KR101571149B1

KR101571149B1 - 근적외선 형광다이를 함유하는 요오드화 오일 유제 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101571149B1
Application number: KR1020130154232A
Authority: KR
Inventors: 임준석; 형우진; 임수정
Original assignee: 연세대학교 산학협력단; 세종대학교산학협력단
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2013-12-11
Publication date: 2015-11-23
Also published as: KR20150068238A

Abstract

본 발명은 근적외선 형광다이를 함유하는 요오드화 오일 유제 및 이의 용도에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 요오드계 조영물질을 포함하는 코어; 및 코어 외부의 쉘에 근적외선 형광 염료와 계면 활성제를 포함하는 수중 유적형 에멀전, 상기 에멀전을 포함하는 감시림프절 (Sentinel lymph node) 탐색용 근적외선 형광 조영제 조성물 및 상기 에멀전을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 근적외선 형광 조영제 조성물(ICG-loaded emulsion)을 기반으로 한 혼성 림프관 조영법(hybrid lymphography)은 CT 및 NIR imaging 모두에서 실현가능하고, 효과적으로 지속적인 위장 SLN 시각화(gastric SLNs visualization)를 가능하게 하였으며, 추가적인 절차를 필요로 하지 않고도 SLN mapping 및 navigation 을 하는 신뢰할 수 있는 수단을 제공하였다. 이러한 능력은 외과적 치료에 있어서 그 응용범위를 확대시키는데 효과적이다.

Description

근적외선 형광다이를 함유하는 요오드화 오일 유제 및 이의 이용{Iodized oil emulsion containing near-infrared fluorescent dye and use thereof}

본 발명은 근적외선 형광다이를 함유하는 요오드화 오일 유제 및 이의 용도에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 요오드계 조영물질을 포함하는 코어; 및 코어 외부의 쉘에 근적외선 형광 염료와 계면 활성제를 포함하는 수중 유적형 에멀전, 상기 에멀전을 포함하는 감시림프절 (Sentinel lymph node) 탐색용 근적외선 형광 조영제 조성물 및 상기 에멀전을 제조하는 방법에 관한 것이다.

넓은 부위의 림프절 절제 (D2 림프절 절제)는 위암 환자에게 있어 표준절차이다. 그러나 이러한 절차를 T1 병기환자(임상 병기 구분에 있어서 T1은 암이 위 점막 혹은 점막하층까지 침윤된 상태를 의미한다.)에게 적용하는데 있어서 논란이 있는데, 왜냐하면 T1 병기환자의 경우 80-95%에서는 림프절에 전이가 되어 있지 않고 오히려 림프절 절제로 인해 수술 후 합병증의 위험이 있기 때문이다. 따라서 T1 병기의 환자에서 림프절 절제범위를 최소화하기 위해서는 높은 정확도를 가지고 림프절 전이의 부재를 확신할 수 있는 신뢰할만한 지표가 필요하다. 감시림프절 맵핑(Sentinel node(SN) mapping)은 이러한 문제의 해결책이 될 것이라 예상되고 있다. 감시림프절은 종양이 일차 암 조직으로부터 림프관을 따라 최초로 유입되는 림프절로 정의할 수 있는데, 감시림프절의 전이가 없다고 확인된 경우 다른 림프절에도 전이가 없을 것으로 판정할 수 있다.

최근에 생염료(vital dye) 및 방사성 콜로이드(radioactive colloid)를 사용한 이중 추적자 방법(dual tracer method)이 초기 위암 환자에게 있어서 감시림프절(SN)을 안정적으로 탐지하는 가장 신뢰할만한 방법으로 여겨지고 있다(Park do J et al.,2011; Kitagawa Y et al., 2005). 생염료(vital dye)는 빠르게 수송 되고 씻겨나가서(분산하는데 5-15분) 주사후 빠른 시간내에 관찰해야만 하는 제한점이 있으며, 또한 림프절이 지방층에 쌓여 있는 경우에 감시림프절의 육안 확인이 불가능하다(Kitagawa Y et al,. 2005; Kitagawa Y et al.,2006). 방사성 추적자(Radioactive tracers)는 공간 해상도(spatial resolution)가 좋지 못하며, 원발종양 주위에 주사된 동위원소의 방사능이 강하기 때문에 감시림프절에서 방출되는 방사능의 탐지를 방해하여 수술 중 감시림프절 검출을 어렵게 만드는 단점이 있고(shine-through effect) (Kitagawa Y et al, 2002; Kim YH et al., 2013), 환자와 수술에 참여하는 의료인력에 피폭을 야기하는 문제가 있다. 게다가, 두 방법 모두 수술 중 감시림프절을 탐지하기 위해 수술하는 동안 추가적인 절차를 필요로 하여 수술시간이 더 길어지게 된다.

인도시아닌 그린(ICG)은 생염료인 동시에 FDA로부터 인체 적용가능이 허용된 몇 안되는 형광염료중의 하나이면서, 신체 각 조직의 흡광이 미미한 근적외선 영역에서 형광을 내기 때문에, 다양한 분야에 활용이 되고 있으나, 물질 자체의 화학적 안정성이 낮아, 더 많은 분야로의 활용에 제약조건이 되고 있다. 이러한 ICG는 감시림프절 탐색을 위해 연구 수준에서 사용되기도 하였으나, 그 크기가 너무 작고 고 (분자량 775) 친수성이어서 생체 내에 주입되었을 때, ICG가 감시림프절에 오래 머물러 있지 않고, 주변 혈관혹은 림프선을 통해 빠르게 washout되어, 육안적 관찰을 위한 시간적 여유가 없다는 문제점이있다. 이러한 점은 실제 수술과정에서 암 조직 주위에서 어느 림프노드가 감시림프절인지를 구분하기 어렵게 만들 수 있다는 단점이 있다.

최근 몇몇 연구자들은 상용화된 수용성 iodine CT 정맥조영제를 이용하여 이를 이용한 감시림프절의 검색을 시도하였다. 그러나 이러한 수용성 조영제는 생염료와 유사하게 빠른 washout으로인해 조영증강된 감시림프절을 관찰할 수 있는 적정한 time-window가 10분 이내로 감시림프절의 발견에 시간적 제약이 있다 (Hyung WJ, Kim YS, Lim JS, Kim MJ, Noh SH, Kim KW. Preoperative imaging of sentinel lymph nodes in gastric cancer using CT lymphography. Yonsei Med J 2010;51(3):407-413).

또한 Kim et al. 은 지용성 ethiodized oil(에치오다이즈드 오일;리피오돌이라고도 한다)을 사용한 CT 림프관 조영 방법을 소개하였다. ethiodized oil은 림프절내에 오래 머무는 장점이 있으나 수술전에 주사한 ethiodized oil이 림프관에 남아 있게 되어 수술 중에 투여한 수용성 리포터(생염료)의 움직임을 방해 할 가능성이 있어 수술 중 감시림프절 탐색을 어렵게 할 수 있으며 또한 지용성 ethiodized oil은 주사된 부위전반에 걸친 염증반응을 유도하는 문제점이 있다.

또한 이러한 수용성 iodine 조영제나 지용성 ethiodized oil을 사용할 경우, 모두 수술 중 감사림프절 탐색을 위해 추가적으로 생염료 (ICG 혹은 methylene blue)의 투여를 필요로 한다.

Park do J, Kim HH, Park YS, et al. Simultaneous indocyanine green and (99m)Tc-antimony sulfur colloid-guided laparoscopic sentinel basin dissection for gastric cancer. Ann Surg Oncol 2011;18:160-5. Kitagawa Y, Fujii H, Kumai K, et al. Recent advances in sentinel node navigation for gastric cancer: a paradigm shift of surgical management. J Surg Oncol 2005;90:147-51; discussion 151-2. Kitagawa Y, Saikawa Y, Takeuchi H, et al. Sentinel node navigation in early stage gastric cancer--updated data and current status. Scand J Surg 2006;95:256-9. Kitagawa Y, Fujii H, Mukai M, et al. Radio-guided sentinel node detection for gastric cancer. Br J Surg 2002;89:604-8. Kim YH, Lee YJ, Park JH, et al. Early Gastric Cancer: Feasibility of CT Lymphography with Ethiodized Oil for Sentinel Node Mapping. Radiology 2013. Lim JS, Choi J, Song J, et al. Nanoscale iodized oil emulsion: a useful tracer for pretreatment sentinel node detection using CT lymphography in a normal canine gastric model. Surg Endosc 2012;26:2267-74. 이호신, 정혜순, 서주환, 박종철, 코어-쉘 나노입자,KIC News, Volume 12, No. 3, 2009, 23-37.

이에 본 발명의 발명자들은 형광염료의 감시림프절로부터의 생체 내 워시아웃(washout)시간을 연장시키고 안정성이 증진된, 근적외선 형광다이를 함유하는 요오드화 오일 유제를 제조하고, 이 물질을 기반으로 수술 전 한번의 주사로 수술시간에 영향을 주지 않는 적절한 시간대에 CT 및 NIR 광학 이미징(NIR 형광영상)을 모두 가능케 하여, 수술 전 및 수술 중의 감시림프절 탐색을 가능하게 함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 요오드계 오일 조영물질을 포함하는 코어; 및 코어 외부의 쉘에 양친성(amphiphilic) 근적외선 형광 염료와 계면활성제를 포함하는 수중 유적형 에멀전(emulsion)을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 에멀전을 포함하는 감시림프절(Sentinel lymph node) 탐색용 근적외선 형광 조영제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 요오드계 오일 조영물질, 계면활성제 및 양친성 근적외선 형광 염료를 용매 중에서 혼합하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 혼합물을 감압증류하여 용매를 증발시키는 단계;

(c) 삼투제를 함유한 수용액을 첨가하여 혼합하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계의 혼합물을 초음파처리(sonication)하여 조 에멀젼(crude emulsion)을 얻는 단계; 및

(e) 상기 (d) 단계의 조 에멀전을 균질화시키는 단계를 포함하는, 상기 에멀전을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 요오드계 오일 조영물질을 포함하는 코어; 및 코어 외부의 쉘에 양친성 근적외선 형광 염료와 계면활성제를 포함하는 수중 유적형 에멀전(emulsion)을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 에멀전을 포함하는 감시림프절(Sentinel lymph node) 탐색용 근적외선 형광 조영제 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 요오드계 오일 조영물질, 계면활성제 및 양친성 근적외선 형광 염료를 용매 중에서 혼합하는 단계;

(c) 삼투제를 함유한 수용액을 첨가하여 혼합하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계의 조 에멀전을 균질화시키는 단계를 포함하는, 상기 에멀전을 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 요오드계 오일 조영물질을 포함하는 코어; 및 코어 외부의 쉘에 양친성 근적외선 형광 염료와 계면활성제를 포함하는 수중 유적형 에멀전(emulsion)을 제공한다.

상기 에멀전(emulsion)은 서로 녹지 않는 두 가지 액체의 한편이 다른 쪽에 작은 입자 상태로 분산된 상태, 즉 분산계(the dispersed phase) 액상의 미세입자가 연속계(the continuous phase)의 액체에 혼합되어 있는 콜로이드 상태를 에멀전이라 총칭한다. 본 발명의 에멀전은 바람직하게 마이크로에멀전(microemulsion) 또는 나노에멀젼 일 수 있다.

상기 에멀젼은 분산계와 연속계 및 유화제에 따라 여러 종류가 있으며, 이에 한정되지 않으나 일반적으로, 연속계가 물이고 분산계가 오일(oil)인 수중유적형(oil-in-water, O/W형) 에멀전, 연속계가 오일이고 분산계가 물인 유중수적형(water-in-oil, W/O형)에멀전 , 다중 에멀젼, O/O형(oil in oil)형 에멀전 등이 있다. 본 발명의 에멀전은 수중 유적형임을 특징으로 하며, 본 발명의 명세서‘에멀전’의 기재는 에멀전 상태의 용액 및 에멀전 속에 포함된 입자를 모두 포함한다.

본 발명의 에멀전 입자는 코어-쉘(core-shell)구조를 가짐을 특징으로 하는 고분자 나노입자이다. 상기 코어-쉘 구조는 중심에 존재하는 코어물질을 쉘을 형성하는 물질이 둘러싼 구조를 의미한다. 본 발명의 에멀전 입자는 코어 부분이 요오드계 오일 조영물질을 포함하며, 코어 외부의 쉘에 양친성(amphipathic) 근적외선 형광염료와 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게 상기 코어 외부의 쉘은 계면활성제 분자 사이사이 공극으로 근적외선 형광 염료가 삽입되어있는 형태일 수 있다(도 16 참조). 본 발명의 에멀전 입자는 상기 코어-쉘(core-shell) 구조를 가짐으로서, 요오드계 오일 조영물질 및 근적외선 형광염료가 동시에 타겟 구조로 이동되게 한다. 따라서 상기 에멀전 입자를 1회 처리함으로써, 타겟 구조에 X-선 또는 근적외선에 의한 이미징(imaging)을 동시에 가능하게 한다. 또한 본 발명의 에멀전 입자는 코어(core) 부분에 요오드계 오일 조영물질을 포함하고, 코어 외부가 양친성인 근적외선 형광염료 및 계면활성제를 포함하는 쉘로 이루어지는 구조로 인해 매우 안정하다.

본 발명의 일실시예에서는 코어에 요오드계 오일 조영물질인 lipiodol을 포함하고, 코어외부의 쉘에 ICG(indocyanin green) 및 계면활성제(Tween80, Span85)를 포함하는 에멀전(이하, ICG-loaded emulsion이라 함)을 제조하였다. 상기 제조된 ICG-loaded emulsion에 electrophoretic light-scattering spectrophotometer를 이용하여 나노파티클 등 입자성물질의 표면하전을 의미하는 제타전위를 측정한 결과 높은 음의 값(-32.8± 2.0 mV)을 나타내어, 이로서 에멀전 입자의 쉘(shell)부분에서 음이온의 ICG가 계면활성제 사이에 탑재되었음을 확인하였고, 상기 에멀젼이 전기적으로 안정된 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 계면활성제의 조성 및 ICG 탑재 여부에 따른 emulsion의 안정성을 평가하였는데, T80:S85 에멀젼 또는 T80:S85:SA 에멀젼에 ICG가 탑재될 경우 평균입자경이 일정하게 유지되어 에멀젼의 안정성이 향상된 것을 확인하였다.

또한 본 발명의 다른 일실시예에서는 용액 상태에서 매우 불안정한 것으로 알려져 있는 ICG가 emulsion에의 탑재에 의해 안정성이 증대되는 지를 평가하였다. ICG을 탑재한 emulsion 또는 free ICG 용액을 여러 가지 조건에서 방치하며 ICG의 화학적 안정성을 측정한 결과, T80:S85 에멀젼 또는 T80:S85:SA 에멀젼에 ICG가 탑재됨으로서 ICG염료 자체의 안정성이 향상되는 것을 확인하였다. 즉 코어 쉘 구조로 인하여 에멀젼 입자 자체의 안정성 및 에멀젼에 탑재된 근적외선 염료의 안정성이 매우 향상됨을 확인하였다.

본 발명의 에멀전의 입자는 이에 제한되지 않으나 바람직하게 크기가 직경 100nm 내지 200nm일 수 있으며, 더욱 바람직하게 150nm 일 수 있다. 본 발명의 에멀전 입자는 0―5 mg/ml의 범위 내에서는 근적외선 형광 염료의 함유량에 관계없이, 입자 크기가 200 nm이하로 유지되는 것이 특징이다. 상기와 같은 사실은 근적외선 형광 염료들을 함유하는 기존의 나노입자 자료들에 비하여 에멀젼 내에 ICG 탑재 농도가 매우 높음에도 불구하고 에멀전 입자경이 일정한 수준을 유지함을 의미하는 것이다.

상기 조영물질은 본 발명의 명세서에 조영제로도 표기된다. 조영물질은 자기공명영상(MRI) 촬영이나 컴퓨터단층(CT) 촬영과 같은 방사선 검사 때에 조직이나 혈관을 잘 볼 수 있도록 각 조직의 X선 흡수차를 인위적으로 크게 함으로써 영상의 대조도(contrast)를 크게 해주는 물질을 의미한다. 이러한 조영물질을 사용함으로써 생체 구조나 병변을 주위와 잘 구별할 수 있게 해 주어 진단적 가치를 향상시켜 준다.

본 발명의 요오드계 오일(oil) 조영물질은 요오드(iodine)를 포함하고 지용성을 띠는 조영물질로서 , 당해 분야에 공지되어있는 요오드계 오일 조영물질이라면 그 종류가 제한되지 않으며 바람직하게는 리피오돌(lipiodol)일 수 있다.

상기 리피오돌(lipiodol)은 임상에서 간동맥의 말초혈관 부위, 특히 암 조직에 영양을 공급하는 혈관을 막아서 암 조직을 괴사시키는 색전제 (Embolizing Agent)로 널리 알려진 약물이다. 리피오돌은 에치오다이즈드오일(ethiodized oil) 또는 에티오돌(ethiodol)로도 불리우며, 양귀비씨에서 추출한 지방산을 요오드화한 에틸에스테르이다. 본 발명의 에멀전 내 함유된 리피오돌의 함량은, X-선 컴퓨터 단층촬영 조영에 적합한 X-선 흡수성을 나타내고 적절한 에멀전 입자 크기를 유지하는 범위로 적절하게 조절할 수 있다.

상기 리피오돌의 색전 효과는 리피오돌이 동일 부위에 계속해서 축적될시 나타나게 된다. 그러나 상기 본원 발명의 수중 유적형 에멀전 입자의 코어에 리피오돌이 포함되게 되면, 리피오돌은 에멀젼의 워시아웃에 의해 체내로부터 나가게 되므로 색전효과를 나타내지 않는다.

상기 계면활성제는 표면장력을 낮춰 계면을 활성화시키는 물질을 의미하며 표면활성제라고도 한다. 본 발명의 계면활성제는 바람직하게 폴리옥시에틸렌소르비탄 에스테르계, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌계, 소르비탄 에스테르계, 폴리옥시에틸렌알킬에테르계, 인지질계, 포비돈계 계면활성제 및 이들의 혼합용매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게 트윈(Tween)류, 폴록사머(Poloxamer)류, 스판(Span)류, 플루론(Pluron)류, Brij류, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)류 [예를 들어, DMPC(dimyristoryl phosphatidylcholine) DOPC (dioleoyl phosphatidylcholine), eggPC(Egg Phosphatidylcholine) soyPc(Soybean Phosphatidylcholine), hydrogenated egg PC, hydrogenated soy PC 등등 ], 콜린산, 콜리돈(Kollidon)류, 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)류, 알파-토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이트, 스테아릴아민(stearylamine), 디세틸 포스페이트(dicetylphosphate), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol, 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 트윈 80(Tween 80) 및 스판85(Span85)의 혼합물 또는 트윈 80(Tween 80), 스판85(Span85) 및 stearylamine의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 계면활성제는 에멀전에 포함되는 근적외선 형광 염료의 이온적 성질(양이온 음이온)에 따라, 당업자가 선택하여 추가 또는 대체하여 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 정전기적 인력에 의해 음이온성의 ICG 의 에멀젼에의 결합효율을 높이기 위하여 양이온 계면활성제 (stearylamine)를 추가로 첨가하여 에멀전을 제조하였고, 이렇게 만들어진 ICG-loaded emulsion에서 ICG의 화학적 안정성이 더욱 현저히 개선된 것을 확인하였다.

상기 근적외선 형광 염료는 근적외선 파장에서 형광을 나타내는 염료(dye)를 의미한다. 상기 근적외선은 적외선영역의 전자파 중 파장이 짧은 영역을 의미하며, 이에 제한되지 않지만 일반적으로 약 1.5~0.75μm의 파장 영역을 나타낸다. 분자의 회전 진동 스펙트럼은 대체로 상기 범위 안에서 나타나므로 분자 구조 연구에 중요한 파장 범위로 여겨지고 있다. 근적외선은 가시광선에 비해 피부 투과도가 좋아, 피하층의 혈관 또는 장기 등을 보기 위한 분자 영상이미지를 획득하거나, 수술과정 중 신경 또는 혈관과 같은 민감한 부분에 대한 가이딩(guiding)에 적용할 수 있는 장점을 가지고 있다.

본 발명의 근적외선 형광 염료는 이에 제한되지 않으나 Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 780, cy3.5, cy5, cy5.5, cy7, 인도시아닌 그린(ICG), Cypate, ITCC, NIR820, NIR2, IRDye78, IRDye80, IRDye82 , IRDye680, IRDye700, IRDye800, DiD, DiR, Cresy Violet, Nile Blue, Oxazine 750 및 Rhodamine800, Texas Red 및 이들의 혼합물 또는 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 근적외선 형광염료는 양친성을 띠는 근적외선 형광염료로서, 이에 한정되지 않으나 시아닌 계열인 cy3.5, cy5, cy5.5, cy7, ICG, Cypate, ITCC, NIR820, NIR2, IRDye78, IRDye80, IRDye82 와 Oxazine 계열의 Cresy Violet, Nile Blue, Oxazine 750, Rhodamines 계열의 Rhodamine800, Texas Red, 및 이들의 혼합물 또는 복합체로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 더욱 바람직하게는 인도시아닌 그린(indocyanine green;ICG)일 수 있다.

또한, 본 발명의 에멀전은 에멀전 입자 표면의 화학적 기능기에 항체, 단백질 등과 같은 특이적인 반응물질을 결합하여, 특정질병의 진단 및 치료에 활용 가능하다.

본 발명은 상기 에멀전을 포함하는 감시림프절(Sentinel lymph node) 탐색용 근적외선 형광 조영제 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 혼성 리포터(hybrid reporters)를 포함하는 것으로, 상기 혼성리포터는 근적외선 형광 다이(NIR fluoresent dye) 및 요오드계 조영물질을 혼성(hybrid)한 것을 의미하며, 바람직하게는 상기 에멀전 일수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 요오드계 오일 조영물질로서 리피오돌, 계면활성제인 Tween80과 Span85 및 근적외선 형광 다이(dye)로서 인도시아닌 그린(indocyanine green)을 혼합하여 균질화(homogenization)하는 방법으로, 혼성 리포터인 ICG를 탑재한 에멀전(ICG-loaded emulsion) 조성물을 제조하였다.

혼성 리포터 속에 포함된 ICG는 감시림프절 영상화(SLN imiging)의 몇몇 측면에 기여한다. 색깔이 어두운 초록색이기 때문에 생염료(vital dye)로서 적용가능하다. NIR optical devices 를 가지고 실행한 ICG imaging은 감시림프절의 탐지가능성을 향상시켰고, 수술하는 동안 고해상도의 실시간 시각화(high-resolution real-time visualization)가 가능했다. 흥미롭게도 림프관 및 림프절에서 ICG-loaded emulsion 은 전체 수술과정동안(투여 후 4 내지 5시간 동안) washout이 감지되지 않았고, 수술 전 CT 림프관 조영에서 드러났던 SLN basin을 면밀히 조사하는데 충분한 시간을 주었다. 적절한 장비를 사용하여, 림프선을 영상화 하여 정확한 감시림프절의 탐색을 가능하게 하였고, 복잡한 draining lymphatic system의 상세한 구성에 대한 통찰을 제공했다. 다시 말하면 림프절사이의 림프관을 직접적으로 시각화 함으로서, 감사림프절과 이차 이상의 림프절(beyond second tier LN; 여기서는 림프계연결에 있어서 감시림프절 다음으로 나타나는 둘째 셋째의 림프절을 의미한다)사이의 구분을 가능케 하였다. 본 발명의 일실시예에서 7번 비글에서, 8번 구역(station 8)에 위치한 2개의 림프절 및 11번 구역(station 11)에 위치한 1개의 림프절은 수술전 CT에서 조영증강이 되고 수술 중 형광 영상에서 형광을 보여 감시림프절로 오인될 수 있었으나, 3번 구역(station 3)의 감시림프절에서 연결되는 림프관이 형광영상에서 발견되어 감시림프절이 아닌 이차 혹은 3차 림프절임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 조성물은 상기 에멀전을 포함하며, 감시림프절(sentinel lymph node; SNL) 탐색용임을 특징으로 한다. 또한 본 발명의 조성물은 림프계 흐름( lymphatic flow)을 감지하여 ‘기능적 림프계 지도(functional lymphatic map)’를 작성하는 데 유익하다.

감시림프절은 종양이 일차 암 조직으로부터 림프관을 따라 최초로 유입되는 림프절을 의미하며, 상기 감시림프절의 암 전이 유무에 따라 감시림프절 이후 말단의 림프절의 전이 유무를 판정할 수 있고 수술범위를 결정하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 본 발명의 조성물을 가지고, 수술 전 CT 림프관 조영 및 수술 중 NIR 광학 이미지 촬영의 dual imiging 방법으로 감시림프절을 찾아내었다. 일 실시예에서 연구자들은 감시림프절(sentinel lymph node;SLN)을, 어느 단계에서든 상응하는 조영전 이미지와 비교하여 30 초과의 Hounsfield unit 증가를 가지고, 결절성 또는 곡선형의 높은 감쇠 초점(high-attenuation foci)을 포함하는 림프절 구조로 정의하였고, 수술 전 CT를 통하여 조영 증강 패턴을 통해, 상기에 정의한 바와 같은 감시림프절을 탐지할 수 있었다. 또한 수술 중의 NIR 형광영상에서는. 수술전 CT lymphography에 의해 탐지된 조영증강 림프절 뿐만아니라, 이때 탐지되지 못했던 추가적인 감시림프절을 찾아내었다. 또한 이를 통해 ICG-loaded emulsion의 주입 부위와 draining LN 사이의 lymphatic connection을 가늠할 수 있어서, 얼마나 실제적으로 lymphatic flow 가 일어나는지(도 12 참조)를 반영하는 ‘functional lymphatic map’을 기록하는데 유익하였다.

또한 본 발명의 조성물은 1회 투여로 생체 염색(vital staining), 근적외선 형광 영상(NIR imaging) 및 컴퓨터 단층 촬영(computed tomography)이 동시에 가능한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조영제 조성물은 이에 제한되지는 않지만, 액체, 현탁액, 페이스트, 분말, 농축액, 적절한 농도로 혼합하기 위한 과립화 분말 또는 고체 형태를 포함한 여러 가지 형태를 가질 수 있다. 예컨대, 본 발명의 조영제 조성물은 주사제, 경피 투여용 제제, 삽관용 제제, 경구용 제제, 직장투여용 제제의 형태로 제조될 수 있으며, 바람직하게 주사제 일 수 있다.

본 발명의 상기 투여는 여러가지 투여 형태가 가능하며, 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나,내시경 점막하 주입, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게 상기 투여는 국소 부위의 내시경 점막하 주사(endoscopic submucosal injection)일 수 있다.

본 발명의 조영제 조성물이 의료 활동 이전 또는 도중에, 개체에게 투여되는 조영제(활성 성분)의 총량은 이에 제한되지 않으나 0.01ml 내지 100ml 범위일 수 있다. 바람직하게 0.1ml 내지 80ml 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1ml 내지 60ml일 수 있다. 상기 투여되는 조영제(활성성분)의 총량은 당해 분야의 기술자라면 개체(또는 환자)의 연령, 체적, 건강상태 등을 고려하여 적정하게 정할 수 있을 것이다.

본 발명의 조영제 조성물은 단일 용량으로 투여되거나, 다중 용량으로 분할하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 조영제가 5ml일 경우, 환자는 진단 절차에 들어가기 약 2시간 전에 2.5ml를 1.25ml씩 2회에 걸쳐 소비하고, 절차에 들어가기 약 1시간 전에 나머지 2.5ml를 1.25ml씩 2회에 걸쳐 소비할 수 있다. 또 다른 방법은 특정 절차에 필요한 총량이 소비될 때까지 매 5분마다 1ml씩을 환자가 소비하도록 하는 것이다. 상기 조영제의 투여 횟수 및 투여 용량은 당해 분야의 기술자라면 제반 사항들을 충분히 고려하여 정할 수 있을 것이다. 바람직하게 본 발명의 조성물은 1회 투여 일 수 있다.

상기 생체 염색(vital staining)은 살아있는 세포나 조직을 색소(dye)를 사용하여 염색하는 것으로, 본 발명의 조성물은 생체 염색을 위한 생염료(Vital dye)로서 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 인도시아닌 그린을 탑재한 에멀젼(ICG-loaded emulsion)을 비글에 투여 후에 수술을 하는데, 수술 중 (특히 열린 개복술 또는 복강경 보조 수술에서) 상기 에멀젼의 주입 부위(injection site), 상기 주입 부위와 연결된 림프절(LN) 및 이 둘을 연결하는 draining lymphatic vessel이 초록색으로 보이게 하여 식별 가능하였다.

본 발명의 조성물은 근적외선 형광 다이(near infra-red fluorescent dye)를 포함하고 있어, 근적외선 파장영역에서 형광 특성을 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 당해 분야의 기술자에게 공지된 근적외선 형광 영상(NIR imaing)방법으로 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 예를 들어 근적외선 광학영상 측정 장치(NIR optical imaging system)를 이용하여 영상을 촬영하고. 형광 분광계(Fluorescence Spectrophotometer; FluoroMate FS-2)를 이용하여 근적외선 형광 스펙트럼을 측정할 수 있다. 상기 근적외선 광학 영상장치는 사용 목적에 따라 서로 다른 형태로 주문 제작 할수 있으며, 바람직하게 본 발명의 광학영상 측정 장치는 2개의 light-emitting diode array 및 830±12 nm band-pass filter와 결부된 CDD camera로 구성되며, 상기 2개의 light-emitting diode array는 760±12 nm의 피크강도(peak intensity)를 나타내고, 760±12 nm band-pass filter를 통과하는 빛을 발산하는 것 일 수 있다.

본 발명의 조성물은 요오드계 오일 조영물질을 포함하고 있어 여러 종류의 조영 장치로 검출될 수 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 다중 검출기/다중 슬라이스 능력을 구비한 나선형 CT 스캐너, GE의 CT: LightSpeed 시리즈 및 HiSpeed , Philips의 CT: Mx8000 시리즈, Siemens의 CT:Somatom, Toshiba의 CT: Aquilion 및 Steion Multi 등 일 수 있으며 바람직하게 CT 스캐너일 수 있다.

상기 컴퓨터 단층 촬영(computed tomography; CT)은 전산화 단층 촬영이라고도 불리우며, 인체의 목적 부위를 여러 방향에서 조사하여 투과한 X-선을 검출기로 수집하고, 그 부위에 대한 X-선의 흡수차이를 컴퓨터가 수학적 기법을 이용하여 재구성하는 촬영기법을 말한다. 즉, 몸 주위로 카메라가 360° 회전하며 여러 다른 각도에서 찍은 수많은 2차원 X-선 사진을 컴퓨터 프로그래밍으로 재조합하여 3차원 영상으로 만드는 영상기법이다.

한편, 하운스필드 단위(Hounsfield Unit: HU)는 X-선의 감쇠(attenuation) 정도를 나타내는 단위로서, CT에서는 하운스필드수치를 사용한다. 이러한 하운스필드 수치는 조직의 상대적인 밀도를 나타낸다. 각각의 화소에 대해 공기= -1000, 물= 0, 및 고밀도 골(compact bone)= 1000으로 스케일 상의 값이 할당된다. 즉 HU 값이 크다는 것은 밀도가 커서 X-선의 흡수 정도가 크고 CT 상에서는 흰색으로 보인다는 의미가 된다. 본 발명에서, 조영제의 하운스필드 단위는, 포뮬레이션의 하운스필드 단위를 판정하기 위해, HDPE(high density polyethylene) 용기 내에 조영제를 넣고 상기 용기를 CT 스캐너에 용기를 넣어 측정할 수 있다. 상기 용기는 CT용 비-방사성 경구 조영제의 패키징용으로 의료 산업에서 사용되는 임의의 공지된 HDPE를 포함할 수 있다.

본 발명의 근적외선 형광 조영제 조성물은 하운스필드 단위(Hounsfield Unit)는 2000 이상인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 3000 이상임을 특징으로 한다

본 발명의 일 실시예에서는 ICG-loaded emulsion을 제조하였고, 제조된 ICG-loaded emulsion은 Hounsfield Unit 3,071로 강한 CT 대비 효과(contrast effect)를 나타냈다.

본 발명의 조성물은, 조성물의 생체 내 유효 시간이 24 내지 72시간인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 림프계의 연결이 일방향 흐름(uni-directional flow)인 쥐 모델을 이용하여 ICG-loaded emulsion이 체내에서 얼마나 오랫동안 유의적인 신호를 내면서 보유될 수 있는지, 그 washout profile을 관찰했다. 그 결과 CT lymphography에서 쥐 슬와 림프절(popliteal LN)은 점전적인 조영증강을 보여주었고, 8시간 후에는 정점에 도달하였다. 24시간 후에 부분적인 washout이 관찰되었으나, 여전히 상당한 양의 조영 증강이 남아있었고, 꾸준히 지속되는 washout 경향은 72시간에서 관찰되었다. 또한 NIR optical imaging에서 ICG signal의 진폭이 감소하였음에도 불구하고, LN들은 24시간 및 72시간 모두에서 핫스팟(hot spot)을 보여주었다. 이는 기존에 사용되었던 대부분의 수용성 리포터들 (대부분의 생염료 및 iodine CT 조영제)이 체내 투여 후 너무 빨리 washout되는 것에 비하여, 현저히 개선된 washout profile을 나타낸다.

상기 ‘검출’은 정량적 및 정성적인 결과 분석을 모두 포함한다.

본 발명의 근적외선 형광 조영제 조성물은 추가적으로 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 안정화제는 임의의 유체, 반-유체 또는 고체를 포함하는, 물질의 점도를 변경시키는 임의의 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명에서 적합하게 사용되는 안정화제로는, 제한되지는 않지만, 셀룰로오스, 젤라틴, 천연 하이드로콜로이드, 벤토나이트, 로커스트 빈 검 또는 영상 공정을 용이하게 하도록 물질의 점도를 적절히 변경 시키는 임의의 화합물이 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물 내 사용에 적합한 천연 하이드로콜로이드는, 제한되지는 않으나, 카라기난, 알긴산염, 한천, 아가로오스, 푸셀란(fucellan) 및 크산탄 검과 같은 천연 해초 추출물; 구아 검, 로커스트 빈 검, 타라검, 타마린드 검 및 프실리움(psillium) 검과 같은 천연 시드(seed) 검; 아카시아, 트라가칸트, 카라야 및 가티(ghatti) 검과 같은 천연 식물 삼출물; 저-메톡실 펙틴 및 고-메톡실 펙틴과 같은 천연 과일 추출물; 벤토나이트 및 비검과 같이, CT 및 MR 영상법의 성능을 향상시키도록 점도를 변경시키고 신호/노이즈 비를 낮추기 위한 천연 및 정제 클레이를 포함한다. 본발명의 조영제 조성물은 이에 한정되지 않지만 조성물 중 약 0.001 중량% 내지 약 70 중량%의 안정화제를 포함할 수 있고, 바람직하게 약 0.05 중량% 내지 약 25 중량%의 안정화제, 더욱 바람직하게약 0.1 중량% 내지 약 10 중량%의 안정화제를 포함할 수 있다.

본 발명의 근적외선 형광 조영제 조성물은 신체로부터 해부학상 부분 내로의 유체의 전달을 촉진시키고, 신체에 의한 해부학상 부분 내 유체의 재흡수를 적어도 실질적으로 억제하는 삼투제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 삼투제는 이에 제한되는 것은 아니지만 당계 (sugar based) 화합물을 포함한다.

상기 당계 화합물은 이에 제한되는 것은 아니지만, 수크로오스, 글루코오스, 프럭토오스(fructose),만니톨, 만노오스, 갈락토오스, 알도헥소오스(aldohexose), 알트로오스(altrose), 탈로오스(talose), 소르비톨,크실리톨, 락토오스, 비이온성 시드 폴리사카라이드, 하나의 갈락토오스 단위에 의해 각각의 만노오스에서 브랜칭으로 그루핑하는 직쇄 만난(mannan), 베타-D-man, 알파-D-gal, D-glcA, D-gal A, L-gul, 베타-D-man, 알파-D-gal(4:1), D-글루쿠론산, D-갈락투론산, 및 L-글루쿠론산을 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 폴리사카라이드를 포함한다. 본 발명의 조영제 조성물은 약 0.005 중량% 내지 약 20 중량%의 삼투제를 포함할 수 있고,바람직하게는 약 1 중량% 내지 약 5 중량%의 삼투제를 포함할 수 있다.

조합되어 사용될 경우, 안정화제 및 삼투제는 상승 작용하여 진단 영상과 같은 의료 진단 절차에서 사용을 위한 향상된 포뮬레이션을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 삼투제는 적합한 양의 유체의 관심 해부학상 부분 내로의 전달을 촉진시키고, 안정화제 및 삼투제는 충분한 양의 유체가 관심 해부학상 부분 내에 유지되도록 하는 것으로 여겨진다. 따라서, 해부학상 부분은 진단 영상을 위해 충분히 팽창 또는 확장되어, 상기 해부학상 부분이 영상화되면, 얻어진 진단 영상 상에서 충분히 윤곽이 그려진다.

본 발명의 ICG-loaded emulsion을 기반으로 한 lymphography는 보통의 정밀 진단(내시경 및 CT 포함) 및 조기위암(eary gastric cancer; EGC)의 치료에 있어서 감시림프절의 개념을 통합시키는데 제공될 수 있을 것이다; 또한 이것은 대부분의 EGC 수술과정에서 draining LN을 편리하게 확인하기 위한 기능으로서 잠재적 역할을 가지고 있다.

넓은 맥락에서, 본 발명의 조성물을 이용한 신규한 감시림프절 탐색 방법이 내시경적 점막 절제술이 가능한 조기 위암 환자에서도 그 역할이 있을 것으로 기대된다. 환자들은 내시경적 처치 과정동안 절제(resection)에 앞서 ICG-loaded emulsion을 점막하에 투여하여, 만약 내시경적 절제술(endoscopic resection)에 의해 회수된 표본에서 림프절 전이관련 고위험인자가 확인된다면(either by frozen or fast track permanent pathology), 차후의 CT lymphography 및 복강경/로봇 보조 수술에 의한 형광영상으로 감시림프절 탐색과 그 생검을 통해 최소침습수술이 가능할 것이다.

본 발명은

(c) 삼투제를 함유한 수용액을 첨가하여 혼합하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계의 조 에멀전을 균질화시키는 단계를 포함하는, 제1항의 에멀전을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서, 상기 용매는 이에 제한되지 않으나, 물, C1 내지 C5의 저급알코올, C3 내지 C10의 사이클로알칸계 유기용매, 카르복시산, 케톤계 용매, 유기시안화계 용매, DMSO(dimethyl sulfoxide) 및 이들의 혼합용매 일 수 있다. 보다 바람직하게는 휘발성을 가지며(비점이 낮고) 리피오돌같은 기름류 및 ICG 같은 수용성 물질을 둘 다 녹일 수 있는 용매이면 이에 제한되지 않으나, 에탄올, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 에탄올 일 수 있다.

상기 (b) 단계는, 상기 (a) 단계에서 제조된 혼합물 속에 존재하는 용매를 증발시키는 과정으로, 당업자에게 알려진 공지의 농축방법이 사용될 수 있으며 이에 제한되지 않으나 바람직하게 감압증류법 일 수 있다. 상기‘감압 증류(distillation under reduced pressure)’란 대기압보다 낮은 압력하에서 증류하는 것을 의미하며, 감압 증류 조건은 이에 한정되지 않으나 바람직하게 압력 0.1-100 mmHg범위 일 수 있으며, 온도는 25-37℃ 일수 있다.

상기 (c) 단계는 삼투제를 함유한 수용액을 첨가하여 혼합하는 단계로, 수중유적형 에멀전의 수(水)상을 제공하되 에멀젼 입자의 내외부 염농도 차이에 의해 에멀젼 입자로부터 내부 물질이 유출되는 것을 방지하기 위해 삼투제를 첨가하는 과정을 포함한다. 상기 삼투제는 이에 제한되는 것은 아니지만, NaCl과 같은 염일 수 있고, 당계 (sugar based) 화합물을 포함한다. 상기 당계 화합물은 이에 제한되는 것은 아니지만, 수크로오스, 글루코오스, 프럭토오스(fructose),만니톨, 만노오스, 갈락토오스, 알도헥소오스(aldohexose), 알트로오스(altrose), 탈로오스(talose), 소르비톨,크실리톨, 락토오스, 비이온성 시드 폴리사카라이드, 하나의 갈락토오스 단위에 의해 각각의 만노오스에서 브랜칭으로 그루핑하는 직쇄 만난(mannan), 베타-D-man, 알파-D-gal, D-glcA, D-gal A, L-gul, 베타-D-man, 알파-D-gal(4:1), D-글루쿠론산, D-갈락투론산, 및 L-글루쿠론산을 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 폴리사카라이드로 이루어진 군에서 선택 된 것일수 있으며, 바람직하게는 글루코오스(glucose)일 수 있다.

또한 상기 (C) 단계에서 첨가되는 삼투제의 농도는, 각각의 삼투제 화합물의 성질에 따라 당업자가 필요에 의해 농도 및 첨가량을 설정할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 일 실시예에서는 5%의 glucose 수용액을 0.7ml 사용하였다.

상기 (d) 단계에서는 상기 (c) 단계의 혼합물을 초음파처리(sonication)하여 조 에멀젼(crude emulsion)을 얻으며, 상기 초음파처리는 당해 분야의 공지된 초음파처리 방법으로 수행될 수 있다. 상기 초음파 처리시의 온도는 30 내지 40℃ 일 수 있고, 바람직하게 37℃일 수 있다. 또한 상기 초음파 처리 시간은 5 내지 60분 일 수 있으며, 바람직하게 10 내지 40분 일 수 있고, 더욱 바람직하게 30분 일 수 있다. 상기 (d) 단계는 필요에 따라 1회 내지 10회 수행될 수 있다.

상기 (e) 단계에서는 상기 (d) 단계에서 제조된 조 에멀젼을 균질기(homogenizer)로 균질화시키며, 상기 균질화 방법은 당해 분야의 공지된 균질화 방법으로 수행될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 균질화는 7000 내지 15000 rpm 에서 수행될 수 있고, 더욱 바람직하게는 11000rpm으로 수행 될수 있다. 또한 본 발명의 균질화 시간은 5분 내지 30분 일 수 있으며, 바람직하게는 10분 일 수 있다.

또한, 상기 방법은

(f) 상기 (d) 내지 (e) 단계를 반복하는 단계;

(g) 상기 조 에멀전을 투석(dialysis)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 (f) 단계에서 ‘반복’은 상기 (d) 내지 (e) 단계를 추가적으로 다수회 수행하는 것을 의미하며, 상기 다수회는 1 내지 10회 일 수 있고, 바람직하게 1내기 5회 일 수 있으며, 더욱 바람직하게 3회 일 수 있다. 상기 (f) 단계에서는 상기 (a) 내지 (e) 단계를 거쳐 만들어진 조성물(또는 에멀젼)의 구성입자 크기(size)를 감소시킬 수 있다.

상기 (g) 단계는, 상기 (a) 내지 (e) 단계 또는 (a) 내지 (f) 단계를 거쳐 제조된 조성물(또는 조 에멀젼)에서 에멀젼 입자의 쉘(shell) 속에 포함되지 못한 여분의 근적외선 형광염료를 제거하는 과정으로, 상기 (a) 내지 (e) 단계 또는 (a) 내지 (f) 단계를 거쳐 제조된 조성물(또는 에멀젼)을 투석(dialysis)하는 방법을 포함한다. 투석이란 반투막으로 콜로이드, 고분자용액을 싸고 이것을 순수 내지 다량의 용매에 담가두어 저분자나 이온으로 섞여 있는 불순물이 막 밖으로 확산하는 것을 이용하여 콜로이드, 고분자 용액을 정제하는 행위를 의미하며, 상기 투석은 당해 분야의 공지된 투석기법을 통해서 수행될 수 있다. 따라서 투석시 사용되는 용액의 종류, 용액의 pH , 투석 시간 및 투석 온도 등은 당업자의 필요에 따라 설정할 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 바람직하게 투석 용액은 glucose 수용액일수 있으며, 용액의 pH는 pH 6.9 내지 pH 7.9 일 수 있고, 투석 시 온도는 4℃ 내지 25℃ 일수 있고, 투석시간은 4 시간 내지 16 시간 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 조 ICR-loaded emulsion을 MW 10,000 cutoff인 투석막을 사용하고, 투석 용액으로 5% glucose을 이용하여 에멀전 입자 속에 포함되지 않은 자유 ICG (free ICG)를 제거하였다.

본 발명의 근적외선 형광 조영제 조성물(ICG-loaded emulsion)을 기반으로 한 혼성 림프관 조영법(hybrid lymphography)은, CT 및 NIR 형광영상 모두에서 실현가능하고 효과적이었다. 즉, 수술 전 CT lymphography를 통해 SLN mapping에 중점을 둔 해부학적 구조 파악이 가능했고, NIR 형광영상을 통해 SLN 과 intervening lymphatic vessel 모두의 고해상도 시각화(high resolution visualization)가 가능하였다. 수술 중의 NIR 형광영상은 SLN 탐지를 현저하게 개선하였다. 또한 ICG-loaded emulsion은 SLN에서 빠르지만 지속적인 축적을 보여주었고, 이것은 전체 실험동안(7시간 까지) 충분한 신호를 유지하였기 때문에 지속적인 위장 SLN 시각화(gastric SLNs visualization)를 가능하게 하였으며, 추가적인 절차를 필요로 하지 않고도 SLN mapping 및 navigation 을 하는 신뢰할 수 있는 수단을 제공하였다. 이러한 능력은 외과적 치료에 있어서 그 응용범위를 확대시키는데 효과적이다.

도 1은 본 발명의 ICG-loaded emulsion 제조 방법을 나타낸 개요도이다.
도 2는 ICG-loaded emulsion이 어두운 초록색임을 보여주며(왼쪽), ICG-loaded emulsion이 Hounsfield unit 3,071의 높은 CT 감쇠(CT attenuation)를 보임을 나타낸다(오른쪽).
도 3은 ICG-loaded emulsion이 stomach antrum posterosuperior wall의 점막하 조직(submucosa)에 내시경적으로 주입되는 모습을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 CT lymphography에서 점선의 네모로 표시된 부위의 조영 전(precontrast), ICG-loaded emulsion 주입 후 즉시, 투여후 60분 및 투여후 120분에서의 CT scan 확대 이미지를 나타낸다(가로로 5개의 이미지가 하나의 세트이다). 각 LN에서 측정된 Hounsfield unit은 괄호안에 삽입하였다.
도 5는 ICG-loaded emulsion 주입 후 즉시의 최대 강도 투영 재구성(projection reconstruction) 이미지를 나타내는 것으로, ICG-loaded emulaion이 점막하 조직에 마운팅(mounting)된 것을 보여주며(파란색 화살), station 3의 LN(노란색 화살표)과 intervening lymphatic channel(노란색 화살촉)을 모두 보여준다.
도 6은 station 3 LN으로 부터 획득된 표본의 CT 이미지(가장 왼쪽), NIR optical image(가운데), H&E staining 결과(가장 오른쪽)를 보여준다.
도 7의 A는 8마리 비글(beagle)의 CT lymphography에서 SLN 부위에서의 ICG-loaded emulsion 조영 증강 패턴을 나타낸다. 증강 정도는 ΔHU(ΔHU : 특정 시기에서의 측정값을 조영전 측정값으로 뺀것)로 나타낸다(가로축: 주입 후 시간, 세로축 : HU value).
도 8의 B는 상기 도7A의 모든 SLN에서의 평균 및 표준편차로서 조영 증강정도를 나타낸 것이다(가로축: 주입 후 시간, 세로축 : HU).
도8의 C는 상기 도7A의 SLN을 perigastric (station 1~6, red line) 및 para-gastric (station 7~14, blue line)부위로 분리하여 각각의 평균 및 표준편차로서 조영 증강정도를 나타낸 것이다(가로축: 주입 후 시간, 세로축 : HU).
도 9는 열린 개복술(open laparotomy)에 의한 외과적 탐사에서의 이미지를 나타낸다. ICG-loaded emulsion은 stomach upper body anterior wall에 주입되었다. (A) 주입후 120분에서의 CT image는 station 7의 SNL에서 조영 증강을 보여준다(화살표). (b)en bloc 위장 외식편(explanted stomach)의 그로스 이미지(Gross image),(c) en bloc 위장 외식편(explanted stomach)의 근적외선 광학 이미지(NIR optical image). 주입 부위의 복막쪽(노란색 화살표와 원), station 7 LN (하얀색 화살표) 및 intervening lymphatic vessels(화살촉, 해당 lymphatic vessel을 표시한 색깔과 다른 색깔)이 표시되어있다.
도 10은 복강경 수술(laparoscopic surgery)시의 감시림프절 탐색 결과를 보여준다. ICG-loaded emulsion은 stomach antrum anteroinferior wall에 주입하였다. (A)주입 후 120분에서의 CT image는 station 6의 2개 LN들의 조영 증강을 나타낸다(화살표).(B,C)복강경 카메라(laparoscope camera)를 통한 수술 부위의 확대이미지를 나타내며, ICG-loaded emulsion 주입 후 대략 4시간 후에서 이미지를 획득하였다. draining lymphatic vessel(화살촉으로 나타냄)들은 초록색으로 나타나며, 주입 부위(노란색 화살표)와 station 6에 위치한 2개 LN들(하얀 화살표) 사이를 가로지른다. (D)회수한 조직의 ex vivo NIR optical imaging은 2개 초점의 강력한 uptake를 확인하였고(화살표), 상기 (C)에서 보였던 2개의 녹색 LN들에 해당하는 부위임을 알았다.
도 11은 로봇 수술(Robotic surgery)에 의한 감시림프절 탐색 결과를 보여준다.(7번 비글을 사용함). 로봇은 near infrared-capable imaging system 장비를 갖추고 있다. ICG-loaded emulsion은 stomach antrum posterosuperior wall에 주입되었다. 동일한 비글에서의 수술전 CT lymphography image는 도 4 및 도 5에서 보여주고 있다. (A)주입 후 120분에서의 CT 확대 이미지(도 4와 같음),(B)수술 중 복강경 카메라영상,(C) NIR 형광영상을 나타내며, station 3 LN에 대한 것은 가장 윗줄에 노란색 화살표로 표시하고, station 6 LN에 대한 것은 중간 줄에 초록색 화살표로 나타내고, station 8 LN은 가장 아랫줄에 주황색 화살표로 나타낸다. (A)이미지의 괄호 속에는 LN의 측정된 Hounsfield unit을 기재하였다. Intervening lymphatic vessel(화살촉)들은 직접적으로 시각화 및 추적 가능하였다. 같은 색의 화살표 및 화살촉은 (A)내지(C)에서 서로 상응하는 lymphatic structure를 나타내다.
도 12는 draining lymphatic system의 기능적 지도(Functional map)를 나타낸 것이다. station 3 및 6의 LN들은 감시림프절로 생각되었는데, 이들이 주입 부위(injection site)와 직접적으로 연결되어 있기 때문이다. 동시에 station 8 및 11의 LN들은 둘째 tier LN이고 다른 하나의 station 8의 LN은 셋째tier LN인 것으로 보이는데, 주입 부위와의 lymphatic connection이 station 3 LN을 통해서 이루어지기 때문이다.
도 13은 쥐 슬와 LN(노란색 화살표)의 ICG-loaded emulsion hybrid lymphography를 나타낸 것이다. 조영전 및 0.3cc ICG-loaded emulsion을 발바닥에 단독투여 한 후 1, 2, 4, 8, 24, 72 시간에서 4마리 쥐의 대표 CT image를 나타낸다.
도 14는 6마리 쥐에서 각 슬와림프절의 Hounsfield unit을 정량적으로 측정한 것을 나타내며, 쥐 1 내지 3 은 24시간까지 쥐 4 내지 6은 72시간 까지 각각 측정하였다.
도 15는 쥐에서의 Gross image(왼쪽) 및 NIR optical image(오른쪽)를 나타낸다. 슬와 LN(popliteal LN)은 각각 주입 후 24시간(윗줄, 2번 쥐) 및 72시간(아랫줄, 4번 쥐)로 부터 획득하였다.
도 16은 본 발명의 에멀전 입자의 구조를 나타낸 것이다.
도 17은 4℃ 보관시에 계면활성제의 조성 및 ICG 탑재 여부에 따른, 각 emulsion의 평균입자경의 변화를 나타낸다(ICG-는 ICG를 넣지 않은 에멀전, ICG+는 ICG를 넣은 에멀전임).
도 18의 (A)는 Free ICG solution, ICG 탑재 T80:S85 에멀젼 및 ICG 탑재 T80:S85:SA 에멀젼 각각을, 4℃에서 빛을 차단시켜 보관한 경우에 ICG 안정성의 변화를 나타낸다.
도 18의 (B)는 Free ICG solution, ICG 탑재 T80:S85 에멀젼 및 ICG 탑재 T80:S85:SA 에멀젼 각각을, 상온(25℃)에서 차광없이 보관한 경우에 ICG 안정성의 변화를 나타낸다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

근적외선 형광다이를 함유하는 요오드화 오일 유제(ICG-loaded emulsion)의 제조 및 이를 이용한 혼성 림프관 조영법(hybrid lymphography)

<실험 준비>

1. 실험동물 및 수술 전의 준비

본 연구는 실험동물의 관리와 사용에 관한 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 연세대학교 Experimental Animal Ethical Committee로부터 승인받았다.

10.5 Kg 내지 13.5 Kg 사이의 몸무게를 가지는 18개월 된 8마리의 건강한 수컷 비글(beagle)이 본 연구에 사용되었다. 내시경 절차를 위한 공복(empty stomach)상태로 만들기 위해서, 비글들은 내시경 전의 밤부터 금식을 하였다. 전신마취는 zoletil 50 (5 mg/kg, Vibrac, France) 과 Rompun (0.2mg/kg, Bayer, Korea)를 정맥주사하여 유도되었고, 간헐적으로 마취제를 보충 투여하여 적정한 수준의 진정상태(sedation)가 유지될 수 있도록 하였다.

최종 CT scan 후에 동물은 수술실로 옮겨졌고, 5 Fr cuffed tube로 기관내 삽관(endotracheal intubation)이 수행되었다. 전신마취는 마취제의 정맥주사에서 enflurane (2.0% end-tidal concentration) 과 산소(oxygen)의 혼합물을 흡입하는 것으로 전환되었다.

비글과 동시에, 림프관조영(lymphography)이 쥐(rat)에서도 수행되었는데 이는 ICG-loaded emulsion이 LN(lymph node)에서 얼마나 오래 남아있는지 테스트하기 위해서이다. 430g 내지 550g 사이의 몸무게를 가지고 9주령인, 총 6마리의 암컷 Crj/Bgi-Sprague-Dawley rats (Charles River Laboratories Japan, Japan)이 사용되었다. 쥐들은 우드칩 베딩(woodchip bedding)된 플라스틱 케이지에 보관되었으며(케이지 당 2-3마리), 음식과 물의 자유식(ad libitum)을 허용하였다. 쥐들은 Zoletil (50 mg/kg, Vibrac, France)과 Rompun (10 mg/kg, Bayer, Korea)의 혼합물을 복강내주사하여 마취시켰다. 수술 후에, 모든 비글과 쥐들은 포화된 염화칼륨(saturated potassium chloride) 및 과잉 zoletil(over dose of zoletil)량으로 안락사시켰다.

2. ICG-loaded Emulsion의 준비

ICG-loaded Emulsion은 균질화 방법(homogenization method)으로 만들어졌다(도 1 참조). 간략하게, 계면활성제(Tween80 127mg, Span85 14mg), 5mg의 ICG(indocyanine green) 및 300ul의 lipiodol oil을 에탄올에 용해시켰다. 이렇게 만들어진 혼합물은 rotary vaporator(Buchi Rotavapor R200)를 이용하여 37℃ 감압하 에탄올을 증발시켰다. 0.7ml 의 5% D-glucose solution을 한방울씩 pre-emulsion concentrate에 첨가하면서 vortexing하였다. 혼합물은 37℃에서 30분동안 초음파처리(sonicate)되었고, crude ICG-loaded emulsion 이 얻어질 때까지 수행되었다. 상기 ICG-loaded emulsion을 ice bath에 넣고 homogenizer (IKA-Werke, Stufen, Germany)를 이용하여 11,000rpm으로 10분동안 균질화하였고, 상온에서 5분동안 방치했다. 이러한 과정은 emulsion의 size를 줄이기 위하여 3회 반복되었다. 최종적으로 free ICG를 제거하기 위하여 분자량 10,000 cutoff의 dialysis bag내에 넣은 ICR-loaded emulsion을 5% glucose액에서 투석(dialysis)하였다. 만들어진 ICG-loaded emulsion은 사용하기 전까지 4℃의 어두운 곳에서 보관되었다.

상기와 같은 방법에 의해 얻어진 ICG-loaded emulsion의 입자크기 평균 및 다분산지수(polydispersity index)는 fiber-optics particle analyzer (FPAR-1000, Otsuka Electronics, Japan)를 이용한 동적광산란법(dynamic light scattering method)으로 측정하였다. ICG-loaded emulsion의 입자크기 평균 및 다분산 지수는 각각 153 ± 20 nm과 0.194 ± 0.028 였는데, 이는 나노입자크기로 균일 분산되었음을 의미한다. 또한 electrophoretic light-scattering spectrophotometer (Delsa Nano Series, Beckman Coulter, USA)를 이용하여 측정된 상기 emulsion의 제타전위(zeta potential)는 높은 음의 값(-32.8 ± 2.0 mV)을 나타냈는데, 이로서 음이온의 ICG가 계면활성제 사이에 탑재되었음을 확인했다. 제타전위값(zeta potential value)은 에멀젼이 충분히 정전기적으로 안정(electrostatic stabilization)될 만큼 높았다.

ICG-loaded emulsion은 어두운 초록색(dark green)을 나타냈으며, 3000 Hounsfield unit 이상의 강한 CT 대비효과(CT contrast effect)를 발생시켰다(도 2 참조).

3. 혼성 조영제 ( hybrid contrast agent )의 내시경 점막하 주사 ( Endoscopic submucosal injection )

혼성 조영제의 내시경 위장 점막하 주사(Endoscopic gastric submucosal injection)는 경험이 풍부한 위장병학자에 의해 수행되었으며, 이는 Lim JS et al.2012 에서 이미 묘사된바 있다. 간단히 설명하면, 유연한 내시경이 위장에 삽입되었다. ICG-loaded emulsion을 점막 아랫부분에 마운팅(submucosal mount)하는 것은 endoscopic 3 point-injection (각 주사 당 0.3ml, 그러므로 대략 총 0.9ml)에 의해 이루어졌으며, 여러번의 주사가 제한된 크기의 EGC(early gastric cancer) 각각의 주변부(margins)에 전달되어지는 임상현장(submucosal mount)을 시뮬레이션하기 위하여 특정한 타겟 위치를 둘러싼 좁은 영역에서 이루어졌다(도 3 참조). 주입 위치에서 유출된 ICG-loaded emulsion을 세척하기 위하여, 식염수 세척을 수행하였다. lower body(n=4) 및 upper body(n=4)로 각각 다른 타겟 위치가 설정되었다(표 1 참조).

4. 수술전 CT scan 및 이미지 분석

모든 CT 이미지는 상품화된 64 channel multidetector CT (Discovery CT750 HD, GE healthcare, U.S.A.)으로 획득되었으며, 이것은 하기의 parameter를 사용한다; 120kV, 250mA, beam collimation = 0.625mm for both beagles and rats.

Axial image는 spacing없이 1.25mm의 단면두께로 재건되었다. 시야(Field of view)는 비글에서는 폐의 아랫부분(lower lung)과 복부 전체 및 골반까지, 쥐는 몸 전체가 포함될 수 있도록 조정되었다. Multiphase CT scan은 조영전(precontrast)과 ICG-loaded emulsion의 내시경 투여 후 즉시(대략 3~5분), 30분, 60분,90분 및 120분에 수행되었다. LN station의 정확한 위치 측정을 돕기위해, 마지막 CT scan은 정맥 내 조영제 주입(intravenous contrast injection)을 한 후에 수행되었다(데이터 미도시).

쥐의 경우, 0.3ml의 ICG-loaded emulsion을 오른쪽 발바닥에 피하주사하였다. 몸 전체의 CT 이미지는 조영전 및 주사 후 1, 2, 4, 8, 24, 72시간에 찍었다. 주사 후 24시간에서 CT scan은 모든 쥐(n=6)에서 수행되었으나, 그 후에 반을 희생시켜서 주입 후 72시간에서의 CT 이미지는 남은 반으로부터 얻었다(n=3).

모든 CT 이미지는 의료영상 저장전송시스템(picture archiving and communicating system workstation; PACS)(Centricity, GE Medical System, U.S.A.)으로 분석되었다. 이미지 분석은 방사선전문의에 의해 수행되었다. 림프노드에서의 신호향상(nodal enhancement) 정도를 정량적으로 측정하기위해, 관심있는 부위는 노드 주변의 지방 조직을 포함하는 것을 피하는 방식으로 각각의 림프 노드(lymph node; LN)에 위치되었고, 평균 Hounsfield unit은 PACS로 계산되었다. 우리는 SLN(sentinel lymph node;감시림프절)을, 어느 단계에서든 상응하는 조영전 이미지와 비교하여 30 초과의 Hounsfield unit 증가를 가지고, 결절성 또는 곡선형의 높은 감쇠 초점(high-attenuation foci)을 포함하는 LN 구조로 정의하였다. 비글에서 각 SNL의 위치는 Japanese Classification of Gastric Carcinoma의 LN station 분류를 채택하여 기록하였다(Japanese Gastric Cancer A. Japanese classification of gastric carcinoma: 3rd English edition. Gastric Cancer 2011;14:101-12.). 골반 LN(pelvic LN)들과 같이 위장(stomach)으로부터 멀리 위치한 LN들은 음성대조군(negative control)으로서 사용되었다.

쥐에서는, 오른쪽 슬와(popliteal) 부위의 LN들이 측정되었다. 관심있는 부위는 노드 주변의 지방은 피하면서 LN들을 포함하도록 조심스럽게 적출되었다. 평균 감쇠 값(Mean attenuation values)은 PACS에서 Hounsfield unit으로 계산되었다.

5. 수술

수술은 두명의 능숙한 외과의사(Y.M.K. and W.J.H.)가 수행하였다. 그들은 수술 절차를 시작하기 전에, CT 림프관 조영(CT lymphography) 결과를 사전에 알고 있었다. 열린 개복술(open laparotomy)에 3마리, 복강경 보조 수술(laparoscopy-assisted surgery)에 3마리, 로봇 보조 수술(Robot-assisted surgery)에 2마리를 사용하였다(표 1 참조). 열린 개복술의 경우, 검상돌기(xiphoid process)부터 배꼽(umbilicus) 아래까지의 긴 정중선을 절개하였으며, self-retractor를 사용하였다. 복강경 보조 수술은 10~12 cmH₂O에서 CO₂ 기복술(CO₂ pneumoperitoneum)을 행한 조건에서 수행되었으며, 4개의 surgical port가 복부에 삽입되었다. 로봇 보조 수술은 12 cmH₂O에서 CO₂ 기복술(CO₂pneumoperitoneum)을 행한 조건에서 da Vinci Si robotic surgical system (Intuitive Surgical, Inc., U.S.A.)을 사용하여 수행되었으며, 5개의 surgical port가 복부에 삽입되었다. 이 로봇(Robot unit)은 near-infrared-capable imaging system을 three-dimensional viewing console로 통합하는 장비를 갖추었다. 로봇 보조 수술 동안, 백색광(white light) 및 NIR fluorescence overlay visualization mode에서의 고화질 3D 이미지(High-definition 3D image)를 얻었다. 동영상은 viewing console을 통하여 기록되었다. 수술부위의 평가가 완료된 후에, 위장 전체, 지라(spleen), 장막(omentum), 이자(pancreas) 및 인접한 연조직(soft tissue)를 포함하여 일괄 절제(en-bloc resection)가 수행되었다.

수술을 준비하는 시간 및 수술 시간은 수술의 종류에 따라 다르다. 열린 개복술과 복강경 보조수술의 경우, 수술은 ICG-loaded emulsion이 위장에 주입되고 난 후 3-4시간 사이에 시작되었고, 수술 시간은 대락 1시간 정도였다. 로봇 보조 수술은 준비과정에 조금 더 시간을 필요로하였으며, ICG-loaded emulsion이 주입되고 난후 대락 5시간 정도에 수술이 시작되었다. 평균 수술시간은 약 2시간이었다.

6. Post - resection 표본 평가

일괄 수술 적출물(en-bloc surgical specimen)은 조심스럽게 검사되었고, 그로스 이미지(gross image)를 얻었다. 선택된 시야(fields of view)에서의 NIR 광학 이미지(NIR optical image)는 주문제작한 장비(Vieworks Corp., Korea)로 획득하였다. 이 장비는 2개의 light-emitting diode array 및 830±12 nm band-pass filter와 결부된 CDD camera로 구성되며, 상기 2개의 light-emitting diode array는 760±12 nm의 피크강도(peak intensity)를 나타내고, 760±12 nm band-pass filter를 통과하는 빛을 발산한다. 시야는 대략 7x5cm이지만, 렌즈와 표본(specimen) 테이블 사이 거리의 상호작용 조작(interactive manipulation)에 따라 다르다.

LN은 표본으로부터 발견되었으며, 회수된 LN의 station은 능숙한 외과의사에 의해 표시되었다. 표본의 CT 및 NIR optical image(eXplore Optix, Advanced Research Technologies GE Healthcare, Canada)를 획득하였다(도 6 참조). 끝으로 표본은 포르말린에 고정, 파라핀 포매(paraffin-embedded), 절편 제작(sectioned) , 헤마톡실린(hematoxylin)및 에오신(eosin) 염색하였다(도 6 참조). Histological assessment는 경험이 풍부한 병리학자(S.H.K.)에 의해 수행되었다.

<실험 결과>

1. CT 림프관 조영( CT lymphography )에 의한 수술전 SLN mapping

수술 전 CT lymphography에서 30 Hounsfield unit을 초과한 증강을 보이는 26개의 LN을 확인하였고, 이것은 SLN으로 생각되었다(도7 및 표1참조). 각각의 비글은 2 내지 6개의 SLN을 가지고 있었다(평균 3.25). 때때로(n=3) 주입 후 즉각적인 CT 이미지는 직접적으로 ICG-loaded emulsion이 lymphatic channel에서 이동하는 것을, 즉 인접한 LN으로 빠져나가는 것을 시각화했다(도4 및 도5 참조). 전반적으로 SLN은 꾸준하지만 점진적으로 향상되는 조영 증강 패턴을 보여주었다(도8의B). peri-gastric(station 1~6)위치와 para-gastric(station 7~12)위치에서의 SLN을 각각 분석하였을 때, 전체적인 조영증강 프로파일(enhancement profile)이 비슷하게 나타났으나, para-gastric SLN은 상대적으로 지연되고 약한 증강 정도의 경향을 보였다(도8의 C). peri-gastric LN 중에서 station 3이, 그 다음으로 station 6이 가장 빈번하게 SLN을 가지고 있었다. para-gastric LN에서, SLN은 station 8에서 가장 빈번하게 발견되었고, 그 다음으로는 station 7 및 11 이었다(표 1 참조).

[표 1]은 투여 부위, 수술 유형 및 CT lymphography를 통해 알아낸 SLN station을 정리하여 나타낸 것이다.(OL: open laparotomy, LAS: laparoscopy-assisted surgery, RAS: Robot-assisted surgery) CT lymphography를 통해 SLN을 알아내었는데, 어는 단계에서든지 조영전 이미지와 비교했을 때 30 Hounsfield unit 이상의 상승경향을 보여주는 LN을 SLN으로 여겼다. 같은 staion 에서 다수의 LN이 탐지된 경우, 림프절의 번호를 괄호안에 삽입하였다. 2개의 LN은 샘플링과정에서 회수에 실패하였고, 이것은 별표(*)로 표시하였다.

Number	Injection site	Surgery	Station of enhancing LNs (CT)
1	Upper body/ posterior wall	OL	1, 11
2	Upper body/ anterior wall	OL	7, 9
3	Upper body/ anterior wall	OL	7, 11
4	Antrum/ anteroinferior wall	LAS	6(2), 8, 9, 12, 14*
5	Lower body/ poteroinferior wall	LAS	3, 6, 8, 9, 11*
6	Antrum/ superior wall	LAS	3(2), 12
7	Antrum/ posterosuperior wall	RAS	3, 6, 8
8	Upper body/ anterior wall	RAS	3, 7, 8

station 3 및 station 6의 2개 LN와 본 발명의 에멀젼 투입 부위 사이의 직접적인 lymphatic vessel communication을 확인하였다(도 11의 B-C, ). station 3 및 station 6의 NL들은 frontline SLN으로 확인되었다. 그러나 station 8 및 station 11의 3개 LN은 두번째 또는 세번째 tier draining LN일 가능성이 큼을 시사하였다(도 11의 A-C,). staion 8에 위치한 2개의 LN 및 staion 11에 위치한 1개의 LN은 ICG 신호를 유지하였지만 이러한 3개의 LN은 본 발명의 에멀젼 투입 위치(injection site)와의 인식 가능한 연결 없이, 다른 station 3을 거치는 lymphatic connection을 수립하고 있었다. 이는 CT 능력이 향상되었음에도 불구하고 station 8 및 station 11은 SLN일지도 모르지만, 만약 생검(biopsy)을 수행한다면 SNL 이 아닌 LN으로 여겨져야한다. 종합하면 station 3 및 station 6의 LN들은 SLN 생검(SLN biopsy)에 있어 최고우선순위를 가져야 한다는 것을 알아내었다.

2. 위장 수술( gastric surgery )의 다양한 상황 모의시험

다양한 종류의 위장 수술 시뮬레이션을 시도하였고, 열린 개복술(open laparotomy)에 3마리, 복강경 보조 수술(laparoscopy-assisted surgery)에 3마리, 로봇 보조 수술(Robot-assisted surgery)에 2마리를 사용하였다.

2-1. 열린 개복술에 의한 외과적 탐사(Surgical exploration)

첫째로, 열린 개복술(n=3)을 수행하였으며 이 방법에서 외과의사는 녹색으로 염색된 LN들을 탐지하여 SLN을 찾으라고 요구받았다. 모든 경우에서 ICG-loaded emulsion의 주입 부위는 위장의 복막 표면(peritoneal surface)으로 부터 알아볼 수 있었다. 수술 전의 CT가 성공적으로 LN 조영 증강을 보여주었음에도 불구하고(도9의 A), 대부분의 경우 상응하는 위치에 있는 LN에서 초록색은 거의 감지할 수 없었다 (도9의 B). 함유된 ICG를 시각화하는 더 나은 방법을 성취하기위해서, 주문제작한 장비를 이용해 en bloc specimen의 ex vivo NIR optical imaging을 수행하였다. 이러한 접근은 소수의 선택된 경우에서, draining lymphatic vessels 및 LN들에 보유된 ICG를 보여주는데 유익하였다(도9의 C). 하지만 대부분의 경우, 이러한 접근에 의해서 en bloc specimen을 조사하는 것은 불가능하지는 않지만 매우 어려웠는데, 왜냐하면 타겟 구조가 장비의 제한된 시야에 들어맞기에는 보통 너무 컸기 때문이다. real-time imaging 능력 대신에, 정지 화상을 수득하는 성격(the nature of static image acquisition)은 실질적인 불화합성(practical incompatibility)의 다른 이유이다. 이러한 문제점을 조정하기 위하여, 우리는 en bloc specimen 대신에 LN 샘플의 NIR imaging(도6 참조)을 수행하였다(그 결과는 후속하여 논한다).

2-2. 복강경 보조 수술에 의한 외과적 탐사

다음으로 복강경 보조 수술(n=3)을 수행하였다. 수술 전 CT에서 조영 증강된 LN들을 적출한 부위가 면밀히 조사되었다. 확대된 시야(Magnified vision) 및 복강경의 뛰어난 조명은 초록색의 탐지를 보다 쉽게 만들었다. 우리는 초록색의 intervening lymphatic vessel들(도10의 B)을 확인 및 추적할 수 있었고, 이것은 주요 injection site 및 특징적으로 초록색인 SNL(도10의 C)과 연결되어있었다. 또한, LN 샘플들의 ex vivo NIR optical imaging은 상응하는 ICG의 강한 uptake(ICG hot uptake)를 보였다(도10의 D). 그러나, 복강경 카메라(laparoscopic camera)에서 초록색의 가시성(visibility)이 때때로 방해받았고, 특히 draining lymphatic structure가 perigastric fat tissues 속에 내포되어있을 때 방해받았다. 그 결과, 확장된 길이를 넘는 intervening lymphatic channel을 추적하는 것은 종종 불가능하였다. 수술 중 navigation의 수행을 향상시키기 위해서, 만약 수술 중의 환경과 양립가능하다면 real-time NIR optical imaging이 유용할 것이라 추정하였다.

2-3. 로봇 보조 수술에 의한 외과적 탐사

우리의 마지막 수술적 접근은 NIR optical imaging system을 설비한 로봇을 사용한 로봇 보조 수술이며(n=2),NIR optical imaging system은 three-dimensional viewing console로 통합될수 있다(Rossi EC, Ivanova A, Boggess JF. Robotically assisted fluorescence-guided lymph node mapping with ICG for gynecologic malignancies: a feasibility study. Gynecol Oncol 2012;124:78-82.). 이것은 신호의 명료성(signal conspicuity)과 조직 침투성(tissue penetration)을 향상시킴으로서, ICG의 고해상도(high resolution) real time imaging에 기초한 신뢰할 수 있는 수술 중 LN navigation을 가능하게 한다. 두 마리의 비글 모두에서, NIR optical imaging 은 수술 전 CT에 대한 상호보완적인 역할(complementary role)을 제공했다; CT lymphography는 SLN(또는 SLN basins)의 해부학적인 정보를 밝혀냈고, 외과의사는 수술 중에 어느 부위를 면밀히 조사해야하는지 사전에 알고있었다(도4 및 도5의 A). 두 마리 동물에서 수술중의 NIR optical imaging은 수술전 CT lymphography에 의해 탐지된 6개의 조영증강 LN 모두에서(도4 및 표1참조) ICG 신호를 확인하였다(도11의 B 및 C). 게다가 수술중의 NIR optical imaging은 2개의 추가적인 ICG 보유 LN을 찾았는데(staion 11 및 비글7에서의 또 하나의 station 8), 이것은 CT lymphography에서 유의적인 증강을 보여주지 못했던 부위이다. 흥미롭게도, intervening lymphatic vessel들의 거의 전체 길이가 직접적으로 시각화 및 추적 가능했으며, 따라서 ICG-loaded emulsion의 주입 부위와 draining LN 사이의 lymphatic connection을 가늠할 수 있었다(도 11). 이러한 과정은 SLN을 확인하는 것뿐만 아니라 얼마나 실제적으로 lymphatic flow 가 일어나는지(도 12)를 반영하는 ‘functional lymphatic map’을 기록하는데 유익하다. 겉으로 보기에 이러한 기능적 지도 작성(functional mapping)은 2군 이상의 LN들(beyond second tier LN)로부터 진짜 SLN(injection site와 직접적으로 연결되어있는 것)을 구별하는 것에 도움을 준다.

3. 수술전 CT lymphography 와 수술후 nodal NIR optical imaging 의 상관관계

일괄 위 절제술(en bloc gastrectomy)이 완료된 후에, 수술 적출물(surgical specimen)을 가시광선에서 검사하였다. 모든 감지 가능한 LN들은 능숙한 외과의사에 의해 각각의 station으로 부터 샘플링 되었으며, NIR optical imaging (도6 참조)이 수행되었다. 우리는 24개의 LN에서 ICG의 강력한 uptake(ICG hot uptake)를 감지할 수 있었으며, 24개의 LN들은 수술 전 CT lymphography (표 1)에서 26개의 조영 증강 LN을 가지는 station들로 부터 얻어졌다. 이는 92.3%(24/26)의 상관관계 비율을 나타낸다. 2개 LN의 미스매치(mismatch)는 해당 station으로 부터 LN이 회수되지 못한 sampling error의 결과로 보인다. 2개의 잃어버린 LN은 para-gastric region (5번 비글의 station 11 및 4번 비글의 station 14)에 위치한다.

로봇 보조 수술의 경우, ex vivo 림프노드 NIR optical imaging은 수술 중 Robotic optical imaging에서 ICG signal을 가지는 LN을 확인한 해당 station으로 부터 샘플링 된 LN에서 ICG의 강력한 uptake 위치를 확인하였다.

4. 쥐에서 ICG - loaded emulsion lymphography 의 지연된 enhancement profile

본 연구를 시작하게된 하나의 주된 동기는 대부분의 수용성 리포터들(대부분의 생염료 및 iodine CT 조영제)이 너무 빠른 washout되는것에 대한 불만이었다. 우리는 이것이 위장 SLN assessment 의 실현 및 일반적인 적용을 심각하게 해치는 결정적인 요인으로 생각하였다. 따라서, 우리의 주요 관심은 추적자(tracer)의 intra-lymphatic flow kinetics를 향상시키키는데 초점이 맞추어졌다. 이상적인 리포터(reporter)는 SLN을 향해 빠르고 예측가능한 수송이 보장되어야하며, 장시간 유지됨을 보여주어야한다. 흐름역학(flow kinetics)의 특성은 입자의 크기 및 안정성과 같은 몇몇 요인들에의해 결정된다(Wilhelm AJ, Mijnhout GS, Franssen EJ. Radiopharmaceuticals in sentinel lymph-node detection - an overview. Eur J Nucl Med 1999;26:S36-42.).

우리는 draining LN에서 얼마나 오래 보유된 ICG-loaded emulsion 이 지속되는지를 측정하였다. washout profile에 초점을 맞추었기 때문에, 우리는 일방향 흐름(uni-directional flow)을 가지는 LN model을 택하였다. 그리하여 비글 대신에 (비글은 multi-directional lymphatic connection을 가지는 것으로 추정되었다) 쥐 모델을 사용하였다. 우리는 0.3ml의 ICG-loaded emulsion을 쥐 발바닥(n=6)에 주입한 후에 여러 시간대에서의 CT image를 획득하였다. CT lymphography에서 쥐 슬와 NL(popliteal LN)은 점전적인 증강을 보여주었고, 8시간 후에는 정점에 도달하였다. 24시간 후에 부분적인 washout이 관찰되었으나, 여전히 상당한 양의 조영 증강이 남아있었다. 꾸준히 지속되는 washout 경향은 72시간에서 관찰되었다(도13 및 도14). 슬와 LN은 각각 24시간(n=3) 및 72시간(n=3)에서 해부되었다. 각각의 시간에서 슬와 LN은 두드러진 초록색을 나타냈다(도15의 왼쪽 그림). NIR optical imaging에서 ICG signal의 진폭이 감소하였음에도 불구하고, 해부된 LN은 24시간 및 72시간 모두에서 핫스팟(hot spot)을 보여주었다(도15의 오른쪽 그림).

흥미롭게도, 즉각적인 uptake와 빠른 washout을 보이는 ,혹은 꾸준한 축적 및 느린 washout을 보이는 iopamidol 또는 ethiodized oil을 기반으로 한 CT 림프관 조영술과 다르게, ICG-loaded emulsion은 draining lymphatic system에서 즉각적으로 uptake하지만 천천히 washout되었다. intra-lymphatic kinetic에 있어서, 이러한 독특한 특성은 최대한의 실행 가능성 및 실질적인 적응성이 있게 하는데, 왜냐하면 기존 CT 림프관 조영 방법과 비교하여 SLN mapping이 폭넓은 시간대에서 시도될수 있고, 상대적으로 덜 엄격한 프로토콜(protocol)이 적용된다.

< 실시예 2>

근적외선 형광다이를 함유하는 요오드화 오일 유제( ICG - loaded emulsion )의 안정성 평가

계면활성제의 조성 및 ICG 탑재 여부에 따른, 에멀젼의 안정성 변화를 평가하였다. 상기 에멀젼은 <실시예 1>의 실험준비 2.에 기재된 방식으로 제조되었다. Tween80:span85를 87:13의 몰비로 혼합한 에멀젼 (이하 T80:S85 에멀젼이라 칭함) 또는 Tween80:span85 혼합액에 steraylamine을 10 몰% 가한 에멀젼 (이하 T80:S85:SA 에멀젼이라 칭함)에 ICG를 탑재하였을 때 emulsions의 안정성을, 시간에 따른 각 emulsion들의 평균입자경 크기변화를 기준으로 평가하였다. 상기 에멀전들에 ICG 탑재시에는, ICG 5 mg/ml을 섞어서 에멀젼을 만들기 시작하였으며 제조 마지막 단계에서 투석하여 free ICG를 제거 후 측정한 ICG의 에멀젼 탑재 농도는 약 4.5 mg/ml였다.

T80:S85:SA 에멀젼을 추가로 제작한 이유는 SA이 양성하전을 띄는 계면활성제로써 음성 하전의 ICG와 정전기적인력으로 결합하여 lipiodol/ICG의 에멀젼의 안정성에 기여할 수 있을 것으로 기대하였기 때문이다. 평균입자경은 fiber optics particle analyzer (FPAR-1000)를 사용하여 광산란법으로 측정하였다.

그 결과 [도 17]에서 보는바와 같이, T80:S85 에멀젼의 경우 ICG의 탑재 여부와 관계없이 4℃에서 10주간 입자경의 변화가 없었다. T80:S85:SA 에멀젼의 경우 ICG를 탑재하지 않은 경우 10 주가 지난 후에 입자경 크기가 약 1.6배 증가하였으나 ICG 탑재에 의하여 평균입자경은 일정하게 유지되었다. 즉 이 경우 ICG의 탑재가 에멀젼을 안정화시킴을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

근적외선 형광다이를 함유하는 요오드화 오일 유제( ICG - loaded emulsion )에 포함된 ICG 염료의 안정성 평가

용액 상태에서 매우 불안정한 것으로 알려져 있는 ICG가 emulsion에의 탑재에 의해 안정성이 증대되는 지를 평가하기 위하여 ICG을 탑재한 emulsion 또는 free ICG 용액을 여러 가지 조건에서 방치하며 ICG의 화학적 안정성을 측정하였다. 상기 에멀전은 <실시예 2>에 기재된 방식으로 제조되었다. Free ICG solution , ICG 탑재 T80:S85 에멀젼 및 ICG 탑재 T80:S85:SA 에멀젼에 포함된 ICG농도를 100ug/ml로 일정하게 맞춘 후 (a) 4℃, 차광 및 (b) 25℃, 빛노출 조건에서 보관하면서 미리 지정한 날짜에 샘플소량을 취해 각 샘플을 에탄올로 희석 후 780nm 파장에서 Beckman Coulter DU-430 UV/visible spectrophotometer로 흡광도를 측정하였다.

그 결과 [도 18]에서 보는 바와 같이, 4℃에서 빛을 차단시켜 보관한 경우 Free ICG solution의 경우 ICG는 30일 후 처음 농도의 63% 만이 남아있었는데 비해 T80:S85 에멀젼, T80:S85:SA 에멀젼에 탑재한 ICG의 경우 각각 87%, 100% 남아있었다. 상온에서 빛에 노출된 상태에서 보관시에는 Free ICG solution 중 ICG의 불안정화는 더욱 촉진되어 7 일 후 ICG의 50%가 감소되었다. 한편 T80:S85 에멀젼에 탑재한 경우는 14일 까지도 ICG가 >50% 남아있었으며 T80:S85:SA 에멀젼에 탑재한 ICG의 경우는 30일까지도 약 64%가 유지되어 에멀젼에의 탑재, 특히 T80:S85:SA 에멀젼에의 탑재에 의해 ICG의 안정성이 현저히 개선되었다. 이는 ICG와의 정전기적 인력에 의해 에멀젼 밖으로의 ICG 방출이 억제되기 때문인 것으로 생각된다.

상기의 결과들을 통해 본 발명의 ICG-loaded emulsion은 ICG를 탑재함으로 인해, 에멀젼 자체의 안정성을 향상시킬 뿐만아니라 에멀전 내에 포함되는 ICG 염료 자체의 안정성도 높아짐을 확인하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 요오드계 조영물질을 포함하는 코어; 및 코어 외부의 쉘에 근적외선 형광 염료와 계면 활성제를 포함하는 수중 유적형 에멀전, 상기 에멀전을 포함하는 감시림프절 (Sentinel lymph node) 탐색용 근적외선 형광 조영제 조성물 및 상기 에멀전을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 근적외선 형광 조영제 조성물(ICG-loaded emulsion)을 기반으로 한 혼성 림프관 조영법(hybrid lymphography)은, CT 및 NIR imaging 모두에서 실현가능하고 효과적이었다. 또한 ICG-loaded emulsion은 기존의 수용성 리포터들과 비교하여 개선된 washout profile로 인해 SLN에서 빠르지만 지속적인 축적을 보여주고, 따라서 지속적인 위장 SLN 시각화(gastric SLNs visualization)를 가능하게 하였으며, 추가적인 절차를 필요로 하지 않고도 SLN mapping 및 navigation 을 하는 신뢰할 수 있는 수단을 제공하였다. 이러한 능력은 외과적 치료에 있어서 그 응용범위를 확대시키는데 효과적이므로 산업상 이용 가능성이 크다.

Claims

요오드계 오일(oil) 조영물질을 포함하는 코어; 및
코어 외부의 쉘에 양친성 근적외선 형광 염료와 계면활성제를 포함하는 수중 유적형 에멀전(emulsion).
제1항에 있어서, 상기 에멀전의 입자 크기가 100nm 내지 200nm인 것을 특징으로 하는 에멀전.
제1항에 있어서, 상기 요오드계 오일 조영물질은 리피오돌(lipiodol)인것을 특징으로 하는 에멀전.
제1항에 있어서, 상기 근적외선 형광염료는 Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 780, cy3.5, cy5, cy5.5, cy7, 인도시아닌 그린(ICG), Cypate, ITCC, NIR820, NIR2, IRDye78, IRDye80, IRDye82 , IRDye680, IRDye700, IRDye800, DiD, DiR, Cresy Violet, Nile Blue, Oxazine 750 및 Rhodamine800, Texas Red 및 이들의 혼합물 또는 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 에멀전.
제1항에 있어서, 상기 계면활성제가 폴리옥시에틸렌소르비탄 에스테르계, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌계, 소르비탄 에스테르계, 폴리옥시에틸렌알킬에테르계, 인지질계, 포비돈계 계면활성제 및 이들의 혼합용매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 에멀전.
제1항에 있어서, 상기 계면활성제가 트윈(Tween)류, 폴록사머(Poloxamer)류, 스판(Span)류, 플루론(Pluron)류, Brij류, DMPC(dimyristoryl phosphatidylcholine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)류, 콜린산, 콜리돈(Kollidon)류, 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)류, 알파-토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이트, 스테아릴아민(stearylamine), 디세틸 포스페이트(dicetylphosphate), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol, 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 에멀전.
제1항의 에멀전을 포함하는 감시림프절(Sentinel lymph node) 탐색용 근적외선 형광 조영제 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조성물은 1회 투여로 생체 염색(vital staining), 근적외선 이미징(NIR imaging) 및 컴퓨터 단층 촬영(computed tomography)이 동시에 가능한 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제7항에 있어서, 상기 조성물의 생체 내 유효 시간은 24 내지 72시간인 것을 특징으로 하는 조성물.
제8항에 있어서, 상기 투여는 내시경 점막하 주입(endoscopic submucosal injection)인 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 요오드계 오일 조영물질, 계면활성제 및 양친성 근적외선 형광 염료를 용매 중에서 혼합하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 혼합물을 감압증류하여 용매를 증발시키는 단계;
(c) 삼투제를 함유한 수용액을 첨가하여 혼합하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 혼합물을 초음파처리(sonication)하여 조 에멀젼(crude emulsion)을 얻는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 조 에멀전을 균질화시키는 단계를 포함하는, 제1항의 에멀전을 제조하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 방법은
(f) 상기 (d) 내지 (e) 단계를 반복하는 단계;
(g) 상기 조 에멀젼을 투석(dialysis)하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항의 에멀전을 제조하는 방법.