KR101594248B1 - Il-8이 처리된 줄기세포의 혈관신생 증가능 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IL-8이 처리된 줄기세포의 현저한 혈관신생 기능에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 IL-8이 처리된 중간엽줄기세포가 AKt 및 ERK를 인산화시키는 기작을 통해 VEGF의 분비를 촉진시키고, 혈관신생을 유도하여 뇌졸중 등의 허혈성 질환을 효과적으로 치료할 수 있는 용도에 관한 것이다.

Description

IL-8이 처리된 줄기세포의 혈관신생 증가능 및 이의 용도{An Enhancing Angiogenes of IL-8-treated Stem Cells and the Use thereof}

본 발명은 IL-8이 처리된 줄기세포의 현저한 혈관신생 기능에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 IL-8이 처리된 중간엽줄기세포가 VEGF의 생성을 촉진시키고, AKt 및 ERK를 인산화시키는 기작을 통해 혈관신생을 유도하여 뇌졸중, 심근허혈(myocardial ischemia) 및 척수손상(spinal cord injury) 등의 허혈성 질환을 효과적으로 치료할 수 있는 용도에 관한 것이다.

뇌졸중은 전세계적으로 사망원인 2위를 차지하는 중요한 질환이다. 뇌졸중의 85%는 혈관의 폐색으로 인한 뇌경색 형태로 오며 폐색의 주된 원인은 혈전의 형성, 심장이나 큰 혈관에서 기인한 색전이다. 혈관이 막히면 비가역적인 손상의 중심이 되는 허혈중심부(ischemic core)가 발생하고 여러 요인들에 의해 생존에 영향을 받는 허혈중심부 주변의 허혈반음영(ischemic penumbra)이 나타난다. 이후에 조직에서는 여러 기전들에 의해 괴사(necrosis)와 세포자멸사(apoptosis)가 발생한다.

기전을 요약해 보면 신경세포 이온채널의 붕괴로 인해 흥분성 신경전달물질인 글루탐산염(glutamate)이 방출되고 이로 인해 N-methyl-D-aspartate (NMDA) 수용체와 전압의존성 칼슘채널(voltage-dependent calcium channel, VDCC)을 통한 과도한 칼슘의 유입이 발생한다. 또한 DNA 손상에 대한 반응으로 nuclear protein poly (ADP-ribose) polymerase가 활성화 되어 NAD+의 세포내 농도가 감소하고 에너지 생산도 감소한다.

그러므로 재관류 즉 혈류의 빠른 복구가 뇌조직의 손상을 최소화시키는 최상의 방법이다. 뇌경색 주변부가 새로운 신경세포와 혈관이 생성되는 주요 부위가 된다. 이러한 내재된 신경생성(neurogenesis)은 신생세포(newborn cell)가 뇌경색 부위로 이주하고 필요한 형태로 분화하면서 증가되는데 혈관재형성(vascular remodeling)과도 연관된다. 이 과정에서 신경생성과 혈관생성(angiogenesis)은 신생 혈관에 의한 stromal-derived factor 1 (SDF1)과 angiopoietin 1 (Ang1)을 통해 밀접하게 연결되어 있다.

현재까지 뇌경색 환자의 급성기 치료로 공인된 유일한 치료법인 혈전용해술은 시간적 문제, 접근성의 문제 등으로 인해 전체 뇌졸중 환자의 3%에서만 적용이 가능한 것이 현실이다. 초기 뇌졸중 사망률은 8-50%로 나라마다 다양하며 생존하는 환자들은 재활치료에 기초한 기능적 회복을 도모하게 된다. 그러나 약 50%의 환자는 지속적인 기능적 장애를 겪게 되는데 이들 중 30%는 요양원에 입소하거나 비슷한 환경에서 생활하게 되며 약 20% 이상의 환자는 일상생활 영유에 보호자, 간병인 등의 도움이 필요하게 된다.

그러므로 뇌졸중 후 발생하는 신경학적 장애를 최소화하고 회복시킬 능력이 있는 복구능력과 재생능력을 갖춘 새로운 치료법이 반드시 필요한 실정이다.

최근에 뇌졸중으로부터 신경학적 회복을 증가시키기 위하여 줄기세포 치료를 실시하여 안전성과 효과를 증명하는 많은 보고들이 있다. 뇌졸중은 줄기세포 치료 대상으로 몇 가지 장점을 가지고 있다. 다른 신경계 질환과는 달리 하나의 국소적인 손상부위가 있어 직접적인 세포주입 목표점이 되고 질병의 안정화나 악화의 완화가 아니라 기능의 회복을 기대해 볼 수 있다는 점이다. 뇌졸중 동물연구 결과에 의하면 줄기세포 치료는 세포이식, 뇌조직으로의 분화유도, 기능적 호전 등의 재생능력을 발휘하고 있다.

그러나, 아직까지 줄기세포를 이용한 뇌졸중 환자의 치료는 초기단계에 있다. 줄기세포를 뇌졸중으로 인한 기능적 장애를 극복하기 위한 후보 치료법으로 본다면 아직 넘어야 할 과제가 많다. 또한 뇌졸중 이후 줄기세포의 투입시기, 방법, 세포의 종류, 세포수에 대한 연구가 더 필요하다.

이에, 본 발명자는 IL-8이 처리된 중간엽줄기세포가 VEGF의 생성을 촉진시키고, AKt 및 ERK를 인산화시키는 기작을 통해 혈관신생을 효과적으로 유도하는 메커니즘을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

1. KR 20100056318 A 2. KR 20100023715 A 3. US 20070059288 A1

1.Bederson JB, Pitts LH, Germano SM, Nishimura MC, Davis RL, Bartkowski HM. (1986) Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke 17:1304-1308. 2. Chen JL, Zhang ZG, Li Y, Wang L, Xu YX, Gautam SC, Lu M, Zhu ZP, Chopp M. (2003) Intravenous Administration of Human Bone Marrow Stromal Cells Induces Angiogenesis in the Ischemic Boundary Zone After Stroke in Rats. Circulation Research 92:692-699. 3. Deng YB, Ye WB, Hu ZZ, Yan Y, Wang Y, Takon BF, Zhou GQ, Zhou YF. (2010) Intravenously administered BMSCs reduce neuronal apoptosis and promote neuronal proliferation through the release of VEGF after stroke in rats. Neurological Research 32:148-156. 4. Fresno Vara JA, Casado E, de Castro J, Cejas P, Belda-Iniesta C, Gonzalez-Baron M. (2004) PI3K/Akt signalling pathway and cancer. Cancer Treatment Reviews 30:193-204. 5. Glynn PC, Henney E, Hall IP. (2002) The selective CXCR2 antagonist SB272844 blocks interleukin-8 and growth-related oncogene-alpha-mediated inhibition of spontaneous neutrophil apoptosis. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics 15:103-110. 6. Grau AJ, Reis A, Buggle F, Al-Khalaf A, Werle E, Valois N, Bertram M, Becher H, Grond-Ginsbach C. (2001) Monocyte function and plasma levels of interleukin-8 in acute ischemic stroke. Journal of the Neurological Sciences 192:41-47. 7. Herrmann JL, Weil BR, Abarbanell AM, Wang Y, Poynter JA, Manukyan MC, Meldrum DR. (2011) IL-6 and TGF-α costimulate mesenchymal stem cell vascular endothelial growth factor production by ERK-, JNK-, and PI3K-mediated mechanisms. Shock 35:512-516 8. Jain KK. (2009) Cell therapy for CNS trauma. Molecular Biotechnology 42:367-376.

본 발명은 IL-8을 처리한 줄기세포의 유난히 현저한 VEGF의 생성능 및 관련 메커니즘에 관한 것으로, 본 발명의 주된 목적은 VEGF의 생성능을 향상시키는, IL-8 처리한 줄기세포를 함유하는 허혈성 질환 치료 및 예방용 조성물 및 이의 이용한 허혈성 질환의 치료방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해, IL-8이 처리된 줄기세포, 바람직하게는 중간엽줄기세포가 VEGF의 생성을 촉진시키면서 나아가 AKt 및 ERK의 인산화 또한 촉진시킴으로써 혈관신생의 촉진을 유도함을 규명한 메커니즘의 이용을 제공한다.

이 때, 상기 IL-8 처리는 줄기세포의 생존능 및 분화능에는 영향을 끼치지 않으면서 VEGF의 생성 및 AKt와 ERK를 인산화를 촉진시킴으로써 혈관 신생을 유도하는 것을 특징으로 한다.

구체적인 일 례로서, 본 발명의 IL-8이 처리된 줄기세포를 함유하는, 허혈성 뇌질환 치료 및 예방용 세포 치료제를 제공한다. 상기 허혈성 뇌질환은 뇌졸중인 것을 가장 바람직하다.

이 때, 상기 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 지방 유래, 혈액 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래, 신경 유래, 부신 유래, 상피 유래 및 자궁 유래의 인간조직 성체 줄기세포에서 선택되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 이들의 중간엽줄기세포에서 선택되는 것이다. 본 발명의 일 실시예에서는 골수 유래 중간엽줄기세포를 사용하였다.

또한, 이러한 줄기세포에 대하여 IL-8는 약 150~250 ng/ml 농도로 약 1~3일 동안 처리되는 것이 바람직하다.

이 밖에도, 본 발명은 IL-8를 처리한 줄기세포의 유난히 현저한 혈관신생 능력을 이용하는 다른 용도도 제공할 수 있다.

본 발명은 IL-8을 처리한 줄기세포의 현저한 VEGF의 생성능과 관련된 메커니즘을 이용하는 것으로, IL-8을 처리한 줄기세포는 AKt 및 ERK를 인산화촉진 신호 경로에 관여함으로써 VEGF의 생성 및 이에 따른 혈관신생을 촉진시킨다. 그러므로, 본 발명은 줄기세포에 특정 사이토카인 IL-8의 처리의 간단한 방법으로 매우 효과적으로 혈관신생을 유도함으로써 뇌졸중 등의 허혈성 뇌질환치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 IL-8 처리된 hBM-MSCs에서 VEGF 발현 및 생성을 웨스턴 블럿(A) 및 ELISA(B)로 확인한 결과이다.
도 2는 hBM-MSCs에서의 IL-8 영향을 확인한 결과로서, IL-8 처리에 따른 hBM-MSCs 생존능 및 분화능을 비교한 결과이다.
도 3은 hBM-MSCs에서 IL-8-유도된 VEGF 생성에 관여하는 PI3K/Akt 및 MAPK/ERK 신호 경로를 확인하기 위한 각 저해제의 영향(A), hBM-MSCs에서 Akt, ERK, p38, 및 JNK 녹다운의 웨스턴 블럿 분석 결과(B) 및 IL-8 처리된 hBM-MSCs에 서Akt, ERK, p38, 및 JNK 녹다운의 영향을 확인한 결과이다.
도 4는 PI3K 및 ERK 저해제 존재 또는 부존재 처리 후 hBM-MSCs에서의 IL-8의 Akt 및 ERK 인산화(phosphorylation) 촉진능을 확인한 결과이다.
도 5는 IL-8-유도된 VEGF의 in vitro에서의 튜브 형성 능력을 관찰한 결과로서, MBECs의 혈관형성 능력을 확인한 결과이다.
도 6은 PI3K/Akt 및 MAPK/ERK 신호 변환 경로에 따른 IL-8-유도된 혈관형성 조절능을 확인한 결과이다[A:튜브 형성능, B:통계학적 분석 그래프]
도 7은 MCAO 랫트에서 병변 크기 상의 IL-8-처리된 hBM-MSCs의 영향에 대한 허혈 병변 볼륨을 TTC 염색에 의해 측정한 결과 및 이의 통계적 분석 결과이다.
도 8은 PKH26-표지된 IL-8-처리 hBMMSCs를 허혈성 뇌에 이식한 결과이다.
도 9는 뇌졸중 후 혈관형성에서 IL-8-처리 hBM-MSCs의 영향을 알아보기 위하여, 내피세포 마커 BrdU 및 CD31로 냉동 뇌조직을 이중 라벨링하여 내피 세포 증식을 관찰한 결과이다.

본 발명에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 랫트, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 바람직하게는 인간이다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 또는 "핵산(nucleic acid)"이라는 용어는 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 디옥시리보뉴클레오티드 등 온갖 길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미한다. 이 용어는 분자의 1차적 구조만을 의미하고, 따라서 이중 또는 단일 사슬의 DNA 또는 RNA를 의미한다.

"형질감염 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다.

"줄기세포(stem cell)"는 어떤 조직으로든 발달할 수 있는 세포를 의미한다. 기본적인 특징으로는 두 가지가 있는데, 우선 반복 분열하여 자신을 만들어 내는 자기 재생산(self-renewal), 그리고 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는다.

"(중)간엽줄기세포"는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 성체 줄기세포의 한 종류로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있다. 성체 줄기세포 중 조혈모세포는 주로 부유상태(non-adherent)로 존재하지만 간엽줄기세포는 주로 부착성 세포들이다. 특히, 제대 유래 간엽줄기세포, 제대혈 유래 간엽줄기세포, 골수 유래 간엽줄기세포, 지방 유래 간엽줄기세포, 근육 유래 간엽줄기세포, 신경 유래 간엽줄기세포, 피부 유래 간엽줄기세포, 양막 유래 간엽줄기세포 및 태반 유래 간엽줄기세포일 수 있다. 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.

"분화(differentiation)"라는 용어는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다.

"미분화성"은 줄기세포에서 적어도 1개 이상의 미분화 마커 또는 여러가지 항원 분자의 발현에 의해 확인할 수 있는 미분화한 상태를 나타내는 성질을 의미한다. 줄기세포의 미분화한 상태는 줄기세포가 거의 영구적으로 또는 장기간 세포 증식 가능하고, 정상적인 핵(염색체)형을 나타내며, 적당한 조건에서 3배엽의 모든 계보의 세포로 분화가능한 능력을 가진 상태를 의미한다.

"억제제 또는 저해제(inhibitor)"는 특정 유전자의 발현 또는 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 의미한다. 억제제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함한다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

"세포 치료제"는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 혹은 이종(xenogenic)의 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여러 가지 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방의 목적으로 사용하는 물질로, 세포의 종류 및 분화 정도에 따라 체세포치료제와 줄기세포 치료제로 나눌 수 있다. 본 발명은 줄기세포 치료제에 관한 것이다.

"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "함유하다" 및 "포함하다"란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 허혈성 질환의 치료 및 예방에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 허혈성 질환이란, 허혈성 세포사에 의해 매개되는 뇌허혈, 심장허혈, 당뇨병성 혈관심장질환, 심부전, 심근비대증, 망막허혈, 허혈성 대장염, 허혈성 급성 신부전증, 뇌졸중, 뇌외상, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 신생아 저산소증, 녹내장, 당뇨성 신경증 등을 포함한다. 이 중에서 바람직한 것은 허혈성 뇌질환, 예를 들어, 가장 바람직하게는 뇌졸증의 치료 및 예방에 관한 것이다.

뇌졸중은 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 또는 차단으로 뇌조직의 허혈상태로 발생하는 뇌허혈(ischemic stroke)과 혈관이 터져 뇌조직에서 출혈을 일으키는 뇌출혈(hemorrhagic stroke)의 두 가지로 크게 구분되며, 특히 뇌허혈은 전체 뇌졸중 환자의 약 80% 정도를 차지할 정도로 심각한 질환이다

본 발명은 상기 허혈성 뇌질환의 치료 및 예방을 위해 줄기세포를 이용하는 것을 특징으로 한다. 특히, 상기 줄기세포는 IL-8이 처리된 것을 주요한 특징으로 한다.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로서, 본 발명에서는 바람직하게는 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 자궁, 골수, 근육, 태반, 제대혈 또는 피부(상피) 등의 조직 유래 줄기세포를 사용할 수 있다. 특히, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)인 것이 바람직하다. 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 일반적으로 골수(bone marrow)에서 조혈작용을 돕는 지지세포(stroma)로서, 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포로 분화하는 능력을 지녔으며, 미분화상태를 유지하면서 쉽게 증식시킬 수 있는 특징이 있고, in vivo 수득 및 확장이 보다 용이하고, 이들 사용에 관련된 윤리적 문제가 거의 없는 장점이 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 골수 유래 MSCs를 사용하였다. 이러한 중간엽 줄기세포는 환자 자신으로부터 채취하거나 혈액은행의 데이터베이스를 이용하여 HLA(human leukocyte antigen) 타입이 일치되는 골수로부터 분리하여 사용함으로써 개체간의 면역거부반응을 최소화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 줄기세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다.

적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용가능한 배지를 사용할 수 있다. 상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 이스코브 변형된 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), 둘베코 변형된 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagles medium, DMEM), 알파 MEM (지브코, Gibco), RPMI 1640, 또는 임의의 기타 적절한 시판 배지를 포함한다. 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다.

본 발명의 "IL-8이 처리된 줄기세포"는 상기 배양된 줄기세포에 IL-8을 100~300 ng/ml의 농도로, 바람직하게는 150~250 ng/ml의 농도로 처리하여 제작할 수 있다. 또한 IL-8는 1~3일 동안 처리하는 것이 바람직하다.

Interleukin-8 (IL-8)는 CXC 케모카인들 중 하나로써 원래 호중구의 화학주화성 인자로, 다양한 자극원에 반응하여 백혈구뿐만 아니라 혈관내피세포와 섬유아세포에서 분비된다고 알려져 있다. 그리고 IL-8은 혈관내피세포에 존재하는 수용체에 작용하여 혈관내피세포의 이상을 초래하고 혈관염증과 혈관신생을 촉진시킨다고 한다. 또한 최근에는 IL-8이 혈관신생 초기단계에서 혈관내피세포의 투과성인자로 작용한다고 보고되었다(Biffl 등, 1995; Petreaca 등, 2007).

본 발명에서는, IL-8 단백질은 상용 또는 당업계에 공지된 IL-8을 암호화하는 염기서열을 가지는 임의의 핵산을 이용하여 발현시켜 이용할 수 있다. 이 때, 상기 핵산은 IL-8의 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, IL-8과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 IL-8과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다.

<메커니즘>

본 발명자들은 상기 IL-8이 처리된 줄기세포에 의한, 이하의 혈관 내피세포 성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 생성능 향상에 따른 혈관신생 촉진과 관련된 분자적 메커니즘을 규명하였다.

그러므로, 본 발명은 IL-8이 처리된 줄기세포, 바람직하게는 중간엽줄기세포가 VEGF의 생성을 촉진시키면서 나아가 AKt 및 ERK의 인산화 또한 촉진시킴으로써 혈관신생의 촉진을 유도함을 규명한 메커니즘 및 이의 이용에 관한 것이다.

(1) IL-8이 처리된 줄기세포는 VEGF의 생성을 촉진시킨다.

정상적인 뇌의 기능을 유지하기 위해서는 충분한 혈관신생(angiogenesis)에 의한 혈류공급이 필수적이다. 혈관신생(angiogenesis)은 단순한 혈관내피세포의 성장뿐 아니라 내피세포의 기저막 (basement membrane) 침투, 이동 (migration)과 분화 그리고 모세혈관 형성 등 다양하고 복잡한 일련의 과정이 필요하다.

가장 중요한 혈관신생 촉진인자는 혈관 내피세포 성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF)로서, 혈관내피세포 표면에 있는 수용체인 KDR/Flk-1에 붙어서 그 역할을 한다. VEGF는 32-44 kDa의 크기로 거의 모든 세포에서 분비되며, 혈관유출인자 (vascular permeablity factor)로서 히스타민(histamine)보다 50,000 이상의 강력한 혈액 유출 효과를 나타낸다(Senger et al., 1983). 이러한 혈액 유출에 대한 특성은 혈액 내의 단백질을 혈관 밖으로 이동시켜 새로운 혈관이 형성되는데 도움을 준다. VEGF의 수용체는 혈관 내피세포에 일반적으로 존재하지만 신경세포, Kaposi's sarcoma, 조혈모세포 등에서 발현되며, VEGFR-1 (flt-1), VEGFR-2 (Kdr/ flk-1), VEGFR-3 (flt-4) 등 3 종류가 보고되었다. VEGF가 결합되면 수용체 tyrosine 잔기의 인산화와 함께 수용체 이중화 (dimerization) 작용으로 신호가 전달된다. VEGFR-1는 내피세포의 이동, VEGFR-2는 내피세포의 성장과 혈액유출 효과를 나타낸다.

특히, 본 발명에서는 뇌졸중에 따른 뇌경색 부위에 VEGF의 생성 증가에 따른 신경생성과 혈관생성 부위가 나타나며, 이는 IL-8를 처리한 줄기세포에 내재된 기전 및 재생능력으로 설명된다.

줄기세포의 기능이 충분히 발휘되기 위해서는 줄기세포가 정확한 위치에 도착해야 하며 여러 케모카인(chemokine)들이 뇌경색 주변부로 줄기세포가 모이게 하고 줄기세포의 재생환경 개선작업을 가능하게 한다. 또한 뇌경색으로 인한 국소적 염증이 줄기세포를 끌어들이는 역할을 한다. 특히, 신경생성, 혈관생성이 활발히 일어나는 부위에서 혈관 신생에 필요한 여러 인자들이 관여하고 있다.

본 발명의 줄기세포에 대한 IL-8의 처리는 줄기세포의 생존능 및 분화능에는 아무런 부정적인 영향을 끼치지 않는다. 이를 본 발명의 일 실시예에서도 확인하였다.

즉, 본 발명의 IL-8의 처리는 의해 줄기세포가 가지는 재생환경 개선 능력은 영향을 받지않으면서, VEGF들의 생성증가를 유도한다.

(2) IL-8이 처리된 줄기세포는 PI3K/Akt 및 MAPK/ERK 신호 변환 경로를 통해 VEGF 생성을 유도한다.

여러 가지 신호전달물질들이 혈관형성에 관여하는 신호전달은 두 가지의 경로가 잘 알려지고 있다.

첫째는 phosphoinositol(PI)3-kinase/ Akt를 통하여 HIF-a을 활성화시키는 신호전달 과정이며 (Akagi et al., 1998), 두 번째는 Erk-1/2 혹은 P38 MAPK (mitogen-activated protien kinase)를 활성화함으로 VEGF 유전자 발현을 촉진한다 (Jung et al., 1999; 2001a).

본 발명의 "IL-8이 처리된 줄기세포"는 이러한 Akt 및 ERK 인산화(phosphorylation)를 유도함으로써 혈관형성 관여 신호전달을 활성화시키고, 이를 통해 VEGF 생성을 자극(촉진)하고 결과적으로 혈관 신생(angiogenesis)을 효과적으로 유도한다.

그러므로, 본 발명의 IL-8의 처리는 의해 줄기세포 자체가 가지는 재생능력은 영향을 받지 않으면서, Akt 및 ERK 인산화에 따른 PI3K/Akt 및 MAPK/ERK 신호 전달 경로를 활성화시키고, 혈관신생(angiogenesis)에 관여하는 VEGF의 분비증가를 유도하여 줄기세포자체의 혈관신생능(angiogenic potency)을 촉진하는 것이다.

<치료제>

상기 설명한 메커니즘의 발견에 기초하여, 본 발명은 IL-8를 처리한 줄기세포의 유난히 현저한 혈관신생 능력을 이용하는 모든 용도를 포함한다.

구체적인 일 용도로서, 본 발명은 L-8를 처리한 줄기세포를 함유하는, 허혈성 질환, 바람직하게는 허혈성 뇌질환, 가장 바람직하게는 뇌졸중에 대한 효과적인 세포 치료제 및 이의 용도를 제공한다.

본 발명의 치료제는 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제를 추가로 포함할 수 있다. "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 사람에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다

또한, 본 발명에 따른 치료제는 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 그 중에서도 상기 치료제는 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화하는 것이 바람직하며, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조제제)로 제형화할 수도 있다

본 발명의 치료제에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 치료제 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 무엇보다도, 치료대상 개체의 상태, 치료 대상 암의 특정한 카테고리 또는 종류, 투여 경로, 사용되는 치료제의 속성, 및 상기 특정한 치료제에 대한 뇌졸중 감수성에 의존적일 것이다

본 발명의 치료제는 원하는 조직 부위로 직접 이식하거나 이동하는 방식으로 투여되어, 기능적으로 결핍된 부위를 재구성하거나 재생한다. 바람직하게는 허혈성 뇌질환, 예를 들어 뇌졸중 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

공지의 방법에 따라 환자의 생체 내로 주입될 수 있는데, 예를 들어 뵈클룬트와 스테네비(Bjorklund and Stenevi, Brain Res. 177, 555-560(1979)) 또는 린드발 등(Lindvall et al., Arch. Neurol. 46, 615-31(1989))이 발표한 임상 방법을 이용할 수 있다.

1회 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 증감이 가능하다.

본 발명의 치료제는 활성 성분인 중간엽 줄기세포를 특히 환자 자신의 골수에서 채취하는 경우에는 이식 후 면역거부반응이 전혀 없으며, 혈액은행의 HLA 타입이 일치되는 골수로부터 얻는 경우에도 면역거부반응이 거의 없으므로, 치료가 완료될 때까지 지속적인 투여가 가능하다. 또한, 중간엽줄기세포는 발암유전자를 사용하지 않아도 대량배양이 가능하며, 환자이식에 필요한 충분한 양으로 얻을 수 있는 장점이 있다.

이 밖에도, 본 발명은 IL-8를 처리한 줄기세포의 유난히 현저한 혈관신생 능력을 이용하는 다른 용도를 제공할 수 있다.

이처럼, 본 발명에 따른 IL-8를 처리한 줄기세포, 바람직하게는 IL-8를 처리한 중간엽 줄기세포를 이용하여 VEGF의 생성을 촉진시키고, AKt 및 ERK를 인산화시키는 기작을 통해 혈관신생을 유도하여 허혈성 질환의 치료의 용도로 다양하게 활용할 수 있을 것이다.

<실시예>

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

재료 및 방법

1. 세포 배양 및 시약

hBM-MSCs를 Lonza (Walkersville, IN, USA)로부터 구입하고 세포들을 녹여 배양하였다. 마우스 뇌 내피세포(Mouse brain endothelial cells, MBECs)를 ATCC (Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 내피세포 성장 배지에서 배양하였다. 모든 세포들을 5% CO₂ 함유 습한 대기에서 37℃ 하 배양하였다.

재조합 인간 IL-8을 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터, Neutralizing VEGF 항체는 Abcam (Cambridge, MA, USA)로부터 구입하였다. 성장인자 감소된 기저막 매트릭스(Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix)는 BD Biosciences (San Jose, CA, USA)로부터 구입하고, PI3K 저해제 LY294002, MAPK/ERK 저해제 PD098059 및 JNK(c-jun N-terminal kinase) 저해제 SP600125는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서, p38/MAPK 저해제 SB203580는 Calbiochem (La Jolla, CA, USA)에서 구입하였다

2. 생존율 및 특성

hBM-MSCs를 24-웰 플레이트(8 × 10³/well)에 씨딩하고, 용량 및 시간 의존적으로 IL-8 hBMMSC-특이적 세포독성을 MTT분석(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium)(Sigma)에 의해 테스트하였다.

hBM-MSCs의 지방 또는 골 형성 계통으로의 분화가 IL-8 존재 또는 부존재에 따라 유도되는 것은 이미 보고되어 있다(Pittenger et al, 1999). IL-8 (200 ng/ml) 존재 또는 부존재하는 유도 배지에서 배양하여 3-4 주 후, 분화된 세포들을 10% 포름 알데하이드로 고정시켰다. 0.3% Oil Red O 염색법을 이용하여 10분 동안 세포에서 리피드 액적을 염색함으로써 지방세포들을 검출하였다. 20분 동안 0.2% Alizarin Red S 염색법을 이용하여 칼슘 포스페이트 침착(deposit)에 의해 골세포들을 검출하였다.

3. ELISA 분석( Enzyme - linked immunosorbent assay )

R&D Systems (Madison, WI, USA)의 상용 키트를 이용하여 VEGF 생성을 ELISA에 의해 확인하고, 3회 세척 후 컨쥬게이트된 항체를 플레이트에 첨가하여 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 기질 용액의 첨가 및 상온에서 30분 배양을 수행하였다. 스탑 솔루션으로 상기 반응을 최종적으로 정지시키고, 각 웰의 흡광도를 450nm에서 마이크로플레이트 리더기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.

4. 저해제 실험

컨플루언스 70%에 도달한 후, hBM-MSCs를 24-웰 플레이트에 씨딩하고(2 × 10⁴ cells/well), 세포들을 다음의 시약들로 48시간 동안 처리하였다: (a) 대조군으로 hBM-MSCs 성장 배지; (b) 촉진제 IL-8 단독; (c) 촉진제 + 저해제: PD098059 (50 μM); LY294002 (10 μM); SB203580 (20 μM); SP600125 (10 μM); (d) 저해제 단독. 저해제의 용량은 공지 문헌의 데이터를 참고하였다(Wang et al., 2008; Herrmann et al., 2011). 처리 48시간 후 상청액을 회수하였다

5. RNA 간섭 실험

인간 ERK, p38, Akt, JNK에 대한 siRNA 및 대조군 siRNA를 Cell Signaling Technology로부터 구입하였다. hBM-MSCs를 70% 컨플루언스까지 배양하고 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)을 이용하여 siRNA duplex로 트랜스펙션(형질감염)시켰다. 트랜스펙션 18시간 후, 상기 세포들에 IL-8를 48시간 동안 처리하고, 상청액 및 세포들을 수거하여 VEGF 농도 및 트랜스펙션 효율을 각각 확인하였다.

6. 웨스턴 블럿 분석

세포 단백질을 10% 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS?PAGE)에 의해 분해하고, β-actin (Sigma), VEGF, ERK, phospho-ERK, Akt, 및 phospho-Akt (Cell Signaling)에 대한 각각의 일차 항체와 함께 배양한 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인들을 계속해서 HRP(horseradish peroxidase)-컨쥬게이트된 이차 항체들(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)과 함께 배양하고, Amersham ECL detection reagents (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)을 이용하여 밴드들을 검출하였다..

7. 매트릭스 겔 상 혈관형성 분석( Angiogenesis assay )

겔을 96-웰 플레이트에서 37℃ 하 30분 동안 폴리머화시켰다. MBECs를 2 × 10⁴/well로 씨딩하고 다음과 같은 상이한 배지에서 성장시켰다: (a) 내피 세포 기저 배지(endothelial cell basal medium); (b) hBMMSCs 성장 배지; (c) hBM-MSCs 상청액; (d) IL-8-처리된 hBM-MSCs 상청액; 및 (e) IL-8-처리된 hBM-MSCs 상청액 + VEGF neutralizing 항체.

18 시간 후, 광학 현미경으로 튜브 형성이 관찰되었고, 분석을 위해 각 샘플의 상이한 영역으로부터, 컴퓨터 시스템으로 ×100 대물 렌즈 하 4개의 사진을 캡쳐하였다. 모든 이미지들을 MetaMorph software version 7.5 (Molecular Devices)을 이용하여 컴퓨터 상에서 확인하였다.

8. 허혈성 동물 모델 및 실험군

모든 동물 프로토콜들은 가톨릭 의과 대학 실험 동물 운영위원회의 승인을 받았다. 일시적 MCAO(middle cerebral artery occlusion, 중간대뇌동맥)를 공지문헌(Longa et al., 1989)의 다소의 변경에 의해 유도하였다. 간단히 말하면, 오른쪽 CCA(common carotid artery, 총경동맥), ECA(external carotid artery, 외부 경동맥), 및 ICA(internal carotid artery, 내부 경동맥)를 복부 정중선 절개를 통해 노출시키고, 라운드 팁(rounded tip)을 구비한 4-0 나일론 단일 필라멘트 봉합선을 CCA 루멘에 도입하고 MCA(middle cerebral artery)의 갈라짐(bifurcating origin)이 블로킹될때까지 부드럽게 ICA로 나아갔다. 발병 2시간 후 상기 팁들을 제거하였다.

수술 후 24시간 후, 18 랫트들을 임의로 3그룹으로 나누었다: PBS (20 μl, LP(lumbar puncture)에 의한 척추관(intrathecal) 주사, n = 6), hBM-MSCs (각 랫트 당 20 μl PBS 중 1.0 × 10⁶ cells, LP에 의한 척추관 주사 n = 6), IL-8-처리된 hBM-MSCs (각 랫트 당 20 ul PBS 중 1.0 × 10⁶ cells, LP에 의한 척추관 주사, n = 6). BrdU(Bromodeoxyuridine) (Sigma)를 세포 이식 후 연이어서 복강 내 투여하였다.

9. 경색 볼륨의 염색 및 정량 분석

세포 투여 후 14일째 랫트들을 희생시키고, 신선한 뇌를 제거하고 설치류 뇌 매트릭스(rodent brain matrix)를 이용하여 4개의 같은 크기의(2mm) 코로나 블록으로 구획화하였다. 각 절편들을 2% 2,3,5-트리페닐테트라졸리움(triphenylterazolium, TTC)으로 30분 동안 37℃에서 염색하였다. 염색되지 않은 부분은 경색 부위(infarcted area)로 간주하였다(Bederson et al., 1986). 각 슬라이스에 대한 총 경색 볼륨을, MetaMorph 소프트웨어, 버전 7.5(Molecular Devices)를 이용하여 모든 뇌 슬라이스의 경색 부위 합에 의해 계산하였다.

10. 이중-표지 면역형광분석( Double - Labeling immunofluorescence )

세포 이식 14일 후, 상기 3그룹으로부터의 냉동 뇌 절편들을 수집하여 다음과 같은 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다: 단클론 마우스 항-BrdU (Dako, Glostrup, Denmark), 다클론 래빗 항-CD31 (Chemicon International Temecula, CA, USA). 일차 항체는 항-마우스 Cy3-컨쥬게이트된 항-마우스 항체(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), Alexa 488-컨쥬게이트된 항-래빗 항체(Invitrogen)로 가시화하였다.

면역반응성의 특이성은 일차 또는 이차 항체들을 생략한 절편에서 면역조직화학 반응의 부재에 의해 확인하였다. 모든 절편에서, 4-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; Roche, Penzberg, Germany)로 10분 동안 절편을 배양함으로써 세포 핵의 대조염색을 실시하였다. 모든 이미지들을 LSM 700 공초점 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 수득하였다. .

11. 통계학적 분석

값들은 평균(mean)±SE로 나타냈다. 저해재 및 siRNA 실험에서 VEGF 생성에 대한 통계학적 분석은 Tukeys post hoc test에 따른 by two-way ANOVA로 수행하였다. 형질도입 경로의 인산화 및 튜브 형성은, 대조군 및 다양한 처리 실험군에 대해 Bonferroni post hoc test에 따른 one-way ANOVA에 의해 비교하였다. 전체 튜브 길이는 사진의 대물 확대 비율 하 단일 엣지의 합으로 표시하였다. in vivo 데이터는, 각 그룹간의 모든 통계학적 비교를, post-hoc Bonferroni corrections로 one-way ANOVA를 이용하여 수행하였다. p < 0.05인 경우 통계학적으로 유의미한 것으로 간주한다.

실시예 1: hBM - MSCs 에서 IL -8의 VEGF 생성 자극 확인

IL-8 (0-200 ng/ml) 처리된 hBM-MSCs에서 VEGF 발현 및 생성을 웨스턴 블럿 및 ELISA로 각각 검출하였다.

IL-8 용량 의존적으로 VEGF 발현을 증가시켰다. VEGF 생성은 낮은 농도의 IL-8 (25 or 50 ng/ml)로 자극하였을 때 경미하게 증가하였고, 고농도(100 ng/ml)에 노출시킨 세포에서 현저하게 증가되었다. 그리고 200 ng/ml (p < 0.05, 도 1 A)로 자극되었을 때 가장 크게 증가하였다. IL-8 또한 hBM-MSCs에서 시간 의존적 방법(p < 0.05, 도 1 B)으로 VEGF 발현 및 생성을 증가시켰다.

IL-8는 세포가 200 ng/ml 용량으로 72시간에 노출될 때까지 hBM-MSC 생존력에 영향을 끼치지 않았다(도 2 A). 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 200 ng/ml의 IL-8 농도 및 이어지는 실험동안 48시간의 처리시간을 선별하였다. 이렇게 선별된 IL-8 농도는 hBM-MSCs가 지방 또는 골 형성 계통으로 분화하는 능력에 영향을 주지 않았다(도 2 B).

실시예 2: hBM - MSCs 에서 IL -8-유도된 VEGF 생성에 관여하는 PI3K / Akt 및 MAPK / ERK 신호 경로

hBM-MSCs에서 IL-8-유도된 VEGF 생성 메커니즘을 알아보기 위하여, 본 발명자들은 여러 가지 신호 경로의 블로킹을 포함하는 실험을 수행하였다.

IL-8-유도된 VEGF 생성은 PI3K (LY294002), ERK (PD098059), p38 (SB203580), 및 JNK (SP600125)의 저해에 의해 약화되었다. 대조적으로, ERK, p38, 및 JNK의 저해는 기저 VEGF 생성을 현저하게 억제하였다(p < 0.01, 도 3 A). Tukeys post hoc test에 의한 Two-way ANOVA는 PI3K 및 ERK 억제가 IL-8-유도된 VEGF 생성을 현저히 약화시킴을 보여주었다(p < 0.01), 반면, p38 및 JNK 억제는 hBM-MSCs에서 IL-8-유도된 VEGF 생성을 감소시키지 않았다.

이러한 데이터들은 PI3K 및 ERK 신호 변환 경로가 hBM-MSCs에서 IL-8-유도된 VEGF 생성에 관여하는 것; 및 PI3K, ERK, 및 P38 신호 변환 경로가 hBM-MSCs에서 자가분비(autocrine) 생성에 관여함을 시사한다.

hBM-MSCs에서 VEGF 생성 상 IL-8의 효과에 관여하는 신호 변환 경로를 확인하기 위해, 본 발명자들은 추가로 hBM-MSCs를 Akt, ERK, p38, 및 JNK에 대한 siRNA로 형질감염시켰다.

그 결과, 상기siRNA는 Akt, ERK, p38, 및 JNK 단백질을 하향조절하였고(도 3 B), 저해제와 같은 유사한 VEGF 생성 패턴을 보였다(도 3 C).

이러한 결과들은 hBM-MSCs에서 IL-8 이 PI3K/Akt 및 MAPK/ERK 신호 변환 경로를 통해 VEGF 생성을 유도함을 시사한다.

실시예 3: hBM - MSCs 에서 IL -8의 Akt 및 ERK 인산화( phosphorylation ) 유도능 확인

PI3K/Akt 및 MAPK/ERK 신호 활성에서 IL-8의 영향을 확인하기 위해, PI3K 및 ERK 저해제 존재 또는 부존재 처리 후 hBM-MSCs에 2시간 동안 IL-8를 처리하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 것처럼, IL-8 자극은 Akt 및 ERK 인산화를 증가시켰다. PI3K 저해제(LY294002) 또는 ERK 저해제(PD098059)의 처리는 이러한 인산화를 방지한다(p < 0.05, 도 4).

이러한 결과들은 IL-8이 PI3K/Akt 및 MAPK/ERK 신호 변환 경로를 활성화시켜 hBM-MSCs에서의 VEGF 생성을 자극(촉진)함을 추가로 증명해준다.

실시예 4: 매트리겔 ( Matrigel ) 상 IL -8-유도된 VEGF 의 MBECs 의 혈관형성능 증가 확인

매트리겔 상 내피세포에 의한 모세혈관-유사 튜브의 형성은 혈관생성을 촉진 또는 저해하는 다양한 인자들을 스크리닝하는데 중요한 방법이다 (Ponce, 2009; Muramatsu et al., 2013). 이에, 이러한 방법을 본 발명자들도 튜브 형성 분석을 수행하여 hBM-MSCs에서 VEGF의 측분비 생성 상의 IL-8 영향을 가시화하였다.

그 결과, 매트리겔 상 배양된 MBECs는 혈청이 없는 기저 배지에서 튜브를 형성하지 않았다(데이터 도시 않음).

그러나, 대조적으로, MBECs는 hBM-MSC 성장 배지에서 튜브를 형성하였다(도 5 A, a). 상기 튜브는 성장 배지와 비교하여 hBM-MSC 상청액에서 현저히 더 길게 나타났다(p <0.05, 도 5 A의 b 및 도 5 B). 또한, 튜브 길이는 hBM-MSC 상청액과 비교하여 IL-8-처리된 hBM-MSC 상청액에서 현저히 증가하였다 (p < 0.05, 도 5 A의 c 및 도 5 B). 그리고, IL-8의 이러한 유도 효과는 VEGF-neutralizing 항체에 따라 크게 감소하였다 (p < 0.05, 도 5 A의 d 및 도 5 B).

이러한 결과는 IL-8-처리된 hBM-MSCs가 손상된 조직에서 혈관형성을 증가시키고 기능적 회복을 촉진시킴을 시사한다. 또한. IL-8-유도된 혈관형성에 PI3K/Akt 및 MAPK/ERK 신호 변환 경로가 관여함을 보여준다 (도 6).

실시예 5: IL -8-처리된 hBM - MSCs 의 투여에 따른 뇌졸증 후 경색 부위 감소

MCAO 랫트에서 병변 크기 상의 IL-8-처리된 hBM-MSCs의 영향을 알아보기 위하여, 허혈 병변의 크기를 TTC 염색에 의해 측정하여 도 7 A에 도시하였다.

도 7에 나타난 바처럼, hBM-MSC 처리는 PBS 처리군과 비교하여 경색 볼륨을 현저히 감소시켰다(p < 0.05). 또한, IL-8-처리된 hBM-MSCs의 투여는 hBM-MSC 처리군과 비교하여 상당히 경색 볼륨을 감소시켰다(p < 0.05, 도 7 B).

한편, LP에 의한 MSCs의 척추강 내 이식(intrathecal transplantation)은 뇌손상의 치료를 위한 유용하고 실현가능한 형태이므로(Lim et al., 2011), 본 발명자들도 PKH26-표지된 IL-8-처리 hBMMSCs를 허혈성 뇌에 이식한 결과를 도 8에 도시하였다. 이를 통해서도 마찬가지로, IL-8-처리 hBMMSCs를 허혈성 뇌에 이식하면 경색 볼륨을 감소시키는 치료효과가 있음을 확인하였다.

실시예 6 : IL -8-처리 hBM - MSCs 의 뇌졸증 후 혈관형성 증가능 확인

뇌졸중 후 혈관형성에서 IL-8-처리 hBM-MSCs의 영향을 알아보기 위하여, 내피세포 마커 BrdU 및 CD31로 냉동 뇌조직을 이중 라벨링하고, 내피 세포 증식을 검출하였다.

그 결과, 허혈 영역에서 이중-라벨링된 세포 수는 hBM-MSCs 단독 처리군 및 PBS-처리군과 비교하여, IL-8-처리 hBM-MSCs로 처리한 그룹에서 현저히 높게 나타났다(p <0.05, 도 9 B 및 C).

이러한 결과들은 IL-8-처리 hBM-MSCs이 손상 조직에서 혈관형성을 증가시킬 수 있음을 시사한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

1. IL-8이 처리된 골수 유래 중간엽줄기세포를 함유하는, 허혈성 뇌질환 치료 및 예방용 세포 치료제.
2. 제1항에 있어서,
   상기 IL-8의 처리는 줄기세포의 생존능 및 분화능에는 영향을 끼치지 않으면서 VEGF의 생성 및 AKt와 ERK를 인산화를 촉진시킴으로써 혈관 신생을 유도하는 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌질환 치료 및 예방용 세포 치료제.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 IL-8은 150~250 ng/ml 농도로 줄기세포에 처리되는 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌질환 치료 및 예방용 세포 치료제.
6. 제1항에 있어서,
   상기 IL-8은 1~3일 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌질환 치료 및 예방용 세포 치료제.
7. 제1항에 있어서,
   상기 허혈성 뇌질환은 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌질환 치료 및 예방용 세포 치료제.

Images