KR101576565B1 - 비스ｐｎａ를 이용한 핵산의 표지, 및 검출 또는 분석 방법및 키트, 및 이를 위한 비스ｐｎａ - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리아데닌을 포함하는 핵산과 삼중가닥(triplex)을 형성할 수 있고, 하나 이상의 검출 가능한 표지로 표지된 비스PNA(bisPNA), 이를 이용한 타겟 핵산의 표지, 및 검출 또는 분석 방법, 및 이를 포함하는 타겟 핵산의 표지, 및 검출 또는 분석 키트에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 비스PNA는 타겟 핵산에 포함된 폴리아데닌과 열적으로 안정한 삼중가닥을 형성함으로써 타겟 핵산을 높은 특이도 및 민감도로 표지, 및 검출 또는 분석할 수 있으며, 특히 단시간 내에 타겟 핵산과 혼성화하므로 경시안정성이 낮은 타겟 핵산, 특히 마이크로RNA(microRNA)의 검출 또는 발현양상 분석에 효과적으로 사용될 수 있다.

PNA, 비스PNA, 마이크로RNA, PNA 칩, 삼중가닥, Triplex, 마이크로어레이, 발현 프로파일링

Description

비스ＰＮＡ를 이용한 핵산의 표지, 및 검출 또는 분석 방법 및 키트, 및 이를 위한 비스ＰＮＡ{Methods and kits for labeling and detecting or analyzing nucleic acids using BisPNA, and BisPNA for the same}

본 발명은 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)을 이용한 핵산의 표지, 및 검출 또는 분석에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 비스PNA(bisPNA)를 이용한 핵산의 표지, 및 검출 또는 분석 방법 및 키트, 및 이를 위한 비스PNA에 관한 것이다.

천연 상태 그대로 검출하기 어려운 핵산을 표지하여 검출하는 방법은 분자생물학이나 세포생물학의 다양한 분야에 응용되어 왔다. 특이적인 혼성화 반응(specific hybridization reaction)을 이용하는 서던 블로팅(Southern blotting), 노던 블로팅(Northern blotting), 인시츄 혼성화(in situ hybridization), 핵산 마이크로어레이(microarray)에서 신호를 검출하기 위해 표지 물질이 부착된 핵산이 널리 사용되어 왔다. 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에서 표지된 단량체(표지된 dNTP) 또는 표지된 프라이머를 사용하여 DNA를 증폭함과 동시에 DNA를 표지하는 방법이 알려져 있다. 이렇게 표지된 DNA를 마이크로어레이로 검출할 수 있다. PCR과 동시에 핵산을 표지하는 방법은 표지를 위한 별도의 단계가 필요하지 않은 장점이 있는 반면, 형광 염료 등으로 표지된 단량체를 사용하는 경우 표지되지 않은 단량체를 사용하는 경우보다 PCR의 효율이 떨어지는 단점이 있다. 또한, RNA는 PCR 방법으로 증폭할 수 없기 때문에 PCR로 표지하는 방법으로 RNA를 검출하려면 역전사(reverse transcription)를 통해 cDNA를 제조하여야 하는 단계가 필요하고, 특히 마이크로RNA(microRNA, miRNA)와 같이 길이가 짧은 경우 cDNA 제조가 번거로운 문제가 있다.

최근 DNA에서 전사되지만 단백질로는 번역되지 않는 21~35 염기 길이의 짧은 비암호화 RNA(non-coding RNA)들이 많이 발견되었고, 이 중에서 특히 마이크로RNA는 진핵생물에서 발견되는 짧은 단일가닥(single strand) RNA 분자로서 유전자 발현을 제어하는 조절물질이다. 마이크로RNA가 암 및 세포증식, 세포분화, 세포사멸 및 지방 대사 조절 등에서 중요하게 작용하는 것이 밝혀지고 있어서 관심의 초점이 되고 있다. 또한, 마이크로RNA를 바이오마커로 사용하여 마이크로RNA의 발현 양상을 분석하여 특정 질병이나 암을 진단하고 예측할 수 있다(문헌 [Stenvang J, Silahtaroglu AN, Lindow M, Elmen J, Kauppinen S. (2008) "The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics" Seminars in cancer biology 18:89-102]).

RNA를 검출하는 전통적인 방법인 노던 블라팅 방법은 많은 양의 RNA가 필요하고 시간과 노력이 많이 들며, 한번에 한 가지 RNA만 검출할 수 있다. 이에, 다수의 상보적인 프로브를 표면에 고정한 마이크로어레이를 사용하여 여러 가지 마이 크로RNA의 발현 양상을 동시에 분석하는 방법도 개발되었다. 마이크로어레이를 사용하여 효과적으로 마이크로RNA의 발현양상을 분석하기 위해서는 길이가 짧은 마이크로RNA를 효과적으로 표지할 수 있는 방법이 필요하다. 마이크로RNA를 증폭하지 않고 검출하는 경우에는 마이크로RNA를 cDNA로 역전사하는 단계를 거치지 않고 마이크로RNA를 바로 검출하는 편이 유리하다. 효소를 이용하거나 화학적인 방법으로 마이크로RNA에 표지 물질을 결합시켜 마이크로RNA를 표지하는 방법이 알려져 있다. 효소를 이용하는 경우에는, 리가제(ligase), 폴리(A) 중합효소(poly(A) polymerase), 또는 말단 데옥시뉴클레오티드 전달효소(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)와 같은 효소를 이용하여 마이크로RNA의 3' 말단에 표지된 단량체나 표지할 수 있는 염기서열을 부착할 수도 있고, 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase)를 이용하여 5' 말단에 방사능 표지 분자를 부착할 수도 있다. 방사능 표지 분자를 이용하는 표지 방법은 허가를 받은 특정한 장소에서만 실시할 수 있고 반응물과 반응산물을 처리하는 것이 번거롭다. 형광 등으로 표지된 기질(substrate)를 사용하는 경우에는 표지를 위한 기질의 변형 때문에 효소 반응의 효율이 떨어지는 문제가 있다. 마이크로RNA를 표지하는 여러 방법 중에 폴리(A) 중합효소를 사용하는 방법이 가장 민감하다고 알려져 있다(문헌 [Yin JQ, Zhao RC, Morris KV. (2008) "Profiling microRNA expression with microarrays" Trends in Biotechnology 26:70-76]). 하지만, 표지되지 않은 아데닌 단량체를 사용하여 폴리(A) 중합효소로 합성된 폴리아데닌에서는 검출할 수 있는 신호가 나오지 않기 때문에, 폴리(A) 중합효소 처리 단계 이후에 추가적으로 리가제 효소 등을 사용하여 폴리아데닌을 표지하는 단계가 필요하다.

효소를 이용한 방법 외에도 화학적인 방법을 통해서 타겟 핵산을 표지하는 방법이 알려져 있다. 핵산의 염기에 공유결합을 통해서 표지 물질을 붙이는 방법(문헌 [J. A. Wolff, P. M. Slattum, J. E. Hagstrom, V. G. Budker "Gene expression with covalently modified polynucleotides" 미국특허 제7,049,142호])은 핵산염기가 변형되기 때문에 상보적인 염기 서열과의 혼성화 반응을 간섭하는 단점이 있다. 표지 화합물을 핵산의 구아닌 염기에 부착하는 화학적인 표지화 방법(문헌 [1. H. J. Houthoff, J. Reedijk, T. Jelsma, R. J. Heetebrij, H. H. Volkers, "Methods for labeling nucleotides, labeled nucleotides and useful intermediates" 미국특허 제7,217,813호]도 같은 단점이 있고, 이 방법은 구아닌 염기를 포함하지 않은 서열을 표지할 수 없다.

펩티드 핵산(Peptide nucleic acid, PNA)은 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다(문헌 [Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O. (1991) "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide", Science 254:1497-1500])(도 1 참조). PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한 PNA는 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다. PNA는 화학적으로 안정할 뿐만 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA의 이중가닥의 안정성은 염 농도에 의해 영향을 받지 않는다. PNA의 또 다른 특징은 호모피리미딘(homopyrimidine) PNA가 상보적인 서열을 가지고 있는 호모퓨린(homopurine)의 DNA, RNA 또는 PNA와 매우 안정한 삼중가닥 복합체를 형성한다는 것이다(문헌 [Betts L, Josey JA, Veal JM, Jordan SR. (1995) "A Nucleic Acid Triple Helix Formed by a Peptide Nucleic Acid-DNA Complex" Science, 270:1838-1841; Knudsen H, Nielsen PE. (1996) "Antisense properties of duplex- and triplex-forming PNAs" Nucleic Acids Research 24:494-500])(도 2 참조). 이와 같은 안정성은 일반적인 이중가닥(duplex)을 형성하는 왓슨-크릭 염기쌍(antiparallel orientation) 이외에 훅스틴(Hoogsteen) 염기쌍(parallel orientation)에 기인한다. 시토신 대신 슈도이소시토신(pseudoisocytosine, J)이 포함된 PNA는 pH에 상관없이 삼중가닥을 형성할 수 있다. 또한 PNA가 핵산과 이중가닥 또는 삼중가닥을 형성하는 혼성화 반응은 같은 타겟 핵산에 대한 DNA의 혼성화 반응보다 속도가 훨씬 빠르다.

이와 같은 삼중가닥은 2개의 PNA 서열이 적당한 링커(linker)를 통해서 하나의 분자로 연결된 비스PNA를 통해서 더욱 안정화될 수 있다(문헌 [Egholm M, Christensen L, Dueholm KL, Buchardt O, Coull J, Nielsen PE. (1995) "Efficient pH-independent sequence-specific DNA binding by pseudoisocytosine-containing bis-PNA", Nucleic Acids Research 23:217-222])(도 3 참조). 적당한 길이의 링커로 연결된 2개의 PNA 서열이 DNA 또는 RNA와 왓슨-크릭 염기쌍과 훅스틴 염기쌍을 통해서 삼중가닥을 형성하는 경우(비스PNA/DNA 또는 비스PNA/RNA) 3개의 단일가닥으로 이루어지는 삼중가닥(PNA₂/DNA 또는 PNA₂/RNA)보다 더 안정한 삼중가닥을 형성한다. 이러한 장점들 때문에 비스PNA는 진단뿐만 아니라 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다(문헌 [Hyrup B, Nielsen PE. (1996) "Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications" Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:5-23; Good L, Nielsen PE (1998) "Antisense inhibition of gene expression in bacteria by PNA targeted to mRNA" Nature Biotechnology 16:355-358]).

본 발명의 제1목적은 폴리아데닌을 포함하는 핵산과 삼중가닥을 형성할 수 있고, 하나 이상의 검출 가능한 표지로 표지되어 있는 비스PNA를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제2목적은 상기 비스PNA를 이용하여 타겟 핵산을 표지하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제3목적은 상기 비스PNA를 이용하여 타겟 핵산을 검출 또는 분석 하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제4목적은 상기 비스PNA를 포함하는 타겟 핵산의 표지 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제5목적은 상기 비스PNA를 포함하는 타겟 핵산의 검출 또는 분석키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제1면은 6 내지 200개의 연속한 아데닌을 포함하는 핵산과 삼중가닥을 형성할 수 있는, 하기 일반식 1로 나타내어지는 비스PNA에 관한 것이다:

[일반식 1]

상기 식에서,

A 및 A'는 각각 독립적으로 아데닌과 상보적 결합을 형성할 수 있는 4 내지 40개의 염기로 이루어지는 PNA를 나타내고,

L은 링커를 나타내며,

D₁, D₂, D₃ 및 D₄는 각각 독립적으로 검출 가능한 표지를 나타내고,

a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 0 이상의 정수이되, a+b+c+d≥1이다.

본 발명의 제2면은 6 내지 200개의 연속한 아데닌을 포함하는 타겟 핵산을 상기 비스PNA와 혼성화하여 비스PNA-타겟 핵산의 삼중가닥을 형성하는 단계를 포함하는, 타겟 핵산의 표지 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제3면은

1) 6 내지 200개의 연속한 아데닌을 포함하는 타겟 핵산을 상기 비스PNA와 혼성화하여 비스PNA-타겟 핵산의 삼중가닥을 형성하고;

2) 단계 1)의 삼중가닥으로부터의 신호를 검출하는:

단계를 포함하는, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제5면은 상기 비스PNA를 포함하는, 타겟 핵산의 표지 키트에 관한 것이다.

본 발명의 제6면은 상기 비스PNA를 포함하는, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 키트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 비스PNA는 타겟 핵산에 포함된 폴리아데닌과 열적으로 안정한 삼중가닥을 형성함으로써 타겟 핵산을 높은 특이도 및 민감도로 표지, 및 검출 또는 분석할 수 있다. 특히 단시간 내에 타겟 핵산과 혼성화하므로 경시안정성이 낮은 타겟 핵산, 특히 마이크로RNA의 검출 또는 발현양상 분석에 효과적으로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 비스PNA의 합성

본 발명에서는, 폴리아데닌과 열적으로 안정한 삼중가닥을 형성하는, 2개의 PNA 염기서열이 적당한 길이의 링커로 연결된 비스PNA를 사용한다. 본 발명의 비 스PNA는 검출할 수 있는 신호를 발생시키는 표지물질(D)을 포함하고, 2개의 PNA 서열(A 및 A')이 링커(L)로 연결된다. 표지물질은 PNA 서열, 링커, 비스PNA의 끝 부분 등 비스PNA의 어느 부분에라도 부착될 수 있다. 예를 들어 D-A-L-A', A-L-A'-D, A-D-L-A', A-L-D-A' 등의 구조를 이룰 수 있다. 상기 비스PNA는 하나 또는 2 이상의 표지물질을 포함할 수 있다.

링커(L)는 2개의 PNA 서열이 하나의 분자를 이루도록 연결하는 역할을 한다. 예를 들어, 물에 잘 녹는 폴리에테르, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 글리세롤, 아미드(amide), 카바메이트(carbamate), 당(saccharides), 다당(polysaccharides) 또는 아미노산 단위가 일반적으로 하나 또는 여러 개(예를 들어, ~20개)가 한 줄로 연결된 형태를 가질 수 있다. 바람직하게, 링커는 에틸렌글리콜, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군에서 선택되는 1 내지 20개의 단위로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명에서는, 검출 가능한 신호를 내는 것이라면 어떠한 것이라도 표지물질(D)로 사용할 수 있으며, 예를 들면, 형광물질, 헵텐, 단백질, 펩타이드, 바이오틴, 또는 방사성 원소를 포함한다. 일반적으로 널리 쓰이는 형광 신호를 이용하는 경우에 표지물질(D)은 형광을 내는 물질이거나 형광물질과 결합할 수 있는 물질로, 상기 비스PNA에 1개 이상 포함된다. 예를 들면, 바이오틴, 로다민, 사이아닌-3(Cyanine-3), 피렌(pyrene), 사이아닌-5, 녹색형광단백질(GFP; Green Fluorescent Protein), 칼세인(Calcein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 알렉사-488(Alexa-488), 5- 또는 6-카르복시플루오레세인(FAM), 2',4',5',7'-테트라클로로 -6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(HEX), 2',7'-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(TET), 플루오레세인 클로로트리아지닐(Fluorescein Chlorotriazinyl), 플루오레세인, 오레건 그린(Oregon Green), 마그네슘 그린(Magnesium Green), 칼슘 그린(Calcium Green), 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인(JOE), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), 테트라메틸-로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 카르복시테트라메틸 로다민(TAMRA), 로다민 팔로이딘(Phodamine PHalloidin), 피로닌 Y(Pyronin Y), 리싸민(Lissamine), ROX(X-rhodamine), 칼슘 크림슨(Calcium Crimson), 텍사스 레드(Texas Red), 나일 레드(Nile Red), 티아디카르보시아닌(Thiadicarbocyanine) 등이 사용될 수 있다. 이러한 표지물질을 효과적으로 비스PNA에 부착하기 위해, 이러한 표지물질과 비스PNA 사이에 O-링커(8-amino-2,6-dioxaoctanoic acid)와 같은 스페이서(spacer)가 포함될 수도 있으나, 본 발명의 범위가 이것들로 제한되는 것은 아니다.

각 PNA 서열(A 및 A')은 폴리아데닌과 상보적인 염기쌍을 형성할 수 있도록 티민, 우라실, 슈도우라실, 티민 유도체, 우라실 유도체, 슈도우라실, 또는 유니버셜 염기로 구성된다. 두 서열의 길이는 같거나 다를 수 있고, 바람직하게는 4~20개의 염기로 이루어진다. 핵산염기들이 N-(2-아미노에틸)글리신으로 연결된 PNA가 가장 흔하게 쓰이지만, 타겟 핵산과의 결합을 더 강하게 하기 위해 PNA 주사슬에 생리학적 조건에서 양전하를 띠는 N-(2-아미노에틸)라이신이나 N-(2-아미노에틸)아르기닌으로 연결된 PNA를 사용할 수도 있다(문헌 [Krupnik OV, Guscho YA, Sluchanko KA, Nielsen PE, Lazurkin YS. (2001) "Thermodynamics of the melting of PNA₂/DNA triple helices" Journal of Biomolecular Structure & Dynamics 19:535-542; Ishizuka T, Yoshida J, Yamamoto Y, Sumaoka J, Tedeschi T, Corradini R, Sforza S, Komiyama M. (2008) "Chiral introduction of positive charges to PNA for double-duplex invasion to versatile sequence" Nucleic Acids Research, 36:1464-1471; Zhou P, Wang M, Du L, Fisher GW, Waggoner A, Ly DH. (2003) "Novel Binding and Efficient Cellular Uptake of Guanidine-Based Peptide Nucleic Acids (GPNA)" Journal of American Chemical Society 125:6878-6879]). 주 사슬이 다른 방식으로 변형된 PNA도 본 발명에 이용될 수 있고, 다음과 같은 공지의 것들이 포함된다:

(Base: 핵산염기, R: 아미노산의 측쇄)

비스PNA에 포함되는 핵산염기는 일반적으로 티민 또는 우라실이며 우라실의 유도체, 슈도우라실의 유도체 또는 유니버셜 염기가 포함될 수 있다. 핵산염기로 는 하기 화학식 1의 화합물을 사용할 수 있다:

상기 식에서,

X는 메틸, 수소원자, 할로겐 원자 또는 아미노알릴(aminoallyl)을 나타내고,

Y는 산소원자 또는 황원자를 나타낸다.

상기 화학식 1에서, X = CH₃ , Y = O인 화합물이 티민이고, X = H, Y = O인 화합물이 우라실이며, X = H, Y = S인 화합물이 2-티오우라실이다.

슈도우라실의 유도체로는 하기 화학식 2의 화합물을 사용할 수 있다.

상기 식에서, R은 수소원자 또는 보호기, 예를 들어 메틸을 나타낸다

유니버셜 염기는 천연 핵산염기인 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실과는 달리 2가지 이상의 염기와 혼성화할 수 있는 특성을 갖는다. 예를 들어, T. A. Millican 등(문헌 [Millican TA, Mock GA, Chauncey MA, Patel TP, Eaton MAW, Gunning J, Cutbush SD, Neidle S, Mann J. (1984) "Synthesis and biophysical studies of short oligodeoxynudeotides with novel modifications: a possible approach to the problem of mixed base oligodeoxynudeotide synthesis" Nucleic Acids Research 12:7435-7453])은 단순히 염기를 제거하거나 페닐기를 가짐으로써 수소결합에 의한 특이적 혼성화 반응에 의한 영향을 받지 않도록 한 1,2-디데옥시-D-리보퓨라노스 및 1,2-디데옥시-1-페닐-b-D-리보퓨라노스를 고안하였다. 이들 염기는 비록 천연 염기 보다는 결합강도가 떨어지지만 4가지 염기와 모두 반응하는 성질을 갖는다. 그 후 4가지 염기에 모두 결합할 수 있는 하이포잔틴, 잔틴 및 탈아민화된 구아닌(문헌 [Eritja R, Horowitz DM, Walker PA, Ziehler-Martin JP, Boosalis MS, Goodman MF, Itakura K, Kaplan BE. (1986) "Synthesis and properties of oligonucleotides containing 2'-deoxynebularine and 2'-deoxyxanthosine" Nucleic Acids Research 14:8135-8153] 및 2'-데옥시이노신(문헌 [Seela F, Kaiser K. "Phosphoramidites of base-modified 2'-deoxyinosine isosteres and solid-phase synthesis of d(GCI*CGC) oligomers containing an ambiguous base" Nucleic Acids Research 14:1825-1844])뿐만 아니라, 아데닌과 구아닌 2가지 염기에 결합할 수 있는 5'-플루오로데옥시우리딘(문헌 [Habener JF, Vo CD, Le DB, Gryan GP, Ercolani L, Wang AHJ (1988) "5-Fluorodeoxyuridine as an alternative to the synthesis of mixed hybridization probes for the detection of specific gene sequences" Proceedings of National Academy of Sciences 85:1735-1739]) 및 메톡시시토신, 6H,8H-3,4-디하이드로-피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온(문헌 [Lin PKT, Brown DM. (1989) "Synthesis and duplex stability of oligonucleotides containing cytosine-thymine analogues" Nucleic Acids Research 17:10373-10383])이 개발되었다. 근래에는, 3-니트로피롤(문헌 [Bergstrom DE, Zhang P, Toma PH, Andrews CA, Nichols R. (1995) "Synthesis, structure, and deoxyribonucleic-acid sequencing with a universal nucleoside-1-(2'-deoxy-beta-d-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole" Journal of American Chemical Society 117:1201-1209]) 및 5-니트로인돌(문헌 [Loakes D, Brown DM, Linde S, Hill F. (1995) "3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR" Nucleic Acids Research 23:2361-2366])과 같이 4가지 염기 모두와 수소결합을 하여 혼성화 반응이 이루어질 수 있는 유니버셜 염기가 개발되었는데, 이들 염기는 기존에 개발된 염기에 비해 4가지 염기에 동일하게 결합하므로 염기에 따른 반응의 차이를 줄일 수 있어 널리 활용되고 있다. 그밖에도 문헌[Loakes D. (2001) "Survey and Summary: The applications of universal DNA base analogues" Nucleic Acids Research 29:2437-2447]에 여러 유니버셜 염기가 예시되어 있다. DNA에 유니버셜 염기를 적용한 예들이 많이 알려져 있지만, PNA에 유니버셜 염기를 적용한 예들도 또한 알려져 있다(문헌 [Zhang BP, Egholm M, Paul N, Pingle M, Bergstrom DE. (2001) "Peptide Nucleic Acid-DNA Duplexes Containing the Universal Base 3-Nitropyrrole", METHODS 23:132-140]; [Challa H, Styers ML, Woski SA. (1999) "Nitroazole Universal Bases in Peptide Nucleic Acids", Organic Letters 1:1639-1641]). 유니버셜 염기를 너무 많이 사용하면 타겟 핵산과의 결합력이 감소하므로 비스PNA에 포함된 유니버셜 염기는 4개 이하인 것이 바람직하다.

PNA 이외에도 타겟 핵산과 안정한 삼중가닥을 형성할 수 있다면 다른 핵산이나 핵산 유도체도 사용할 수 있으며, 예를 들어 LNA(locked nucleic acid)를 포함하며, 이러한 변형은 당업자에게 자명한 것인바, 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명에서는 한국특허 제555,204호에 개시된 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체를 사용하여 비스PNA를 합성하였다. 이외에도 알려진 Fmoc 또는 t-Boc으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 비스PNA를 합성할 수도 있다(문헌 [Dueholm KL, Egholm M, Behrens C, Christensen L, Hansen HF, Vulpius T, Petersen KH, Berg RH, Nielsen PE, Buchardt O. (1994) "Synthesis of Peptide Nucleic Acid Monomers Containing the Four Natural Nucleobases: Thymine, Cytosine, Adenine, and Guanine and Their Oligomerization" Journal of Organic Chemistry 59:5767-5773; Christensen L, Fitzpatrick R, Gildea B, Petersen KH, Hansen HF, Koch T, Egholm M, Buchardt O, Nielsen PE, Coull J. (1995) "Solid-phase synthesis of peptide nucleic acids" Journal of Peptide Science 1:175-183; Thomson SA, Josey JA, Cadilla R, Gaul MD, Hassman CF, Luzzio MJ, Pipe AJ, Reed KL, Ricca DJ. (1995) "Fmoc mediated synthesis of peptide nucleic acids" Tetrahedron 51: 6179-6194]. 이와 같이, 본 발명에서는 통상적인 PNA 합성방법 중 어떠한 방법도 사용할 수 있는바, PNA 합성방법에 의해 본 발명의 범위 가 제한되지는 않는다.

2. 타겟 핵산의 제조

마이크로어레이 실험을 위해 핵산을 추출하여 준비하였다. 본 발명은 RNA 또는 DNA 추출방법과 무관하기 때문에 여러 추출 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어 혈액이나 특정 조직에서 추출하여 사용할 수 있으며, 트리졸(trizol)을 이용한 방법, 상용화되어 있는 제품을 이용하는 방법 등을 사용할 수 있다. 마이크로RNA를 분석하는 경우에는 짧은 RNA나 마이크로RNA만을 분리하는 PAGE 분획(fraction) 방법을 사용할 수 있으며, 그 방법에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법으로 핵산을 검출하기 위해서는 폴리아데닌을 포함하는 타겟 핵산이 필요하다. mRNA에는 50 내지 200개의 아데닌 염기가 연속된 폴리아데닌 꼬리가 있으므로 폴리아데닌과 삼중가닥을 형성하는 비스PNA로 표지하여 검출할 수 있다. 검출하려는 핵산에 폴리아데닌이 포함되어 있지 않다면 폴리아데닌을 타겟 핵산에 인위적으로 부착하여야 한다. 폴리(A) 중합효소, 리가제 등을 사용하여 폴리아데닌을 타겟 핵산에 부착할 수 있다. 마이크로어레이 방법으로 타겟 핵산을 검출하는 경우, 마이크로어레이에 고정된 프로브에 타겟 핵산을 혼성화하기 전에 폴리아데닌을 부착하는 방법과 마이크로어레이에 고정된 프로브에 타겟 핵산을 혼성화한 후에 폴리아데닌을 부착하는 방법이 있다. 여기서 마이크로어레이라고 하는 것은 유리 슬라이드나 다른 고체 표면에 여러 프로브가 고정된 마이크로어레이 이외에 비드마다 각각 다른 프로브가 고정된 비드어레이, 마이크로비드 등을 포함 한다.

균질 용액 상에서 추출한 RNA에 폴리아데닌을 부착하는 방법은 널리 알려져 있고 이 단계를 수행하는 키트도 상업적으로 제공된다(문헌 [Engel JD, Davidson N. (1978) "Addition of poly(adenylic acid) to RNA using polynucleotide phosphorylase: an improved method for electron microscopic visualization of RNA-DNA hybrids" Biochemistry, 17:3883-3888]; [Lingner J, Keller W. (1999) "3'-end labeling of RNA with recombinant yeast poly(A) polymerase" Nucleic Acids Research 21:2917-2920]; [Yehudai-Resheff S, Schuster G. (2000) "Characterization of the E.coli poly (A) polymerase: nucleotide specificity, RNA bidning affinities and RNA structure dependence" Nucleic Acids Research 28:1139-1144]).

3. 비스PNA를 이용한 타겟 핵산의 표지 및 분석

본 발명에 따른 비스PNA를 사용하여 다음의 3 가지 변법(process variant)으로 타겟 핵산을 검출할 수 있다.

<변법 1>

폴리아데닌을 포함하는 타겟 핵산과, 본 발명에 따른 비스PNA를 용액 상에서 먼저 1차 혼성화하여 폴리아데닌 부위에 삼중가닥을 형성한 후, 타겟 핵산을 마이크로어레이에 고정된 프로브와 2차 혼성화를 통해 타겟 핵산을 검출하는 방법(도 4)

<변법 2>

폴리아데닌을 포함하는 타겟 핵산을 마이크로어레이에 고정된 프로브와 1차 혼성화하여 타겟 핵산을 마이크로어레이에 고정한 후, 본 발명에 따른 비스PNA를 고정된 타겟 핵산과 2차 혼성화하여 타겟 핵산을 검출하는 방법(도 5)

<변법 3>

타겟 핵산을 마이크로어레이에 고정된 프로브와 1차 혼성화하여 타겟핵산을 마이크로어레이에 고정하고 고정되지 않은 핵산들을 세척한 후, 폴리(A) 중합효소 등을 이용하여 마이크로어레이에 고정된 핵산에 폴리아데닌을 부착한 다음, 본 발명에 따른 비스PNA를 고정된 타겟 핵산과 2차 혼성화하여 타겟 핵산을 검출하는 방법(도 6). 이 경우, 폴리아데닌 부착 단계에서 타겟 핵산에만 선택적으로 폴리아데닌이 부착되고 마이크로어레이에 고정된 프로브에는 폴리아데닌이 부착되지 않아야 한다. 예를 들어 PNA 프로브가 고정된 마이크로어레이를 폴리(A) 중합효소와 함께 사용할 수 있다.

각 변법을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

<변법 1>

(a) 폴리아데닌을 포함하는 타겟 핵산과, 본 발명에 따른 비스PNA가 삼중가닥을 형성하는 1차 혼성화 단계;

(b) 삼중가닥을 형성한 타겟 핵산과 마이크로어레이에 고정된 프로브의 2차 혼성화 단계;

(c) 혼성화 반응하지 않은 반응잔여물을 제거하는 세척 단계; 및

(d) 마이크로어레이에서 표지물질의 신호를 읽는 검출 단계.

단계 (a)에서는, 타겟 핵산에 폴리아데닌(포획 서열(capture sequence))을 도입하고, 이와 비스PNA(상보적 서열)를 혼성화시킨다. 혼성화된 삼중가닥은 열적으로 매우 안정하다. 삼중가닥 혼성화에 바람직한 온도는 30 내지 70 ℃이며, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 ℃이다. 혼성화 시간은 10 분 내지 24 시간이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30 분 내지 3 시간이다. 본 발명에 따른 비스PNA와 삼중가닥을 형성한 타겟 핵산은 쉽게 검출할 수 있다.

단계 (b)에서는, 삼중가닥을 형성한 타겟 핵산을 마이크로어레이 상에 고정된 프로브와 2차 혼성화시킨다. 혼성화에 바람직한 온도는 30 내지 70 ℃이며, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 ℃이되, 단계 (a)의 1차 혼성화 온도 이하인 것이 바람직하다. 2차 혼성화 시간은 10 분 내지 24 시간이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30 분 내지 3 시간이다.

단계 (c)에서는, 혼성화 반응을 하지 않은 비스PNA나 혼성화 반응을 하지 않은 잔여 타겟 핵산을 세척하여 제거하여 마이크로어레이의 프로브에 상보적인 염기쌍으로 결합된 타겟 핵산만 남긴다.

단계 (d)에서는, 표지물질의 신호를 이용하여 타겟 핵산을 검출한다.표지물질의 종류에 따라 형광 검출법, 전기화학적 방법, 질량변화를 이용한 검출법, 전하량 변화를 이용한 검출법, 또는 광학적 성질의 차이를 이용한 검출법 등과 같은 잘 알려진 혼성화 검출방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 바이오틴과 결합하는 스트렙트아비딘(streptavidin)에 결합한 형광 염료를 이용한 형광 검출법을 사용할 수도 있고, 바이오틴과 결합하는 스트렙트아비딘에 결합한 호스래디쉬 퍼옥시데이 즈(HRP, Horse Radish peroxydase)를 이용한 효소 발색법을 사용하여 타겟 핵산을 검출할 수도 있다. 본 발명의 실시예에서는 표지물질로 바이오틴을 사용하여 바이오틴과 결합하여 신호를 발색하는 스트렙트아비딘에 Cy5와 Cy3가 부착된 물질을 이용하여 형광 신호를 검출하였다.

<변법 2>

(a) 폴리아데닌을 포함하는 타겟 핵산을 마이크로어레이에 고정된 프로브와 1차 혼성화하는 단계;

(b) 혼성화가 일어난 폴리아데닌을 가진 타겟 핵산이 비스PNA와 삼중가닥을 형성하는 2차 혼성화 단계;

(c) 혼성화 반응하지 않은 반응잔여물을 제거하는 세척 단계; 및

(d) 마이크로어레이에서 표지물질의 신호를 읽는 검출 단계.

단계 (a)에서는, 일반적인 혼성화 반응으로서, 마이크로어레이 제공 업체의 권장 방법에 따라 타겟 핵산을 마이크로어레이의 프로브에 고정시킨다.

단계 (b)에서는, 단계 (a)에서 프로브에 고정된 타겟 핵산에 포함된 폴리아데닌을 비스PNA와 2차 혼성화 반응시켜 안정한 삼중가닥을 형성하게 한다.

단계 (c) 및 (d)는 변법 1의 단계 (c) 및 (d)와 동일하게 수행한다.

<변법 3>

a) 폴리아데닌을 포함하지 않는 타겟 핵산과 마이크로어레이에 고정된 PNA 프로브의 1차 혼성화 단계;

b) 1차 혼성화 반응하지 않은 반응잔여물을 제거하는 1차 세척 단계;

c) 마이크로어레이의 프로브에 고정된 타겟 핵산에 폴리아데닌을 부착하는 단계;

d) 폴리아데닌이 부착된 타겟 핵산과 비스PNA의 삼중가닥을 형성하는 2차 혼성화 단계;

e) 2차 혼성화 반응하지 않은 반응잔여물을 제거하기 위한 2차 세척 단계; 및

f) 마이크로어레이에서 표지 물질의 신호를 읽는 검출 단계.

마이크로RNA를 분석하고자 하는 경우, 단계 (a)에서는 전처리를 거치지 않은 전체 RNA 또는 분획하여 얻은 짧은 길이의 RNA를 마이크로어레이에 고정된 PNA 프로브에 혼성화한다. 마이크로어레이에 고정되지 않은 잔여 핵산들을 단계 (b)에서 1차 세척하여 제거한다.

단계 (c)에서는 마이크로어레이에 고정된 타겟 핵산에 폴리아데닌을 부착한다. 본 발명의 실시예에서는 폴리(A) 중합효소를 사용하여 혼성화된 타겟 핵산에 폴리아데닌을 부착하였다.

단계 (d),(e) 및 (f)는 변법 2의 단계 (b),(c) 및 (d)와 동일하게 수행한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 비스PNA(바이오틴-OO-TTT-TTT-OOO-TTT-TTT-LysLys-NH2 = 비스PNA(159))의 합성

6개의 티민(T)으로 이루어진 2개의 PNA 서열이 O-링커(8-amino-2,6-dioxaoctanoic acid) 3개로 연결되며 한쪽 끝에 바이오틴 표지물질이 부착된 비스PNA(159)를 한국특허 제555,204호의 방법에 따라 Bts(Benzothizaolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 고체상 합성법(solid phase synthesis)으로 합성하였다.

실시예 2(1): 마이크로어레이의 제작

Let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g, miR-16, miR-21, miR-24, miR-222, miR-125b, miR-143, miR142, miR-155, miR-15a 서열에 상보적인 염기 서열의 PNA 올리고머를 에폭시 코팅된 슬라이드 유리의 다른 위치에 고정된 PNA 마이크로어레이를 제작하였다.

실시예 2(2): 마이크로어레이의 제작

실시예 2(1)에서, PNA 올리고머 대신 miRNA 서열에 상보적인 염기 서열의 DNA 올리고머가 고정된 DNA 마이크로어레이를 제작하였다.

실시예 3: 혼성화 반응 전 타겟 miRNA에 형광물질 표지화를 위한 폴리아데닌 도입

타겟 miRNA(miR222) 1~100 ng에 반응 완충액 100 ㎕ 중 10× 폴리(A) 중합효소 완충액 10 ㎕, 10 mM ATP 1:100으로 희석하여 1 ㎕, 폴리(A) 중합효소(4 ㎕/1 ㎕) 1 ㎕(EPICENTRE Biotechnologies, 미국), 증류수 88 ㎕의 조성으로 37 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 반응 후 에탄올을 이용하여 정제하였다.

실시예 4: 변법 1을 통한 표지물질의 도입 및 분석

miR-222 염기서열에 아데닌이 10개 추가된 합성 RNA 1 nM을 바이오틴 표지물질이 부착된 비스PNA(159) 2 nM과 100 ㎕의 반응 완충용액에서 40 ℃에서 2 시간 동안 혼성화 반응을 시켰다. 2 시간 후 이 혼합물을, 실시예 2(1)에서 제조한 PNA 마이크로어레이와 40 ℃에서 2 시간 동안 혼성화 반응을 진행하였다. 마이크로어레이를 세척한 후 스트렙트아비딘-Cy5(50 ng)을 포함하는 반응 완충액(100 ㎕)에서 40 ℃에서 10 분간 바이오틴을 스트렙트아비딘-Cy5와 반응시켰다. 세척 건조 후 형광스캐너를 이용하여 마이크로어레이의 스팟에서 나오는 형광 신호를 분석하였다(진픽스(Genepix) 4000B, 엑손(Exon), 미국). 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 방법에 따라 타겟 miRNA를 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있는 것으로 확인되었다.

실시예 5: 변법 2를 통한 표지물질의 도입 및 분석(1)

miR-222 염기서열에 아데닌이 10개 추가된 합성 RNA 1nM을 실시예 2(1)에서 제조한 PNA 마이크로어레이에 40 ℃에서 2 시간 동안 혼성화 반응을 시켰다. 마이 크로어레이를 세척한 후 마이크로어레이를 2 nM의 비스PNA(159)를 포함한 반응 완충액(100 ㎕)에서 40 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 세척 완충액으로 5 분간 2회 세척하고 건조하였다. 마이크로어레이를 세척한 후 스트렙트아비딘-Cy5(50 ng)을 포함하는 반응 완충액(100 ㎕)에서 40 ℃에서 10 분간 바이오틴을 스트렙트아비딘-Cy5와 반응시켰다. 세척 건조 후 형광스캐너를 이용하여 마이크로어레이의 스팟에서 나오는 형광 신호를 분석하였다(진픽스(Genepix) 4000B, 엑손(Exon), 미국). 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 방법에 따라 타겟 miRNA를 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있는 것으로 확인되었다.

실시예 6: 변법 2를 통한 표지물질의 도입 및 분석(2)

실시예 3에서 폴리(A) 중합효소를 사용하여 폴리아데닌을 도입한 miRNA-222를 실시예 2(1)에서 제조한 PNA 마이크로어레이와 40 ℃에서 2 시간 혼성화 반응을 시켰다. 마이크로어레이를 세척한 후 마이크로어레이를 2 nM의 비스PNA(159)를 포함한 반응 완충액(100 ㎕)에서 40 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 세척 완충액으로 5 분간 2회 세척하고 건조하였다. 마이크로어레이를 세척한 후 스트렙트아비딘-Cy5(50 ng)을 포함하는 반응 완충액(100 ㎕)에서 40 ℃에서 10 분간 바이오틴을 스트렙트아비딘-Cy5와 반응시켰다. 세척 건조 후 형광스캐너를 이용하여 마이크로어레이의 스팟에서 나오는 형광 신호를 분석하였다(진픽스(Genepix) 4000B, 엑손(Exon), 미국). 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 방법에 따라 타겟 miRNA를 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있는 것으로 확인되었다.

실시예 7: 변법 3을 통한 표지물질의 도입 및 분석

miR-222 1 nM을 실시예 2에서 제조한 PNA 마이크로어레이와 40 ℃에서 2 시간 혼성화 반응을 시켰다. 이 마이크로어레이에 100 ㎕의 용액을 보유할 수 있는 구멍이 형성된 실리콘 고무 반응기를 밀착시켰다. 총부피 100 ㎕에 각각 10× 폴리(A) 중합효소 완충액 10 ㎕, 10 mM ATP을 1:100으로 희석하여 1 ㎕, 폴리(A) 중합효소(4 ㎕/1 ㎕) 1 ㎕(EPICENTRE Biotechnologies, 미국), 증류수 88 ㎕의 조성으로 혼합한 혼합액을 마이크로어레이 위의 반응기에서 37 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 마이크로어레이를 세척한 후 마이크로어레이를 2 nM의 비스PNA(159)를 포함한 반응 완충액(100 ㎕)에서 40 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 세척 완충액으로 5 분간 2회 세척하고 건조하였다. 마이크로어레이를 세척한 후 스트렙트아비딘-Cy5(50 ng)을 포함하는 반응 완충액(100 ㎕)에서 40 ℃에서 10 분간 바이오틴을 스트렙트아비딘-Cy5와 반응시켰다. 세척 건조 후 형광스캐너를 이용하여 마이크로어레이의 스팟에서 나오는 형광 신호를 분석하였다(진픽스(Genepix) 4000B, 엑손(Exon), 미국). 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 방법에 따라 타겟 miRNA를 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있는 것으로 확인되었다.

도 1은 PNA와 DNA의 구조식을 나타낸 도면이고;

도 2는 PNA의 호모피리미딘과 DNA 또는 RNA의 호모퓨린이 삼중가닥(triplex)을 형성하는 방법을 나타낸 도면이며;

도 3은 PNA₂/DNA(RNA)가 이루는 삼중가닥과 비스PNA/DNA(RNA)가 이루는 삼중가닥을 나타낸 도면이고;

도 4는 본 발명에 따른 타겟 핵산 검출 방법의 변법 1을 도식적으로 나타낸 도면이며;

도 5는 본 발명에 따른 타겟 핵산 검출 방법의 변법 2를 도식적으로 나타낸 도면이고;

도 6은 본 발명에 따른 타겟 핵산 검출 방법의 변법 3을 도식적으로 나타낸 도면이며;

도 7은 본 발명에 따른 타겟 핵산 검출 방법의 변법 1의 검출 결과를 나타낸 그래프이고;

도 8은 본 발명에 따른 타겟 핵산 검출 방법의 변법 2의 검출 결과를 나타낸 그래프이며;

도 9는 본 발명에 따른 타겟 핵산 검출 방법의 변법 2의 검출 결과를 나타낸 그래프이며;

도 10은 본 발명에 따른 타겟 핵산 검출 방법의 변법 3의 검출 결과를 나타 낸 그래프이다.

Claims (33)

1. 6 내지 200개의 연속한 아데닌을 포함하는 타겟 핵산으로 DNA, RNA, 인위적으로 폴리아데닌이 도입된 DNA 또는 인위적으로 폴리아데닌이 도입된 RNA와 삼중가닥(triplex)을 형성할 수 있는, 하기 일반식 1로 나타내어지는 비스PNA(bisPNA):

   [일반식 1]

   

   상기 식에서,

   A 및 A'는 각각 독립적으로 아데닌과 상보적 결합을 형성할 수 있는 4 내지 40개의 염기 서열로 이루어지는 PNA를 나타내고,

   L은 링커(linker)를 나타내며,

   D₁, D₂, D₃ 및 D₄는 각각 독립적으로 검출 가능한 표지를 나타내고,

   a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 0 이상의 정수이되, a+b+c+d≥1이다.
2. 제1항에 있어서, 아데닌과 상보적 결합을 형성할 수 있는 염기가 티민, 우라실, 슈도우라실, 티민의 유도체, 우라실의 유도체, 슈도우라실의 유도체 및 유니버셜 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것인 비스PNA.
3. 제2항에 있어서, 아데닌과 상보적 결합을 형성할 수 있는 염기가 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 2로 나타내어지는 것인 비스PNA.

   [화학식 1]

   

   [화학식 2]

   

   상기 식에서,

   X는 메틸, 수소원자, 할로겐 원자 또는 아미노알릴을 나타내고,

   Y는 산소원자 또는 황원자를 나타내며,

   R은 수소원자 또는 메틸을 나타낸다.
4. 제1항에 있어서, 아래 구조의 PNA를 하나 이상 포함하는 비스PNA:

   

   상기 식에서,

   Base는 핵산염기를 나타내고,

   R은 아미노산의 측쇄를 나타낸다.
5. 제1항에 있어서, A 및 A'는 각각 독립적으로 아데닌과 상보적 결합을 형성할 수 있는 6 내지 10개의 염기 서열로 이루어지는 PNA를 나타내는 것인 비스PNA.
6. 제1항에 있어서, 검출 가능한 표지가 형광물질, 헵텐, 단백질, 펩타이드, 바이오틴, 또는 방사성 원소인 비스PNA.
7. 제6항에 있어서, 형광물질이 로다민, 사이아닌(Cyanine)3, 피렌(pyrene), 사이아닌5, 녹색형광단백질(GFP; Green Fluorescent Protein), 칼세인 (Calcein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 알렉사(Alexa)488, 6-카르복시-플루오레세인(FAM), 2',4',5',7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(HEX), 2',7'-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(TET), 플루오레세인 클로로트리아지닐(Fluorescein Chlorotriazinyl), 플루오레세인, 오레건 그린(Oregon Green), 마그네슘 그린(Magnesium Green), 칼슘 그린 (Calcium Green), 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인(JOE), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), 테트라메틸-로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 카르복시테트라메틸 로다민(TAMRA), 로다민 팔로이딘(Phodamine PHalloidin), 피로닌Y (Pyronin Y), 리싸민(Lissamine), ROX(X-rhodamine), 칼슘 크림선(Calcium Crimson), 텍사스 레드(Texas Red), 나일 레드(Nile Red) 및 티아디카르보시아닌(Thiadicarbocyanine)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것인 비스PNA.
8. 제1항에 있어서, a+b+c+d≥2인 비스PNA.
9. 제1항에 있어서, 링커가 폴리에테르, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 글리세롤, 아미드(amide), 카바메이트(carbamate), 당(saccharides), 다당(polysaccharides) 및 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 1 내지 20개의 단위로 이루어지는 것인 비스PNA.
10. 제2항에 있어서, 유니버셜 염기를 4개 이하로 포함하는 비스PNA.
11. 6 내지 200개의 연속한 아데닌을 포함하는 타겟 핵산으로 DNA, RNA, 인위적으로 폴리아데닌이 도입된 DNA 또는 인위적으로 폴리아데닌이 도입된 RNA와 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 비스PNA와 혼성화하여 비스PNA-타겟 핵산의 삼중가닥을 형성하는 단계를 포함하는, 타겟 핵산의 표지 방법.
12. 삭제
13. 제11항에 있어서, 인위적인 아데닌 도입은 폴리(A) 중합효소 또는 리가제를 이용하여 도입된 것인, 타겟 핵산의 표지 방법.
14. 제11항에 있어서, 혼성화를 30 내지 70 ℃의 온도에서 10 분 내지 24 시간 동안 수행하는, 타겟 핵산의 표지 방법.
15. 제11항에 있어서, 타겟 핵산이 마이크로RNA인, 타겟 핵산의 표지 방법.
16. 1) 6 내지 200개의 연속한 아데닌을 포함하는 타겟 핵산으로 DNA, RNA, 인위적으로 폴리아데닌이 도입된 DNA 또는 인위적으로 폴리아데닌이 도입된 RNA와 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 비스PNA와 혼성화하여 비스PNA-타겟 핵산의 삼중가닥을 형성하고;

    2) 단계 1)의 삼중가닥으로부터의 신호를 검출하는:

    단계를 포함하는, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 방법.
17. 제16항에 있어서, 단계 1)을 수행하기 전 또는 후에 타겟 핵산을 그에 특이적인 프로브가 고정된 지지체에 가하여 타겟 핵산을 프로브와 혼성화함으로써 타겟 핵산을 지지체에 고정하는 단계를 추가로 포함하는, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 방법.
18. 제17항에 있어서, 지지체가 마이크로어레이, 비드어레이 또는 마이크로비드인, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 방법.
19. 제17항에 있어서, 프로브가 PNA 또는 DNA 프로브인, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 방법.
20. 삭제
21. 제16항에 있어서, 인위적인 아데닌 도입은 폴리(A) 중합효소 또는 리가제를 이용하여 도입된 것인, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 방법.
22. 제16항에 있어서, 타겟 핵산이 마이크로RNA인, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 방법.
23. 제17항에 있어서, 타겟 핵산과 비스PNA의 혼성화, 타겟 핵산과 프로브의 혼성화, 또는 이들 둘 다를 30 내지 70 ℃의 온도에서 10 분 내지 24 시간 동안 수행하는, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 방법.
24. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 비스PNA를 포함하는, 타겟 핵산의 표지 키트.
25. 삭제
26. 제24항에 있어서, 인위적인 아데닌 도입은 폴리(A) 중합효소 또는 리가제를 이용하여 도입된 것인, 타겟 핵산의 표지 키트.
27. 제24항에 있어서, 타겟 핵산이 마이크로RNA인, 타겟 핵산의 표지 키트.
28. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 비스PNA를 포함하는, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 키트.
29. 삭제
30. 제28항에 있어서, 인위적인 아데닌 도입은 폴리(A) 중합효소 또는 리가제를 이용하여 도입된 것인, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 키트.
31. 제28항에 있어서, 타겟 핵산이 마이크로RNA인, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 키트.
32. 제28항에 있어서, 지지체 상에 고정된 타겟 핵산에 특이적인 프로브를 추가로 포함하는, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 키트.
33. 제32항에 있어서, 프로브가 PNA 또는 DNA 프로브인, 타겟 핵산의 검출 또는 분석 키트.

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