 검색
상기 방법에 의해 단리한 5개의 양성 클론을 염기 서열 해석에 제공하기 위해서 파지 벡터로부터 플라스미드 벡터로 전환하는 조작을 행했다. 구체적으로는 숙주대장균(XL1-Blue MRF')을 흡광도 OD600이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와, 정제한 파지 용액 250㎕ 또한 ExAssist helper phage(STRATAGENE사 제) 1㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응후, LB 배지를 3㎖ 첨가하고 37℃에서 2.5∼3시간 배양을 행하고, 즉시 70℃의 수욕에서 20분간 보온한 후, 4℃,1000×g, 15분간 원심 분리를 행하여 상청을 파지미드 용액으로서 회수했다. 이어서 파지미드 숙주대장균(SOLR)을 흡광도 OD600이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와, 정제한 파지 용액 10㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시켜, 50㎕를 암피실린(종농도 50μg/㎖) 함유 LB 한천 배지에 뿌려 37℃에서 하룻밤 배양했다. 트랜스폼한 SOLR의 싱글 콜로니를 채취하고, 암피실린(종농도 50μg/㎖) 함유 LB 배지 37℃에서 배양후, QIAGEN plasmid Miniprep Kit(키아겐사 제)를 사용해서 목적의 인서트를 갖는 플라스미드 DNA를 정제했다.
정제한 플라스미드는 서열 번호 31에 기재된 T3 프라이머와 서열 번호 32에 기재된 T7 프라이머를 사용하고, 프라이머 워킹법에 의한 인서트 전체길이 서열의 해석을 행했다. 이 시퀀스 해석에 의해 서열 번호 5, 7, 9, 11, 13에 기재된 유전자 서열을 취득했다. 이 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열(서열 번호 6, 8, 10, 12, 14)을 사용하고, 상동성 검색 프로그램 BLAST 서치(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 행해 기지 유전자와의 상동성 검색을 행한 결과, 얻어진 5개의 유전자 전체가 CAPRIN-1을 코딩하는 유전자인 것이 판명되었다. 5개의 유전자간의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 100%, 아미노산 서열 99%였다. 이 유전자의 인간 상동 인자를 코딩하는 유전자와의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 94%, 아미노산 서열 98%였다. 인간 상동 인자의 염기 서열을 서열 번호 1, 3에, 아미노산 서열을 서열 번호 2,4에 나타낸다. 또한, 취득한 개 유전자의 소 상동 인자를 코딩하는 유전자와의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 94%, 아미노산 서열 97%였다. 소 상동 인자의 염기 서열을 서열 번호 15에, 아미노산 서열을 서열 번호 16에 나타낸다. 또한, 인간 상동 인자를 코딩하는 유전자와 소 상동 인자를 코딩하는 유전자와의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 94%, 아미노산 서열 93∼97%였다. 또한, 취득한 개 유전자의 말 상동 인자를 코딩하는 유전자와의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 93%, 아미노산 서열 97%였다. 말 상동 인자의 염기 서열을 서열 번호 17에, 아미노산 서열을 서열 번호 18에 나타낸다. 또한, 인간 상동 인자를 코딩하는 유전자와 말 상동 인자를 코딩하는 유전자의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 93%, 아미노산 서열 96%였다. 또한, 취득한 개 유전자의 마우스 상동 인자를 코딩하는 유전자와의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 87∼89%, 아미노산 서열 95∼97%였다. 마우스 상동 인자의 염기 서열을 서열 번호 19, 21, 23, 25, 27에, 아미노산 서열을 서열 번호 20, 22, 24, 26, 28에 나타낸다. 또한, 인간 상동 인자를 코딩하는 유전자와 마우스 상동 인자를 코딩하는 유전자의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 89∼91%, 아미노산 서열 95∼96%였다. 또한, 취득한 개 유전자의 닭 상동 인자를 코딩하는 유전자와의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 82%, 아미노산 서열 87%였다. 닭 상동 인자의 염기 서열을 서열 번호 29에, 아미노산 서열을 서열 번호 30에 나타낸다. 또한, 인간 상동 인자를 코딩하는 유전자와 닭 상동 인자를 코딩하는 유전자의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 81∼82%, 아미노산 서열 86%였다.
(4) 각 조직에서의 유전자 발현 해석
상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대해서 개 및 인간의 정상조직 및 각종 세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR법에 의해 조사했다. 역전사 반응은 이하와 같이 행했다. 즉, 각 조직 50∼100mg 및 각 세포주 5∼10×106개의 세포로부터 TRIZOL 시약(invitrogen사 제)을 사용해서 첨부의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출했다. 이 전체 RNA를 사용해서 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen사 제)에 의해 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. PCR 반응은 취득한 유전자 특이적인 프라이머(서열 번호 33 및 34에 기재)를 사용해서 이하와 같이 행했다. 즉, 역전사 반응에 의해 조제한 샘플 0.25㎕, 상기 프라이머를 각 2㎛, 0.2mM 각 dNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리머라아제(다카라 슈조사 제)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전량을 25㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제)를 사용해서 94℃-30초, 60℃-30초, 72℃-30초의 사이클을 30회 반복해서 행했다. 또한, 상기 유전자 특이적 프라이머는 서열 번호 5의 염기 서열(개 CAPRIN-1 유전자) 중의 206번∼632번 및 서열 번호 1의 염기 서열(인간 CAPRIN-1 유전자) 중의 698번∼1124번 염기의 영역을 증폭시키는 것이었다. 비교 대조를 위해서 GAPDH 특이적인 프라이머(서열 번호 35 및 36에 기재)도 동시에 사용했다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 건강한 개 조직에서는 정소에 강한 발현이 보여지고, 한편 개 유방암 및 선암조직에서 발현이 보여졌다. 또한, 취득한 유전자의 인간 상동 인자의 발현을 더불어 확인한 결과, 개 CAPRIN-1 유전자와 마찬가지로 정상조직에서 발현을 확인할 수 있었던 것은 정소뿐이었지만, 암 세포에서는 유방암, 뇌종양, 백혈병, 폐암, 식도암 세포주 등 다종류의 암 세포주에서 발현이 검출되고, 특히 많은 유방암 세포주에서 발현이 확인되었다. 이 결과로부터 CAPRIN-1은 정소 이외의 정상조직에서는 발현이 보여지지 않고, 한편, 많은 암 세포에서 발현되고 있고, 특히 유방암 세포주에서 발현되고 있는 것이 확인되었다.
또한, 도 1 중, 세로축의 참조 번호 1은 상기에서 동정한 유전자의 발현 패턴을, 참조 번호 2는 비교 대조인 GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
(5) CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 폴리클로날 항체의 제작
CAPRIN-1에 결합하는 항체를 얻기 위해서 CAPRIN-1 유래 펩티드(Arg-Asn-Leu-Glu-Lys-Lys-Lys-Gly-Lys-Leu-Asp-Asp-Tyr-Gln(서열 번호 37))를 합성했다. 이 펩티드 1mg을 항원으로 해서 등용량의 불완전 프로인트 애쥬벤트(IFA) 용액과 혼합하고, 이것을 2주간마다 4회, 토끼의 피하에 투여를 행했다. 그 후 혈액을 채취하고, 폴리클로날 항체를 포함하는 항혈청을 얻었다. 또한, 이 항혈청을 프로틴G 담체(GE 헬스케어 바이오사이언스사 제)를 사용해서 정제하고, CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 폴리클로날 항체를 얻었다. 또한, 항원을 투여하고 있지 않은 토끼의 혈청을 상기와 동일하게 해서 프로틴G 담체를 사용해서 정제한 것을 컨트롤 항체로 했다.
(6) 암 세포 상에서의 항원 단백의 발현 해석
이어서 CAPRIN-1 유전자의 발현이 많이 확인된 유방암 세포주 7종(MDA-MB-157, T47D, MRK-nu-1, MDA-MB-231V, BT20, SK-BR-3, MDA-MB-231T)에 대해서 그 세포 표면 상에 CAPRIN-1 단백질이 발현되어 있는지의 여부를 조사했다. 상기에서 유전자 발현이 확인된 각 인간 유방암 세포주 각각 106 세포를 1.5㎖의 미크로 원심 튜브로 원심 분리했다. 이것에 상기 (5)에서 조제한 CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 폴리클로날 항체 2μg(5㎕)을 첨가하고, 또한 95㎕의 0.1% 소태아 혈청을 포함하는 PBS로 현탁후, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 5㎕의 FITC 표식 염소 항래빗 IgG 항체(산타크루즈사 제) 및 95㎕의 0.1% 소태아 혈청(FBS)을 포함하는 PBS로 현탁하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정후, 벡톤디킨슨 가부시키가이샤의 FACS 캘리버로 형광강도를 측정했다. 한편, 상기와 동일한 조작을 CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 폴리클로날 항체 대신에 상기 (5)에서 조제한 컨트롤 항체를 사용해서 행하고 컨트롤로 했다. 그 결과, 항인간 CAPRIN-1 항체가 첨가된 세포는 컨트롤에 비해 모두 형광강도가 30% 이상 강했다. 구체적으로는 MDA-MB-157이 184%, T47D가 221%, MRK-nu-1이 115%, MDA-MB-231V가 82%, BT20이 32%, SK-BR-3이 279%, MDA-MB-231T가 80%인 형광강도의 증강을 나타냈다. 이것으로부터 상기 인간 암 세포주의 세포막 표면 상에 CAPRIN-1 단백이 발현되고 있는 것이 확인되었다. 또한, 상기 형광강도의 증강률은 각 세포에 있어서의 평균 형광강도(MFI값)의 증가율로 나타내어지며, 이하의 계산식에 의해 산출했다.
평균 형광강도의 증가율(형광강도의 증강률)(%)=((항인간 CAPRIN-1 항체를 반응시킨 세포의 MFI값)-(컨트롤 MFI값))÷(컨트롤 MFI값)×100
(7) 면역 조직 화학 염색
(7)-1 마우스 및 개 정상조직에 있어서의 CAPRIN-1의 발현
마우스(Balb/c, 암컷) 및 개(비글견, 암컷)을 에테르 마취 하 및 케타민/이소플루란 마취 하에서 방혈시키고, 개복후, 각 장기(위, 간장, 안구, 흉선, 근육, 골수, 자궁, 소장, 식도, 심장, 신장, 타액선, 대장, 유선, 뇌, 폐, 피부, 부신, 난소, 췌장, 비장, 방광)를 각각 PBS가 들어간 10cm 디시로 옮겼다. PBS 중에서 각 장기를 절개하고, 4% 파라포름알데히드(PFA)를 포함하는 0.1M 인산 완충액(pH7.4)으로 하룻밤 환류 고정했다. 환류액을 버리고, PBS로 각 장기의 조직 표면을 헹구고, 10% 수크로오스를 포함하는 PBS 용액을 50㎖ 용량의 원심 튜브에 넣고, 그 안에 각 조직을 넣어서 4℃에서 2시간 로터를 사용해서 진탕했다. 20% 수크로오스를 포함하는 PBS 용액으로 바꿔넣고, 4℃에서 조직이 잠길 때까지 정치후, 30% 수크로오스를 포함하는 PBS 용액으로 바꿔넣고, 4℃에서 조직이 잠길 때까지 정치했다. 조직을 꺼내어 필요한 부분을 수술용 메스로 잘라냈다. 이어서, OCT 컴파운드(Tissue Tek사 제)를 가해서 조직 표면에 융합시킨 후, 클라이오몰드에 조직을 배치했다. 드라이 아이스 위에 클라이오몰드를 두고 급속 동결시킨 후, 클라이오스타트(LEICA사 제)를 사용해서 10∼20㎛로 박절하고, 슬라이드 글라스째 헤어 드라이어로 30분간 풍건하고, 박절 조직이 놓인 슬라이드 글라스를 제작했다. 이어서 PBS-T(0.05% Tween20을 포함하는 생리식염수)를 채운 염색병에 넣어서 5분마다 PBS-T를 바꿔넣는 조작을 3회 행했다. 절편 주위의 여분의 수분을 킴와이프로 닦아내고, DAKOPEN(DAKO사 제)으로 둘러싼 후 블록킹액으로서 마우스 조직은 MOM 마우스 Ig 블록킹 시약(VECTASTAIN사 제)을, 개 조직은 10% FBS를 포함하는 PBS-T 용액을 각각 첨가하고, 모이스트 챔버 상에서 실온에서 1시간 정치했다. 이어서, 실시예 4에서 제작한 암 세포 표면에 반응하는 서열 번호:73의 중쇄 가변 영역과 서열 번호:77의 경쇄 가변 영역을 갖는 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체(모노클로날 항체 #6)를 블록킹액으로 10μg/㎖로 조제한 용액을 첨가하고, 모이스쳐 챔버 내에서 4℃ 하에서 하룻밤 정치했다. PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후, 블록킹액으로 250배로 희석한 MOM 비오틴 표식 항IgG 항체(VECTASTAIN사 제)를 첨가하여 모이스쳐 챔버 내에서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후, 아비딘-비오틴ABC 시약(VECTASTAIN사 제)을 첨가하고, 모이스쳐 챔버 내에서 실온에서 5분간 정치했다. PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후, DAB 발색액(DAB 10mg+30% H2O2 10㎕/0.05M Tris-HCl(pH7.6) 50㎖)을 넣고, 모이스쳐 챔버 내에서 실온에서 30분간 정치했다. 증류수로 린스하고, 헤마톡시린 시약(DAKO사 제)을 첨가하여 실온에서 1분간 정치후, 증류수로 린스했다. 70%, 80%, 90%, 95%, 100%의 각 에탄올 용액에 순서대로 1분간씩 넣은 후, 크실렌 중에서 하룻밤 정치했다. 슬라이드 글라스를 꺼내고, Glycergel Mounting Medium(DAKO사 제)으로 봉입후, 관찰을 행했다. 그 결과, CAPRIN-1은 타액선, 신장, 결장, 위의 각 조직에 있어서 세포 내에서 약간 발현이 확인되었지만, 세포 표면에서의 발현은 확인되지 않고, 또한 그 밖의 장기유래의 조직에서는 전혀 발현이 확인되지 않았다. 또한, 본 결과는 서열 번호:103의 중쇄 가변 영역과 서열 번호:107의 경쇄 가변 영역을 갖는 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체(모노클로날 항체 #9)를 사용한 경우도 마찬가지였다.
(7)-2 개 유방암 조직에 있어서의 CAPRIN-1의 발현
병리진단에 의해 악성 유방암이라고 진단된 개의 동결된 유방암 조직 108검체를 사용하고, 상기와 동일한 방법으로 동결 절편 슬라이드 제작 및 실시예 4에서 제작한 모노클로날 항체 #6을 사용한 면역 조직 화학 염색을 행했다. 그 결과, CAPRIN-1은 108검체 중 100검체(92.5%)에서 발현이 확인되고, 특히 이형도가 높은 암 세포 표면에 강하게 발현되어 있었다. 또한, 본 결과는 실시예 4에서 제작한 모노클로날 항체 #9를 사용한 경우도 마찬가지였다.
(7)-3 인간 유방암 조직에 있어서의 CAPRIN-1의 발현
파라핀 포매된 인간 유방암 조직 어레이(BIOMAX사 제)의 유방암 조직 188검체를 사용하여 면역 조직 화학 염색을 행했다. 인간 유방암 조직 어레이를 60℃에서 3시간 처리후, 크실렌을 채운 염색병에 넣어서 5분마다 크실렌을 바꿔넣는 조작을 3회 행했다. 이어서 크실렌 대신에 에탄올 및 PBS-T로 동일한 조작을 행했다. 0.05% Tween20을 포함하는 10mM 시트르산 완충액(pH6.0)을 채운 염색병에 인간 유방암 조직 어레이를 넣고, 125℃에서 5분간 처리후, 실온에서 40분 이상 정치했다. 절편 주위의 여분의 수분을 킴와이프로 닦아내고, DAKOPEN으로 둘러싸고, Peroxidase Block(DAKO사 제)을 적량 적하했다. 실온에서 5분간 정치후, PBS-T를 채운 염색병에 넣어서 5분마다 PBS-T를 바꿔넣는 조작을 3회 행했다. 블록킹액으로서 10% FBS를 포함하는 PBS-T 용액을 첨가하고, 모이스쳐 챔버 내에서 실온에서 1시간 정치했다. 이어서 실시예 4에서 제작한 암 세포 표면에 반응하는 모노클로날 항체 #6을 5% FBS를 포함하는 PBS-T 용액에 의해 10μg/㎖로 조제한 용액을 첨가하고, 모이스쳐 챔버 내에서 4℃에서 하룻밤 정치하고, PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후, Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAKO사 제)를 적량 적하하고, 모이스쳐 챔버 내에서 실온에서 30분간 정치했다. PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후, DAB 발색액(DAKO사 제)을 첨가하고, 실온에서 10분 정도 정치한 후, 발색액을 버리고, PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후, 증류수로 린스하고, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%의 각 에탄올 용액에 차례로 1분간씩 넣은 후, 크실렌 중에서 하룻밤 정치했다. 슬라이드 글라스를 꺼내고, Glycergel Mounting Medium(DAKO 사 제)으로 봉입후, 관찰을 행했다. 그 결과, CAPRIN-1은 전체 유방암 조직 188검체 중 138검체(73%)에서 강한 발현이 확인되었다. 또한, 본 결과는 실시예 4에서 제작한 모노클로날 항체 #9를 사용한 경우도 동일하였다.
(7)-4 인간 악성 뇌종양에 있어서의 CAPRIN-1의 발현
파라핀 포매된 인간 악성 뇌종양 조직 어레이(BIOMAX사 제)의 악성 뇌종양 조직 247검체를 사용하고, 상기 (7)-3과 동일한 방법으로 실시예 4에서 제작한 모노클로날 항체 #6를 사용한 면역 조직 화학 염색을 행했다. 그 결과, CAPRIN-1은 전체 악성 뇌종양 조직 247검체 중 227검체(92%)에서 강한 발현이 확인되었다. 또한, 본 결과는 실시예 4에서 제작한 모노클로날 항체 #9를 사용한 경우도 동일하였다.
(7)-5 인간 유방암 전이 림프절에 있어서의 CAPRIN-1의 발현
파라핀 포매된 인간 유방암 전이 림프절 조직 어레이(BIOMAX사 제)의 유방암 전이 림프절 조직 150검체를 사용하여 상기 (7)-3과 동일한 방법으로 실시예 4에서 제작한 모노클로날 항체 #6을 사용한 면역 조직 화학 염색을 행했다. 그 결과, CAPRIN-1은 전체 유방암 전이 림프절 조직 150검체 중 136검체(90%)에서 강한 발현이 확인되었다. 즉, 유방암으로부터 전이한 암조직에 있어서도 CAPRIN-1은 강하게 발현되는 것을 알 수 있었다. 또한, 본 결과는 실시예 4에서 제작한 모노클로날 항체 #9를 사용한 경우도 마찬가지였다.
실시예 2
CAPRIN-1에 대한 항체의 암 세포에 대한 항종양 효과(ADCC 활성)
이어서 CAPRIN-1에 대한 항체는 CAPRIN-1을 발현시키는 종양 세포를 장해할 수 있는지의 여부를 검토했다. 실시예 1에서 조제한 인간 CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 폴리클로날 항체를 사용해서 평가를 행했다. CAPRIN-1의 발현이 확인되어 있는 2종류의 인간 유방암 세포주, T47D 및 MDA-MB-157을 각각 106개 50㎖ 용량의 원심 튜브에 모으고, 100μCi 의 크로뮴51을 첨가하고 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 그 후 10% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에서 3회 세정하고, 96혈 V바닥 플레이트 1구멍당 103개씩 첨가했다. 이것에 상기 인간 CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 폴리클로날 항체를 각각 1μg씩 첨가하고, 또한 토끼의 말초혈로부터 분리된 림프구를 각각 2×105개씩 첨가하여 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양후, 장해를 받은 종양 세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크로뮴(Cr)51의 양을 측정하고, 인간 CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 폴리클로날 항체에 의한 각 암 세포에 대한 ADCC 활성을 산출했다. 그 결과, T47D 및 MDA-MB-157 각각에 대해서 각각 15.4% 및 17.3%의 ADCC 활성이 확인되었다(도 2 및 도 3 참조). 한편, 항원이 면역되어 있지 않은 토끼의 말초혈로부터 조제한 컨트롤 항체(실시예 1(5))를 사용해서 동일한 조작을 행했을 경우, 및 항체를 첨가하지 않았을 경우에는 활성은 거의 확인되지 않았다(도 2 및 3 참조). 따라서, CAPRIN-1에 대한 항체를 사용한 ADCC 활성에 의해 CAPRIN-1을 발현시키는 종양 세포를 장해할 수 있는 것이 명백해졌다.
또한, 세포 장해 활성은 상기한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 CAPRIN-1에 대한 항체, 마우스 림프구 및 크로뮴51을 도입한 103개의 각 백혈병 세포주를 혼합해서 4시간 배양하고, 배양후 배지로 방출된 크로뮴51의 양을 측정하여 이하 계산식*에 의해 산출한 각 백혈병 세포주에 대한 세포 장해 활성을 나타낸 결과이다.
* 식:세포 장해 활성(%)=CAPRIN-1에 대한 항체 및 마우스 림프구를 첨가했을 때의 T47D 및 MDA-MB-157로부터의 크로뮴51 유리량÷1N 염산을 첨가한 표적 세포로부터의 크로뮴51 유리량×100.
실시예 3 인간 신규 암항원 단백의 제작
(1) 재조합 단백질의 제작
실시예 1에서 취득한 서열 번호 1의 유전자를 기초로 이하의 방법으로 인간 상동 유전자의 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 1에서 제작한 각종 조직·세포 cDNA로부터 RT-PCR법에 의한 발현이 확인된 cDNA를 1㎕, SacI 및 XhoI 제한 효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열 번호 38 및 39에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS 폴리머라아제(다카라 슈조사 제)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제)를 이용하여 98℃-10초, 68℃-2.5분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열 번호 2의 아미노산 서열 전체 길이를 코딩하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제)를 사용해서 약 2.1kbp의 DNA 단편을 정제했다.
정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 PCR-Blunt(invitrogen사 제)에 라이게이션했다. 이것을 대장균에 형질 전환 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 SacI 및 XhoI 제한 효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제후, 목적 유전자 서열을 SacI, XhoI 제한 효소로 처리한 대장균용 발현 벡터 pET30a(Novagen사 제)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질을 산생할 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하고, 1mM IPTG 에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균 내에서 발현시켰다.
(2) 재조합 단백질의 정제
상기에서 얻어진 서열 번호 1의 유전자를 발현시키는 각각의 재조합 대장균을 30μg/㎖ 카나마이신 함유 LB 배지에서 600nm에서의 흡광도가 0.7부근이 될 때까지 37℃에서 배양후, 이소프로필-β-D-1-티오가락토피라노시드 종농도가 1mM이 되도록 첨가하고, 37℃에서 4시간 배양했다. 그 후 4800rpm으로 10분간 원심하여 집균했다. 이 균체 펠렛을 인산 완충화 생리식염수로 현탁하고, 또한 4800rpm으로 10분간 원심하여 균체의 세정을 행했다.
이 균체를 인산 완충화 생리식염수에 현탁하고, 빙상에서 초음파 파쇄를 행했다. 대장균 초음파 파쇄액을 6000rpm으로 20분간 원심분리하고, 얻어진 상청을 가용성 획분, 침전물을 불용성 획분으로 했다.
가용성 획분을 정법에 따라서 조정한 니켈킬레이트 컬럼(담체:Chelating Sepharose(상표) Fast Flow(GE HealthCare사), 컬럼 용량 5㎖, 평형화 완충액 50mM 염산 완충액(pH8.0))에 첨가했다. 미흡착 획분을 컬럼 용량의 10배량의 50mM 염산 완충액(pH8.0)과 20mM 이미다졸 함유 20mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정 조작을 행한 후, 즉시 100mM 이미다졸 함유 20mM 인산 완충액(pH8.0)으로 6베드 용출시켰다. 쿠마시 염색에 의해 목적 단백질의 용출을 확인한 100mM 이미다졸 함유 20mM 인산 완충액(pH8.0) 용출 획분을 강음 이온 교환 컬럼(담체:Q Sepharose(상표) Fast Flow(GE HealthCare사), 컬럼 용량 5㎖, 평형화 완충액으로서의 20mM 인산 완충액(pH8.0))에 첨가했다. 미흡착 획분을 컬럼 용량의 10배량의 20mM 인산 완충액(pH7.0)과 200mM 염화나트륨 함유 20mM 인산 완충액(pH7.0)으로 세정 조작을 행한 후, 즉시 400mM 염화나트륨 함유 20mM 인산 완충액(pH7.0)으로 5베드 용출을 행하고, 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 각 단백질의 정제 획분을 얻었다.
상기 방법에 의해 얻어진 각 정제 표품 중 200㎕를 1㎖의 반응용 완충액(20mM Tris-Hcl, 50mM NaCl, 2mM CaCl2 pH7.4)에 분주를 행한 후, 엔타로키나제(Novagen사 제)를 2㎕ 첨가한 후, 실온에서 하룻밤 정치, 반응을 행하고, His 태그를 절단하고, Enterokinase Cleavage Capture Kit(Novagen 사 제)를 사용해서 첨부 프로토콜에 따라서 정제를 행했다. 이어서 상기 방법에 의해 얻어진 정제 표품 1.2㎖를 한외 여과 NANOSEP 10K OMEGA(PALL사 제)를 사용하여 생리용 인산 완충액(닛수이 세이야쿠사 제)으로 치환한 후, HT 터프린 아크로디스크 0.22㎛(PALL사 제)로 무균 여과를 행하고, 이것을 이하의 실험에 사용했다.
실시예 4 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체의 제작
실시예 3에서 조제한 서열 번호 2로 나타내어지는 항원 단백질(인간 CAPRIN-1) 100μg을 등량의 MPL+TDM 애쥬벤트(시그마사 제)와 혼합하고, 이것을 마우스 1마리당 항원 용액으로 했다. 항원 용액을 6주령의 Balb/cc 마우스(니혼 SLC사 제)의 복강 내에 투여후, 1주간 마다 또한 3회 및 24회 투여를 행해 면역을 완료했다. 최후의 면역으로부터 3일후에 적출한 각각의 비장을 멸균한 2장의 슬라이드 글라스에 끼워 갈아서 으깨고, PBS(-)(니수이사 제)를 사용해서 세정하고 1500rpm으로 10분간 원심 분리해서 상청을 제거하는 조작을 3회 반복하여 비장 세포를 얻었다. 얻어진 비장 세포와 마우스 미엘로마 세포 SP2/0(ATCC로부터 구입)를 10:1의 비율로 혼화하고, 그것에 37℃로 가온한 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지 200㎕와 PEG1500(베링거사 제) 800㎕를 혼화해서 조제한 PEG 용액을 첨가해서 5분간 정치해서 세포 융합을 행했다. 1700rpm으로 5분간 원심 분리하여 상청을 제거후, Gibco사 제의 HAT 용액을 2%당량 첨가한 15% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지(HAT 선택 배지) 150㎖로 세포를 현탁하고, 96혈 플레이트(눈쿠사 제)의 1웰당 100㎕씩, 플레이트 15매에 파종했다. 7일간, 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양함으로써 비장 세포와 미엘로마 세포가 융합한 하이브리도마를 얻었다.
제작한 하이브리도마가 산생하는 항체의 CAPRIN-1 단백에 대한 결합 친화성을 지표로 하이브리도마를 선발했다. 실시예 3에서 조제한 CAPRIN-1 단백 용액 1μg/㎖를 96혈 플레이트 1웰당 100㎕ 첨가하고, 4℃에서 18시간 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 3회 세정후, 0.5% Bovine Serum Albumin(BSA) 용액(시그마사 제)을 1웰당 400㎕ 첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 용액을 제외하고, 1웰당 400㎕의 PBS-T로 웰을 3회 세정후, 상기에서 얻어진 하이브리도마의 각 배양 상청을 1웰당 100㎕ 첨가하고, 실온에서 2시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정한 후, PBS로 5000배 희석한 HRP 표식 항마우스 IgG(H+L)항체(인비토로젠사 제)를 1웰당 100㎕ 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후, TMB 기질 용액(Thermo사 제)을 1웰당 100㎕ 첨가해서 15∼30분간 정치해서 발색 반응을 행했다. 발색후, 1규정 황산을 1웰당 100㎕ 첨가해서 반응을 정지시켜 흡광도계를 사용해서 450nm와 595nm의 흡광도값을 측정했다. 그 결과, 흡광도값이 높았던 항체를 산생하는 하이브리도마를 복수개 선발했다.
선발한 하이브리도마를 96혈 플레이트 1웰당 0.5개가 되도록 플레이트에 첨가해서 배양했다. 1주간후, 웰 중에 단일의 콜로니를 형성하고 있는 하이브리도마가 관찰되었다. 이들 웰의 세포를 더 배양하고, 클로닝된 하이브리도마가 산생되는 항체의 CAPRIN-1 단백에 대한 결합 친화성을 지표로 하이브리도마를 선발했다. 실시예 3에서 조제한 CAPRIN-1 단백 용액 1μg/㎖를 96혈 플레이트 1웰당 100㎕ 첨가하고, 4℃에서 18시간 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 3회 세정후, 0.5% BSA 용액을 1웰당 400㎕ 첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 용액을 제외하고, 1웰당 400㎕의 PBS-T로 웰을 3회 세정후, 상기에서 얻어진 하이브리도마의 각 배양 상청을 1웰당 100㎕ 첨가하고, 실온에서 2시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정후, PBS로 5000배 희석한 HRP 표식 항마우스 IgG(H+L) 항체(인비트로젠사 제)를 1웰당 100㎕ 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후, TMB 기질 용액(Thermo사 제)을 1웰당 100㎕ 첨가해서 15∼30분간 정치해서 발색 반응을 행했다. 발색후, 1규정 황산을 1웰당 100㎕ 첨가해서 반응을 정지시켜 흡광도계를 사용해서 450nm와 595nm의 흡광도값을 측정했다. 그 결과, CAPRIN-1 단백에 반응성을 나타내는 모노클로날 항체를 산생하는 150개의 하이브리도마주를 얻었다.
이어서 이들 모노클로날 항체 중 CAPRIN-1이 발현되는 유방암 세포의 세포 표면에 반응성을 나타내는 것을 선발했다. 구체적으로는 106개의 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231V를 1.5㎖ 용량의 미크로 원심 튜브로 원심 분리하고, 이것에 상기 각 하이브리도마의 배양 상청 100㎕를 첨가하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 0.1% FBS를 포함하는 PBS로 500배 희석한 FITC 표식 염소 항마우스 IgG 항체(인비트로젠사 제)를 첨가하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정후, 벡톤디킨슨 가부시키가이샤의 FACS 캘리버로 형광강도를 측정했다. 한편, 상기와 동일한 조작을 항체 대신에 아무것도 처리하지 않은 6주령의 Balb/c 마우스의 혈청을 하이브리도마 배양용 배지로 500배 희석한 것을 사용해서 행하고 컨트롤로 했다. 그 결과, 컨트롤에 비해서 형광강도가 강한 즉 유방암 세포의 세포 표면에 반응하는 모노클로날 항체 11개(#1∼#11)를 선발했다.
실시예 5 선발한 항체의 특징 부여
(1) 항 CAPRIN-1 모노클로날 항체의 가변 영역 유전자의 클로닝
실시예 4에서 선발한 11개의 모노클로날 항체를 각각 산생하는 각 하이브리도마주로부터 mRNA를 추출하고, 마우스 FR1 유래 서열 및 마우스 FR4 유래의 서열에 특이적인 프라이머를 사용한 RT-PCR법에 의해 모든 항CAPRIN-1 모노클로날 항체의 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역의 유전자를 취득했다. 서열 결정을 위해서 이들 유전자를 pCR2.1 벡터(인비트로젠사 제)에 클로닝했다.
(1)-1 RT-PCR
106개의 각 하이브리도마주로부터 mRNA micro purification kit(GE 헬스케어사 제)를 사용해서 mRNA를 조제하고, SuperScriptII 1st strand synthesis kit(인비트로젠사 제)를 사용하여 얻어진 mRNA를 역전사해서 cDNA를 합성했다. 이들 조작은 각 키트의 첨부 프로토콜에 따라 행했다.
얻어진 cDNA를 사용하여 PCR법에 의해 항체 유전자의 증폭을 행했다.
VH 영역의 유전자 취득을 위해서 마우스 중쇄 FR1 서열에 특이적인 프라이머(서열 번호 130) 및 마우스 중쇄 FR4 서열에 특이적인 프라이머(서열 번호 131)를 사용했다. 또 VL 영역의 유전자 취득을 위해서 마우스 경쇄 FR1 서열에 특이적인 프라이머(서열 번호 132) 및 마우스 경쇄 FR4에 특이적인 프라이머(서열 번호 133)를 사용했다. 이들 프라이머는 Jones, S. T. and Bending, M. M. Bio/Technology 9, 88-89(1991)를 참고로 설계했다. PCR은 Ex-taq(다카라 바이오사 제)를 사용했다. 10×EX Taq Buffer 5㎕, dNTP Mixture(2.5mM) 4㎕, 프라이머(1.0㎛) 각 2㎕, Ex Taq(5U/㎕) 0.25㎕에 cDNA 샘플을 첨가하여 멸균수에 의해 총량 50㎕로 했다. 94℃에서 2분 처리후, 변성 94℃ 1분, 어닐링 58℃ 30초, 신장 반응 72℃ 1분의 조합으로 30사이클의 조건으로 행했다.
(1)-2 클로닝
상기에서 얻어진 각 PCR 산물을 사용해서 아가로스 겔로 전기 영동을 행하고, VH 영역 및 VL 영역 각각의 DNA 밴드를 잘라냈다. DNA 단편은 QIAquick Gel purification kit(키아겐사 제)를 사용해서 그 첨부 프로토콜에 따라 행했다. 정제한 각 DNA는 TA 클로닝 키트(인비트로젠사 제)를 사용해서 pCR2.1 벡터에 클로닝했다. 연결한 벡터를 DH5a 컴피턴트 셀(TOYOBO사 제)에 정법에 따라 형질 전환을 행했다. 각 형질 전환체 각각 10클론을 배지(100μg/㎖ 암피실린)에서 37℃ 하룻밤 배양후, 각 플라스미드 DNA를 Qiaspin Miniprep kit(키아겐사 제)를 사용해서 정제했다.
(1)-3 서열 결정
상기에서 얻어진 각 플라스미드 중의 VH 영역 및 VL 영역의 유전자 서열 해석은 M13 포워드 프라이머(서열 번호 134) 및 M13 리버스 프라이머(서열 번호 135)를 사용하여 형광 시퀀서(ABI사 제 DNA 시퀀서 3130XL)에 의해 ABI사 제의 빅다이 터미네이터 Ver3.1 사이클 시퀀싱 키트를 사용하고, 그 첨부 프로토콜에 따라 행했다. 그 결과, 각각의 유전자 서열이 결정되었다(각각 10클론에서 일치).
얻어진 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 43, 서열 번호 73, 서열 번호 83, 서열 번호 93, 서열 번호 103, 서열 번호 113, 및 서열 번호 123에, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 47, 서열 번호 53, 서열 번호 58, 서열 번호 63, 서열 번호 68, 서열 번호 77, 서열 번호 87, 서열 번호 97, 서열 번호 107, 서열 번호 117 및 서열 번호 127에 나타낸다.
즉, 모노클로날 항체 #1은 서열 번호:43의 중쇄 가변 영역과 서열 번호:47의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #2는 서열 번호:43의 중쇄 가변 영역과 서열 번호:53의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #3은 서열 번호:43의 중쇄 가변 영역과 서열 번호:58의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #4는 서열 번호:43의 중쇄 가변 영역과 서열 번호:63의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #5는 서열 번호:43의 중쇄 가변 영역과 서열 번호:68의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #6은 서열 번호:73의 중쇄 가변 영역과 서열 번호:77의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #7은 서열 번호:83의 중쇄 가변 영역과 서열 번호:87의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #8은 서열 번호:93의 중쇄 가변 영역과 서열 번호:97의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #9는 서열 번호:103의 중쇄 가변 영역과 서열 번호:107의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #10은 서열 번호:113의 중쇄 가변 영역과 서열 번호:117의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #11은 서열 번호:123의 중쇄 가변 영역과 서열 번호:127의 경쇄 가변 영역으로 이루어진다.
(2) 취득한 모노클로날 항체를 사용한 각종 암 세포 표면에서의 CAPRIN-1의 발현
이어서 CAPRIN-1 유전자의 발현이 확인된 유방암 세포주 7종(MDA-MB-157, T47D, MRK-nu-1, MDA-MB-231V, BT20, SK-BR-3, DA-MB-231T) 및 그 밖의 유방암 세포주 3종(MDA-MB-231C, MCF-7, ZR75-1), 글리오마 세포주 6종(T98G, SNB19, U251, U87G), 신장암 세포주 3종(Caki-1, Caki2, A498), 위암 세포주 1종(MKN45), 대장암 세포주 1종(Caco2), 폐암 세포주 3종(A549, QG56, PC8), 백혈병 세포주 3종(Namalwa, BDCM, RPI1788)에 대해서 그 세포 표면 상에 CAPRIN-1 단백질이 발현되어 있는지의 여부를 조사했다. 각 세포주 각각 106세포를 1.5㎖ 용량의 미크로 원심 튜브로 원심 분리했다. 이것에 실시예 4에서 제작한 암 세포 표면에 반응하는 #1로부터 #11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체를 포함하는 하이브리도마 상청(100㎕)을 첨가하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 0.1% FBS를 포함하는 PBS로 500배 희석한 FITC 표식 염소 항마우스 IgG 항체(인비트로젠사 제)로 현탁하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정후, 벡톤디킨슨 가부시키가이샤의 FACS 캘리버로 형광강도를 측정했다. 한편, 상기와 동일한 조작을 #1부터 #11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체를 포함하는 하이브리도마 상청 대신에 상기 (5)에서 조제한 컨트롤 항체를 사용해서 행하여 컨트롤로 했다. 그 결과, #1∼#11의 모노클로날 항체가 첨가된 세포는 컨트롤에 비해 모두 형광강도가 30% 이상 강했다. 구체적인 예를 들면, #9의 모노클로날 항체를 사용했을 경우, MDA-MB-157이 211%, T47D가 145%, MRK-nu-1이 123%, MDA-MB-231V가 251%, BT20이 168%, MDA-MB-231T가 94%인 형광강도의 증강을 나타냈다. 이것으로부터 상기 인간 암 세포주의 세포막 표면 상에 CAPRIN-1 단백이 발현되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 상기 형광강도의 증강률은 각 세포에 있어서의 평균 형광강도(MFI값)의 증가율로 나타내어지며, 이하의 계산식에 의해 산출했다.
평균 형광강도의 증가율(형광강도의 증강률)(%)=((항인간 CAPRIN-1 항체를 반응시킨 세포의 MFI값)-(컨트롤 MFI값))÷(컨트롤 MFI값)×100
(3) CAPRIN-1에 대한 항체의 암 세포에 대한 항종양 효과(ADCC 활성)
상기에서 선발한 #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체의 암 세포에 대한 세포 장해 활성(ADCC 활성)을 평가했다. #1∼#11의 모노클로날 항체를 산생 하는 각 하이브리도마를 하이브리도마 SFM(인비트로젠사 제) 배지를 사용해서 배양하고, 얻어진 상청을 Hitrap ProteinA SepharoseFF(GE 헬스케어사 제)를 사용해서 정제하고, PBS(-)로 치환해서 0.22㎛의 필터(미리포아사 제)로 여과한 것을 활성 측정용 항체로서 사용했다. 106개의 인간 유방암 세포주 MDA-MB-157을 50㎖ 용량의 원심 튜브에 모으고, 100μCi의 크로뮴51을 첨가하여 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 그 후 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지로 3회 세정하고, 96혈 V바닥 플레이트 1구멍당 103개씩 첨가해서 표적 세포로 했다. 이것에 상기 정제 항체를 각각 1μg 첨가하고, 또한 마우스 비장으로부터 분리한 마우스 림프구를 2×105개 첨가해서 37℃, 5% CO2의 조건하에서 4시간 배양했다. 배양후, 장해를 받은 종양 세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크로뮴51의 양을 측정하고, 항CAPRIN-1 항체에 의한 암 세포에 대한 ADCC 활성을 산출했다. 그 결과, #1∼#11의 모든 모노클로날 항체가 MDA-MB-157에 대해서 20% 이상의 ADCC 활성을 나타냈다. 구체적으로는 예를 들면, #1은 22.1%, #2는 29.1%, #6은 30.2%, #9는 32.4%의 세포 장해 활성이 얻어졌다(도 4 참조). 한편, 실시예 4에서 제작한 CAPRIN-1 단백 자체에는 반응하지만, 암 세포의 세포 표면에 반응하지 않는 모노클로날 항체를 사용해서 같은 조작을 행했을 경우, 세포 장해 활성은 확인되지 않았다(도 4 참조). 이상의 결과로부터 취득한 항CAPRIN-1 모노클로날 항체(#1∼#11)는 ADCC 활성에 의해 CAPRIN-1을 발현시키는 암 세포를 장해하는 것이 나타내어졌다.
(4) CAPRIN-1에 대한 항체의 암 세포에 대한 항종양 효과(CDC 활성)
상기에서 선발한 #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체의 암 세포에 대한 세포 장해 활성(CDC 활성)을 평가했다. 토끼로부터 채혈한 혈액을 에펜도르프 튜브에 넣고, 실온에서 60분간, 정치한 후 3000rpm으로 5분간, 원심 분리함으로써 CDC 활성 측정용 혈청을 조제했다. 인간 유방암 세포인 MDA-MB-231V를 105개 50㎖ 용량의 원심 튜브에 모으고, 100μCi의 크로뮴51을 첨가해서 37℃에서 2시간 인큐베이트한 후, 10% FBS를 포함하는 RPMI 배지로 3회 세정했다. 그 후 상기에서 조제한 토끼 혈청을 50% 포함하는 RPMI 배지로 현탁하고, 96혈 V바닥 플레이트 1구멍당 103개씩 첨가했다. 이것에 상술(3)에서 얻은 #1∼#11의 모노클로날 항체를 각각 1μg씩 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양후, 장해를 받은 종양 세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크로뮴51의 양을 측정하고, 하이브리도마 상청 중의 항CAPRIN-1 모노클로날 항체에 의한 MDA-MB-231V에 대한 CDC 활성을 산출했다. 그 결과, #1∼#11의 모든 모노클로날 항체가 30% 이상의 CDC활성을 나타냈다. 한편, 실시예 4에서 제작한 CAPRIN-1 단백 자체에는 반응하지만, 암 세포의 세포 표면에 반응하지 않는 모노클로날 항체를 사용해서 같은 조작을 행했을 경우, 세포 장해 활성은 확인되지 않았다. 따라서, CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체(#1∼#11)는 CDC 활성에 의해서도 CAPRIN-1을 발현시키는 종양 세포를 장해할 수 있는 것이 명백해졌다.
실시예 6 마우스 생체 내에 있어서의 항CAPRIN-1 모노클로날 항체의 항종양 효과
이어서, 취득한 #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체의 담암 마우스 생체 내에 있어서의 항종양 효과를 평가했다. 사용한 항체는 상기와 마찬가지로 각 하이브리도마의 배양 상청을 컬럼 정제한 것을 사용했다.
CAPRIN-1을 발현시키는 마우스 유래의 암 세포주를 이식한 담암 마우스를 사용해서 #1∼#11 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체의 항종양 효과를 검토했다. 70마리의 Balb/c 마우스(니혼 SLC사 제)의 등부 피하에 1마리당 106개의 CT26 세포(ATCC로부터 구입)를 이식하고, 종양이 지름 7mm정도의 크기가 될 때까지 성장시켰다. 그 중, 60마리의 담암 마우스에 대해서 #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체 및 실시예 4에서 제작한 CAPRIN-1 단백 자체에는 반응하지만 암 세포의 세포 표면에 반응하지 않는 모노클로날 항체 1종을 1마리당 300μg(300㎕)씩 1항체에 대해서 5마리에게 복강내 투여했다. 그 후, 2일간 총 3회, 동량의 각 항체를 각 담암 마우스의 복강에 투여하고, 매일 종양의 크기를 계측하여 항종양 효과를 관찰했다. 한편, 나머지 10마리의 담암 마우스에 대해서 항체 대신에 PBS(-)를 투여하고, 이것을 컨트롤군으로 했다. 항종양 효과의 관찰 결과, #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체를 투여받은 검토군은 종양이 항체 투여 개시시의 종양 체적을 100%로 한 경우에, 4일째에는 50%정도로까지 퇴축되고, 6일째에는 10%정도, 8일째에는 수%로까지 종양이 퇴축되고, 11∼14일째까지는 종양은 거의 완전히 퇴축되었다(도 5 참조). 한편, 컨트롤군에서는 4일째, 6일째, 8일째, 11일째에는 각각 약 260%, 350%, 550%, 800%로까지 종양이 증대했다(도 5 참조). 또한, CAPRIN-1 단백 자체에는 반응하지만 암 세포의 세포 표면에 반응하지 않는 모노클로날 항체를 투여한 군에서는 항종양 효과는 얻어지지 않고, 컨트롤군과 마찬가지로 종양이 증대했다. 이 결과로부터 취득한 #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체는 CAPRIN-1을 발현시키는 암 세포에 대해서 생체 내에서 강한 항종양 효과를 발휘하는 것이 나타내어졌다. 또한, 종양의 크기는 장경×단경×단경×0.5의 계산식을 사용해서 체적을 산출했다.
또한, 마우스 암 세포주 N1E 세포(ATCC로부터 구입)가 이식된 담암 마우스(Balb/c)에 대해서 #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체를 상기와 마찬가지로 투여한 결과, 항체 투여후 15일째에는 완전히 종양이 퇴축되었다. 한편, 컨트롤군에서는 약 950%로까지 종양은 증대했다(도 6 참조).
실시예 7 암 세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 항체가 결합하는 CAPRIN-1 단백질 중의 펩티드의 동정
상기에서 취득한 암 세포의 세포 표면에 반응하는 #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 이들이 인식하는 CAPRIN-1 단백질 중의 부분 서열의 동정을 행했다.
우선, PBS로 1μg/㎕의 농도로 용해한 재조합 CAPRIN-1 단백질 용액 100㎕에 종농도가 10mM가 되도록 DTT(Fluka사 제)를 첨가하고, 95℃, 5분간 반응시켜서 CAPRIN-1 단백질 내의 디술피드 결합의 환원을 행하고, 이어서 종농도 20mM의 요오드아세트아미드(와코 쥰야쿠사 제)를 첨가하고, 37℃, 차광 조건 하에서 30분간 티올기의 알킬화 반응을 행했다. 얻어진 환원 알킬화 CAPRIN-1 단백질 40μg에 #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체를 각각 50μg 첨가하고, 20mM 인산 완충액(pH7.0) 1㎖에 메스업해서 교반 혼합하면서 4℃에서 하룻밤 반응시켰다.
이어서, 트립신(프로메가사 제)을 종농도 0.2μg이 되도록 첨가하고, 37℃ 1시간, 2시간, 4시간, 12시간 반응시킨 후, 미리 1% BSA(시그마사 제)를 포함하는 PBS로 블록킹하고, PBS로 세정한 프로틴A-유리 비즈(GE사 제)와 1mM 탄산 칼슘, NP-40 완충액(20mM 인산 완충액(pH7.4), 5mM EDTA, 150mM NaCl, 1% NP-40) 중에서 혼합하고, 각각 30분간 반응시켰다.
반응액을 25mM 탄산 암모늄 완충액(pH8.0)으로 세정한 후, 0.1% 포름산 100㎕를 사용해서 항원 항체 복합체를 용출하고, 용출액에 대해서 Q-TOF Premier(Waters-MicroMass사 제)를 사용해서 LC-MS 해석을 행했다. 해석은 기기에 부속된 프로트콜에 따랐다.
그 결과, #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 모노클로날 항체가 모두 인식하는 CAPRIN-1의 부분 서열로서 서열 번호 136의 폴리펩티드가 동정되었다. 또한, 모노클로날 항체 #2∼#5, #6∼#8 및 #10이 인식하는 상기 서열 번호 136의 폴리펩티드 중의 부분 서열로서 서열 번호 137의 펩티드가 동정되고, 또한 그 부분 서열 펩티드인 서열 번호 138의 펩티드를 모노클로날 항체 #2∼#5가 인식하는 것을 알 수 있었다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명의 항체는 암의 치료 및/또는 예방을 위해서 유용하다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허 출원 2009-087285호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 해서 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.
(서열표 프리 텍스트)
서열 번호 31∼39, 서열 번호 130∼135:프라이머
SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> Pharmaceutical Composition for Treatment and Prevention of Cancers <130> PH-4051-PCT <150> JP 2008-201928 <151> 2008-08-05 <150> JP 2009-87285 <151> 2009-03-31 <160> 138 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 5562 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (190)..(2319) <223> <400> 1 cagagggctg ctggctggct aagtccctcc cgctcccggc tctcgcctca ctaggagcgg 60 ctctcggtgc agcgggacag ggcgaagcgg cctgcgccca cggagcgcgc gacactgccc 120 ggaagggacc gccacccttg ccccctcagc tgcccactcg tgatttccag cggcctccgc 180 gcgcgcacg atg ccc tcg gcc acc agc cac agc ggg agc ggc agc aag tcg 231 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser 1 5 10 tcc gga ccg cca ccg ccg tcg ggt tcc tcc ggg agt gag gcg gcc gcg 279 Ser Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala 15 20 25 30 gga gcc ggg gcc gcc gcg ccg gct tct cag cac ccc gca acc ggc acc 327 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr 35 40 45 ggc gct gtc cag acc gag 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Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp 255 260 265 270 cag gta cct gaa gct gaa cct gag cca gca gaa gag tac act gag caa 1047 Gln Val Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gln 275 280 285 agt gaa gtt gaa tca aca gag tat gta aat aga cag ttc atg gca gaa 1095 Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu 290 295 300 aca cag ttc acc agt ggt gaa aag gag cag gta gat gag tgg aca gtt 1143 Thr Gln Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Glu Trp Thr Val 305 310 315 gaa acg gtt gag gtg gta aat tca ctc cag cag caa cct cag gct gca 1191 Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ala 320 325 330 tcc cct tca gta cca gag ccc cac tct ttg act cca gtg gct cag gca 1239 Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln Ala 335 340 345 350 gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gta caa gac ctt atg gca caa atg 1287 Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln Met 355 360 365 cag ggt ccc tat aat ttc ata cag gat tca atg ctg gat ttt gaa aat 1335 Gln Gly Pro 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cag 1671 Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln 480 485 490 gct ggg aca agc aaa cct tta cat agc agt gga atc aat gta aat gca 1719 Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala 495 500 505 510 gct cca ttc caa tcc atg caa acg gtg ttc aat atg aat gcc cca gtt 1767 Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val 515 520 525 cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta aaa cag caa aat cag tac cag 1815 Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Asn Gln Tyr Gln 530 535 540 gcc agt tat aac cag agc ttt tct agt cag cct cac caa gta gaa caa 1863 Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln 545 550 555 aca gag ctt cag caa gaa cag ctt caa aca gtg gtt ggc act tac cat 1911 Thr Glu Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr His 560 565 570 ggt tcc cca gac cag tcc cat caa gtg act ggt aac cac cag cag cct 1959 Gly Ser Pro Asp Gln Ser His Gln Val Thr Gly Asn His Gln Gln Pro 575 580 585 590 cct cag cag aac act gga ttt cca cgt agc aat cag ccc tat tac aat 2007 Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gln Pro Tyr Tyr Asn 595 600 605 agt cgt ggt gtg tct cgt gga ggc tcc cgt ggt gct aga ggc ttg atg 2055 Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met 610 615 620 aat gga tac cgg ggc cct gcc aat gga ttc aga gga gga tat gat ggt 2103 Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly 625 630 635 tac cgc cct tca ttc tct aac act cca aac agt ggt tat aca cag tct 2151 Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gln Ser 640 645 650 cag ttc agt gct ccc cgg gat tac tct ggc tat caa cgg gat gga tat 2199 Gln Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr 655 660 665 670 cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg cag agt gga cca cgg gga gcc 2247 Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala 675 680 685 cca cga ggt aat att ttg tgg tgg tga tcctagctcc taagtggagc 2294 Pro Arg Gly Asn Ile Leu Trp Trp 690 ttctgttctg gccttggaag agctgttaat agtctgcatg ttaggaatac atttatcctt 2354 tccagacttg ttgctaggga ttaaatgaaa tgctctgttt ctaaaactta atcttggacc 2414 caaattttaa tttttgaatg atttaatttt ccctgttact atataaactg tcttgaaaac 2474 tagaacatat tctcttctca gaaaaagtgt ttttccaact gaaaattatt tttcaggtcc 2534 taaaacctgc taaatgtttt taggaagtac ttactgaaac atttttgtaa gacatttttg 2594 gaatgagatt gaacatttat ataaatttat tattcctctt tcattttttt gaaacatgcc 2654 tattatattt tagggccaga caccctttaa tggccggata agccatagtt aacatttaga 2714 gaaccattta gaagtgatag aactaatgga atttgcaatg ccttttggac ctctattagt 2774 gatataaata tcaagttatt tctgactttt aaacaaaact cccaaattcc taacttattg 2834 agctatactt aaaaaaaatt acaggtttag agagtttttt gtttttcttt tactgttgga 2894 aaactacttc ccattttggc aggaagttaa cctatttaac aattagagct agcatttcat 2954 gtagtctgaa attctaaatg gttctctgat ttgagggagg ttaaacatca aacaggtttc 3014 ctctattggc cataacatgt ataaaatgtg tgttaaggag gaattacaac gtactttgat 3074 ttgaatacta gtagaaactg gccaggaaaa aggtacattt ttctaaaaat taatggatca 3134 cttgggaatt actgacttga ctagaagtat caaaggatgt ttgcatgtga atgtgggtta 3194 tgttctttcc caccttgtag catattcgat gaaagttgag ttaactgata gctaaaaatc 3254 tgttttaaca gcatgtaaaa agttatttta tctgttaaaa gtcattatac agttttgaat 3314 gttatgtagt ttctttttaa cagtttaggt aataaggtct gttttcattc tggtgctttt 3374 attaattttg atagtatgat gttacttact actgaaatgt aagctagagt gtacactaga 3434 atgtaagctc catgagagca ggtaccttgt ctgtcttctc tgctgtatct attcccaacg 3494 cttgatgatg gtgcctggca catagtaggc actcaataaa tatttgttga atgaatgaa 3553 <210> 4 <211> 694 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala 35 40 45 Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys 50 55 60 Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu 65 70 75 80 Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val 85 90 95 Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu 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gat att cag aaa aca ata aag aag act gca cgt cgg gag cag ctt 105 Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu 5 10 15 20 atg aga gag gaa gcg gaa caa aaa cgt tta aaa act gta ctt gag ctc 153 Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu 25 30 35 cag tat gtt ttg gac aaa ttg gga gat gat gaa gtg aga act gac ctg 201 Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu 40 45 50 aag caa ggt ttg aat gga gtg cca ata ttg tct gaa gaa gaa ttg tcg 249 Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser 55 60 65 ttg ttg gat gaa ttc tac aaa tta gca gac cct gaa cgg gac atg agc 297 Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser 70 75 80 ttg agg ttg aat gag cag tat gaa cat gct tcc att cac ctg tgg gac 345 Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp 85 90 95 100 ttg ctg gaa gga aag gaa aag tct gta tgt gga aca acc tat aaa gca 393 Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Ser Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala 105 110 115 cta aag gaa att gtt gag cgt gtt ttc cag tca aat tac ttt gac agc 441 Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser 120 125 130 act cac aac cac cag aat ggg cta tgt gag gaa gaa gag gca gcc tca 489 Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser 135 140 145 gca cct aca gtt gaa gac cag gta gct gaa gct gag cct gag cca gca 537 Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala 150 155 160 gaa gaa tac act gaa caa agt gaa gtt gaa tca aca gag tat gta aat 585 Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn 165 170 175 180 aga caa ttt atg gca gaa aca cag ttc agc agt ggt gaa aag gag cag 633 Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Glu Gln 185 190 195 gta gat gag tgg acg gtc gaa aca gtg gag gtg gtg aat tca ctc cag 681 Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln 200 205 210 cag caa cct cag gct gcg tct cct tca gta cca gag ccc cac tct ttg 729 Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu 215 220 225 act ccg gtg gct cag gca gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gtc cag 777 Thr Pro Val Ala Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln 230 235 240 gac ctt atg gcg cag atg cag ggg ccc tat aat ttc ata cag gat tca 825 Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser 245 250 255 260 atg ctg gat ttt gaa aac cag aca ctc gat cct gcc att gta tct gca 873 Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala 265 270 275 cag cct atg aat ccg aca caa aac atg gac atg ccc cag ctg gtt tgc 921 Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val Cys 280 285 290 cct cca gtt cat tct gaa tct aga ctt gct caa cct aat caa gtt cct 969 Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Pro 295 300 305 gta caa cca gaa gct aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt gag 1017 Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu 310 315 320 ggg tat aca gca tct caa ccc ttg tac cag cct tct cat gct aca gag 1065 Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Glu 325 330 335 340 caa cga cca caa aag gaa cca att gac cag att cag gca aca atc tct 1113 Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Ile Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser 345 350 355 tta aat aca gac cag act aca gcg tca tca tcc ctt ccg gct gct tct 1161 Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser 360 365 370 cag cct cag gta ttc cag gct ggg aca agc aaa cca tta cat agc agt 1209 Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser 375 380 385 gga atc aat gta aat gca gct cca ttc caa tcc atg caa acg gtg ttc 1257 Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe 390 395 400 aat atg aat gcc cca gtt cct cct gtt aat gaa cca gaa act ttg aaa 1305 Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys 405 410 415 420 caa caa aat cag tac cag gcc agt tat aac cag agc ttt tct agt cag 1353 Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln 425 430 435 cct cac caa gta gaa caa aca gag gga tgc cgc aaa tga acactcagca 1402 Pro His Gln Val Glu Gln Thr Glu Gly Cys Arg Lys 440 445 agtgaattaa tctgattcac aggattatgt ttaaacgcca aaaacacact ggccagtgta 1462 ccataatatg ttaccagaag agttattatc tatttgttct ccctttcagg aaacttattg 1522 taaagggact gttttcatcc cataaagaca ggactacaat tgtcagcttt atattacctg 1582 gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1605 <210> 6 <211> 448 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 6 Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg 1 5 10 15 Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr 20 25 30 Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val 35 40 45 Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu 50 55 60 Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu 65 70 75 80 Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile 85 90 95 His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Ser Val Cys Gly Thr 100 105 110 Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn 115 120 125 Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu 130 135 140 Glu Ala Ala Ser Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu 145 150 155 160 Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr 165 170 175 Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser Ser Gly 180 185 190 Glu Lys Glu Gln Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val 195 200 205 Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu 210 215 220 Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg 225 230 235 240 Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe 245 250 255 Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala 260 265 270 Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp Met Pro 275 280 285 Gln Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro 290 295 300 Asn Gln Val Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser 305 310 315 320 Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser 325 330 335 His Ala Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Ile Asp Gln Ile Gln 340 345 350 Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu 355 360 365 Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro 370 375 380 Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met 385 390 395 400 Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro 405 410 415 Glu Thr Leu Lys Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser 420 425 430 Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln Thr Glu Gly Cys Arg Lys 435 440 445 <210> 7 <211> 4154 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (1)..(2154) <223> <400> 7 atg ccg tcg gcc acc agc ctc agc gga agc ggc agc aag tcg tcg ggc 48 Met Pro Ser Ala Thr Ser Leu Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 ccg ccg ccc ccg tcg ggt tcc tcc ggg agc gag gcg gcg gcg gcg gcg 96 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 ggg gcg gcg ggg gcg gcg ggg gcc ggg gcg gct gcg ccc gcc tcc cag 144 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln 35 40 45 cac ccc gcg acc ggc acc ggc gct gtc cag acc gag gcc atg aag cag 192 His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln 50 55 60 atc ctc ggg gtg atc gac aag aaa ctc cgg aac ctg gag aag aaa aag 240 Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys 65 70 75 80 ggc aag ctt gat gat tac cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt 288 Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu 85 90 95 aat caa gat cag ctg gat gcc gta tct aag tac cag gaa gtc aca aat 336 Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn 100 105 110 aac ttg gag ttt gca aaa gaa tta cag agg agt ttc atg gca tta agt 384 Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser 115 120 125 caa gat att cag aaa aca ata aag aag act gca cgt cgg gag cag ctt 432 Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu 130 135 140 atg aga gag gaa gcg gaa caa aaa cgt tta aaa act gta ctt gag ctc 480 Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu 145 150 155 160 cag tat gtt ttg gac aaa ttg gga gat gat gaa gtg aga act gac ctg 528 Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu 165 170 175 aag caa ggt ttg aat gga gtg cca ata ttg tct gaa gaa gaa ttg tcg 576 Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser 180 185 190 ttg ttg gat gaa ttc tac aaa tta gca gac cct gaa cgg gac atg agc 624 Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser 195 200 205 ttg agg ttg aat gag cag tat gaa cat gct tcc att cac ctg tgg gac 672 Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp 210 215 220 ttg ctg gaa gga aag gaa aag tct gta tgt gga aca acc tat aaa gca 720 Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Ser Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala 225 230 235 240 cta aag gaa att gtt gag cgt gtt ttc cag tca aat tac ttt gac agc 768 Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser 245 250 255 act cac aac cac cag aat ggg cta tgt gag gaa gaa gag gca gcc tca 816 Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser 260 265 270 gca cct aca gtt gaa gac cag gta gct gaa gct gag cct gag cca gca 864 Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala 275 280 285 gaa gaa tac act gaa caa agt gaa gtt gaa tca aca gag tat gta aat 912 Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn 290 295 300 aga caa ttt atg gca gaa aca cag ttc agc agt ggt gaa aag gag cag 960 Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Glu Gln 305 310 315 320 gta gat gag tgg acg gtc gaa aca gtg gag gtg gtg aat tca ctc cag 1008 Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln 325 330 335 cag caa cct cag gct gcg tct cct tca gta cca gag ccc cac tct ttg 1056 Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu 340 345 350 act ccg gtg gct cag gca gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gtc cag 1104 Thr Pro Val Ala Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln 355 360 365 gac ctt atg gcg cag atg cag ggg ccc tat aat ttc ata cag gat tca 1152 Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser 370 375 380 atg ctg gat ttt gaa aac cag aca ctc gat cct gcc att gta tct gca 1200 Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala 385 390 395 400 cag cct atg aat ccg aca caa aac atg gac atg ccc cag ctg gtt tgc 1248 Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val Cys 405 410 415 cct cca gtt cat tct gaa tct aga ctt gct caa cct aat caa gtt cct 1296 Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Pro 420 425 430 gta caa cca gaa gct aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt gag 1344 Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu 435 440 445 ggg tat aca gca tct caa ccc ttg tac cag cct tct cat gct aca gag 1392 Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Glu 450 455 460 caa cga cca caa aag gaa cca att gac cag att cag gca aca atc tct 1440 Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Ile Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser 465 470 475 480 tta aat aca gac cag act aca gcg tca tca tcc ctt ccg gct gct tct 1488 Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser 485 490 495 cag cct cag gta ttc cag gct ggg aca agc aaa cca tta cat agc agt 1536 Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser 500 505 510 gga atc aat gta aat gca gct cca ttc caa tcc atg caa acg gtg ttc 1584 Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe 515 520 525 aat atg aat gcc cca gtt cct cct gtt aat gaa cca gaa act ttg aaa 1632 Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys 530 535 540 caa caa aat cag tac cag gcc agt tat aac cag agc ttt tct agt cag 1680 Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln 545 550 555 560 cct cac caa gta gaa caa aca gac ctt cag caa gaa cag ctt caa aca 1728 Pro His Gln Val Glu Gln Thr Asp Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr 565 570 575 gtg gtt ggc act tac cat ggt tcc cag gac cag ccc cac caa gtg act 1776 Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Gln Asp Gln Pro His Gln Val Thr 580 585 590 ggt aac cat cag cag cct ccc cag cag aac act gga ttt cca cgt agc 1824 Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser 595 600 605 agt cag ccc tat tac aat agt cgt ggt gtg tct cgt ggt ggt tcc cgt 1872 Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg 610 615 620 ggt gct aga ggc tta atg aat gga tac agg ggc cct gcc aat gga ttc 1920 Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe 625 630 635 640 aga gga gga tat gat ggt tac cgc cct tca ttc tct aac act cca aac 1968 Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn 645 650 655 agt ggt tat aca cag tct cag ttc agt gct ccc cgg gac tac tct ggc 2016 Ser Gly Tyr Thr Gln Ser Gln Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly 660 665 670 tat cag cgg gat gga tat cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg cag 2064 Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln 675 680 685 agt gga cca cgg gga gcc cca cga ggt cgt gga ggg ccc cca aga ccc 2112 Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro 690 695 700 aac aga ggg atg ccg caa atg aac act cag caa gtg aat taa 2154 Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn Thr Gln Gln Val Asn 705 710 715 tctgattcac aggattatgt ttaaacgcca aaaacacact ggccagtgta ccataatatg 2214 ttaccagaag agttattatc tatttgttct ccctttcagg aaacttattg taaagggact 2274 gttttcatcc cataaagaca ggactacaat tgtcagcttt atattacctg gatatggaag 2334 gaaactattt ttattctgca tgttcttcct aagcgtcatc ttgagccttg cacatgatac 2394 tcagattcct cacccttgct taggagtaaa acataataca ctttacaggg tgatatctcc 2454 atagttattt gaagtggctt ggaaaaagca agattaactt ctgacattgg ataaaaatca 2514 acaaatcagc cctagagtta ttcaaatggt aattgacaaa aactaaaata tttcccttcg 2574 agaaggagtg gaatgtggtt tggcagaaca actgcatttc acagcttttc cggttaaatt 2634 ggagcactaa acgtttagat gcataccaaa ttatgcatgg gcccttaata taaaaggctg 2694 gctaccagct ttgacacagc actattcatc ctctggccaa acaactgtgg ttaaacaaca 2754 catgtaaatt gctttttaac agctgatact ataataagac aaagccaaaa tgcaaaaatt 2814 gggctttgat tggcactttt tgaaaaatat gcaacaaata tgggatgtaa tctggatggc 2874 cgcttctgta cttaatgtga agtatttaga tacctttttg aacacttaac agtttcttct 2934 gacaatgact tttgtaagga ttggtactat ctatcattcc ttataatgta cattgtctgt 2994 cactaatcct cagatcttgc tgtattgtca cctaaattgg tacaggtact gatgaaaata 3054 tctaatggat aatcataaca ctcttggtca catgtttttc ctgcagcctg aaggttttta 3114 aaagaaaaag atatcaaatg cctgctgcta ccaccctttt aaattgctat cttttgaaaa 3174 gcaccagtat gtgttttaga ttgatttccc tattttaggg aaatgacaga cagtagtttc 3234 agttctgatg gtataagcaa aacaaataaa acatgtttat aaaagttgta tcttgaaaca 3294 ctggtgttca acagctagca gcttatgtgg ttcaccccat gcattgttag tgtttcagat 3354 tttatggtta tctccagcag ctgtttctgt agtacttgca tttatctttt gtctaaccct 3414 aatattctca cggaggcatt tatattcaaa gtggtgatcc cttcacttag acgcataggg 3474 agagtcacaa gtttgatgaa gaggacagtg tagtaattta tatgctgttg gaatttgtgc 3534 tagcagtttg agcactagtt ctgtgtgcct atgaacttaa tgctgcttgt catattccac 3594 tttgacttca tggagaatta atcccatcta ctcagcaaag gctatactaa tactaagtta 3654 atggtatttt ctgtgcagaa attgaatttt gttttattag catttagcta aggaattttt 3714 ccagtaggtg ctcagctact aaagaaaaac aaaaacaaga cacaaaacta ttctcaaaca 3774 ttcattgtta gacaactgga gtttttgctg gttttgtaac ctactaaaat ggataggctg 3834 ttgaacattc cacattcaaa agttttttgt agggtggtgg ggaagggggg gtgtcttcaa 3894 tgtttatttt aaaataaaat aagttcttga cttttctcat gtgtggttgt ggtacatcat 3954 attggaaggg ttatctgttt acttttgcaa atgagtattt ctcttgctag cacctcccgt 4014 tgtgcgcttt aaatgacatc tgcctgggat gtaccacaac catatgttag ctgtatttta 4074 tggggaatag ataaaatatt cgtggtttat tgggtaatcc ctagatgtgt atgcttacaa 4134 tcctatatat aaaactaaat 4154 <210> 8 <211> 717 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 8 Met Pro Ser Ala Thr Ser Leu Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln 35 40 45 His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu 85 90 95 Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val 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(1)..(2109) <223> <400> 9 atg ccg tcg gcc acc agc ctc agc gga agc ggc agc aag tcg tcg ggc 48 Met Pro Ser Ala Thr Ser Leu Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 ccg ccg ccc ccg tcg ggt tcc tcc ggg agc gag gcg gcg gcg gcg gcg 96 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 ggg gcg gcg ggg gcg gcg ggg gcc ggg gcg gct gcg ccc gcc tcc cag 144 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln 35 40 45 cac ccc gcg acc ggc acc ggc gct gtc cag acc gag gcc atg aag cag 192 His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln 50 55 60 atc ctc ggg gtg atc gac aag aaa ctc cgg aac ctg gag aag aaa aag 240 Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys 65 70 75 80 ggc aag ctt gat gat tac cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt 288 Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu 85 90 95 aat caa gat cag ctg gat gcc gta tct aag tac cag gaa gtc aca aat 336 Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn 100 105 110 aac ttg gag ttt gca aaa gaa tta cag agg agt ttc atg gca tta agt 384 Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser 115 120 125 caa gat att cag aaa aca ata aag aag act gca cgt cgg gag cag ctt 432 Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu 130 135 140 atg aga gag gaa gcg gaa caa aaa cgt tta aaa act gta ctt gag ctc 480 Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu 145 150 155 160 cag tat gtt ttg gac aaa ttg gga gat gat gaa gtg aga act gac ctg 528 Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu 165 170 175 aag caa ggt ttg aat gga gtg cca ata ttg tct gaa gaa gaa ttg tcg 576 Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser 180 185 190 ttg ttg gat gaa ttc tac aaa tta gca gac cct gaa cgg gac atg agc 624 Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser 195 200 205 ttg agg ttg aat gag cag tat gaa cat gct tcc att cac ctg tgg gac 672 Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp 210 215 220 ttg ctg gaa gga aag gaa aag tct gta tgt gga aca acc tat aaa gca 720 Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Ser Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala 225 230 235 240 cta aag gaa att gtt gag cgt gtt ttc cag tca aat tac ttt gac agc 768 Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser 245 250 255 act cac aac cac cag aat ggg cta tgt gag gaa gaa gag gca gcc tca 816 Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser 260 265 270 gca cct aca gtt gaa gac cag gta gct gaa gct gag cct gag cca gca 864 Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala 275 280 285 gaa gaa tac act gaa caa agt gaa gtt gaa tca aca gag tat gta aat 912 Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn 290 295 300 aga caa ttt atg gca gaa aca cag ttc agc agt ggt gaa aag gag cag 960 Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Glu Gln 305 310 315 320 gta gat gag tgg acg gtc gaa aca gtg gag gtg gtg aat tca ctc cag 1008 Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln 325 330 335 cag caa cct cag gct gcg tct cct tca gta cca gag ccc cac tct ttg 1056 Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu 340 345 350 act ccg gtg gct cag gca gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gtc cag 1104 Thr Pro Val Ala Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln 355 360 365 gac ctt atg gcg cag atg cag ggg ccc tat aat ttc ata cag gat tca 1152 Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser 370 375 380 atg ctg gat ttt gaa aac cag aca ctc gat cct gcc att gta tct gca 1200 Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala 385 390 395 400 cag cct atg aat ccg aca caa aac atg gac atg ccc cag ctg gtt tgc 1248 Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val Cys 405 410 415 cct cca gtt cat tct gaa tct aga ctt gct caa cct aat caa gtt cct 1296 Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Pro 420 425 430 gta caa cca gaa gct aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt gag 1344 Val Gln 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agt gct ccc cgg gac tac tct ggc 2016 Ser Gly Tyr Thr Gln Ser Gln Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly 660 665 670 tat cag cgg gat gga tat cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg cag 2064 Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln 675 680 685 agt gga cca cgg gga gcc cca cga ggt aat att ttg tgg tgg tga 2109 Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Asn Ile Leu Trp Trp 690 695 700 tcctagctcc taagtggagc ttctgttctg gccttggaag agctgttcca tagtctgcat 2169 gtaggttaca tgttaggaat acatttatca ttaccagact tgttgctagg gattaaatga 2229 aatgctctgt ttctaaaact tctcttgaac ccaaatttaa ttttttgaat gactttccct 2289 gttactatat aaattgtctt gaaaactaga acatttctcc tcctcagaaa aagtgttttt 2349 ccaactgcaa attatttttc aggtcctaaa acctgctaaa tgtttttagg aagtacttac 2409 tgaaacattt ttgtaagaca tttttggaat gagattgaac atttatataa atttattatt 2469 attcctcttt catttttgaa catgcatatt atattttagg gtcagaaatc ctttaatggc 2529 caaataagcc atagttacat ttagagaacc atttagaagt gatagaacta actgaaattt 2589 caatgccttt ggatcattaa tagcgatata aatttcaaat tgtttctgac ttttaaataa 2649 aacatccaaa atcctaacta acttcctgaa ctatatttaa aaattacagg tttaaggagt 2709 ttctggtttt ttttctctta ccataggaaa actgtttcct gtttggccag gaagtcaacc 2769 tgtgtaataa ttagaagtag catttcatat gatctgaagt tctaaatggt tctctgattt 2829 aagggaagtt aaattgaata ggtttcctct agttattggc cataacatgt ataaaatgta 2889 tattaaggag gaatacaaag tactttgatt tcaatgctag tagaaactgg ccagcaaaaa 2949 ggtgcatttt atttttaaat taatggatca cttgggaatt actgacttga agtatcaaag 3009 gatatttgca tgtgaatgtg ggttatgttc tttctcacct tgtagcatat tctatgaaag 3069 ttgagttgac tggtagctaa aaatctgttt taacagcatg taaaaagtta ttttatctgt 3129 tacaagtcat tatacaattt tgaatgttat gtagtttctt tttaacagtt taggtaacaa 3189 ggtctgtttt tcattctggt gcttttatta attttgatag tatgatgtta cttactactg 3249 aaatgtaagc tagagtgtac actagaatgt aagctccatg agagcaggta ccttgtctgt 3309 cttcactgct gtatctattt ccaacgcctg atgacagtgc ctgacacata gtaggcactc 3369 aataaatact tgttgaatga atgaatgaat gagtactggt ggaatactcc attagctcta 3429 ctcttctttt agctagagaa catgagcaaa 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Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln 35 40 45 His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu 85 90 95 Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn 100 105 110 Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser 115 120 125 Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu 130 135 140 Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu 145 150 155 160 Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu 165 170 175 Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser 180 185 190 Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser 195 200 205 Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp 210 215 220 Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Ser Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala 225 230 235 240 Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln 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gat tac cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt 288 Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu 85 90 95 aat caa gat cag ctg gat gcc gta tct aag tac cag gaa gtc aca aat 336 Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn 100 105 110 aac ttg gag ttt gca aaa gaa tta cag agg agt ttc atg gca tta agt 384 Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser 115 120 125 caa gat att cag aaa aca ata aag aag act gca cgt cgg gag cag ctt 432 Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu 130 135 140 atg aga gag gaa gcg gaa caa aaa cgt tta aaa act gta ctt gag ctc 480 Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu 145 150 155 160 cag tat gtt ttg gac aaa ttg gga gat gat gaa gtg aga act gac ctg 528 Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu 165 170 175 aag caa ggt ttg aat gga gtg cca ata ttg tct gaa gaa gaa ttg tcg 576 Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser 180 185 190 ttg ttg gat gaa ttc tac aaa tta gca gac cct gaa cgg gac atg agc 624 Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser 195 200 205 ttg agg ttg aat gag cag tat gaa cat gct tcc att cac ctg tgg gac 672 Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp 210 215 220 ttg ctg gaa gga aag gaa aag tct gta tgt gga aca acc tat aaa gca 720 Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Ser Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala 225 230 235 240 cta aag gaa att gtt gag cgt gtt ttc cag tca aat tac ttt gac agc 768 Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser 245 250 255 act cac aac cac cag aat ggg cta tgt gag gaa gaa gag gca gcc tca 816 Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser 260 265 270 gca cct aca gtt gaa gac cag gta gct gaa gct gag cct gag cca gca 864 Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala 275 280 285 gaa gaa tac act gaa caa agt gaa gtt gaa tca aca gag tat gta aat 912 Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn 290 295 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Gln Leu Val Cys 405 410 415 cct cca gtt cat tct gaa tct aga ctt gct caa cct aat caa gtt cct 1296 Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Pro 420 425 430 gta caa cca gaa gct aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt gag 1344 Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu 435 440 445 ggg tat aca gca tct caa ccc ttg tac cag cct tct cat gct aca gag 1392 Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Glu 450 455 460 caa cga cca caa aag gaa cca att gac cag att cag gca aca atc tct 1440 Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Ile Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser 465 470 475 480 tta aat aca gac cag act aca gcg tca tca tcc ctt ccg gct gct tct 1488 Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser 485 490 495 cag cct cag gta ttc cag gct ggg aca agc aaa cca tta cat agc agt 1536 Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser 500 505 510 gga atc aat gta aat gca gct cca ttc caa tcc atg caa acg gtg ttc 1584 Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe 515 520 525 aat atg aat gcc cca gtt cct cct gtt aat gaa cca gaa act ttg aaa 1632 Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys 530 535 540 caa caa aat cag tac cag gcc agt tat aac cag agc ttt tct agt cag 1680 Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln 545 550 555 560 cct cac caa gta gaa caa aca gac ctt cag caa gaa cag ctt caa aca 1728 Pro His Gln Val Glu Gln Thr Asp Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr 565 570 575 gtg gtt ggc act tac cat ggt tcc cag gac cag ccc cac caa gtg act 1776 Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Gln Asp Gln Pro His Gln Val Thr 580 585 590 ggt aac cat cag cag cct ccc cag cag aac act gga ttt cca cgt agc 1824 Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser 595 600 605 agt cag ccc tat tac aat agt cgt ggt gtg tct cgt ggt ggt tcc cgt 1872 Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg 610 615 620 ggt gct aga ggc tta atg aat gga tac agg ggc cct gcc aat gga ttc 1920 Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe 625 630 635 640 aga gga gga tat gat ggt tac cgc cct tca ttc tct aac act cca aac 1968 Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn 645 650 655 agt ggt tat aca cag tct cag ttc agt gct ccc cgg gac tac tct ggc 2016 Ser Gly Tyr Thr Gln Ser Gln Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly 660 665 670 tat cag cgg gga tgc cgc aaa tga acactcagca agtgaattaa tctgattcac 2070 Tyr Gln Arg Gly Cys Arg Lys 675 aggattatgt ttaaacgcca aaaacacact ggccagtgta ccataatatg ttaccagaag 2130 agttattatc tatttgttct ccctttcagg aaacttattg taaagggact gttttcatcc 2190 cataaagaca ggactacaat tgtcagcttt atattacctg gatatggaag gaaactattt 2250 ttattctgca tgttcttcct aagcgtcatc ttgagccttg cacatgatac tcagattcct 2310 cacccttgct taggagtaaa acataataca ctttacaggg tgatatctcc atagttattt 2370 gaagtggctt ggaaaaagca agattaactt ctgacattgg ataaaaatca acaaatcagc 2430 cctagagtta ttcaaatggt aattgacaaa aactaaaata tttcccttcg agaaggagtg 2490 gaatgtggtt tggcagaaca actgcatttc acagcttttc cggttaaatt ggagcactaa 2550 acgtttagat gcataccaaa ttatgcatgg gcccttaata taaaaggctg gctaccagct 2610 ttgacacagc actattcatc ctctggccaa acaactgtgg ttaaacaaca catgtaaatt 2670 gctttttaac agctgatact ataataagac aaagccaaaa tgcaaaaatt gggctttgat 2730 tggcactttt tgaaaaatat gcaacaaata tgggatgtaa tctggatggc cgcttctgta 2790 cttaatgtga agtatttaga tacctttttg aacacttaac agtttcttct gacaatgact 2850 tttgtaagga ttggtactat ctatcattcc ttataatgta cattgtctgt cactaatcct 2910 cagatcttgc tgtattgtca cctaaattgg tacaggtact gatgaaaata tctaatggat 2970 aatcataaca ctcttggtca catgtttttc ctgcagcctg aaggttttta aaagaaaaag 3030 atatcaaatg cctgctgcta ccaccctttt aaattgctat cttttgaaaa gcaccagtat 3090 gtgttttaga ttgatttccc tattttaggg aaatgacaga cagtagtttc agttctgatg 3150 gtataagcaa aacaaataaa acatgtttat aaaagttgta tcttgaaaca ctggtgttca 3210 acagctagca gcttatgtgg ttcaccccat gcattgttag tgtttcagat tttatggtta 3270 tctccagcag ctgtttctgt agtacttgca tttatc 3306 <210> 12 <211> 679 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 12 Met Pro Ser Ala Thr Ser Leu Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln 35 40 45 His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu 85 90 95 Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn 100 105 110 Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser 115 120 125 Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu 130 135 140 Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu 145 150 155 160 Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu 165 170 175 Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser 180 185 190 Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser 195 200 205 Leu Arg Leu Asn Glu Gln 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Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys 65 70 75 80 ggc aag ctt gat gat tac cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt 288 Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu 85 90 95 aat caa gat cag ctg gat gcc gta tct aag tac cag gaa gtc aca aat 336 Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn 100 105 110 aac ttg gag ttt gca aaa gaa tta cag agg agt ttc atg gca tta agt 384 Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser 115 120 125 caa gat att cag aaa aca ata aag aag act gca cgt cgg gag cag ctt 432 Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu 130 135 140 atg aga gag gaa gcg gaa caa aaa cgt tta aaa act gta ctt gag ctc 480 Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu 145 150 155 160 cag tat gtt ttg gac aaa ttg gga gat gat gaa gtg aga act gac ctg 528 Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu 165 170 175 aag caa ggt ttg aat gga gtg cca ata ttg tct gaa gaa gaa ttg tcg 576 Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser 180 185 190 ttg ttg gat gaa ttc tac aaa tta gca gac cct gaa cgg gac atg agc 624 Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser 195 200 205 ttg agg ttg aat gag cag tat gaa cat gct tcc att cac ctg tgg gac 672 Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp 210 215 220 ttg ctg gaa gga aag gaa aag tct gta tgt gga aca acc tat aaa gca 720 Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Ser Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala 225 230 235 240 cta aag gaa att gtt gag cgt gtt ttc cag tca aat tac ttt gac agc 768 Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser 245 250 255 act cac aac cac cag aat ggg cta tgt gag gaa gaa gag gca gcc tca 816 Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser 260 265 270 gca cct aca gtt gaa gac cag gta gct gaa gct gag cct gag cca gca 864 Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala 275 280 285 gaa gaa tac act gaa caa agt gaa gtt gaa tca aca gag tat gta aat 912 Glu Glu Tyr 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tcc atg caa acg gtg ttc 1584 Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe 515 520 525 aat atg aat gcc cca gtt cct cct gtt aat gaa cca gaa act ttg aaa 1632 Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys 530 535 540 caa caa aat cag tac cag gcc agt tat aac cag agc ttt tct agt cag 1680 Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln 545 550 555 560 cct cac caa gta gaa caa aca gac ctt cag caa gaa cag ctt caa aca 1728 Pro His Gln Val Glu Gln Thr Asp Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr 565 570 575 gtg gtt ggc act tac cat ggt tcc cag gac cag ccc cac caa gtg act 1776 Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Gln Asp Gln Pro His Gln Val Thr 580 585 590 ggt aac cat cag cag cct ccc cag cag aac act gga ttt cca cgt agc 1824 Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser 595 600 605 agt cag ccc tat tac aat agt cgt ggt gtg tct cgt ggt ggt tcc cgt 1872 Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg 610 615 620 ggt gct aga ggc tta atg aat gga tac agg ggc cct gcc aat gga ttc 1920 Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe 625 630 635 640 aga gga gga tat gat ggt tac cgc cct tca ttc tct aac act cca aac 1968 Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn 645 650 655 agt ggt tat aca cag tct cag ttc agt gct ccc cgg gac tac tct ggc 2016 Ser Gly Tyr Thr Gln Ser Gln Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly 660 665 670 tat cag cgg gat gga tat cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg cag 2064 Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln 675 680 685 agt gga cca cgg gga gcc cca cga ggt cgt gga ggg ccc cca aga ccc 2112 Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro 690 695 700 aac aga ggg atg ccg caa atg aac act cag caa gtg aat taa 2154 Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn Thr Gln Gln Val Asn 705 710 715 tctgattcac aggattatgt ttaaacgcca aaaacacact ggccagtgta ccataatatg 2214 ttaccagaag agttattatc tatttggact gttttcatcc cataaagaca ggactacaat 2274 tgtcagc 2281 <210> 14 <211> 717 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 14 Met Pro Ser Ala Thr Ser Leu Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln 35 40 45 His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu 85 90 95 Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn 100 105 110 Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser 115 120 125 Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu 130 135 140 Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu 145 150 155 160 Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu 165 170 175 Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser 180 185 190 Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro 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Pro Ala Ser Gln His Pro Met Thr 30 35 40 ggc acc ggg gct gtc cag acc gag gcc atg aag cag att ctc ggg gtg 255 Gly Thr Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val 45 50 55 atc gac aag aaa ctt cgg aac ctg gag aag aaa aag ggc aag ctt gat 303 Ile Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp 60 65 70 gat tat cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt aat caa gat cag 351 Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln 75 80 85 90 ctg gat gcc gtg tct aag tac cag gaa gtc aca aat aac ttg gag ttt 399 Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe 95 100 105 gca aaa gaa tta cag agg agt ttc atg gca tta agc caa gat att cag 447 Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln 110 115 120 aaa aca ata aag aag aca gca cgt cgg gag cag ctt atg aga gag gaa 495 Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu 125 130 135 gct gaa cag aaa cgt tta aaa aca gta ctt gag ctg cag tat gtt ttg 543 Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu 140 145 150 gac aaa cta gga gat gat gaa gtg aga act gac ctg aag caa ggt ttg 591 Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu 155 160 165 170 aat gga gtg cca ata ttg tct gaa gag gag ttg tcg ttg tta gat gag 639 Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu 175 180 185 ttc tac aaa tta gca gac cct gaa cga gac atg agc ttg agg ttg aat 687 Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn 190 195 200 gag cag tat gaa cat gcc tcc att cac ctg tgg gac ttg ctg gaa gga 735 Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly 205 210 215 aag gaa aaa cct gta tgt gga aca act tat aaa gct cta aag gaa att 783 Lys Glu Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Glu Ile 220 225 230 gtt gag cgt gtt ttc cag tca aac tac ttt gac agc acc cac aac cac 831 Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His 235 240 245 250 cag aat ggt ctg tgt gag gaa gag gag gca gcc tca gca cct aca gtt 879 Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Thr Val 255 260 265 gaa gac cag gca gct gaa gct gaa cct gag cca gtg gaa gaa tat act 927 Glu Asp Gln Ala Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Val Glu Glu Tyr Thr 270 275 280 gaa caa aat gag gtt gaa tca aca gag tat gta aat aga caa ttt atg 975 Glu Gln Asn Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met 285 290 295 gca gaa aca cag ttc agc agt ggt gaa aag gag cag gta gat gat tgg 1023 Ala Glu Thr Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Asp Trp 300 305 310 aca gtt gaa aca gtt gag gtg gta aat tca ctc cag cag caa cct cag 1071 Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln 315 320 325 330 gct gca tct cct tca gta cca gaa ccc cac tct ttg acc cca gtg gct 1119 Ala Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala 335 340 345 caa gcc gat ccc ctc gtg aga aga cag cga gta cag gac ctt atg gca 1167 Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala 350 355 360 caa atg cag ggg ccc tat aat ttc ata cag gat tca atg ttg gat ttt 1215 Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe 365 370 375 gaa aac cag aca ctt gat cct gcc att gta tct gca cag ccg atg aat 1263 Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn 380 385 390 cca gca cag aac atg gac ata ccc cag ctg gtt tgc cct cca gtt cat 1311 Pro Ala Gln Asn Met Asp Ile Pro Gln Leu Val Cys Pro Pro Val His 395 400 405 410 tct gaa tct aga ctt gct caa cct aat caa gtt tct gta cag cca gaa 1359 Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Ser Val Gln Pro Glu 415 420 425 gct aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt gag gga tat aca gca 1407 Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala 430 435 440 tct caa ccc ttg tac caa cct tct cat gct act gac caa cga cca caa 1455 Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Asp Gln Arg Pro Gln 445 450 455 aag gaa ccg att gat cag att cag gcg acg atc tct tta aat aca gac 1503 Lys Glu Pro Ile Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp 460 465 470 cag act aca gca tca tca tcc ctt cct gct gct tct cag cct caa gtg 1551 Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val 475 480 485 490 ttc cag gct ggg aca agc aaa cct tta cat agc agt gga atc aat gta 1599 Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val 495 500 505 aat gca gct cca ttc caa tcc atg caa acg gta ttc aat atg aat gcc 1647 Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala 510 515 520 cca gtt cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta aaa cag caa aat cag 1695 Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Asn Gln 525 530 535 tac cag gcc agt tac aac cag agc ttt tcc agt cag cct cac caa gta 1743 Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val 540 545 550 gaa caa aca gag ctt cag caa gaa cag ctt caa aca gtg gtt ggc act 1791 Glu Gln Thr Glu Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr 555 560 565 570 tat cat ggt tct cag gac cag ccc cat caa gtg act ggt aac cac cag 1839 Tyr His Gly Ser Gln Asp Gln Pro His Gln Val Thr Gly Asn His Gln 575 580 585 cag cct cct cag cag aac act gga ttt cca cgt agc aat cag ccc tat 1887 Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gln Pro Tyr 590 595 600 tac aac agt cgt ggt gtg tct cgt gga ggt tcc cgt ggt gct aga ggc 1935 Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly 605 610 615 ttg atg aat gga tac aga gga cct gct aat gga ttc aga gga gga tat 1983 Leu Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr 620 625 630 gat ggt tac cgc cct tca ttc tct act aac act cca aac agt ggt tat 2031 Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Thr Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr 635 640 645 650 aca caa tct caa ttc agt gct ccc cgg gac tac tct ggc tat cag cgg 2079 Thr Gln Ser Gln Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg 655 660 665 gat gga tat cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg cag agt gga cca 2127 Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro 670 675 680 cgg gga gcc cca cga ggt cgt gga ggg ccc cca aga ccc aac aga ggg 2175 Arg Gly Ala Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly 685 690 695 atg ccg caa atg aac act cag caa gtg aat taa tctgattcac aggattatgt 2228 Met Pro Gln Met Asn Thr Gln Gln Val Asn 700 705 ttaatcgcca aaaacacact ggccagtgta ccataatatg ttaccagaag agttattatc 2288 tatttgttct ccctttcagg aaacttattg taaagggact gttttcatcc cataaagaca 2348 ggactacaat tgtcagcttt atattacctg gatatggaag gaaactattt ttactctgca 2408 tgttctgtcc taagcgtcat cttgagcctt gcacatgata ctcagattcc tcacccttgc 2468 ttaggagtaa aacataatat actttaatgg ggtgatatct ccatagttat ttgaagtggc 2528 ttggataaag caagactgac ttctgacatt ggataaaatc tacaaatcag ccctagagtc 2588 attcagtggt aactgacaaa actaaaatat ttcccttgaa aggaagatgg aaggagtgga 2648 gtgtggtttg gcagaacaac tgcatttcac agcttttcca cttaaattgg agcactgaac 2708 atttagatgc ataccgaatt atgcatgggc cctaatcaca cagacaaggc tggtgccagc 2768 cttaggcttg acacggcagt gttcaccctc tggccagacg actgtggttc aagacacatg 2828 taaattgctt tttaacagct gatactgtat aagacaaagc caaaatgcaa aattaggctt 2888 tgattggcac ttttcgaaaa atatgcaaca attaagggat ataatctgga tggccgcttc 2948 tgtacttaat gtgaaatatt tagatacctt tcaaacactt aacagtttct ttgacaatga 3008 gttttgtaag gattggtagt aaatatcatt ccttatgacg tacattgtct gtcactaatc 3068 cttggatctt gctgtattgt cacctaaatt ggtacaggta ctgatgaaaa tctaatggat 3128 aatcataaca ctcttggtta catgtttttc ctgcagcctg aaagttttta taagaaaaag 3188 acatcaaatg cctgctgctg ccaccctttt aaattgctat cttttgaaaa gcaccagtat 3248 gtgttttaga ttgatttccc tattttaggg aaatgacagt cagtagtttc acttctgatg 3308 gtataagcaa acaaataaaa catgtttata aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3368 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3386 <210> 16 <211> 708 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 16 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Asn Glu Ala Gly Ala Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Met Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln 35 40 45 Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg 50 55 60 Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met 65 70 75 80 Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys 85 90 95 Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg 100 105 110 Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr 115 120 125 Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu 130 135 140 Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp 145 150 155 160 Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu 165 170 175 Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp 180 185 190 Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala 195 200 205 Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Pro Val Cys 210 215 220 Gly Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln 225 230 235 240 Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu 245 250 255 Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Ala Ala Glu 260 265 270 Ala Glu Pro Glu Pro Val Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Asn Glu Val Glu 275 280 285 Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser 290 295 300 Ser Gly Glu Lys 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Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn 515 520 525 Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn 530 535 540 Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln Thr Glu Leu Gln 545 550 555 560 Gln Glu Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Gln Asp 565 570 575 Gln Pro His Gln Val Thr Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn 580 585 590 Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val 595 600 605 Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg 610 615 620 Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser 625 630 635 640 Phe Ser Thr Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gln Ser Gln Phe Ser 645 650 655 Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn 660 665 670 Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly 675 680 685 Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn Thr 690 695 700 Gln Gln Val Asn 705 <210> 17 <211> 3150 <212> DNA <213> Equus caballus <220> <221> CDS <222> (1)..(1917) <223> <400> 17 atg gag ggc aag ctc gat gat tac caa gag cga atg aac aaa gga gaa 48 Met Glu Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu 1 5 10 15 agg ctt aat cag gat cag ctg gat gct gtg tct aag tac cag gaa gtc 96 Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val 20 25 30 aca aat aac ttg gag ttt gcg aaa gaa ttg cag agg agt ttc atg gcg 144 Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala 35 40 45 ttg agt cag gat att cag aaa aca ata aag aag acg gca cgt cgg gag 192 Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu 50 55 60 cag ctt atg aga gaa gaa gct gaa cag aaa cgt tta aaa act gta ctt 240 Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu 65 70 75 80 gag ctg cag tat gtt ttg gac aaa ttg gga gat gaa gaa gtg cga act 288 Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Glu Glu Val Arg Thr 85 90 95 gac ctg aaa caa ggt ttg aat gga gtg cca ata ctc tct gaa gaa gag 336 Asp Leu Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu 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Glu Ser Thr Glu Tyr 210 215 220 gta aat aga cag ttt atg gca gaa gcg cag ttc agt ggt gag aag gag 720 Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu Ala Gln Phe Ser Gly Glu Lys Glu 225 230 235 240 cag gtg gat gag tgg aca gtc gag acg gtc gag gtg gta aat tca ctc 768 Gln Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu 245 250 255 cag cag caa cct cag gct gca tct cct tca gta ccg gag ccc cac tct 816 Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser 260 265 270 ttg act cca gtg gct cag gca gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gta 864 Leu Thr Pro Val Ala Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val 275 280 285 cag gac ctt atg gcg caa atg cag ggg ccc tat aat ttc ata cag gat 912 Gln Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp 290 295 300 tca atg ctg gat ttt gaa aac cag aca ctt gat cct gcc att gta tct 960 Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser 305 310 315 320 gca cag cct atg aat cca gca cag aat atg gac atg ccc cag ctg gtt 1008 Ala Gln Pro Met Asn Pro Ala Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val 325 330 335 tgc cct cca gtt cat gct gaa tct aga ctt gct caa cct aat caa gtt 1056 Cys Pro Pro Val His Ala Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val 340 345 350 cct gta caa cca gaa gct aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt 1104 Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser 355 360 365 gag ggg tat aca gca tct cag ccc ttg tac cag cct tct cat gct aca 1152 Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr 370 375 380 gag caa cga ccg caa aag gaa ccg act gac cag atc cag gca aca atc 1200 Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Thr Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile 385 390 395 400 tct tta aat aca gac cag act aca gca tca tca tcc ctt cct gct gct 1248 Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala 405 410 415 tct cag cct cag gtg ttc cag gct ggg aca agc aaa cct tta cac agc 1296 Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser 420 425 430 agt ggg atc aat gta aat gca gcg cca ttc cag tcc atg caa acg gtg 1344 Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val 435 440 445 ttc aac atg aat gcc ccg gtt cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta 1392 Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu 450 455 460 aaa cag caa aat cag tac cag gcc agc tat aac cag agc ttt tcc agt 1440 Lys Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser 465 470 475 480 ccg cct cac caa gta gag cag aca gag ctt ccg caa gag cag ctt cag 1488 Pro Pro His Gln Val Glu Gln Thr Glu Leu Pro Gln Glu Gln Leu Gln 485 490 495 acg gtg gtt ggt act tac cat gct tcc caa gac cag ccc cat caa gtg 1536 Thr Val Val Gly Thr Tyr His Ala Ser Gln Asp Gln Pro His Gln Val 500 505 510 acc ggt aac cac cag cag cct ccc cag cag aac act ggg ttt cca cgt 1584 Thr Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg 515 520 525 agc agt cag ccc tat tac aac agt cgt ggt gtg tct cgt gga ggc tcc 1632 Ser Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser 530 535 540 cgt ggt gct aga ggc ttg atg aat gga tac agg ggc cct gcc aat gga 1680 Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly 545 550 555 560 ttc aga gga gga tat gat ggt tac cgc cct tcg ttc tct aac act cca 1728 Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro 565 570 575 aac agc ggt tac aca cag tct cag ttc agt gct ccc cgg gac tac tct 1776 Asn Ser Gly Tyr Thr Gln Ser Gln Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser 580 585 590 ggc tat cag cgg gat gga tat cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg 1824 Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly 595 600 605 cag agt gga ccc cgg gga gcc cca cga ggt cgt gga ggg ccc cca aga 1872 Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg 610 615 620 ccc aac aga ggg atg ccg caa atg aac act cag caa gtg aat taa 1917 Pro Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn Thr Gln Gln Val Asn 625 630 635 tctgattcac aggattatct ttaatcgcca aaacacactg gccagtgtac cataatatgt 1977 taccagaaga gttattatct atttgttctc cctttcagga aacttattgt aaagggactg 2037 ttttcatccc ataaagacag gactacagtt gtcagcttta tattacctgg atatggaagg 2097 aaactatttt tactctgcat gttctgtcct aagcgtcatc ttgagccttg cacatgatac 2157 tcagattcct ttcccttgct taggagtaaa acataatata ctttatgggg tgataatatc 2217 tccatagtta tttgaagtgg cttggaaaaa gcaagattga cttttgacat tggataaaat 2277 ctacaaatca gccctagagt ttcatggtca ttcacaaaac taaaatattt cccttgaaag 2337 gaagatggaa ggactggagt gtggtttggc agaacaactg catttcacag cttttcctat 2397 taaattggag cactgaatgt taaatgcata ccaaattatg catgggccct taatcacaca 2457 tacatggcta ccagctttga cacagcacta ttcatcctct ggccaaacga ctgtggttaa 2517 aaacacgtgt aaattgcttt ttaacagctg atactgtaaa agacaaagct aaaatgcaaa 2577 attaggcttt cattggcact tttcgaaaaa tatgcaacaa atttgggatg taatctggat 2637 ggccacttct gtacttaatg tgaagtattt agataccttt ttgaacactt aacagtttct 2697 tcgacaatga cttttgtaag gattggtagt atatatcatt ccttatgaca tacattgtct 2757 gttgctaatc cttggatctt gctgtattgt cacctaaatt ggtacaggta ctgatgaaaa 2817 tctctcatgg ataaacctaa cactcttcgt cacatgtttt tcctgcagcc tgaaggtttt 2877 taaaaggaaa agatatcaaa tgcctgctgc taccaccctt ttaaattgct atcttttgaa 2937 aagcaccagt atgtgttttt agattgattt ccctatttta gggaaatgac agtcagtagt 2997 ttcagttctg atggtataag caaagcaaat aaaacgtgtt tataaaagtt gtatcttgaa 3057 acactggtgt tcaacagcta gcagcttctg tggttcaccc cctgccttgt tagtgttacc 3117 catttatggt tatctccagc agcaatttct cta 3150 <210> 18 <211> 638 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 18 Met Glu Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu 1 5 10 15 Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val 20 25 30 Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala 35 40 45 Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu 50 55 60 Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu 65 70 75 80 Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Glu Glu Val Arg Thr 85 90 95 Asp Leu Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu 100 105 110 Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Val Arg Asp 115 120 125 Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu 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cat ccg gca acc ggc acc ggc gcc gtc cag 322 Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln 35 40 45 acc gag gcc atg aag cag att ctc ggc gta atc gac aag aaa ctt cgg 370 Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg 50 55 60 aac ctg gag aag aaa aag ggt aaa ctt gat gat tac cag gaa cga atg 418 Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met 65 70 75 80 aat aaa ggg gaa agg ctc aat caa gac cag ctg gat gcc gta tct aag 466 Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys 85 90 95 tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca aag gaa tta cag agg 514 Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg 100 105 110 agt ttc atg gca tta agt caa gat att cag aaa aca ata aag aag aca 562 Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr 115 120 125 gca cgt cgg gaa cag ctt atg aga gaa gaa gca gaa cag aag cgc tta 610 Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu 130 135 140 aaa act gta ctt gag tta 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Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn Thr Gln 690 695 700 caa gtg aat taa tgtgatacac aggattatgt ttaatcgcca aaaacacact 2342 Gln Val Asn 705 ggccagtgta ccataatatg ttaccagaag agttattatc tatttgttct ccctttcagg 2402 aaacttattg taaagggact gttttcatcc cataaagaca ggactgcaat tgtcagcttt 2462 acattacctg gatatggaag gaaactattt ttattctgca tgttctgtcc taagcgtcat 2522 cttgagcctt gcacacaata caatactcag attcctcacc cttgcttagg agtaaaacat 2582 tatatactta tggggtgata atatctccat agttagttga agtggcttgg aaaaaaaatg 2642 caagattgaa tttttgacct tggataaaat ctacaatcag ccctagaact attcagtggt 2702 aattgacaaa gttaaagcat tttctttgaa aggaagatgg aaggagtgga gtgtggttta 2762 gcaaaactgc atttcatagc tttcccatta aattggagca ccgacagatt aaaagcatac 2822 caaattatgc atgggtcctt actcacacaa gtgaggctgg ctaccagcct tgacatagca 2882 ctcactagtc ttctggccaa acgactgtga ttaaaacaca tgtaaattgc tctttagtag 2942 tggatactgt gtaagacaaa gccaaattgc aaatcaggct ttgattggct cttctggaaa 3002 atatgcatca aatatggggg ataatctgga tgggctgctg ctgtgctcaa 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363 Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp 60 65 70 75 tac cag gaa cga atg aat aaa ggg gaa agg ctc aat caa gac cag ctg 411 Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu 80 85 90 gat gcc gta tct aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca 459 Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala 95 100 105 aag gaa tta cag agg agt ttc atg gca tta agt caa gat att cag aaa 507 Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys 110 115 120 aca ata aag aag aca gca cgt cgg gaa cag ctt atg aga gaa gaa gca 555 Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala 125 130 135 gaa cag aag cgc tta aaa act gta ctt gag tta cag tat gta ttg gat 603 Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp 140 145 150 155 aag ctg gga gat gat gat gtg aga aca gat ctg aaa caa ggt ttg agt 651 Lys Leu Gly Asp Asp Asp Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Ser 160 165 170 gga gtg cca ata ttg tct gag gag gag ttg tca ttg ctg gat gag ttc 699 Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe 175 180 185 tac aag ctc gta gat cct gag cgt gac atg agt tta agg tta aat gag 747 Tyr Lys Leu Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu 190 195 200 cag tat gaa cat gcc tca att cac ttg tgg gat ttg ctg gaa ggg aaa 795 Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys 205 210 215 gaa aag cct gtg tgt gga aca acc tat aaa gct cta aag gaa att gtt 843 Glu Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Glu Ile Val 220 225 230 235 gag cgt gtt ttc cag tca aac tac ttt gat agc act cac aat cat caa 891 Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln 240 245 250 aat ggg ttg tgt gag gag gaa gag gcg gct tca gcg ccc aca gtg gag 939 Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Thr Val Glu 255 260 265 gac cag gta gct gaa gct gaa cct gag cca gcg gaa gaa tac aca gag 987 Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu 270 275 280 caa agt gag gtt gaa tca aca gag tat gtc aat agg cag ttc atg gca 1035 Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala 285 290 295 gaa aca cag ttc agc agt ggt gag aag gag caa gtg gat gag tgg aca 1083 Glu Thr Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Glu Trp Thr 300 305 310 315 gtt gaa aca gtt gag gtt gta aac tca ctc cag cag caa cct cag gct 1131 Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala 320 325 330 gcg tcc cct tca gtc cca gag ccc cac tct ttg act cca gtg gct cag 1179 Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln 335 340 345 tca gat cca ctt gtg aga agg cag cgt gta caa gat ctt atg gca caa 1227 Ser Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln 350 355 360 atg caa ggg ccc tat aat ttc ata cag gat tca atg ttg gat ttt gaa 1275 Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu 365 370 375 aat cag acg ctt gat cct gcc att gta tcc gca cag cct atg aac cct 1323 Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro 380 385 390 395 acc cag aac atg gat atg cct cag ctg gtt tgc cct cag gtt cat tct 1371 Thr Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val Cys Pro Gln Val His Ser 400 405 410 gaa tct aga ctt gcc caa tct aat caa gtt cct gta caa cca gaa gcc 1419 Glu Ser Arg Leu Ala Gln Ser Asn Gln Val Pro Val Gln Pro Glu Ala 415 420 425 aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt gag ggg tat aca gca tct 1467 Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser 430 435 440 cag ccc ttg tac cag cca tct cat gct acg gag cag cgg ccg cag aaa 1515 Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys 445 450 455 gag cca atg gat cag att cag gca aca ata tct ttg aat aca gac cag 1563 Glu Pro Met Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln 460 465 470 475 act aca gca tcc tca tcc ctt cct gct gct tct cag cct caa gtg ttc 1611 Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe 480 485 490 cag gct ggg aca agt aaa cct ttg cac agc agt gga atc aat gta aat 1659 Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn 495 500 505 gca gct cca ttc cag tcc atg caa acg gtg ttc aat atg aat gct cca 1707 Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro 510 515 520 gtc cct cct gct aat gaa cca gaa acg tta aaa caa cag agt cag tac 1755 Val Pro Pro Ala Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Ser Gln Tyr 525 530 535 cag gcc act tat aac cag agt ttt tcc agt cag cct cac caa gtg gaa 1803 Gln Ala Thr Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu 540 545 550 555 caa aca gag ctt caa caa gac caa ctg caa acg gtg gtt ggc act tac 1851 Gln Thr Glu Leu Gln Gln Asp Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr 560 565 570 cat gga tcc cag gac cag cct cat caa gtg cct ggt aac cac cag caa 1899 His Gly Ser Gln Asp Gln Pro His Gln Val Pro Gly Asn His Gln Gln 575 580 585 ccc cca cag cag aac act ggc ttt cca cgt agc agt cag cct tat tac 1947 Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Ser Gln Pro Tyr Tyr 590 595 600 aac agt cgt ggg gta tct cga gga ggg tct cgt ggt gcc aga ggc ttg 1995 Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu 605 610 615 atg aat gga tac agg ggc cct gcc aat gga ttt aga gga gga tat gat 2043 Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp 620 625 630 635 ggt tac cgc cct tca ttc tcg aac act cca aac agt ggt tat tca cag 2091 Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Gln 640 645 650 tct cag ttc act gct ccc cgg gac tac tct ggt tac cag cgg gat gga 2139 Ser Gln Phe Thr Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly 655 660 665 tat cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg cag agt gga cca cgg gga 2187 Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly 670 675 680 gcc cca cga ggt cgt gga ggg ccc cca aga ccc aac aga ggg atg ccg 2235 Ala Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro 685 690 695 caa atg aac act cag caa gtg aat taa tgtgatacac aggattatgt 2282 Gln Met Asn Thr Gln Gln Val Asn 700 705 ttaatcgcca aaaacacact ggccagtgta ccataatatg ttaccagaag agttattatc 2342 tatttgttct ccctttcagg aaacttattg taaagggact gttttcatcc cataaagaca 2402 ggactgcaat tgtcagcttt acattacctg gatatggaag gaaactattt ttattctgca 2462 tgttctgtcc taagcgtcat cttgagcctt gcacacaata caatactcag attcctcacc 2522 cttgcttagg agtaaaacat tatatactta tggggtgata atatctccat agttagttga 2582 agtggcttgg aaaaaaaatg caagattgaa tttttgacct tggataaaat ctacaatcag 2642 ccctagaact attcagtggt aattgacaaa gttaaagcat tttctttgaa aggaagatgg 2702 aaggagtgga gtgtggttta gcaaaactgc atttcatagc tttcccatta aattggagca 2762 ccgacagatt aaaagcatac caaattatgc atgggtcctt actcacacaa gtgaggctgg 2822 ctaccagcct tgacatagca ctcactagtc ttctggccaa acgactgtga ttaaaacaca 2882 tgtaaattgc tctttagtag tggatactgt gtaagacaaa gccaaattgc aaatcaggct 2942 ttgattggct cttctggaaa atatgcatca aatatggggg ataatctgga tgggctgctg 3002 ctgtgctcaa tgtgaactat ttagatacct ttggaacact taacagtttc tctgaacaat 3062 gacttacatg gggattggtc ctgtttgtca ttcctcacca taattgcatt gtcatcacta 3122 atccttggat cttgctgtat tgttactcaa attggtaata ggtactgatg gaaatcgcta 3182 atggatggat aatcataaca cttttggtca catgttttct cctgcagcct gaaagttctt 3242 aaagaaaaag atatcaaatg cctgctgcta ccaccctttt aaattgctat ctttagaaaa 3302 gcaccggtat gtgttttaga ttcatttccc tgttttaggg aaatgacagg cagtagtttc 3362 agttctgatg gcaaaacaaa taaaaacatg tttctaaaag ttgtatcttg aaacactggt 3422 gttcaacagc tagcagctaa agtaattcaa cccatgcatt gctagtgtca cagcctttgg 3482 ttatgtctag tagctgtttc tgaagtattt tcatttatct tttgtcaaat ttaaccctgt 3542 ttgaattctc tcctttcctc aaggagacac ttatgttcaa agtgttgatt ctttgcctta 3602 ggtgcataga gagtagacag tttggagatg gaaaggttag cagtgactta gccatatgtt 3662 ctgtgttgga atttgtgcta gcagtttgag cactagctct gcgtgcctat gaactgaatg 3722 ctgcttgtcc cattccattt tatgtcatgg agaaataatt ccacttggta acacaaaggc 3782 taagttaatg ttattttctg tacagaaatt aaattttact tttagccttt tgtaaacttt 3842 tttttttttt ttccaagccg gtatcagcta ctcaaaacaa ttctcagata ttcatcatta 3902 gacaactgga gtttttgctg gttttgtagc ctactaaaac tgctgaggct gttgaacatt 3962 ccacattcaa aagttttgta gggtggtgga taatggggaa gcttcaatgt ttattttaaa 4022 ataaataaaa taagttcttg acttttctca tgtgtggtta tggtacatca tattggaagg 4082 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gtt gag gtt gta aac tca ctc cag cag caa cct cag gct 1131 Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala 320 325 330 gcg tcc cct tca gtc cca gag ccc cac tct ttg act cca gtg gct cag 1179 Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln 335 340 345 tca gat cca ctt gtg aga agg cag cgt gta caa gat ctt atg gca caa 1227 Ser Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln 350 355 360 atg caa ggg ccc tat aat ttc ata cag acg ctt gat cct gcc att gta 1275 Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val 365 370 375 tcc gca cag cct atg aac cct acc cag aac atg gat atg cct cag ctg 1323 Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu 380 385 390 395 gtt tgc cct cag gtt cat tct gaa tct aga ctt gcc caa tct aat caa 1371 Val Cys Pro Gln Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Ser Asn Gln 400 405 410 gtt cct gta caa cca gaa gcc aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca 1419 Val Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr 415 420 425 agt gag ggg tat aca gca tct cag ccc ttg tac cag cca tct cat gct 1467 Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala 430 435 440 acg gag cag cgg ccg cag aaa gag cca atg gat cag att cag gca aca 1515 Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Met Asp Gln Ile Gln Ala Thr 445 450 455 ata tct ttg aat aca gac cag act aca gca tcc tca tcc ctt cct gct 1563 Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala 460 465 470 475 gct tct cag cct caa gtg ttc cag gct ggg aca agt aaa cct ttg cac 1611 Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His 480 485 490 agc agt gga atc aat gta aat gca gct cca ttc cag tcc atg caa acg 1659 Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr 495 500 505 gtg ttc aat atg aat gct cca gtc cct cct gct aat gaa cca gaa acg 1707 Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Ala Asn Glu Pro Glu Thr 510 515 520 tta aaa caa cag agt cag tac cag gcc act tat aac cag agt ttt tcc 1755 Leu Lys Gln Gln Ser Gln Tyr Gln Ala Thr Tyr Asn Gln Ser Phe Ser 525 530 535 agt cag cct cac caa gtg gaa caa aca gag ctt caa caa gac caa ctg 1803 Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln Thr Glu Leu Gln Gln Asp Gln Leu 540 545 550 555 caa acg gtg gtt ggc act tac cat gga tcc cag gac cag cct cat caa 1851 Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Gln Asp Gln Pro His Gln 560 565 570 gtg cct ggt aac cac cag caa ccc cca cag cag aac act ggc ttt cca 1899 Val Pro Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro 575 580 585 cgt agc agt cag cct tat tac aac agt cgt ggg gta tct cga gga ggg 1947 Arg Ser Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly 590 595 600 tct cgt ggt gcc aga ggc ttg atg aat gga tac agg ggc cct gcc aat 1995 Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn 605 610 615 gga ttt aga gga gga tat gat ggt tac cgc cct tca ttc tcg aac act 2043 Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr 620 625 630 635 cca aac agt ggt tat tca cag tct cag ttc act gct ccc cgg gac tac 2091 Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Gln Phe Thr Ala Pro Arg Asp Tyr 640 645 650 tct ggt tac cag cgg gat gga tat cag cag aat ttc aag cga ggc tct 2139 Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser 655 660 665 ggg cag agt gga cca cgg gga gcc cca cga ggt cgt gga ggg ccc cca 2187 Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro 670 675 680 aga ccc aac aga ggg atg ccg caa atg aac act cag caa gtg aat taa 2235 Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn Thr Gln Gln Val Asn 685 690 695 tgtgatacac aggattatgt ttaatcgcca aaaacacact ggccagtgta ccataatatg 2295 ttaccagaag agttattatc tatttgttct ccctttcagg aaacttattg taaagggact 2355 gttttcatcc cataaagaca ggactgcaat tgtcagcttt acattacctg gatatggaag 2415 gaaactattt ttattctgca tgttctgtcc taagcgtcat cttgagcctt gcacacaata 2475 caatactcag attcctcacc cttgcttagg agtaaaacat tatatactta tggggtgata 2535 atatctccat agttagttga agtggcttgg aaaaaaaatg caagattgaa tttttgacct 2595 tggataaaat ctacaatcag ccctagaact attcagtggt aattgacaaa gttaaagcat 2655 tttctttgaa aggaagatgg aaggagtgga gtgtggttta gcaaaactgc atttcatagc 2715 tttcccatta aattggagca ccgacagatt aaaagcatac caaattatgc atgggtcctt 2775 actcacacaa gtgaggctgg ctaccagcct tgacatagca ctcactagtc ttctggccaa 2835 acgactgtga ttaaaacaca tgtaaattgc tctttagtag tggatactgt gtaagacaaa 2895 gccaaattgc aaatcaggct ttgattggct cttctggaaa atatgcatca aatatggggg 2955 ataatctgga tgggctgctg ctgtgctcaa tgtgaactat ttagatacct ttggaacact 3015 taacagtttc tctgaacaat gacttacatg gggattggtc ctgtttgtca ttcctcacca 3075 taattgcatt gtcatcacta atccttggat cttgctgtat tgttactcaa attggtaata 3135 ggtactgatg gaaatcgcta atggatggat aatcataaca cttttggtca catgttttct 3195 cctgcagcct gaaagttctt aaagaaaaag atatcaaatg cctgctgcta ccaccctttt 3255 aaattgctat ctttagaaaa gcaccggtat gtgttttaga ttcatttccc tgttttaggg 3315 aaatgacagg cagtagtttc agttctgatg gcaaaacaaa taaaaacatg tttctaaaag 3375 ttgtatcttg aaacactggt gttcaacagc tagcagctaa agtaattcaa cccatgcatt 3435 gctagtgtca cagcctttgg ttatgtctag tagctgtttc tgaagtattt tcatttatct 3495 tttgtcaaat 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agaaggtgta aaagttgttt gtagtttgac ttgtttattt tttaagttgc 4395 ttattccttt caacagcaac atatcattag ctgtcattct accattgcag ttctagtgag 4455 ttttaacgtc tgcattcaag actgttttaa aagcaacctc actggacaga gaactgctaa 4515 agtcttttcc ttaagatctg agtctttgtt actcagtatc ttctataata tgcaaatgct 4575 tgtctagagg cagaagacct tttgtttggt caagtgtgta ttttaccaga gtacagggaa 4635 ctgatggtcc tacatgtctc ttagtgtagt aagactataa aatcttttgt acatgcacaa 4695 ttcacagtat gtttagatac cacgtgtata atgccccccc ctcccccagg tagcatgcca 4755 ttgatgactt tttgcttagg gccattttat taccagggcc ttaatattcc taaaaagatg 4815 attttttttc atcctttctc ctcttttgat cattgtatct tgatattaaa aacatgacct 4875 tccaatgatt gtagtaaatt aacttctata gttcttttgt ctctatatgt attcatatat 4935 atgctattgt atagagactt caaggagaca tggagatgca tgcttattct caggttcatt 4995 cactaaggtg cttggcagac aaccagtttc taagtgcaga atgtagttaa gcagcttcat 5055 atatgtgcca ggcaatttgt tttgttaaat tttcatctac ttaaggaaat agggtattgt 5115 agcttaggct gatcataccc ttcatttcaa ccttaagctc tcaacctgca tccatccgac 5175 ttgagctatt aagtacttta gttttatcga gtataagtta acagaaaaag taaattaagc 5235 tttgccttta ctattttgaa tttatataca ttctggaaaa acttagaaac tgttgtatat 5295 ttcattagat taaattatat gaaaatgtga ttgtttatag caaagcctgt gagttgcata 5355 caccctaagg aaaactcctt aagtgctcct tgaagagaga agaaacaatt ctgggtctgg 5415 tctttttaag aacaaagcta gactactgta tgttagcact gtacattaat agtctgttgt 5475 gaagcttgag cagtttcctg catagccttg atccttcacc gttggcattg aaaatagcag 5535 tatccctgat gtacttaaaa cttaaagtca ggttttggta tatttatttg taagtcttaa 5595 tttcctctaa atactatatc tctttagcga gacaacctga aatttattag cacatttggg 5655 tatctcttgc ttggcattat ggccagtgtt aactattcag tggtgaaaaa attacccctc 5715 aagacactgg agtgacccca gatgtgtgta gtaagtggca tggttcaact gtgtggttaa 5775 tgataaatat atgacttagt cggtatgatc tggaaagact tgattgaaag ataattcagc 5835 tgacataagg atgagtgagg agtggcaaac tggataaaag agtcaagaga cctgtattcc 5895 agtgactcct gttttgttta agcattagca agatctgtct ggggaaactg gatagggcag 5955 ttttcttcca tgtttagttt ttgtctcaac atttggaagc tattgaaggt tttaaaatgg 6015 tgtgtattgt ttttttttgg ggggggggtg gccagaatag tgggtcatct aataaaactg 6075 ccatttaaaa gatcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 6114 <210> 24 <211> 698 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln 35 40 45 Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg 50 55 60 Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met 65 70 75 80 Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys 85 90 95 Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg 100 105 110 Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr 115 120 125 Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu 130 135 140 Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp 145 150 155 160 Asp Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Ser Gly Val Pro Ile Leu 165 170 175 Ser Glu 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ggg gca 274 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30 gct gcg ccg gct tct cag cat ccg gca acc ggc acc ggc gcc gtc cag 322 Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln 35 40 45 acc gag gcc atg aag cag att ctc ggc gta atc gac aag aaa ctt cgg 370 Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg 50 55 60 aac ctg gag aag aaa aag ggt aaa ctt gat gat tac cag gaa cga atg 418 Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met 65 70 75 80 aat aaa ggg gaa agg ctc aat caa gac cag ctg gat gcc gta tct aag 466 Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys 85 90 95 tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca aag gaa tta cag agg 514 Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg 100 105 110 agt ttc atg gca tta agt caa gat att cag aaa aca ata aag aag aca 562 Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr 115 120 125 gca cgt cgg gaa cag ctt atg aga gaa gaa gca gaa cag aag cgc 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aat ggg ttg tgt gag 946 Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu 245 250 255 gag gaa gag gcg gct tca gcg ccc aca gtg gag gac cag gta gct gaa 994 Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu 260 265 270 gct gaa cct gag cca gcg gaa gaa tac aca gag caa agt gag gtt gaa 1042 Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu 275 280 285 tca aca gag tat gtc aat agg cag ttc atg gca gaa aca cag ttc agc 1090 Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser 290 295 300 agt ggt gag aag gag caa gtg gat gag tgg aca gtt gaa aca gtt gag 1138 Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu 305 310 315 320 gtt gta aac tca ctc cag cag caa cct cag gct gcg tcc cct tca gtc 1186 Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val 325 330 335 cca gag ccc cac tct ttg act cca gtg gct cag tca gat cca ctt gtg 1234 Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln Ser Asp Pro Leu Val 340 345 350 aga agg cag cgt gta caa gat ctt atg gca caa atg caa ggg ccc tat 1282 Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr 355 360 365 aat ttc ata cag gat tca atg ttg gat ttt gaa aat cag acg ctt gat 1330 Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp 370 375 380 cct gcc att gta tcc gca cag cct atg aac cct acc cag aac atg gat 1378 Pro Ala Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp 385 390 395 400 atg cct cag ctg gtt tgc cct cag gtt cat tct gaa tct aga ctt gcc 1426 Met Pro Gln Leu Val Cys Pro Gln Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala 405 410 415 caa tct aat caa gtt cct gta caa cca gaa gcc aca cag gtt cct ttg 1474 Gln Ser Asn Gln Val Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu 420 425 430 gtt tca tcc aca agt gag ggg tat aca gca tct cag ccc ttg tac cag 1522 Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln 435 440 445 cca tct cat gct acg gag cag cgg ccg cag aaa gag cca atg gat cag 1570 Pro Ser His Ala Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Met Asp Gln 450 455 460 att cag gca aca ata tct ttg aat aca gac cag act aca gca tcc tca 1618 Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser 465 470 475 480 tcc ctt cct gct gct tct cag cct caa gtg ttc cag gct ggg aca agt 1666 Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser 485 490 495 aaa cct ttg cac agc agt gga atc aat gta aat gca gct cca ttc cag 1714 Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln 500 505 510 tcc atg caa acg gtg ttc aat atg aat gct cca gtc cct cct gct aat 1762 Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Ala Asn 515 520 525 gaa cca gaa acg tta aaa caa cag agt cag tac cag gcc act tat aac 1810 Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Ser Gln Tyr Gln Ala Thr Tyr Asn 530 535 540 cag agt ttt tcc agt cag cct cac caa gtg gaa caa aca gag ctt caa 1858 Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln Thr Glu Leu Gln 545 550 555 560 caa gac caa ctg caa acg gtg gtt ggc act tac cat gga tcc cag gac 1906 Gln Asp Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Gln Asp 565 570 575 cag cct cat caa gtg cct ggt aac cac cag caa ccc cca cag cag aac 1954 Gln Pro His Gln Val Pro Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn 580 585 590 act ggc ttt cca cgt agc agt cag cct tat tac aac agt cgt ggg gta 2002 Thr Gly Phe Pro Arg Ser Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val 595 600 605 tct cga gga ggg tct cgt ggt gcc aga ggc ttg atg aat gga tac agg 2050 Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg 610 615 620 ggc cct gcc aat gga ttt aga gga gga tat gat ggt tac cgc cct tca 2098 Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser 625 630 635 640 ttc tcg aac act cca aac agt ggt tat tca cag tct cag ttc act gct 2146 Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Gln Phe Thr Ala 645 650 655 ccc cgg gac tac tct ggt tac cag cgg gat gga tat cag cag aat ttc 2194 Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe 660 665 670 aag cga ggc tct ggg cag agt gga cca cgg gga gcc cca cga ggt aat 2242 Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Asn 675 680 685 ata ttg tgg tgg tga tcctagctcc tatgtggagc ttctgttctg gccttggaag 2297 Ile Leu Trp Trp 690 aactgttcat agtccgcatg taggttacat gttaggaata catttatctt ttccagactt 2357 gttgctaaag attaaatgaa atgctctgtt tctaaaattt catcttgaat ccaaatttta 2417 atttttgaat gactttccct gctgttgtct tcaaaatcag aacattttct ctgcctcaga 2477 aaagcgtttt tccaactgga aatttatttt tcaggtctta aaacctgcta aatgttttta 2537 ggaagtacct actgaaactt tttgtaagac atttttggaa cgagcttgaa catttatata 2597 aatttattac cctctttgat ttttgaaaca tgcatattat atttaggctg agaagccctt 2657 caaatggcca gataagccac agttttagct agagaaccat ttagaattga cataactaat 2717 ctaaacttga acacttttag gaccaatgtt agtgttctaa ataccaacat atttctgatg 2777 tttaaacaga tctcccaaat tcttaggacc ttgatgtcat taaaatttag aatgacaagc 2837 ttaagaggct ttagtttcat ttgtttttca agtaatgaaa aataatttct tacatgggca 2897 gatagttaat ttgttgaaca attacaggta gcatttcatg taatctgatg ttctaaatgg 2957 ttctcttatt gaaggaggtt aaagaattag gtttcttaca gtttttggct ggccatgaca 3017 tgtataaaat gtatattaag gaggaattat aaagtacttt aatttgaatg ctagtggcaa 3077 ttgatcatta agaaagtact ttaaagcaaa aggttaatgg gtcatctggg aaaaatactg 3137 aagtatcaaa ggtatttgca tgtgaatgtg ggttatgttc ttctatccca ccttgtagca 3197 tattctatga aagttgagtt aaatgatagc taaaatatct gtttcaacag catgtaaaaa 3257 gttattttaa ctgttacaag tcattataca attttgaatg ttctgtagtt tctttttaac 3317 agtttaggta caaaggtctg ttttcattct ggtgcttttt attaattttg atagtatgat 3377 gtcacttcct attgaaatgt aagctagcgt gtaccttaga atgtgagctc catgagagca 3437 ggtaccttgt ttgtcttcac tgctgtatct attcccaacg cctcatgaca gtgcctggca 3497 catagtaggc actcaataaa tacttgttga atgaatgaaa aaaaaaaaaa a 3548 <210> 26 <211> 692 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln 35 40 45 Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg 50 55 60 Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp 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Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu 80 85 90 gat gcc gta tct aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca 459 Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala 95 100 105 aag gaa tta cag agg agt ttc atg gca tta agt caa gat att cag aaa 507 Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys 110 115 120 aca ata aag aag aca gca cgt cgg gaa cag ctt atg aga gaa gaa gca 555 Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala 125 130 135 gaa cag aag cgc tta aaa act gta ctt gag tta cag tat gta ttg gat 603 Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp 140 145 150 155 aag ctg gga gat gat gat gtg aga aca gat ctg aaa caa ggt ttg agt 651 Lys Leu Gly Asp Asp Asp Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Ser 160 165 170 gga gtg cca ata ttg tct gag gag gag ttg tca ttg ctg gat gag ttc 699 Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe 175 180 185 tac aag ctc gta gat cct gag cgt gac atg agt tta agg tta aat gag 747 Tyr Lys Leu Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu 190 195 200 cag tat gaa cat gcc tca att cac ttg tgg gat ttg ctg gaa ggg aaa 795 Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys 205 210 215 gaa aag cct gtg tgt gga aca acc tat aaa gct cta aag gaa att gtt 843 Glu Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Glu Ile Val 220 225 230 235 gag cgt gtt ttc cag tca aac tac ttt gat agc act cac aat cat caa 891 Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln 240 245 250 aat ggg ttg tgt gag gag gaa gag gcg gct tca gcg ccc aca gtg gag 939 Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Thr Val Glu 255 260 265 gac cag gta gct gaa gct gaa cct gag cca gcg gaa gaa tac aca gag 987 Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu 270 275 280 caa agt gag gtt gaa tca aca gag tat gtc aat agg cag ttc atg gca 1035 Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala 285 290 295 gaa aca cag ttc agc agt ggt gag aag gag caa gtg gat gag tgg aca 1083 Glu Thr Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Glu Trp Thr 300 305 310 315 gtt gaa aca gtt gag gtt gta aac tca ctc cag cag caa cct cag gct 1131 Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala 320 325 330 gcg tcc cct tca gtc cca gag ccc cac tct ttg act cca gtg gct cag 1179 Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln 335 340 345 tca gat cca ctt gtg aga agg cag cgt gta caa gat ctt atg gca caa 1227 Ser Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln 350 355 360 atg caa ggg ccc tat aat ttc ata cag gat tca atg ttg gat ttt gaa 1275 Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu 365 370 375 aat cag acg ctt gat cct gcc att gta tcc gca cag cct atg aac cct 1323 Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro 380 385 390 395 acc cag aac atg gat atg cct cag ctg gtt tgc cct cag gtt cat tct 1371 Thr Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val Cys Pro Gln Val His Ser 400 405 410 gaa tct aga ctt gcc caa tct aat caa gtt cct gta caa cca gaa gcc 1419 Glu Ser Arg Leu Ala Gln Ser Asn Gln Val Pro Val Gln Pro Glu Ala 415 420 425 aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt gag ggg tat aca gca tct 1467 Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser 430 435 440 cag ccc ttg tac cag cca tct cat gct acg gag cag cgg ccg cag aaa 1515 Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys 445 450 455 gag cca atg gat cag att cag gca aca ata tct ttg aat aca gac cag 1563 Glu Pro Met Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln 460 465 470 475 act aca gca tcc tca tcc ctt cct gct gct tct cag cct caa gtg ttc 1611 Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe 480 485 490 cag gct ggg aca agt aaa cct ttg cac agc agt gga atc aat gta aat 1659 Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn 495 500 505 gca gct cca ttc cag tcc atg caa acg gtg ttc aat atg aat gct cca 1707 Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro 510 515 520 gtc cct cct gct aat gaa cca gaa acg tta aaa caa cag agt cag tac 1755 Val Pro Pro Ala Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Ser Gln Tyr 525 530 535 cag gcc act tat aac cag agt ttt tcc agt cag cct cac caa gtg gaa 1803 Gln Ala Thr Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu 540 545 550 555 caa aca gag ctt caa caa gac caa ctg caa acg gtg gtt ggc act tac 1851 Gln Thr Glu Leu Gln Gln Asp Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr 560 565 570 cat gga tcc cag gac cag cct cat caa gtg cct ggt aac cac cag caa 1899 His Gly Ser Gln Asp Gln Pro His Gln Val Pro Gly Asn His Gln Gln 575 580 585 ccc cca cag cag aac act ggc ttt cca cgt agc agt cag cct tat tac 1947 Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Ser Gln Pro Tyr Tyr 590 595 600 aac agt cgt ggg gta tct cga gga ggg tct cgt ggt gcc aga ggc ttg 1995 Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu 605 610 615 atg aat gga tac agg ggc cct gcc aat gga ttt aga gga gga tat gat 2043 Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp 620 625 630 635 ggt tac cgc cct tca ttc tcg aac act cca aac agt ggt tat tca cag 2091 Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Gln 640 645 650 tct cag ttc act gct ccc cgg gac tac tct ggt tac cag cgg gat gga 2139 Ser Gln Phe Thr Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly 655 660 665 tat cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg cag agt gga cca cgg gga 2187 Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly 670 675 680 gcc cca cga ggt aat ata ttg tgg tgg tga tcctagctcc tatgtggagc 2237 Ala Pro Arg Gly Asn Ile Leu Trp Trp 685 690 ttctgttctg gccttggaag aactgttcat agtccgcatg taggttacat gttaggaata 2297 catttatctt ttccagactt gttgctaaag attaaatgaa atgctctgtt tctaaaattt 2357 catcttgaat ccaaatttta atttttgaat gactttccct gctgttgtct tcaaaatcag 2417 aacattttct ctgcctcaga aaagcgtttt tccaactgga aatttatttt tcaggtctta 2477 aaacctgcta aatgttttta ggaagtacct actgaaactt tttgtaagac atttttggaa 2537 cgagcttgaa catttatata aatttattac cctctttgat ttttgaaaca tgcatattat 2597 atttaggctg agaagccctt caaatggcca gataagccac agttttagct agagaaccat 2657 ttagaattga cataactaat ctaaacttga acacttttag gaccaatgtt agtgttctaa 2717 ataccaacat atttctgatg tttaaacaga tctcccaaat tcttaggacc ttgatgtcat 2777 taaaatttag aatgacaagc ttaagaggct ttagtttcat ttgtttttca agtaatgaaa 2837 aataatttct tacatgggca gatagttaat ttgttgaaca attacaggta gcatttcatg 2897 taatctgatg ttctaaatgg ttctcttatt gaaggaggtt aaagaattag gtttcttaca 2957 gtttttggct ggccatgaca tgtataaaat gtatattaag gaggaattat aaagtacttt 3017 aatttgaatg ctagtggcaa ttgatcatta agaaagtact ttaaagcaaa aggttaatgg 3077 gtcatctggg aaaaatactg aagtatcaaa ggtatttgca tgtgaatgtg ggttatgttc 3137 ttctatccca ccttgtagca tattctatga aagttgagtt aaatgatagc taaaatatct 3197 gtttcaacag catgtaaaaa gttattttaa ctgttacaag tcattataca attttgaatg 3257 ttctgtagtt tctttttaac agtttaggta caaaggtctg ttttcattct ggtgcttttt 3317 attaattttg atagtatgat gtcacttcct attgaaatgt aagctagcgt gtaccttaga 3377 atgtgagctc catgagagca ggtaccttgt ttgtcttcac tgctgtatct attcccaacg 3437 cctcatgaca gtgcctggca catagtaggc actcaataaa tacttgttga atgaatgaaa 3497 aaaaaaaaaa a 3508 <210> 28 <211> 692 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln 35 40 45 Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg 50 55 60 Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met 65 70 75 80 Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys 85 90 95 Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg 100 105 110 Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr 115 120 125 Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu 130 135 140 Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp 145 150 155 160 Asp Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Ser Gly Val Pro Ile Leu 165 170 175 Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Val 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385 390 395 400 Met Pro Gln Leu Val Cys Pro Gln Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala 405 410 415 Gln Ser Asn Gln Val Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu 420 425 430 Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln 435 440 445 Pro Ser His Ala Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Met Asp Gln 450 455 460 Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser 465 470 475 480 Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser 485 490 495 Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln 500 505 510 Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Ala Asn 515 520 525 Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Ser Gln Tyr Gln Ala Thr Tyr Asn 530 535 540 Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln Thr Glu Leu Gln 545 550 555 560 Gln Asp Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Gln Asp 565 570 575 Gln Pro His Gln Val Pro Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn 580 585 590 Thr Gly Phe Pro Arg Ser Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val 595 600 605 Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg 610 615 620 Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser 625 630 635 640 Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Gln Phe Thr Ala 645 650 655 Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe 660 665 670 Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Asn 675 680 685 Ile Leu Trp Trp 690 <210> 29 <211> 2109 <212> DNA <213> Gallus gallus <220> <221> CDS <222> (1)..(2109) <223> <400> 29 atg ccc tcg gct acc aac ggc acc atg gcg agc agc agc ggg aag gcg 48 Met Pro Ser Ala Thr Asn Gly Thr Met Ala Ser Ser Ser Gly Lys Ala 1 5 10 15 ggc ccg ggc ggc aac gag cag gcc ccg gcg gcg gca gcg gcg gcc ccg 96 Gly Pro Gly Gly Asn Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro 20 25 30 cag gcg tcg ggc ggc agc atc acc tcg gtt cag acc gag gcc atg aag 144 Gln Ala Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Val Gln Thr Glu Ala Met Lys 35 40 45 cag atc ttg gga gtg atc gac aaa aag ctc cgc aac ctc gag aag aaa 192 Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys 50 55 60 aag agc aaa ctt gac gat tac cag gaa cga atg aac aag ggg gaa cgt 240 Lys Ser Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 cta aat caa gat caa ctg gat gca gtg tca aaa tac cag gaa gtg aca 288 Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr 85 90 95 aat aac ctg gaa ttc gct aaa gaa ctg cag agg agc ttt atg gca ctg 336 Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu 100 105 110 agc caa gat atc cag aaa aca ata aaa aag acg gct cgc agg gag cag 384 Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln 115 120 125 ctg atg aga gaa gag gct gag cag aag cgt tta aag act gtg cta gag 432 Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu 130 135 140 ctg cag ttc att ttg gac aag ttg ggt gac gat gaa gtg cgc agt gac 480 Leu Gln Phe Ile Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Ser Asp 145 150 155 160 ttg aaa caa gga tca aat gga gta ccg gta ctg aca gag gag gaa ctg 528 Leu Lys Gln Gly Ser Asn Gly Val Pro Val Leu Thr Glu Glu Glu Leu 165 170 175 aca atg ctg gat gaa ttt tac aag cta gtt tac cct gaa agg gac atg 576 Thr Met Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Val Tyr Pro Glu Arg Asp Met 180 185 190 aac atg agg ttg aat gag cag tat gag caa gca tct gtt cac ctg tgg 624 Asn Met Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu Gln Ala Ser Val His Leu Trp 195 200 205 gac tta ctg gaa ggg aag gaa aaa ccc gtt tgt gga aca acc tat aaa 672 Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys 210 215 220 gcc ctg aag gag gtt gtt gaa cgt att ctt caa act agt tac ttt gat 720 Ala Leu Lys Glu Val Val Glu Arg Ile Leu Gln Thr Ser Tyr Phe Asp 225 230 235 240 agc acc cat aac cat cag aac ggg tta tgt gag gaa gaa gag gca gca 768 Ser Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala 245 250 255 ccc aca cct gca gta gaa gac act gta gca gaa gct gag cct gat cca 816 Pro Thr Pro Ala Val Glu Asp Thr Val Ala Glu Ala Glu Pro Asp Pro 260 265 270 gca gaa gaa ttt act gaa cct act gaa gtt gaa tcg act gag tat gta 864 Ala Glu Glu Phe Thr Glu Pro Thr Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val 275 280 285 aac aga caa ttc atg gca gag act cag ttc agc agt agt gag aag gaa 912 Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser Ser Ser Glu Lys Glu 290 295 300 cag gta gat gag tgg aca gtt gaa acg gtt gag gtt gta aat tca ctg 960 Gln Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu 305 310 315 320 cag caa caa aca caa gct aca tct cct cca gtt cct gaa cct cat aca 1008 Gln Gln Gln Thr Gln Ala Thr Ser Pro Pro Val Pro Glu Pro His Thr 325 330 335 ctc act act gtg gct caa gca gat cct ctt gtt aga aga cag aga gta 1056 Leu Thr Thr Val Ala Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val 340 345 350 cag gac ctt atg gcc cag atg cag ggt cca tat aac ttc atg cag gac 1104 Gln Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Met Gln Asp 355 360 365 tct atg ctg gag ttt gag aac cag aca ctt gat cct gcc att gta tct 1152 Ser Met Leu Glu Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser 370 375 380 gca cag ccc atg aat cca gca cag aat ttg gac atg ccg caa atg gtc 1200 Ala Gln Pro Met Asn Pro Ala Gln Asn Leu Asp Met Pro Gln Met Val 385 390 395 400 tgc cct cca gtt cat act gag tca aga ctt gcc cag cct aat caa gtt 1248 Cys Pro Pro Val His Thr Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val 405 410 415 cct gtg caa cca gaa gct acg cag gtt ccc ttg gtt tca tct aca agt 1296 Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser 420 425 430 gag gga tat aca gcc tcc cag ccc atg tat cag cct tct cat acc aca 1344 Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Met Tyr Gln Pro Ser His Thr Thr 435 440 445 gag caa cgg cca cag aag gaa tcc att gac cag att cag gct tca atg 1392 Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Ser Ile Asp Gln Ile Gln Ala Ser Met 450 455 460 tca ctg aat gca gac cag acc ccg tca tca tca tca ctt ccc act gca 1440 Ser Leu Asn Ala Asp Gln Thr Pro Ser Ser Ser Ser Leu Pro Thr Ala 465 470 475 480 tcc cag ccg caa gtt ttc caa gct gga tct agc aaa cct ttg cat agc 1488 Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Ser Ser Lys Pro Leu His Ser 485 490 495 agc gga atc aat gtt aat gca gct cca ttc caa tcc atg caa aca gta 1536 Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val 500 505 510 ttc aac atg aat gca cct gtt cct cct gtt aat gag cca gaa gcc ctt 1584 Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Ala Leu 515 520 525 aag caa caa aat cag tac cag gcc agt tac aac cag agt ttc tcc aat 1632 Lys Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Asn 530 535 540 cag cca cac caa gta gaa caa tca gat ctt cag caa gaa cag ctc cag 1680 Gln Pro His Gln Val Glu Gln Ser Asp Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln 545 550 555 560 aca gtg gtt ggt act tac cat ggt tct ccg gac cag acc cat caa gtg 1728 Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Pro Asp Gln Thr His Gln Val 565 570 575 gca gga aac cac cag caa cct ccc cag cag aat act gga ttt cca cgc 1776 Ala Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg 580 585 590 aac agt cag cct tat tac aac agt cgg gga gtg tct cgt ggt gga tca 1824 Asn Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser 595 600 605 cgt ggg act cgt gga ttg atg aat ggt tac agg gga cct gca aat gga 1872 Arg Gly Thr Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly 610 615 620 ttt aga gga gga tat gat ggc tac cgt cct tca ttt tcc aac act ccg 1920 Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro 625 630 635 640 aac agt ggt tac acg cag ccc caa ttt aat gct cct cga gat tat tca 1968 Asn Ser Gly Tyr Thr Gln Pro Gln Phe Asn Ala Pro Arg Asp Tyr Ser 645 650 655 aac tac cag cgg gat gga tat cag cag aac ttc aaa cgt ggt tct gga 2016 Asn Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly 660 665 670 caa agt ggg cct cgg gga gct cct cga ggt cgt gga ggg ccc cca aga 2064 Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg 675 680 685 cca aac aga ggg atg cct caa atg aac gct cag caa gtg aat taa 2109 Pro Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn Ala Gln Gln Val Asn 690 695 700 <210> 30 <211> 702 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 30 Met Pro Ser Ala Thr Asn Gly Thr Met Ala Ser Ser Ser Gly Lys Ala 1 5 10 15 Gly Pro Gly Gly Asn Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro 20 25 30 Gln Ala Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Val Gln Thr Glu Ala Met Lys 35 40 45 Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys 50 55 60 Lys Ser Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr 85 90 95 Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu 100 105 110 Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln 115 120 125 Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu 130 135 140 Leu Gln Phe Ile Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Ser Asp 145 150 155 160 Leu Lys Gln Gly Ser Asn Gly Val Pro Val Leu Thr Glu Glu Glu Leu 165 170 175 Thr Met Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Val Tyr Pro Glu Arg Asp Met 180 185 190 Asn Met Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu Gln Ala Ser Val His Leu Trp 195 200 205 Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys 210 215 220 Ala Leu Lys Glu Val Val Glu Arg Ile Leu Gln Thr Ser Tyr Phe Asp 225 230 235 240 Ser Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala 245 250 255 Pro Thr Pro Ala Val Glu Asp Thr Val Ala Glu Ala Glu Pro Asp Pro 260 265 270 Ala Glu Glu Phe Thr Glu Pro Thr Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val 275 280 285 Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser Ser Ser Glu Lys Glu 290 295 300 Gln Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu 305 310 315 320 Gln Gln Gln Thr Gln Ala Thr Ser Pro Pro Val Pro Glu Pro His Thr 325 330 335 Leu Thr Thr Val Ala Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val 340 345 350 Gln Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Met Gln Asp 355 360 365 Ser Met Leu Glu Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser 370 375 380 Ala Gln Pro Met Asn Pro Ala Gln Asn Leu Asp Met Pro Gln Met Val 385 390 395 400 Cys Pro Pro Val His Thr Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val 405 410 415 Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser 420 425 430 Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Met Tyr Gln Pro Ser His Thr Thr 435 440 445 Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Ser Ile Asp Gln Ile Gln Ala Ser Met 450 455 460 Ser Leu Asn Ala Asp Gln Thr Pro Ser Ser Ser Ser Leu Pro Thr Ala 465 470 475 480 Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Ser Ser Lys Pro Leu His Ser 485 490 495 Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val 500 505 510 Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Ala Leu 515 520 525 Lys Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Asn 530 535 540 Gln Pro His Gln Val Glu Gln Ser Asp Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln 545 550 555 560 Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Pro Asp Gln Thr His Gln Val 565 570 575 Ala Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg 580 585 590 Asn Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser 595 600 605 Arg Gly Thr Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly 610 615 620 Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro 625 630 635 640 Asn Ser Gly Tyr Thr Gln Pro Gln Phe Asn Ala Pro Arg Asp Tyr Ser 645 650 655 Asn Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly 660 665 670 Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg 675 680 685 Pro Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn Ala Gln Gln Val Asn 690 695 700 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T3 primer <400> 31 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T7 primer <400> 32 taatacgact cactatagg 19 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 aaggtttgaa tggagtgc 18 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 34 tgctcctttt caccactg 18 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 35 gggctgcttt taactctg 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 36 ccaggaaatg agcttgac 18 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptides <400> 37 Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln 1 5 10 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 38 aggtsharct gcagsagtcw gg 22 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 39 ctcgagttaa ttcacttgct gag 23 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40 Asp Tyr Asn Met Asp 1 5 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 Asp Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 43 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu His Gln Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asp Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala 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80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 Ser Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 115 120 125 Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Asn Pro Tyr Asp 130 135 <210> 48 <211> 444 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 48 atggaatgga gcggggtctt tatctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgag 60 gtccagctgc atcagtttgg agctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120 tgcaaggctt ctggctacac attcactgac tacaacatgg actgggtgaa gcagagccat 180 ggaaagagcc ttgagtggat tggagatatt aatcctaact atgatagtac tagctacaac 240 cagaagttca agggaaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 300 gagctccgca gcctgacatc tgaggacact gcagtctatt actgtgcaag atcgaggagc 360 tatgattacg aaggatttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc 420 aaaacaacac ccccatcagt ctat 444 <210> 49 <211> 444 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 49 atggaatgga gcggggtctt tatctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgag 60 gtccagctgc atcagtttgg agctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120 tgcaaggctt ctggctacac attcactgac tacaacatgg actgggtgaa gcagagccat 180 ggaaagagcc ttgagtggat tggagatatt aatcctaact atgatagtac tagctacaac 240 cagaagttca agggaaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 300 gagctccgca gcctgacatc tgaggacact gcagtctatt actgtgcaag atcgaggagc 360 tatgattacg aaggatttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc 420 aaaacaacac ccccatcagt ctat 444 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Leu Trp Ser Val Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Gly Ala Ser Ile Arg Glu Ser 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Gln His Asn His Gly Ser Phe Leu Pro 1 5 <210> 53 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Ala Val Leu Arg Cys Ser Arg Gly Leu Leu Val Ile Trp Ile Ser Asp 1 5 10 15 Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Thr Ala Gly Glu 20 25 30 Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Trp Ser Val 35 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ttcacaatta 120 tttagcatgg tatcagcaga aacagggaaa atctcctcag ctcctggtct ataatgcaaa 180 aaccttagca gatggtgtgc catcaaggtt cagtggcagt ggatcaggaa cacaatattc 240 tctcaagatc aacagcctgc agcctgaaga ttttgggagt tattactgtc aacatttttg 300 gagtacgctc acgttcggag gtggtaccaa gctggagatc aaacaatcgg atc 353 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 60 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu His 1 5 10 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 62 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 63 <211> 94 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63 Ser Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 10 15 Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu 20 25 30 Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val 50 55 60 Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp 65 70 75 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ggaagattat ttctgtctgc aacattgtaa ttatcctaac 240 gagttcagag gttgtaccaa ggtgccaatc taaagaacaa acaccccctg 290 <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 80 Ser Tyr Trp Met Gln 1 5 <210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81 Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 82 Ala Arg Gly Glu Tyr Gly Asn Tyr Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 83 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 83 Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys 1 5 10 15 Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln 20 25 30 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile 35 40 45 Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Gly Lys 50 55 60 Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu 65 70 75 80 Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Glu Tyr Gly Asn Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 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ggatgcagtg ggtaaaacag aggcctggac 120 agggtctgga atggattggg gctatttatc ctggagatgg tgatactagg tacactcaga 180 agttcaaggg caaggccaca ttgactgcag ataaatcctc cagcacagcc tacatgcaac 240 tcagcagctt ggcatctgag gactctgcgg tctattactg tgcaagaggg gagtatggta 300 actattttgc ttactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaaat cg 352 <210> 89 <211> 302 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 89 ggacatcgga tgcatctcta ggagagagag tcactatcac ttgcaaggcg agtcaggaca 60 ttaatagcta tttaagctgg ttccagcaga aaccagggaa atctcctaag accctgatct 120 atcgtgcaaa cagattggta gatggggtcc catcaaggtt cagtggcagt ggatctgggc 180 aagattattc tctcaccatc agcagcctgg agtatgaaga tatgggaatt tattattgtc 240 tacagtatga tgagtttccg ctcacgttcg gaggaggtac caagctggag atcaaacaaa 300 aa 302 <210> 90 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 90 Asp Thr Tyr Met His 1 5 <210> 91 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 91 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 92 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 92 Ala Arg 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gttgatagtt atggcaatag ttttatgcac tggtaccagc agaaaccagg acagccaccc 120 aaactcctca tctatcgtgc atccaaccta gaatctggga tccctgccag gttcagtggc 180 agtgggtcta ggacagactt caccctcacc attaatcctg tggaggctga tgatgttgca 240 acctattact gtcagcaaag taatgaggat cctggacgtt cggaggtggt accaagctgg 300 agatcaaaca aaa 313 <210> 100 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 100 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 101 Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 102 Ala Arg Ala Asn Trp Ala Phe Asp Tyr 1 5 <210> 103 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 103 Pro Arg Ala Ser Leu Gly Val Ser Glu Thr Leu Leu Cys Thr Ser Gly 1 5 10 15 Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly 20 25 30 Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr 35 40 45 Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 50 55 60 Asp Asn Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu 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musculus <400> 108 ggccgcgtgc tagcctgggg gtctctgaga ctctcctgtg cacttctggg ttcaccttca 60 ctgattacta catgagctgg gtccgccagc ctccaggaaa ggcacttgag tggttgggtt 120 ttattagaaa caaagctaat ggttacacaa cagagtacag tgcatctgtg aagggtcggt 180 tcaccatctc cagagataat tcccaaagca tcctctatct tcaaatgaac accctgagag 240 ctgaggacag tgccacttat tactgtgcaa gggctaactg ggcctttgac tactggggcc 300 aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaaaa 329 <210> 109 <211> 284 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 109 tcaggagata gagtcagtct ttcctgcagg gccagtcaaa gtattagcaa ctacctacac 60 tggtatcaac aaaaatcaca tgagtctcca aggcttctca tcaagtatgc ttcccagtcc 120 atctctggga tcccctccag gttcagtggc agtggatcag ggacagattt cactctcagt 180 atcaacagtg tggagactga agattttgga atgtatttct gtcaacagag taacagctgg 240 ccgtacacgt tcggaggagg taccaagctg gagatcaaac agaa 284 <210> 110 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 110 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 111 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 111 Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys 1 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DNA <213> Mus musculus <400> 119 cgccttcctt tctattctct ggagcagagg gccaccatct catacagggc cagcaaaaat 60 gtcagtacat ctggctatag ttatatgcac tggaaccaac agaaaccagg acagccaccc 120 aaactcctca tctatcttgt atccaaccta gaatctgggg tccctgccag gttcagtggc 180 agtgggtctg ggacagactt caccctcaac atccatcctg tggaggagga ggatgctgca 240 acctattact gtcagcacat tagggagctt acacgttcgg agctggtacc aagctggaaa 300 tcaaac 306 <210> 120 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 120 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 121 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 121 Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 122 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 122 Ala Arg Gly Leu Arg His Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 123 <211> 101 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 123 Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His 1 5 10 15 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile 20 25 30 Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys 35 40 45 Ala Thr Leu Asn Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu 50 55 60 Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 65 70 75 80 Leu Arg His Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 85 90 95 Thr Val Ser Ser Lys 100 <210> 124 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 124 Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 125 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 125 Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 126 Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser 1 5 <210> 127 <211> 99 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 127 Thr Ile Leu Trp Arg Glu Gly Pro Phe Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser 1 5 10 15 Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro 20 25 30 Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 35 40 45 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 50 55 60 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Glu Val Pro Ser Trp Arg 85 90 95 Ser Asn Lys <210> 128 <211> 304 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 128 gtgtcctgca aggcttcagg ctataccttc accagctact ggatgcactg ggtgaaacag 60 aggcctggac aaggccttga gtggattggc atgattgatc cttccaatag tgaaactagg 120 ttaaatcaga agttcaagga caaggccaca ttgaatgtag acaaatcctc caacacagcc 180 tacatgcagc tcagcagcct gacatctgag gactctgcag tctattactg tgcaagaggg 240 ttacgccact actggtactt cgatgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 300 aaaa 304 <210> 129 <211> 298 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 129 actattctct ggagagaggg ccccttctca tacagggcca gcaaaagtgt cagtacatct 60 ggctatagtt atatgcactg gaaccaacag aaaccaggac agccacccag actcctcatc 120 tatcttgtat ccaacctaga atctggggtc cctgccaggt tcagtggcag tgggtctggg 180 acagacttca ccctcaacat ccatcctgtg gaggaggagg atgctgcaac ctattactgt 240 cagcacatta gggagcttac acgttcggag gaggtaccaa gctggagatc aaacaaaa 298 <210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 130 aggtsharct gcagsagtcw gg 22 <210> 131 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 131 tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34 <210> 132 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 132 tccgatatcc agctgaccca gtctcca 27 <210> 133 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 133 gtttgatctc cagcttggta cchscdccga a 31 <210> 134 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 134 agtcacgacg ttgta 15 <210> 135 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 135 caggaaacag ctatgac 17 <210> 136 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn Gly 1 5 10 15 Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp Gln 20 25 30 Val Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser 35 40 45 Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg 50 55 <210> 137 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg 1 5 10 15 <210> 138 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg 1 5 10

Claims (22)

  1. 서열 번호 2∼30 중 짝수의 서열 번호로 나타내어지는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 CAPRIN-1 단백질, 또는 연속되는 7 이상의 아미노산을 포함하는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체; 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 CAPRIN-1 단백질의 단편으로서 서열 번호 2∼30 중 서열 번호 6 및 서열 번호 18을 제외한 짝수의 서열 번호로 나타내어지는 어느 하나의 아미노산 서열 중 아미노산 잔기 번호 50-98 또는 아미노산 잔기 번호 233-305의 영역 내의 연속되는 7개 이상의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드와 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체; 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    서열 번호 37 또는 서열 번호 136으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 CAPRIN-1의 부분 폴리펩티드, 또는 연속되는 7 이상의 아미노산을 포함하는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체; 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 유방암, 뇌종양, 백혈병, 림프종, 폐암, 식도암 또는 대장암인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 2중 특이성 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 44, 45 및 46을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 50, 51 및 52를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 55, 56 및 57을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 60, 61 및 62를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 65, 66 및 67을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 서열 번호 70, 71 및 72를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 74, 75 및 76을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 서열 번호 80, 81 및 82를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 84, 85 및 86을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 서열 번호 90, 91 및 92를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 94, 95 및 96을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 서열 번호 100, 101 및 102를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 104, 105 및 106을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  17. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 서열 번호 110, 111 및 112를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 114, 115 및 116을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  18. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 서열 번호 120, 121 및 122를 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 124, 125 및 126을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖고, 또한 CAPRIN-1의 암 세포의 세포 표면에 발현되는 부분과 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  19. 제 8 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 2중 특이성 항체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
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