KR101597604B1 - 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 줄기세포의 보관 안정성을 증진시킬 수 있는 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 혈청을 함유하는 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물은, 줄기세포의 성상, 세포수 및 크기의 변화 없이 90% 이상의 생존율을 6일 이상 유지할 수 있으므로, 세포치료용 줄기세포의 장기간 운송 및 효과가 우수한 세포치료제 주사제품의 제조에도 유용하다.

Description

줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물 {Composition for Enhancing the Storage Stability of Stem Cells}
본 발명은 줄기세포의 보관 안정성을 증진시킬 수 있는 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 혈청을 함유하는 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.
만능 줄기세포(totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며, 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 다른 조직세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포이다.
다분화능 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고(Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다(C.M. Verfaillie et al., Trends Cell Biol . 12:502, 2002). 그러나, 골수와 같은 성체 조직내의 줄기세포는 매우 드물게 존재하고, 이러한 세포들은 분화유도 하지 않고 배양하기 어려워서, 특이적으로 스크린 된 배지들이 없으면 그 세포들을 배양하기 어렵다. 즉, 줄기세포들을 분리하여 체외에서 보존하기가 매우 어렵다는 단점이 있다.
최근, 지방 조직이 다분화능 줄기세포의 새로운 소스임이 밝혀졌으며(B. Cousin et al., BBRC, 301:1016, 2003; A. Miranville et al., Circulation, 110:349, 2004; S. Gronthos et al., J. Cell Physiol. 189:54, 2001; M.J. Seo et al., BBRC , 328:258, 2005), 지방추출(지방흡입술(liposuction))에 의해 얻어진 인간 지방조직에 미분화 세포군이 포함되어 있고, 이것이 in vitro 상에서 지방세포, 골 형성세포, 근원세포 및 연골모세포로의 분화능을 갖는다는 것이 보고되었다(P.A. Zuk et al., Tissue Eng. 7:211, 2001; A.M. Rodriguez et al., BBRC, 315:255, 2004). 아울러 지방 조직 유래 세포가 근육 재생능 및 신경혈관분화를 촉진하는 능력이 있다는 것이 동물 모델 실험을 통하여 알려진 바 있다. 이러한 지방 조직은 대량으로 추출할 수 있다는 장점이 있어, 기존의 단점을 보완하는 새로운 줄기세포의 소스로 주목 받고 있다.
대량으로 획득이 가능해진 줄기세포는 주로 난치병 등의 치료를 포함한 의학 분야 및 미용, 성형 등의 목적으로 줄기세포 자체를 주사하는 세포치료제로서의 이용이 늘어나고 있는 추세이다.
세포치료제 용도의 줄기세포는 배양 후 바로 환자에 시술이 가능할 경우에는 문제가 없으나, 환자의 상태에 따라 줄기세포 시술 시기의 조절이 필요한 경우에는 줄기세포 배양 후 장기간 보존이 필요하다. 또한, 배양한 줄기세포를 시술할 장소까지 장거리 운송이 필요한 경우에도 줄기세포의 안정적인 공급이 필수적이다. 이를 위해, 5~10일 정도의 장기간 동안 줄기세포의 높은 생존율을 유지하는 것이 필요하며, 현재 세포를 동결하지 않고 장기간 유지할 경우, 세포 생존율이 현저하게 낮아지는 문제가 있다. 그러나, 세포 동결법은 해동 당시의 세포 생존율이 현저히 떨어지며, 생물학적 관점에서 줄기세포로서의 기능성 등의 문제가 있다. 또한, 동결 상태로의 운송은 냉장 운송보다 힘들다는 단점이 있다.
현재 냉장상태로 줄기세포를 보존하는 종래 기술로는, 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 냉장조건에서 생리식염수에 부유하여 보관하는 기술이 있으나, 이 경우 48시간 이상 보관 시 70% 이상의 생존율을 나타내기 어렵다. 이를 개선하기 위해 슈크로오스나 알부민을 첨가하는 경우 48시간 내지 72시간까지는 생존율이 70% 이상을 나타내며, 보관 안정성이 향상되는 것을 확인된 바 있다(대한민국 특허 제2008-0103637호). 하지만, 72시간 이후 생존율이 급격히 감소하므로, 냉장조건(4℃)에서 세포치료제에 포함된 줄기세포의 생존율을 장기간 안정적으로 높게 유지해 주는 보관 안정성 증진용 조성물의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 장시간 냉장 보관 시에도 줄기세포의 생존율을 높게 유지시키기 위해 예의 노력한 결과, 혈청을 함유하는 경우 냉장 상태에서 줄기세포의 생존율이 6일 이상 높게 유지되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. 인간혈청을 세포 배양을 위한 배지 조성물로 사용한 경우는 있으나(대한민국 특허 제10-0394430호), 인간 혈청을 함유하는 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물에 대하여는 개시된 바가 없다.
본 발명의 목적은, 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 함유하는 세포치료제 주사제품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈청을 함유하는 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로, 혈청 5~80%(v/v)과 나머지는 생리식염수, 하트만-D 용액 및 PBS로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 부형제로 구성되고, 피브리노겐을 함유하지 않는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 함유하는 세포치료제 주사제품을 제공한다.
본 발명에 따른 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물은, 줄기세포의 성상, 세포수 및 크기의 변화 없이 90% 이상의 생존율을 6일 이상 유지할 수 있으므로, 세포치료용 줄기세포의 장기간 운송 및 효과가 우수한 세포치료제 주사제품의 제조에도 유용하다.
도 1은 서로 다른 농도(10, 20, 30%)의 자가혈청 및 0.3% 알부민을 함유한 보존제로 0.5x107 줄기세포를 냉장 보관하여 0~144 시간까지 보존 시간에 따른 줄기세포의 생존율을 비교한 것이다. 대조군은 0.3% 알부민을 함유한 보존제를 사용하였다.
도 2는 서로 다른 농도(10, 20, 30%)의 자가혈청 및 0.3% 알부민을 함유한 보존제로 1.0x107 줄기세포를 냉장 보관하여 0~144 시간까지 보존 시간에 따른 줄기세포의 생존율을 비교한 것이다. 대조군은 0.3% 알부민을 함유한 보존제를 사용하였다.
도 3은 서로 다른 농도(10, 20, 30%)의 타가혈청 및 0.3% 알부민을 함유한 보존제로 0.5x107 줄기세포를 냉장 보관하여 0~144 시간까지 보존 시간에 따른 줄기세포의 생존율을 비교한 것이다. 대조군은 0.3% 알부민을 함유한 보존제를 사용하였다.
도 4는 서로 다른 농도(10, 20, 30%)의 타가혈청 및 0.3% 알부민을 함유한 보존제로 1.0x107 줄기세포를 냉장 보관하여 0~144 시간까지 보존 시간에 따른 줄기세포의 생존율을 비교한 것이다. 대조군은 0.3% 알부민을 함유한 보존제를 사용하였다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 혈청을 함유하는 줄기세포 보존제가 냉장상태의 줄기세포의 생존율을 95% 이상 유지함으로써, 줄기세포의 보관 안정성이 증진되는 것을 밝혔다. 본 발명의 혈청을 함유하는 줄기세포 보존제는 냉장상태의 줄기세포 생존율을 6일 이상 높게 유지 가능함으로, 세포치료용 줄기세포의 안정적인 공급에 유용하다.
본 발명에서 용어 "세포치료제 주사제품" 또는 "세포치료제"란 조직의 결함을 치료하기 위해 줄기세포를 함유하여 비경구투여, 즉 주사의 형태로 결함부위 또는 그 인접부위에 주사되어, 결함을 교정할 수 있는 약학 조성물을 의미한다.
본 발명에서 용어 "부형제"란 약학 조성물의 약리학적 특성을 나타내는 유효성분 외, 일정 용량, 중량을 주어 취급을 용이하게 할 목적으로 첨가되거나 액체의 형태 등 형태를 유지하기 위하여 부가하는 물질을 의미하는 것으로, 일반적으로는 액체 형태를 위한 부형제로 생리식염수(Saline), 하트만-D 용액, PBS(Phosphate Buffered Saline) 등을 이용하고 있으나, 그 외 여러 가지 조성을 포함할 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어 "지방조직 유래 줄기세포"란 지방조직에서 분리해 낸 미분화 줄기세포로, 그 분리 방법은 다음과 같을 수 있다. 지방흡입술로 얻어지는 생리식염수에 부유된 지방 함유 suspension을 배양한 다음, 배양용기에 부착된 줄기세포 층을 트립신 처리하여 회수하거나 스크래퍼로 긁어 회수하는 방법을 통해 지방조직 유래 줄기세포를 분리할 수 있다.
본 발명의 줄기세포를 얻기 위해, 하기와 같은 방법으로 획득할 수 있다.
우선, 지방흡입술(Liposuction)에 의해 복부지방으로부터 얻어진 인간 지방조직을 분리하여 PBS로 세척한 다음, 조직을 잘게 자른 후 콜라겐 분해 효소를 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 분해후, PBS로 세척하고 원심분리 한다. 상층액은 제거하고 펠렛은 PBS로 세척한 후 다시 원심분리하여, 100㎛ 매쉬를 이용하여 부유물을 제거한 다음, PBS로 세척하였다. DMEM(10% FBS, 2mM NAC, 0.2mM 아스코브산) 배지에서 배양하고, 하룻밤 지난 후 배양용기에 부착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 케라티노사이트-SFM(FBS, NAC, 아스코브산, 칼슘, rEGF, 인슐린, bFGF 및 하이드로코티손) 배지를 2일마다 교체하면서 계대배양하여 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다. 이 외에도, 당업계에 이미 공지된 방법으로 줄기세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 10~30%(v/v)의 자가 또는 타가 인간혈청 및 0.3% 알부민이 포함된 조성물에 부유시켜 냉장(4℃) 상태에서 시간에 따른 세포의 크기, 성상, 세포수 및 생존율을 분석하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 혈청을 함유하는 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 혈청 5~80%(v/v)과 나머지는 생리식염수, 하트만-D 용액 및 PBS로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 부형제로 구성되고, 피브리노겐을 함유하지 않는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 지방, 제대혈, 골수, 근육, 태반 및 피부로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 지방조직 유래인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 줄기세포는 인간을 포함하는 포유류 유래 줄기세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈청의 함량은 1~80%(v/v)인 것이 바람직하고, 5~50%(v/v)인 것이 더욱 바람직하며, 10~30%인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 혈청은 인간을 포함하는 포유류 유래 혈청인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 동종유래의 혈청인 것이 바람직하며, 자가 또는 타가혈청의 사용에 제한이 없다.
본 발명에 있어서, 추가로 알부민 또는 부형제를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 알부민의 함량은 0.1~1%(v/v)인 것이 바람직하고, 0.2~0.5%(v/v)인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 부형제는 생리식염수, 하트만-D 용액 및 PBS로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "v/v"은 생리식염수에 부유시킨 줄기세포의 용량(부피 퍼센트)에 1~80%의 혈청이 첨가되어 전체 용량(부피 퍼센트)이 100%가 되는 것을 의미한다.
본 발명은 다른 관점에서, 혈청을 함유하는 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물을 함유하는 세포치료제 주사제품에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 혈청 5~80%(v/v)과 나머지는 생리식염수, 하트만-D 용액 및 PBS로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 부형제로 구성되고, 피브리노겐을 함유하지 않는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물을 함유하는 세포치료제 주사제품에 관한 것이다.
본 발명에 따른 주사제품은 환자의 체질 및 결함의 종류에 따라 당업계에 통상적으로 알려진 분량을 취하여 충진된 주사의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제품은 치료하고자 하는 결함에 인접한 부위 또는 결함부위에 주사되어 이용될 수 있으며, 이러한 방법으로 교정될 수 있는 결함은 주름, 튼살, 흉터, 피부함몰, 입술성형부전, 치주 결함, 연부조직 결함, 뼈 결함, 화상, 피부궤양 등 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포치료제 주사제품은 필요한 경우, 추가로 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성제, 희석제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 함황환원제, 산화방지제 등을 적절히 첨가할 수 있다.
[실시예]
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명 할 것이다.
실시예 1: 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
지방흡입술(Liposuction)에 의해 복부지방으로부터 얻어진 인간 지방조직을 분리하여 PBS로 세척하였다. 조직을 잘게 자른 후 collagenase type1 (1mg/ml)을 첨가한 DMEM media를 이용해 37℃에서 2시간 동안 조직을 분해시켰다. 콜라게나아제 처리된 조직을 PBS로 세척 후 1000rpm에서 5분간 원심분리 하여, 상층액을 제거하고, 펠렛을 PBS로 세척한 후 1000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 100㎛ mesh에 필터링하여 부유물을 제거한 후 PBS로 세척하고, 10% FBS, 2mM NAC(N-acetyl-Lcysteine), 0.2mM ascorbic acid가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 하룻밤 지난 후 부착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 5% FBS, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid, 0.09mM calcium, 5ng/ml rEGF, 5㎍/ml 인슐린, 10ng/ml bFGF 및 74ng/ml Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM media을 2일마다 교체하면서 계대배양하여 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 분리하였다.
실시예 2: 부형제에 대한 pH 측정
2-1: 실험군의 구성
실시예 1의 방법으로 분리된 각각 다른 4가지 지방 줄기세포를 4℃에서 냉장보관하여, 냉장제형 세포치료제 주사제품에 사용되는 줄기세포의 생존율을 분석하였다.
분리된 4가지 지방줄기세포는 하기 표 1과 같이 실험군을 구성하였다. 0.3% 알부민이 포함된 줄기세포 대조군, 0.3% 알부민 + 10% 자가혈청이 포함된 실험군, 0.3% 알부민 + 10% 타가혈청이 포함된 실험군, 0.3% 알부민 + 20% 자가혈청이 포함된 실험군, 0.3% 알부민 + 20% 타가혈청이 포함된 실험군, 0.3% 알부민 + 30% 자가혈청이 포함된 실험군 및 0.3% 알부민 + 30% 타가혈청이 포함된 실험군으로 구성하여 생존율을 분석하였다.
줄기세포 대조군 실험군 1 실험군 2 실험군 3
세포 1 0.3% 알부민 0.3% 알부민+
10% 자가 인간혈청		 0.3% 알부민+
20% 자가 인간혈청		 0.3% 알부민+
30% 자가 인간혈청
세포 2
세포 3 0.3% 알부민 0.3% 알부민+
10% 타가 인간혈청		 0.3% 알부민+
20% 타가 인간혈청		 0.3% 알부민+
30% 타가 인간혈청
세포 4
2-2: 부형제 별 pH 값
본 실시예에서는 줄기세포 보관 안정성 증진용 조성물의 부형제에 대한 pH를 분석하였다.
pH는 수소이온 농도를 수치화한 것이며, 일반적인 생리식염수(Saline)의 경우 pH 범위가 약 5.5~8.0으로 넓게 나타나므로, 생리식염수에 알부민 및 인간혈청이 첨가되었을 때의 pH 변화를 PBS와 함께 비교하였다. 정상적인 건강한 상태의 pH는 세포, 혈액, 체액 등이 약알칼리성을 유지하는 경우이다.
pH 분석은 Thermo Scientific사(社)의 Orion Star A111를 사용하여, 줄기세포 보관 안정성 증진용 조성물에 포함되는 알부민과 인간혈청에 의한 pH 변화를 분석하였다. 또한 pH는 측정 온도에 의해 영향을 받으므로 20~24℃ 범위의 상온에서 측정하였다.
그 결과, 표 2에 나타난 것과 같이, 알부민만 첨가된 경우에 약간 상승한 pH는 인간혈청이 첨가되어 약알칼리성 pH를 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
pH 비교 측정(SA : Saline + 0.3 % Albumine)
PBS Saline SA SA+10% 인간혈청 SA+20% 인간혈청 SA+30% 인간혈청
serum 1 serum 2 serum 1 serum 2 serum 1 serum 2
1 차 7.3 5.85 6.96 7.76 7.58 8.08 8.04 8.18 8.09
2 차 7.3 5.93 6.88 7.82 7.57 8.27 8.05 8.2 8.07
평균 7.3 5.89 6.92 7.79 7.57 8.17 8.04 8.19 8.08
이에, 이후 실시예에서는 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유된 줄기세포 대조군 및 각각 10, 20, 30% 자가 인간 혈청과 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유된 줄기세포 실험군과 각각 10, 20, 30% 타가 인간 혈청과 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유된 줄기세포 실험군으로 생존력 분석을 실시하였다.
실시예 3: 시간에 따른 줄기세포 크기 및 성상 분석
실시예 1의 방법으로 분리된 지방줄기세포는 PBS로 세척 후, 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시켜 각각 10, 20, 30%의 자가 및 타가 인간혈청을 첨가하여, 실시예 2의 대조군 및 실험군으로 구성하였다.
각 실험 군당 줄기세포를 1.0x107세포/ml의 농도로 3cc 주사기에 충진한 후, 4℃에 냉장보관하고 0, 24, 48, 72, 96, 120 및 144시간 후에 냉장제형 세포치료제 주사제품에 사용되는 줄기세포의 크기 및 성상을 분석하였다.
3-1: 자가혈청 실험군
세포 1은 0.5x107 줄기세포를 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 대조군 및 각각 10, 20, 30% 자가혈청/0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 줄기세포 실험군 3개를 준비하였다.
세포 2는 1.0x107 줄기세포를 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 대조군 및 각각 10, 20, 30% 자가혈청/0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 줄기세포 실험군 3개를 준비하였다.
세포 1의 대조군, 실험군 3개 및 세포 2의 대조군, 실험군 3개 모두 3cc 시린지에 줄기세포를 충진한 후, 4℃에 냉장보관하고 0, 24, 48, 72, 96, 120 및 144시간 후에 세포의 크기, 성상 및 총 세포수를 분석하였다. 줄기세포의 세포의 세포수 및 크기는 Invitrogen사(社)의 CountessTM Automated Cell Counter를 사용하여 분석하였으며, 성상 분석은 육안으로 확인하였다.
결과는 표 3(세포 1의 세포수), 표 4(세포 1의 크기), 표 5(세포 2의 세포수) 및 표 6(세포 2의 크기)에 나타냈다.


세포 1
(0.5x107 충진)		 구분 0hr 24hr 48hr 72hr 96hr 120hr 144hr
세포수(X107)
대조군 SA 0.43 0.39 0.45 0.37 0.35 0.34 0.35
실험군 1 SA+10% 인간혈청 0.47 0.76 0.77 0.56 0.24 0.31 0.45
실험군 2 SA+20% 인간혈청 0.58 0.77 0.67 0.73 0.53 0.64 0.32
실험군 3 SA+30% 인간혈청 0.75 0.83 0.76 0.83 0.6 0.61 0.49


세포 1
(0.5x107 충진)		 구분 0hr 24hr 48hr 72hr 96hr 120hr 144hr
세포크기(㎛)
대조군 SA 16.05 15 15.03 14.12 12.9 12.98 11.65
실험군 1 SA+10% 인간혈청 15 15.5 15.92 15.6 14.44 14.27 13.37
실험군 2 SA+20% 인간혈청 14.3 15.53 15.45 15.16 14.25 14.61 13.82
실험군 3 SA+30% 인간혈청 14.1 15.4 15.04 14.86 14 14.39 13.69


세포 2
(1.0x107 충진)		 구분 0hr 24hr 48hr 72hr 96hr 120hr 144hr
세포수(X107)
대조군 SA 1.3 1 0.85 0.75 0.65 0.69 0.8
실험군 1 SA+10% 인간혈청 1.3 0.98 0.89 0.69 0.56 0.56 0.51
실험군 2 SA+20% 인간혈청 1.1 1.1 0.98 0.89 0.79 0.72 0.53
실험군 3 SA+30% 인간혈청 0.97 1.1 0.99 1 0.91 0.72 0.6


세포 2
(1.0x107 충진)		 구분 0hr 24hr 48hr 72hr 96hr 120hr 144hr
세포크기(㎛)
대조군 SA 17.3 16.14 16.23 16.06 15.9 16.27 15.08
실험군 1 SA+10% 인간혈청 16.99 15.69 15.6 15.39 15.36 15.2 15.21
실험군 2 SA+20% 인간혈청 16.72 15.37 15.21 15.18 15.06 15.28 15.03
실험군 3 SA+30% 인간혈청 16.3 15.28 15.24 15.15 14.82 15.01 14.9
표 3~6에 나타난 바와 같이, 대조군의 세포 크기의 변화는 약 15~25% 정도 감소한 반면, 자가 인간혈청이 함유된 실험군의 세포 크기의 변화는 약 3~10% 정도로 크게 변화가 나타나지 않았다. 반면, 세포의 성상은 대조군과 실험군 모두 변화가 관찰되지 않았으며, 총 세포수 또한 대조군과 실험군에서 차이가 없었다.
3-2: 타가혈청 실험군
세포 3은 0.5x107 줄기세포를 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 대조군 및 각각 10, 20, 30% 타가혈청/0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 줄기세포 실험군 3개를 준비하였다.
세포 4는 1.0x107 줄기세포를 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 대조군 및 각각 10, 20, 30% 타가혈청/0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 줄기세포 실험군 3개를 준비하였다.
세포 3의 대조군, 실험군 3개 및 세포 4의 대조군, 실험군 3개 모두 3cc 시린지에 줄기세포를 충진한 후, 4℃에 냉장보관하고 0, 24, 48, 72, 96, 120 및 144시간 후에 세포의 크기, 성상 및 총 세포수를 분석하였다. 줄기세포의 세포의 세포수 및 크기는 Invitrogen사(社)의 CountessTM Automated Cell Counter를 사용하여 분석하였으며, 성상 분석은 육안으로 확인하였다.
결과는 표 7(세포 3의 세포수), 표 8(세포 3의 크기), 표 9(세포 4의 세포수) 및 표 10(세포 4의 크기)에 나타냈다.


세포 3
(0.5x107 충진)		 구분 0hr 24hr 48hr 72hr 96hr 120hr 144hr
세포수(X107)
대조군 SA 0.46 0.64 0.63 0.54 0.5 0.42 0.14
실험군 1 SA+10% 인간혈청 0.66 0.65 0.56 0.42 0.33 0.23 0.28
실험군 2 SA+20% 인간혈청 0.45 0.64 0.55 0.49 0.4 0.25 0.29
실험군 3 SA+30% 인간혈청 0.49 0.61 0.61 0.5 0.46 0.33 0.29


세포 3
(0.5x107 충진)		 구분 0hr 24hr 48hr 72hr 96hr 120hr 144hr
세포크기(㎛)
대조군 SA 16.15 15.92 14.79 13.35 13.46 13.8 13.14
실험군 1 SA+10% 인간혈청 15.45 15.87 15.3 14.79 14.61 14.16 13.34
실험군 2 SA+20% 인간혈청 14.08 15.34 14.83 14.72 14.66 14.21 14.06
실험군 3 SA+30% 인간혈청 13.8 15.1 14.83 14.67 14.54 13.75 13.45


세포 4
(1.0x107 충진)		 구분 0hr 24hr 48hr 72hr 96hr 120hr 144hr
세포수(X107)
대조군 SA 0.92 0.68 0.68 0.67 0.7 0.54 0.5
실험군 1 SA+10% 인간혈청 0.83 0.9 0.76 0.62 0.69 0.5 0.45
실험군 2 SA+20% 인간혈청 0.75 0.88 0.87 0.78 0.74 0.67 0.51
실험군 3 SA+30% 인간혈청 0.67 0.87 0.92 0.86 0.84 0.7 0.58


세포 4
(1.0x107 충진)		 구분 0hr 24hr 48hr 72hr 96hr 120hr 144hr
세포크기(㎛)
대조군 SA 16.47 16.72 15.9 15.9 16.42 15.78 16.39
실험군 1 SA+10% 인간혈청 16.55 16.08 15.78 15.83 16.46 15.75 16.07
실험군 2 SA+20% 인간혈청 16.27 15.59 15.31 15.55 15.53 15.13 15.37
실험군 3 SA+30% 인간혈청 16.05 15.41 15.14 14.94 15.3 15.03 15.1
표 7~10에 나타난 바와 같이, 대조군의 세포 크기의 변화는 약 20% 정도 감소한 반면, 타가 인간혈청이 함유된 실험군의 세포 크기의 변화는 약 3~10% 정도로 크게 변화가 나타나지 않았다. 반면, 세포의 성상은 대조군과 실험군 모두 변화가 관찰되지 않았으며, 총 세포수 또한 대조군과 실험군에서 차이가 없었다.
실시예 4: 시간에 따른 줄기세포 생존율 분석
실시예 3과 같은 조건으로 시간에 따른 줄기세포의 생존율을 분석하였다.
분리된 지방줄기세포는 PBS로 세척 후, 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시켜 각각 10, 20, 30%의 자가 및 타가 인간혈청을 첨가하여, 각각의 대조군 및 실험군으로 구성하였다. 각 실험 군당 줄기세포를 1.0x107세포/ml의 농도로 3cc 주사기에 충진한 후, 4℃에 냉장보관하고 0, 24, 48, 72, 96, 120 및 144시간 후에 냉장제형 세포치료제 주사제품에 사용되는 줄기세포의 생존율을 분석하였다. 줄기세포의 생존율 측정은 세포와 트립판 블루 용액을 1:1로 혼합하여 Invitrogen사(社)의 CountessTM Automated Cell Counter를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 인간혈청을 함유한 조성물은 0.3% 알부민만 함유한 대조군에 비해, 세포수의 큰 변화 없이 생존율이 높게 나타났으며, 혈청농도가 높을수록 생존율이 더 높고 세포의 안정성 유지 기간도 길어지는 것을 확인하였다(도 1, 2, 3 및 4).
특히, 30% 혈청 함유 줄기세포인 실험군 3은 144시간까지 98% 이상의 매우 높은 세포 생존율을 유지하였으며, 10~20% 혈청 함유 실험군에서도 72시간 이후까지 90% 이상의 생존율을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 자가혈청 실험군(도 1 및 2)과 타가혈청 실험군(도 3 및 4) 간에 세포의 보존 시간에 따른 생존율의 효과차이는 없는 것으로 나타났다.
따라서, 인간 혈청에 의한 줄기세포의 보관 안정성 증진은 144시간 이상의 장시간 생존율 유지가 가능하며, 자가혈청과 타가혈청의 효과에는 차이가 없음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (9)

  1. i) 줄기세포; ii) 5~80%(v/v) 혈청; 및 iii) 생리식염수, 하트만-D 용액 및 PBS로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하고, 피브리노겐 및 항응고제를 함유하지 않는, 냉장보관 안정성을 가지며 체내 투여가 가능한 줄기세포 치료제 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방, 제대혈, 골수, 근육, 태반 및 피부로 구성된 군에서 선택된 조직 유래인 것을 특징으로 하는 냉장보관 안정성을 가지며 체내 투여가 가능한 줄기세포 치료제 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 냉장보관 온도는 0.1~10℃인 것을 특징으로 하는 냉장보관 안정성을 가지며 체내 투여가 가능한 줄기세포 치료제 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 혈청의 함량은 10~50%(v/v)인 것을 특징으로 하는 냉장보관 안정성을 가지며 체내 투여가 가능한 줄기세포 치료제 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 알부민을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 냉장보관 안정성을 가지며 체내 투여가 가능한 줄기세포 치료제 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 알부민의 함량은 0.1~1%(v/v)인 것을 특징으로 하는 냉장보관 안정성을 가지며 체내 투여가 가능한 줄기세포 치료제 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 알부민의 함량은 0.2~0.5%(v/v)인 것을 특징으로 하는 냉장보관 안정성을 가지며 체내 투여가 가능한 줄기세포 치료제 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 함유하는 줄기세포의 체내 주입 또는 주사 제형.
  9. 제8항에 있어서, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성제, 희석제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 함황환원제, 산화방지제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 체내 주입 또는 주사 제형.
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