KR101578994B1 - Carbon Nanotube-Antibody Conjugate and Detection of Target Substances Using the same - Google Patents

Abstract

항체의 인식을 위한 합텐 작용기와 수성 환경에 탄소 나노튜브를 분산하기 위한 작용기를 갖춘 변형 덱스트란, 이 변형 덱스트란이 탄소 나노튜브와 회합한 작용기화 나노튜브, 이 작용기화 나노튜브에 표적 물질과 전술한 합텐 작용기를 인식할 수 있는 이중 특이적 항체가 결합한 탄소 나노튜브-항체 접합체를 개시한다. 아울러 이러한 탄소 나노튜브-항체 접합체를 이용한 표적 물질의 검출 방법을 개시한다. 본 발명의 탄소 나노튜브-항체 접합체는 항체의 배향 제어와 밀도 조절이 가능하고 라만 분광법, 근적외선 광발광, 표면 플라스몬 공명 등의 분석법으로 표적 물질에 대한 특이적 결합을 검출할 수 있다. 이러한 본 발명의 탄소 나노튜브-항체 접합체는 표적 물질의 검출 및 물질 전달, 의료 등의 분야에 쓰일 수 있다.A modified dextran having a functional group for dispersing carbon nanotubes in an aqueous environment, a functionalized nanotube in which the modified dextran is associated with a carbon nanotube, a target substance in the functionalized nanotube, Discloses a carbon nanotube-antibody conjugate in which a bispecific antibody capable of recognizing the above-mentioned hapten function is bound. In addition, a method for detecting a target substance using such a carbon nanotube-antibody conjugate is disclosed. The carbon nanotube-antibody conjugate of the present invention is capable of controlling the orientation of the antibody and controlling the density thereof, and can detect specific binding to the target substance by an assay such as Raman spectroscopy, near infrared ray photoluminescence, and surface plasmon resonance. Such a carbon nanotube-antibody conjugate of the present invention can be used in the fields of detection of target substances, mass transfer, and medical treatment.

Description

탄소 나노튜브-항체 접합체와 이를 이용한 표적 물질 검출{Carbon Nanotube-Antibody Conjugate and Detection of Target Substances Using the same}Carbon Nanotube-Antibody Conjugate and Target Substance Detection Using the Carbon Nanotube-Antibody Conjugate and Detection of Target Substance Using the Same

본 발명은 생물나노소재 분야의 발명이다. 보다 상세하게 본 발명은 탄소 나노튜브와 항체를 이용한 생나노접합체(bionanoconjugate)와 이를 이용한 표적 물질의 검출에 관련된 것이다. The present invention is an invention in the field of biological nanomaterials. More specifically, the present invention relates to a bioanoconjugate using a carbon nanotube and an antibody, and detection of a target substance using the bioanoconjugate.

기능성 나노물질은 독특하고 조정할 수 있는(tunable) 속성 때문에 생물학과 의학 분야에서 감지와 영상화를 위한 기반 물질로 부각되고 있다. 표적 분자의 선택적 탐지를 위한 인식력을 나노물질에 부여하기 위해서는 항체, 펩티드, DNA와 같은 친화성 생체 분자를 나노물질의 표면에 접합하는 것이 필수적이다. 이 경우에, 나노물질 생체 접합체(bioconjugate)의 결합 효율을 최대화하기 위하여 나노물질당 농도, 방향 및 나노물질 인터페이스의 분리 거리를 조절하여 인식용 생체 분자를 붙이는 것이 중요하다.Functional nanomaterials are emerging as the basis for sensing and imaging in biology and medicine due to their unique and tunable nature. In order to impart the recognition ability to the nanomaterial for the selective detection of the target molecule, it is essential to bond an affinity biomolecule such as an antibody, a peptide, or DNA to the surface of the nanomaterial. In this case, in order to maximize the binding efficiency of the bioconjugate, it is important to attach the biomolecule for recognition by controlling the concentration, direction and separation distance of the nanomaterial interface per nanomaterial.

탄소 나노튜브는 형상비(길이/지름의 비)가 매우 크고, 기계적 강도와 전기적 특성이 우수하고 광학적 성질도 뛰어나기 때문에 바이오센서 및 영상화에 응용하는데 이상적인 나노물질로 여겨지고 있다. 그러나 탄소 나노튜브의 인터페이스에서 항체 등의 인식용 생분자를 접합함에 있어서 분자 규모에서 접합체를 설계하는 것은 그 중요성에도 불구하고 세심한 관심을 받지 못했는데, 탄소 나노튜브에 단백질을 접합하는데 알려진 가장 일반적인 방법은 카르보디이미드 화학(carbodiimide chemistry)이다. 카르보디이미드 화학에서는 항체 등의 단백질의 아미노기와 나노튜브 카르복시기 사이에 아미드 결합을 만든다. 그러나 이 방법은 탄소 나노튜브 표면 단백질 리간드의 방향과 농도를 조절할 수 없어, 표적 물질에 분자에 대한 유효 결합 친화력을 높이는데 한계가 있다. Carbon nanotubes are considered nanomaterials that are ideal for applications in biosensors and imaging applications because of their extremely large aspect ratio (length / diameter ratio), excellent mechanical and electrical properties, and excellent optical properties. However, despite the importance of designing conjugates at the molecular scale in joining recognition biomolecules such as antibodies at the carbon nanotube interface, they have not received close attention. The most common method known for conjugating proteins to carbon nanotubes Carbodiimide chemistry. In carbodiimide chemistry, an amide bond is formed between the amino group of a protein such as an antibody and the nanotube carboxyl group. However, this method can not control the direction and concentration of the carbon nanotube surface protein ligand, and there is a limitation in increasing the effective binding affinity to molecules in the target substance.

요컨대 이 분야에서는 탄소 나노튜브에 생분자를 접합할 때 접합체 분자 수준에서 충분한 제어가 부족하였기 때문에 높은 친화력과 성능을 지니는 생나노접합체에 대한 수요를 만족시키지 못하고 있는 실정이다.In short, in this field, when a biomolecule is bonded to carbon nanotubes, sufficient control at the level of the conjugate molecule is insufficient, and therefore, the demand for biosynthetic conjugates having high affinity and performance is not satisfied.

본 발명의 기술적 과제 중 하나는 탄소 나노튜브와 항체를 포함한 나노소재 생분자 접합체와 이러한 접합체를 이용한 표적 물질의 검출 방법 및 영상화 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 기술적 과제 중 다른 하나는 이러한 나노소재 생분자 접합체로서 구성 요소의 모듈식 설계가 가능하고, 나노미터 규모에서 접합체의 항체 배향과 밀도를 제어할 수 있는 접합체를 제공하는데 있다.One of the technical problems of the present invention is to provide a nanomaterial biomolecule conjugate including a carbon nanotube and an antibody, and a method of detecting and imaging a target substance using such a conjugate. Another of the technical problems of the present invention is to provide a conjugate capable of modular design of components as nanomaterial biomolecule conjugates and capable of controlling antibody orientation and density of the conjugate on a nanometer scale.

전술한 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 한 측면에서는 변형 덱스트란을 제공한다. 본 발명의 변형 덱스트란은 천연 덱스트란을 구성하는 글루코스 단위의 수산기 중 일부가 두 개의 기능성 작용기로 변형된 것이다. 이 기능성 변형 중 하나는 -OH를 -OCH₂CHOHCH₂OAr의 작용기로 치환하는 것이다. 여기서 Ar는 탄소 나노튜브와 π-π 상호작용을 일으킬 수 있는 아릴기이다. 상기 기능성 변형 중 다른 하나는 -OH를 -OAng로 치환하는 것이다. 여기서 Ang는 분자량이 0.1~5 kDa인 소형 유기 분자 부위로서, 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 합텐이다. 본 발명의 변형 덱스트란에서 전술한 변형 작용기를 하나 이상 포함하는 변형된 글루코스 단위들과 미변형 글루코스 단위들을 합한 총수는 30~90이다. 여기서 변형 덱스트란 단위 무게에 대하여 -OCH₂CHOHCH₂OAr 기능성 변형 작용기가 차지하는 비율은 0.5~5 mmol/g이고, -OAng 기능성 변형 작용기가 차지하는 비율은 0.1~1 mmol/g이다.In order to solve the above-mentioned technical problems, one aspect of the present invention provides a modified dextran. In the modified dextran of the present invention, a part of the hydroxyl groups of the glucose unit constituting the natural dextran is modified into two functional groups. One of these functional modifications is to replace -OH with the functional group of -OCH ₂ CHOHCH ₂ OAr. Here, Ar is an aryl group which can cause a π-π interaction with carbon nanotubes. Another of the functional variants is to replace -OH with -OAng. Here, Ang is a small organic molecule moiety having a molecular weight of 0.1-5 kDa, which is a hapten capable of specifically binding to an antibody. The total number of modified glucose units and unmodified glucose units comprising at least one of the above-mentioned modified functional groups in the modified dextran of the present invention is 30-90. Here, the ratio of -OCH ₂ CHOHCH ₂ OAr functional functional groups to modified dextran units is 0.5 to 5 mmol / g, and the proportion of -OAng functional functional groups is 0.1 to 1 mmol / g.

본 발명 변형 덱스트란의 한 실시 형태에서는 상기 Ar이 페닐이다. 본 발명 변형 덱스트란의 다른 실시 형태에서는 -OAng가 트랜스-4-코티닌카르복시(trans-4-cotininecarboxy)이다.In one embodiment of the modified dextran of the present invention, Ar is phenyl. In another embodiment of the present invention is a modified dextran -OAng the trans-4-carboxy cotinine (trans -4-cotininecarboxy).

본 발명의 다른 측면에서는 전술한 변형 덱스트란이 탄소 나노튜브의 길이 방향을 따라 감겨 있거나 대체로 평행하게 회합(會合 association)하고 있는 작용기화 탄소 나노튜브를 제공한다. 본 발명의 작용기화 탄소 나노튜브를 구성하는 변형 덱스트란과 탄소 나노튜브 사이에는 공유결합이 형성되어 있지 않다. 본 발명 작용기화 탄소 나노튜브의 한 구체적인 실시 형태에서 이 탄소 나노튜브는 단일벽 탄소 나노튜브이다. According to another aspect of the present invention, there is provided a functionalized carbon nanotube in which the above-mentioned modified dextran is wound or substantially parallel to the longitudinal direction of the carbon nanotube. There is no covalent bond between the modified dextran and the carbon nanotube constituting the functionalized carbon nanotubes of the present invention. In one embodiment of the functionalized carbon nanotubes of the present invention, the carbon nanotubes are single-walled carbon nanotubes.

본 발명의 한 다른 측면에서는 전술한 작용기화 탄소 나노튜브와 이중 특이적 항체를 포함하는 탄소 나노튜브-항체 접합체를 개시한다. 본 발명의 접합체에서 상기 이중 특이적 항체는 상기 작용기화 탄소 나노튜브의 Ang와 상기 Ang가 아닌 표적 물질, 예를 들어 세포 표면에 존재하는 수용체나 항원 등의 생분자에 대해서 특이적으로 결합할 수 있는 물질이다. 이 이중 특이적 항체는 접합체 내에서 상기 Ang와 특이적으로 비공유결합하고 있는데, 이 이중 특이적 항체 내에서 표적 물질과 Ang 결합 부위는 각각 서로 다른 사슬에 위치하거나, 같은 사슬 내의 서로 다른 영역(domain)에 각각 자리잡는다.In another aspect of the present invention, there is disclosed a carbon nanotube-antibody conjugate comprising the aforementioned functionalized carbon nanotubes and a bispecific antibody. In the conjugate of the present invention, the bispecific antibody is capable of specifically binding to the Ang of the functionalized carbon nanotubes and a biomolecule such as a receptor or an antigen existing on the target substance other than the Ang, for example, It is a substance. The bispecific antibody specifically binds to the Ang in the conjugate. In this bispecific antibody, the target substance and the Ang-binding site are located in different chains, or in different regions within the same chain Respectively.

본 발명 접합체의 한 실시 형태에서는 상기 표적 물질과 Ang 결합 부위가 같은 사슬 내에 위치하는 서로 다른 영역에 각각 자리잡고, 이 때 각각의 영역은 단쇄 가변 분절(scFv)인데, 이 단쇄 가변 분절들은 직렬식(tandem)으로 연결된다.In one embodiment of the conjugate of the present invention, the target substance and the Ang binding site are each located in different regions located within the same chain, wherein each region is a short chain variable segment (scFv) (tandem).

본 발명의 또 다른 측면에서는 전술한 변형 덱스트란, 탄소 나노튜브와 이중 특이적 항체가 분리되어 존재하는 키트를 제공한다.In another aspect of the present invention, there is provided a kit comprising the above-mentioned modified dextran, a carbon nanotube and a bispecific antibody separated therefrom.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에서는 전술한 탄소 나노튜브-항체 접합체를 이용한 표적 물질의 검출 방법을 개시한다. 이 검출 방법은 In yet another aspect of the present invention, a method for detecting a target substance using the above-described carbon nanotube-antibody conjugate is disclosed. This detection method

(1) 표적 물질의 존부를 측정할 시료를 고상의 표면에 고정하는 단계, (1) fixing the sample to be measured for the presence or absence of the target substance to the solid surface,

(2) 전술한 탄소 나노튜브-항체 접합체로서, 상기 표적 물질을 특이적으로 인식하는 이중 특이적 항체를 지닌 탄소 나노튜브-항체 접합체와 상기 고정된 시료를 접촉시키는 단계,(2) contacting the fixed sample with a carbon nanotube-antibody conjugate having a bispecific antibody that specifically recognizes the target substance as the above-mentioned carbon nanotube-antibody conjugate,

(3) 상기 접촉 후 특이적으로 결합하지 않은 탄소 나노튜브-항체 접합체를 제거하는 단계와(3) removing the unconjugated carbon nanotube-antibody conjugate after the contacting, and

(4) 상기 고정된 시료에 자외선 내지 적외선 영역의 빛을 조사 후 발생하는 라만 신호를 검출하는 단계를 포함한다.(4) detecting a Raman signal generated after irradiating the fixed sample with ultraviolet light or infrared light.

본 발명 검출 방법의 한 실시 형태에서 상기 (4) 단계의 신호 검출은 근적외선 광발광 분광 분석이나 표면 플라스몬 공명 분석으로 대체할 수 있다. 본 발명 검출 방법의 한 구체적인 실시 형태에서는 단일벽 탄소 나노튜브인 탄소 나노튜브-항체 접합체를 사용하고 1585 ± 5 cm^-1의 이동값에서 공명 라만 신호를 검출한다.In one embodiment of the detection method of the present invention, the signal detection in the step (4) may be replaced by near-infrared light emission spectroscopic analysis or surface plasmon resonance analysis. In one specific embodiment of the detection method of the present invention, a carbon nanotube-antibody conjugate, which is a single-walled carbon nanotube, is used and a resonant Raman signal is detected at a moving value of 1585 ± 5 cm ^-1 .

본 발명은 신규한 탄소 나노튜브-항체 접합체와 이를 이용한 표적 물질의 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 접합체는 위치 특이적으로 항체가 접합된 나노소재로서 나노미터 규모에서 항체의 배향(orientation)과 밀도의 제어가 가능하다. 이 때문에 카르보디이미드 화학에 기반한 종래 기술의 항체 접합 방식을 이용한 생나노소재보다 표적 물질에 대하여 더 강력하게 특이적으로 결합할 수 있다. 아울러 본 발명의 접합체는 모듈식 설계가 가능하므로 다양한 표적 물질의 선택적 검출뿐 아니라 물질 전달과 치료에도 적용할 수 있다. 그리고 본 발명의 접합체는 근적외선 광발광, 라만 분광법 및 표면 플라스몬 공명 등 다양한 분석 방법과 영상화를 지원한다. The present invention provides a novel carbon nanotube-antibody conjugate and a method for detecting a target substance using the same. The conjugate of the present invention is a nanomaterial to which antibodies are attached in a site-specific manner, and it is possible to control the orientation and density of the antibody on the nanometer scale. This makes it possible to bind more specifically and more specifically to the target substance than to raw nanomaterials using the prior art antibody conjugation method based on carbodiimide chemistry. In addition, since the conjugate of the present invention can be modularly designed, it can be applied not only to selective detection of various target substances, but also to mass transfer and treatment. The conjugate of the present invention supports various analysis methods and imaging such as near-infrared light emission, Raman spectroscopy and surface plasmon resonance.

도 1은 본 발명의 한 실시 형태에 따른 탄소 나노튜브-항체 접합체를 이용하여 암세포 표면의 표적 물질을 검출하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 한 실시 형태에 따른 탄소 나노튜브-항체 접합체를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다. 도 2(a)는 본 발명의 한 실시 형태에 따른 변형 덱스트란의 합성을 나타낸 그림이다. 도 2(b)는 덱스트란, 도 2(a)의 변형 덱스트란 합성 과정의 중간체와 도 2(a)의 변형 덱스트란의 푸리에 변환 적외선 스펙트럼이다. 도 2(c)는 상기 덱스트란, 중간체, 변형 덱스트란의 자외선 스펙트럼이다. 도 2(d)는 도 2(a)에서 합성한 변형 덱스트란으로 작용기화한 탄소 나노튜브에 직렬식 항체를 접합하여 본 발명의 한 실시 형태에 따른 탄소 나노튜브-항체 접합체를 제조하는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 제조한 작용기화 나노튜브(3(a) 내지 3(c))와 탄소 나노튜브-항체 접합체(3(d) 내지 3(f))의 원자간력 현미경 사진 및 탄소 나노튜브의 길이 대 높이 분포를 분석한 그래프이다.
도 4는 비신코니닉산(BCA) 정량법으로 본 발명의 실시예에서 제조한 탄소 나노튜브-항체 접합체에 결합한 항체의 양을 측정한 그래프이다. 도 4(a)는 소 혈청 알부민 표준 물질의 검량 곡선이다. 도 4(b)는 본 발명의 실시예에서 제조한 탄소 나노튜브-항체 접합체(SNA-1과 SNA-3)와 종래 기술로 제조한 탄소 나노튜브-항체 접합체(EDC 커플링제)의 항체 결합량을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 제조한 탄소 나노튜브-항체 접합체의 광학적 특성을 나타낸다. 도 5(a)는 접합체의 여기/방출 프로파일이고, 5(b)는 항체의 접합 전후의 작용기화 탄소 나노튜브의 광발광을 비교한 그래프이며, 5(c)는 접합체의 라만 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 제조한 탄소 나노튜브-항체 접합체(SNA-1과 SNA-3)와 종래 기술로 제조한 탄소 나노튜브-항체 접합체(EDC 커플링제)가 그 표적 물질에 결합하는 세기를 나타낸 표면 플라스몬 공명 센소그램이다.
도 7은 음성 대조군 세포(MCF-7(-))와 비교하여 본 발명의 실시예에서 제조한 탄소 나노튜브-항체 접합체가 그 해당 인식 항원을 과다발현하는 암세포(SK-BR-3(+))를 특이적으로 검출하는 것을 광학 영상과 라만 영상(도 7(a) 내지 7(f))과 라만 스펙트럼(도 7(g) 내지 7(i))으로 나타낸 사진과 그래프이다. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic diagram showing the detection of a target substance on the surface of a cancer cell using a carbon nanotube-antibody conjugate according to an embodiment of the present invention. FIG.
2 is a schematic view showing a process for producing a carbon nanotube-antibody conjugate according to an embodiment of the present invention. Figure 2 (a) illustrates the synthesis of a modified dextran according to one embodiment of the present invention. FIG. 2 (b) is a Fourier transform infrared spectrum of dextran, the intermediate of the modified dextran synthesis process of FIG. 2 (a) and the modified dextran of FIG. 2 (a). 2 (c) is the ultraviolet spectrum of the dextran, the intermediate, and the modified dextran. FIG. 2 (d) is a schematic diagram for preparing a carbon nanotube-antibody conjugate according to an embodiment of the present invention by bonding a tandem type antibody to a carbon nanotube functionalized with modified dextran synthesized in FIG. 2 (a) .
3 is an atomic force microscope photograph of the functionalized nanotubes 3 (a) to 3 (c)) and the carbon nanotube-antibody conjugates 3 (d) to 3 (f) And the length-to-height distribution of carbon nanotubes.
FIG. 4 is a graph showing the amount of antibody bound to the carbon nanotube-antibody conjugate prepared in Example of the present invention by quantitative determination of non-cinchoninic acid (BCA). 4 (a) is a calibration curve of a bovine serum albumin reference material. Fig. 4 (b) is a graph showing the antibody binding amounts of the carbon nanotube-antibody conjugates (SNA-1 and SNA-3) prepared in the examples of the present invention and the carbon nanotube- antibody conjugate (EDC coupling agent) FIG.
Fig. 5 shows the optical characteristics of the carbon nanotube-antibody conjugate prepared in the example of the present invention. 5 (a) shows the excitation / emission profile of the conjugate, 5 (b) is a graph comparing the photoluminescence of the functionalized carbon nanotubes before and after conjugation of the antibody, and 5 (c) is the Raman spectrum of the conjugate.
FIG. 6 is a graph showing the relationship between the carbon nanotube-antibody conjugate (SNA-1 and SNA-3) prepared in the example of the present invention and the carbon nanotube-antibody conjugate (EDC coupling agent) It is the surface plasmon resonance spectrograph which shows the intensity.
FIG. 7 is a graph showing the results of immunohistochemical staining for cancer cells (SK-BR-3 (+)) which overexpresses corresponding recognition antigens of the carbon nanotube-antibody conjugate prepared in the example of the present invention as compared with negative control cells (MCF- (Figs. 7 (a) to 7 (f)) and Raman spectrum (Figs. 7 (g) to 7 (i)).

이하 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다. 이하 본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어를 해석하는 데 있어서는, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 반드시 통상적이거나 사전적인 의미로만 한정해서 해석할 것이 아니며, 본 명세서에서 기재하는 바에 따라 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석하여야 한다는 것을 밝혀 둔다.Hereinafter, the present invention will be described in detail. In interpreting the terms or words used in the present specification and claims, it is to be understood that the interpretation of terms or words used herein is necessarily conventional, based on the principle that the inventor can properly define the concept of the term to describe its invention in the best way It is to be understood that the invention is not to be interpreted as being limited only by the precautionary sense, but should be construed in accordance with the meaning and concept consistent with the technical idea of the present invention as described in the present specification.

본 명세서에서 탄소 나노튜브란 가늘고 긴 튜브 모양의 거대분자로서 그 지름이 1~200 nm 규모이고, 길이가 마이크로미터에서 밀리미터 규모인 탄소의 거대분자를 의미한다. 한편 필요할 경우 본 명세서에서 탄소 나노튜브는 전도도 향상제 등의 첨가제를 소량으로 포함한 것을 의미할 수도 있다. 한편으로 필요한 경우 본 명세서에서 나노튜브는 합성 후 표면 개질제로 개질된 것도 포함한다. 본 명세서에서 탄소 나노튜브란 맥락에 따라 단일벽 나노튜브(SWNT)를 가리킬 수도 있고, 다중벽 나노튜브(MWNT)를 가리킬 수도 있다. 본 발명의 한 바람직한 실시 형태에서는 단일벽 나노튜브를 사용한다. 본 발명의 더욱 구체적인 실시 형태에서는 지름이 0.7 ~ 1 nm 이고, 길이가 1 마이크로미터 규모인 단일벽 나노튜브를 사용한다.In this specification, carbon nanotubes are macromolecules of carbon having a diameter of 1 to 200 nm and a length of micrometer to millimeter, which are long and tubular macromolecules. If necessary, the carbon nanotubes in this specification may mean that a small amount of additives such as a conductivity improver is contained. On the other hand, if necessary, the nanotubes in this specification include those modified with a surface modifier after synthesis. In this specification, carbon nanotubes may refer to single-walled nanotubes (SWNTs) or multi-walled nanotubes (MWNTs) according to the context. In a preferred embodiment of the present invention, single-walled nanotubes are used. In a more specific embodiment of the present invention, a single-walled nanotube having a diameter of 0.7 to 1 nm and a length of 1 micrometer is used.

본 명세서에서 "항체"란 항체, 항체 펩티드, 면역글로불린 또는 전술한 것들중 어느 하나의 항원 결합성 단편, 예를 들어 항체의 단편으로서 항원에 결합하는 성질의 단편일 수 있다. 이러한 항체는 단일 클론 항체 또는 다중 클론 항체이거나 다중 특이적 항체일 수 있다. 본 명세서에서 항체라고 할 때에는 단일 사슬 항체(예를 들어 scFv)도 포함된다. 아울러 본 명세서에서 항체라고 할 때에는 비록 고전적인 범주의 항체에 포함되는 것은 아니지만, 항원 특이적 결합을 위하여 상보성 결정 부위(CDR)를 이용하는 항체 유사체(analog)와 기타 비항체성 단백질 기반 스캐폴드(예를 들어 융합 단백질 및/또는 면역 접합체(immunoconjugate))들 역시 망라하는 것으로 한다. 예컨대 면역글로불린과 3차원적 구조가 유사하면서 한 사슬에 하나 이상의 항원 결합 영역(domain)을 지니는 재조합 단백질도 본 발명의 항체에 해당한다. 항체 제조를 위한 다양한 기법은 공지 기술로 잘 알려져 있는데, 예를 들어 Harlow 외, <ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL>, 미국 뉴욕주 Cold Spring Harbor 소재 Cold Spring Harbor Laboratory Press간(1988)을 참조하라.As used herein, an "antibody" may be an antibody, an antibody peptide, an immunoglobulin, or an antigen-binding fragment of any of the foregoing, eg, a fragment of an antibody that binds to an antigen. Such an antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody or a multispecific antibody. In the present specification, an antibody refers to a single chain antibody (for example, scFv). Although antibodies herein are not intended to be included in classical antibodies, antibody analogs using complementarity determining regions (CDRs) and other non-antibody protein-based scaffolds for antigen-specific binding (eg, For example, fusion proteins and / or immunoconjugates). For example, a recombinant protein having one or more antigen binding domains in one chain and having a three-dimensional structure similar to immunoglobulin is also an antibody of the present invention. Various techniques for producing antibodies are well known in the art, see, for example, Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988.

본 명세서에서 이중 특이적 항체란 서로 다른 두 종류의 항원에 결합할 수 있는 항체를 의미하는데, 이 때 이 두 항원 결합 부위는 같은 곳이 아니다.As used herein, a bispecific antibody refers to an antibody capable of binding to two different antigens, wherein the two antigen binding sites are not the same.

본 명세서에서 단쇄 가변 분절(single chain variable fragment) 또는 scFv 란 경쇄 가변 부위(V_L)와 중쇄 가변 부위(V_H)를 하나의 사슬 내에 갖추고 있으면서 항원을 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 상기 중쇄와 경쇄의 가변 부위는 유연한 올리고펩티드 링커로 연결되어 있을 수 있다. 본 명세서에서 scFv라고 할 때에는 이가(divalent) scFv, 다이아보디(diabody), 트리아보디(triabody), 테트라보디(tetrabody)도 역시 망라한다.As used herein, a single chain variable fragment or scFv refers to an antibody capable of specifically binding an antigen while having a light chain variable region (V _L ) and a heavy chain variable region (V _H ) in one chain . The variable region of the heavy and light chains may be linked by a flexible oligopeptide linker. In the present specification, scFv also includes divalent scFv, diabody, triabody, and tetrabody.

본 발명의 목적 중 하나는 모듈식으로 설계 변경이 가능하여 다양한 표적 물질을 선택적 검출할 수 있고, 위치 특이적이고 배향 제어가능한 방식으로 항체를 나노튜브에 접합시킨 탄소 나노튜브-항체 접합체와 이 접합체를 이용한 검출 방법을 제공하는 것이다.One of the objects of the present invention is to provide a carbon nanotube-antibody conjugate in which an antibody is bound to a nanotube in a position-specific and orientation-controllable manner capable of selectively detecting a variety of target substances by a modular design change, And to provide a detection method using the same.

이를 위하여 본 발명의 한 측면에서는 변형 덱스트란을 개시한다. 본 발명의 변형 덱스트란은 천연 덱스트란과 대비하였을 때, 천연 덱스트란을 구성하는 글루코스 단위의 수산기 중 일부에 기능성 작용기로 변형이 일어나 있고, 변형 덱스트란 분자 전체적으로는 이러한 기능성 변형 작용기를 적어도 두 종류 지니고 있는 물질이다. 본 발명에서 변형 덱스트란은 친수성 물질로서 이러한 기능성 작용기 변형 덕택에 소수성인 탄소 나노튜브를 수성 매체 속에 분산시키고 항체의 특이적 결합 자리를 제공하는 역할을 맡는다.To this end, one aspect of the present invention discloses a modified dextran. When the modified dextran of the present invention is modified with a functional group in a part of the hydroxyl groups of the glucose unit constituting the natural dextran when compared with the natural dextran, the modified dextran molecule has at least two kinds It is the substance that it carries. In the present invention, the modified dextran is a hydrophilic substance and plays a role of dispersing hydrophobic carbon nanotubes in an aqueous medium and providing a specific binding site of the antibody due to the functional functional modification.

본 발명 변형 덱스트란의 글루코스 단위에서 변형이 일어나는 수산기는 특별히 한정되지 않는다. 한 변형 글루코스 단위 안에 동일한 종류의 변형 작용기가 둘 이상 포함되어 있을 수도 있고, 서로 다른 두 종류의 변형 작용기가 모두 포함되어 있을 수도 있다. 본 발명의 변형 덱스트란에서 한 변형 글루코스 단위 안에는 대개 하나의 변형 작용기만이 존재하는 것이 보통이나, 본 발명의 변형 덱스트란은 이러한 구성만으로 한정되지 않는다. 본 발명 변형 덱스트란의 한 구체적인 실시 형태에서 상기 기능성 작용기의 변형은 글루코스 단위의 2번 또는 3번 탄소에 부착된 수산기에 일어난 것이다.The hydroxyl group in which deformation occurs in the glucose unit of the modified dextran of the present invention is not particularly limited. One modified glucose unit may contain two or more of the same type of modified functional groups or two different types of modified functional groups. In the modified dextran of the present invention, there is usually only one deformation group in a modified glucose unit, but the modified dextran of the present invention is not limited to such a configuration. In one specific embodiment of the modified dextran of the present invention, the modification of the functional group occurs at a hydroxyl group attached to carbon number 2 or 3 of the glucose unit.

본 발명의 변형 덱스트란 제조를 위한 기능성 변형 중 하나는 글루코스 단위의 -OH를 화학식 1의 작용기로 치환하는 것이다.One of the functional modifications for making the modified dextran of the present invention is to replace the -OH of the glucose unit with the functional group of formula (I).

화학식 1의 작용기에서 Ar는 탄소 나노튜브와 π-π 상호작용을 일으킬 수 있는 아릴기이다. π-π 상호작용은 π 치쌓임(stacking)이라고도 일컬으며, 두 유기 화합물 분자의 방향족 고리 사이에 일어나는 분산력으로서 인력을 일으킨다. 이러한 Ar의 존재 때문에 본 발명의 변형 덱스트란은 탄소 나노튜브 표면에 흡착할 수 있고, 효과적으로 탄소 나노튜브를 극성 용매인 물 속에 분산시킬 수 있다. 본 발명에서 화학식 1의 Ar로는 탄소 나노튜브의 측벽과 π-π 상호작용을 일으켜 수성 환경에 탄소 나노튜브를 분산시킬 수 있는 아릴기이면 어느 것이든 무방하며 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 범위를 제한하려는 취지가 아닌, 이해를 돕기 위한 예시의 의미로서 상기 Ar의 구체적인 예를 일부만 들자면 페닐, 나프틸, 톨루일, 자일릴, 인돌릴 작용기를 사용할 수 있다. 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 화학식 1의 작용기는 아래 화학식 2의 작용기이다. In the functional group of the formula (1), Ar is an aryl group capable of interacting with carbon nanotubes by a pi-pi. The π-π interaction is also referred to as π-stacking and causes gravity as the dispersive force that occurs between the aromatic rings of the two organic compound molecules. Due to the presence of Ar, the modified dextran of the present invention can adsorb on the surface of carbon nanotubes and effectively disperse the carbon nanotubes in water as a polar solvent. In the present invention, Ar in formula (1) is not particularly limited as long as it is an aryl group capable of causing π-π interaction with the side wall of the carbon nanotube to disperse the carbon nanotubes in an aqueous environment. For example, phenyl, naphthyl, tolyl, xylyl, and indolyl functional groups may be used for some of the specific examples of Ar as an example for the sake of understanding, rather than to limit the scope of the present invention. In one specific embodiment of the present invention, the functional group of formula (1) is a functional group of the following formula (2).

본 발명의 변형 덱스트란에 존재하는 기능성 변형 중 다른 하나는 -OH를 아래 화학식 3의 작용기로 치환하는 것이다. Another functional modification present in the modified dextran of the present invention is to replace -OH with a functional group of the following formula (3).

화학식 3에서 Ang는 분자량이 0.1~5 kDa인 소형 유기 분자 부위로서, 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 합텐(hapten)이다. 이 Ang 합텐은 후술할 탄소 나노튜브-항체 접합체에서 항체가 제어된 배향(orientation)으로 위치 특이적으로 결합하는 자리이다. 본 발명에서 화학식 3의 Ang로는 통상적인 항원-항체 반응 수준의 결합력을 가지고 항체와 특이적으로 결합할 수 있는 항원성 부위이면 어느 것이든 무방하며 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 범위를 제한하려는 취지가 아닌, 이해를 돕기 위한 예시의 의미로서 상기 Ang의 구체적인 예를 일부만 들자면 플루오레사인(fluorescein), 바이오틴, 디곡시제닌(digoxigenin), 디니트로페놀을 사용할 수 있다. 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 화학식 3의 작용기는 아래 화학식 4의 트랜스-4-코티닌카르복시이다. In Formula (3), Ang is a small organic molecule moiety having a molecular weight of 0.1 to 5 kDa, which is a hapten capable of specifically binding to an antibody. This Ang hapten is a site that specifically binds to an antibody in a controlled orientation in a carbon nanotube-antibody conjugate described later. In the present invention, Ang in formula (3) may be any antigenic site capable of binding specifically to an antibody with a binding force of a conventional antigen-antibody reaction level, and is not particularly limited. For purposes of clarity, and not for the purpose of limiting the scope of the present invention, fluorescein, biotin, digoxigenin, dinitrophenol may be used as a specific example of the Ang, . In one specific embodiment of the present invention, the functional group of Formula 3 is trans-4-cotinecarboxy of Formula 4 below.

본 발명의 한 실시 형태에서 변형 덱스트란의 분자 내에서 전술한 변형 작용기를 하나 이상 포함하는 변형된 글루코스 단위들과 미변형 글루코스 단위들을 합한 총수는 30~90인 것이 적당하다. 본 발명의 다른 실시 형태에서 변형 덱스트란 단위 무게에 대하여 -OCH₂CHOHCH₂OAr 기능성 변형 작용기들이 차지하는 비율은 0.5~5 mmol/g이다. -OCH₂CHOHCH₂OAr 기능성 변형 작용기가 0.5~5 mmol/g 범위로 있으면 탄소 나노튜브가 수용성 용매에 분산되기 적합하기 때문에 기능화에 유리하다. 본 발명의 또 다른 실시 형태에서 -OAng로 변형된 글루코스 단위가 전체 변형과 미변형 글루코스 단위 중에서 차지하는 비율은 0.1~1 mmol/g이다. -OAng로 변형된 글루코스 단위들이 0.1~1 mmol/g에 있으면 유효한 항체의 작용을 유도하고, 탄소 나노튜브를 수용액 상에 효과적으로 분산시키기에 적절하다. -OAng로 변형된 글루코스 단위들을 조절함에 따라 추후에 도입되는 항체의 양을 조절할 수 있으므로, 다양한 비율의 -OAng로 변형된 글루코스를 포함한 변형 덱스트란을 확보하는 것이 유리하다. In one embodiment of the present invention, the total number of modified glucose units and unmodified glucose units containing at least one of the above-mentioned modified functional groups in the molecule of the modified dextran is suitably from 30 to 90. In another embodiment of the present invention, the ratio of -OCH ₂ CHOHCH ₂ OAr functional functional groups to modified dextran units is 0.5-5 mmol / g. When the -OCH ₂ CHOHCH ₂ OAr functional modifying functional group is in the range of 0.5 to 5 mmol / g, the carbon nanotubes are advantageously dispersed in a water-soluble solvent, which is advantageous for functionalization. In another embodiment of the present invention, the ratio of glucose units modified to -OAng in the total modified and unmodified glucose units is 0.1 to 1 mmol / g. When the glucose units modified with -OAng are in the range of 0.1 to 1 mmol / g, it is effective to induce the action of an effective antibody and effectively disperse the carbon nanotubes on the aqueous solution. Since it is possible to regulate the amount of antibody introduced at a later time by modifying the glucose units modified with -OAng, it is advantageous to obtain modified dextran containing glucose modified with various proportions of -OAng.

본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 상기 Ar은 페닐이고 -OCH₂CHOHCH₂OPh 기능성 변형 작용기는 변형 덱스트란 단위 무게에 대하여 0.8 ~1.5 mmol/g, 예를 들어 1.3 mmol/g의 범위로 포함된다. 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 상기 -OAng는 트랜스-4-코티닌카르복시이고, 이 기능성 변형 작용기는 변형 덱스트란 단위 무게에 대하여 0.29 ~0.73 mmol/g의 범위로 포함된다.In one specific embodiment of the present invention, Ar is phenyl and the -OCH ₂ CHOHCH ₂ OPh functional modification functional group is included in the range of 0.8 to 1.5 mmol / g, for example 1.3 mmol / g, based on the modified dextran unit weight. In one specific embodiment of the present invention, -OAng is trans-4-cotinecarboxy and the functional modified functional group is included in the range of 0.29 to 0.73 mmol / g with respect to the modified dextran unit weight.

본 발명의 변형 덱스트란은 덱스트란의 글루코스 수산기를 활성화하여 적절한 전구체에 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 목표하는 작용기 변형이 있을 때 덱스트란 글루코스 단위의 수산기에 반응시킬 시약과 반응 조건을 선택하는 것에 대한 화학은 공지 기술로 알려져 있으므로 여기서 상술하지는 않는다. 예를 들어 -OCH₂CHOHCH₂OAr의 변형을 일으키기 위해서 1,2-에폭시-3-아릴옥시프로판을 알칼리 조건 하에서 덱스트란 수산기와 반응시킬 수 있다. 한편 에스테르 연결을 이용하여 합텐(Ang)을 덱스트란에 연결하고자 하는 경우는 해당 합텐 분자에 있는 적절한 작용기를 선택하여 수산기와 반응시키거나, 적절한 작용기가 없는 경우 항체 결합 부위를 훼손하지 않는 한도 내에서 적당한 반응기를 도입함으로써 해당 합텐을 수산기에 연결할 수 있다. 예를 들어, 해당 합텐에 카르복시기가 있거나 카르복시기를 도입한 경우에는 적절한 에스테르화 커플링 시약(예를 들어 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)계 커플링제와 4-N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP)의 촉진제 조합)을 사용하여 합텐을 에스테르 연결기로 덱스트란에 이어줄 수 있다. 본 발명의 변형 덱스트란의 제조 방법에서는 미변형 덱스트란에 대한 이러한 반응물의 비율을 조절함으로써 기능성 변형 작용기의 비율을 조절할 수 있다.The modified dextran of the present invention can be obtained by reacting a suitable precursor by activating the glucose hydroxyl group of dextran. The chemistry for selecting the reagents and reaction conditions to react to the hydroxyl groups of dextranulose units when there is a target functional group modification is known in the art and is not described here. For example, 1,2-epoxy-3-aryloxypropane can be reacted with dextran hydroxyl groups under alkaline conditions to cause deformation of -OCH ₂ CHOHCH ₂ OAr. When linking dentran with dentran using an ester linkage, the appropriate functional group in the hapten molecule is selected and reacted with the hydroxyl group, or, in the absence of an appropriate functional group, By introducing a suitable reactor, the hapten can be linked to the hydroxyl group. For example, when a carboxy group is present in the hapten or a carboxyl group is introduced, an appropriate esterification coupling reagent (for example, a 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) coupling agent and 4- N, N- dimethylaminopyridine DMAP) can be used to bring the hapten to the dextran with an ester linkage. In the process for preparing the modified dextran of the present invention, the ratio of the functional modified functional group can be controlled by controlling the ratio of the reactant to the unmodified dextran.

본 발명의 다른 측면에서는 작용기화 탄소 나노튜브를 제공한다. 본 발명의 작용기화 탄소 나노튜브는 항체 등의 표적 인식 물질이 결합할 자리를 제공하면서 수성 환경에서 잘 분산되므로 탄소 나노튜브의 뛰어난 광학적, 전기적 특성을 이용하여 수성 환경 하에서 표적 물질을 검출하는데 유용하다.Another aspect of the present invention provides a functionalized carbon nanotube. Since the functionalized carbon nanotubes of the present invention are well dispersed in an aqueous environment while providing a place to bind a target recognition substance such as an antibody, the functionalized carbon nanotube is useful for detecting a target substance in an aqueous environment using excellent optical and electrical properties of carbon nanotubes .

본 발명의 작용기화 탄소 나노튜브는 그 길이 방향을 따라 전술한 변형 덱스트란이 감겨 있거나 길이 방향을 따라서 대체로 평행하게 회합(會合 association)하고 있다. 본 명세서에서 변형 덱스트란이 "탄소 나노튜브의 길이 방향을 따라 감겨" 있다고 함은 쇠막대에 비스듬히 끈을 감듯이 변형 덱스트란이 일정한 간격으로 나선상으로 감겨 있는 것은 물론 덱스트란의 감긴 모양이 나노튜브의 지름을 둘러싸고 팽팽하게 붙어 있거나 느슨하게 감싸고 있는 식으로 늘어나고 줄어드는 들쭉날쭉한 감긴 모양과 탄소 나노튜브를 한 시선 방향에서 관찰하였을 때 보이는 덱스트란의 골격 사이 간격이 일정하지 않은 모양도 망라한다. 이러한 변형 덱스트란의 감긴 방식은 전술한 π-π 상호작용을 책임지는 작용기의 종류와 OAng의 합텐의 종류, 사용된 탄소 나노튜브 표면의 상태(개질 여부 등)에 따라 달라질 수 있다. 예컨대 본 발명의 변형 덱스트란에 도입된 π-π 상호작용을 일으키는 화학식 1의 작용기가 비교적 일정한 간격으로 덱스트란에 치환되어 있느냐에 따라 본 발명의 작용기화 탄소 나노튜브의 덱스트란 "끈"이 고르게 나선상으로 감겨져 있느냐가 달라질 수 있는 것이다. The functionalized carbon nanotubes of the present invention are gathered in association with each other along the longitudinal direction of the deformed dextran, or substantially parallel along the longitudinal direction. The term " deformation of dextran " in the present specification means that the deformed dextran is wound spirally at regular intervals, such that the dextran is wrapped around the carbon nanotube in an oblique manner, A jagged spiral shape that stretches or shrinks in a tightly wrapped or loosely wrapped fashion around the diameter, and a shape in which the spacing between the skeletons of dextran is not constant when viewed in a single direction of the carbon nanotube. The winding manner of the modified dextran can be varied depending on the kind of the functional group responsible for the above-mentioned π-π interaction, the kind of the OAng hapten, the state of the surface of the carbon nanotube used (whether it is modified, etc.). For example, dextran "strings" of the functionalized carbon nanotubes of the present invention can be evenly distributed depending on whether dextrane is substituted at the relatively constant intervals of the functional group of the formula (1) causing the? -Π interaction introduced into the modified dextran of the present invention Whether it is wrapped in a spiral can be changed.

본 발명에서 탄소 나노튜브의 길이 방향을 따라서 변형 덱스트란이 탄소 나노튜브와 "대체로 평행하게 회합"한다는 의미는 변형 덱스트란의 고분자 골격에서 평균적으로 정의할 수 있는 장축이 탄소 나노튜브의 길이 방향과 대체로 평행하게 놓이고, 양자 사이에 작용하는 인력이 변형 덱스트란과 탄소 나노튜브를 붙들고 있는 상태를 가리킨다. 덱스트란은 글루코스 단위들 사이에 1,6-연결로 이어진 축이 기본적인 골격의 방향(장축)이고, 여기에 1,3-연결이 가지침을 일으킨다. 따라서 탄소 나노튜브와 덱스트란은 "대체로" 평행하다고 밖에 말할 수 없다. 예컨대 탄소 나노튜브의 길이 방향과 덱스트란의 평균적 장축이 이루는 각도가 -20°~ +20°이내에 이르는 것도 "대체로" 평행하다고 말할 수 있다.In the present invention, the deformation of dextran along the longitudinal direction of the carbon nanotube means that the carbon nanotube is "substantially parallel to the carbon nanotube." The long axis, which can be defined in the polymer skeleton of the modified dextran, Refers to a state in which the attraction force acting between the two is held in parallel with dextran and carbon nanotubes. Dextran is the basic skeletal direction (long axis) along which the 1,6-linkage between the glucose units leads to 1,3-linkage. Thus, carbon nanotubes and dextran are "almost" parallel. For example, it can be said that the angle between the longitudinal direction of carbon nanotubes and the average long axis of dextran is within the range of -20 ° to + 20 °.

본 발명의 작용기화 탄소 나노튜브를 길이 방향을 따라 감겨 있거나 대체로 평행하게 회합하는 변형 덱스트란 분자의 수는 둘 이상일 수 있으며 특별히 제한되지 않는다.The number of modified dextran molecules that associate the functionalized carbon nanotubes of the present invention with the functionalized carbon nanotubes in the longitudinal direction is not particularly limited and may be two or more.

본 발명의 작용기화 탄소 나노튜브를 구성하는 변형 덱스트란과 탄소 나노튜브 사이에는 전술한 π-π 상호작용에 의한 인력이 작용하기 때문에 공유결합으로 양자를 붙들어 맬 필요는 없다. 그러나 변형 덱스트란과 탄소 나노튜브를 공유결합으로 연결하더라도 무방하다. 예컨대 탄소 나노튜브 표면의 결함 작용기(카르복시기)를 이용하여, 항체의 특이적 인식 등에 영향을 주지 않는 한도 내에서, 변형 덱스트란의 작용기(예를 들어 상기 기능성 변형 작용기나 글루코스 수산기)에 이 결함 작용기를 반응시켜 공유결합을 형성할 수 있다. 본 발명 작용기화 탄소 나노튜브의 한 실시 형태에서는 상기 변형 덱스트란과 탄소 나노튜브 사이에 공유결합이 형성되어 있지 않다. There is no need to attach both of them to the carbon nanotubes by covalent bonding because the attraction due to the above-mentioned? -Π interaction acts between the deformed dextran and the carbon nanotubes constituting the functionalized carbon nanotubes of the present invention. However, the modified dextran and the carbon nanotube may be covalently linked. For example, it is possible to use a defective functional group (carboxyl group) on the surface of the carbon nanotube and to use the functional group of the modified dextran (for example, the functional modification group or the glucose hydroxyl group) May be reacted to form a covalent bond. In one embodiment of the functionalized carbon nanotubes of the present invention, no covalent bond is formed between the deformed dextran and the carbon nanotubes.

본 발명의 작용기화 탄소 나노튜브에서는 탄소 나노튜브는 단일벽, 다중벽 나노튜브를 모두 사용할 수 있다. 본 발명 작용기화 탄소 나노튜브의 한 구체적인 실시 형태에서 이 탄소 나노튜브는 단일벽 탄소 나노튜브이다. 단일벽 탄소 나노튜브는 광탈색 문턱값(photobleaching threshold)이 없는 근적외선 광발광(예를 들어 형광)과 강한 공명 라만 신호를 발할 수 있는 이점이 있다. 본 발명의 작용기화 탄소 나노튜브에서 탄소 나노튜브의 길이는 특별한 제한이 없지만 1 μm이면 적당하다.In the functionalized carbon nanotubes of the present invention, single wall or multiwall nanotubes can be used as the carbon nanotubes. In one embodiment of the functionalized carbon nanotubes of the present invention, the carbon nanotubes are single-walled carbon nanotubes. Single-walled carbon nanotubes have the advantage of emitting near-infrared light emission (e.g., fluorescence) and strong resonance Raman signals without a photobleaching threshold. The length of the carbon nanotubes in the functionalized carbon nanotubes of the present invention is not particularly limited, but is preferably 1 μm.

본 발명의 또 다른 측면에서는 전술한 탄소 나노튜브가 물 속에 분산되어 있는 분산액을 제공한다. 본 발명의 분산액은 선택적으로 무기 염과 완충 물질을 더 포함할 수 있다.In another aspect of the present invention, there is provided a dispersion in which the carbon nanotubes described above are dispersed in water. The dispersions of the present invention may optionally further comprise inorganic salts and buffer substances.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에서는 전술한 작용기화 탄소 나노튜브와 이중 특이적 항체를 포함하는 생나노접합체(bionanoconjugate)인 탄소 나노튜브-항체 접합체(conjugate)를 제공한다. 본 발명의 접합체에서 상기 이중 특이적 항체는 상기 작용기화 탄소 나노튜브의 Ang에 특이적으로 비공유결합할 수 있으면서 상기 Ang가 아닌 표적 물질, 예를 들어 세포 표면에 존재하는 수용체나 항원 등의 생분자에 대해서도 특이적으로 비공유결합할 수 있는 물질이다. 본 발명에서 이러한 표적 물질은 Ang가 아니어야 한다는 전제 하에서 항체가 인식할 수 있는 모든 표적 물질을 망라한다. 본 발명 접합체의 이중 특이적 항체에서 상기 표적 물질 결합 부위와 Ang 결합 부위는 각각 이중 특이적 항체의 서로 다른 사슬에 위치하거나, 같은 사슬 내의 서로 다른 영역(domain)에 각각 자리잡는다. 본 발명의 접합체는 이처럼 표적 물질 결합 부위와 Ang 결합 부위가 나뉘어져 있기 때문에 표적 물질 결합 부위만 바꾸면 다양한 표적 물질의 검출이 가능한 모듈식 설계를 지원한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a carbon nanotube-antibody conjugate, which is a bio-conjugated bionanoconjugate comprising the above-described functionalized carbon nanotube and a bispecific antibody. In the conjugate of the present invention, the bispecific antibody can bind specifically to Ang of the functionalized carbon nanotubes, and can bind to a target substance other than the Ang, for example, biomolecules such as receptors or antigens present on the cell surface And can specifically bind non-covalently. In the present invention, the target substance encompasses all target substances recognizable by the antibody under the premise that it should not be Ang. In the bispecific antibody of the conjugate of the present invention, the target substance binding site and the Ang binding site are respectively located in different chains of the bispecific antibody or in different domains in the same chain, respectively. Since the conjugate of the present invention is divided into the target substance binding site and the Ang binding site, a modular design capable of detecting various target substances can be supported by changing only the target substance binding site.

본 발명의 탄소 나노튜브-항체 접합체에서는 항체가 위치 특이적으로, 또한 특정 배향(orientation)으로 변형 덱스트란의 Ang에 결합하기 때문에 Ang 결합 부위와 서로 별개인 표적 물질의 결합 부위는 덱스트란이나 탄소 나노튜브에 구속받지 않고 자유로이 방치된다. 따라서 표적 물질 결합 부위가 입체 장애 등의 방해를 받지 받고 표적 물질에 온전히 결합할 수 있기 때문에 비특이적인 방식으로 탄소 나노튜브에 항체를 결합시킨 종래 기술의 생나노접합체보다 우수한 표적 물질 결합력을 가질 수 있다. 예를 들어 종래 기술의 카르보디이미드계 커플링 시약(전형적인 경우에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드(EDC) 염화수소화물과 N-히드록시숙신이미드(NHS)의 조합을 사용)을 이용하여 항체와 탄소 나노튜브를 연결하는 경우, 항체의 라이신 잔기의 아미노기나 N-말단 아미노기가 모두 탄소 나노튜브 표면의 카르복시기 결함에 연결될 수 있기 때문에 탄소 나노튜브에 항체가 결합할 때 배향의 조절이 불가능하였고 이는 항원 결합력의 감소로 이어졌다. 본 발명은 이렇게 배향의 제어가 불가능한 종래 기술의 단점을 극복하였을 뿐 아니라 나노튜브 표면 결함 작용기의 빈도에 제약받지 않고 변형 덱스트란 내 Ang의 밀도 조절을 통하여 접합체에 결합하는 항체의 밀도도 제어할 수 있는 이점이 있다.In the carbon nanotube-antibody conjugate of the present invention, since the antibody binds to the Ang of the modified dextran in a specific orientation and in a specific orientation, the binding site of the target substance, which is different from the Ang binding site, And is freely left without being restrained by the nanotubes. Therefore, the target substance binding site can have a better target substance binding ability than the prior art bio-nano-conjugate in which the antibody is bound to the carbon nanotube in a nonspecific manner because the target substance binding site can be unhindered such as steric hindrance and can bind to the target substance . For example, the prior art of carbodiimide based coupling reagents (N- (3- dimethylaminopropyl) In a typical case - N '- ethylcarbodiimide (EDC) hydrochloric cargo and N - hydroxysuccinimide (NHS) When the antibody and the carbon nanotube are connected by using a combination of the antibody and the carbon nanotube, since the amino group and the N-terminal amino group of the lysine residue of the antibody can all be linked to the carboxyl group defect on the surface of the carbon nanotube, The orientation could not be controlled and this led to a decrease in antigen binding capacity. The present invention overcomes the disadvantages of the prior art, in which the orientation can not be controlled, and can also control the density of antibody binding to the conjugate by controlling the density of Ang in the modified dextran without being limited by the frequency of nanotube surface defect functions There is an advantage.

본 발명 접합체의 한 실시 형태에서는 상기 표적 물질과 Ang 결합 부위가 같은 사슬 내에 위치하면서 서로 다른 영역에 각각 자리잡고, 이 때 각각의 영역은 단쇄 가변 분절(scFv)인데, 이 단쇄 가변 분절들은 직렬식(tandem)으로 연결된다. 이 실시 형태에서처럼 Ang과 표적 물질에 각각 결합하는 부위들을 한 항체 사슬 내에 두되, 서로 다른 항체 영역에 나누는 경우, Ang와 표적 물질 결합 부위를 서로 다른 사슬에 나누어 놓은 이중 특이적 항체보다 항체의 제조가 훨씬 간단해지는 이점이 있다. 왜냐하면 하나의 사슬이 Ang와 표적 물질 결합 활성을 모두 지니고 있으므로 이황화 결합을 형성할 수 있는 조건만 설정하여 주면(혹은 이황화 결합 이외의 방식으로 이합체를 형성할 수 있는 조건을 설정하면 주면) 생성되는 이합체가 모두 자동적으로 이중 특이적 항체가 될 것이기 때문이다. 이에 반하여 Ang와 표적 물질 결합 부위를 서로 다른 사슬에 두는 구성의 항체라면 헤테로이합체를 만들어야 하는 분리·정제상의 어려움이 있다. 그리고 하나의 사슬이 Ang와 표적 물질 결합 활성을 모두 지니는 경우 이합체를 형성하지 않고 단일 사슬로 남아 있어도 이중 특이적 활성을 나타낼 가능성이 있다.In one embodiment of the conjugate of the present invention, the target substance and the Ang binding site are located in different regions, respectively, located within the same chain, wherein each region is a short chain variable segment (scFv) (tandem). As in this embodiment, when binding Ang and target substances to each other within a single antibody chain but dividing them into different antibody regions, the production of antibody is more preferable than the bispecific antibody in which Ang and the target substance binding site are divided into different chains There is an advantage of being much simpler. Because one chain has both Ang and its target substance binding activity, it is necessary to set only the conditions that can form disulfide bonds (or to set the conditions to form dimers in a manner other than disulfide bonds) Will all automatically become bispecific antibodies. On the other hand, if the antibody is composed of Ang and the target substance binding site on different chains, it is difficult to separate and purify the heterodimer. When one chain has both Ang and target substance binding activity, it is likely to exhibit bispecific activity even if it remains as a single chain without forming a dimer.

본 발명 접합체에서 상기 이중 특이적 항체는, 예컨대 150 kDa 정도의 크기인 경우 상기 접합체의 단위 무게 당 약 1.0~2.0 μmol/g, 더욱 구체적으로 1.46 ~ 1.63 μmol/g의 밀도(또는 상기 접합체의 길이 방향을 따라 3.2 ~ 3.6 mmol/nm의 선밀도)로 결합하고 있으면 적당하다. In the conjugate of the present invention, the bispecific antibody has a density of about 1.0 to 2.0 μmol / g, more specifically 1.46 to 1.63 μmol / g per unit weight of the conjugate (eg, a length of the conjugate And a linear density of 3.2 to 3.6 mmol / nm along the direction).

본 발명 접합체의 한 실시 형태에서 인식할 표적 물질은 세포 표면에 존재하는 생분자이다. 더욱 구체적인 실시 형태에서 이 생분자는 암세포에 특이적이거나, 암세포에서 과다 발현된다.In one embodiment of the conjugate of the present invention, the target substance to be recognized is a biomolecule present on the cell surface. In a more specific embodiment, the biomolecule is specific to cancer cells or overexpressed in cancer cells.

도 1은 본 발명의 한 실시 형태에 따른 탄소 나노튜브-항체 접합체를 이용하여 암세포 표면의 표적 물질을 검출하는 것을 나타낸 모식도이다. 도 1의 접합체는 왼쪽 그림에 나타낸 것처럼 탄소 나노튜브(검은색 원통) 표면을 변형 덱스트란이 나선상으로 감고 있는 형상이며, 이 변형 덱스트란의 골격(파란색)을 따라 합텐(붉은색)인 Ang 작용기가 돌출하여 이중 특이적 항체의 결합 자리를 마련하여 주고 있다. 도 1의 가운데 그림은 이중 특이적 항체 중 표적 물질에 결합하지 않은 것을 확대한 그림이다. 이 이중 특이적 항체는 암세포 표면에 발현하는 암세포 특이적인 표적 물질을 인식할 수 있는 scFv 영역인 표적 물질 결합 부위(분홍색)가 같은 사슬 내에서 역시 scFv인 Ang 결합 부위와 나란히 연결되어 있는 직렬식(tandem) 항체이다. 변형 덱스트란의 골격에서 돌출한 Ang와 이중 특이적 항체의 Ang 결합 부위가 항원-항체 결합을 하려면 일정한 위치와 배향으로 결합할 수밖에 없다. 따라서 본 발명의 접합체에서 이중 특이적 항체는 배향 제어된 방식으로 변형 덱스트란에 결합하고, 그 결과 표적 물질 결합 부위는 표적 물질에 자유로이 결합할 수 있도록 구속받지 않고 탄소 나노튜브 표면에서 바깥쪽으로 향할 수 있도록 해방된다. 이러한 탄소 나노튜브-접합체는 암세포 표면의 표적 물질과 결합하고, 적절한 파장대의 빛을 조사하여 주면 탄소 나노튜브로부터 발생하는 강한 라만 신호를 방출하기 때문에 쉽게 검출할 수 있다(도 1 오른쪽 그림)BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic diagram showing the detection of a target substance on the surface of a cancer cell using a carbon nanotube-antibody conjugate according to an embodiment of the present invention. FIG. As shown in the left figure, the conjugate of Fig. 1 has a shape in which dextran is spirally wound around the surface of a carbon nanotube (black cylinder), and the Ang function To provide a binding site for the bispecific antibody. 1 is an enlarged view of a bispecific antibody that is not bound to a target substance. This bispecific antibody is a tandem type in which the target substance binding site (pink), which is an scFv region capable of recognizing a cancer cell-specific target substance expressed on the cancer cell surface, is linked side by side with the Ang binding site which is also scFv in the same chain tandem antibody. The Ang-protruding Angle of the modified dextran skeleton and the Ang-binding site of the bispecific antibody have to bind at a certain position and orientation in order to bind antigen-antibody. Therefore, in the conjugate of the present invention, the bispecific antibody binds to the modified dextran in an orientation-controlled manner, so that the target substance binding site can be directed outward from the surface of the carbon nanotube without being restrained to bind freely to the target substance . Such a carbon nanotube-conjugate binds to a target substance on the surface of a cancer cell and emits a strong Raman signal generated from carbon nanotubes by irradiating light of an appropriate wavelength band, so that it can be easily detected (right picture of FIG. 1)

본 발명 접합체의 한 실시 형태에서 상기 이중 특이적 항체는 효과 인자 부위(effector moiety)를 더 포함할 수 있다. 이 효과 인자 부위는 원하는 표적 물질에 도달하였을 때 표적 물질 인식 이외의 작용, 예컨대 물질 전달과 치료를 할 수 있게 하여 준다. 예를 들어 표적 물질이 암세포 표면의 항원인 경우, 이 효과 인자 부위는 해당 암세포를 살상하기 위한 세포 독소(toxin), 효소, 세포막 천공 단백질(pore-forming protein), 소형 유기 분자, 친수성 소형 유기 분자를 함유한 미셀 등의 베시클(vesicle)일 수 있다. 또한 전술한 효과 인자 부위와 사람면역결핍 바이러스(HIV)의 세포 융합 단백질 gp41의 융합 단백질이거나 복합체일 수 있다. 이러한 gp41과 세포내로 전달할 물질의 복합체를 사용하면 특정 세포내로 선택적인 물질 전달이 가능하다. 이러한 효과 인자 부위는 상기 Ang 결합 부위와 표적 물질 결합 부위의 작용을 방해하지 않는 한도 내에서 상기 이중 특이적 항체의 어느 위치에라도 자리잡을 수 있다.In one embodiment of the conjugate of the invention, the bispecific antibody may further comprise an effector moiety. This effector site allows actions other than target substance recognition, such as mass transfer and treatment, when the desired target material is reached. For example, when the target substance is an antigen on the surface of a cancer cell, the effector site may be a cytotoxin, an enzyme, a pore-forming protein, a small organic molecule, a hydrophilic small organic molecule Or a vesicle such as a micelle or the like. It may also be a fusion protein or complex of the above-mentioned effector site and the human fusion protein (gp41) of the human immunodeficiency virus (HIV). Using this complex of gp41 and the substance to be delivered into cells, selective mass transfer into specific cells is possible. Such effector moiety can be located at any position of the bispecific antibody so long as it does not interfere with the action of the Ang binding site and the target substance binding site.

본 발명의 또 다른 측면에서는 전술한 변형 덱스트란, 탄소 나노튜브와 이중 특이적 항체가 각각 분리되어 존재하는 키트를 제공한다.In another aspect of the present invention, there is provided a kit in which the above-mentioned modified dextran, the carbon nanotube and the bispecific antibody are separately present.

본 발명의 하나의 또 다른 측면에서는 전술한 탄소 나노튜브-항체 접합체를 이용하여 시료에서 표적 물질의 존부를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 검출 방법은 아래 단계들을 포함한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting the presence or absence of a target substance in a sample using the carbon nanotube-antibody conjugate. The detection method of the present invention includes the following steps.

(1) 표적 물질의 존부를 측정할 시료를 고상의 표면에 고정하는 단계, (1) fixing the sample to be measured for the presence or absence of the target substance to the solid surface,

(2) 전술한 탄소 나노튜브-항체 접합체로서, 상기 표적 물질을 특이적으로 인식하는 이중 특이적 항체를 지닌 탄소 나노튜브-항체 접합체와 상기 고정된 시료를 접촉시키는 단계,(2) contacting the fixed sample with a carbon nanotube-antibody conjugate having a bispecific antibody that specifically recognizes the target substance as the above-mentioned carbon nanotube-antibody conjugate,

(3) 상기 접촉 후 특이적으로 결합하지 않은 탄소 나노튜브-항체 접합체를 제거하는 단계와(3) removing the unconjugated carbon nanotube-antibody conjugate after the contacting, and

(4) 상기 고정된 시료에 자외선 내지 적외선 영역의 빛을 조사 후 발생하는 라만 신호를 검출하는 단계를 포함한다.(4) detecting a Raman signal generated after irradiating the fixed sample with ultraviolet light or infrared light.

본 발명의 검출 방법에서 표적 물질의 존부를 확인하고자 하는 시료를 고상의 표면에 고정하는 단계는 시료 속의 분석 대상 물질을 고상의 표면에 공유결합으로 또는 기타 화학적 인력으로 구속하는 단계이다. 시료는 항체가 인식할 수 있는 표적 물질을 포함할 수 있는 모든 형태의 혼합물이다. 시료의 표면 고정을 위하여 필요한 경우 고정을 위한 처리 외에 적절한 전처리를 할 수도 있다. 시료 속에 포함될 수 있는 표적 물질로는 항체가 인식할 수 있는 것을 전제로 소형 유기 분자나 단백질 등의 생분자, 세포 등의 거대 분석 대상 물질이나 무기 화합물 등 특별히 제한이 없으며, 시료는 이러한 표적 물질을 포함할 수 있는 모든 종류의 혼합물(고상, 액상, 기상)이다. 시료 내의 표적 물질을 고상의 표면에 고정하는 방법은 이 분야에서 공지되어 있으므로 여기서 상술하지 않는다. 부분적으로 예를 들자면 시료의 고정은 표적 물질이 특정 세포 표면의 인식 분자(특정 항원 등)인 경우 그 세포를 해당 표면에 배양하는 정도의 단순할 것일 수 있다(해당 세포가 표면에 부착하는 성질의 세포인 경우). 소형 유기 화합물의 경우 시료의 고정은 시료 속의 이 유기 화합물을 적절한 기판에 노출시킨 다음 화학 반응을 이용하여 이 기판에 결합시키는 것일 수 있다.In the detection method of the present invention, the step of immobilizing the sample to be identified on the solid surface to the surface of the solid is to covalently bind the analyte in the sample to the solid surface with covalent bonds or other chemical forces. A sample is any type of mixture that may contain a target substance that the antibody recognizes. If necessary for the surface fixation of the sample, appropriate pretreatment may be performed in addition to the treatment for fixation. The target substance that can be included in the sample is not particularly limited, such as a large analyte or inorganic compound such as a biomolecule or a cell such as a small organic molecule or a protein on the premise that the antibody can recognize the sample. It is a mixture of all kinds that can be contained (solid, liquid, vapor). Methods of immobilizing the target material in the sample on the solid surface are well known in the art and are not described here. In part, for example, fixation of a sample may be as simple as incubating the cell on the surface if the target substance is a recognition molecule (such as a specific antigen) on a specific cell surface Cells). In the case of small organic compounds, fixation of the sample may be by exposing the organic compound in the sample to a suitable substrate and then using a chemical reaction to bond the substrate.

본 발명 검출 방법의 한 실시 형태에서 이 표적 물질은 세포 표면의 분자이다. 한 구체적인 실시 형태에서 이 세포는 암세포나 다른 질병에 관련된 세포이다. 이 방법의 다른 구체적인 실시 형태에서는 첫 번째 단계가 끝난 후 또는 첫 번째 단계 수행 중에 세포 고정을 수행하여 탄소 나노튜브-항체 접합체가 세포 속으로 내포(internalization)되는 것을 방지한다. 이러한 세포 고정에는 포르말린 처리 등 세포학 분야에서 공지된 수단을 사용할 수 있다. In one embodiment of the detection method of the present invention, the target material is a cell surface molecule. In one specific embodiment, the cell is a cell associated with cancer cells or other diseases. In another specific embodiment of the method, cell fixation is performed after the first step or during the first step to prevent the carbon nanotube-antibody conjugate from being internalized into the cell. For such cell fixation, means known in the field of cytology such as formalin treatment can be used.

본 발명 검출 방법의 두 번째 단계인 탄소 나노튜브-항체 접합체와 고정된 시료의 접촉 단계는 항체의 항원 인식이 충분한 세기를 가지고 이루어질 수 있도록 허용하는 모든 알려진 방식으로 수행할 수 있고 특별히 제한되지 않는다. 이 때 해당 표적 물질을 탄소 나노튜브-항체 접합체가 인식하기 위하여 특정한 환경(pH, 염 농도, 온도 등)이 필요한 경우 상기 첫 번째 단계와 두 번째 단계 사이에 적절한 완충 용액을 이용하여 시료가 고정된 표면을 세척하거나 이 완충 용액 속에서 배양하여 필요한 환경 조건을 맞출 수 있다.The step of contacting the immobilized sample with the carbon nanotube-antibody conjugate, which is the second step of the detection method of the present invention, can be carried out in any known manner allowing the antigen recognition of the antibody to be carried out with sufficient strength, and is not particularly limited. In this case, when a specific environment (pH, salt concentration, temperature, etc.) is required for recognizing the target substance as a carbon nanotube-antibody conjugate, the sample is immobilized using a suitable buffer solution between the first step and the second step The surface can be cleaned or cultured in this buffer to meet the required environmental conditions.

본 발명 검출 방법의 세 번째 단계인 제거 단계는 표적 물질에 특이적으로 결합하지 않은 탄소 나노튜브-항체 접합체를 상기 시료가 고정된 표면에서 없애는 단계이다. 이 단계에서 뒤의 신호 검출 단계에서 나올 수 있는 거짓 양성 반응(false positive)을 제거하게 된다. 본 발명에서 특이적으로 결합하지 못한 접합체의 제거는 특별히 어떠한 방식으로 제한되지 않는다. 대개 완충 용액(예를 들어 인산 완충 식염수(PBS)) 등의 수용액으로 두 번째 단계를 마친 상기 시료가 고정된 표면을 세척하여 결합하지 않은 접합체를 세척해 내는 것으로 세 번째 단계를 수행하는 것이 편리하다.In the third step of the detection method of the present invention, the removal step is a step of removing the carbon nanotube-antibody conjugate not specifically bound to the target substance from the surface on which the sample is immobilized. This step removes false positives that may occur in the subsequent signal detection step. In the present invention, the removal of the specifically unbound conjugate is not particularly limited in any way. It is convenient to perform the third step by washing the unfixed conjugate by washing the fixed surface of the sample with the second step, usually with an aqueous solution such as buffered solution .

본 발명 검출 방법의 네 번째 단계는 탄소 나노튜브-접합체의 탄소 나노튜브 부분을 이용하여 고정된 표적 물질에 결합한 접합체의 신호를 검출하는 단계이다. 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 상기 접합체의 탄소 나노튜브는 단일벽 나노튜브이고, 상기 발광의 검출은 1585 ± 5 cm^-1의 이동값에서 공명 라만 신호를 검출한다. 단일벽 탄소 나노튜브는 이 라만 이동값에서 강력한 공명 라만 신호를 검출하므로 검출이 용이하다. 다른 구체적인 실시 형태에서는 상기 공명 라만 신호의 검출에는 공초점 현미경을 이용한 라만 영상화를 이용한다. 예컨대 이러한 라만 영상화는 조사광의 범위를 200~3000 nm로 하고, 적절한 노출 시간(예를 들어 0.5 초 안팎)을 주어 이루어질 수 있다.The fourth step of the detection method of the present invention is a step of detecting a signal of a conjugate bound to a fixed target substance using the carbon nanotube portion of the carbon nanotube-conjugate. In one specific embodiment of the present invention, the carbon nanotubes of the conjugate are single-walled nanotubes, and the detection of the luminescence detects a resonant Raman signal at a travel value of 1585 5 cm ^-1 . Single-walled carbon nanotubes detect a strong resonant Raman signal at this Raman shift value and are therefore easy to detect. In another specific embodiment, Raman imaging using a confocal microscope is used to detect the resonance Raman signal. For example, such Raman imaging can be performed with a range of irradiation light of 200 to 3000 nm and an appropriate exposure time (for example, about 0.5 seconds or so).

전술한 방법에서는 라만 신호를 검출하는 것을 예로 설명하였지만 본 발명 검출 방법의 다른 실시 형태에서는 상기 (4) 단계의 라만 신호 검출을 근적외선 광발광(photoluminescence) 분광 분석이나 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 분석으로 대체할 수 있다. In the above-described method, the detection of the Raman signal has been described as an example. However, in another embodiment of the detection method of the present invention, the detection of the Raman signal in the step (4) may be performed by near-infrared photoluminescence spectroscopy, surface plasmon resonance, SPR) analysis.

[실시예] [ Example ]

이하, 본 발명을 이하 제시하는 실시예와 실험예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐으로서 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples and experimental examples. However, it should be understood that the present invention is not limited thereto.

이하 본 발명에 따른 탄소 나노튜브-항체 접합체의 한 구체적인 실시 형태를 제시하고 이를 이용하여 암세포를 특이적으로 검출한다. 변형 덱스트란을 합성하는 것부터 시작하여 접합체를 제조하고, 접합체의 결합력과 신호 검출 성능을 평가하였다. Hereinafter, a specific embodiment of the CNT-antibody conjugate according to the present invention is presented, and cancer cells are specifically detected using the same. Starting from synthesis of modified dextran, the conjugate was prepared and the binding force of the conjugate and the signal detection performance were evaluated.

소수성인 탄소 나노튜브를 수용액 속에서 분산하기 위하여 화학식 1의 Ar이 페닐이고, 합텐 OAng가 트랜스-4-코티닌카르복시인 변형 덱스트란을 합성하였다. 이 변형 덱스트란을 단일벽 탄소 나노튜브와 회합시켜 작용기화 탄소 나노튜브를 얻은 후 이 작용기화 탄소 나노튜브와 표적 물질을 사람 표피 성장 인자 수용체(human epidermal growth factor receptor, HER)로 하는 이중 특이적 항체를 접합하여 탄소 나노튜브-항체 접합체를 얻었다.In order to disperse the hydrophobic carbon nanotubes in an aqueous solution, modified dextran was synthesized in which Ar of the formula (1) was phenyl and hapten OAng was trans-4-cctinecarboxy. This deformed dextran is combined with single-walled carbon nanotubes to obtain functionalized carbon nanotubes. Then, the functionalized carbon nanotubes and the target substance are subjected to a double-specific reaction with human epidermal growth factor receptor (HER) The antibody was conjugated to obtain a carbon nanotube-antibody conjugate.

변형 덱스트란의 합성Synthesis of modified dextran

변형 덱스트란의 합성은 도 2a에 나타난 것과 같이 π-π 상호작용을 위한 작용기로 3-페녹시-2-히드록시프로폭시기 도입한 중간체(PhO-dex)를 거쳐서 이루어졌다. 먼저 π-π 상호작용기 전구체인 1,2-에폭시-4-페녹시프로판 0.75 mL를 가한 1 M 수산화나트륨 수용액 10 mL 속에 덱스트란(10 kDa) 1 g을 녹였다. 이 혼합물을 40℃에서 10시간 동안 섞은 다음, 원하는 산물(PhO-dex)을 침전시키기 위하여 상기 반응 혼합물에 메탄올 150 mL를 천천히 가했다. 그 후 이 침전물을 메탄올로 여러 차례 세척하고, 고진공에서 건조하였다. PhO-dex 중간체의 페녹시기는 π-π 상호작용을 통해 탄소 나노튜브의 측벽에 흡착하여, 수용액 속에서 나노튜브를 효과적으로 분산할 수 있다.The synthesis of the modified dextran was carried out via an intermediate (PhO-dex) introduced with 3-phenoxy-2-hydroxypropoxy group as a functional group for the pi-pi interaction as shown in Fig. First, 1 g of dextran (10 kDa) was dissolved in 10 mL of a 1 M aqueous solution of sodium hydroxide to which 0.75 mL of 1,2-epoxy-4-phenoxypropane as a precursor of the? -? The mixture was stirred at 40 占 폚 for 10 hours, and then 150 mL of methanol was slowly added to the reaction mixture to precipitate the desired product (PhO-dex). The precipitate was then washed several times with methanol and dried in a high vacuum. The phenoxy group of the PhO-dex intermediate is adsorbed on the sidewall of the carbon nanotube through a π-π interaction and can effectively disperse the nanotube in the aqueous solution.

이어서 이 중간체에 트랜스-4-코티닌카르복시기를 도입하기 위하여 에스테르 커플링제인 BOP 시약(benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate)과 DMAP 시약(4-(dimethylamine)pyridine)을 사용하였다. 각각 BOP 0.4, 1.2 또는 2.1 g, DMAP 0.1, 0.3 또는 0.6 g의 존재하에서 PhO-dex의 DMF 용액(1 g PhO-dex/50 mL DMF)에 트랜스-4-코티닌카르복시산 0.13, 0.4 또는 0.7 g을 첨가하였다.Benzotriazol-1-yloxy tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate, which is an ester coupling agent, and DMAP reagent (4- (dimethylamine) pyridine) were then used to introduce the trans-4-cotinecarboxylic group into this intermediate. 0.4, or 0.7 g of trans-4-cotinic carboxylic acid in a DMF solution of PhO-dex (1 g PhO-dex / 50 mL DMF) in the presence of BOP 0.4, 1.2 or 2.1 g, DMAP 0.1, 0.3 or 0.6 g, .

이 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 60℃에서 5시간 동안 교반하였다. 이어서 원하는 생성물을 침전시키기 위하여, 상기 반응 혼합물에 메탄올 500 mL를 천천히 첨가하였다. 이 침전물을 셀룰로오스 투석막(분자량 차단값 8 kDa)으로 물에 대하여 3일 동안 투석하여 정제하였다. 상기 최종 생성물(Cot-PhO-dex)을 고진공 하에서 건조하고 자외선-가시광선과 푸리에 변환 적외선 분광법 및 원소 분석으로 특성을 분석했다. The reaction mixture was stirred at 60 &lt; 0 &gt; C for 5 hours under a nitrogen atmosphere. To precipitate the desired product, 500 mL of methanol was slowly added to the reaction mixture. This precipitate was purified by dialysis against water with a cellulose dialysis membrane (molecular weight cut off value 8 kDa) for 3 days. The final product (Cot-PhO-dex) was dried under high vacuum and characterized by ultraviolet-visible light, Fourier transform infrared spectroscopy and elemental analysis.

<실험예 1><Experimental Example 1>

합성한 변형 덱스트란의 특성 분석Characterization of synthesized dextran

변형 전의 덱스트란, 합성된 PhO-dex 중간체와 Cot-PhO-dex 변형 덱스트란을 FT-IR 분광법으로 비교 분석한 결과를 도 2(b)에 나타내었다. PhO-dex(파란색 선)의 스펙트럼에서는 방향족 고리의 C=C 신축 진동 모드(1596과 1497 cm^-1)가 뚜렷하게 관찰되었다. 또한 PhO-dex의 자외선 스펙트럼에서는 268 nm에서 π 결합 오비탈로부터 π 반결합 오비탈(π^*)로의 전자 전이가 관찰되었다(도 2c 파란색 선). PhO-dex 중간체의 페녹시기 함량을 268 nm에서 흡광도로 계산한 결과 중간체 g 당 1.3 mmol로 나타났다. FIG. 2 (b) shows the results of FT-IR spectroscopic analysis of the dextran, the synthesized PhO-dex intermediate and the Cot-PhO-dex modified dextran before the deformation. In the spectrum of PhO-dex (blue line), the C = C stretching vibration modes (1596 and 1497 cm ^-1 ) of the aromatic rings were clearly observed. In the ultraviolet spectrum of PhO-dex, electron transition from a π-binding orbital to a π-half-orbital (π ^* ) was observed at 268 nm (FIG. The phenoxy content of the PhO-dex intermediate was calculated as absorbance at 268 nm and was found to be 1.3 mmol per gram of intermediate.

도 2(b)에 잘 나타나 있듯이 PhO-dex 중간체에 트랜스-4-코티닌카르복시기를 에스테르 결합을 통하여 도입하여 Cot-PhO-dex 변형 덱스트란이 생성되면 C=O 신축 진동(1739 cm^-1)의 진동 모드(붉은색 선)가 뚜렷하게 나타났다. 또한, FT-IR 스펙트럼에서 변형 덱스트란의 아미드 C=O 및 C=N 신축의 피크도 1663 및 1563 cm^-1에서 각각 관찰되었다. 트랜스-4-코티닌카르복시기는 페녹시기처럼 π-π 상호작용을 할 수 있는바, PhO-dex 중간체에 코티닌카르복시 변형을 하여 얻은 Cot-PhO-dex의 UV 스펙트럼에는 π → π^* 전자 전이도 상당히 증가한 것을 볼 수 있었다. 이러한 결과는 도입한 트랜스-4-코티닌카르복시기가 PhO-dex의 골격에 공유결합으로 연결되었다는 것을 제시한다. As shown in FIG. 2 (b), when Cot-PhO-dex modified dextran is introduced by introducing trans-4-cotinecarboxylic group into the PhO-dex intermediate through ester linkage, C═O stretching vibration (1739 cm ^-1 ) The vibration mode (red line) became clear. Further, in the FT-IR spectrum, peaks of amide C = O and C = N stretching shafts of modified dextran were also observed at 1663 and 1563 cm ^-1 , respectively. The trans-4-cotinecarboxylic group is capable of π-π interaction like the phenoxy group, and the UV spectrum of Cot-PhO-dex obtained by cotinine carboxy modification on the PhO-dex intermediate has a considerably increased π → π ^* electron transition I could see that. These results suggest that the introduced trans-4-cotinine carboxyl group is covalently linked to the skeleton of PhO-dex.

한편, 원소 분석을 이용하여 Cot-PhO-dex에서 트랜스-4-카르복시기의 함량을 정량하였다. 트랜스-4-코티닌카르복시산을 가해 준 양이 달라지면서, 최종 트랜스-4-카르복시기의 함량이 변형 덱스트란 단위 무게(g)당 0.29, 0.66, 0.73 mmol로 증가하였다. 이 세 가지 합성된 변형 덱스트란을 이하 각각 1-Cot-PhO-dex, 3-Cot-PhO-dex와 5-Cot-PhO-dex라고 명명한다. 1-Cot-PhO-dex, 3-Cot-PhO-dex와 5-Cot-PhO-dex에서 변형과 미변형 글루코스 단위를 포함한 변형 덱스트란내 전체 글루코스 단위 62개에 대한 트랜스-4-코티닌카르복시 작용기의 몰 비는 각각 1:17, 3:17, 4:17이었다. On the other hand, the content of trans-4-carboxy group in Cot-PhO-dex was quantified using elemental analysis. As the amount of trans-4-cotinecarboxylic acid added varied, the final trans-4-carboxyl group content increased to 0.29, 0.66, 0.73 mmol per gram dextran unit weight (g). These three synthesized dextranes are hereinafter referred to as 1-Cot-Pho-dex, 3-Cot-Pho-dex and 5-Cot-Pho-dex, respectively. 1-Cot-PhO-dex, 3-Cot-PhO-dex and 5-Cot-PhO-dex, the trans-4-cotinine carboxy functional group for 62 total glucose units in the modified dextran containing modified and unmodified glucose units Were 1:17, 3:17 and 4:17, respectively.

작용기화Functionalization 나노튜브의 합성 Synthesis of nanotubes

단일벽 탄소 나노튜브(SouthWest NanoTechnologies사 등록상표 CoMoCAT(튜브 지름 : 0.7 ~ 1.0 nm, 길이 : 1 μm) 5 mg을 상기 합성한 Cot-PhO-dex 수용액(1 mg/mL) 5 mL 속에 가하고, 프로브팁(probe tip) 초음파 발생장치(10 W)로 얼음 중탕에서 90분 동안 초음파 처리하여 분산하였다. 분산된 SWNT를 15,000×g에서 1.5 시간 동안 원심분리하고, 상층액을 수집하여 작용기화 SWNT를 얻었다.5 mg of single-walled carbon nanotubes (CoMoCAT, manufactured by SouthWest NanoTechnologies, Inc. (tube diameter: 0.7 to 1.0 nm, length: 1 μm) was added to 5 mL of the synthesized Cot-PhO-dex aqueous solution (1 mg / mL) Dispersed SWNTs were centrifuged at 15,000 × g for 1.5 hours, and the supernatant was collected to obtain the functionalized SWNTs. The supernatant was collected by centrifuging the dispersed SWNTs at 15,000 × g for 90 minutes in an ice bath with a probe tip ultrasonic generator (10 W) .

변형 덱스트란 중 1-Cot-Phe-dex와 3-Cot-PhO-dex는 초음파 처리를 통하여 SWNT를 물에 잘 분산시킬 수 있었으나, 트랜스-4-코티닌카르복시기 함량이 가장 높은 5-Cot-PhO-dex는 수용액에서 SWNT를 분산시키지 못했다. 본 발명의 작용 원리에 대하여 어떠한 특정한 이론에 얽매이고자 하는 의도는 아니지만, 이해를 돕기 위하여 설명을 해 보자면 변형 덱스트란에 극성인 트랜스-4-코티닌카르복시가 늘어남에 따라 SWNT의 소수성 표면에 대한 5-Cot-PhO-dex의 친화력이 감소한 것이라고 추측된다.In the modified dextran, 1-Cot-Phe-dex and 3-Cot-PhO-dex were able to disperse SWNT in water well by ultrasonication, but 5-Cot-Pho- dex could not disperse SWNT in aqueous solution. Although not intending to be bound by any particular theory as to the working principle of the present invention, for the sake of clarity, it should be noted that as the trans-4-cotinine carboxy polarity, which is polarized in the modified dextran, It is presumed that the affinity of Cot-PhO-dex decreased.

1-Cot-PhO-dex와 3-Cot-PhO-dex로 제조한 작용기화 탄소 나노튜브의 광학적 특성을 라만 분광법과 근적외석 광발광으로 분석하였다. 이들은 G 모드에서 강한 라만 신호를 발하였고 강렬한 근적외선 광발광(NIR PL)을 나타냈다(도 5(b)의 검은 선). 더욱이 이 작용기화 나노튜브들은 라만 스펙트럼에서 D 모드가 뚜렷하게 나타나지 않았는데(미도시), 이는 SWNT의 측벽에 변형 덱스트란이 공유결합이 아니라 흡착하였다는 것을 가리킨다.The optical properties of functionalized carbon nanotubes prepared with 1-Cot-PhO-dex and 3-Cot-PhO-dex were analyzed by Raman spectroscopy and near-infrared light emission. They emitted a strong Raman signal in G mode and exhibited intense near-IR light emission (NIR PL) (black line in Figure 5 (b)). Furthermore, these functionalized nanotubes did not exhibit a distinct D-mode in the Raman spectrum (not shown), indicating that the dextran was adsorbed rather than covalently attached to the sidewalls of the SWNTs.

이중 특이적 항체의 제조와 발현Preparation and expression of bispecific antibodies

HER2 수용체와 코티닌 부위를 이중 특이적으로 인식하는 항HER2×코티닌 직렬식 scFv Fc(사람 IgG1의 경첩 부위(hinge region)와 C_H2-C_H3 영역을 포함) 융합 단백질을 발현하고 정제하였다. 이 항체 제조에 관한 자세한 내용은 J Cancer Res Clin Oncol, 2014, 140(2), 227~223쪽을 참조하라. 간략히 설명하자면, 제조사의 설명에 따라 Lipofectamine 2000(Invitrogen사)를 이용하여 융합 단백질 DNA 재조합을 마친 발현 벡터로 HEK293F 세포(Invitrogen사 FreeStyle(상표) 293-F 세포)에 형질 도입하였다. 오비탈 진동 배양기(스위스 Bottmingen 소재 INFORS HT사의 Minitron)를 써서 135 rpm으로 흔들어 주면서 7 % CO₂ 하에서 세포를 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 함유된 FreeStyle(상표) 293 발현 배지(Invitrogen사) 안에 37℃에서 배양하였다. 배지의 상층액을 형질 도입 3일, 6일, 9일 후에 수집하였다. 이 융합 단백질을 단백질 A-아가로스 비드(미국 매사추사츠주 Waltham 소재 RepliGen)를 이용한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 배양 상층액으로부터 정제하였다. 용출액을 4L 인산 완충 식염수(PBS: 137 mM 염화나트륨, 10 mM 인산염 및 2.7 mM 염화칼륨, pH 7.4)로 4℃에서 하룻밤 동안 투석하여 항HER2×코티닌 직렬식 scFv Fc를 얻었다.Expression and purification of anti-HER2 × cotinine tandem scFv Fc (including hinge region and C _H 2-C _H 3 region of human IgG1) fusion protein that recognizes the HER2 receptor and cotinine region in a bispecific manner. For more information on the manufacture of this antibody, please contact J Cancer Res Clin Oncol , 2014, 140 (2), 227-223. Briefly, HEK293F cells (Invitrogen FreeStyle (R) 293-F cells) were transfected with an expression vector that had undergone fusion protein DNA recombination using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Cells were plated on FreeStyle (R) 293 expression medium (Invitrogen) containing 100 U / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin under 7% CO ₂ with shaking at 135 rpm using an orbital vibrating incubator (Minitron, INFORS HT, Bottmingen, Switzerland) 0.0 &gt; 37 C. &lt; / RTI &gt; The supernatant of the medium was collected 3, 6, and 9 days after transduction. This fusion protein was purified from the culture supernatant using affinity chromatography with protein A-agarose beads (RepliGen, Waltham, MA). The eluate was dialyzed overnight at 4 ° C in 4 L phosphate buffered saline (PBS: 137 mM sodium chloride, 10 mM phosphate and 2.7 mM potassium chloride, pH 7.4) to obtain anti-HER2 × cotinine tandem scFv Fc.

이중 특이적 항체와 작용기화 탄소 나노튜브의 접합Binding of bispecific antibody to functionalized carbon nanotubes

SWNT-직렬식 항체 접합체를 합성하기 위하여, 먼저 원심분리 여과(분자량 차단값 100 kDa)를 이용하여 실시예 2에서 합성한 작용기화 SWNT 용액에서 유리 Cot-PhO-dex를 제거하고 용매인 물을 PBS(pH 7.4, 10 mM)로 교체하였다. 이어서 이 작용기화 SWNT 용액(0.84 mg/mL) 0.956 mL에 전술한 항HER2×코티닌 직렬식 scFv Fc 용액(570 μg/mL) 44 μL를 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 부드럽게 섞어 주었다. 5,000×g에서 원심분리 여과(분자량 차단값 300 kDa)하여 나노튜브에 결합하지 않은 항체를 제거하였다. 이렇게 얻은 탄소 나노튜브-항체 접합체를 이하 각각 SNA-1(1-Cot-PhO-dex 사용)과 SNA-3(3-Cot-PhO-dex 사용)이라고 일컫겠다. In order to synthesize the SWNT-tandem antibody conjugate, first, the glassy Cot-PhO-dex was removed from the functionalized SWNT solution prepared in Example 2 using centrifugal filtration (molecular weight cutoff value 100 kDa) (pH 7.4, 10 mM). Next, 44 μL of the above-mentioned anti-HER2 × cotinine scFv Fc solution (570 μg / mL) was added to 0.956 mL of this functionalized SWNT solution (0.84 mg / mL) and gently mixed at room temperature for 4 hours. And centrifuged at 5,000 x g (molecular weight cut-off value 300 kDa) to remove antibodies that did not bind to the nanotubes. The carbon nanotube-antibody conjugates thus obtained are hereinafter referred to as SNA-1 (using 1-Cot-PhO-dex) and SNA-3 (using 3-Cot-PhO-dex), respectively.

SNA-1과 SNA-3을 원자간력 현미경(AFM), 자외선-가시광선 분광법, 광발광, 라만 분광법, 비신코니닉산(BCA) 정량법 및 표면 플라스몬 공명을 이용하여 분석하였다.SNA-1 and SNA-3 were analyzed using atomic force microscopy (AFM), ultraviolet-visible spectroscopy, photoluminescence, Raman spectroscopy, BCA quantitation and surface plasmon resonance.

<실험예 2> 원자간력 현미경 분석Experimental Example 2 Atomic force microscope analysis

1-Cot-PhO-dex 작용기화 탄소 나노튜브, 3-Cot-PhO-dex 작용기화 탄소 나노튜브와 SNA-1과 SNA-3의 형상을 원자간력 현미경으로 관찰하였다. 도 3(a)~3(c)는 이들의 AFM 영상과 높이 대 길이 분포(height vs length profile)이다. 작용기화 SWNT들은 잘 나뉘어 용액에 분산되었고, 평균 높이는 2.2 nm였다. 그러나, 기능화된 SWNT에 이중 특이적 항체를 접합한 후 평균 높이는 6.5 nm로 증가하였는데(도 3(d)~3(f)), 이는 이중 특이적 항체가 성공적으로 작용기화 SWNT에 접합하였음을 가리킨다. 게다가, SNA들은 PBS 용액 속에서 뭉치지(aggregation) 않고 안정적으로 유지되었다.1-Cot-PhO-dex functionalized carbon nanotubes, 3-Cot-PhO-dex functionalized carbon nanotubes, SNA-1 and SNA-3 were observed by atomic force microscopy. Figs. 3 (a) -3 (c) are the AFM images and the height vs length profile. The functionalized SWNTs were well dispersed in solution and the average height was 2.2 nm. However, after conjugation of the bispecific antibody to the functionalized SWNT, the average height increased to 6.5 nm (Fig. 3 (d) to 3 (f)) indicating that the bispecific antibody successfully conjugated to the functionalized SWNT . In addition, SNAs remained stable in PBS solution without aggregation.

<실험예 3> 탄소 나노튜브-항체 접합체 속의 항체 함량 분석<Experimental Example 3> Analysis of antibody content in carbon nanotube-antibody conjugate

BCA 정량법을 이용하여 작용기화 SWNT에 접합한 이중 특이적 항체의 양을 측정하였다. 실시예 2에서 합성한 작용기화 SWNT와 이중 특이적 항체의 접합 반응 후, 원심 분리 여과(분자량 차단값 300 kDa)로 용액 속의 유리 항체를 제거하였고, 이 제거된 안티바디를 BCA 정량하였다. 도 4(a)에 나타낸 것과 같이, 먼저 농도를 알고 있는 소 혈청 알부민(BSA)을 표준 물질로 하여 검정 곡선을 얻은 뒤 562 nm에서 제거된 항체의 양을 최초 항체량에서 뺌으로써 작용기화 탄소 나노튜브에 접합한 이중 특이적 항체량을 구하였다. 도 4(b)로부터 3-Cot-PhO-dex로 작용기화한 탄소 나노튜브(113×10^-3 g 항체/g 접합체)가 1-Cot-PhO-dex로 작용기화한 탄소 나노튜브(92×10^-3 g 항체/g 접합체)보다 표면 항체 밀도가 더 크다는 것을 알 수 있다. The amount of bispecific antibody conjugated to the functionalized SWNTs was determined using BCA assays. After the conjugation reaction between the functionalized SWNT synthesized in Example 2 and the bispecific antibody, the glass antibody in the solution was removed by centrifugal filtration (molecular weight cutoff value: 300 kDa), and the removed anti body was quantitated with BCA. As shown in FIG. 4 (a), first, a calibration curve was obtained using bovine serum albumin (BSA) having known concentration as a standard, and then the amount of antibody removed at 562 nm was subtracted from the initial antibody amount, The amount of bispecific antibody conjugated to the tube was determined. 4 (b) shows that carbon nanotubes functionalized with 3-Cot-PhO-dex (113 × 10 ^-3 g antibody / g conjugate) were carbon nanotubes functionalized with 1-Cot-PhO- 10 &lt; ^-3 &gt; g antibody / g conjugate).

종래 기술의 탄소 나노튜브-항체 접합체와 비교Comparison with prior art carbon nanotube-antibody conjugates

종래 기술의 카르보디이미드 화학을 이용한 공유결합 접합 방식의 탄소 나노튜브-항체와 본 발명 접합체의 항체 밀도를 비교하였다. N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드(EDC) 염화수소화물과 N-히드록시숙신이미드(NHS)시약을 이용하여 작용기화 SWNT 표면의 결함 카르복시기에 항체를 공유결합으로 접합하였다. 도 4(b)에 나타낸 것과 같이, EDC 커플링 시약을 이용하면 많은 양의 항체를 SWNT에 접합할 수 있었다(120×10^-3 g 항체/g 접합체). The antibody densities of the covalent bonding type carbon nanotube-antibody and the conjugate of the present invention using carbodiimide chemistry of the prior art were compared. N- (3- dimethylaminopropyl) - N '- ethylcarbodiimide (EDC) hydrochloric cargo and N - hydroxysuccinimide (NHS) functionalized with a reagent covalently linked to an antibody to the carboxyl group of the SWNT surface defects Respectively. As shown in Figure 4 (b), a large amount of antibody could be conjugated to SWNT using an EDC coupling reagent (120 x ^10-3 g antibody / g conjugate).

<실험예 4> 본 발명 접합체의 광학적 분석<Experimental Example 4> Optical analysis of the conjugate of the present invention

도 5(a)에 나타내었듯이 SNA-1과 SNA-3은 여기-방출 프로파일에서 강한 근적외선 형광을 보였다. 그러나 SNA의 상대적인 형광 강도는 작용기화 탄소 나노튜브에 비교하였을 때 약간 감소하였는데(도 5(b)), 본 발명의 작용 원리에 대하여 어떠한 특정한 이론에 얽매이고자 하는 의도는 아니지만, 이는 SWNT로부터 접합한 항체의 티로신, 트립토판 및 히스티딘과 같은 산화-환원에 활성인 아미노산 잔기로 전하 이동이 일어났기 때문이라고 생각된다. 표면에 단백질의 흡착으로 인한 SWNT 형광 강도의 감소는 이전에 보고된 문헌에서도 발견된 바 있다. 그러므로, 상기 형광 강도의 감소는 간접적으로 SWNT 표면에 항체가 성공적으로 접합하였음을 시사한다. 상기 얻어진 SNA는 1588 cm^-1에서 매우 강렬한 공명 라만 신호를 보였다. <실험예 5>본 발명과 종래 기술 접합체의 유효 결합력 측정As shown in Fig. 5 (a), SNA-1 and SNA-3 showed strong near-infrared fluorescence in the excitation-emission profile. However, the relative fluorescence intensities of SNAs decreased slightly when compared to functionalized carbon nanotubes (Fig. 5 (b)), although not intending to be bound by any particular theory on the working principle of the present invention, It is believed that this is due to the charge transfer to the amino acid residues active in oxidation-reduction such as tyrosine, tryptophan and histidine of the antibody. Reduction of SWNT fluorescence intensity due to adsorption of proteins on the surface has also been found in previously reported documents. Thus, the reduction in fluorescence intensity suggests that the antibody was successfully conjugated indirectly to the SWNT surface. The obtained SNA showed a very intense resonance Raman signal at 1588 cm ^-1 . &Lt; Experimental Example 5 > Measurement of effective binding force of the present invention and prior art conjugate

종래 기술의 EDC 커플링제로 제조한 실험예 3 접합체의 유효 결합 친화력을 SNA-1 및 SNA-3과 비교하였다.The effective binding affinities of the conjugates prepared in the prior art EDC coupling agent were compared to those of SNA-1 and SNA-3.

0.005 부피% Tween 20을 포함하는 PBS 용액을 BIAcore 표면 플라스몬 공명 측정기의 센서칩에 10분 동안 주입한 후, 칩 표면의 카르복시기를 활성화하기 위하여 CM5칩에 EDC/NHS 용액(EDC 0.6 M과 NHS 0.2 M)을 10 μL/min으로 5분 동안 주입하였다. 과량의 반응물을 제거하기 위하여 칩을 PBS로 5분간 세척한 다음, 반응 신호가 24000 RU가 될 때까지 90 μL의 HER2-Fc(75 μg/mL)를 칩에 주입하였다. HER2-Fc는 칩 표면에 250 fmol/mm²의 농도로 고정되었다. 0.005 부피% Tween 20을 포함하는 PBS 용액으로 칩을 세척한 다음, 카르복시-NHS 에스테르를 비활성화하기 위하여 에탄올아민(0.5 M) 50 μL를 주입했다. HER2-Fc를 포함하는 칩을 운전 완충액(PBS)으로 세척한 다음, 100 내지 800 μg/mL 범위에서 SNA-1 또는 SNA-3 200 μL를 반응 포화가 관찰될 때까지 10 μL/min로 주입하였다. 그 후, 칩에 운전 완충액을 10분 동안 흘려주었다. 대조군으로서, 항원을 포함하지 않은 CM5 칩의 다른 표면 위에 SNA를 흘리고, 이에서 발생하는 신호를 제함으로써 항원에 대한 특이적인 결합만을 측정하였다. 실험의 각 사이클 후에, 글리신/HCl 용액(10 mM, pH 2.0)을 6분 동안 주입하여 센서칩을 재생하였다. EDC 커플링 시약으로 제조한 접합체의 유효 결합 친화력 측정도 동일한 방법으로 수행하였다.After the PBS solution containing 0.005% by volume Tween 20 was injected into the sensor chip of the BIAcore surface plasmon resonance instrument for 10 minutes, an EDC / NHS solution (EDC 0.6 M and NHS 0.2 M ) was injected at 10 μL / min for 5 minutes. The chip was washed with PBS for 5 minutes to remove excess reactants and 90 μL of HER2-Fc (75 μg / mL) was injected into the chip until the reaction signal was 24000 RU. HER2-Fc was immobilized on the chip surface at a concentration of 250 fmol / mm ² . The chip was washed with a PBS solution containing 0.005% Tween 20 and then 50 μL of ethanolamine (0.5 M ) was injected to inactivate the carboxy-NHS ester. The chip containing HER2-Fc was washed with driving buffer (PBS) and 200 μL of SNA-1 or SNA-3 was injected at 10 μL / min until the reaction saturation was observed in the range of 100 to 800 μg / mL . Thereafter, the chip was flushed with the driving buffer for 10 minutes. As a control, only the specific binding to the antigen was measured by flowing the SNA onto the other surface of the CM5 chip that did not contain the antigen and removing the signal generated therefrom. After each cycle of the experiment, the sensor chip was regenerated by injecting a glycine / HCl solution (10 mM, pH 2.0) for 6 minutes. Measurement of the effective binding affinity of the conjugate prepared from the EDC coupling reagent was also performed in the same manner.

도 6의 센소그램(sensogram)에 나타낸 것과 같이, SNA-1, SNA-3 및 실험예 3의 종래 기술 접합체의 BIAcore 반응값(response value)은 투입 농도가 증가함에 따라 증가하였고, 이는 칩의 표면에서 접합체와 HER2가 결합하는 것을 명확하게 나타낸다. 칩에 운전 완충액을 투입한 후에는 복합체의 분리 또한 관찰되었다. 이렇게 얻은 센소그램을 랭뮤어 결합 모형(Langmuir binding model)에 맞추어. SNA 및 EDC 커플링 접합체의 결합 속도 상수 및 평형 해리 상수를 구하였다. 이 상수를 표 1에 정리하였다. As shown in the sensogram of FIG. 6, the BIAcore response values of SNA-1, SNA-3 and prior art conjugates of Experimental Example 3 increased with increasing input concentration, Lt; RTI ID = 0.0 &gt; HER2. &Lt; / RTI &gt; Separation of the complex was also observed after the driving buffer was added to the chip. The sensograms thus obtained were fitted to the Langmuir binding model. The binding rate constants and equilibrium dissociation constants of the SNA and EDC coupling conjugates were determined. These constants are summarized in Table 1.

본 발명의 접합체인 SNA-1은 평형 해리 상수가 1.58×10^-8로서, 항체의 접합 방향이 무작위한 종래 기술의 EDC 접합체의 평형 해리 상수 1.54×10^-6 M^-1보다 값이 훨씬 작아, SNA-1이 EDC 접합체보다 HER2에 대한 유효 결합 친화력이 두 자릿수만큼 더 크다는 것을 나타낸다. 항체의 밀도가 더 높은 SNA-3은 해리 상수(4.73×10^-9)가 SNA-1보다 더 작아서 SNA-3가 SNA-1보다 HER2에 대하여 한 자릿수 더 큰 결합 친화력을 가지는 것을 보여 주었다. 이 결과는 SWNT 표면의 방향 제어된 항체의 밀도가 높아지면 접합체의 유효 결합 친화력도 향상된다는 것을 시사한다. 본 발명의 작용 원리에 대하여 어떠한 특정한 이론에 얽매이고자 하는 의도는 아니지만, 이렇게 나노미터 규모에서 항체 밀도의 조절이 친화력의 강화로 나타나는 것은 그 까닭이 적어도 부분적으로는 표적 물질에 대하여 접합체 항체가 다가성(mutivalency)을 지니게 된 것에 있다고 생각된다.A conjugate of SNA-1 is the equilibrium dissociation constant 1.58 × 10 ^-8 of the invention, the bonding direction of antibody equilibrium dissociation constant than 1.54 × 10 ^-6 M ^-1 for EDC conjugates of the prior art random much smaller, Indicating that SNA-1 is two orders of magnitude larger in effective binding affinity for HER2 than EDC conjugate. The higher antibody density of SNA-3 showed that the dissociation constant (4.73 × 10 ^-9 ) was smaller than SNA-1, indicating that SNA-3 had one-digit greater affinity for HER2 than SNA-1. These results suggest that the higher the density of the directionally controlled antibody on the SWNT surface, the better the binding affinity of the conjugate. It is not intended to be bound by any particular theory as to the working principle of the present invention, but the control of the antibody density on the nanometer scale thus appears as an enhancement of affinity, at least in part because the conjugate antibody is multivalent (mutivalency).

탄소 나노튜브-항체 접합체를 이용한 선택적 표적 인식과 영상화Selective Target Recognition and Imaging using Carbon Nanotube-Antibody Conjugates

HER2에 대한 유효 결합 친화력이 가장 높은 것으로 판단된 SNA-3을 선택하여 강한 공명 라만 신호를 이용하여 암세포를 탐지하였다. 암 진단에 중요한 생체표지인 수용체 티로신 키나아제 HER2는 유방암 및 난소암 조직에서 과발현된다. HER2를 과발현하는 것으로 잘 알려진 SK-BR-3 유방암 세포를 SNA-3을 이용한 HER2의 세포 탐지의 양성 세포주(positive cell line)로 선택하였고, HER2 발현 수준이 매우 낮은 MCF 유방암 세포를 음성군 세포주로 선택하였다. SNA-3 was selected as the most effective binding affinity for HER2, and cancer cells were detected using a strong resonance Raman signal. Receptor tyrosine kinase HER2, an important biomarker for cancer diagnosis, is overexpressed in breast and ovarian cancer tissues. SK-BR-3 breast cancer cells, which are known to overexpress HER2, were selected as positive cell lines for HER2 cell detection using SNA-3, and MCF breast cancer cells with very low HER2 expression levels were selected as negative cell lines Respectively.

SK-BR-3(또는 MCF-7) 유방암 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 표준 세포 배양 조건(CO₂ 5%, 36.5℃)으로 배양하였다. 배양 접시(지름 20 mm)에서 세포 합류(confluence)가 90%에 도달하였을 때, 세포에 트립신-EDTA 1 mL을 가하였다. 트립신에 의해 배지에 분산되어 있는 세포를 원심분리한 다음, 원심분리한 다음, 커버슬립을 포함하는 6-웰 플레이트(6-well plate)에 나누었다. 그 후, 세포 합류가 10%에 도달할 때까지 세포를 배양하였고, PBS(pH 7.4, 10 mM)로 세척하였다. SNA가 세포 안으로 내포되는 것을 방지하기 위해서 세포 배양 접시에 포름알데히드 수용액(3.7 %)을 첨가하고, 실온에서 15분 동안 부드럽게 섞어서 세포를 고정하였다. 고정된 SK-BR-3 세포를 PBS(10 mM)로 세 번 세척한 다음, SNA-3(10 μg/mL, PBS) 2 mL를 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 동안 부드럽게 흔들어 주었다. 결합하지 않은 SNA를 PBS로 세척한 다음, 라만 영상화 전에 마운팅 용액(Life technologies(상표))을 표적 SK-BR-3 세포에 첨가하였다. 633 nm 레이저가 장착된 공초점 현미경 라만 시스템으로 세포를 영상화하였다. 0.3 초 노출 시간으로 200부터 3000 nm까지 라만 영상을 얻었다.SK-BR-3 (or MCF-7) breast cancer cells were cultured in standard cell culture conditions (CO ₂ 5%, 36.5 ° C) in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin- . When the cell confluence reached 90% in the culture dish (diameter 20 mm), 1 mL of trypsin-EDTA was added to the cells. Cells dispersed in the medium by trypsin were centrifuged, centrifuged, and then divided into 6-well plates containing cover slips. The cells were then cultured until the cell confluence reached 10% and washed with PBS (pH 7.4, 10 mM). To prevent the SNA from being contained in the cells, a formaldehyde aqueous solution (3.7%) was added to the cell culture dishes and the cells were fixed by gentle mixing at room temperature for 15 minutes. The immobilized SK-BR-3 cells were washed three times with PBS (10 mM), and then 2 mL of SNA-3 (10 μg / mL, PBS) was added and gently shaken at room temperature for 1.5 hours. Unbound SNA was washed with PBS and mounting solution (Life technologies (TM)) was added to the target SK-BR-3 cells before Raman imaging. Cells were imaged with a confocal microscope Raman system equipped with a 633 nm laser. Raman images were obtained from 200 to 3000 nm at 0.3 second exposure time.

도 7(a)~7(c)에 나타낸 것과 같이, SNA-3로 처리한 MCF-7 세포의 라만 영상에서는 SNA-3의 라만 신호가 감지되지 않았다(오른쪽 열 사진). 도 7(g)는 MCF-7 세포의 대표적인 라만 스펙트럼을 나타내는데, SWNT의 특징적인 라만 피크가 나타나지 않았다. 그러나 도 7(d)~7(f)의 오른쪽 열 사진에서는 SNA-3 처리한 SK-BR-3 세포의 라만 영상에서 강력한 SNA-3 라만 신호가 두드러졌다. 또한, SK-BR-3 세포의 대표 라만 스펙트럼의 1585 cm^-1에서 SWNT의 특징적인 라만 피크가 강하게 나타났다(도 7(h)). 도 7(i)에 나타난 것과 같이, SK-BR-3 및 MCF-7 세포의 4개의 다른 라만 영상으로부터 1585 cm^-1에서 SNA-3의 라만 강도의 평균값을 계산하였다. SK-BR-3 세포에서만 강한 SNA-3의 라만 신호가 감지되었고, MCF-7 세포에서는 미약한 배경값이 관측되었다. 이러한 결과는 강한 라만 신호를 기반으로 SNA-3이 HER2-과발현 암세포를 선택적이며 효과적으로 탐지할 수 있다는 것을 명백하게 나타낸다.As shown in Figs. 7 (a) to 7 (c), the Raman signal of SNA-3 was not detected in the Raman image of MCF-7 cells treated with SNA-3 (right column photograph). Figure 7 (g) shows a representative Raman spectrum of MCF-7 cells, with no characteristic Raman peak of SWNT. However, in the right column of FIGS. 7 (d) to 7 (f), a strong SNA-3 Raman signal was prominent in the Raman image of SK-BR-3 cells treated with SNA-3. In addition, the characteristic Raman peak of SWNT was strongly observed at 1585 cm ^-1 of representative Raman spectrum of SK-BR-3 cells (Fig. 7 (h)). As shown in Fig. 7 (i), the average value of Raman intensity of SNA-3 at 1585 cm ^-1 was calculated from four different Raman images of SK-BR-3 and MCF-7 cells. Strong SNA-3 Raman signal was detected only in SK-BR-3 cells and slight background value was observed in MCF-7 cells. These results clearly demonstrate that SNA-3 can selectively and effectively detect HER2-overexpressing cancer cells based on the strong Raman signal.

전술한 바와 같이 특정 내용과 일부 실시예를 들어 본 발명을 설명하였으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 구체적인 예로써 제시한 설명일 뿐임을 밝혀 둔다. 본 발명은 전술한 실시 형태들로만 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 실시 형태에 대하여 다양한 수정 및 변형을 할 수 있고, 이러한 수정 및 변형도 본 발명의 기술 사상 속에서 망라하고 있다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to certain exemplary embodiments thereof, it should be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be taken by way of limitation. It will be understood by those skilled in the art that various changes and modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention as defined in the appended claims. .

따라서 앞에서 설명한 실시 형태들과 후술하는 특허 청구의 범위는 물론, 이 특허 청구 범위의 모든 균등물이나 등가인 변경 실시 형태들도 본 발명 기술 사상의 범주에 속한다.Accordingly, all equivalents of the claims and their equivalents, as well as the embodiments described hereinabove and the appended claims, are also within the scope of the present invention.

Claims (18)

변형 덱스트란으로서, 상기 변형 덱스트란은
천연형 덱스트란을 구성하는 글루코스 단위와 동일한 미변형 글루코스 단위와 변형 글루코스 단위들의 중합체이며, 이 때 상기 변형 글루코스 단위는 미변형 글루코스 단위에 존재하는 자유 수산기 중 일부가 아래 화학식 5를 중간체로 하여 화학식 6의 작용기로 변형된 구조이고,
상기 변형 덱스트란에서 변형과 미변형 글루코스 단위들을 합한 총 수는 30~90이며, 상기 변형 덱스트란 단위 무게 당 화학식 5의 작용기 중간체가 차지하는 비율은 0.5~5 mmol/g이고, 화학식 6의 작용기가 차지하는 비율은 0.1~1 mmol/g인 변형 덱스트란:
<화학식 5>

<화학식 6>

단 이 때 Ar는 탄소 나노튜브와 π-π 상호작용을 일으킬 수 있는 아릴기이며, Ang는 분자량이 0.1~5 kDa인 소형 유기 분자 부위로서, 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 합텐이다.As the modified dextran, the modified dextran
Modified glucose units and modified glucose units identical to the glucose units constituting the natural type dextran, wherein the modified glucose units are those in which some of the free hydroxyl groups present in the unmodified glucose units are represented by the following formula (5) 6, < / RTI >
Wherein the total number of modified and unmodified glucose units in the modified dextran is 30 to 90, the ratio of the functional intermediate of Formula 5 to the modified dextran unit weight is 0.5 to 5 mmol / g, Deformation ratio of 0.1 to 1 mmol / g,
&Lt; Formula 5 >

(6)

In this case, Ar is an aryl group capable of causing a π-π interaction with carbon nanotubes, and Ang is a small organic molecule having a molecular weight of 0.1 to 5 kDa, which is a hapten capable of specifically binding to an antibody. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 5를 중간체로 하는 화학식 6의 변형은 미변형 글루코스 단위의 2번 탄소에 부착된 수산기에 일어난 변형인 것을 특징으로 하는 변형 덱스트란.The modified dextran of claim 1, wherein the modification of formula (6) having the formula (5) as an intermediate is a modification of hydroxyl group attached to carbon number 2 of the unmodified glucose unit. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 5의 작용기는 아래 화학식 7의 작용기인 것을 특징으로 하는 변형 덱스트란.
<화학식 7>

The modified dextran of claim 1, wherein the functional group of formula (5) is a functional group of the following formula (7).
&Lt; Formula 7 >

제 1항에 있어서, 상기 OAng는 화학식 8의 작용기인 것을 특징으로 하는 변형 덱스트란.
<화학식 8>

The modified dextran of claim 1, wherein said OAng is a functional group of formula (8).
(8)

제 1항에 있어서, 상기 Ar은 페닐, 나프틸, 톨루일, 자일릴 및 인돌릴 중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 변형 덱스트란.2. The modified dextran of claim 1, wherein Ar is selected from phenyl, naphthyl, tolyl, xylyl and indolyl. 탄소 나노튜브; 및
상기 탄소 나노튜브의 길이 방향을 따라 감겨 있거나 대체로 평행하게 회합(會合 association)하고 있는 제 1항의 변형 덱스트란을 포함하고,
상기 변형 덱스트란과 상기 탄소 나노튜브 사이에는 공유결합이 형성되어 있지 않은 작용기화 탄소 나노튜브. Carbon nanotubes; And
The modified dextran of claim 1, wherein the modified dextran is rolled or substantially parallel to the longitudinal direction of the carbon nanotubes,
Wherein the covalent bond is not formed between the deformed dextran and the carbon nanotube. 제 6항에 있어서, 상기 탄소 나노튜브는 단일벽 탄소 나노튜브인 것을 특징으로 하는 작용기화 탄소 나노튜브.7. The functionalized carbon nanotube according to claim 6, wherein the carbon nanotube is a single wall carbon nanotube. 제 6항의 작용기화 탄소 나노튜브; 및
상기 작용기화 탄소 나노튜브의 Ang와 상기 Ang가 아닌 표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 이중 특이적 항체를 포함하는 접합체로서,
상기 이중 특이적 항체는 상기 접합체 내에서 Ang와 특이적으로 비공유결합하고 있고, 상기 이중 특이적 항체내에서 표적 물질과 Ang 결합 부위는 각각 서로 다른 사슬에 위치하거나, 같은 사슬내 서로 다른 영역(domain) 속에 각각 위치하는 탄소 나노튜브-항체 접합체.The functionalized carbon nanotube of claim 6; And
A conjugate comprising a bispecific antibody capable of specifically binding to the Ang of the functionalized carbon nanotube and a target substance other than the Ang,
Wherein the bispecific antibody specifically binds to Ang in the conjugate and the target substance and the Ang binding site in the bispecific antibody are located in different chains or in different regions in the same chain ). &Lt; / RTI &gt; 제 8항에 있어서, 상기 이중 특이적 항체의 표적 물질과 Ang 결합 부위는 같은 사슬 내에 위치하는 서로 다른 영역에 각각 자리잡고, 각 영역은 단쇄 가변 분절이며, 이 단쇄 가변 분절들은 직렬식(tandem scFv)으로 연결된 것을 특징으로 하는 탄소 나노튜브-항체 접합체.9. The antibody of claim 8, wherein the target substance and Ang binding site of the bispecific antibody are each located in different regions located within the same chain, each region being a short chain variable segment, the tandem variable fragments being tandem scFv ). &Lt; / RTI &gt; 제 9항에 있어서, 상기 이중 특이적 항체는 상기 접합체의 단위 무게 당 1.0~2.0 μmol/g의 밀도로 결합하고 있는 것을 특징으로 하는 탄소 나노튜브-항체 접합체.10. The CNT-antibody conjugate according to claim 9, wherein the bispecific antibody binds at a density of 1.0 to 2.0 占 퐉 ol / g per unit weight of the conjugate. 제 8항에 있어서, 상기 표적 물질은 세포 표면에 존재하는 생분자인 것을 특징으로 하는 탄소 나노튜브-항체 접합체.9. The CNT-antibody conjugate according to claim 8, wherein the target substance is a biomolecule present on the cell surface. 제 11항에 있어서, 상기 생분자는 암세포에 특이적이거나, 암세포에서 과다 발현되는 것을 특징으로 하는 탄소 나노튜브-항체 접합체.12. The CNT-antibody conjugate according to claim 11, wherein the biomolecule is specific to cancer cells or overexpressed in cancer cells. 제 1항의 변형 덱스트란;
탄소 나노튜브; 및
상기 변형 덱스트란의 Ang와 상기 Ang가 아닌 표적 물질에 대하여 특이적으로 비공유결합할 수 있는 이중 특이적 항체를 포함하고, 이들 세 성분이 각각 분리되어 존재하는 키트.A modified dextran of claim 1;
Carbon nanotubes; And
And a bispecific antibody capable of specifically binding non-covalently to a target substance other than the Ang and the Ang of the modified dextran, wherein the three components are separately present. (1) 표적 물질의 존부를 측정할 시료를 고상의 표면에 고정하는 단계;
(2) 제 9항의 탄소 나노튜브-항체 접합체로서, 상기 표적 물질을 특이적으로 인식하는 이중 특이적 항체를 지닌 탄소 나노튜브-항체 접합체와 상기 고정된 시료를 접촉시키는 단계;
(3) 상기 접촉 후 특이적으로 결합하지 않은 탄소 나노튜브-항체 접합체를 제거하는 단계; 및
(4) 상기 고정된 시료로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함하고, 이 때 상기 신호는 아래 (ㄱ) 내지 (ㄷ) 중 적어도 어느 한 신호인 표적 물질의 검출 방법:
(ㄱ) 상기 고정된 시료에 자외선 내지 적외선 영역에 속하는 빛을 조사한 후 발생하는 라만 신호,
(ㄴ) 상기 고정된 시료에 근적외선을 조사하여 발생하는 광발광 신호와
(ㄷ) 표면 플라스몬 공명 신호.(1) immobilizing a sample to be measured for the presence or absence of a target substance on a surface of a solid phase;
(2) The carbon nanotube-antibody conjugate according to (9), wherein the carbon nanotube-antibody conjugate having a bispecific antibody specifically recognizing the target substance is contacted with the immobilized sample;
(3) removing the unconjugated carbon nanotube-antibody conjugate after the contacting; And
(4) detecting a signal generated from the fixed sample, wherein the signal is at least one of the following (a) to (c):
(A) a Raman signal generated after irradiating the fixed sample with ultraviolet light or infrared light,
(B) a photoluminescence signal generated by irradiating near infrared rays to the fixed sample and
(C) surface plasmon resonance signal. 제 14항에 있어서, 상기 표적 물질은 암세포에 특이적인 세포 표면에 존재하는 생분자인 것을 특징으로 하는 표적 물질의 검출 방법.15. The method of claim 14, wherein the target substance is a biomolecule existing on a cell surface specific to cancer cells. 제 15항에 있어서, 상기 (2) 단계 후 (3) 단계 개시 전에 고정된 시료를 포름알데히드 수용액으로 처리하는 단계를 더 포함하는 표적 물질의 검출 방법.16. The method of claim 15, further comprising treating the fixed sample with an aqueous formaldehyde solution before step (3) after step (2). 제 14항에 있어서, 상기 접합체의 탄소 나노튜브는 단일벽 나노튜브이고, 상기 라만 신호의 검출은 1585 ± 5 cm^-1의 이동값에서 공명 라만 신호를 검출하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 검출 방법.15. The method of claim 14, wherein the carbon nanotube of the conjugate is a single-walled nanotube, and the detection of the Raman signal detects a resonant Raman signal at a moving value of 1585 5 cm ^-1 . . 제 17항에 있어서, 상기 공명 라만 신호의 검출은 공초점 현미경을 이용한 라만 영상화인 것을 특징으로 하는 표적 물질의 검출 방법.18. The method of claim 17, wherein the detection of the resonant Raman signal is Raman imaging using a confocal microscope.

Images