KR101561552B1 - 리그난 화합물을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
리그난 화합물을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 특정 화학 구조 (화학식 1)를 갖는 리그난 화합물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 리그난 화합물을 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 특정 화학 구조 (화학식 1)를 갖는 리그난 화합물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 리그난 화합물을 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
암은 현재 전세계적으로 가장 많은 사망자를 내는 질병 중 하나로서, 암 발생 연령은 점차 낮아지고 있는 반면 평균 수명은 점차 연장되어가고 있어 암 발생률은 더욱 증가할 것으로 전망되고 있다. 국립 암센터 (National Cancer Center)에서 제공하는 2013년 통계 자료에 따르면 (비특허문헌 1), 2010년 암 등록 통계과에 등록된 우리 나라 암 발생 환자는 모두 202,053 명이며, 2015년에는 약 27 만여 명에 달할 것으로 추정되고 있다.
한편, 리그난 (Lignan) 화합물은 n-페닐프로판 (n-Phenylpropane) 2 분자가 산화적으로 축합하여 생성된 물질을 총칭하는 것으로, β,γ-디벤질부탄 (β,γ-Dibenzylbutane) 구조를 기본 골격으로 갖는 물질을 말한다. 리그난은 자연계에서 곡류, 콩류, 채소류, 과일류, 종자류 등의 고등 식물에 고농도로 함유되어 있으며, 사람을 비롯한 동물의 체액 내에도 존재하는 것으로 알려져 있다.
상기 리그난 화합물의 효능에 대한 연구는 오랫동안 진행되어 왔으며, 이 중 최근 주목받고 있는 리그난 화합물의 효능으로는 항산화 활성, 항천식 효능, 항염증 효능 등을 들 수 있다 (특허문헌 1 및 비특허문헌 2). 그러나, 리그난 화합물의 항암 효능에 대하여는 아직 연구가 미비한 실정이며, 특히 특정 화학 구조를 갖는 리그난 화합물의 항암 효능에 대하여는 더더욱 알려진 바가 없다.
리그난 화합물은 β,γ-디벤질부탄을 기본 골격으로 하기는 하나, 치환이나 첨가 등에 따른 매우 다양한 구조를 갖는 화합물들이 존재하는 상당히 광범위한 개념에 해당하기 때문에 상기 리그난 화합물의 구체적인 구조에 따라 성질에 상당한 차이를 나타낼 수 밖에 없으며 따라서 구체적인 구조를 갖는 리그난 화합물의 성질에 대한 연구는 상당히 중요하다. 특히 리그난 화합물 중에는 포도필로톡신 (Podophyllotoxin)과 같이 치명적인 독성을 나타내는 종류의 것들도 포함되어 있어 이러한 연구의 중요성을 뒷받침한다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 리그난 화합물의 항암 효능에 대한 연구를 수행하였으며, 이에 특정 화학 구조, 후술하는 바와 같이 화학식 1의 구조를 갖는 리그난 화합물이 우수한 항암 효능을 나타낸다는 것을 발견하고, 이를 활용한 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 완성하기에 이르렀다.
국립 암센터, 통계로 본 암 현황 (Cancer Facts & Figures 2013), p 18, 2013
이상현 외, Archives of Pharmacal Research, 2004, 27(2), 106-110
Namba, T., Coloured Ilustration of Wakan-Yaku, Hoikusha Publishing, Osaka, 1980, Vol.Ⅱ, 127-129
Tang, W 및 G. Eisenbrand, Chinese Drugs of Plant Origin, Springer-Verlag, Berlin, 1992, 639-646
본 발명은 특정 화학 구조 (화학식 1)를 갖는 리그난 화합물을 이용하여 암 세포의 증식을 억제함으로써 암을 예방, 개선 또는 치료하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
본 발명에서 사용되는 "상기 화학식 1로 표시되는 화합물"은 리그난 화합물에 속하는 것으로, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, 이를 함유하는 것으로 본 발명의 기술 분야에서 공지되어 있는 식물로부터 극성 또는 비극성 용매를 사용하여 분리 정제할 수 있다. 또는 상업적으로 시판되는 화합물을 구입할 수도 있다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 농도는 상기 조성물이 암 예방 또는 치료의 효능을 충분히 나타내는 정도라면 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 상기 조성물의 부피를 기준으로, 1 μM 내지 100 μM일 수 있으며, 보다 바람직하게는 5 μM 내지 80 μM일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 μM 내지 70 μM일 수 있다. 상기 범위 내에서 세포의 성장 및/또는 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 이점이 있다. 참고로 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 농도 범위에서 사용된 M은 몰농도를 나타낸 것이며, 몰농도는 용액 1 리터 중에 녹아있는 용질의 몰 (mol) 수를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 표적 동물 (예컨대, 포유류)이 생리학적으로 수인 가능한 본 발명의 화합물의 모든 (예컨대, 산 또는 염기와 반응하여 얻은) 염을 의미한다. 본 발명 화합물의 염은 유기 또는 무기산 및 염기로부터 유도될 수 있다. 산의 예로서는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-황산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 그 자체로는 약학적으로 허용할 수 없지만 옥살산 등의 그 밖의 산 또한 본 발명의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 첨가염을 획득하기 위한 중간체로서 유용한 염의 제조시 사용될 수 있다. 염기의 예에는 알칼리 금속 (예컨대, 나트륨) 수산화물, 알칼리 토금속 (예컨대, 마그네슘) 수산화물, 및 암모니아를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 염의 예에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파레이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 플루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트, 운데카노에이트 및 이와 유사한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 그 밖의 염의 예에는 Na+, NH4 +, 및 NW4 + (여기서 W는 Cl 내지 C4의 알킬기이다), 및 이와 유사한 적절한 양이온과 화합하는 본 발명 화합물의 음이온이 포함된다. 치료용으로 사용되기 위하여, 본 발명 화합물의 염은 약학적으로 허용 가능하도록 고려되었다. 그러나 약학적으로 허용 불가능한 산 및 염기의 염도 예컨대, 약학적으로 허용 가능한 화합물의 제조 또는 정제에 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 디메틸피노레시놀 (Dimethylpinoresinol), 디메틸리로레시놀 (Dimethylliroresinol), 에피유데스민 (Epieudesmin), 에피마그놀린 (Epimagnolin), 디메톡시아스칸틴 (Demethoxyaschantin), 아스칸틴 (Aschantin) 및 파르게신 (Fargesin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 화합물들은 각각 단독으로도 우수한 항암 효능을 나타내며, 상기 화학식 1의 화합물과 함께 사용하지 않아도 항암 효능을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "디메틸피노레시놀", "디메틸리로레시놀", "에피유데스민", "에피마그놀린", "디메톡시아스칸틴", "아스칸틴" 및 "파르게신"은 리그난 화합물에 속하는 것으로, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어 상기 화합물들은, 이를 함유하고 있는 것으로 본 발명의 기술 분야에서 공지된 식물로부터 극성 또는 비극성 용매를 사용하여 분리 정제할 수 있다. 또는 상업적으로 시판되는 화합물을 구입할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 디메틸피노레시놀, 디메틸리로레시놀, 에피유데스민, 에피마그놀린, 디메톡시아스칸틴, 아스칸틴 및 파르게신의 구조의 일 예들을 하기 화학식 2 내지 8에 나타낸다.
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
본 발명에서 사용되는 용어 "암"은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 자살 (apoptosis)의 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 의미한다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴 (腫塊)를 형성할 수 있으며 체내의 정상적인 구조의 파괴나 변형을 유발할 수 있는데, 이러한 상태를 통칭하여 암이라고 한다.
일반적으로 종양 (tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 종양은 양성 종양 (benign tumor)과 악성 종양 (malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장 속도가 매우 빠르며 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암 (cancer)'이라 한다.
본 발명에서 암의 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 상기 암의 비제한적인 예로 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중프종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식 세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 상술한 종류의 암 이외의 암에 있어서도 효과적인 항암 효능을 나타내나, 특히 피부암, 폐암의 예방 또는 치료에 보다 효과적이다. 본 발명의 일 실시예에서 사용한 JB6 Cl41세포는 피부에서 상피 세포 성장 인자 (Epidermal Growth Factor; EGF)의 자극에 의해 정상 세포로부터 암세포로의 형질 전환 실험을 실시하는 대표적인 세포이며, A549세포는 사람의 폐암 세포주로 구성적 활성 (constitutive active) Ras의 돌연변이를 갖고 있는 세포이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방" 이란, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 암의 발병을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 암 발병 의심 개체에 투여하여 암의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 종양 세포의 세포 증식을 억제함으로써 암을 예방 또는 치료할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase)의 활성 부위에 ATP와 경쟁적으로 결합하여 ERK의 활성을 억제하고, 이에 의해 선택적으로 ERKs/RSKs신호 전달 경로를 억제하여 세포 주기 단계의 진행을 방해함으로써 세포 증식을 억제하는 것으로 확인되었다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.
본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및/또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다. 경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물을 정제 또는 캡슐 등과 같은 경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스 (Saccharose), 솔비톨 (Sorbitol), 만니톨 (Mannitol), 전분, 아밀로펙틴 (Amylopectin), 셀룰로오스 (Cellulose) 또는 젤라틴 (Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 (dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘 (magnesium stearate), 스테아르산 칼슘 (calcium stearate), 스테아릴 푸마르산 나트륨 (sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 (polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 포함할 수 있다. 나아가 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 상기 조성물을 비경구 투여하는 방법으로는, 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이들에 제한되지 아니한다.
상기 비경구 투여를 위한 제형으로는, 예를 들어 피하 주사, 정맥 주사 또는 근육 내 주사 등의 주사용 형태; 좌제 주입 방식; 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있으나 이에 제한되지 아니한다. 상기 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 (ampoule) 또는 바이알 (vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 상기 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 또는 투여량은, 상기 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로는 물론, 투여 대상이 되는 동물의 나이, 체중, 성별, 질병 증상의 정도, 섭취하는 음식, 배설 속도 등과 같은 요인들에 의해 다양해 질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
본 발명의 상기 조성물은 디메틸피노레시놀, 디메틸리로레시놀, 에피유데스민, 에피마그놀린, 디메톡시아스칸틴, 아스칸틴 및 파르게신으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 건강 기능 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 건강 기능 식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비제한적인 예로 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 상기 첨가되는 추가 성분의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 음료 또는 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 사용되거나 2 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가물의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 제공한다.
본 발명의 상기 조성물은 디메틸피노레시놀, 디메틸리로레시놀, 에피유데스민, 에피마그놀린, 디메톡시아스칸틴, 아스칸틴 및 파르게신으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료 또는 음용수에 혼합시키는 방식으로 사용하거나, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 사료 또는 음용수 제조시 직접 첨가하는 방식으로 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말 형태일 수 있다. 본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 건조된 분말 형태로 제조하기 위한 건조 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 건조 방법의 비제한적인 예로는, 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조, 동결 건조 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 가지 이상의 방법을 함께 이용하는 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 필요에 따라 기타 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 사용 가능한 첨가제의 비제한적인 예로는, 사료 또는 음용수의 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등; 사료 또는 음용수의 효용 증대를 위하여 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백질태질소화합물 (非蛋白質態窒素化合物), 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제 또는 올리고당 등이 있으며, 그 외에 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 함께 첨가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 사료 또는 음용수를 제공한다.
본 발명의 상기 조성물은 디메틸피노레시놀, 디메틸리로레시놀, 에피유데스민, 에피마그놀린, 디메톡시아스칸틴, 아스칸틴 및 파르게신으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
상기 사료 또는 음용수는, 사료 또는 음용수에 본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 첨가하여 제조하거나, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이를 포함하는 조성물을 직접 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 음용수의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 음용수를 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"란, 암이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 암이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물의 적합 한 1 일 총 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
특정 동물에 대한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물의 구체적인 약학적 유효량은, 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 해당 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 또는 식이는 물론, 상기 마그놀린을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간 등을 고려하여 결정될 수 있으며, 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며 목적하는 해당 부위에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 마그놀린 (Magnolin)을 함유하는 신이 (Magnoliae Flos) 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "마그놀린 (Magnolin)"은 신이 (Magnoliae Flos)에 함유된 성분의 하나로서, 신이로부터 추출되거나 분획될 수 있는 화합물에 해당한다.
본 발명에서 사용되는 마그놀린은 그 출처가 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 입수 가능한 신이로부터 추출하여 얻은 것이거나, 제조, 기타 다른 방법으로 획득한 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 사용한 마그놀린은 한국생명공학연구원 (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology; KRIBB)에서 공급받은 것으로 중국산 신이 (Magnoliae forgesii Cheng, M. biondii Pamp.)로부터 추출된 마그놀린을 사용하였다.
본 발명에서 사용되는 상기 마그놀린의 일 예로 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
[화학식 1]
본 발명에서 사용되는 용어 "신이"는 목련과 (Magnoliaceae)에 속하는 목련의 꽃봉오리를 건조한 것으로 매운 맛을 내며 거풍 (祛風), 통규 (通竅)의 효능이 있는 것으로 알려져 있어 예부터 한약재 등으로 사용되어 왔다. 본 발명에서 사용되는 상기 신이는 목련과에 속하는 목련의 꽃봉오리를 건조한 것이라면 특별한 제한없이 사용 가능하나, 바람직하게는 중국산 신이의 피지 않은 꽃봉오리 (화뢰)를 건조한 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "추출물"은 천연물로부터 분리된 활성 성분을 의미하는 것으로, 상기 추출물은 신이의 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액이나 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
본 발명에서 신이를 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있다.
본 발명에서 신이를 추출하는 데에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 알코올을 용매로 사용하는 경우에는 보다 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올 (메탄올, 에탄올, 부탄)을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "분획물"이란, 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 신이 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 신이를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 사용하였다. 상기 신이 분획물을 얻는 데에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 등의 극성 용매; 헥산 (Hexan), 에틸아세테이트 (Ethyl acetate), 클로로포름 (Chloroform), 디클로로메탄 (Dichloromethane) 등의 비극성 용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 용매 중 알코올을 사용하는 경우에는 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올을 사용할 수 있다.
본 발명의 목적 상, 신이 분획물을 얻는 데에 사용되는 용매로 보다 바람직하게는 클로로포름, 헥산, 에틸아세테이트를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 클로로포름을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 신이 추출물의 여러 분획물에 대하여 MTS 검색법 (MTS Assay)을 수행한 일 실시예에 따르면, 신이 추출물의 분획물 중, 특히 헥산 분획물, 클로로포름 분획물 및 에틸아세테이트 분획물이 세포의 성장을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다 (도 2(b) 내지 (f)). 또한 이들 분획물 중 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 경우, 세포에 약 50 ㎍/ml의 농도로 처리하는 경우에는 세포에 상기 분획물을 처리하기 전인 초기 0 시간 때 보다 MTS 값이 더 낮아지는 결과를 보였다 (도 2(b) 및 (d)). 이와 달리 클로로포름 분획물의 경우 0 시간 때 보다 MTS 값이 낮아지는 현상은 관찰되지 않았다 (도 (c)). 이러한 결과로부터 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 클로로포름 분획물은 모두 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 탁월한 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었으며, 나아가 일부 세포 사멸을 일으키기도 할 것으로 생각되었다. 다만 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 경우 비교적 고농도로 처리하는 경우에는 세포가 처음 0 시간일 때보다 상당히 감소되는 것에 비추어, 세포 자살 (apoptosis)에 의한 세포 사멸뿐 아니라 세포 괴사 (necrosis)에 의한 세포 사멸도 일어날 가능성이 있다고 판단되었다. 즉 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물 내에 세포 괴사를 유발할 수 있는 인자가 포함되어 있을 수 있으며 이러한 경우, 이들이 종양 세포 등 암 발병이나 병증 심화를 유발하는 세포에 선택적으로 세포 괴사가 발생하도록 조절할 수 있다면 암 예방 및/또는 치료에 매우 효과적일 것이나, 세포 괴사는 일반적으로 불특정 다수의 세포에 대하여 비특이적으로 발생하는 것으로 알려져 있기 때문에 상기 헥산 분획물이나 에틸아세테이트 분획물을 고농도로 암 치료에 사용할 경우에는 암 세포 성장 및/또는 증식 억제 이외에 기타 부작용을 유발할 염려가 있어 이에 관한 추가 연구가 진행되는 것이 바람직할 것이다.
따라서, 본 발명에서 사용되는 신이 추출물의 분획물은 전술한 바와 같이 그 사용된 분획 용매의 종류가 특별히 제한되지는 아니하나, 바람직하게는 헥산, 에틸아세테이트 또는 클로로포름을 용매로 사용한 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 클로로포름을 용매로 사용하여 분획한 분획물일 수 있다.
본 발명의 상기 마그놀린을 함유하는 신이 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 디메틸피노레시놀, 디메틸리로레시놀, 에피유데스민, 에피마그놀린, 디메톡시아스칸틴, 아스칸틴 및 파르게신으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 마그놀린을 함유하는 신이 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 조성물에 있어서, 상기 신이 추출물 또는 이의 분획물의 농도는 상기 조성물이 암 예방 또는 치료의 효능을 충분히 나타내는 정도라면 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 상기 조성물의 부피를 기준으로, 2 ㎍/ml 내지 250 ㎍/ml일 수 있으며, 보다 바람직하게는 5 ㎍/ml 내지 200 ㎍/ml 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml 일 수 있다. 상기 범위 내에서 세포의 성장 및/또는 증식을 효과적으로 억제할 수 있으며, 나아가 신이 추출물 또는 분획물 중 일부 성분이 세포 괴사를 유발하는 경우, 지나친 세포 괴사를 방지할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 마그놀린을 함유하는 신이 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 조성물은 디메틸피노레시놀, 디메틸리로레시놀, 에피유데스민, 에피마그놀린, 디메톡시아스칸틴, 아스칸틴 및 파르게신으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 작용을 하며, 이를 이용하여 암을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있다. 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 자연계에 존재하는 식물로부터 수득하여 사용하는 경우 천연물로부터 유래된 것이어서 항암 효능 이외에 체내에 심각한 자극을 가하게 된다거나 유해한 작용이 유발됨이 없이 보다 안전하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 항암 효능을 갖는 리그난 화합물 (화학식 1)의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 신이 추출물 및 신이 분획물의 세포 증식 억제 효과를 나타낸 것으로, (a)는 신이 추출물 (전분획물), (b)는 헥산 분획물, (c)는 클로로포름 분획물, (d)는 에틸아세테이트 분획물, (e)는 부탄올 분획물, (f)는 물 분획물의 세포 증식 억제 효과를 MTS 값으로 나타낸 것이다.
도 3(a) 내지 (f)는 신이 클로로포름 분획물을 보다 세분화하여 각 클로로포름 분획물의 세포 증식 억제 효과를 MTS 값으로 나타낸 것이다.
도 4는 클로로포름 분획물의 종류 및 농도에 따른 세포 자살 효과를 나타낸 것이다.
도 5(a) 내지 (f)는 클로로포름 분획물의 종류 및 농도에 따른 세포 자살 효과를 PI 및 아넥신 V 염색을 통하여 나타낸 것이다.
도 6은 신이 추출물 및 분획물 내의 성분 물질 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 신이 클로로포름 분획물 내의 성분 중, 세포 증식 억제 효과를 갖는 주요 성분 물질 8 가지를 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 8은 신이 추출물 및 분획물 내의 세포 증식 억제 효과를 갖는 주요 성분 물질 8 가지를 TOFMS 분석을 이용하여 분석한 것을 나타낸 것으로, (a)는 디메틸피노레시놀, (b)는 마그놀린, (c)는 디메틸리로레시놀, (d)는 에피유데스민, (e)는 에피마그놀린, (f)는 디메톡시아스칸틴, (g)는 아스칸틴, (h)는 파르게신을 나타낸 것이다.
도 9는 마그놀린의 세포 증식 억제 효과를 나타낸 것으로, (a)는 마그놀린 농도에 따른 세포 증식 억제 효과를, (b)는 마그놀린의 세포 독성 여부를 나타낸 것이다.
도 10은 세포 주기 단계 진행에 있어서 마그놀린의 효과를 나타낸 것으로, (a)는 마그놀린을 처리한 세포의 세포 주기 단계에 따른 분포율을, (b)는 마그놀린을 처리한 세포의 세포 주기 단계별 세포 수를 나타낸 것이다.
도 11은 EGF에 의해 유도되는 세포 주기 단계 진행에 있어서 마그놀린의 효과를 나타낸 것으로, (a)는 마그놀린을 처리한 세포의 세포 주기 단계에 따른 분포율을, (b)는 마그놀린을 처리한 세포의 세포 주기 단계별 세포 수를 나타낸 것이다.
도 12는 ERKs/RSKs 신호 전달 경로를 선택적으로 억제하는 마그놀린의 효과를 나타낸 것으로, (a), (b), (c), (d) 및 (f)는 웨스턴 블랏 결과를, (e)는 마그놀린 및 PD98059를 각각 독립적으로 처리한 JB6 Cl41 세포에서의 세포 증식이 억제되는 것을 MTS 값으로 나타낸 것이다.
도 13은 마그놀린이 ERK1 및 ERK2를 타겟으로 하는지 여부에 대하여 나타낸 것으로, (a)는 ERK1에 의해 매개되는 RSK2의 인산화 (Thr359/Ser363 및 Thr577 위치)가 마그놀린에 의해 억제되는 것을 나타낸 것이고, (b)는 마그놀린과 ERK1, ERK2의 컴퓨터 도킹 결과를 나타낸 것이며, (c)는 ERK1 활성에서 마그놀린의 IC50 값을, (d)는 ERK2 활성에서 마그놀린의 IC50 값을 나타낸 것이고, (e)는 마그놀린의 증가에 따라 ATP-아가로오스 비드에 결합하는 ERK2가 감소되는 것을 나타낸 것이다.
도 14는 마그놀린의 ATF1 및 AP-1의 전사 촉진 활성 억제 효과를 나타낸 것으로, (a)는 EGF에 의해 유도되는 Ser63 위치에서의 ATF1 인산화가 마그놀린에 의해 억제되는 것을 나타낸 것이고, (b)는 EGF에 의해 유도된 핵 인산-ATF1 단백질 수준이 마그놀린에 의해 낮아지는 것을 나타낸 것이다. (c)는 EGF에 의해 유도된 Ser63 및 Ser73 위치에서의 c-Jun 인산화 및 AP-1 전사 촉진 활성이 마그놀린에 의해 억제되는 것을 나타낸 것이고, (d)는 EGF에 의해 증가된던 핵 인산-c-Jun이 마그놀린에 의해 감소되는 것을 나타낸 것이다.
도 15는 EGF에 의해 유도되는 세포 형질 전환을 억제하는 마그놀린의 효과를 부착-비의존성 세포 형질 전환 분석을 통하여 나타낸 것이다.
도 16은 마그놀린이 정상 Ras를 갖는 H226 세포 및 RasG12V를 갖는 A549 세포의 형질 전환을 억제하는 것을 나타낸 것으로, (a)는 마그놀린 처리에 따른 정상 Ras를 갖는 H226 세포 및 RasG12V를 갖는 A549 세포의 증식 억제를, (b) 및 (c)는 마그놀린 처리에 따른 정상 Ras를 갖는 H226 세포 및 RasG12V를 갖는 A549 세포의 콜로니 수 및 사이즈를 ECLIPSE Ti 도립 현미경 및 NIS-Elements AR (V. 4.0) 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 이용하여 나타낸 것이다.
도 17은 RasG12V를 발현하는 NIH3T3 세포 및 거짓 인자 (mock)를 발현하는 NIH3T3 세포에 마그놀린을 처리한 경우의 세포 증식 억제 및 세포 형질 전환 억제 여부를 나타낸 것으로, (a)는 각 세포에서 Ras가 발현되는 지 여부를, (b)는 각 세포에 대한 마그놀린의 세포 증식 억제 효과를 나타낸 것이며, (c)는 마그놀린 처리에 따른 RasG12V를 발현하는 NIH3T3 세포 및 거짓 인자를 발현하는 NIH3T3 세포의 콜로니 수 및 사이즈를 ECLIPSE Ti 도립 현미경 및 NIS-Elements AR (V. 4.0) 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 이용하여 나타낸 것이다.
도 2는 신이 추출물 및 신이 분획물의 세포 증식 억제 효과를 나타낸 것으로, (a)는 신이 추출물 (전분획물), (b)는 헥산 분획물, (c)는 클로로포름 분획물, (d)는 에틸아세테이트 분획물, (e)는 부탄올 분획물, (f)는 물 분획물의 세포 증식 억제 효과를 MTS 값으로 나타낸 것이다.
도 3(a) 내지 (f)는 신이 클로로포름 분획물을 보다 세분화하여 각 클로로포름 분획물의 세포 증식 억제 효과를 MTS 값으로 나타낸 것이다.
도 4는 클로로포름 분획물의 종류 및 농도에 따른 세포 자살 효과를 나타낸 것이다.
도 5(a) 내지 (f)는 클로로포름 분획물의 종류 및 농도에 따른 세포 자살 효과를 PI 및 아넥신 V 염색을 통하여 나타낸 것이다.
도 6은 신이 추출물 및 분획물 내의 성분 물질 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 신이 클로로포름 분획물 내의 성분 중, 세포 증식 억제 효과를 갖는 주요 성분 물질 8 가지를 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 8은 신이 추출물 및 분획물 내의 세포 증식 억제 효과를 갖는 주요 성분 물질 8 가지를 TOFMS 분석을 이용하여 분석한 것을 나타낸 것으로, (a)는 디메틸피노레시놀, (b)는 마그놀린, (c)는 디메틸리로레시놀, (d)는 에피유데스민, (e)는 에피마그놀린, (f)는 디메톡시아스칸틴, (g)는 아스칸틴, (h)는 파르게신을 나타낸 것이다.
도 9는 마그놀린의 세포 증식 억제 효과를 나타낸 것으로, (a)는 마그놀린 농도에 따른 세포 증식 억제 효과를, (b)는 마그놀린의 세포 독성 여부를 나타낸 것이다.
도 10은 세포 주기 단계 진행에 있어서 마그놀린의 효과를 나타낸 것으로, (a)는 마그놀린을 처리한 세포의 세포 주기 단계에 따른 분포율을, (b)는 마그놀린을 처리한 세포의 세포 주기 단계별 세포 수를 나타낸 것이다.
도 11은 EGF에 의해 유도되는 세포 주기 단계 진행에 있어서 마그놀린의 효과를 나타낸 것으로, (a)는 마그놀린을 처리한 세포의 세포 주기 단계에 따른 분포율을, (b)는 마그놀린을 처리한 세포의 세포 주기 단계별 세포 수를 나타낸 것이다.
도 12는 ERKs/RSKs 신호 전달 경로를 선택적으로 억제하는 마그놀린의 효과를 나타낸 것으로, (a), (b), (c), (d) 및 (f)는 웨스턴 블랏 결과를, (e)는 마그놀린 및 PD98059를 각각 독립적으로 처리한 JB6 Cl41 세포에서의 세포 증식이 억제되는 것을 MTS 값으로 나타낸 것이다.
도 13은 마그놀린이 ERK1 및 ERK2를 타겟으로 하는지 여부에 대하여 나타낸 것으로, (a)는 ERK1에 의해 매개되는 RSK2의 인산화 (Thr359/Ser363 및 Thr577 위치)가 마그놀린에 의해 억제되는 것을 나타낸 것이고, (b)는 마그놀린과 ERK1, ERK2의 컴퓨터 도킹 결과를 나타낸 것이며, (c)는 ERK1 활성에서 마그놀린의 IC50 값을, (d)는 ERK2 활성에서 마그놀린의 IC50 값을 나타낸 것이고, (e)는 마그놀린의 증가에 따라 ATP-아가로오스 비드에 결합하는 ERK2가 감소되는 것을 나타낸 것이다.
도 14는 마그놀린의 ATF1 및 AP-1의 전사 촉진 활성 억제 효과를 나타낸 것으로, (a)는 EGF에 의해 유도되는 Ser63 위치에서의 ATF1 인산화가 마그놀린에 의해 억제되는 것을 나타낸 것이고, (b)는 EGF에 의해 유도된 핵 인산-ATF1 단백질 수준이 마그놀린에 의해 낮아지는 것을 나타낸 것이다. (c)는 EGF에 의해 유도된 Ser63 및 Ser73 위치에서의 c-Jun 인산화 및 AP-1 전사 촉진 활성이 마그놀린에 의해 억제되는 것을 나타낸 것이고, (d)는 EGF에 의해 증가된던 핵 인산-c-Jun이 마그놀린에 의해 감소되는 것을 나타낸 것이다.
도 15는 EGF에 의해 유도되는 세포 형질 전환을 억제하는 마그놀린의 효과를 부착-비의존성 세포 형질 전환 분석을 통하여 나타낸 것이다.
도 16은 마그놀린이 정상 Ras를 갖는 H226 세포 및 RasG12V를 갖는 A549 세포의 형질 전환을 억제하는 것을 나타낸 것으로, (a)는 마그놀린 처리에 따른 정상 Ras를 갖는 H226 세포 및 RasG12V를 갖는 A549 세포의 증식 억제를, (b) 및 (c)는 마그놀린 처리에 따른 정상 Ras를 갖는 H226 세포 및 RasG12V를 갖는 A549 세포의 콜로니 수 및 사이즈를 ECLIPSE Ti 도립 현미경 및 NIS-Elements AR (V. 4.0) 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 이용하여 나타낸 것이다.
도 17은 RasG12V를 발현하는 NIH3T3 세포 및 거짓 인자 (mock)를 발현하는 NIH3T3 세포에 마그놀린을 처리한 경우의 세포 증식 억제 및 세포 형질 전환 억제 여부를 나타낸 것으로, (a)는 각 세포에서 Ras가 발현되는 지 여부를, (b)는 각 세포에 대한 마그놀린의 세포 증식 억제 효과를 나타낸 것이며, (c)는 마그놀린 처리에 따른 RasG12V를 발현하는 NIH3T3 세포 및 거짓 인자를 발현하는 NIH3T3 세포의 콜로니 수 및 사이즈를 ECLIPSE Ti 도립 현미경 및 NIS-Elements AR (V. 4.0) 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 이용하여 나타낸 것이다.
이하, 제조예 및 실시예들을 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
제조예
1: 신이 추출물 (
전분획물
)의 제조
신이 (Magnoliae Flos) 추출물은 한국생명공학연구원의 식물추출물은행으로부터 입수한 중국산 신이 (Magnoliae forgesii Cheng, M. biondii Pamp.)를 사용하였으며 상기 추출물은 용매로 메탄올을 사용하여 추출한 신이 메탄올 추출물이다.
상기 추출물의 일반적인 추출 과정을 살펴보면, 입수한 신이를 분쇄하여 분말화한 후 이에 메탄올을 가하여 상온에서 추출한 다음, 이를 여과하여 감압 농축을 수행하는 과정을 거쳐 추출물을 수득할 수 있다.
상기 추출물의 농도에 따른 항암 효능을 살펴보기 위하여 상기 추출물을 디메틸설폭사이드 (Dimethyl sulfoxide; DMSO, Sigma-Aldrich Co.LLC.)에 0.4 ㎍/ml, 2 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 50 ㎍/ml 및 250 ㎍/ml의 1,000 배 고농도가 되도록 용해하고, 상기 각 시료를 -20℃에 보관하였다. 본 제조예에서 추출물을 DMSO에 상기 제시한 농도의 1,000 배 고농도로 용해시키는 이유는 후술하는 실시예에서 상기 추출물이 용해된 DMSO를 1,000 배 희석하여 사용함으로써, 상기 제시한 농도의 신이 추출물을 세포에 제공하되 이와 함께 세포에 제공되는 DMSO의 농도는 0.1 % 또는 그 이하로 낮춤으로써 세포 성장, 증식에 대한 DMSO의 영향을 최소화하기 위한 것이다.
상기 추출물은 후술하는 분획 과정을 거치지 않은 추출물이라는 의미에서 "전분획물 (Total fraction)"이라 할 수 있으며, 따라서 이하, "신이 추출물"과 "전분획물"은 동일한 의미로 사용되는 것으로 이해한다.
제조예
2: 신이
분획물의
제조
상기 제조예 1 에서 얻어진 신이 메탄올 추출물 1.0 g에 증류수 50 ㎖를 가하여 현탁시켰다. 그 다음, 동량의 n-헥산 (n-Hexan)을 가하여 혼합한 후 n-헥산 가용성 분획부와 물 가용성 분획부를 분리하였고, 이를 3회 반복하여 실시한 다음, 이를 여과하고 감압 농축하여 헥산 분획물을 수득하였다. 그 다음, 상기 헥산 분획물을 제거하고 남은 물층에 클로로포름 (Chloroform)을 동량 가하고 상기와 동일한 방법으로 클로로포름 분획물을 수득하였다. 그 다음, 상기 클로로포름 분획물을 제거하고 남은 물층에 에틸아세테이트를 동량 가하고 상기와 동일한 방법으로 에틸아세테이트 분획물을 수득하였다. 그 다음, 상기 에틸아세테이트 분획물을 제거하고 남은 물층에 부탄올을 동량 가하여 역시 상기와 동일한 방법으로 부탄올 분획물을 수득하였으며, 그 다음 상기 부탄올 분획물을 제거하고 남은 물층을 농축하여 물 분획물을 수득하였다.
상기 수득한 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물을 각각 DMSO에 0.4 mg/ml, 2 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml 및 250 mg/ml의 1,000 배 고농도가 되도록 용해하고, 상기 각 시료들을 -20 ℃에 보관하였다.
실시예
1: 신이 추출물의 세포 증식 억제 효과 검증
(1) 세포의 배양
JB6 Cl41 마우스 피부 상피 세포를, 5% 소 태아 혈청 (Fetal bovine serum; FBS)이 포함된 최소 필수 배양 배지 (minimun essential medium; MEM)에서 37 ℃의 온도 조건으로 5 % CO2 세포 배양기에서 배양하였다. 상기 세포는 80 % 내지 90 % confluent 상태에서 계대 배양하였으며, 매 2일 내지 3일 마다 배지를 교환하였다.
(2) 신이 추출물의 세포 증식 억제 효과의 검증
상기 배양된 JB6 Cl41 세포 1 X 103개를 96-well에 분주하여 24 시간 동안 안정화시킨 다음, 이에 3-(4,5-디메틸티아졸 (dimethylthiazol)-2-일 (yl))-5-(3-카르복시메톡시페닐(carboxymethoxyphenyl))-2-(4-설포페닐(sulfophenyl))-2H-테트라졸륨 (tetrazolium) (MTS)-based CellTiter 96®의 수성 용액을 상기 각 well에 20 μl씩 첨가한 후, 5% CO2 세포 배양기에서 37 ℃의 온도 조건으로 1 시간 동안 추가로 배양한 다음, 492 nm에서의 흡광도를 측정하여 0 시간대에서의 세포의 성장을 측정하였다.
상기 0 시간대 흡광도 측정과 동시에, 상기 제조예 1에 따른 신이 추출물 (전분획물) 시료를 최종 농도가 각각 0.4 ㎍/ml, 2 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 50 ㎍/ml 및 250 ㎍/ml이 되도록 세포에 처리하고 (상술한 바와 같이, 신이 추출물이 포함된 DMSO 시료를 1,000 배 희석하여 사용), 이를 24 시간 간격으로 흡광도를 측정하면서 96 시간 동안 배양하였다. 상기 추출물 시료가 포함된 배지의 교환은 매 24 시간 마다 실시하였다.
본 실시예에서는 분획물 시료에 의한 흡광도의 변화를 보다 정확하게 확인하고 보정하기 위하여 세포 수 변화 이외의 원인에 의한 흡광도 변화를 배제하고자, 세포가 없는 well에 상기 세포에 처리한 동일한 배지를 첨가하고 상기 세포 배양과 동일한 조건 및 시간 동안 배양한 후의 흡광도를 측정하고 이를 상기 에서 측정한 흡광도 결과에서 제외함으로써 순수한 세포 수의 변화에 따른 흡광도를 획득하였다. 또한, 세포 배양에 있어서 세포에 각 분획물 시료를 처리한 것에 대한 대조군으로 세포에 DMSO를 처리하여 세포 배양을 수행하였다.
상기 실험 결과, 신이 추출물의 세포 증식 억제 효과는 신이 추출물의 농도에 의존적이라는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 신이 추출물의 농도가 0.4 ㎍/ml인 경우에는 세포의 증식을 거의 억제하지 못하였으나, 농도가 2 ㎍/ml인 경우 세포 증식 억제가 미세하게 나타남이 관찰되었고, 농도가 10 ㎍/ml에 이르렀을 때는 상당한 세포 증식 억제 효능을 보였으며, 농도가 50 ㎍/ml 이상이 되면서 세포의 증식이 거의 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (도 2(a)).
상기 신이 추출물의 세포 증식 억제 효능 실험에 비추어, 상기 제조예 2에 따라 제조된 각 분획물 시료들의 세포에 처리하는 최고 농도를 50 ㎍/ml로 설정하고 다음의 실시예를 수행하였다.
실시예
2: 신이
분획물의
세포 증식 억제 효과 검증
상기 실시예 1에 있어서, 배양된 세포에 신이 추출물을 처리하는 대신, 상기 제조예 2에 따라 제조한 각 분획물 시료 (헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물)를 배양된 세포에 최종 농도가 각각 0.4 ㎍/ml, 2 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 및 50 ㎍/ml가 되도록 처리하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1에서와 동일한 방법에 의하여 실험을 수행하였다.
상기 실험 결과, 각 신이 분획물의 세포 증식 억제 효과는 상기 신이 추출물의 경우와 마찬가지로 신이 분획물의 농도에 의존적이라는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 각 분획물 시료 모두 2 ㎍/ml의 농도로 처리한 경우 미세한 세포 증식 억제 효과를 나타내었으며, 10 ㎍/ml의 농도로 처리한 경우 눈에 띄는 정도의 세포 증식 억제를 나타내었다. 그리고 50 ㎍/ml의 농도로 처리한 경우 현저한 세포 증식 억제 효과를 나타내었는데, 특히 헥산 분획물, 클로로포름 분획물 및 에틸아세테이트 분획물에서 우수한 것으로 관찰되었다 (도 2(b) 내지 (f)).
이들 분획물 중 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 경우, 이들을 50 ㎍/ml의 농도로 처리한 때에는 상기 이들 분획물 처리 전인 0 시간대에서 측정된 MTS 값보다 상당히 낮은 MTS 값을 나타내는 현상을 보였다 (도 2(b) 및 (d)). 이는 상기 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물에 세포 괴사 (necrosis)를 유발하는 인자가 포함되어 있을 수 있음을 시사하며, 이러한 경우 불특정 다수의 세포에 대하여 비특이적으로 세포 괴사가 유발될 수 있으므로 상기 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물을 암 치료에 활용하기 위하여는 보다 주의를 요할 것으로 생각된다.
상기 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 경우에서와 달리, 클로로포름 분획물의 경우 50 ㎍/ml로 처리한 경우에도 MTS 값이 현저히 감소하기는 하나 0 시간대에 측정된 MTS 값보다 낮아지는 현상이 관찰되지 않아 세포 괴사는 유발하지 않으면서도 세포 증식을 매우 효과적으로 억제한다는 것을 확인할 수 있었다 (도 2(c)).
한편, 신이 추출물과 각 신이 분획물을 처리한 경우를 비교하면, 특히 10 ㎍/ml로 처리한 경우에 각 분획물의 경우보다 신이 추출물 (전분획물)을 처리한 경우에 세포 증식 억제 효과가 더 우수하게 나타나는 것이 관찰되었는데, 이는 전분획물에서는 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물에 의한 세포 증식 억제 효과가 합쳐짐에 의해 시너지 효과가 일어난 것으로 생각된다.
하기 표 1은 상기 실시예 1 및 2에서 사용된 분획물의 종류 및 처리 농도를 정리하여 나타낸 것이다.
| 분획물 | 처리 농도 (㎍/ml) |
| 전분획물 | 0.4, 2, 10, 50, 250 |
| 헥산 분획물 | 0.4, 2, 10, 50 |
| 클로로포름 분획물 | 0.4, 2, 10, 50 |
| 에틸아세테이트 분획물 | 0.4, 2, 10, 50 |
| 부탄올 분획물 | 0.4, 2, 10, 50 |
| 물 분획물 | 0.4, 2, 10, 50 |
실시예
3: 신이 클로로포름
분획물의
세포 성장 억제 효과 검증
상기 실시예 2의 결과에 비추어, 암 예방 또는 치료에 활용하기에 특히 우수할 것으로 판단되는 클로로포름 분획물의 세포 성장 억제 효과를 보다 면밀히 관찰하기 위하여, 상기 제조예 2에서 제조된 클로로포름 분획물을 다시 6 가지로 세분화 (클로로포름 #1 내지 #6)하여 실험을 수행하였다.
세분화된 클로로포름 분획물들의 세포 성장 억제 효과를 검증하기 위하여 상기 실시예 2에 있어서, 배양된 세포에 처리하는 시료로 클로로포름 #1 내지 #6 분획물을 처리하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법에 의하여 실험을 수행하였다.
상기 실험 결과, 상기 클로로포름 분획물들 중 특히 클로로포름 #2 내지 #6 분획물이 세포 증식 억제에 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었으며, 이들 중 클로로포름 5# 및 #6 분획물이 특히 우수한 것으로 확인되었다 (도 3(b) 내지 (f)). 다만, 상기 클로로포름 5# 분획물의 경우, 이를 50 ㎍/ml으로 세포에 처리하였을 때, 약 48 시간 경과 이후의 MTS 값이 0 시간대의 MTS 값보다 낮아지는 현상을 보여 (도 3(e)), 이것이 세포 자살 (apoptosis)에 의한 것인지 아니면 세포 괴사 (necrosis)에 의한 것인지를 확인하는 후속 실험을 수행하였다,
실시예
4: 신이 클로로포름
분획물의
세포 자살 효과 검증
상기 실시예 3에서 세포 증식 억제 효과가 가장 높게 나타난 클로로포름 #5 및 #6 분획물의 작용에 있어서 세포 괴사가 일어나는 지 아니면 세포 자살이 일어나는 지를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
직경 60 mm 세포 배양 접시에 1 X 105의 JB6 Cl41 세포를 접종하고 24 시간 동안 배양하여 안정화하였다. 상기 세포에 상기 실시예 3의 각 클로로포름 5# 분획물 및 #6 분획물을 10 ㎍/ml, 50 ㎍/ml의 농도로 처리한 다음, 24 시간 후의 세포의 세포 자살 여부를 형광 이용 세포 분류 (Fluorescence Activated Cell Sorting; FACS) 유동 세포 계수법 (Flow cytometry) (BD FACSCalibur™ 유동 세포 계수 장치, Franklin Lakes, NJ, USA)을 이용하여 분석하였다. 세포 자살 여부를 분석하기 위하여 상기 세포에 처리되었던 클로로포름 분획물 및 세포 배지를 함께 회수하고, 배양 접시에 붙어 있는 세포는 트립신 처리법 (trypsinization) 으로 떼어내어 합쳤다. 그 다음, 원심 분리하여 세포를 획득하고 인산 완충 식염수 (Phosphate Buffered Saline; PBS)로 부유시킨 후, 프로피디움 요오드화물 (Propidium iodide; PI) (20 ㎍/ml) 및 아넥신 V (Annexin V)(Trevigen, Gaithersburg, MD, USA, 100배 희석하여 사용)를 처리하여 얼음 속에서 15 분 동안 반응시켰다. 그 다음, PBS를 이용하여 3회의 세척 과정을 반복 수행한 후, 유동 세포 계수법을 이용하여 세포 자살이 일어난 세포 집단의 %를 확인하였다.
상기 실험 결과, 클로로포름 #5 분획물의 경우 10 ㎍/ml에서 DMSO 대조군과 비교하여 아넥신 V의 양이 증가하였지만 결정적인 세포 자살을 결정할 수 있을 정도의 세포 자살은 관찰하지 못하였다 (도 4, 5(a) 및 5(b)). 그러나 클로로포름 #5 분획물의 농도가 50 ㎍/ml인 경우에서는 아넥신 V의 염색 및 PI 염색이 세포막의 바깥쪽 부분에 포스파티딜세린 (phosphatidylserine)의 증가와 PI의 염색의 농도가 동시에 증가함에 따라 이는 세포 자살로 판명되었으며, 아넥신 V의 증가에 따른 초기 세포 자살 (early apoptosis)과 PI 염색 증가에 따른 후기 세포 자살 (late apoptosis)의 합이 클로로포름 #5 분획물을 처리한지 24 시간만에 전체 세포군의 약 100 %에 도달될 정도의 탁월한 세포 자살 능력을 보유하고 있음이 확인 되었다 (도 4 및 5(c)).
한편, 클로로포름 #6 분획물에서는 농도를 50 μg/ml로 하여 처리하였을 경우 상기 실시예 3에서 관찰한 바와 같이, 세포의 증식을 매우 탁월하게 억제하는 작용을 한다는 것을 확인할 수 있었으며 (도 3(f)), 클로로포름 #6 분획물 처리 후 24 시간대에서 보이는 아넥신 V의 염색 정도가 아넥신 V의 농도에 따라 서서히 움직이고 있는 현상을 발견하였다 (도 5(d) 내지 (f)). 상기 결과는 클로로포름 #6 분획물은 세포 자살을 급격히 일으키는 것이 아니라 세포의 증식을 줄이는 것으로 판단된다.
실시예
5: 신이 추출물 및 이의
분획물
내의 성분 분석
상기 실시예 1 내지 4의 결과를 바탕으로, 신이 추출물 및 분획물 내에 함유되어 있는 물질들 중 세포의 증식을 억제하고 세포 자살을 유도하는 물질을 분리하고 구조를 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
분쇄한 신이 3 ㎏에 메탄올 9 L를 가하여 3일간 침지한 후 추출하고 다시 메탄올 5 L로 2회 더 추출하였으며, 모두 감압 농축하여 총 추출물 225 g을 얻었다. 상기 추출물을 증류수 2 L에 현탁한 후 n-헥산을 1 L씩 3회 반복 추출하여 핵산 분획 40 g을 얻었고, 남은 수용액 층은 같은 방법으로 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 (n-buthanol)을 각각 순차적으로 가하여 클로로포름 분획 109 g을 얻었다. 클로로포름 분획 100 g을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (silica gel column chromatography) (Kieselgel 60; No 9385, Merck)로 n-헥산-아세톤 혼합 용매를 극성을 올리면서 용출하여 분획 19개를 얻었다.
8번째 분획을 역상 칼럼 크로마토그래피 (YMCgel ODS-4 60A; 70-230 메쉬 (mesh), YMC, 용리 (elution); 메탄올:H2O = 7:3)로 활성 혼합물을 분리한 후 HPLC (칼럼; Capcell PAK C18; Φ20×250 mm, Shiseido, 용리; 메탄올:아세토니트릴:H2O = 3:2:5)로 디메톡시아스칸틴 (Demethoxyaschantin) 400 mg, 아스칸틴 (Aschantin) 260 mg, 파르게신 (Fargesin) 59 mg을 각각 분리하였다.
또한, 11 번째 분획에서는 역상 칼럼 크로마토그래피 (YMCgel ODS-4 60A; 70-230 메쉬, YMC, 용리; 메탄올:H2O = 3:2)로 얻은 활성 혼합물을 HPLC (칼럼; Capcell PAK C18; Φ20×250 mm, Shiseido, 용리; 메탄올:아세토니트:H2O = 6:7:12)로 디메틸피노레시놀 (Dimethylpinoresinol) 200 mg, 마그놀린(magnolin) 720 mg, 디메틸리로레시놀 (Dimethylliroresinol) 110 mg, 에피마그놀린 (Epimagnolin) 20 mg, 에피유데스민 (Epieudesmin) 100 mg을 각각 분리하였다.
상기에서 각각 분리한 화합물은 NMR 과 LC-MS를 사용하여 그 구조를 분석하였으며, 이미 보고된 구조 분석 결과를 참조하여 구조를 동정하였다.
상기 실시예 1 내지 4의 결과를 바탕으로 성분을 분석한 결과, 도 6에서 직사각형 박스 모양으로 표시된 약 6 내지 8 범위의 화합물이 세포 증식을 억제하는 효과를 나타내는 성분일 것으로 판단되었다. 상기 분석된 결과 및 TOFMS (Time-of-flight mass spectrometry) 분석 결과를 종합하여, 신이 추출물 및 분획물 내에 세포 증식을 억제하는 물질들로 예상되는 성분 8 가지를 분석하였다 (도 7 및 도 8). 상기 성분들은 마그놀린, 디메틸피노레시놀, 디메틸리로레시놀, 에피유데스민, 에피마그놀린, 디메톡시아스칸틴, 아스칸틴 및 파르게신인 것으로 확인되었다.
상기 분리된 성분들 중, 마그놀린이 가장 많은 양으로 수득되었으며, 이에 마그놀린이 세포 증식 억제 및 세포 자살을 유도하는 가장 주요한 성분일 것으로 판단하여 마그놀린의 항암 효능에 대해 보다 구체적인 실험을 수행해보고자, 마그놀린 (액체 크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography; HPLC) 순도 99.9% 이상)을 DMSO에 15 μM, 30 μM, 60 μM 및 100 μM의 1,000 배 고농도가 되도록 용해하고, 상기 각 시료들을 -20 ℃에 보관하였다.
실시예
6:
마그놀린의
세포 증식 억제 효과 검증
JB6 Cl41 마우스 피부 상피 세포를 10 %의 FBS가 포함된 DMEM 배지 (Dulbeco's Modified Eagle's Medium)에 37 ℃의 온도 조건으로 5 % CO2 세포 배양기에서 배양하였다. 상기 세포를 80 % 내지 90 % confluent 상태에서 계대 배양 하였으며, 매 2일 내지 3일 마다 배지를 교환하였다.
상기 배양된 JB6 Cl41 세포 1 X 103개를 100 ㎕의 5% FBS-MEM이 담긴 96-well에 분주하고 37 ℃의 온도 조건으로 5 % CO2 세포 배양기에서 2 시간 동안 배양하였다. 그 다음, MTS-based CellTiter 96®의 수성 용액을 상기 각 well에 20 μl씩 첨가한 후, 5 % CO2 세포 배양기에서 37 ℃의 온도 조건으로 1 시간 동안 추가로 배양한 다음, 10 % 도데실 황산 나트륨 (sodium dodeceyl sulfate; SDS) 용액 25 ㎕를 각 well에 첨가하여 상기 반응을 정지시키고, 492 nm에서의 흡광도를 측정하여 0 시간대에서의 세포의 성장을 측정하였다
상기 0 시간대 흡광도 측정과 동시에 상기 실시예 5에서 제조한 마그놀린 시료를 최종 농도가 각각 15 μM, 30 μM 및 60 μM이 되도록 세포에 처리하고 이를 24 시간 간격으로 흡광도를 측정하며 96 시간 동안 배양하였다. 상기 실험에서 DMSO만을 처리한 세포를 대조구로 설정하였다.
상기 실험 결과, DMSO만을 처리한 대조구와 비교할 때, 30 μM 농도의 마그놀린을 처리한 경우 세포 증식이 약 40 % 억제되었으며, 처리한 마그놀린의 농도가 60 μM인 경우에는 세포 증식이 약 70 % 억제되었다 (도 9(a)).
한편, 추가적으로 마그놀린의 세포 독성을 시험해보기 위하여, 배양한 세포 2 X 104를 100 μl의 5 % FBS-MEM이 담긴 96-well에 분주하고 밤새 배양한 다음, 상기 실시예 5에서 제조한 마그놀린 시료를 최종 농도가 각각 15 μM, 30 μM, 60 μM 및 100 μM이 되도록 세포에 처리하였다. 그 다음 이를 24 시간 간격으로 흡광도를 측정하며 48 시간 동안 배양하였다. 상기 실험에서 DMSO만을 처리한 세포를 대조구로 설정하였다.
상기 마그놀린의 세포 독성 관찰 결과, 마그놀린을 100 μM 이상으로 처리한 경우에도 세포 독성은 나타나지 않아 이를 개체에 사용하여도 유해한 작용을 하지 않을 것으로 판단되었다 (도 9(b)).
실시예
7:
마그놀린의
세포 주기 단계 진행 억제 효과 검증
상기 실시예 6의 결과에 비추어, 마그놀린의 세포 증식 억제 작용은 세포 주기 단계의 진행을 억제함으로써 달성되는 것이라는 가설을 세우고 이를 증명하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
배양된 JB6 Cl41 세포 (2 x 105)를 직경이 60 mm인 배양 접시에 분주하고 이를 37 ℃의 온도 조건으로 5 % CO2 배양기에서 밤새 동안 배양하였다. 일반적인 세포 배양 조건하에서 상기 세포의 세포 주기를 관찰하기 위하여 JB6 Cl41 세포를 완전한 세포 배양 배지에서 배양하였으며, 마그놀린을 최종 농도가 각각 30 μM 및 60 μM가 되도록 처리하고 12 시간 동안 배양하였다. 12 시간 후, 상기 세포에 트립신을 처리하여 고정한 다음, 4 ℃에서 15 분 동안 PI (20 ㎍/ml)를 처리하고 유동 세포 계수 장치 (BD FACSCalibur™ Flow cytometer, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 세포 주기 분포를 분석하였다.
상기 실험 결과, 마그놀린을 30 μM 농도로 처리한 경우 약 55 %가 G1/G0 단계에 분포하였으며, 마그놀린을 60 μM 농도로 처리한 경우에는 약 60 %가 G1/G0 단계에 분포하는 것으로 관찰되었다. 이는 DMS를 처리한 대조구의 경우 (약 42 %가 G1/G0 단계에 분포) 에 비해 상당히 증가된 분포를 보인 것이었다. 이와 달리, G2/M 단계의 경우에는 마그놀린을 처리한 경우 대조구에 비하여 매우 미미한 정도의 증가만이 관찰되었다 (도 10(a), (b)).
한편, 상피 세포 성장 인자 (Epidermal Growth Factor; EGF)는 세포 주기 단계의 진행을 유도하는 인자이며 종양 프로모터의 하나로, 일반적인 경우 S 단계를 유도하고 G1/G0 단계를 억제하는 것으로 알려져 있다. 이러한 EGF에 의해 유도되는 세포 주기 단계 진행에 있어서의 마그놀린의 작용을 관찰하기 위하여 하기와 같은 실험을 추가로 수행하였다.
배양된 세포 JB6 Cl41 (2 x 105)를 직경이 60 mm인 배양 접시에 분주하고 이를 37 ℃의 온도 조건으로 5 % CO2 배양기에서 밤새 동안 배양하였다. 그 다음 최종 농도가 각각 15 μM, 30 μM 및 60 μM가 되도록 마그놀린을 30분 동안 미리 처리한 다음, 상기 마그놀린의 존재 하에 EGF (1 ng/ml)로 12 시간 동안 자극하였다.
상기 실험 결과, 마그놀린을 처리하는 경우 세포 주기 단계에 있어서의 EGF의 작용이 상당한 방해를 받는 다는 것을 확인할 수 있었다. 특히 마그놀린을 60 μM 농도 이상으로 처리하는 경우에는 세포 주기에 대한 EGF의 효력이 거의 완전히 억제됨을 확인할 수 있었다 (도 11(a) 및 (b)). 상기의 결과에 비추어, 마그놀린이 세포 주기에서 G1/S 단계의 진행을 억제함으로써 EGF와 같은 종양 프로모터에 의해 유도되는 세포의 증식을 억제한다는 결론을 얻을 수 있었다.
실시예
8:
마그놀린의
선택적인
ERKs
/
RSKs
신호 전달 경로 억제 효과 검증 -
웨스턴
블랏
(
Western
blot
)
상기 실시예 7에서 마그놀린이 세포 증식을 억제하며 구체적으로 EGF에 의해 유도되는 G1/S 세포 주기 단계의 진행을 억제한다는 것이 확인되었음에 비추어, 마그놀린이 ERKs/RSKs신호 전달 경로를 억제할 것이라는 가설을 세우고 하기와 같이 웨스턴 블랏을 이용한 실험을 수행하였다. 상기에서 RSK (Ribosomal S6 Kinase)는 리보솜 키나아제의 하나로, 인산화를 통하여 ERK가 마이토겐 (mitogen)-유도 활성 신호를 매개하는 데에 수단으로 작용한다.
JB6 Cl41 세포 (1 X 106)를 직경 100 mm 세포 배양 접시에 분주하고 밤새 배양하였다. 그 다음 상기 세포를 0.1 % FBS-MEM에서 24 시간 동안 방치하고 각각 마그놀린을 15 μM, 30 μM 및 60 μM의 농도로 30 분 동안 미리 처리한 다음, 30 분 후 EGF와 함께 마그놀린을 처리하였다.
상기 배양된 JB6 Cl41 세포에서 단백질을 추출하고, 상기 단백질이 포함된 시료를 8 % 내지 10 % SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)으로 분석하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride; PVDF) 막에 옮겼다. 상기 막을 5 % 탈지유를 함유하는 블록킹 버퍼 (blocking buffer)에 배양한 다음, 인산 (phosphor)-MEK (MAPK (mitogen-activated protein kinase)/ERK 키나아제), 전체 (total)-MEK, 인산-ERK, 전체-ERK, 인산-RSK, 전체-RSK, 인산-Akt, 전체-Akt, 인산- p38 키나아제, 전체- p38 키나아제, 인산-JNK (c-Jun N-terminal kinase) 및 전체 -JNK에 대한 특이적 항체 (상기 항체는 모두 Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA로부터 입수)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 여기서 β-액틴 (β-actin)(Santa Cruz, CA, USA)을 대조구로 사용하였으며, 웨스턴 블랏은 케미독 (Chemidoc) XRS 이미저 시스템 (imager system) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 이용하여 개선된 화학 발광 검출 시스템 (chemiluminescence detection system) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 시각화하였다.
상기 실험 결과, 마그놀린은 RSKs의 Thr359/Ser363 위치에서의 인산화를 방해하는 양상을 보였으나 (도 12(a) 및 (f)), MEK, Akt, p38 키나아제 및 JNKs의 인산화에는 관여하지 않는 것으로 관찰되었다 (도 12(a) 내지 (c)).
이러한 RSKs의 Thr359/Ser363 위치에서의 인산화를 방해하는 마그놀린의 작용이 MEKs/ERKs 신호 전달에 선택적인 것인지 아닌지를 확인하기 위하여 MEK1/2 인히비터 (inhibitor)인 PD98059를 처리하였을 때의 ERKs 및 RSKs의 인산화와 비교하는 실험을 하였는데, PD98059는 Thr202/Tyr204 위치에서의 ERK1/2 인산화를 방해하는 반면, 마그놀린은 상기 인산화를 방해하지 않는 것으로 확인되었고, Thr359/Ser363 위치에서의 RSKs 인산화는 각각 마그놀린과 PD98059에 의해 모두 억제된다는 것이 확인되었다 (도 92 (d)). 도 12(e)는 각각 마그놀린과 PD98059를 독립적으로 처리한 JB6 Cl41 세포에서의 세포 증식이 억제되는 것을 나타낸 것이다. 상기의 결과에 따라, 마그놀린은 선택적으로 ERKs의 활성을 억제하는 것으로 판단되었다.
실시예
9:
마그놀린이
ERK1
및
ERK2
를
타겟으로
하는지 여부 검증 - 시험관 내
키나아제
분석 및 컴퓨터 도킹 (
computational
docking
)
상기 실시예 8에서 마그놀린이 ERK (ERK1 및 ERK2)의 활성을 억제한다는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 보다 상세히 관찰하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
328 아미노산 내지 740 아미노산을 포함하는 절단된 RSK2 단백질 (His-RSK-328-740)을 Ni-NTA 아가로오스 비드 (Qiagen Korea Ltd., Seoul Korea)를 이용하여 정제하고 (도 13(a) 왼쪽), 활성 ERK 및 His-RSK2-328-740 단백질을 이용해 시험관 내 키나아제 분석을 수행하였다. 구체적으로, 시험관 내 키아나제 분석은 상기 정제된 시료 20 ㎕에 활성 ERK1 또는 ERK2 (20 ng), RSK2 (100 ng), 및 100 μM의 저온 ATP를 처리하고, 마그놀린을 각각 3.75 μM, 7.5 μM, 15 μM, 30 μM 및 60 μM의 농도로 처리하였다. 그 다음, 키나아제 반응을 30 ℃에서 30 분 동안 수행하고, 6X SDS-샘플 버퍼를 첨가하고 가열하여 반응을 정지시켰다. 상기 반응이 정지된 후, 웨스턴 블랏을 이용하여 시각화하였다.
상기 실험 결과, ERK1에 의해 매개되는 Thr359/Ser363 및 Thr577 위치에서의 RSK2의 인산화가 마그놀린에 의해 약 90 % 정도 억제됨을 확인할 수 있었다 (도 13(a) 오른쪽). 상기 결과는 상기 실시예 8에서의 결과와 함께 마그놀린이 ERK1 및 ERK2의 활성을 억제한다는 것을 보여주는 것이다.
상기 실험 후, 마그놀린과 ERK1 및 ERK2의 컴퓨터 도킹을 수행하였다. 표준 정밀도 (standard precision; SP) 모드에 의한 마그놀린 및 ERKK1 또는 ERK2의 플렉서블 도킹을 위하여, 단백질 데이터 뱅크 (Protein Data Bank; PDB) (htt://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)로부터 ERK1(2ZOQ) 및 ERK2(1WZY)의 결정 구조를 얻었다.
상기 컴퓨터 도킹 결과, 마그놀린이 ERK1의 Lys168 위치 (도 13(b) 왼쪽) 및 ERK2의 Met108 및 Lys54 위치 (도 13(b) 오른쪽) 각각에 수소 결합을 형성함을 알 수 있었다. 또한, ERK1 또는 ERK2의 활성 부위에서 마그놀린은 완전히 다른 분자 구조 및 결합각을 갖는 다는 것이 확인되었다. ERK1 및 ERK2의 활성 부위에서의 마그놀린의 도킹 스코어는 각각 -0.7 및 -6.68이었다. 또한, ERK1 또는 ERK2 활성에서 마그놀린의 IC50을 측정하기 위하여 시험관 내 키나아제 분석을 수행하였으며, ERK1 활성에서 마그놀린의 IC50 값은 약 87 nM이었고 (도 13(c)), ERK2 활성에서는 16.5 nM이었다 (도 13(d)).
그 다음, 마그놀린이 ATP와 경쟁적인지 아닌지를 확인하기 위하여, APT-아가로오스 비드를 이용하여 마그놀린 경쟁 분석을 수행하였다. 상기 실험 결과, 마그놀린이 증가하면 ATP-아가로오스 비드에 결합하는 ERK2가 감소하는 것을 확인할 수 있었으며 (도 13(e)), 이는 마그놀린이 ATP와 경쟁적으로 ERK1 또는 ERK2의 활성 부위를 타겟으로 함으로써 ERKs/RSKs 신호 전달 경로를 억제하고 이에 의해 세포 증식을 억제한다는 것을 의미하는 것으로 판단되었다.
실시예
10:
마그놀린의
ATF1
및
AP
-1의 전사 촉진 활성 억제 효과 검증
마그놀린이 ATF1 (ERKs/RSK2/c-AMP-의존적 전사 인자) 및 AP (activator protein)-1의 필수 구성인 c-Jun의 인산화, 인산-ATF1 및 인산-c-Jun의 핵에의 로컬리제이션, 및 ATF1 및 AP-1 복합체의 전사 촉진 활성을 억제하는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
JB6 Cl41 세포 (1 X 106)를 직경 100 mm 배양 접시에 밤새 배양하였다. 상기 세포를 24 시간 동안 양분이 공급되지 않은 상태에서 24 시간 동안 방치한 다음, 이에 마그놀린을 15 μM, 30 μM 및 60 μM의 농도로 30 분 동안 미리 처리한 후, EGF (10 ng/ml)와 마그놀린을 함께 30 분 동안 처리하였다. 상기 세포로부터 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏으로 시각화하였다.
한편, pGAL4-ATF1 발현 플라스미드 및 p5xGal4-루시페라아제 리포터 플라스미드를 상기 세포에 감염시키고 이를 12 시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 30 분 동안 마그놀린으로 미리 처리한 다음, EGF와 마그놀린을 함께 6 시간 동안 처리하였다. 그 다음, 상기 세포의 배양을 중지하고, VIXTOR X3 (PerkinElmer)를 이용하여 반딧불이 (firefly) 루시페라아제 활성을 측정하였다.
상기 실험 결과, EGF에 의해 유도되는 Ser63 위치에서의 ATF1 인산화가 마그놀린에 의해 억제된다는 것이 확인되었다 (도 14(a)). 더욱이, EGF 및 마그놀린을 함께 처리하는 경우, EGF 자극에 의하여 증가되었던 ATF1의 전사 촉진 활성이 마그놀린에 의해 억제된다는 것이 확인되었으며, 이는 상기 마그놀린의 ATF1 인산화 억제와 동일한 방식으로 이루어지는 것으로 관찰되었다. 또한, 웨스턴 블랏 및 면역 형광 분석 결과, EGF 및 마그놀린을 함께 처리하는 경우 EGF에 의해 유도된 핵 인산-ATF1 단백질 수준이 마그놀린에 의해 낮아지는 것으로 관찰되었다 (도 14(b)).
또한, EGF 및 마그놀린을 함께 처리하는 경우, EGF에 의해 유도된 Ser63 및 Ser73 위치에서의 c-Jun 인산화 및 AP-1 전사 촉진 활성이 마그놀린에 의해 억제되었고 (도 14(c)), 이에 EGF의 자극에 의해 증가되었던 핵 인산-c-Jun이 마그놀린에 의해 감소하였다 (도 14(d)). 상기 결과로부터, 마그놀린은 ATF1 및 AP-1의 전사 촉진 활성을 억제함으로써 ERKs의 활성을 억제하여 세포 증식을 방해한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
11:
마그놀린의
EGF
에 의해 유도되는 세포 형질 전환 억제 효과 검증 - 부착-
비의존성
세포 형질 전환 분석 (
Anchorage
-
independent
cell
transformation
assay
)
마그놀린이 EGF와 같은 종양 프로모터에 의해 유도되는 세포 형질 전환을 억제하는 작용을 하는 지를 확인하기 위하여 하기와 같이 부착-비의존성 세포 형질 전환 분석을 수행하였다.
10% FBS, 및 마그놀린을 각각 15 μM, 30 μM 및 60 μM 농도로 함유하는 1 ml의 0.3 % Basal Medium Eagle (BME) 아가 (agar) 환경에 있는 JB6 Cl41 세포 (8 X 103)를 EGF (10 ng/ml)에 노출하고 이를 37 ℃의 온도를 유지하며 14일 동안 5 % CO2 세포 배양기에서 배양하였다. 그 다음, ECLIPSE Ti 도립 현미경 (inverted microscope) 및 NIS-Elements AR (V. 4.0) 컴퓨터 소프트웨어 프로그램 (NIKON Instruments Korea, Seoul, Korea)을 이용하여 상기 세포 콜로니의 수 및 사이즈를 계산하였다.
상기 실험 결과, 마그놀린을 30 μM 농도로 처리한 경우 부착-비의존성 세포 형질 전환이 약 40 % 정도 억제되었고, 60 μM 농도로 처리한 경우 부착-비의존성 세포 형질 전환이 약 75 % 정도 억제된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 15).
한편, 세포 증식 및 형질 전환에 있어서 마그놀린이 Ras/ERKs 신호 전달 경로를 선택적으로 억제하는 지를 확인하기 위하여, Ras (RasG12V)의 구성성 돌연변이 (constitutive mutation)를 갖는 A549 및 정상 Ras (Ras-wt)를 갖는 H226을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
정상 Ras를 갖는 H226 인간 폐종양 세포 (2 X 103) 및 돌연변이 활성 인자인 RasG12V를 갖는 A549 인간 폐종양 세포 (2 X 103)를 각각 96-well에 분주하고 마그놀린을 15 μM, 30 μM 및 60 μM 농도로 처리한 다음 이를 24 시간 간격으로 96 시간 동안 배양하면서 세포 증식을 측정하였다. 상기 실험 결과, 마그놀린은 H226 세포에 비하여 A549 세포에서 세포 증식을 더욱 억제한다는 것을 확인할 수 있었다 (도 16(a)).
또한, 정상 Ras를 갖는 H226 세포 (8 X 103) 및 RasG12V를 갖는 A549 세포 (8 X 103)를 10 % FBS 및 각각 15 μM, 30 μM 및 60 μM 농도의 마그놀린을 함유하는 0.3 % DMEM 아가 1 ml에서 37 ℃의 온도를 유지하며 10일 동안 5 % CO2 세포 배양기에서 배양한 다음, ECLIPSE Ti 도립 현미경 및 NIS-Elements AR (V. 4.0) 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 이용하여 상기 세포 콜로니의 수 및 사이즈를 계산한 결과, A549 세포의 부착-비의존성 콜로니 성장이 마그놀린에 의해 억제된다는 것을 알 수 있었다. 다만 H226 세포는 소프트 아가 조건에서 성장이 잘 이루어 지지 않는 것으로 확인되었다 (도 16(b) 및 (c)).
상기 실험 결과들을 보다 명확히 하기 위하여 안정적으로 거짓 인자 (mock) 또는 RasG12V를 발현하는 NIH3T3 세포를 이용하여 상기와 동일한 추가 실험을 수행하였다.
실험 결과, 거짓 인자를 발현하는 NIH3T3 세포와 비교할 때, RasG12V를 발현하는 NIH3T3 세포에서 마그놀린의 세포 증식 억제가 더욱 민감하게 관찰되었다 (도 17(a) 및 17(b)). 나아가 거짓 인자를 발현하는 NIH3T3 세포에서는 부착-비의존성 콜로니 성장이 관찰되지 않은 반면, RasG12V를 발현하는 NIH3T3 세포는 부착-비의존성 콜로니 성장을 나타내어 상기 세포가 형질 전환되었다는 것을 보여 주었으며, 상기 RasG12V를 발현하는 NIH3T3 세포에 마그놀린을 처리한 경우 부착-의존성 콜로니 성장을 억제하는 것이 확인되었다 (도 17(c)).
상기 결과들을 종합할 때, ERK1 및 ERK2 활성 부위를 타겟으로 하는 마그놀린은 ATF1 및 AP-1을 포함하는 Ras/ERK/RSK2에 의해 매개되는 다운스트림 신호 전달 경로를 억제하며, 이에 EGF와 같은 종양 프로모터에 의해 유도되는 세포의 증식 및 형질 전환을 억제하는 것으로 판단된다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.
Claims (13)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
[화학식 1]
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 디메틸피노레시놀 (Dimethylpinoresinol), 디메틸리로레시놀 (Dimethylliroresinol), 에피유데스민 (Epieudesmin), 에피마그놀린 (Epimagnolin), 디메톡시아스칸틴 (Demethoxyaschantin), 아스칸틴 (Aschantin) 및 파르게신 (Fargesin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물을 추가로 포함하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물의 부피를 기준으로, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 농도가 1 μM 내지 100 μM인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase)의 활성을 조절하여 종양 세포의 증식을 억제함으로써 암 전이를 억제하는 것인 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 조성물을, 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 암 전이 억제 방법.
- 삭제
- 마그놀린 (Magnolin)을 함유하는 신이(Magnoliae Flos) 추출물의 클로로포름 분획물을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 조성물은 디메틸피노레시놀, 디메틸리로레시놀, 에피유데스민, 에피마그놀린, 디메톡시아스칸틴, 아스칸틴 및 파르게신으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물을 추가로 포함하는 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 조성물의 부피를 기준으로, 상기 신이 추출물의 클로로포름 분획물의 농도가 2 ㎍/ml 내지 250 ㎍/ml인 조성물.
- 마그놀린을 함유하는 신이 추출물의 클로로포름 분획물을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물.
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부암 또는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 조성물을, 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 피부암 또는 폐암의 예방 또는 치료 방법.
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부암 또는 폐암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물.
[화학식 1]
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| KR1020130111392A KR101561552B1 (ko) | 2013-09-16 | 2013-09-16 | 리그난 화합물을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130111392A KR101561552B1 (ko) | 2013-09-16 | 2013-09-16 | 리그난 화합물을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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