JP2010083803A - Gold fine particle, method for producing the same and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微子（金ナノロッド）と、その製造方法と、その集積方法、およびその用途に関する。 The present invention includes an organic substance (A) having a site compatible with a dispersion medium, having a linker bonded to a gold fine particle at one end, and a site compatible with a dispersion medium having a polymerization average molecular weight larger than that of the organic substance (A). , A rod-shaped gold micron (gold nanorod) modified with an organic substance (B) having a peptide that specifically binds to a target site at both ends and a linker that binds to gold microparticles, its production method, and its integration It relates to a method and its use.
本発明は、より具体的には、分散媒に相溶する部位を含み分子量の異なる２種の高分子で金ナノロッドを修飾して分散媒中で金ナノロッドを安定に分散するものであり、分子量の大きな高分子にペプチドを導入しておくことで、高分子中へのペプチド部位の埋没を防ぎ、ペプチドが標的物質から認識される確率を高めた金ナノロッドとその製造方法であり、標的物質に結合し金ナノロッドが集積することを利用した標的物質の検出方法と金ナノロッドの標的部位への集積方法、金ナノロッドが集積した部位のフォトサーマル治療やバイオイメージング、そして標的物質が存在する部位への薬物輸送方法として有用である。 More specifically, the present invention is a method in which gold nanorods are modified with two types of polymers having different molecular weights including a portion compatible with the dispersion medium, and the gold nanorods are stably dispersed in the dispersion medium. This is a gold nanorod and its manufacturing method that prevents the peptide site from being buried in the polymer and increases the probability that the peptide is recognized from the target substance by introducing the peptide into a large polymer. Detection method of target substance using the combination of gold nanorods and gold nanorods, and integration method of gold nanorods on the target site, photothermal treatment and bioimaging of the site where gold nanorods are integrated, and the site where the target substance exists It is useful as a drug delivery method.
溶媒中に分散した金属微粒子に光を照射すると局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon resonance：ＬＳＰＲ）と呼ばれる共鳴吸収現象が生じる。この吸収現象は金属の種類と形状、そして金属微粒子周囲における媒体の屈折率によって吸収波長が決定される。例えば、球状の金微粒子が水に分散した場合は５３０nm付近に吸収域を持ち、金微粒子の形状を短軸１０ｎｍ程度のロッド状（金ナノロッド）にすると、ロッドの短軸に起因する５３０nm付近の吸収の他に、ロッドの長軸に起因する長波長側の吸収を有することが知られている（非特許文献１）。 When light is applied to metal fine particles dispersed in a solvent, a resonance absorption phenomenon called Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) occurs. The absorption wavelength is determined by the type and shape of the metal and the refractive index of the medium around the metal fine particles. For example, when spherical gold fine particles are dispersed in water, there is an absorption region around 530 nm, and if the shape of the gold fine particles is made into a rod shape (gold nanorod) with a short axis of about 10 nm, it is around 530 nm due to the short axis of the rod. In addition to absorption, it is known to have absorption on the long wavelength side caused by the long axis of the rod (Non-Patent Document 1).
これらの金属微粒子分散液は、低分子化合物や高分子化合物を保護剤として金属微粒子表面に吸着ないし結合させることによって、金属微粒子が凝集することなく安定に溶媒に分散させることができる。特に金ナノロッドは形状の変化や凝集状態変化、金ナノロッド周辺の環境によって分光特性が変化する特異な金微粒子であり（非特許文献２、３、４）、近赤外光をプローブとして用いる新しい分光分析の材料として可能性がある。 These metal fine particle dispersions can be stably dispersed in a solvent without aggregation of the metal fine particles by adsorbing or binding to the surface of the metal fine particles using a low molecular compound or a polymer compound as a protective agent. In particular, gold nanorods are unique gold fine particles whose spectroscopic properties change depending on changes in shape, changes in the state of aggregation, and the environment around the gold nanorods (Non-Patent Documents 2, 3, and 4). Potential as analytical material.
金ナノロッドはアスペクト比（長軸長さ／短軸長さ）が１より大きいロッド状のナノサイズの金微粒子であり、例えば、カチオン性界面活性剤である第四級アンモニウム塩のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）に溶解した水中で合成され、ＣＴＡＢ水溶液中の金イオンを化学還元、電気還元、光還元などによって合成することが可能であり、合成した金ナノロッドはＣＴＡＢの保護作用によって水中で安定に分散している（特許文献１、２、３、４）。
Gold nanorods are rod-shaped nano-sized gold fine particles having an aspect ratio (major axis length / minor axis length) of more than 1, for example, quaternary ammonium salt hexadecyltrimethylammonium that is a cationic surfactant. Synthesized in water dissolved in bromide (CTAB), it is possible to synthesize gold ions in CTAB aqueous solution by chemical reduction, electroreduction, photoreduction, etc. The synthesized gold nanorods are stable in water by the protective action of CTAB (
近年、金ナノロッドにアビジン−ビオチン、抗原−抗体などの相互作用による目的物質への特異的な吸着反応を利用した研究が報告されており、抗体を介してがん細胞に金ナノロッドを取り込ませることによって、金ナノロッドの二光子発光によるがん細胞のイメージングが可能であることが報告されている（非特許文献５）。 In recent years, studies using gold nanorods that utilize specific adsorption reactions to target substances through interactions such as avidin-biotin and antigen-antibody have been reported, and gold nanorods can be incorporated into cancer cells via antibodies. It is reported that imaging of cancer cells by two-photon emission of gold nanorods is possible (Non-patent Document 5).
また、αｖβ3インテグリンに特異的に認識されるペプチドについて、環状ＲＧＤ（アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ））ペプチドが高い選択性を示すことが報告されている（非特許文献６、特許文献５、６、７、８、９、１０）。さらに、金微粒子、ＲＧＤペプチド、インテグリンの組成物が報告されている（特許文献１１）。 In addition, regarding peptides specifically recognized by αvβ 3 integrin, it has been reported that cyclic RGD (arginine (R), glycine (G), aspartic acid (D)) peptides exhibit high selectivity (non-patented). Document 6, Patent Documents 5, 6, 7, 8, 9, 10). Furthermore, a composition of gold fine particles, RGD peptide, and integrin has been reported (Patent Document 11).
さらに、α−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコールを修飾した金ナノロッドをバイオマーカーとしてマウスに注入し、一定時間経過後に血中や各器官を分別採取しそれぞれの部位における金ナノロッドの濃度を測定することによって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾した金ナノロッドの血液中での分散安定性が報告されている（非特許文献７）。また、チオプロニン保護した金微粒子にＰＥＧ部位を有する分子鎖を介してＲＧＤ配列を含むＧＲＧＤＳＰペプチドを導入し、分子鎖の化学構造の違いによる細胞への結合挙動が報告されている（非特許文献８）。
特許文献１〜４などの方法で合成された金ナノロッドはＣＴＡＢに被覆された状態で水中に分散しているが、特定部位で集積する機能は有していない。
Gold nanorods synthesized by methods such as
非特許文献５は、金ナノロッドをポリスチレンスルホネートで表面処理後に抗体と結合させているが、金ナノロッドの二光子発光を測定するための処理方法であり、金ナノロッドのＬＳＰＲをセンシング技術やバイオイメージングに応用したものではない。 Non-Patent Document 5 discloses that gold nanorods are bound to an antibody after surface treatment with polystyrene sulfonate, but this is a processing method for measuring the two-photon emission of gold nanorods. It is not applied.
非特許文献６と特許文献５〜１０は、αｖβ3インテグリンが特異的に環状ＲＧＤペプチドを認識することを報告したものであり、金微粒子の分散安定性を保持しつつ、環状ＲＧＤペプチドを修飾する方法は報告していない。また、金微粒子に修飾された環状ＲＧＤペプチドがαｖβ3インテグリンに認識されやすいよう設計する技術は報告していない。 Non-Patent Document 6 and Patent Documents 5 to 10 report that αvβ 3 integrin specifically recognizes cyclic RGD peptide, and modifies cyclic RGD peptide while maintaining the dispersion stability of gold microparticles. No method has been reported. In addition, there is no report on a technique for designing a cyclic RGD peptide modified with gold fine particles so that αvβ 3 integrin is easily recognized.
非特許文献７は、ＰＥＧ修飾による金ナノロッドは血液中で分散安定性が高まることが報告されているが、ＰＥＧ鎖中に反応性の官能基がないため、他の化合物と反応させることはできない。 Non-Patent Document 7 reports that gold nanorods modified with PEG have increased dispersion stability in blood, but cannot be reacted with other compounds because there is no reactive functional group in the PEG chain. .
特許文献１１の組成物は、ＤＮＡなどの細胞への導入効率を上昇させるための組成物であって、金微粒子へＲＧＤペプチドを修飾する技術や、インテグリンとＲＧＤペプチドの特異的結合を金微粒子の集積に利用した技術を報告したものではない。 The composition of Patent Document 11 is a composition for increasing the efficiency of introduction of DNA or the like into a cell, and is a technique for modifying RGD peptide to gold fine particles, or the specific binding of integrin and RGD peptide to gold fine particles. It does not report the technology used for integration.
非特許文献８は、近赤外域における金微粒子のＬＳＰＲによるバイオイメージングを検討した技術ではない。また、金微粒子に修飾された環状ＲＧＤペプチドがαｖβ3インテグリンに認識されやすいよう設計する技術は報告されていない。 Non-Patent Document 8 is not a technique that examined bioimaging by LSPR of gold fine particles in the near infrared region. The technique cyclic RGD peptide modified gold microparticles is designed to easily recognized in Arufabuibeta 3 integrin has been reported.
本発明は従来の上記技術では知られていない金ナノロッドの新規技術を提供する。具体的には、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ吸着するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微粒子（金ナノロッド）であって、ペプチドが標的物質によって高い確率で認識される金微粒子と、その製造方法、その集積方法、およびその用途を提供する。 The present invention provides a novel technique of gold nanorods that is not known in the prior art. Specifically, an organic material (A) having a linker that is compatible with the dispersion medium and having a linker that is adsorbed to gold fine particles at one end, and a site that is compatible with the dispersion medium having a polymerization average molecular weight larger than that of the organic material (A). A rod-shaped gold microparticle (gold nanorod) that is modified by an organic substance (B) that includes a peptide that specifically binds to a target site at both ends and a linker that binds to a gold microparticle. The present invention provides a gold fine particle recognized with high probability, a manufacturing method thereof, an integration method thereof, and an application thereof.
本発明は、以下に示す構成を有する金微粒子に関する。
〔１〕分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的物質と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微粒子。
〔２〕有機物(Ｂ)の分散媒に相溶する部位の重合平均分子量が、有機物(Ａ)の分散媒に相溶する部位の重合平均分子量より２０００以上大きい上記[１]の金微粒子。
〔３〕分散媒に相溶する部位が水溶性高分子である上記[１]または上記[２]の金微粒子。
〔４〕有機物(Ｂ)の分散媒に相溶する部位が重合平均分子量４００００以下のポリエチレングリコールである上記[１]〜上記[３]の何れかに記載する金微粒子。
〔５〕リンカーがチオール基であることを特徴であることをする上記[１]〜上記[４]に記載する金微粒子。
〔６〕標的物質に特異的に結合するペプチドが環状ＲＧＤペプチドである上記[１]〜上記[５]の何れかに記載する金微粒子。
〔７〕標的物質がインテグリンであることを特徴とする上記[６]に記載する金微粒子。
〔８〕インテグリンがαｖβ3インテグリンであることを特徴とする上記[７]に記載する金微粒子。
〔９〕環状ＲＧＤペプチドがαｖβ3インテグリンにより特異的に認識され、αｖβ3インテグリンの発現している特定部位に該金微粒子が集積することを特徴とする上記[１]〜上記[８]の何れかに記載する金微粒子。
〔１０〕長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲である上記[１]〜上記[９]の何れかに記載する金微粒子。
The present invention relates to gold fine particles having the following configuration.
[1] An organic substance (A) having a site compatible with the dispersion medium, having a linker bonded to the gold fine particle at one end, and a part compatible with the dispersion medium having a larger polymerization average molecular weight than the organic substance (A), Rod-shaped gold fine particles modified with an organic substance (B) having a peptide that specifically binds to the target substance at both ends and a linker that binds to the gold fine particles.
[2] The gold fine particles according to [1], wherein the polymerization average molecular weight of the site compatible with the dispersion medium of the organic matter (B) is 2000 or more larger than the polymerization average molecular weight of the site compatible with the dispersion medium of the organic matter (A).
[3] The gold fine particles according to [1] or [2] above, wherein a site compatible with the dispersion medium is a water-soluble polymer.
[4] The gold fine particles according to any one of [1] to [3] above, wherein the part compatible with the dispersion medium of the organic substance (B) is polyethylene glycol having a polymerization average molecular weight of 40000 or less.
[5] The gold fine particles according to [1] to [4] above, wherein the linker is a thiol group.
[6] The gold fine particle according to any one of [1] to [5] above, wherein the peptide that specifically binds to the target substance is a cyclic RGD peptide.
[7] The gold fine particle as described in [6] above, wherein the target substance is integrin.
[8] the gold fine particles according to [7], wherein the integrin is Arufabuibeta 3 integrin.
[9] cyclic RGD peptides are specifically recognized by Arufabuibeta 3 integrin, [1], characterized in that the accumulation gold particles to specific sites expressing the Arufabuibeta 3 integrin any of ~ the [8] Gold fine particles described in the above.
[10] The long axis length is less than 400 nm, the aspect ratio is larger than 1, and the maximum absorption wavelength of localized surface plasmon resonance is in the range of 700 to 2000 nm. Gold fine particles.
また、本発明は、以下に示す構成を有する上記金微粒子の製造に関する。
〔１１〕分散媒に相溶する部位とペプチドを含む有機物を合成し、該有機物にリンカーを導入し、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)を合成する工程、該有機物(Ｂ)と、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)をロッド形状の金微粒子に結合させる工程を有する表面修飾金微粒子の製造方法。
〔１２〕保護されたアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を両末端に含むポリエチレングリコールのＮＨＳと環状ＲＧＤペプチドのアミノ基を反応して、環状ＲＧＤペプチドとポリエチレングリコールを含む有機物を合成し、該有機物の脱保護したアミノ基と、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを反応して２−ピリジル−ジスルフィド基を導入し、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンと反応してジスルフィド結合を還元切断して得られた有機物(Ｂ)と、有機物(Ｂ)のポリエチレングリコールより重合平均分子量の小さなポリエチレングリコールを含む方末端がチオール基の有機物(Ａ)をロッド形状の金微粒子に表面処理する上記[１１]に記載する表面修飾金微粒子の製造方法。
Moreover, this invention relates to manufacture of the said gold fine particle which has the structure shown below.
[11] An organic substance comprising a peptide compatible with a dispersion medium and an organic substance containing a peptide, a linker introduced into the organic substance, a peptide that specifically binds to a target site at both ends, and a linker that binds to gold fine particles ( A step of synthesizing B), and a step of bonding the organic substance (B) and the organic substance (A) having a linker compatible with the gold fine particle at one end to the rod-shaped gold fine particle. A method for producing surface-modified gold fine particles.
[12] By reacting the NHS of polyethylene glycol containing a protected amino group and N-hydroxysuccinimide ester (NHS) at both ends with the amino group of cyclic RGD peptide, an organic substance containing cyclic RGD peptide and polyethylene glycol is synthesized. The deprotected amino group of the organic substance is reacted with N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate to introduce a 2-pyridyl-disulfide group and reacted with tris (2-carboxyethyl) phosphine. The organic substance (B) obtained by reducing and cleaving the disulfide bond and the organic substance (A) having a thiol group at the end containing polyethylene glycol having a polymerization average molecular weight smaller than the polyethylene glycol of the organic substance (B) are converted into rod-shaped gold fine particles. The method for producing surface-modified gold fine particles according to [11] above, which is surface-treated
さらに本発明は、以下に示す構成を有する金微粒子の集積方法、およびこれを利用した検出方法、治療方法などに関する。
〔１３〕上記[９]に記載する集積によって特定部位にロッド形状の金微粒子を集めることを特徴とする金微粒子の集積方法。
〔１４〕上記[９]または上記[１３]に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルで検出物質を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
〔１５〕上記[９]または上記[１３]に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルを観察することを特徴とするバイオイメージング。
〔１６〕上記[９]または上記[１３]に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換により発生した熱で死滅させることを特徴とするフォトサーマル治療。
〔１７〕上記[９]または上記[１３]に記載する集積方法によって生じる金微粒子の集積部位に、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、集積部位周辺の細胞を該金微粒子の光熱変換によって発生した熱で該金微粒子に担持させた薬物を放出させることを特徴とするドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）。
Furthermore, the present invention relates to a method for accumulating gold fine particles having the following configuration, and a detection method, a treatment method and the like using the same.
[13] A method for accumulating gold fine particles, comprising collecting rod-shaped gold fine particles at a specific site by the accumulation described in [9].
[14] A method for detecting a target substance, wherein the detection substance is detected by an absorption spectrum of localized surface plasmon resonance generated by the accumulation of gold fine particles according to [9] or [13].
[15] A bioimaging characterized by observing an absorption spectrum of localized surface plasmon resonance generated by the accumulation of gold fine particles according to [9] or [13].
[16]
[17] Irradiation of 700 to 2000 nm of near-infrared rays to the gold fine particle accumulation site generated by the accumulation method described in [9] or [13] above, and cells around the accumulation site are generated by photothermal conversion of the gold fine particles. A drug delivery system (DDS) characterized in that the drug supported on the gold fine particles is released by the applied heat.
本発明の金微粒子は、分散媒に相溶する部位を含む分子量の異なる２種の有機物(Ａ)(Ｂ)で修飾されており、ペプチドが導入されている有機物(Ｂ)の分子量を大きくすることによって、金微粒子の分散安定性を損なうことなく高分子中へのペプチド部位の埋没を防止できるため、標的物質に認識される確率を高めることができる。 The gold fine particles of the present invention are modified with two kinds of organic substances (A) and (B) having different molecular weights including a portion compatible with the dispersion medium, and increase the molecular weight of the organic substance (B) into which the peptide is introduced. As a result, it is possible to prevent the peptide site from being buried in the polymer without impairing the dispersion stability of the gold fine particles, and thus the probability of being recognized by the target substance can be increased.
本発明の金微粒子の製造方法は上記有機物(Ａ)(Ｂ)を金微粒子（金ナノロッド）に修飾する方法であり、金ナノロッドに結合するリンカーとして、例えば、末端にチオール基を有するものを用いることによって、チオール基末端から優先的に金ナノロッドに結合させることができる。 The method for producing gold fine particles of the present invention is a method of modifying the organic matter (A) (B) to gold fine particles (gold nanorods), and, for example, a linker having a thiol group at the end is used as a linker for bonding to the gold nanorods. Thus, the gold nanorods can be bonded preferentially from the thiol group terminal.
本発明の金微粒子に修飾されたペプチドは、標的物質から高い確率で認識され標的物質へ特異的に結合するため、標的物質が存在する部位へ集積することができる。 Since the peptide modified with the gold microparticles of the present invention is recognized from the target substance with high probability and specifically binds to the target substance, it can be accumulated at the site where the target substance exists.
本発明の金微粒子は、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲の金ナノロッドを用いているので、集積によってＬＳＰＲの分光特性が変化することを利用して、ペプチドと特異的に結合する標的物質を検出することができる。 The gold microparticles of the present invention use gold nanorods having a maximum absorption wavelength of localized surface plasmon resonance in the range of 700 to 2000 nm. Therefore, utilizing the fact that the spectral characteristics of LSPR change due to integration, specific to peptides The target substance that binds to can be detected.
さらに、金ナノロッドは光熱変換機能を有するので、金ナノロッドを集積させた標的部位周辺組織へのフォトサーマル治療、バイオイメージング、そしてドラックデリバリーシステムの構築が可能である。 Furthermore, since gold nanorods have a photothermal conversion function, it is possible to construct a photothermal treatment, bioimaging, and drug delivery system for tissues around a target site where gold nanorods are integrated.
以下、本発明を実施形態に基づいて具体的に説明する。なお、濃度の％は特に示さない限り質量％である。 Hereinafter, the present invention will be specifically described based on embodiments. The concentration% is mass% unless otherwise indicated.
本発明の金微粒子は、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ａ)と、有機物(Ａ)より大きな重合平均分子量の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)によって修飾されているロッド形状の金微粒子であって、上記有機物がリンカーで結合していることを特徴とする金微粒子である。 The gold fine particles of the present invention are compatible with an organic substance (A) having a linker compatible with the gold fine particles at one end and a dispersion medium having a polymerization average molecular weight larger than that of the organic substance (A). A rod-shaped gold fine particle modified with an organic substance (B) including a site and a peptide that specifically binds to the target site at both ends and a linker that binds to the gold fine particle, the organic substance being bound by the linker It is a gold fine particle characterized by the above.
本発明の集積方法は、上記金ナノロッドを修飾している有機物に導入されたペプチドの標的物質への特異的結合を利用したものであり、ペプチドが標的物質に認識されると金ナノロッドが標的物質の存在する部位に集積することを利用したものである。 The integration method of the present invention uses specific binding of a peptide introduced into an organic substance modifying gold nanorods to a target substance, and when the peptide is recognized by the target substance, the gold nanorods become the target substance. It is used to accumulate in the site where the sword exists.
本発明の標的物質の検出方法は、上記金ナノロッドの集積方法を利用したものであり、金ナノロッドの集積によってＬＳＰＲの分光特性や散乱光強度が変化することを利用して標的物質を検出するものである。 The target substance detection method of the present invention uses the above-described gold nanorod integration method, and detects the target substance by utilizing the change in the spectral characteristics and scattered light intensity of LSPR due to the gold nanorod integration. It is.
本発明のフォトサーマル治療は、上記金ナノロッドがＬＰＳＲに相当する光を吸収して熱に変換する光熱変換機能を利用し、該金ナノロッドが集積している標的物質が存在する部位周辺の細胞（腫瘍細胞など）を発生した熱で死滅させるものである。本発明のＤＤＳは、上記金ナノロッドに薬物を担持させて生体内に投与し、標的物質が存在する部位で金ナノロッドが集積するのを利用して特定部位に薬物を集中投与するシステムである。 The photothermal treatment of the present invention uses a photothermal conversion function in which the gold nanorod absorbs light corresponding to LPSR and converts it into heat, and cells around the site where the target substance on which the gold nanorod is accumulated ( Tumor cells, etc.) are killed by the generated heat. The DDS of the present invention is a system in which a drug is loaded on the gold nanorod and administered into a living body, and the drug is concentratedly administered to a specific site by utilizing the accumulation of the gold nanorod at the site where the target substance exists.
また、本発明のバイオイメージングは、上記金ナノロッドが集積している部位を金ナノロッドのＬＳＰＲを測定して画像化することによって確認するものである。なお、本発明における吸収スペクトルの変化とは、金ナノロッドの集積に伴うＬＳＰＲの最大吸収波長の吸光度の低下や吸収スペクトル形状の変化を意味する。また、本発明のＲＧＤとは、アミノ酸配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ；アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ））をいう。 Further, the bioimaging of the present invention is to confirm the site where the gold nanorods are accumulated by measuring the LSPR of the gold nanorods and imaging them. The change in the absorption spectrum in the present invention means a decrease in absorbance at the maximum absorption wavelength of LSPR or a change in the absorption spectrum shape accompanying the accumulation of gold nanorods. The RGD of the present invention refers to an amino acid sequence (Arg-Gly-Asp; arginine (R), glycine (G), aspartic acid (D)).
〔修飾有機物〕
本発明の金微粒子（金ナノロッド）は２種の有機物(Ａ)(Ｂ)によって修飾されたものである。有機物(Ａ)は、分散媒に相溶する部位を含み、片末端に金微粒子へ結合するリンカーを有する。有機物(Ｂ)は、分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金微粒子へ結合するリンカーを有し、該有機物(Ｂ)の分散媒相溶部位の重量平均分子量は有機物(Ａ)の分散媒相溶部位の重量平均分子量より大きいものが用いられる。
[Modified organic matter]
The gold fine particles (gold nanorods) of the present invention are modified with two kinds of organic substances (A) and (B). The organic substance (A) includes a site that is compatible with the dispersion medium, and has a linker bonded to the gold fine particle at one end. The organic substance (B) includes a site that is compatible with the dispersion medium, has a peptide that specifically binds to the target site and a linker that binds to the gold fine particle at both ends, and the dispersion medium compatible site of the organic substance (B) The weight average molecular weight is larger than the weight average molecular weight of the dispersion medium compatible site of the organic matter (A).
分散媒に相溶する部位としては水溶性高分子を用いることができる。また、リンカーとしては、チオール基を用いることができる。ペプチドとしては、環状ＲＧＤペプチドを用いることができる。金ナノロッドとしては、長軸長さ４００ｎｍ未満であってアスペクト比が１より大きく、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００ｎｍの範囲の金ナノロッドが使用できる。 A water-soluble polymer can be used as a site compatible with the dispersion medium. Moreover, a thiol group can be used as a linker. A cyclic RGD peptide can be used as the peptide. As the gold nanorod, a gold nanorod having a major axis length of less than 400 nm, an aspect ratio larger than 1, and a maximum absorption wavelength of localized surface plasmon resonance in the range of 700 to 2000 nm can be used.
金ナノロッドに結合させる上記有機物(Ａ)(Ｂ)において、分散媒に相溶する部位の水溶性高分子としては、水と相溶して金ナノロッドを分散媒中で安定に分散させることができるような水溶性高分子であれば制限なく使用でき、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、セルロース、ポリアクリル酸などが挙げられる。以下では、ＰＥＧの例について説明する。 In the organic substances (A) and (B) to be bonded to the gold nanorods, as the water-soluble polymer in a portion compatible with the dispersion medium, the gold nanorods can be stably dispersed in the dispersion medium by being compatible with water. Any water-soluble polymer can be used without limitation, and examples thereof include polyethylene glycol (PEG), cellulose, and polyacrylic acid. Hereinafter, an example of PEG will be described.
分散媒に相溶する部位に使用するＰＥＧとしては、重量平均分子量４００００以下のＰＥＧを使用することができる。ＰＥＧの重合平均分子量は１０００〜２００００のものが好ましい。重合平均分子量が１０００より小さいと分散媒中での分散安定性が不足し、一方、重合平均分子量が４００００より大きいと分散安定性に変化はなく、コスト的に不利である。 PEG having a weight average molecular weight of 40,000 or less can be used as a PEG to be used at a site compatible with the dispersion medium. The average molecular weight of PEG is preferably 1,000 to 20,000. When the polymerization average molecular weight is less than 1000, the dispersion stability in the dispersion medium is insufficient. On the other hand, when the polymerization average molecular weight is more than 40000, the dispersion stability is not changed, which is disadvantageous in cost.
本発明の有機物(Ｂ)に用いるＰＥＧの重合平均分子量は、有機物(Ａ)に用いるＰＥＧよりも大きな重合平均分子量であることが適当である。ペプチドが導入されている有機物(Ｂ)に用いるＰＥＧの重合平均分子量の方が大きいため、ＰＥＧ鎖中にペプチド部位が埋没するのを防止することができ、ペプチドが標的物質により高い確率で認識され、特異的に結合することが可能となるため、標的物質が存在する特定部位へ効率よく金ナノロッドを集積させることができる。両有機物のＰＥＧの重合平均分子量の差は、少なくとも２０００以上が好ましい。重合平均分子量が２０００未満の場合、ペプチド部位がＰＥＧ中へ埋没する確立が高くなり、ペプチドが標的物質から認識され難い。 The polymerization average molecular weight of PEG used for the organic substance (B) of the present invention is suitably a polymerization average molecular weight larger than that of PEG used for the organic substance (A). Since the polymerization average molecular weight of PEG used in the organic substance (B) into which the peptide is introduced is larger, it is possible to prevent the peptide site from being buried in the PEG chain, and the peptide is recognized by the target substance with a high probability. Since it becomes possible to bind specifically, gold nanorods can be efficiently accumulated at a specific site where the target substance exists. The difference in the polymerization average molecular weight of PEG of both organic substances is preferably at least 2000 or more. When the polymerization average molecular weight is less than 2000, the probability that the peptide site is buried in PEG is high, and the peptide is difficult to be recognized from the target substance.
本発明の有機物(Ａ)の一方の末端は、金ナノロッドへ結合するリンカーを有しており、リンカーとしてはチオール基を使用できる。チオール基は金と共有結合を形成するので、有機物(Ａ)はチオール基末端から優先的に金ナノロッドに結合する。有機物(Ａ)の他方の末端は金と結合を起こさない化学構造であるメトキシ基が好ましい（ｍＰＥＧ−ＳＨ）。 One end of the organic substance (A) of the present invention has a linker bonded to a gold nanorod, and a thiol group can be used as the linker. Since the thiol group forms a covalent bond with gold, the organic substance (A) is preferentially bonded to the gold nanorod from the end of the thiol group. The other end of the organic substance (A) is preferably a methoxy group that has a chemical structure that does not cause a bond with gold (mPEG-SH).
本発明の有機物(Ｂ)の一方の末端は、標的物質から認識され特異的に結合するペプチドを有しており、他方の末端は金ナノロッドへ結合するリンカーを有しており、リンカーとしてはチオール基を使用できる。チオール基は金と共有結合を形成するので、有機物(Ｂ)はチオール基末端から優先的に金ナノロッドに結合する。 One end of the organic substance (B) of the present invention has a peptide that is recognized and specifically bound by the target substance, and the other end has a linker that binds to the gold nanorod. Groups can be used. Since the thiol group forms a covalent bond with gold, the organic substance (B) is preferentially bonded to the gold nanorod from the end of the thiol group.
本発明の金ナノロッドに結合させる有機物(Ｂ)に使用するＲＧＤペプチドとしては、ＲＧＤ配列（アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ））を有するペプチドを使用できる。特に標的物質であるインテグリンはＲＧＤ配列を認識するため、ＲＧＤペプチドを修飾した金ナノロッドは、インテグリンが発現している部位で認識され、特異的結合が得られる。特に、αｖβ3インテグリンは環状構造を有するＲＧＤペプチドを強く認識するため、環状ＲＧＤペプチドを修飾した金ナノロッドはαｖβ3インテグリンが発現している部位（腫瘍細胞など）で高い集積効果が得られる。環状ＲＧＤペプチドは、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸を連続的に含む環状構造を有するペプチドであり、Ｆｍｏｃ固相合成法などによって合成することができる。 As the RGD peptide used for the organic substance (B) to be bound to the gold nanorod of the present invention, a peptide having an RGD sequence (arginine (R), glycine (G), aspartic acid (D)) can be used. In particular, since the integrin that is a target substance recognizes the RGD sequence, the gold nanorod modified with the RGD peptide is recognized at the site where the integrin is expressed and specific binding is obtained. In particular, Arufabuibeta 3 integrin to strongly recognize RGD peptide having a cyclic structure, the gold nanorods were modified cyclic RGD peptide high integration effect is obtained at a site Arufabuibeta 3 integrin is expressed (such as tumor cells). The cyclic RGD peptide is a peptide having a cyclic structure continuously containing amino acids of arginine (R), glycine (G), and aspartic acid (D), and can be synthesized by the Fmoc solid phase synthesis method or the like.
〔有機物(Ｂ)の合成〕
本発明の分散媒に相溶する部位を含み、両末端に標的部位と特異的に結合するペプチドと金ナノロッドへ結合するリンカーを有する有機物(Ｂ)は、保護されたアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を両末端に含むＰＥＧ（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）を用いて合成できる。炭酸水素ナトリウム溶液に溶解したＢｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳと環状ＲＧＤペプチド（ｃＲＧＤ）を混合して攪拌すると、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳはｃＲＧＤのアミノ基とアミド結合を形成し、ＰＥＧとｃＲＧＤを含む有機物（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）が得られる。Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを凍結乾燥し、トリフルオロ酢酸によりアミノ基の脱保護を行い（ＮＨ2−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）、得られたＮＨ2−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、アセトニトリルに溶解したＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートと混合して攪拌すると、脱保護したアミノ基とスクシンイミジル基が反応して、２−ピリジル−ジスルフィド基がアミド結合を介して導入される（ＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）。得られたＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンと反応してジスルフィド結合を還元切断すると、ｃＲＧＤとチオール基を末端に有する有機物(Ｂ)が得られる（ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）。
[Synthesis of organic substance (B)]
An organic substance (B) having a site compatible with the dispersion medium of the present invention, a peptide specifically binding to the target site at both ends, and a linker binding to the gold nanorod, is a protected amino group and N-hydroxysuccinimide It can be synthesized using PEG (Boc-PEG-NHS) containing an ester (NHS) at both ends. When Boc-PEG-NHS dissolved in sodium bicarbonate solution and cyclic RGD peptide (cRGD) are mixed and stirred, Boc-PEG-NHS forms an amide bond with the amino group of cRGD, and an organic substance containing PEG and cRGD ( Boc-PEG-cRGD) is obtained. Boc-PEG-cRGD was lyophilized, amino group was deprotected with trifluoroacetic acid (NH 2 -PEG-cRGD), and the resulting NH 2 -PEG-cRGD was dissolved in sodium bicarbonate solution and dissolved in acetonitrile. When mixed with dissolved N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate and stirred, the deprotected amino group reacts with the succinimidyl group and the 2-pyridyl-disulfide group is introduced via an amide bond. (SS-PEG-cRGD). When the obtained SS-PEG-cRGD is reacted with tris (2-carboxyethyl) phosphine to reduce and cleave the disulfide bond, an organic substance (B) having cRGD and a thiol group at the terminal is obtained (SH-PEG-cRGD). ).
本発明の金ナノロッドに結合させた有機物(Ｂ)に導入したｃＲＧＤは、標的物質であるαｖβ3インテグリンにより認識され、特異的に結合する。本発明の金ナノロッドは、αｖβ3インテグリンの他にもｃＲＧＤが認識され特異的結合を示す標的物質であれば、際限なく適用できる。 CRGD introduced organic matter bound to gold nanorods (B) of the present invention is recognized by Arufabuibeta 3 integrin is a target substance specifically binds. Gold nanorods of the present invention, if the target substance showing a Arufabuibeta 3 integrin in addition to cRGD are recognized specific binding can also be endlessly applied without.
〔金ナノロッド〕
本発明で使用する金ナノロッド（ＮＲｓ）は、長軸の長さが４００nm未満であって、アスペクト比が１より大きいロッド形状の金微粒子が好ましい。具体的には、ＬＳＰＲの最大吸収波長が波長７００〜２０００ｎｍの範囲内にあるアスペクト比の金ナノロッドが適当である。また金ナノロッドの長軸長さは２００ｎｍ以下がより好ましい。長軸長さがこより長いと、金ナノロッドが沈降しやすくなる傾向があり、分散媒中での分散安定性が失われる。
[Gold nanorods]
The gold nanorods (NRs) used in the present invention are preferably rod-shaped gold fine particles having a major axis length of less than 400 nm and an aspect ratio of greater than 1. Specifically, gold nanorods having an aspect ratio in which the maximum absorption wavelength of LSPR is in the range of 700 to 2000 nm are suitable. The major axis length of the gold nanorod is more preferably 200 nm or less. If the long axis length is longer than this, the gold nanorods tend to settle, and the dispersion stability in the dispersion medium is lost.
金ナノロッドは次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が溶解した水溶液中で金イ
オンを還元することによって合成することができる。例えば、ｎ＝１５のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を使用することによって、ＣＴＡＢが表面に吸着した金ナノロッドを得ることができる。この金ナノロッドはＣＴＡＢが吸着した状態で水中に安定に分散している。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
Gold nanorods can be synthesized by reducing gold ions in an aqueous solution in which a quaternary ammonium salt represented by the following formula [I] is dissolved. For example, by using n = 15 hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), gold nanorods with CTAB adsorbed on the surface can be obtained. This gold nanorod is stably dispersed in water with CTAB adsorbed.
CH 3 (CH 2 ) n N + (CH 3 ) 3 Br − (n is an integer of 1 to 15)… [I]
上記金ナノロッド水分散液は、水中に存在する余剰の界面活性剤ＣＴＡＢを除去して使用するとよい。具体的には、金ナノロッド水分散液を遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させ、ＣＴＡＢを含む上澄みを除去する。沈降した金ナノロッドは水を添加して再分散させる。この操作を１〜３回繰り返すことによって余剰なＣＴＡＢを除去することができる。なお、ＣＴＡＢを過剰に除去すると金ナノロッドが凝集して水に再分散しなくなる。 The gold nanorod aqueous dispersion may be used after removing excess surfactant CTAB present in the water. Specifically, the gold nanorod aqueous dispersion is centrifuged to settle the gold nanorod on the bottom of the centrifuge tube, and the supernatant containing CTAB is removed. The precipitated gold nanorods are redispersed by adding water. Excess CTAB can be removed by repeating this operation 1-3 times. If CTAB is removed excessively, the gold nanorods aggregate and do not re-disperse in water.
〔表面処理〕
余剰のＣＴＡＢを除去した金ナノロッド（ＮＲｓ）水分散液と、有機物(Ａ、 ｍＰＥＧ−ＳＨ)と有機物(Ｂ、ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＳＨ)を混合して攪拌すると、ｍＰＥＧ−ＳＨとｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＳＨがそれぞれのリンカー（チオール基）で金ナノロッドに結合し、溶媒に安定に分散し、ｃＲＧＤが導入された金ナノロッド（ｃＲＧＤ−ＮＲｓ）が得られる。金ナノロッドに未結合のｍＰＥＧ−ＳＨとＲＧＤ−ＰＥＧ−ＳＨは透析処理などで除去すればよい。
〔surface treatment〕
When the gold nanorod (NRs) aqueous dispersion from which excess CTAB was removed, the organic substance (A, mPEG-SH) and the organic substance (B, cRGD-PEG-SH) were mixed and stirred, mPEG-SH and cRGD-PEG- SH binds to the gold nanorods with each linker (thiol group) and is stably dispersed in a solvent, thereby obtaining gold nanorods (cRGD-NRs) into which cRGD is introduced. What is necessary is just to remove mPEG-SH and RGD-PEG-SH which are not couple | bonded with a gold nanorod by a dialysis process etc.
金ナノロッドに対するｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤの混合比は、適宜調整可能である。例えば、金１ｍｏｌに対し、ｍＰＥＧ−ＳＨが０．１ｍｏｌ、ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤが０．０１ｍｏｌとなるように混合すればよい。 The mixing ratio of mPEG-SH and SH-PEG-cRGD to gold nanorods can be adjusted as appropriate. For example, what is necessary is just to mix so that mPEG-SH may be 0.1 mol and SH-PEG-cRGD may be 0.01 mol with respect to 1 mol of gold | metal | money.
〔金ナノロッドの集積〕
上記有機物(Ａ)と有機物(Ｂ)によって修飾されたｃＲＧＤ−ＮＲｓは、αｖβ3インテグリンによりｃＲＧＤペプチドが選択的に認識され特異的に結合するため、αｖβ3インテグリンが発現している部位で集積させることができる。
[Integration of gold nanorods]
CRGD-NRs modified with the organic matter (B) above organic (A), since the cRGD peptide by Arufabuibeta 3 integrin is selectively recognized by specific binding, it is integrated at a site Arufabuibeta 3 integrin is expressed be able to.
ｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液をαｖβ3インテグリンの発現している部位へ接触し、３７℃で２４時間以上インキュベートすることで、金ナノロッドの高い集積が得られる。インキュベートする時間が２４時間より短いと充分な金ナノロッドの集積が確認されない。 High accumulation of gold nanorods can be obtained by contacting the cRGD-NRs aqueous dispersion with the site where αvβ 3 integrin is expressed and incubating at 37 ° C. for 24 hours or longer. When the incubation time is shorter than 24 hours, sufficient accumulation of gold nanorods is not confirmed.
αｖβ3インテグリンの発現している量によっても金ナノロッドの集積量は変化する。αｖβ3インテグリンが発現している部位にｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液を接触した場合、αｖβ3インテグリンの発現量が多いと金ナノロッドの集積が確認され、αｖβ3インテグリンの発現量が少ないと金ナノロッドの集積が確認されない。 the accumulated amount of the gold nanorods by an amount expressing the Arufabuibeta 3 integrin changes. If Arufabuibeta 3 integrin has contacted the cRGD-NRs aqueous dispersion to the site you are expressed, Arufabuibeta 3 accumulation of integrin expression amount is larger gold nanorods was confirmed, the Arufabuibeta 3 integrin expression amount is small gold nanorods Accumulation is not confirmed.
〔検出方法・治療方法等〕
本発明に使用する金ナノロッドは、７００〜２０００ｎｍにＬＳＰＲの吸収ピークを有しており、金ナノロッドの集積はＬＳＰＲの吸収ピークを分光測定することで確認できる。例えば、金ナノロッドのＬＳＰＲの吸収ピークが９００ｎｍの場合、αｖβ3インテグリンの発現部位に一定量の金ナノロッドが集積すると、集積部位に９００ｎｍ付近のピークが分光特性として得られる。
[Detection and treatment methods]
The gold nanorod used in the present invention has an absorption peak of LSPR at 700 to 2000 nm, and the accumulation of the gold nanorod can be confirmed by spectroscopic measurement of the absorption peak of LSPR. For example, when the absorption peak of LSPR of gold nanorods is 900 nm, when a certain amount of gold nanorods accumulates at the expression site of αvβ 3 integrin, a peak near 900 nm is obtained as the spectral characteristic at the accumulation site.
この検出方法としては、金ナノロッドの吸収スペクトルの形状変化、吸光度の変化、散乱光強度の変化が挙げられる。特に波長８００nm〜１２００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Near Infrared Window）、生体にも安全な波長域であり、生体外部から近赤外光を照射することによって、生体内に投与した金ナノロッドの分散状態や凝集状態による分光特性の変化を測定することが可能であり、近赤外光分析システムやバイオイメージングシステム（特定酵素部位の画像処理化など）を構築することができる。 Examples of this detection method include changes in the shape of the absorption spectrum of gold nanorods, changes in absorbance, and changes in scattered light intensity. In particular, near-infrared light with a wavelength of 800 nm to 1200 nm is less affected by water absorption (Near Infrared Window) and is a safe wavelength range for the living body. By irradiating near-infrared light from outside the living body, It is possible to measure changes in spectral characteristics depending on the dispersion state and aggregation state of administered gold nanorods, and it is possible to construct near infrared light analysis systems and bioimaging systems (such as image processing of specific enzyme sites) .
αｖβ3インテグリンの発現部位に集積させた金ナノロッドにＬＳＰＲに相当する光を照射すると、金ナノロッドの光熱変換機能により集積している部位周辺の温度が上昇する。特に、生体内で集積させた金ナノロッドに近赤外線を照射した場合、集積部位周辺の細胞（例えば腫瘍細胞）を発生した熱で死滅させることが可能であり、金ナノロッド集積部位をフォトサーマル治療用のターゲットマーカーとして使用することができる。 Upon irradiation with light corresponding to LSPR to Arufabuibeta 3 integrin gold nanorods are integrated on the site of expression of the temperature of the surrounding site that integrated with the light-heat conversion function of the gold nanorods is increased. In particular, when gold nanorods accumulated in vivo are irradiated with near infrared rays, cells around the accumulation site (eg, tumor cells) can be killed by the generated heat, and the gold nanorod accumulation site can be used for photothermal treatment. Can be used as a target marker.
本発明の有機物で修飾した金ナノロッド（ｃＲＧＤ−ＮＲｓ）に薬物を担持させて、生体内に投与した場合、αｖβ3インテグリンの存在する特定部位で特異的に集積するため、薬物を効率よく輸送・放出することが可能である。例えば、αｖβ3インテグリンは腫瘍細胞で過剰発現しており、投与されたｃＲＧＤ−ＮＲｓは、腫瘍細胞部位のαｖβ3インテグリンにて認識され特異的に結合し、金ナノロッドが集積することにより、薬物を集中投与可能となるため、ｃＲＧＤ−ＮＲｓを薬物担持キャリアーとするＤＤＳが構築可能である。特に、金は生体に安全な材料であり、キャリアーとして有用である。 And drugs by supporting the modified gold nanorods (cRGD-NRs) an organic material of the present invention, when administered in vivo, for specifically integrated at a specific site in the presence of Arufabuibeta 3 integrin efficiency drug good transport and It is possible to release. For example, Arufabuibeta 3 integrin is overexpressed in tumor cells, cRGD-NRs administered, by recognized and specifically bound by Arufabuibeta 3 integrin tumor cell sites, gold nanorods are concentrated, the drug Since intensive administration is possible, a DDS using cRGD-NRs as a drug-carrying carrier can be constructed. In particular, gold is a biologically safe material and is useful as a carrier.
以下、本発明を実施例によって具体的に示す。また、比較例を示す。なお、以下の実施例は、金ナノロッドの主に９００ｎｍ付近の波長域におけるＬＳＰＲの吸収波長シフトを測定しているが、金ナノロッドのアスペクト比を変更することによって７００〜２０００nmまでの波長域についても同様の吸収波長のシフトを測定することができる。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. Moreover, a comparative example is shown. The following examples measure the absorption wavelength shift of LSPR mainly in the wavelength region near 900 nm of gold nanorods, but also in the wavelength region from 700 to 2000 nm by changing the aspect ratio of gold nanorods. A similar shift in absorption wavelength can be measured.
〔ｃＲＧＤペプチドの合成〕
Ｆｍｏｃ固相合成法により、ＲＧＤのアミノ酸配列を含む環状ＲＧＤペプチドを合成した（分子量６０４；ｃｙｃｌｏ（−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−（アルギニン（Ａｒｇ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｄ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）、リジン（Ｌｙｓ））。式１にｃＲＧＤの分子内環化反応を示す。反応終了後、エーテル沈殿を行い、逆相ＨＰＬＣにより精製して得られた。
[Synthesis of cRGD peptide]
A cyclic RGD peptide containing the amino acid sequence of RGD was synthesized by Fmoc solid phase synthesis (molecular weight 604; cyclo (-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys- (arginine (Arg), glycine (Gly), asparagine). Acid (Asp), D-phenylalanine (D-Phe), lysine (Lys))
〔ｃＲＧＤの合成スキーム〕
〔金ナノロッド水分散液の調製〕
４００mMのＣＴＡＢ水溶液中で合成された金ナノロッド水分散液を遠沈管に入れ、１４０００(×g)の相対遠心加速度（遠心加速度を地球の重力加速度で除したもの）で１０分間遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させた。上澄み液を別の遠沈管に入れ、沈降した金ナノロッドは水で再分散させた。別の遠沈管に入れた上澄み液は、再び１４０００(×g)で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、この上澄み液を除去することにより余剰のＣＴＡＢを除去した。沈降した金ナノロッドは水で再分散させ、前の再分散液と合わせて、金ナノロッド（ＣＴＡＢ−ＮＲｓ）水分散液を得た。吸光度から金ナノロッド水分散液中の金原子濃度を求めた。
[Preparation of gold nanorod aqueous dispersion]
Gold nanorod aqueous dispersion synthesized in 400 mM CTAB aqueous solution is placed in a centrifuge tube and centrifuged at 14000 (× g) relative centrifugal acceleration (centrifugal acceleration divided by the Earth's gravitational acceleration) for 10 minutes. Nanorods were allowed to settle to the bottom of the centrifuge tube. The supernatant liquid was put into another centrifuge tube, and the settled gold nanorods were redispersed with water. The supernatant in another centrifuge tube was centrifuged again at 14,000 (× g) for 10 minutes to settle the gold nanorods, and the supernatant was removed to remove excess CTAB. The precipitated gold nanorods were redispersed with water, and combined with the previous redispersion liquid, a gold nanorod (CTAB-NRs) aqueous dispersion liquid was obtained. The gold atom concentration in the gold nanorod aqueous dispersion was determined from the absorbance.
〔有機物(Ａ)〕
有機物(Ａ)としては、ＰＥＧの重合平均分子量が約５０００であり、一方の末端がチオール基で、他方の末端はメトキシ基であるα−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＳＨ）を使用した。
[Organic (A)]
As the organic substance (A), α-methoxy-ω-mercaptopolyethylene glycol (mPEG-SH) in which the polymerization average molecular weight of PEG is about 5000, one end is a thiol group and the other end is a methoxy group is used. did.
〔有機物(Ｂ)の合成〕
有機物(Ｂ)としては、ＰＥＧの重合平均分子量が約１００００であり、一方の末端がチオール基で、他方の末端にｃＲＧＤである有機物を合成した。保護されたアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を両末端に含む重合平均分子量１００００のＰＥＧ（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）を炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、ｃＲＧＤを混合して攪拌し、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳとｃＲＧＤのアミノ基をアミド結合して、ＰＥＧとｃＲＧＤを含む有機物（Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）を合成した。Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを凍結乾燥し、トリフルオロ酢酸によりアミノ基の脱保護を行い（ＮＨ2−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）、得られたＮＨ2−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、アセトニトリルに溶解したＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートと混合して攪拌し、脱保護したアミノ基とスクシンイミジル基を反応させ、２−ピリジル−ジスルフィド基を導入した（ＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ、式２）。得られたＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンと反応してジスルフィド結合を還元切断し、ｃＲＧＤとチオール基を末端に有する有機物(Ｂ)を得た（ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ）。
[Synthesis of organic substance (B)]
As the organic substance (B), an organic substance having a polymerization average molecular weight of PEG of about 10,000, one terminal having a thiol group and the other terminal being cRGD was synthesized. PEG (Boc-PEG-NHS) having a protected amino group and N-hydroxysuccinimide ester (NHS) at both ends is dissolved in sodium bicarbonate solution, cRGD is mixed and stirred, and Boc -An organic substance (Boc-PEG-cRGD) containing PEG and cRGD was synthesized by amide bonding of the amino group of PEG-NHS and cRGD. Boc-PEG-cRGD was lyophilized, amino group was deprotected with trifluoroacetic acid (NH 2 -PEG-cRGD), and the resulting NH 2 -PEG-cRGD was dissolved in sodium bicarbonate solution and dissolved in acetonitrile. Mixing and stirring with dissolved N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate, the deprotected amino group and succinimidyl group were reacted to introduce 2-pyridyl-disulfide group (SS-PEG-cRGD, Formula 2). The obtained SS-PEG-cRGD was reacted with tris (2-carboxyethyl) phosphine to reduce and cleave the disulfide bond to obtain an organic substance (B) having cRGD and a thiol group at its terminal (SH-PEG-cRGD). ).
〔ＳＳ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤの合成スキーム〕
金ナノロッド水分散液の分光特性は日本分光株式会社製品のＶ−６７０で測定した。ゼータ電位はMalverne社製測定器（Zeta-sizer Nano―ZS）を用いて測定した。 The spectral characteristics of the gold nanorod aqueous dispersion were measured by V-670 of JASCO Corporation. The zeta potential was measured using a measuring device (Zeta-sizer Nano-ZS) manufactured by Malverne.
αｖβ3インテグリンはガラスボトムディッシュでＵ−８７ＭＧ（ヒトグリオブラストーマ：高αｖβ3インテグリン発現）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ヒト乳がん細胞：中αｖβ3インテグリン発現）、そしてＭＣＦ−７（ヒト乳がん細胞：低αｖβ3インテグリン発現）をそれぞれ、５×１０4cell／ｍｌ播種し、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）を１０％と抗生物質を１％含む培地を与えて、３７℃で２４時間インキュベートして培養した。 Arufabuibeta 3 integrin U-87MG glass bottom dish (human glioblastoma: high Arufabuibeta 3 integrin expression), MDA-MB-435 (human breast cancer cells: Medium Arufabuibeta 3 integrin expression), and MCF-7 (human breast cancer cells: Low αvβ 3 integrin expression) was seeded at 5 × 10 4 cells / ml, fed with a medium containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum) and 1% antibiotics, incubated at 37 ° C. for 24 hours, and cultured. .
標的物質とｃＲＧＤの特異的結合は、αｖβ3インテグリンを発現させたガラスボトムディッシュ（直径５０ｍｍ）に、ｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液を添加して行った。一定時間経過後、ＮＲｓ水分散液を除去して、ガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位について、マルチチャンネル分光器を用いて、露光時間１００ｍｓ、積算回数５０００回の条件で吸収スペクトルを測定した。なおベースラインは、５０％グリセリンで満たしたガラスボトムディッシュの底（ガラス）とした。 Specific binding of the target substance and cRGD is the glass bottom dish was expressed Arufabuibeta 3 integrin (diameter 50 mm), it was done with the addition of cRGD-NRs aqueous dispersion. After the elapse of a predetermined time, to remove NRs aqueous dispersion, for Arufabuibeta 3 integrin expression sites of the glass bottom dish, using a multi-channel spectrometer, exposure time 100 ms, the absorption spectrum was measured by integration number 5000 conditions. The base line was the bottom (glass) of a glass bottom dish filled with 50% glycerin.
〔実施例１〕
ＣＴＡＢ−ＮＲｓ水分散液（金濃度１ｍＭ）１ｍｌに、金原子：ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤ：ｍＰＥＧ−ＳＨ＝１：０．１：０．０１のモル比になるように、ｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを添加し、ボルテックスミキサーで２４時間攪拌した。攪拌終了後、透析処理によって金ナノロッドに未結合のｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを除去し、ｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤが結合した金ナノロッド（ｃＲＧＤ−ＮＲｓ）を得た。得られたｃＲＧＤ−ＮＲｓの分光特性を測定した結果、処理前の分光特性と大きな変化はなく、処理後も安定に分散可能であった（図１）。ｃＲＧＤ―ＮＲｓ水分散液のゼータ電位を測定したところ、処理前のゼータ電位は＋３８ｍＶであったが、処理後は−１．５ｍＶであり、ＣＴＡＢ由来の正電荷から、電荷をもたないｃＲＧＤやＰＥＧを構成部位とする有機物へ金ナノロッド表面が置換されたことが確認された。
[Example 1]
In 1 ml of CTAB-NRs aqueous dispersion (gold concentration: 1 mM), mPEG-SH and SH- were mixed at a molar ratio of gold atom: SH-PEG-cRGD: mPEG-SH = 1: 0.1: 0.01. PEG-cRGD was added and stirred with a vortex mixer for 24 hours. After the completion of stirring, mPEG-SH and SH-PEG-cRGD that were not bound to the gold nanorods were removed by dialysis to obtain gold nanorods (cRGD-NRs) in which mPEG-SH and SH-PEG-cRGD were bound. As a result of measuring the spectral characteristics of the obtained cRGD-NRs, there was no significant change from the spectral characteristics before the treatment, and it was possible to disperse stably after the treatment (FIG. 1). When the zeta potential of the cRGD-NRs aqueous dispersion was measured, the zeta potential before the treatment was +38 mV, but after the treatment, it was -1.5 mV. From the positive charge derived from CTAB, the cRGD having no charge It was confirmed that the gold nanorod surface was replaced with an organic substance having PEG as a constituent site.
〔実施例２〕
実施例１で得られたｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液（金濃度５ｍＭ）を、ＦＢＳと抗生物質を含むＤＭＥＭ（Dulbeccos Modified Eagles medium）で１０倍に希釈し、Ｕ−８７ＭＧを培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位に１ｍｌ添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベート後、ｃＲＧＤ−ＮＲｓ水分散液を除去し、αｖβ3インテグリン発現部位をリン酸緩衝液で２回洗浄後、４％パラホルムアルデヒドを１ｍｌ添加し、室温で３０分間静置した。４％パラホルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳで２回洗浄後、５０％グリセリンで浸した。得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークが観察され、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓが特異的に結合したことが確認された（図２）。
[Example 2]
The cRGD-NRs aqueous dispersion (gold concentration 5 mM) obtained in Example 1 was diluted 10-fold with DMEM (Dulbeccos Modified Eagles medium) containing FBS and antibiotics, and U-87MG was cultured in a glass bottom dish. 1 ml was added to the αvβ 3 integrin expression site and incubated at 37 ° C. for 24 hours. After incubation, remove the cRGD-NRs aqueous dispersion, washed twice with a Arufabuibeta 3 integrin expression sites with phosphate buffer, 4% paraformaldehyde was added 1 ml, was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. 4% paraformaldehyde was removed, washed twice with PBS, and then immersed in 50% glycerin. As a result of measuring the obtained cell sample with a multichannel spectrometer, a peak around 900 nm derived from a gold nanorod was observed, confirming that αvβ 3 integrin and cRGD-NRs were specifically bound (FIG. 2).
〔比較例１〕
ＳＨ−ＰＥＧ−ｃＲＧＤを添加しない以外は実施例１と同様に、ｍＰＥＧ−ＳＨのみが結合した金ナノロッド（ＰＥＧ−ＮＲｓ）を得た。得られたＰＥＧ−ＮＲｓを実施例２と同様にＵ−８７ＭＧを培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位に添加し、得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークは観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓの特異的な結合は確認されなかった（図３）。
[Comparative Example 1]
Gold nanorods (PEG-NRs) to which only mPEG-SH was bound were obtained in the same manner as in Example 1 except that SH-PEG-cRGD was not added. As a result of adding the obtained PEG-NRs to the αvβ 3 integrin expression site of the glass bottom dish in which U-87MG was cultured in the same manner as in Example 2, and measuring the obtained cell sample with a multichannel spectrometer, it was derived from gold nanorods. No peak around 900 nm was observed, and specific binding between αvβ 3 integrin and cRGD-NRs was not confirmed (FIG. 3).
〔比較例２〕
ＰＥＧ部位がなくチオール基を有するｃＲＧＤ（ＳＨ−ｃＲＧＤ）を用いて、ＣＴＡＢ−ＮＲｓ水分散液（金濃度１ｍＭ）１ｍｌに、金原子：ＳＨ−ｃＲＧＤ：ｍＰＥＧ−ＳＨ＝１：０．１：０．０１のモル比になるように、ｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ｃＲＧＤを添加し、ボルテックスミキサーで２４時間攪拌した。攪拌終了後、透析処理によって金ナノロッドに未結合のｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ｃＲＧＤを除去し、ｍＰＥＧ−ＳＨとＳＨ−ｃＲＧＤが結合した金ナノロッドを得た。得られた金ナノロッドを実施例２と同様にＵ−８７ＭＧを培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位に添加し、得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークは観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓの特異的な結合は確認されず、ｃＲＧＤ部位がＰＥＧ鎖に埋もれており、αｖβ3インテグリンにより認識されないことが確認された。
[Comparative Example 2]
Using cRGD having no PEG moiety and having a thiol group (SH-cRGD), gold atom: SH-cRGD: mPEG-SH = 1: 0.1: 0 in 1 ml of CTAB-NRs aqueous dispersion (
〔参考例１〕
３７℃で３時間インキュベートする以外は実施例２と同様に処理して、マルチチャンネル分光器で測定した。結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークが観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓが特異的に結合するための時間が不足していることが確認された（図４）。
[Reference Example 1]
The sample was treated in the same manner as in Example 2 except that it was incubated at 37 ° C. for 3 hours, and measured with a multichannel spectrometer. As a result, a peak near 900 nm derived from gold nanorods was not observed, and it was confirmed that the time for specifically binding αvβ 3 integrin and cRGD-NRs was insufficient (FIG. 4).
〔参考例２〕
ＭＣＦ−７を培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位を用いる他は実施例２と同様に、得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークは観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓの特異的な結合は確認されなかった（図５）。
[Reference Example 2]
As a result of measuring the obtained cell sample with a multichannel spectrometer in the same manner as in Example 2 except that the αvβ 3 integrin expression site of the glass bottom dish in which MCF-7 was cultured was used, the peak near 900 nm derived from gold nanorods was No specific binding between αvβ 3 integrin and cRGD-NRs was confirmed (FIG. 5).
〔参考例３〕
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を培養したガラスボトムディッシュのαｖβ3インテグリン発現部位を用いる他は実施例２と同様に、得られた細胞サンプルをマルチチャンネル分光器で測定した結果、金ナノロッド由来の９００ｎｍ付近のピークは観察されず、αｖβ3インテグリンとｃＲＧＤ−ＮＲｓの特異的な結合は確認されなかった（図６）。
[Reference Example 3]
The obtained cell sample was measured with a multichannel spectrometer in the same manner as in Example 2 except that the αvβ 3 integrin expression site of the glass bottom dish in which MDA-MB-435 was cultured was used. No peak was observed, and specific binding between αvβ 3 integrin and cRGD-NRs was not confirmed (FIG. 6).
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014515009A (en) * | 2011-03-02 | 2014-06-26 | イムラ アメリカ インコーポレイテッド | Controllable surface modification and functionalization of stable colloidal gold nanoparticles |
| JP2015514560A (en) * | 2012-02-02 | 2015-05-21 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フェルデルング デア ヴィッセンシャフテン エー． ファオ．Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｚｕｒ Ｆｏｅｒｄｅｒｕｎｇ Ｄｅｒ Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ Ｅ．Ｖ． | Polystyrene stabilized nanoparticles and methods for preparing nanostructured substrate surfaces comprising the same, nanostructured substrate surfaces, and uses thereof |
| CN109513040A (en) * | 2018-09-06 | 2019-03-26 | 天津大学 | The modified golden material of a kind of polyethylene glycol and anticoagulant peptides surface and preparation method |
| WO2020196787A1 (en) * | 2019-03-26 | 2020-10-01 | 積水化学工業株式会社 | Magnetic particles and test agent |
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