KR101618948B1 - Diagnosis method of meat quality using allele specific-PCR in Korean cattle - Google Patents

Abstract

본 발명은 대립유전자 특이적 피씨알 기법을 이용한 한우육 성숙도 진단 방법에 관한 것으로서, 육질 형질이 우수한 한우의 유전적 자질을 예측하고 판정하는 유전자 마커를 개발하여 조기 선발 및 개체 평가의 정확성을 제고하는 데 활용 가능한 유전자 진단 방법을 제공하기 위한 것이다. 이에 본 발명에서는 ADRB3 유전자를 한우 육질형질 관련 후보유전자로 선정하고, ADRB3 유전자의 특정 SNP를 이용한 allele specific-PCR 분석 및 육질형질과의 연관성 통계 분석을 통해 유전적으로 성숙도가 우수한 한우 진단 및 선발에 활용할 수 있는 DNA 분자표지를 개발하였다.
더욱 상세하게는, 한우의 혈액으로부터 genomic DNA를 분리하고, ADRB3 유전자의 intron 1번 영역 내 위치하는 특정 SNP를 포함하는 총 4가지의 primer를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, 증폭산물을(PCR product)을 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동하여 각 유전자형별 DNA marker를 결정한 후, 한우 육질형질과의 연관성 통계분석을 통해 성숙도와 밀접하게 관련되어 있는 DNA marker를 발굴함으로써 이를 이용하여 유전적으로 육질이 우수한 한우를 진단하고 판정할 수 있는 방법을 제공한다.The present invention relates to a method for diagnosing the maturity of Korean beef cattle using the allele-specific PCA technique, in which genetic markers for predicting and determining the genetic qualities of Korean beef cattle having excellent meat quality are developed to improve the accuracy of early selection and individual evaluation And to provide an available method for genetic diagnosis. In the present invention, the ADRB3 gene is selected as a candidate gene related to the Korean native cattle trait, and the allele specific-PCR analysis using the specific SNP of the ADRB3 gene and the statistical analysis of the correlation with the meat quality trait are utilized for diagnosis and screening of highly genetically- DNA molecule markers.
More specifically, the genomic DNA was isolated from the blood of Korean cattle, and amplified by PCR using four primers including a specific SNP located in the intron 1 region of the ADRB3 gene. The PCR products ) Were electrophoresed on agarose gel to determine the DNA markers of each genotype. The DNA markers closely related to maturity were obtained through a statistical analysis of the association with the Hanwoo meat quality traits, This method provides a method to diagnose and judge excellent Hanwoo.

Description

대립유전자 특이적 중합효소 연쇄반응 기법을 이용한 한우 육질 진단 방법 {Diagnosis method of meat quality using allele specific-PCR in Korean cattle}[0001] The present invention relates to an allele-specific polymerase chain reaction (PCR)

본 발명은 분자유전학적 분석기법인 allele specific-PCR 분석 기법을 이용하여 한우의 ADRB3 (adrenoceptor beta 3) 유전자의 특정 단일염기다형(SNP)을 이용한 한우 성숙도 관련 유전자 마커를 개발함으로써, 이를 이용하여 유전적으로 육질이 우수한 한우를 조기에 진단할 수 있는 기술을 제공한다.The present invention uses a specific single nucleotide polymorphism (SNP) of the ADRB3 (adrenoceptor beta 3) gene of Korean beef cattle using the allele specific-PCR analysis technique, a molecular genetic analyzer method, Provides a technology that can diagnose early-stage Korean beef with superior meat quality.

최근 분자유전공학적 분석기술의 발달로 인해 DNA 분자수준에서 가축의 특정 형질과 밀접하게 연관되어 있는 후보유전자들의 특이적인 DNA 염기서열 변이에 따른 유전적 형질 진단용 분자표지 기술개발이 활발히 이루어지고 있다. 대표적으로 PCR 기술을 이용하는 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism), RAPD (random amplified polymorphic DNA) 및 SSCP (single strand conformation polymorphisms) 기법 등 다양한 DNA 분석기법을 이용하여 가축의 주요 경제형질과 관련된 분자표지를 이용한 조기 진단 및 선발 기술은 물론 다양한 산업 전반에 걸쳐 본 기술이 활용되고 있는 실정이다. Recent developments in molecular genetic engineering techniques have led to the development of molecular marking technology for the diagnosis of genetic traits based on specific DNA sequence variations of candidate genes closely related to specific traits of livestock at the DNA molecule level. A variety of DNA analysis techniques, including PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism), RAPD (random amplified polymorphic DNA) and SSCP (single strand conformation polymorphism) techniques, are used to represent molecular markers related to major economic traits of livestock This technology is utilized in various industries as well as early diagnosis and selection technology.

이와 같은 시대적 흐름에 발맞추어 최근에는 분자유전학적 기술을 이용한 한우 경제형질 관련 분자표지를 이용한 고능력 우량 한우 조기 진단 방법에 대한 기술들이 다양하게 개발되어 대한민국 특허청에 특허출원 및 등록되어 있다. 그 대표적인 예로, 한우의 근내지방도 연관 프라이머 및 그를 이용한 한우 근내지방도 성적 검사방법(출원번호 : 10-2000-0065925), 한우 근내지방도 연관 분자표지를 이용한 한우 육질진단 방법(특허등록번호: 10-1083213) 및 한우의 등지방두께 및 근내지방도 관련 분자표지인자 개발(특허등록번호: 10-0827544) 등과 같이 우량 한우 조기 진단 방법과 관련된 발명 기술들이 특허등록되어 있다.In line with this trend, in recent years, various techniques for early detection of high-performance Korean cattle using molecular markers related to Korean traits have been developed using molecular genetic techniques and have been filed and registered with the Korean Intellectual Property Office. As a representative example thereof, a method of inspecting a Korean beef cattle using primers related to an intramuscular fat of Korean beef cattle (Korean Patent Application No. 10-2000-0065925) ) And development of backbone thickness and intramuscular fat-related molecular markers (Korean Patent No. 10-0827544) of Korean beef cattle.

그러나, 상기에 제시한 기존의 발명들은 대부분 한우의 육질형질 가운데 근내지방도에 대한 유전적 잠재능력을 진단할 수 있는 기술에 매우 집중되어 있다는 문제가 있다. 현재 우리나라 한우 육질 등급 판정은 근내지방도만 판정하여 등급을 매기는 것이 아니라 그 밖에도 성숙도 및 조직감, 육색, 지방색 등의 다양한 항목에 대해 성적을 매겨 이들을 종합하여 육질등급을 판정한다. 따라서, 근내지방도 뿐 만 아니라 성숙도와 같은 다양한 육질형질에 대한 유전학적 조기 진단 방법 개발이 필요한 실정이다. 이에 본 발명에서는 간단한 DNA 검사를 통해 한우육 성숙도 형질의 유전적 자질을 진단하고 판정할 수 있는 방법을 제시한다.However, the above-mentioned existing inventions have a problem in that most of the meat quality traits of Korean beef cattle are highly concentrated on the technology capable of diagnosing the genetic potential for the intramuscular fatness. Currently, Hanwoo meat quality grading in Korea is not only graded by grading but also various grades such as maturity, texture, color, and local color. Therefore, it is necessary to develop a method for early diagnosis of various meat quality traits such as maturity as well as intramuscular fatness. Accordingly, the present invention provides a method for diagnosing and diagnosing the genetic qualities of Korean hamster maturity traits through a simple DNA test.

또한, 기술적 측면에서도 기존의 기술들은 대부분 특정 유전자의 증폭산물(PCR product)에 제한효소를 처리하여 해당 염기변이 부위의 차이에 따라 DNA 절편이 각각 다르게 나타나는 것을 이용한 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석기법을 이용하여 발명되어진 기술들이 주를 이루고 있다. 물론 이런 기술들도 재현성과 정확성이 뛰어나 유전자 검사에 매우 유용한 기술로 평가되고 있지만, PCR을 수행한 다음 제한효소를 다시 사용한다는 점에서 분석비용과 시간면에서 효율성이 다소 떨어지는 단점이 있다. 그에 반해, 본 발명에서는 제한효소 처리과정 없이 PCR 증폭 만으로 SNP 유전자형을 분석할 수 있는 allele specific-PCR 기법을 이용하기 때문에 기존의 발명 기술에 비해 비용과 시간을 절감할 수 있는 장점이 있다.In addition, from the technical point of view, PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) using restriction enzymes in PCR products of specific genes and different DNA fragments according to the difference of base mutation sites, Techniques that have been invented using analytical techniques have become mainstream. Although these techniques are highly reproducible and accurate, they are considered to be very useful for genetic testing, but they have a disadvantage in that their efficiency and cost are somewhat deteriorated in that PCR is performed and restriction enzyme is used again. On the other hand, in the present invention, allele specific-PCR technique capable of analyzing SNP genotypes by PCR amplification without restriction enzyme treatment is used, which is advantageous in that cost and time can be saved as compared with the conventional technology.

최근 한미 FTA 협상 발효 및 한 EU 간 FTA 타결 등 쇠고기 수입개방에 대응한 국내 한우 사육농가의 보호 및 발전을 위해서는 한우육의 육질 고급화를 통한 수입육과의 차별화로 품질경쟁력을 높이는 전략이 필요하다. 이를 위해서는 최적의 사육 환경 조성도 중요하겠지만, 근본적으로 육질형질에 대한 유전적 자질이 우수한 한우를 조기에 진단하여 선발하는 최첨단 분자육종기술 개발이 필요하다. 이를 통해 품질 좋고 경제성 높은 고능력 고품질 한우를 생산함으로써 소비자들에게 안전하고, 맛 좋은 고급육 한우를 보다 저렴한 가격에 제공할 수 있을 것이다. In order to protect and develop domestic Hanwoo farming households responding to the recent opening of Korea-US FTA negotiations and opening an FTA with Korea, it is necessary to develop a strategy to enhance quality competitiveness by differentiating imported Hanwoo meat from imported meat. For this purpose, it is important to develop an advanced breeding environment, but it is necessary to develop a cutting-edge molecular breeding technique that early diagnoses and selects Korean beef, which is basically excellent in genetic qualities for meat quality traits. By producing high - quality, high - quality Korean beef with high quality and economy, it will be possible to provide safe, delicious, high - quality Korean beef at lower prices to consumers.

현재 우리나라 축산물 등급판정은 한우 육질등급 판정의 경우 근내지방도(marbling), 육색, 지방색, 조직감 및 성숙도 등의 도체성적 항목을 이용하여 1++, 1+, 1, 2, 3 등급으로 육질등급을 판정하고 있는데 이들 항목 중에서 성숙도는 소도체 골격의 골화정도를 측정하여 골격의 특성을 판정하는 항목으로서 육질등급을 결정하는데 영향을 미치는 요인 중 하나이다. 따라서, 한우의 육질 고급화를 통한 품질경쟁력을 높이려면 유전적으로 성숙도가 우수한 개체를 조기에 진단하고 선발하여 최적의 환경에서 사육 관리하는 것이 중요하다. At present, Korean livestock grade grades are graded 1+, 1+, 1, 2, and 3 grades using the carcass grades such as marbling, meat color, local color, texture and maturity Among these items, maturity is one of the factors that determine the skeletal characteristics by measuring the degree of ossification of the small conductor skeleton, which is one of factors affecting the determination of the meat quality grade. Therefore, in order to improve the quality competitiveness through quality upgrading of Korean beef cattle, it is important to diagnose and select genetically superior individuals at an early stage and to manage them in an optimal environment.

가축의 육종개량에 있어 종래의 양적 유전학적 방법은 가축의 표현형적 기록에 의존해왔다. 즉, 후보종모우는 혈통기록과 체형 발달 등의 당대 기록으로 우선 선발하고 빈우와의 교배에 의해 생산되는 후대 검정우를 사육, 도축하여 도체 및 육질형질들을 기록하고 가축이 사육되어진 환경 요인들을 최대한 배제하면서 가축의 진정한 육종가를 추정해 내기 위한 가장 적절한 통계 모델식을 고안하여 종축을 선발하게 되는데 이러한 표현형적 관찰치를 측정하는 데는 많은 시간이 소요되므로 종축의 선발을 지연하게 되어 세대 간격이 길어지고 많은 두수의 후보 종축을 사육하게 되므로 사료비, 시설투자비 및 유지비, 인건비 등의 경제적 비용과 과도한 노동력이 소요된다. 이와 같이 종래의 전통적인 양적 유전학적 방법만으로 높은 개량 효과를 기대하기에는 어느 정도 한계가 있기 때문에 최근에는 MAS (marker assisted selection)를 이용한 첨단 육종 방법이 각광받고 있다. MAS 방법은 가축이 도축 되기 이전에 유전자 검사 즉 DNA marker 분석을 통하여 육질 및 육량 등 특정 형질이 우수한 개체를 조기에 진단하고 선발할 수 있는 방법으로서 과거 전통적인 육종방법에 추가하여 본 기술을 이용할 경우 개량의 속도를 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 더 높은 개량효율을 기대할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 한우의 육질형질과 밀접하게 연관되어 있는 유전자의 분자표지를 탐색하여 이를 이용한 고급육 생산 한우 조기 진단 및 선발에 활용할 수 있는 기술을 개발하고자 수행하였다.Conventional quantitative genetic methods for improving breeding of livestock have relied on phenotypic records of livestock. In other words, the candidates were selected for the first time, such as pedigree record and body development, and the next black sheep produced by mating with the birds was reared and slaughtered to record the carcass and meat quality traits, In order to estimate the true breeding price of livestock, the most suitable statistical model formula is devised to select the breed axis. It takes a long time to measure these phenotypic observations, The cost of labor, such as feed costs, facility investment and maintenance costs, labor costs, and excessive labor are required. Recently, there has been a growing interest in advanced breeding methods using MAS (marker assisted selection) because there is a limit to expect a high improvement effect only by the conventional conventional quantitative genetic methods. The MAS method is a method for early diagnosis and selection of individuals with excellent traits such as meat quality and meat quality through genetic testing or DNA marker analysis before slaughtering livestock. In addition to the conventional breeding methods, It is possible to expect a higher improvement efficiency. Therefore, in the present invention, the inventors have searched for molecular markers closely related to the meat quality of Korean beef cattle, and developed a technique for early diagnosis and selection of high-yielded beef cattle using the same.

본 발명자들은 소의 27번 염색체에 존재하는 ADRB3 (adrenoceptor beta 3) 유전자를 한우의 육질형질 관련 후보유전자로 선정하여 한우 성숙도와 밀접하게 연관되어 있는 유전자 마커를 개발하고 이를 이용한 고급육 생산 한우 진단 방법을 발명하였다. 본 발명에서 이용한 ADRB3 유전자는 지방 합성에 관여하는 유전자로서 기존의 연구에 의하면 육우의 육질형질과 밀접하게 연관되어 있는 것으로 보고되어 있다. 따라서 본 발명에서는 ADRB3 유전자를 한우 육질형질 관련 후보유전자로 선정하고, ADRB3 유전자의 특정 SNP를 이용한 allele specific-PCR 분석 및 육질형질과의 연관성 통계 분석을 통해 유전적으로 성숙도가 우수한 한우 진단 및 선발에 활용할 수 있는 DNA 분자표지를 개발하였다.The present inventors selected ADRB3 (adrenoceptor beta 3) gene located on the chromosome 27 of cattle as a candidate gene for the maturation of Korean cattle and developed a genetic marker closely related to the maturity of Korean cattle, Respectively. The ADRB3 gene used in the present invention is a gene involved in lipogenesis and has been reported to be closely related to the meat quality of beef cattle according to existing studies. Therefore, in the present invention, the ADRB3 gene is selected as the candidate gene related to the Korean native cattle trait, and the allele specific-PCR analysis using the specific SNP of the ADRB3 gene and the statistical analysis of the correlation with the meat quality trait are utilized for diagnosis and selection of genetically- DNA molecule markers.

더욱 상세하게는, 한우의 혈액으로부터 genomic DNA를 분리하고, ADRB3 유전자의 intron 1번 영역 내 위치하는 특정 SNP를 포함하는 총 4가지의 primer를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, 증폭산물을(PCR product)을 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동하여 각 유전자형별 DNA marker를 결정한 후, 한우 육질형질과의 연관성 통계분석을 통해 성숙도와 밀접하게 관련되어 있는 DNA marker를 발굴함으로써 이를 이용하여 유전적으로 육질이 우수한 한우 진단 방법을 제공한다.More specifically, the genomic DNA was isolated from the blood of Korean cattle, and amplified by PCR using four primers including a specific SNP located in the intron 1 region of the ADRB3 gene. The PCR products ) Were electrophoresed on agarose gel to determine the DNA markers of each genotype. The DNA markers closely related to maturity were obtained through a statistical analysis of the association with the Hanwoo meat quality traits, This provides excellent diagnostic methods for Hanwoo.

한우 ADRB3 유전자 intron 1번 영역의 증폭영역 내 321번째 T↔C 염기치환으로 인한 DNA 유전자형 마커(TT, TC 및 CC형)를 이용하여 한우 성숙도에 대한 각 개체의 육질 특성을 규명할 수 있으며 이를 바탕으로 고능력 한우의 조기 진단 및 선발과 유용 유전자원의 산업적 활용이 가능하다. 즉, 한우 ADRB3 유전자의 특정 SNP 유전자형을 보유하고 있는 개체를 조기에 진단하고 선발 육종하여 한우 육종개량사업의 효율성과 개량성과를 극대화하고 동시에 우리나라 고유의 한우 유전자원을 보다 우수하게 개량하고 보존하는 효과를 얻을 수 있다.Using the DNA genotypic markers (TT, TC and CC type) due to the 321st T↔C base substitution in the amplification region of the ADRB3 gene intron 1 region of Korean beef cattle, , It is possible to conduct early diagnosis and selection of high - ability Korean beef cattle and to utilize useful genetic resources industrially. That is, it is possible to maximize the efficiency and improvement performance of Hanwoo breeding improvement project and to improve and preserve Korea's own Hanwoo genetic resources better by early diagnosing and selecting and breeding individuals having specific SNP genotype of Hanwoo ADRB3 gene Can be obtained.

또한, 본 발명은 한우의 genomic DNA를 대상으로 allele specific-PCR 분석 방법을 이용하는 최첨단 분자육종 기술로서 본 발명에서 이용한 allele specific-PCR 분석 기법은 신속하고 간편하며 정확성이 높아 선발의 효율성과 실용성을 극대화 할 수 있을 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 DNA marker 유전자형을 보다 간편하고 정확하게 판정할 수 있는 장점이 있다.  In addition, the present invention is a state-of-the-art molecular breeding technique using allele specific-PCR analysis method for genomic DNA of Hanwoo, and the allele specific-PCR analysis technique used in the present invention is quick, simple and highly accurate, thereby maximizing selection efficiency and practicality DNA marker genotypes can be easily and accurately judged on a large number of samples.

도면 1은 본 발명에서 allele specific-PCR 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 ADRB3 유전자 증폭 영역 내 321번째 T↔C 단일염기다형(SNP)으로 인한 각 개체의 SNP 유전자형별 DNA marker 전기영동 사진
도면 2는 본 발명에서 allele specific-PCR 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 ADRB3 유전자 증폭 영역 내 321번째 T↔C 단일염기다형(SNP)에 대한 각 SNP 유전자형별 DNA marker의 염기서열 분석 크로마토그램FIG. 1 shows the DNA marker electrophoresis of SNP genotypes of each individual due to the 321st T↔C single nucleotide polymorphism (SNP) in the amplified region of the ADRB3 gene in SEQ ID NO: 1 detected by the allele specific-PCR analysis technique in the present invention
2 is a nucleotide sequence analysis chromatogram of the DNA marker of each SNP genotype for the 321st T↔C single nucleotide polymorphism (SNP) in the amplified region of the ADRB3 gene in SEQ ID NO: 1 detected by the allele specific-PCR analysis technique in the present invention

상기에 제시한 목적을 달성하기 위하여 이하 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
In order to achieve the above objects, the present invention will be described in more detail with reference to the following non-limiting examples.

실시 예 1 : 한우 ADRB3 유전자의 Example 1: Generation of the Korean Adult ADRB3 gene SNPSNP 유전자형 검출 Genotype detection

1. 공시재료 및 DNA 분리 정제1. Disclosure material and DNA separation purification

본 발명에 사용한 한우는 혈통기록과 도체성적을 보유하고 있는 농가현장 검증 한우 집단 총 300두를 공시축으로 선정하였다. 각 공시축 혈액으로부터의 genomic DNA의 분리 및 정제는 Miller등(1988)의 방법을 일부 변경하여 분리 정제하였으며 스펙트로포토메타(spectrophotometer)를 이용하여 DNA 농도를 측정한 후 TE buffer (10mM Tris-HCl, pH 7.4; 1mM EDTA)에 용해하여 -20℃ 냉동고에 보존하고 공시재료로 사용하였다.In the present invention, a total of 300 Hanwoo farms with bloodline records and conductance scores were selected as the public axes. Genomic DNA was separated and purified from each test tube by the method of Miller et al. (1988). The DNA concentration was measured using a spectrophotometer, and then TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1 mM EDTA) and stored in a -20 ° C freezer to be used as a reference material.

2. Allele specific PCR 기법을 이용한 한우 ADRB3 유전자 PCR 증폭2. Allele specific PCR-based PCR amplification of Hanwoo ADRB3 gene

한우 ADRB3 유전자의 intron 1번 영역에 존재하는 특정 SNP에 대한 각 한우 개체별 SNP 유전자형 마커 검출을 위해 allele specific-PCR 분석을 수행하였다. 본 발명에서 이용한 한우 ADRB3 유전자의 SNP 위치는 미국립생물학정보센터 유전자은행(NCBI GenBank)에 보고되어 있는 bovine genome 등록번호 NC_007328.4호의 1,647번째 T↔C 염기치환에 의한 SNP로서 본 발명에서 제시한 서열번호 1의 321번째 염기와 동일하다.Allele specific-PCR analysis was performed to detect the SNP genotype markers of each Hanwoo on specific SNPs in intron 1 of Hanwoo ADRB3 gene. The SNP position of the Hanwoo ADRB3 gene used in the present invention is the SNP of the 1,647th T↔C base substitution in the bovine genome registration number NC_007328.4 reported in NCBI GenBank of the National Center for Biological Information, 1 < / RTI >

상기에 제시한 한우 ADRB3 유전자의 SNP에 대한 allele specific-PCR 분석을 수행하기 위해 본 발명에서는 표-1에 제시한 서열번호 2, 3, 4 및 5의 총 4가지 primer를 모두 이용하여 GeneAmp system 9700 PCR 증폭장치로 PCR 증폭반응을 수행하였다. In order to perform the allele specific-PCR analysis of SNPs of the Hanwoo ADRB3 gene described above, all four primers of SEQ ID NOS: 2, 3, 4 and 5 shown in Table 1 were used, and GeneAmp system 9700 PCR amplification was performed using a PCR amplification apparatus.

한우 ADRB3 유전자의 allele specific-PCR 분석을 위한 primer 염기서열Primer sequences for allele specific-PCR analysis of the ADRB3 gene in Hanwoo 유전자명Gene name SNP 영역SNP region Primer 염기서열(5'-3')Primer sequence (5'-3 ') 서열번호SEQ ID NO: ADRB3ADRB3 intron 1intron 1 Outer F-AGGAAGCTTTCTGTATCTCCGCOuter F-AGGAAGCTTTCTGTATCTCCGC 22 Outer R-AAGGTTCCGGATCAATGGAGOuter R-AAGGTTCCGGATCAATGGAG 33 Inner F-TTTGCTAGCTTAGTTCTTTCTCTACInner F-TTTGCTAGCTTAGTTCTTTCTCTAC 44 Inner R-GCGAGATGGTAAGAAATTTGTAInner R-GCGAGATGGTAAGAAATTTGTA 55

Allele specific-PCR 분석을 위한 PCR 증폭 반응액 조성은 0.2 ml 튜브에 genomic DNA 50 ng, primer 각 0.1 μM(서열번호 2~5번까지의 primer 모두 사용), dNTP 각 250 μM, 10X PCR buffer 2㎕, 그리고 Taq DNA 중합효소 1 unit 을 첨가하여 PCR 반응액을 총 30 ㎕로 조정하였다. PCR 반응조건은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 후 94℃에서 30초, 57℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초간의 사이클을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하여 DNA 증폭과정을 종료하였다.For PCR analysis, 50 μl of genomic DNA, 0.1 μM of each primer (using all primers of SEQ ID NOS: 2 to 5), 250 μM of each dNTP, 2 μl of 10 × PCR buffer , And 1 unit of Taq DNA polymerase was added to adjust the total amount of PCR reaction solution to 30 μl. The PCR reaction conditions were preliminary heating at 94 ° C for 5 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 57 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds, and finally heating at 72 ° C for 5 minutes to amplify DNA The process was terminated.

3. 전기영동을 통한 한우 ADRB3 유전자의 SNP 유전자형 분석 및 판독3. SNP genotyping and analysis of Hanwoo ADRB3 gene by electrophoresis

Allele specific-PCR을 통한 한우 ADRB3 유전자의 SNP(서열번호 1의 321번째 T↔C 염기치환) 유전자형 분석을 위해 2% agarose gel에 100 V의 전압으로 약 2시간 동안 전기영동하여 각 한우 개체별 DNA marker를 검출하고 각각의 SNP 유전자형을 판독하였다. 전기영동 결과, TT 유전자형을 가진 개체들은 760 및 342 bp의 DNA 단편이 검출되었다. 즉, PCR 증폭과정에서 서열번호 2번(outer F)과 서열번호 3번(outer R) primer가 함께 작용하여 760 bp의 DNA 단편이 검출되었으며, 서열번호 2번(outer F)과 서열번호 5번(inner R) primer가 함께 작용하여 342 bp의 DNA 단편이 검출되었다. 한편 CC 유전자형을 가진 개체들의 경우 760 및 464 bp의 DNA 단편이 검출되었다. 즉, PCR 증폭과정에서 서열번호 2번(outer F)과 서열번호 3번(outer R) primer가 함께 작용하여 760 bp의 DNA 단편이 검출되었으며, 서열번호 4번(inner F)과 서열번호 3번(Outer R) primer가 함께 작용하여 464 bp의 DNA 단편이 검출되었다. 마지막으로 TC 유전자형을 가진 개체들의 경우 서열번호 2~5까지의 총 4개 primer가 모두 함께 작용하여 760, 464 및 342 bp의 DNA 단편이 모두 검출되었다.For SNP analysis (321st T↔C base substitution in SEQ ID NO: 1) of Hanwoo ADRB3 gene through Allele specific-PCR, electrophoresis was performed for 2 hours at a voltage of 100 V on 2% agarose gel, and SNP genotypes were detected. As a result of electrophoresis, 760 and 342 bp DNA fragments were detected in TT genotypes. That is, in the PCR amplification process, a DNA fragment of 760 bp was detected by the combination of the outer F and the outer R primers, and the DNA fragment of SEQ ID NO: 2 (outer F) and SEQ ID NO: 5 (inner R) primer were working together to detect a 342 bp DNA fragment. On the other hand, 760 and 464 bp DNA fragments were detected in individuals with CC genotype. That is, in the PCR amplification process, a DNA fragment of 760 bp was detected by the combination of the outer F and the outer R primers, and the DNA fragment of SEQ ID NO: 4 and the DNA of SEQ ID NO: 3 (Outer R) primer were working together to detect a 464 bp DNA fragment. Finally, in the case of individuals with the TC genotype, a total of 4 primers of SEQ ID NOS: 2 to 5 all worked together to detect 760, 464 and 342 bp DNA fragments.

이상과 같은 방법으로 한우 검정 집단 총 300두를 대상으로 분석한 ADRB3 유전자 서열번호 1의 321번째 SNP 대립유전자 출현빈도와 유전자형 출현율을 분석한 결과 대립유전자 출현빈도는 T 대립유전자가 약 46.5%, C 대립유전자가 약 53.5%로 C 대립유전자 출현빈도가 T 대립유전자에 비해 높게 나타났으며, SNP marker 유전자형 출현빈도는 TT형 29.7%(89두), TC형 33.7%(101두), 그리고 CC형이 36.6%(110두)로서 CC 유전자형이 가장 높고, TT 유전자형의 출현빈도가 가장 낮은 것으로 분석되었다.
As a result of analyzing the frequencies of 321nd SNP alleles and genotypes of ADRB3 gene of SEQ ID NO: 1 analyzed in 300 Hanwoo test groups, the allele frequency of T allele was about 46.5%, C The genotype frequencies of SNP markers were 29.7% (89 cases) in TT type, 33.7% (101 cases) in TC type and 101.7 cases in CC type. The frequency of C allele was higher than that of T allele And 36.6% (110 pairs), respectively, and CC genotype was the highest and frequency of occurrence of TT genotype was lowest.

실시 예 2. 한우 Example 2. Hanwoo ADRB3ADRB3 유전자의  Gene SNPSNP 유전자형과  Genotype and 육질형질과의Fleshy 연관성 통계 분석 Association statistical analysis

본 발명을 통해 검출된 한우 ADRB3 유전자의 SNP 유전자형이 한우 육질형질에 미치는 효과를 추정하기 위해 SASⓐ9.1 Package/PC 프로그램을 이용하여 PROC GLM 법으로 통계 처리하였으며, 이들 중 유전자형 효과의 유의성이 인정된 형질에 대해 던칸 다중검정(Duncan′s Multiple Range Test; DMRT) 방법으로 각 유전자형의 최소자승평균치간의 차이에 의한 유의성 검정을 실시하였다.In order to estimate the effect of the SNP genotype of the Hanwoo ADRB3 gene detected by the present invention on the Hanwoo meat quality trait, statistical analysis was performed using the PROC GLM method using the SAS a9.1 Package / PC program. The significance test was performed by the Duncan's Multiple Range Test (DMRT) method on the difference between the least squares mean of each genotype.

그 결과 한우 ADRB3 유전자의 intron 1번 영역 내 T↔C 염기치환에 의한 SNP 부위(서열번호 1의 321번째)의 유전자형은 한우의 성숙도 형질과의 유의적 연관성이 입증되었다(P<0.05). 즉, 표 2에서 보는 바와 같이 성숙도에서 TC 유전자형을 가진 개체들이 TT 및 CC 유전자형을 가진 개체들에 비해 각각 0.708 및 0.732 정도 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 참고로, 성숙도는 소 도체의 흉추골, 요추골, 천추골 및 갈비뼈의 골화정도를 수치화하여 표기하는데 점수가 낮을수록 골화의 정도가 낮고 연골이 선명하여 더 높은 육질등급을 받을 수 있다. 따라서, 성숙도가 비교적 높은 TC 유전자형을 가진 개체들은 TT 및 CC 유전자형을 가진 개체들에 비해 유전적으로 육질형질이 열등할 것으로 예측할 수 있다.As a result, the genotype of the SNP region (No. 321 of SEQ ID NO: 1) due to T↔C base substitution in the intron 1 region of the Hanwoo ADRB3 gene was proved to be significantly related to the maturity trait of Hanwoo (P <0.05). As shown in Table 2, individuals with TC genotype in maturity were significantly higher than those with TT and CC genotype by 0.708 and 0.732, respectively (P <0.05). For reference, maturity is expressed by digitizing the degree of ossification of the thoracic, lumbar, sacral, and ribs of the small body. The lower the score, the lower the degree of ossification and the sharpness of the cartilage. Thus, individuals with a relatively high maturity TC genotype may be predicted to be genetically inferior in quality to those with TT and CC genotypes.

한우 ADRB3 유전자의 SNP 유전자형과 육질형질과의 연관성 분석 결과Analysis of association between SNP genotype and meat quality traits in the Hanwoo ADRB3 gene 도체형질Conductor trait ADRB3 SNP 유전자형 (서열번호 1의 321번째)The ADRB3 SNP genotype (SEQ ID NO: 1, 321) P-valueP-value TTTT TCTC CCCC 근내지방도/1-9Intramuscular fatigue / 1-9 5.876±0.1845.876 + 0.184 5.690±0.1735.690 + 0.173 5.818±0.1655.818 ± 0.165 0.7480.748 육색/1-7Meat / 1-7 4.898±0.0344.898 + 0.034 4.970±0.0324.970 + 0.032 4.945±0.0304.945 + 0.030 0.3090.309 지방색/1-7Local color / 1-7 3.000±0.0063.000 ± 0.006 3.000±0.0053.000 ± 0.005 2.990±0.0052.990 ± 0.005 0.4240.424 조직감/1-3Texture / 1-3 1.101±0.0321.101 + 0.032 1.130±0.0301.130 0.030 1.081±0.0291.081 + 0.029 0.5200.520 성숙도/1-3Maturity / 1-3 2.078±0.031^ab 2.078 ± 0.031 ^ab 2.786±0.029^a 2.786 + 0.029 ^a 2.054±0.028^b 2.054 + 0.028 ^b 0.0180.018

a,b : 서로 다른 부호간에는 유의차가 있음(P<0.05).
a, b: Significant difference between different codes (P <0.05).

이상의 본 발명에 대한 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 한우 ADRB3 유전자의 서열번호 1의 321번째 T↔C SNP 유전자형은 한우의 육질등급 판정에 있어 중요한 항목인 성숙도에 대한 유의적 연관성이 입증되어 본 SNP 마커를 이용하여 도축하기 이전에 유전자 검사를 수행함으로써 미리 성숙도 형질을 진단하고 예측할 수 있는 유전자 마커로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
As a result of the above results of the present invention, the 321st T↔C SNP genotype of SEQ ID NO: 1 of the Hanwoo ADRB3 gene of the present invention has a significant correlation with maturity, which is an important item in determining the meat quality of Hanwoo This SNP marker can be used as a genetic marker for predicting and predicting maturity traits by carrying out genetic testing before slaughtering.

도면 1에서, M: 100 bp DNA size marker; TT, TC, CC: 본 발명의 ADRB3 유전자 SNP에 의한 각각의 DNA marker 유전자형. 760, 464, 343 bp: DNA 단편의 크기
도면 2에서, TT, TC, CC : 본 발명의 ADRB3 유전자 SNP에 의한 염기서열 분석 크로마토그램에 대한 각각의 DNA marker 유전자형1, M: 100 bp DNA size marker; TT, TC, CC: Each DNA marker genotype by the ADRB3 gene SNP of the present invention. 760, 464, 343 bp: Size of DNA fragment
In FIG. 2, TT, TC, and CC: the DNA marker genotypes for the nucleotide sequence analysis chromatograms by the ADRB3 gene SNP of the present invention

<110> SANGJI UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Diagnosis method of meat quality using allele specific-PCR in Korean cattle <130> 2014-01 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 760 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> gene <222> (1)..(760) <223> Bovine ADRB3 gene, partial sequence <220> <221> intron <222> (1)..(760) <223> intron 1 <220> <221> variation <222> (321) <223> SNP: T>C <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <223> Outer forward primer binding site <220> <221> primer_bind <222> (321)..(342) <223> Inner reverse primer binding site <220> <221> primer_bind <222> (741)..(760) <223> Outer reverse primer binding site <220> <221> primer_bind <222> (297)..(321) <223> Inner forward primer binding site <400> 1 aggaagcttt ctgtatctcc gctggtcaat tttttttgag ttcggggttc gggaggagaa 60 gatggggctg aggagggtct ttgcaatcaa gagaaggggg gcacagagta gggaatcaaa 120 gtggaaccca gagccctttc ctttcccgtt tcctacccac cctgccaggg ctgggcgagg 180 ggggcggtgg aagcaaagga ggcggccggg tggttctcca gcccaggaac aacagtgcgc 240 ccgaaggtgc cgcggtgcgg agggcccccg gctcgaccgg tcagctctag ttttggtttg 300 ctagcttagt tctttctctg tccaaatttc ttaccatctc gcgggctggc tttgacttgc 360 cgagaagact agagggcaac cccccatccc ccaccccacc ccaccccacc cccgcgcccg 420 tccccaagcc ttcgggctta gttctggttt ctttgaaaag tctgatagcc ctgaaggtga 480 ggattcgctt ccggaatgaa ggctaggcgg gctgaggaag ctgtgagtgc aaattcttcc 540 ccagtagaag cgggtcgggt tggagttggg cttgggcttt atggctcggt ggatcccaga 600 ggggcttccc aaggtccctg accaacggcc cccccccacc cccaaccctc gttcccaccc 660 tttgccccct caccccaagg tactgttatc tccgtttttt cagggcttcc tgcggacttt 720 cttaggcctt gaagaaacaa ctccattgat ccggaacctt 760 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <223> Outer Foward primer <400> 2 aggaagcttt ctgtatctcc gc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> Outer Reverse primer <400> 3 aaggttccgg atcaatggag 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <223> Inner Forward primer <400> 4 tttgctagct tagttctttc tctac 25 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(22) <223> Inner Reverse primer <400> 5 gcgagatggt aagaaatttg ta 22 <110> SANGJI UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Diagnosis method of meat quality using allele specific-PCR in          Korean cattle <130> 2014-01 <160> 5 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 760 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> gene <222> (1). (760) <223> Bovine ADRB3 gene, partial sequence <220> <221> intron <222> (1). (760) <223> intron 1 <220> <221> variation <222> <223> SNP: T> C <220> <221> primer_bind <222> (1) (22) <223> Outer forward primer binding site <220> <221> primer_bind <222> (321). (342) <223> Inner reverse primer binding site <220> <221> primer_bind <222> (741). (760) <223> Outer reverse primer binding site <220> <221> primer_bind <222> (297). (321) <223> Inner forward primer binding site <400> 1 aggaagcttt ctgtatctcc gctggtcaat tttttttgag ttcggggttc gggaggagaa 60 gatggggctg aggagggtct ttgcaatcaa gagaaggggg gcacagagta gggaatcaaa 120 gtggaaccca gagccctttc ctttcccgtt tcctacccac cctgccaggg ctgggcgagg 180 ggggcggtgg aagcaaagga ggcggccggg tggttctcca gcccaggaac aacagtgcgc 240 ccgaaggtgc cgcggtgcgg agggcccccg gctcgaccgg tcagctctag ttttggtttg 300 ctagcttagt tctttctctg tccaaatttc ttaccatctc gcgggctggc tttgacttgc 360 cgagaagact agagggcaac cccccatccc ccaccccacc ccaccccacc cccgcgcccg 420 tccccaagcc ttcgggctta gttctggttt ctttgaaaag tctgatagcc ctgaaggtga 480 ggattcgctt ccggaatgaa ggctaggcgg gctgaggaag ctgtgagtgc aaattcttcc 540 ccagtagaag cgggtcgggt tggagttggg cttgggcttt atggctcggt ggatcccaga 600 ggggcttccc aaggtccctg accaacggcc cccccccacc cccaaccctc gttcccaccc 660 tttgccccct caccccaagg tactgttatc tccgtttttt cagggcttcc tgcggacttt 720 cttaggcctt gaagaaacaa ctccattgat ccggaacctt 760 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> primer_bind <222> (1) (22) <223> Outer Foward primer <400> 2 aggaagcttt ctgtatctcc gc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> primer_bind <222> (1) <223> Outer Reverse primer <400> 3 aaggttccgg atcaatggag 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> primer_bind <222> (1) <223> Inner Forward primer <400> 4 tttgctagct tagttctttc tctac 25 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> primer_bind <222> (1) (22) <223> Inner Reverse primer <400> 5 gcgagatggt aagaaatttg ta 22

Claims (3)

유전적으로 성숙도가 높은 한우 개체를 예측하고 판정하기 위해 한우의 ADRB3 (Microsomal triglyceride transfer protein) 유전자를 대상으로 서열번호 2, 3, 4 및 5의 프라이머(primer)를 모두 이용하는 allele specific-PCR 분석기법을 통해 서열번호 1의 321번째 T↔C 염기치환에 의한 각 한우 개체별 SNP 유전자형 마커(DNA marker)를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형(TT, TC 및 CC)을 판독하여 유전적으로 성숙도가 높은 한우를 미리 예측하고 판정하는 것을 특징으로 하는 allele specific-PCR(대립유전자 특이적 중합효소연쇄반응) 기법을 이용한 한우 육질 진단 방법In order to predict and determine highly genetically mature Hanwoo individuals, the allele specific-PCR analysis technique using all of the primers of SEQ ID NOS: 2, 3, 4 and 5 against the ADRB3 gene of Hanwoo (microsomal triglyceride transfer protein) (TT, TC, and CC) of the individual SNP genotypic markers (DNA markers) of each Hanwoo by the 321st T↔C base substitution of SEQ ID NO: 1 were detected and genetically matured Hanwoo A method for diagnosing Korean beef cattle meat using allele specific-PCR (allele-specific polymerase chain reaction) 청구항 1에 있어서,
5'에서 3' 방향으로 AGGAAGCTTTCTGTATCTCCGC의 염기서열로 구성된 서열번호 2의 outer 정방향 프라이머(Forward primer)와 5'에서 3' 방향으로 AAGGTTCCGGATCAATGGAG의 염기서열로 구성된 서열번호 3의 outer 역방향 프라이머(Reverse primer), 그리고 5'에서 3' 방향으로 TTTGCTAGCTTAGTTCTTTCTCTAC의 염기서열로 구성된 서열번호 4의 inner 정방향 프라이머와 5'에서 3' 방향으로 GCGAGATGGTAAGAAATTTGTA의 염기서열로 구성된 서열번호 5의 inner 역방향 프라이머를 모두 이용하여 한우 ADRB3 유전자를 PCR 증폭하는 것을 특징으로 하는 allele specific-PCR 기법을 이용한 한우 육질 진단 방법The method according to claim 1,
An outer reverse primer of SEQ ID NO: 3 consisting of the outer forward primer of SEQ ID NO: 2 consisting of the base sequence of AGGAAGCTTTCTGTATCTCCGC in the 5 'to 3' direction and the base sequence of AAGGTTCCGGATCAATGGAG in the 5 'to 3' direction, And the inner reverse primer of SEQ ID NO: 4 composed of the nucleotide sequence of TTTGCTAGCTTAGTTCTTTCTCTAC in the 5 'to 3' direction and the inner reverse primer of SEQ ID NO: 5 composed of the nucleotide sequence of GCGAGATGGTAAGAAATTTGTA in the 5 'to 3' direction, PCR-amplified allele specific-PCR technique 청구항 1에 있어서,
Allele specific-PCR 분석을 통해 검출된 한우 ADRB3 유전자의 세 가지 유전자 마커(DNA marker) 유전자형(TT, TC 및 CC) 가운데 TC 유전자형을 나타내는 한우개체를 TT 및 CC 유전자형을 나타내는 한우 개체에 비해 유전적으로 성숙도가 높은 한우로 예측하여 판정하는 것을 특징으로 하는 allele specific-PCR 기법을 이용한 한우 육질 진단 방법The method according to claim 1,
Among the three genomic marker DNA markers (TT, TC and CC) of Hanwoo ADRB3 gene detected by Allele specific-PCR analysis, Korean Hanwoo, representing TC genotype, was genetically higher than Hanwoo representing TT and CC genotype The method for the diagnosis of Korean beef cattle using the allele specific-PCR technique

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