KR101417389B1 - Development of genetic marker related to maturity score in Hanwoo - Google Patents

Abstract

본 발명은 한우의 성숙도와 밀접하게 연관되어 있는 유전자 마커를 이용한 고급육 한우 진단 방법에 관한 것으로서, 육질 형질이 우수한 한우의 유전적 자질을 예측하고 판정하는 유전자 마커를 개발하여 조기 선발 및 개체 평가의 정확성을 제고하는 데 활용 가능한 유전자 진단 방법을 제공하기 위한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 한우 MTTP (Microsomal triglyceride transfer protein) 유전자의 인트론(intron) 7번 영역 내에 존재하는 특정 SNP를 이용하여 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형성) 기법으로 한우 개체별 SNP 유전자형에 따른 유전자 마커(DNA marker)를 검출함으로써 이들 가운데 가장 바람직한 유전자형(TT 및 TC형)을 가진 개체를 유전적으로 성숙도가 낮은 육질이 우수한 한우 개체로 진단하는 방법을 제공한다.The present invention relates to a method for diagnosing high-quality Korean cattle using a genetic marker closely related to the maturity of Korean cattle, and has developed a genetic marker for predicting and determining the genetic qualities of Korean cattle having superior meat quality, The present invention provides a method for diagnosing a gene which can be utilized for enhancing gene expression.
More particularly, the present invention relates to the use of PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) technique using a specific SNP present in the intron region 7 of a microsomal triglyceride transfer protein (MTTP) (DNA markers) according to individual SNP genotypes, thereby providing a method for diagnosing individuals having the most desirable genotypes (TT and TC types) as genetically engineered Korean beef cattle with low maturity.

Description

한우 성숙도 관련 유전자 마커 개발 {Development of genetic marker related to maturity score in Hanwoo}Development of genetic markers related to maturation of Hanwoo (Development of genetic marker related to maturity score in Hanwoo)

본 발명은 분자유전학적 분석기법인 PCR-RFLP 분석을 통하여 한우의 육질형질 가운데 성숙도와 밀접하게 연관되어 있는 MTTP (Microsomal triglyceride transfer protein) 유전자의 특정 단일염기다형(SNP)을 이용한 한우 성숙도 관련 유전자 마커를 개발함으로써, 이를 이용하여 유전적으로 성숙도가 우수한 우수한 한우를 조기에 진단할 수 있는 기술을 제공한다.The present invention relates to the use of a specific single nucleotide polymorphism (SNP) of a microsomal triglyceride transfer protein (MTTP) gene, which is closely related to the maturation of the meat quality traits of Korean beef cattle through PCR-RFLP analysis, By using this technology, we can provide the technology to diagnose excellent genetically superior Korean beef early.

현대에는 분자유전학 및 유전자 분석기술의 발달로 인해 DNA 분자수준에서 가축의 특정 형질과 밀접하게 연관되어 있는 후보유전자들의 특이적인 DNA 염기서열 변이에 따른 유전적 형질 진단용 분자표지 기술개발이 활발히 이루어지고 있다. 최근에는 PCR 기술을 이용하는 RAPD (random amplified polymorphic DNA), SSCP (single strand conformation polymorphisms) 기법 및 microsatellite 등 다양한 DNA 분석기법을 이용하여 가축의 주요 경제형질과 관련된 분자표지를 이용한 조기 진단 및 선발 기술은 물론 다양한 산업 전반에 걸쳐 본 기술이 활용되고 있는 실정이다. 특히, 특정 유전자의 PCR product에 제한효소를 처리하여 해당 염기변이 부위의 차이에 따라 DNA 절편이 각각 다르게 나타나는 것을 이용한 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석기법은 타 분석기법들에 비해 재현성과 정확성이 뛰어나 유전자 검사에 매우 유용한 기술로 평가되고 있다.In recent years, development of molecular genetics and genetic analysis techniques have led to the development of molecular marking technology for the diagnosis of genetic traits based on specific DNA sequence variations of candidate genes closely related to specific traits of livestock at the DNA molecule level . Recently, early identification and screening techniques using molecular markers related to the major economic traits of livestock using various DNA analysis techniques such as RAPD (random amplified polymorphic DNA), SSCP (single strand conformation polymorphisms) and microsatellite This technology is used in various industries. In particular, PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) analysis technique using restriction enzyme in a PCR product of a specific gene and showing different DNA fragments according to the difference of base mutation sites, Is highly regarded as a useful technology for genetic testing.

이와 같은 시대적 흐름에 발맞추어 최근에는 분자유전학적 기술을 이용한 한우 경제형질 관련 분자표지를 이용한 고능력 우량 한우 조기진단 기술이 몇몇 개발되어 대한민국 특허청에 특허출원/등록 되어 있다. 그 대표적인 예로, 한우의 근내지방도 연관 프라이머 및 그를 이용한 한우근내지방도 성적 검사방법(출원번호 : 10-2000-0065925), 한우의 경제형질과 연관성 있는 마이크로새틀라이트 DNA 및 이의 분석용 프라이머 세트(출원번호 : 10-2004-0091892) 및 신규 프라이머 세트 및 이를 이용한 한우 선발방법(출원번호 : 10-2003-0093288) 등 DNA 분자표지를 이용한 한우 경제형질 진단 방법과 관련된 발명기술들이 특허등록되어 있다.In line with this trend, several advanced technologies for high-performance high-performance Cow's milk using molecular markers related to Korean traits have been developed and registered with the Korean Intellectual Property Office. As a representative example thereof, a method for inspecting a fatty acid-related primer of Korean beef cattle and a method for proving fatty acid in Hanwoo crain using the same (Application No.: 10-2000-0065925), microsatellite DNA associated with the economic traits of Hanwoo and a primer set for analysis thereof : 10-2004-0091892) and a novel primer set and a method for selecting a Korean cattle using the same (Application No.: 10-2003-0093288).

그러나, 상기에 제시한 기존의 발명들은 특정한 형질 발현과 밀접하게 연관되어 있는 유전자를 이용하는 본 발명에서의 분석방법과 달리, 약 2-7 bp 크기의 DNA 염기 반복 수에 따라 개체별 유전적 다형성을 구분하는 마이크로새틀라이트(microsatellite) 분석기술을 이용한 분자표지들로서 본 발명에서 이용한 PCR-RFLP 분석기법에 비해 분자표지의 재현성이 낮아 정확성이 현저하게 떨어지는 단점이 있다. 그에 반해 본 발명에서는 한우 경제형질과 밀접하게 연관되어 있는 MTTP 후보유전자의 특정 SNP영역을 이용하여 PCR-RFLP기법으로 분자표지를 개발한 것으로서 한우 경제형질과 보다 연관성 있는 유전자 분자마커를 제공할 수 있을 뿐만이 아니라, 타 분석기법들에 비해 RFLP 마커의 재현성이 뛰어나 보다 정확성 높은 유전자 분자표지를 제공하는 장점이 있다.However, the above-mentioned existing inventions, unlike the analysis method of the present invention using a gene closely related to a specific expression of a gene, can not discriminate individual genetic polymorphisms according to DNA base repeat number of about 2-7 bp As a result, the reproducibility of the molecular markers is lower than that of the PCR-RFLP analysis techniques used in the present invention. In contrast, in the present invention, a specific marker SNP region of the MTTP candidate gene closely related to the Hanwoo economic trait was used to develop a molecular marker by PCR-RFLP technique. In addition, the RFLP marker is more reproducible than other analytical techniques, providing the advantage of providing more accurate genetic marker.

최근 한미 FTA 협상 타결 등 쇠고기 수입개방에 대응한 국내 한우 사육농가의 보호 및 발전을 위해서는 한우육의 육질 고급화를 통한 수입육과의 차별화로 품질경쟁력을 높이는 전략이 필요하다. 이를 위해서는 최적의 사육 환경 조성도 중요하겠지만, 근본적으로 유전적 자질이 우수한 한우를 조기에 진단하여 선발하는 최첨단 육종개량 모델을 개발하여 품질 좋고 경제성 높은 고능력 고품질 한우를 생산함으로써 소비자들에게 안전하고, 맛 좋은 고급육 한우를 보다 저렴한 가격에 제공할 수 있을 것이다. 현재 우리나라 축산물 등급판정은 한우 육질등급 판정의 경우 근내지방도(marbling), 육색, 지방색, 조직감 및 성숙도 등의 도체성적 항목을 이용하여 1++, 1+, 1, 2, 3 등급으로 육질등급을 판정하고 있는데 이들 항목 중에서 성숙도는 소도체 골격의 골화정도를 측정하여 골격의 특성을 판정하는 항목으로서 육질등급을 결정하는데 영향을 미치는 요인 중 하나이다. 따라서, 한우의 육질 고급화를 통한 품질경쟁력을 높이려면 유전적으로 성숙도가 우수한 개체를 조기에 진단하고 선발하여 최적의 환경에서 사육 관리하는 것이 중요하다. In order to protect and develop domestic Hanwoo farming households responding to the recent opening of Korea-US FTA negotiations, it is necessary to develop a strategy to enhance quality competitiveness by differentiating imported Hanwoo meat from imported meat. Although it is important to establish optimal breeding environment for this purpose, it is necessary to develop high-tech breeding improvement model that early diagnosis and selection of Hanwoo, which is fundamentally superior in genetic qualities, to produce high quality and high- We will be able to provide delicious high-quality Korean beef at lower prices. At present, Korean livestock grade grades are graded 1+, 1+, 1, 2, and 3 grades using the carcass grades such as marbling, meat color, local color, texture and maturity Among these items, maturity is one of the factors that determine the skeletal characteristics by measuring the degree of ossification of the small conductor skeleton, which is one of factors affecting the determination of the meat quality grade. Therefore, in order to improve the quality competitiveness through quality upgrading of Korean beef cattle, it is important to diagnose and select genetically superior individuals at an early stage and to manage them in an optimal environment.

가축의 육종개량에 있어 종래의 양적 유전학적 방법은 가축의 표현형적 기록에 의존해왔다. 즉, 후보종모우는 혈통기록과 체형 발달 등의 당대 기록으로 우선 선발하고 빈우와의 교배에 의해 생산되는 후대 검정우를 사육, 도축하여 도체 및 육질형질들을 기록하고 가축이 사육되어진 환경 요인들을 최대한 배제하면서 가축의 진정한 육종가를 추정해 내기 위한 가장 적절한 통계 모델식을 고안하여 종축을 선발하게 되는데 이러한 표현형적 관찰치를 측정하는 데는 많은 시간이 소요되므로 종축의 선발을 지연하게 되어 세대 간격이 길어지고 많은 두수의 후보 종축을 사육하게 되므로 사료비, 시설투자비 및 유지비, 인건비 등의 경제적 비용과 과도한 노동력이 소요된다. 이와 같이 종래의 전통적인 양적 유전학적 방법만으로 높은 개량 효과를 기대하기에는 어느 정도 한계가 있기 때문에 최근에는 MAS (marker assisted selection)를 이용한 첨단 육종 방법이 각광받고 있다. MAS 방법은 가축이 도축 되기 이전에 유전자 검사 즉 DNA marker 분석을 통하여 육질 및 육량 등 특정 형질이 우수한 개체를 조기에 진단하고 선발할 수 있는 방법으로서 과거 전통적인 육종방법에 추가하여 본 기술을 이용할 경우 개량의 속도를 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 더 높은 개량효율을 기대할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 한우의 육질형질과 밀접하게 연관되어 있는 유전자의 분자표지를 탐색하여 이를 이용한 고급육 생산 한우 조기 진단 및 선발에 활용할 수 있는 기술을 개발하고자 수행하였다.Conventional quantitative genetic methods for improving breeding of livestock have relied on phenotypic records of livestock. In other words, the candidates were selected for the first time, such as pedigree record and body development, and the next black sheep produced by mating with the birds was reared and slaughtered to record the carcass and meat quality traits, In order to estimate the true breeding price of livestock, the most suitable statistical model formula is devised to select the breed axis. It takes a long time to measure these phenotypic observations, The cost of labor, such as feed costs, facility investment and maintenance costs, labor costs, and excessive labor are required. Recently, there has been a growing interest in advanced breeding methods using MAS (marker assisted selection) because there is a limit to expect a high improvement effect only by the conventional conventional quantitative genetic methods. The MAS method is a method for early diagnosis and selection of individuals with excellent traits such as meat quality and meat quality through genetic testing or DNA marker analysis before slaughtering livestock. In addition to the conventional breeding methods, It is possible to expect a higher improvement efficiency. Therefore, in the present invention, the inventors have searched for molecular markers closely related to the meat quality of Korean beef cattle, and developed a technique for early diagnosis and selection of high-yielded beef cattle using the same.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 개선하기 위하여 연구 개발한 결과, 소의 6번 염색체에 존재하는 MTTP (Microsomal triglyceride transfer protein) 유전자를 한우의 육질형질 관련 후보유전자로 선정하여 한우 성숙도와 밀접하게 연관되어 있는 유전자 마커를 개발하고 이를 이용한 고급육 생산 한우 진단 방법을 발명하였다. 본 발명에서 이용한 MTTP 유전자는 지방의 합성과 분해에 연관되어 있는 유전자로서 최근 선행 연구에 따른면 돼지에서 초기 지방 단백질의 합성 및 지방산 조성 등에 관여하는 것으로 보고되어 있다. 본 발명에서는 체내의 지방 합성 및 분해와 관련되어 있는 MTTP 유전자를 한우 육질형질 관련 후보유전자로 최종 선정하고, MTTP 유전자의 특정 SNP를 이용한 PCR-RFLP 분석 및 도체형질과의 연관성 통계 분석을 통해 육질형질과 밀접하게 연관되어 있는 유전자 마커를 개발하여 유전적으로 성숙도가 우수한 고급육 생산 한우 조기 진단 및 선발에 활용할 수 있는 DNA 분자표지를 개발하였다.Accordingly, the present inventors have found that MTTP (Microsomal Triglyceride Transfer Protein) gene located on chromosome 6 of bovine cow is selected as a candidate gene related to meat quality traits of Korean beef cattle and is closely related to Hanwoo maturity And developed a diagnostic method for producing high quality meat using the same. The MTTP gene used in the present invention is a gene involved in the synthesis and degradation of fat. It has been reported that the MTTP gene involved in early fat protein synthesis and fatty acid composition in cotton pigs according to recent researches. In the present invention, the MTTP gene related to lipid synthesis and degradation in the body is finally selected as a candidate gene related to a fleshy trait, and PCR-RFLP analysis using a specific SNP of the MTTP gene and a correlation with a trait of a carcass, And developed a DNA marker that can be used for the early diagnosis and selection of genetically engineered high quality Korean beef cattle.

더욱 상세하게는, 한우의 혈액으로부터 genomic DNA를 분리하고, 이를 MTTP 유전자의 인트론 7번 영역을 포함하는 프라이머(primer)를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, 증폭된 PCR 산물에 Taq Ⅰ 제한효소를 첨가하여 절단된 DNA 단편을 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동 하여 각 유전자형별 DNA marker를 결정한 후, 한우 도체형질과의 연관성 통계분석을 통해 성숙도와 연관되어 있는 DNA marker를 발굴함으로써 이를 이용하여 유전적으로 육질이 우수한 한우 조기 진단 방법을 제공한다.More specifically, genomic DNA is isolated from the blood of Hanwoo, amplified by PCR using a primer containing the intron 7 region of the MTTP gene, and then Taq I restriction enzyme is added to the amplified PCR product DNA fragments of each genotype were determined by electrophoresis of the digested DNA fragments on an agarose gel and then DNA markers related to maturity were identified through statistical analysis of the association with the traits of Hanwoo carcass, It provides an early diagnostic method of Hanwoo which is excellent in meat quality.

한우 MTTP 유전자 인트론 7번 영역의 증폭영역 내 84번째 T↔C 염기치환으로 인한 DNA 유전자형 마커(TT, TC 및 CC형)를 이용하여 한우 성숙도에 대한 각 개체의 육질 특성을 규명할 수 있으며 이를 바탕으로 고능력 한우의 조기 진단 및 선발과 유용 유전자원의 산업적 활용이 가능하다. 즉, MTTP 유전자의 특정 SNP 유전자형을 보유하고 있는 개체를 조기에 진단하고 선발 육종하여 한우 육종개량사업의 효율성과 개량성과를 극대화하고 동시에 우리나라 고유의 한우 유전자원을 보다 우수하게 개량하고 보존하는 효과를 얻을 수 있다.We can characterize the meat quality of each individual on the maturity of Korean beef using DNA genotypic markers (TT, TC and CC type) due to 84th T↔C base substitution in the amplification region of the intestine 7 region of Hanwoo MTTP gene. , It is possible to conduct early diagnosis and selection of high - ability Korean beef cattle and to utilize useful genetic resources industrially. In other words, by early diagnosis and selective breeding of individuals with specific SNP genotype of MTTP gene, it is possible to maximize the efficiency and improvement performance of Hanwoo breeding breeding program, and to improve and preserve Korean native Hanwoo genetic resources better Can be obtained.

또한, 본 발명은 한우의 genomic DNA를 대상으로 PCR-RFLP 분석 방법을 이용하는 최첨단 분자육종 기술로서 본 발명에서 이용한 PCR-RFLP 분석 기법은 신속하고 간편하며 정확성이 높아 선발의 효율성과 실용성을 극대화 할 수 있을 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 DNA marker 유전자형을 보다 간편하고 신속하며, 정확하게 판정할 수 있는 장점이 있다.  In addition, the present invention is a state-of-the-art molecular breeding technique using a PCR-RFLP analysis method for genomic DNA of Hanwoo, and the PCR-RFLP analysis technique used in the present invention is quick, simple and highly accurate, DNA marker genotypes can be easily, quickly, and accurately determined for a large number of samples.

도면 1은 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 MTTP 유전자 증폭 영역 내 84번째 T↔C 단일염기다형(SNP)으로 인한 각 개체의 SNP 유전자형별 유전자 마커(DNA marker) 전기영동 사진
도면 2는 본 발명에서 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 한우 MTTP 유전자 증폭 영역 내 84번째 T↔C 단일염기다형(SNP)에 대한 각 SNP 유전자형별 유전자 마커(DNA marker)의 염기서열 분석 크로마토그램FIG. 1 is a graph showing the SNP genotypic genetic markers (DNA marker) of each individual caused by the 84th T↔C single nucleotide polymorphism (SNP) in the amplified region of MTT gene of Korean cattle in SEQ ID NO: 1 detected by the PCR- Youngdong photo
2 shows the nucleotide sequence of a DNA marker of each SNP genotype for the 84th T↔C single nucleotide polymorphism (SNP) in the amplification region of the MTT gene of Korean cattle in SEQ ID NO: 1 detected by PCR-RFLP analysis in the present invention Analytical chromatogram

상기에 제시한 목적을 달성하기 위하여 이하 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
In order to achieve the above objects, the present invention will be described in more detail with reference to the following non-limiting examples.

실시 예 1 : 한우 Example 1: MTTPMTTP 유전자의  Gene SNPSNP 유전자형 검출 Genotype detection

1. 공시재료 및 DNA 분리 정제1. Disclosure material and DNA separation purification

본 발명에 사용한 한우는 혈통기록과 도체성적을 보유하고 있는 농가현장 검증 한우 집단 총 294두를 공시축으로 선정하였다. 각 공시축 혈액으로부터의 genomic DNA의 분리 및 정제는 Miller등(1988)의 방법을 일부 변경하여 분리 정제하였으며 스펙트로포토메타(spectrophotometer)를 이용하여 DNA 농도를 측정한 후 TE buffer (10mM Tris-HCl, pH 7.4; 1mM EDTA)에 용해하여 -20℃ 냉동고에 보존하고 공시재료로 사용하였다.In the present invention, 294 dogs were selected as the public axes. Genomic DNA was separated and purified from each test tube by the method of Miller et al. (1988). The DNA concentration was measured using a spectrophotometer, and then TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1 mM EDTA) and stored in a -20 ° C freezer to be used as a reference material.

2. 한우 MTTP 유전자의 PCR 증폭 및 단일염기다형(SNP) 검출2. PCR amplification and single base polymorphism (SNP) detection of Hanwoo MTTP gene

한우 MTTP 유전자의 intron 7 ~ intron 8번 영역을 일부 포함하는 서열번호 1에 제시한 764 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머(primer)는 GenBank 등록번호 NC_007304.5호에 등록된 염기서열 정보를 참고하여 서열번호 2와 서열번호 3에 제시한 바와 같이 각각 설계 및 제작하였으며, 본 발명에 사용한 프라이머 염기서열은 표 1과 같다.A primer for amplifying the 764 bp DNA fragment shown in SEQ ID NO: 1, which partially includes the intron 7 to intron 8 of the Hanwoo MTTP gene, includes a nucleotide sequence information registered in GenBank registration number NC_007304.5 The primer sequences used in the present invention are shown in Table 1, as shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.

한우 MTTP 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머 염기서열Primer base sequence for PCR amplification of Hanwoo MTTP gene 유전자명Gene name 좌위Seat 프라이머 염기서열 (5'-3')The primer sequence (5'-3 ') 서열번호SEQ ID NO: MTTP MTTP intron 7 -
intron 8intron 7 -
intron 8 정방향 F-CTGGCTTCAGATGTAACACCGTForward F-CTGGCTTCAGATGTAACACCGT 22 역방향 R-CATCCCCCTATCTGTGTACCAAReverse R-CATCCCCCTATCTGTGTACCAA 33

MTTP 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 진엠프 시스템 9700(GenAmp PE Applied Biosystem, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에 실시하였다. 즉, 반응액 조성은 0.2 ml 튜브에 주형(template) DNA 50 ng, 프라이머 각 0.1 μM, dNTP 각 250 μM, 10X PCR buffer 2㎕, 그리고 Taq DNA 중합효소 1 unit 을 첨가하여 PCR 반응액을 총 20㎕로 조정하였다. PCR 반응조건은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 후 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 그리고 72℃에서 40초 간의 사이클을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하여 DNA 증폭과정을 종료하였다. PCR 증폭산물은 2% 아가로즈젤(agarose gel)에 전기영동 하여 DNA 증폭 성공여부를 검증하였다. 한우 MTTP 유전자의 PCR 증폭산물을 이용하여 direct sequencing 기법으로 염기서열을 분석한 결과 서열번호 1에 제시한 바와 같이 총 764 bp 크기의 염기를 검출하였으며, 검출된 이들 증폭 영역 내 염기에서 총 1개의 단일염기다형(SNP) 부위를 검출하였다. 즉, NCBI GenBank 등록번호 NC_007304.5호의 22,942번째(서열번호 1의 84번째) 염기에서 T↔C 염기치환에 따른 SNP를 검출하였다.검출된 SNP에 대한 각 검정대상 한우 개체별 SNP 유전자형 분석을 위해 Taq Ⅰ 제한효소를 이용하여 RFLP 분석을 수행하였다.The reaction conditions for the PCR amplification of the MTTP gene were carried out using the JAMP System 9700 (GenAmp PE Applied Biosystem, USA) under the following conditions. The reaction solution was prepared by adding 50 ng of template DNA, 0.1 μM of each primer, 250 μM of dNTP, 2 μl of 10X PCR buffer and 1 unit of Taq DNA polymerase to a 0.2 ml tube. ≪ / RTI > The PCR reaction conditions were preliminary heating at 94 ° C for 5 minutes, followed by repeating 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 40 seconds, and finally heating at 72 ° C for 5 minutes to amplify DNA The process was terminated. PCR amplification products were electrophoresed on 2% agarose gel to verify DNA amplification success. As shown in SEQ ID NO: 1, a total of 764 bp of the base was detected using a direct sequencing method using the PCR amplification product of the Hanwoo MTTP gene. As a result, a total of one single The SNP region was detected. That is, the SNPs according to the T↔C base substitution were detected in the nucleotide 22,942 of the NCBI GenBank registration number NC_007304.5 (84th nucleotide in SEQ ID NO: 1) For SNP genotyping analysis of the detected SNPs RFLP analysis was performed using Taq I restriction enzyme.

3. PCR-RFLP 기법에 의한 한우 MTTP 유전자의 SNP 유전자형 마커 분석3. Analysis of SNP genotypic markers of Hanwoo MTTP gene by PCR-RFLP

검출된 한우 MTTP 유전자의 증폭영역 내 84번째 T↔C SNP 부위에 Taq Ⅰ 제한효소 인지부위(5'-T^↓CGA-3')가 존재하여 RFLP 기법으로 한우 MTTP 유전자의 세 종류 SNP 유전자형(TT, TC 및 CC)에 상응하는 유전자 마커(DNA marker)를 검출하였다[도면 1 및 도면 2]. There was a Taq I restriction enzyme recognition site (5'-T ^↓ CGA-3 ') at the 84th T↔C SNP site in the amplified region of the detected Hanwoo MTTP gene. Three types of SNP genotypes (TT , TC and CC) (FIG. 1 and FIG. 2).

한우 MTTP 유전자의 RFLP 분석은 5 ㎕의 PCR 증폭산물에 2 unit의 Taq Ⅰ 제한효소를 첨가한 다음 37℃에서 약 3시간 이상 반응시켜 절단하였다. PCR 증폭산물을 제한효소로 각각 절단하여 얻어진 DNA 단편은 TBE buffer (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA, pH 8.0)을 이용하여 2% 아가로즈젤에 약 100 volt 전압으로 약 2시간 30분 동안 전기영동하고 EtBr (ethidium bromide)로 염색한 후, DNA 단편 양상을 관찰하여 각 검정 개체별 SNP 유전자형을 판정하였다. 즉, TT homo 유전자형을 가진 개체들에서는 1개의 제한효소 인지부위가 존재하여 84 및 680 bp 크기를 갖는 총 2개의 DNA 단편이 검출되었고, CC homo 유전자형을 가진 개체들에서는 제한효소 인지부위가 존재하지 않아 764 bp 크기를 갖는 총 1개의 DNA 단편이 검출되었다. 그리고 TC hetero 유전자형을 가진 개체들은 이들 세 가지의 DNA 단편이 모두 검출되어 84, 680 및 764 bp 크기를 갖는 DNA band가 검출되었다[도면 1]. RFLP analysis of Hanwoo MTTP gene was performed by adding 2 units of Taq I restriction enzyme to 5 μl of PCR amplification product, followed by reaction at 37 ° C for at least 3 hours. The DNA fragments obtained by digesting the PCR amplification products with restriction enzymes were subjected to a 2% agarose gel using TBE buffer (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA, pH 8.0) at about 100 volts for about 2 hours and 30 minutes After electrophoresis and staining with EtBr (ethidium bromide), the SNP genotype of each test individual was determined by observing the DNA fragment pattern. In other words, in the individuals with the TT homo genotype, one restriction endonuclease site was present, and two DNA fragments of 84 and 680 bp in size were detected. In the CC homo genotype, restriction enzyme recognition sites were present A total of one DNA fragment of 764 bp in size was detected. DNA fragments of 84, 680, and 764 bp were detected in all of the three DNA fragments of TC heterozygous individuals [Fig. 1].

이상과 같은 방법으로 한우 검정 집단 총 294두를 대상으로 분석한 MTTP 유전자의 증폭영역 내 84번째 SNP 대립유전자 출현빈도와 유전자형 출현율을 분석한 결과 대립유전자 출현빈도는 T 대립유전자가 약 81.6%, C 대립유전자가 약 18.4%로 T 대립유전자 출현빈도가 C 대립유전자에 비해 높게 나타났으며, SNP marker 유전자형 출현빈도는 TT형 67.3%(198두), TC형 28.6%(84두), 그리고 CC형이 4.1%(12두)로서 TT 유전자형이 가장 높고, CC 유전자형이 가장 낮은 것으로 분석되었다.
As a result of analyzing the frequency and genotype frequencies of the 84th SNP allele in the amplified region of the MTTP gene analyzed in 294 Korean cattle population groups, the frequencies of alleles were found to be 81.6% for T allele, The frequency of the T allele was higher than that of the C allele. The frequencies of SNP marker genotypes were 67.3% (198 cases), TC type 28.6% (84 cases), CC type (4.1%), the TT genotype was the highest and the CC genotype was the lowest.

실시 예 2. 한우 Example 2. Hanwoo MTTPMTTP 유전자의  Gene DNADNA markermarker 유전자형과  Genotype and 도체형질과의Conductivity 연관성 통계 분석 Association statistical analysis

본 발명을 통해 검출된 한우 MTTP 유전자의 SNP 유전자형이 한우의 도체형질에 미치는 효과를 추정하기 위해 SASⓐ8.2 Package/PC 프로그램을 이용하여 PROC GLM 법으로 통계 처리하였으며, 이들 중 유전자형 효과의 유의성이 인정된 형질에 대해 던칸 다중검정(Duncan′s Multiple Range Test; DMRT) 방법으로 각 유전자형의 최소자승평균치간의 차이에 의한 유의성 검정을 실시하였다.In order to estimate the effect of the SNP genotype of Hanwoo MTTP gene detected by the present invention on the carcass traits of Korean cattle, statistical treatment was carried out using PROC GLM method using SAS a8.2 Package / PC program. The significance test was performed by the Duncan 's Multiple Range Test (DMRT) method on the difference between the least squares mean of each genotype.

그 결과 한우 MTTP 유전자의 인트론 7번 영역 내 T↔C 염기치환에 의한 SNP 부위(서열번호 1의 84번째)의 유전자형은 한우의 성숙도지방도 육종가 추정치와의 유의적 연관성이 입증되었다(P<0.05). 즉, 표 2에서 보는 바와 같이 성숙도에서 TC 및 TT 유전자형을 가진 개체들이 CC 유전자형을 가진 개체들에 비해 각각 0.280 및 0.289 정도 유의적으로 낮게 나타났다(P<0.05). 참고로, 성숙도는 소 도체의 흉추골, 요추골, 천추골 및 갈비뼈의 골화정도를 1부터 9까지의 수치로 표기하는데 점수가 낮을수록 골화의 정도가 낮고 연골이 선명하여 더 높은 육질등급을 받을 수 있다.As a result, the genotype of the SNP region (84th position in SEQ ID NO: 1) due to T↔C base substitution in the intron 7 region of the Hanwoo MTTP gene was proved to be significantly correlated with the maturation lipid sarcoma estimates of Hanwoo (P <0.05) . As shown in Table 2, individuals with TC and TT genotypes were significantly lower (0.25 and 0.289, respectively) than those with CC genotype in maturity (P <0.05). For reference, the maturity level indicates the degree of ossification of the thoracic, lumbar, sacral, and ribs of the small carcasses from 1 to 9. The lower the score, the lower the degree of ossification and the sharpness of the cartilage, have.

한우 MTTP 유전자의 DNA marker 유전자형과 도체형질과의 연관성 분석 결과Analysis of association between DNA marker genotype and carcass traits of Hanwoo MTTP gene 도체형질Conductor trait SNP genotype of MTTP g.22942T>CSNP genotype of MTTP g.22942T> C P-valueP-value TTTT TCTC CCCC 근내지방도/1-9Intramuscular fatigue / 1-9 5.628±0.1285.628 + 0.128 5.833±0.2645.833 + 0.264 4.875±0.6074.875 ± 0.607 0.3530.353 육색/1-7Meat / 1-7 4.932±0.0284.932 + 0.028 4.952±0.0444.952 + 0.044 5.000±0.1015.000 ± 0.101 0.7820.782 지방색/1-7Local color / 1-7 3.000±0.0073.000 ± 0.007 2.976±0.0122.976 + 0.012 3.000±0.0283.000 + 0.028 0.2650.265 조직감/1-3Texture / 1-3 1.105±0.0301.105 + 0.030 1.095±0.0471.095 + 0.047 1.125±0.1081.125 + 0.108 0.9630.963 성숙도/1-9Maturity / 1-9 2.086±0.029^a 2.086 ± 0.029 ^a 2.095±0.046^a 2.095 + 0.046 ^a 2.375±0.106^b 2.375 + - 0.106 ^b 0.0350.035 육질등급Meat grade 3.605±0.0883.605 + 0.088 3.571±0.1393.571 + 0.139 3.250±0.3183.250 0.318 0.5600.560 등지방두께/mmBacking Thickness / mm 14.338±0.51914.338 ± 0.519 14.333±0.81614.333 + 0.816 16.125±1.87116.125 ± 1.871 0.6490.649 배최장근단면적/㎠Circumstantial cross sectional area / ㎠ 91.144±1.00391.144 ± 1.003 91.357±1.57991.357 ± 1.579 94.500±3.61994.500 + - 3.619 0.6710.671 도체중/kgConductor weight / kg 436.192±5.258436.192 + - 5.258 427.761±8.274427.761 + - 8.274 467.750±18.959467.750 ± 18.959 0.1540.154 육량지수Meat index 63.829±0.40363.829 + 0.403 64.061±0.63564.061 + - 0.635 62.391±1.45662.391 + 1.456 0.5760.576 육량등급Weight rating 1.903±0.0641.903 + 0.064 1.928±0.1011.928 + 0.101 1.750±0.2321.750 + - 0.232 0.7800.780

a,b : 서로 다른 부호간에는 유의차가 있음(P<0.05).
a, b: Significant difference between different codes (P <0.05).

이상의 본 발명에 대한 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 한우 MTTP 유전자의 증폭영역 내 84번째 T↔C SNP 유전자형은 한우의 육질등급 판정에 있어 중요한 항목인 성숙도에 대한 유의적 연관성이 입증되어 본 SNP 마커를 이용하여 유전적으로 성숙도가 낮은 우수한 한우를 조기에 진단하고 선발할 수 있는 유전자 마커로 활용할 수 있을 것으로 사료된다. As a result of the above results of the present invention, the 84th T↔C SNP genotype in the amplification region of the Korean cattle MTTP gene of the present invention has been proved to be significantly related to maturity, which is an important item in determining the meat quality of Hanwoo SNP markers can be used as genetic markers for early diagnosis and selection of genetically poorly matched Korean beef cattle.

도면 1에서, M: 100 bp DNA size marker; TT, TC, CC: 본 발명의 MTTP 유전자 SNP에 의한 각각의 DNA marker 유전자형. 84, 680, 764 bp: DNA 단편의 크기
도면 2에서, TT, TC, CC : 본 발명의 MTTP 유전자 SNP에 의한 염기서열 분석 크로마토그램에 대한 각각의 DNA marker 유전자형1, M: 100 bp DNA size marker; TT, TC, CC: Each DNA marker genotype by the MTTP gene SNP of the present invention. 84, 680, 764 bp: Size of DNA fragment
In FIG. 2, TT, TC, and CC: the respective DNA marker genotypes for the nucleotide sequence analysis chromatograms of the MTTP gene SNP of the present invention

서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list

Claims (3)

서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머(primer)에 의해 PCR (Polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응) 증폭된 한우 MTTP (Microsomal triglyceride transfer protein) 유전자 증폭산물에 Taq Ⅰ 제한효소를 처리하는 과정을 포함하는 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형성) 분석법으로 서열번호 1에 제시한 한우 MTTP 유전자 염기서열 84번째 T↔C 염기치환에 따른 개체별 유전자 마커(DNA marker)를 검출하고, 각각의 SNP 유전자형(TT, TC 및 CC)을 분석하여 유전적으로 성숙도가 낮은 한우를 예측하고 판정하는 것을 특징으로 하는 한우 성숙도 관련 유전자 마커를 이용한 고급육 한우 진단 방법The present invention includes a step of treating Taq I restriction enzyme in the amplification product of a microsomal triglyceride transfer protein (MTTP) gene amplified by a PCR (Polymerase chain reaction) with a primer of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 (DNA marker) according to the 84th T &amp; E-T base substitution of the base sequence of the MTT gene of Korean beef cattle shown in SEQ ID NO: 1 by PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) A method for diagnosing high-quality Korean cattle using a genetic marker related to Hanwoo maturation, characterized by analyzing SNP genotypes (TT, TC and CC) and predicting and determining genetically low-maturity Korean cattle 삭제delete 청구항 1에 있어서,
PCR-RFLP 분석법으로 검출된 한우 MTTP 유전자의 세 가지 유전자 마커(DNA marker) 유전자형(TT, TC 및 CC) 가운데 TT 및 TC 유전자형을 나타내는 한우개체를 CC 유전자형을 나타내는 한우 개체에 비해 유전적으로 성숙도가 낮은 한우로 예측하여 판정하는 것을 특징으로 하는 한우 성숙도 관련 유전자 마커를 이용한 고급육 한우 진단 방법The method according to claim 1,
Among the three genetic markers (DNA marker) genotypes (TT, TC and CC) of the Hanwoo MTTP gene detected by the PCR-RFLP method, Hanwoo individuals exhibiting TT and TC genotypes were genetically mature A method for diagnosing high-quality Korean cattle using a genetic marker associated with Korean cattle

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