KR101621061B1 - 커큐민―헥사펩타이드 복합체를 포함하는 항산화 또는 피부상태 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 커큐민-헥사펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 커큐민과 기능성 펩타이드 사이의 상승적(synergistic) 효과로 인하여 매우 우수한 항산화 및 피부상태 개선활성을 동시에 나타낼 수 있다. 본 발명의 조성물은 항산화, 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선 및 피부 노화 방지 등을 위한 목적으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

커큐민―헥사펩타이드 복합체를 포함하는 항산화 또는 피부상태 개선용 조성물{Compositions for antioxidation or improvement of skin conditions comprising curcumin-hexapeptide complexes}

본 발명은 커큐민-헥사펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물에 관한 것이다.

화장품 산업은 기술적 측면에서 화학, 생물학, 생리학 및 약학 등의 기초과학과 응용 기술이 복합적으로 적용되는 분야로, 기술집약적이고 고부가가치 산업이다. 오늘날 화장품은 사람의 피부에 직접 사용하는 제품으로서 피부에 대한 안전성, 효능 및 사용 편의성 등을 갖추어야 하며, 아름다움을 가꾸는 미적 기능 뿐 아니라, 피부를 보호, 청결, 보습, 유연 및 피부 생리적 기능을 유지하는 생물학적 기능 또한 갖추어야 한다.

고도 산업의 발달과 더불어 야기되는 생활환경의 변화로 인해 트러블성 피부 및 피부 질환이 증가하고 있으며, 성인보다는 유·소아에서 보다 심하게 나타나고 있다. 이러한 이유로 화장품 및 바이오 산업계에서는 피부의 아름다움을 지키고 키우는 고전적 의미의 화장품 기능에서 피부의 건강을 유지, 강화 혹은 회복하고 다양한 피부질환을 개선 혹은 완화하는 고기능성 화장품의 연구개발과 상용화를 위한 다양한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 생명공학기술의 발달은 최근의 웰빙 문화와 함께 요구되는 높은 수준의 기능성을 만족시킬 수 있는 다양한 생리활성 소재의 개발과 생산을 가능하게 하고 있어, 향후 고기능의 준치료성 화장품에 대한 수요가 급증할 것으로 예상된다.

국민소득이 증가함에 따라 소비자들의 건강에 대한 관심이 높아지고 있으며, 특히, 노화 방지 및 미백에 대한 관심은 연구자들뿐 아니라, 일반인들에게도 주요 관심 대상이다. 노화는 신체 모든 기관에서 공통으로 발생되는 생물학적 현상이라 할지라도 일차적으로 외모 특히 피부에서 제일 먼저 나타나므로 이를 지연 또는 예방하기 위하여 생명공학분야 뿐만 아니라 화장품 영역에서도 많은 연구가 진행되어 왔다. 특히, 국내에서는 화장품 기능성법이 시행되고 있으며, 화장품의 기능이 단순히 피부 보호 또는 보습의 역할에서 한발 더 나아가 미백(등록특허 10-1257641, 등록특허 10-1251040), 주름예방(등록특허 10-0490315, 등록특허 10-0890492, 등록특허 10-0628518) 등의 기능성을 강조하는 제품 개발이 활발히 이루어지고 있다.

최근에 이러한 흐름에 부합하고 있는 고기능성 바이오 원료 중 대표적인 것으로 펩타이드 소재를 들 수 있다. 펩타이드 생산 및 응용 기술은 1970년대 고체상 펩타이드 합성법 기술 개발 이후 특별한 합성 기술적 고도성은 증가하지 않았으나, 펩타이드 내 아미노산 서열이 가지는 배열 및 구조에 따라 생체 내 혹은 피부에서 생리활성을 가지게 되어 생물학적 제제로서의 펩타이드는 화장품 소재(등록특허 10-1527280, 등록특허 10-1410589), 의약품 소재(등록특허 10-1375026, 등록특허 10-1437599)로서 산업적 응용가능성이 높다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 울금(Curcuma longa)에 주로 존재하는 천연 항산화 성분인 커큐민(curcumin)과 주름 개선에 효과가 있는 기능성 펩타이드인 아세틸 헥사펩타이드-3(argireline)을 융합한 커큐민-헥사펩타이드 융합 신소재를 개발하고, 이의 상승적(synergistic)인 피부 생리활성을 확인하였으며, 이를 함유하는 피부 외용제가 특히 주름의 개선에 매우 효과적임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 항산화 또는 피부상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 항산화 또는 피부상태 개선용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 커큐민; 및 상기 커큐민과 링커 화합물을 통하여 N 말단이 결합된 서열목록 제1서열의 헥사펩타이드를 포함하고, 상기 헥사펩타이드의 C-말단은 아세트아마이드인 것을 특징으로 하는 커큐민-헥사펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부상태(skin conditions) 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 커큐민; 및 상기 커큐민과 링커 화합물을 통하여 N 말단이 결합된 서열목록 제1서열의 헥사펩타이드를 포함하고, 상기 헥사펩타이드의 C-말단은 아세트아마이드인 것을 특징으로 하는 커큐민-헥사펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부상태 개선용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 울금(Curcuma longa)에 주로 존재하는 천연 항산화 성분인 커큐민(curcumin)과 주름 개선에 효과가 있는 기능성 펩타이드인 아세틸 헥사펩타이드-3(argireline)을 융합한 커큐민-헥사펩타이드 융합 신소재를 개발하고, 이의 상승적(synergistic)인 피부 생리활성을 확인하였으며, 이를 함유하는 피부 외용제가 특히 주름의 개선에 매우 효과적임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 명세서에서 용어, "커큐민[(1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1, 6-heptadiene-3,5-dione)]"은 울금의 구근에 포함되어 있는 심황(turmeric)의 주색소 성분을 의미한다. 커큐민은 다양한 원천으로부터 얻을 수 있으며, 예를 들면 화학적으로 합성될 수 있고, 식물로부터 분리될 수도 있다. 본 발명의 목적상 상기 커큐민에는 커큐민과 실질적으로 동일한 활성(예컨대, 항산화능)을 나타내는 한 이의 유도체도 포함된다.

본 명세서에서 용어, "헥사펩타이드" 또는 "기능성 펩타이드"는 주름 개선 활성을 가지며, Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH₂의 아미노산 서열(서열목록 제1서열, C-말단이 아세트아마이드)을 갖는 헥사펩타이드를 의미한다. 서열목록 제1서열의 헥사펩타이드의 N-말단에 아세틸기를 갖는 경우(Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH₂), 아지렐린(Argireline, acetyl hexapeptide-3)으로 알려진 주름개선 기능성 펩타이드이다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 커큐민-헥사펩타이드 복합체는 상기의 커큐민, 헥사펩타이드 및 이들을 연결하는 링커 화합물을 포함한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 링커 화합물은 생분해성 링커 화합물이다. 하나의 특정예에 따르면, 상기 링커 화합물은 커큐민과 에스터(ester) 결합을 형성하며, 체내의 에스터라제(esterase)에 의해 가수분해될 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 링커 화합물은 글루타레이트(glutarate)이다. 상기 글루타레이트 링커는 커큐민의 작용기(예컨대, OH 그룹) 및 헥사펩타이드의 N-말단과 각각 공유결합 하여 커큐민-헥사펩타이드 복합체를 형성할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 링커 화합물은 커큐민과 에스터 결합으로 결합되고, 헥사펩타이드와는 펩타이드 결합으로 결합된다. 예를 들면, 상기 링커 화합물로서 글루타레이트를 이용하는 경우, 링커 화합물은 커큐민의 OH 그룹과 축합반응(에스터 결합)으로 결합하고, 헥사펩타이드의 N-말단과도 축합반응으로 결합(펩타이드 결합)함으로써 커큐민-헥펩타이드 복합체가 형성된다. 상기 커큐민-헥사펩타이드 복합체의 화학식은 도 2에 도시되어 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 피부상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선 또는 피부 노화 방지이다. 하기 실시예에서 확인한 바와 같이, 커큐민-헥사펩타이드 복합체는 세포 독성을 나타내지 않으며(도 3 참조), 비타민 C와 동등한 정도의 강력한 항산화 활성을 나타내고(도 4 및 5 참조), 세포 내 지질과산화를 저해하여 노화를 방지할 수 있으며(도 6 참조), 콜라겐 생합성을 매우 촉진시킬 수 있다(도 7 참조). 특히, 본 발명의 커큐민-헥사펩타이드 복합체를 포함하는 화장료 조성물(피부 외용제)은 주름 개선에 있어 월등한 효능을 나타낼 수 있다(표 7 내지 10 참조).

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서의 커큐민-펩타이드 복합체 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 화장수(수렴 화장수, 유연 화장수 등), 크림, 로션, 세럼, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 경피 투여된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.0001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 커큐민-기능성 헥사펩타이드 융합 신소재를 포함하는 조성물을 제공한다.

(ii) 본 발명의 조성물은 커큐민과 기능성 펩타이드 사이의 상승적(synergistic) 효과로 인하여 매우 우수한 항산화 및 피부상태 개선활성을 동시에 나타낼 수 있다.

(iii) 본 발명의 조성물은 항산화, 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선 및 피부 노화 방지 등을 위한 목적으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 정제공정을 통하여 생산된 커큐민-헥사펩타이드 복합체의 크로마토그래피 결과를 보여준다.
도 2는 커큐민-헥사펩타이드 복합체의 개략적인 합성과정을 보여준다.
도 3은 커큐민-헥사펩타이드 복합체의 피부세포 안전성 시험결과를 보여준다. 피부세포에서의 안전성을 MTT 시험법으로 시험하였으며, 농도는 최고 100 μM에서 2배씩 희석하여 최저 6.25 μM까지 처리하였다. A: 각질형성세포, B: 섬유아세포.
도 4는 비타민과 커큐민의 항산화 효과를 보여준다. A: 비타민, B: 커큐민.
도 5는 커큐민-헥사펩타이드 복합체의 항산화 효과를 보여준다.
도 6은 커큐민-헥사펩타이드 복합체의 지질과산화 저해 활성을 보여준다.
도 7은 커큐민-헥사펩타이드 복합체의 콜라겐 생합성 촉진 효과를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 이하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예

제조예. 초음파 합성기를 이용한 커큐민-헥사펩타이드 복합체의 제조

사용원료

Fmoc-Glu(tbu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH 등의 원료는 GLS로부터 구매하였고, 커큐민은 TCI에서 구매하였으며, 글루타레이트는 Sigma에서 구입하였으며, 일반 원료(DMF, DIEA, NMP, DCM)는 대정화금으로부터 구매하여 사용하였다.

Fmoc 탈보호

Fmoc의 탈보호는 20% 피페리딘/DMF을 사용하였으며, 세척은 DCM(Dichloromethane), DMF(dimethylformamide) 등을 사용하여 5분씩 수행하였다.

아미노산 결합

커플링 시약(coupling reagent)으로 HOBT/DIC(Hydroxybenzotriazole/ diisopropylcarbodiimide)를 사용하여 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 아미노산들을 순서대로 고체상 합성법에 의하여 순서대로 결합하였다. 반응시간은 4시간 이상, 합성 온도는 30℃로 하였다.

분리(Cleavage)

반응완료 후 전체 분리는 70% TFA/DCM 용액을 사용하여 2시간 동안 분리하고, 에테르 중에서 추출하고 건조하여 비-정제된 펩타이드를 얻었다.

커큐민-헥사펩타이드 복합체 합성

NH₂(아마이드 레진)를 1시간 동안 DMF 용매에서 스웰링 한 후 Fmoc을 20% 피페리딘을 이용하여 10분간 2회 실시하고, DMF를 이용하여 2분간 6회에 걸쳐 깨끗하게 세척하였다. 상기 아마이드 레진에 Fmoc-Arg(pbf)-OH를 DMF에 완벽히 녹인 다음 레진에 넣어주었다. 커플링 시약으로 HOBT 및 DIC를 아미노산의 당량에 따라 넣어주었다. 이후, 초음파 합성기(Sonicator, 애니젠 제작) 이용하여 4시간 이상 합성을 실시하였다.

반응이 종료되면 용매를 벤트(Vent)시킨 후 깨끗한 DMF로 2분씩 6회에 걸쳐 세척하였다. 이후, 상기의 방법과 같은 방법으로 Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH 및 Fmoc-Glu(tBu)-OH의 아미노산으로 커플링을 실시하였다. 세척 후, 합성한 레진 상태에서 글루타릭 무수물(Glutaric anhydride)을 3당량, DIEA를 사용하여 자체 제작한 대용량 초음파 합성기로 2시간 실시하였으며, 온도는 35℃를 유지하며 반응시켰다. 이후, 커큐민을 위와 같은 방법으로 3당량, DMAP를 사용하여 위의 물질에 합성을 실시하였다. 합성 완료 후 70% TFA/DCM 용액을 이용하여 2시간 동안 분리를 실시한 후 얻은 조(Crude) 제품을 HPLC를 이용하여 정제한 후 커큐민-헥사펩타이드(Argireline) 물질을 확보하였다. 구체적인 합성공정은 다음과 같았다.

정제

수득된 펩타이드는 하기 조건의 그래디언트(gradient) 조건하에서 HPLC로 정제 후 동결 건조하여 목적 펩타이드를 수득하였다.

A. 기기: Shimadzu 8A (5 cm * 25 cm)/8A (prep(dia 5 cm))

B. 용매의 조성: 버퍼 A=0.1% TFA/아세토나이트릴, 버퍼 B=0.1% TFA/H₂O

C. 흐름속도(Flow rate): 50-140 ㎖/분

D. 컬럼: Silicagel C18 reverse phase

E. 그래디언트 테이블

중간 규모(10 mmole) 펩타이드 합성에서 얻어진 결과를 바탕으로 펩타이드 의약품 원료에 대한 대규모(100 mmole) 합성을 수행하여 스케일 상승(scale-up)을 실시하였다. 합성된 조펩타이드는 HPLC 정제조건을 확립하여 정제를 하여 최종목적물을 생산하였다(도 1). 커큐민-아지렐린 복합체의 개략적인 합성과정 및 이의 화학식을 도 2에 나타내었다.

실시예 1. 커큐민-헥사펩타이드 복합체의 인간 피부세포 안전성 시험

커큐민-아지렐린 복합체에 대하여 인간 피부구성 세포들 즉, 각질형성세포(keratinocyte)와 섬유아세포(fibroblast)에 세포주인 HaCaT 세포주와 CCD-986sk에 대하여 안전성 혹은 세포 독성 존재 여부를 검사하기 위해 MTT 시험을 실시하였다. 이를 위하여 인간 각질형성 세포주 HaCaT 세포와 섬유아세포인 CCD-986sk를 24웰 플레이트에 5 X 10³ 세포/웰과 5 X 10⁴ 세포/웰씩 동일하게 혈구계수기(heamacytometer)를 이용하여 계수한 후 분주해 배양하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 동안 배양하여 배양용기 표면적의 50% 만큼 배양되면, 커큐민-아지렐린 복합체가 적절한 농도로 함유되어 있는 배지에서 24시간 동안 더 배양하였다. 배양 후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma M5655) 용액(2.5 mg/㎖)을 50 ㎕ 첨가하고 3시간 동안 추가로 배양하였다. 이후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200 ㎕의 디메틸설폭사이드(DMSO, Sigma D2650)를 각 웰 당 200 ㎕ 처리하여 교반한 후, 100 ㎕ 씩을 96 웰로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포에 대한 독성 혹은 증식을 촉진하는 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 커큐민-아지렐린 복합체는 처리 농도 100 μM 까지 세포독성이 없었다. 특히, 섬유아세포에서 커큐민-아지렐린 복합체 50 μM에서 대조군 대비 약 20% 이상 세포 증식능을 보였으며, 이는 화장품 원료로서 세포독성이 없으면서, 피부교원질을 생산하는 섬유아세포의 증식을 촉진시킴으로써 주름개선에도 효과가 있음을 의미한다(도 3의 B).

실시예 2. 커큐민-헥사펩타이드 복합체의 항산화 시험

유해산소(toxic oxygen species)라고도 하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 호흡 등과 같은 생리작용에 의해 세포에서 생성되는 독성물질로 끈임없이 생산되고 소멸하며, 정상적인 상태에서는 3-5% 정도로 존재한다. 이런 활성산소종은 수퍼옥시드 라디칼(Superoxide radical, O^{2 -}), 하이드록시라디칼(hydroxyl radical, HO⁺)과 같은 자유라디칼(free radical : 화학적으로 최외각 전자궤도에 쌍을 이루고 있지 않은 원자나 분자로 매우 불안정하여 높은 반응성을 가짐)의 형태로 존재하거나 혹은 과산화수소(hydorgen peroxide, H₂O₂)나 일중항산소(Singlet radical, ¹O₂)와 같이 쌍을 이룬 전자를 가진 화합물의 형태로 존재한다. 활성산소는 생리계 내에서 세균을 살균하는 생체 방어 작용을 하는 장점도 있지만, 일반적으로 생체 내에서 산화를 일으켜 질병의 원인이 되는 유해한 작용을 한다. 이 활성산소는 생물분자를 공격하여 세포나 조직에 피해를 주며, 노화나 각종 성인병질환에 관여하는 여러 종류의 질병을 야기한다는 보고도 있다. 이러한 활성산소에 의한 산화작용을 억제 할 수 있는 항산화제에 관한 연구가 미용업계에서도 활발하게 진행 되고 있으며, 항산화력이 강력한 천연물이나 물질들의 연구개발은 항노화 물질로서 각광받고 있다.

본 시험 방법은 에탄올상에서 DPPH(1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl, Sigma D9132-1G)가 발생시키는 자유라디칼에 대한 소거능을 시험함으로써 항산화 효과의 직접적인 작용 정도를 파악할 수 있는 시험법이다. 화합물 DPPH는 에탄올 내에서 자유라디칼을 발생하는데, 이에 일정 농도의 시료와 혼합하여 자유라디칼의 양이 어느 정도 감소하는지 확인하였다. 구체적으로, 에탄올 0.4 ㎖에 0.1 mM의 DPPH용액 0.5 ㎖, 그리고 일정농도로 희석된 추출물 0.1 ㎖를 첨가하고, 10초간 강하게 볼텍싱한 후 냉암소에서 30분간 반응시켰다. ELISA를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하며, 항산화능의 정도는 에탄올을 사용한 대조군(음성대조군)의 흡광강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

[수학식 1]

자유라디칼 활성 저해율(%) = 100 - {(각 시료액의 반응흡광도/공시료액의 반응흡광도) X 100}

커큐민-아지렐린 복합체의 항산화 시험을 DPPH 시험법을 통하여 확인한 결과, 커큐민을 비타민과 비교하였을 때 커큐민은 비타민과 유사한 항산화 효과가 있음을 확인하였다(도 4). 커큐민-아지렐린 복합체 역시 항산화 효과가 대조군 대비 매우 우수한 항산화력을 가지며(도 5). 커큐민-아지렐린 복합체의 경우 50 μM에서 이미 고점에 도달하였으며, 시너지 효과가 있음을 확인하였다(도 5). 이러한 결과는 비타민 C와 유사한 항산화력을 가지면서도 피부세포에 안정하여 항노화 화장품 원료로서 매우 가치가 높음을 의미한다.

실시예 3. 지질과산화(Lipid peroxidation) 시험방법

지질과산화는 동물이나 식물에서 세포 손상을 일으키는 메커니즘으로 잘 알려져 있다. 따라서, 이러한 지질과산화를 시험하기 위하여 TBARS(Thiobarbituric Acid Reactive Substance) 키트를 이용하여 시험하였다. 지질과산화는 세포에서 산화적 스트레스의 지시자로서 지질과산화의 자연적인 두 가지 산물인 MDA나 4-HNE(4-hydorxynonenal)와 같은 더욱 복잡하고 반응성이 높은 물질을 형성하며 분해된다. TBARS 키트는 직접적으로 MDA(Malondialdehyde)를 측정하는 기법으로, 구체적인 실험방법으로는 적정농도의 커큐민-아지렐린 복합체를 인간 각질형성 세포주에 처리한 후 그 배양액을 수득하여 사용하였다. 시험방법은 다음과 같았다. 100 ㎕의 시료와 MDA 스탠다드를 E-튜부에 분주하고, SDS 용해 용액을 100 ㎕ 추가하였다. 가볍게 믹스한 후 상온에서 5분 동안 반응시키고, 250 ㎕의 TBA 시약을 각 웰에 추가한 다음, E-튜브의 뚜껑을 닫은 후 95℃서 45-60분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 얼음에서 5분간 추가 반응시킨 후, 3,000 rpm으로 15분 동안 원심분리 후 상등액을 취하여 분석하였다. 200 ㎕씩 96 웰에 옮긴 후 532 nm로 읽었다.

세포 내 지질과산화는 세포 손상의 직접적인 원인이 된다. 그렇기 때문에 세포 내 지질과산화를 저해한다는 것은 세포 손상을 줄이고, 노화나 질병으로부터 보호할 수 있다는 의미가 된다. 커큐민-아지렐린 복합체의 지질과산화에 대한 실험 결과, 대조군에 비하여 커큐민-아지렐린을 100 μM 처리 시 지질과산화를 약 20% 이상 줄여주는 것을 확인하였다(도 6).

실시예 4. 커큐민-헥사펩타이드 복합체의 콜라겐 생합성 개선 확인

사람 피부를 구성하는 섬유아세포에서 분비되는 다양한 콜라겐은 노화 과정 및 주름형성과 밀접한 관련이 있다. 섬유아세포를 이용한 콜라겐 합성 정도를 통해 시험물질의 항주름 활성을 검증할 수 있다. 콜라겐의 합성 정도를 확인하기 위하여 인간섬유아세포(CCD986-SK) 배양 시 커큐민-펩타이드 복합체를 25 μM로 처리하여 세포 내 콜라겐의 생성 증가 정도를 비교 시험하는 방법으로 Procollagen type I C-peptide EIA 키트(Precoated, Takara Biomedical Co)를 사용하여 측정하였다. 주름개선 생리활성에 대한 양성 대조군으로 한국식품의약품안전청(KFDA)으로부터 주름개선 기능성으로 인증받은 레티놀을 사용하여 레티놀 보다 30% 이상의 콜라겐 생합성 촉진 효과가 있는지 여부를 평가하였다.

커큐민-아지렐린 복합체의 콜라겐 생합성을 ELISA 키트로 측정한 결과, 커큐민-아지렐린 복합체의 경우 대조군 대비 약 30% 이상 콜라겐 생합성을 촉진함을 확인하였다(도 7).

실시예 5. 커큐민 - 헥사펩타이드 복합체를 함유하는 화장료 조성물의 효능 평가

상기의 실험들로 피부생리 활성이 확인된 커큐민-아지렐린 복합체를 함유하는 조성물의 효능을 확인하기 위하여 일반적으로 많이 사용되는 화장품 제형인 화장수(표 3), 로션(표 4), 크림(표 5) 및 에센스(표 6)의 제형에 커큐민-아지렐린 복합체를 0.5% (5g/kg) 적용하여 화장품들을 제조하였다. 각 제형의 제조 방법은 다음과 같았다. 화장수를 제조하기 위하여, 표 1의 성분 11번에 2, 3, 4 및 8번을 순서대로 투입하고 교반하여 용해시켰다(용해물 1). 5번을 60℃ 정도로 가열하여 용해시킨 후, 여기에 10번을 투입하여 용해시켰다(용해물 2). 상기 용해물 2를 용해물 1에 투입하였다. 마지막으로 1, 6, 7 및 9번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시켰다.

로션을 제조하기 위하여, 표 2의 성분 10, 11, 13 및 16번을 혼합 교반하면서 80-85℃에서 가열하여 제조부에 투입한 후 유화시키고, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 12번을 80-85℃에서 가열 용해한 후 투입시켜 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번을 투입하고, 45℃까지 냉각한 뒤 14번을 투입하고, 35℃에서 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

크림을 제조하기 위하여, 표 3의 성분 12, 13, 14 및 16번을 혼합 교반하면서 80-85℃에서 가열하여 제조부에 투입한 후 유화시키고, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11번을 80-85℃에서 가열하여 용해한 후 15번을 투입하고 교반한 다음, 그 결과물을 제조부에 투입하고 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고, 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

에센스를 제조하기 위하여, 표 4의 성분 2, 3, 4, 5 및 6번을 일정한 온도에서 균질화하여, 비이온계 양친매성 지질을 얻었다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 1, 7, 8 및 14번을 혼합하고, 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루이다이져를 통과시키고, 이어 9번을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루이다이져에 재차 통과시켰다. 그리고, 10, 11, 12 및 13번을 투입하여 분산시켜 안정화시키고 숙성시켰다.

제조된 조성물들을 가지고 인체 피부 적용 시 주름개선 효과를 시험하기 위하여 50세 이상의 건강한 성인 남녀 16명을 대상으로 14일간 커큐민-아지렐린 복합체 2종을 함유하는 조성물들과 대조군으로 함유하지 않은 조성물들을 1일 2회 1g (혹은 ㎖) 씩 눈가 주름에 바르는 방법으로 시험하였다. 14일간 도포 후 개선 효과는 눈가 주름의 개선 정도에 대한 만족도 조사를 통해 매우 효과, 약간 효과, 무 효과 및 주름 악화의 4단계로 수치화 하였다.

번호	원료	함량(중량 %)
1	커큐민-아지렐린 복합체	0.5%
2	글리세린	3.0%
3	부틸렌 글리콜	2.0%
4	프로필렌 글리콜	2.0%
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0%
6	에탄올	10.0%
7	트리에탄올아민	0.1%
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향로	미량
11	정제수	up to 100%

번호	원료	함량(중량 %)
1	커큐민-아지렐린 복합체	0.5%
2	밀납	1.0%
3	폴리솔베이트 60	1.5%
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5%
5	유동 파라핀	10.0%
6	소르비탄 스테아레이트	1.0%
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5%
8	스테아린산	1.5%
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0%
10	프로필렌글리콜	3.0%
11	카르복시폴리머	0.1%
12	트리에탄올아민	0.2%
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향로	미량
16	정제수	up to 100%

번호	원료	함량(중량 %)
1	커큐민-아지렐린 복합체	0.5%
2	스테아린산	2.0%
3	세틸알콜	2.0%
4	글리세릴모노스테아레이트	2.0%
5	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	0.5%
6	솔비탄세스퀴올레이트	0.5%
7	글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0%
8	왁스	1.0%
9	유동파라핀	4.0%
10	스쿠알란	4.0%
11	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0%
12	카르복시비닐폴리머	0.3%
13	부틸렌글리콜	5.0%
14	글리세린	3.0%
15	트리에탈올아민	0.5%
16	정제수	up to 100%

번호	원료	함량(중량 %)
1	커큐민-아지렐린 복합체	0.5%
2	시토 스테롤	1.7%
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.5%
4	세라마이드	0.7%
5	스테아레스-4	1.2%
6	콜레스테롤	1.5%
7	디세틸포스페이트	0.4%
8	농글리세린	5.0%
9	마카다미아 오일	15.0%
10	카르복시비닐폴리머	0.2%
11	산탄검	0.2%
12	방부제	미량
13	향료	미량
14	정제수	up to 100%

실험결과, 하기 표 7 내지 10에 나타난 바와 같이, 커큐민-아지렐린 복합체가 들어 있는 조성물의 사용군들에서 높은 주름 개선효과를 확인할 수 있었다. 구체적으로, 대조군으로 사용된 조성물에서는 주목할 만한 주름 개선효과가 나타나지 않은 반면, 커큐민-아지렐린 복합체를 0.5% 함유하는 조성물들에서는 일관되게 주름개선에 대한 효과가 나타났다. 특히, 크림과 에센스 제형에서는 매우 효과라고 응답한 비율이 전체 사용의 50%를 넘었다(표 7 내지 10).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> AnyGen Co., Ltd. BIO FD&C Co., Ltd. <120> Compositions comprising curcumin-hexapeptide complexes <130> PN130219 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hexapeptide <400> 1 Glu Glu Met Gln Arg Arg 1 5

Claims (6)

1. 커큐민; 및 상기 커큐민과 링커 화합물을 통하여 N-말단이 결합된 서열목록 제1서열의 헥사펩타이드를 포함하고, 상기 헥사펩타이드의 C-말단은 아세트아마이드인 것을 특징으로 하는 커큐민-헥사펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부상태(skin conditions) 개선용 화장료 조성물로서 상기 피부상태 개선은 피부 주름 개선 또는 피부 탄력 개선인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 링커 화합물은 글루타레이트(glutarate)인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 링커 화합물은 커큐민과 에스터 결합하고, 헥사펩타이드의 N-말단과는 펩타이드 결합하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 크림, 로션, 세럼 및 에센스로 구성된 군으로부터 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
6. 삭제

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