KR101559330B1 - 암 및 만성 감염 치료를 위한, 효능제 활성을 갖는 인터루킨 2로부터 유도된 폴리펩티드 - Google Patents

암 및 만성 감염 치료를 위한, 효능제 활성을 갖는 인터루킨 2로부터 유도된 폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돌연변이된 몇몇 아미노산들을 제외하고는 인간 IL-2와 주서열을 공유하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 도입된 돌연변이들은 이러한 폴리펩티드들이 인 비트로 및 인 비보에서 조절 T 세포들 (T CD4+CD25+FoxP3+)을 자극하는 능력을 실질적으로 감소시키며, 이러한 폴리펩티드들이 이식가능한 쥐과 종양들의 치료에 더욱 효과적이 되게끔 한다. 또한, 본 발명은 이러한 돌연변이된 변이체들의 치료적 사용을 포함하며, 이는 단독으로, 또는 암 또는 조절 T 세포들 (Tregs)의 활성이 관련되는 감염과 같은 질병들의 치료를 위한 백신들과 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 태양은 개시된 폴리펩티드를 활성 성분으로서 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 암 및 만성 감염 질환들과 같은 질병들에 대한 상기 펩티드 및 약학적 조성물의 면역 체계 조절 효과를 이용하여 그들을 치료적으로 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

암 및 만성 감염 치료를 위한, 효능제 활성을 갖는 인터루킨 2로부터 유도된 폴리펩티드 {Polypeptides derived from IL-2 having agonist activity, for the therapy of cancer and chronic infections}
본 발명은 면역학에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 원래 분자의 효능제 활성을 갖고, 예상 외로, 탁월한 치료 효능을 나타내는 천연 분자 유사체를 사용하여 면역 체계를 치료적으로 조절하는 것에 관한 것이다.
인터루킨 2 (IL-2)는 T 세포들에 대해서 처음으로 보고된 성장 인자이다. 그 발견 이래로, IL-2는 T 인 비트로 세포들의 번식 및 생존을 촉진하는 능력이 있는 것으로 보고된 바 있으며 (Smith, KA. (1988) Science. 240, 1169-76), 또한 T 바이러스성 감염 (Blattman, JN, et al. (2003) Nat Med 9, 540-7) 또는 백신 (Fishman, M., et al. (2008) J Immunother. 31, 72-80, Kudo-Saito, C ., et al. (2007) Cancer ImmunolImmunother. 56, 1897-910　; Lin, CT., et al. (2007) ImmunolLett. 114, 86-93)에 있어서 면역 반응을 증강시키는 것으로 보고된 바 있다. 그러나, 이러한 T 면역 반응 촉진제로서의 IL-2의 통상적 역할에 대해서 최근 수 많은 실험적 데이터들이 의문을 제기하고 있는 바 (Almeida, AR., et al .(2002) J Immunol. 169, 4850-60　; de la Rosa, M., et al. (2004) Eur J Immunol. 34, 2480-8, Malek; TR, et al. (2004) Nat Rev Immunol. 4, 665-74), 이러한 시토카인이 천연 조절 T 세포들 CD4+CD25+FoxP3+ (Tregs)에 대한 항상성 성장 인자라는 점을 밝혔다. IL-2는 또한 조절 T 세포들이 CD4 T 헬퍼 세포들, 세포독성 CD8 T 세포들 및 천연 킬러 (NK) 세포들과 같은 다른 효과기 세포들 (effector cells)의 활성 및 확장을 억제하는 메카니즘에 있어서 주요한 역할을 하는 것으로 제안된 바 있다. 특히, 최근에는 조절 T 세포들이 다른 T 세포들을 억제하여 IL-2 수준의 국소적 감소를 유도하는 것으로 제안된 바 있다 (Pandiyan, P., et al. (2007) Nat Immunol. 8, 1353-1362). 이러한 억제 효과는: a) 효과기 T 세포들이 새로운 IL-2를 생산하는 것을 직접적으로 억제하는 능력 (Almeida, AR., et al. (2002) J Immunol. 169, 4850-60; Takahashi, T., et al . (1998) IntImmunol. 10, 1969-80; Thornton, AM., et al. (1998) J Exp Med 188, 287-96; Wolf, M., et al. (2001) Eur J Immunol. 31, 1637-45); b) 미소환경 하에 존재하는 IL-2를 신속하게 격리하고, 내부로 이송하고, 분해하는 능력 (Pandiyan, P., et al. (2007) Nat Immunol. 8, 1353-62) 및 c) IL-2의 알파 사슬을 과발현하는 능력 (Kuniyasu, Y., et al. (2000) IntImmunol. 12, 1145-1155)에 기반하는 것으로서, IL-2의 농도가 낮은 경우에 이를 더욱 효과적으로 사용하는 것을 가능하게 한다.
요약하면, IL-2는 다른 세포 군집들의 생물학적 활성과 매우 관련이 있는, 고도의 다면발현성 (pleiotropic) 시토카인이다. 이러한 특성으로 인해서 면역 반응의 조절에 있어서 IL-2가 중요한 교점이 되며, 치료 및 복잡한 면역 조절에 있어서 IL-2가 매력적인 표적이 된다.
IL-2는 수년 동안 암 치료법에서 사용되어 왔다. 특히, IL-2를 고용량으로 사용하는 것은 전이성 흑색종 (metastatic melanoma) 및 신장 세포 암종 (renal cell carcinoma)의 치료를 위한 방법으로서 여러 국가에서 승인된 치료법이다. 그러나, 환자에 IL-2를 직접 사용하는 것은 그 독성 및 낮은 효율성으로 인해서 매우 제한되고 있다. 따라서, 적격 환자들 중의 20%만이 IL-2 기반 치료법을 받고 있으며, 치료된 환자들 중 17%만이 긍정적 반응을 보인다. 임상 환경에서 이러한 극적인 실패에 대한 개연성 있는 설명으로는, 천연 IL-2를 사용한 치료법이 또한 조절 T 세포들의 개체군을 자극한다는 점인데 (Ahmadzadeh, M., et al. (2006) Blood. 107, 2409-14), 이러한 자극은 바람직한 면역-자극을 억제하게 된다. 최근에, 다수의 전임상 증거들이 이러한 아이디어를 뒷받침한다. 특히, 쥐과 동물 모델들에서의 실험들은 인 비보로 주사된 IL-2의 주된 활성이 천연 조절 T 세포들의 항상적 팽창 (homeostatic expansion)임을 보여준다. IL-2 요법의 독성 효과를 완화하기 위해서 몇몇 전략들이 개발되었다. 이러한 전략들 중의 일부는 IL-2의 돌연변이 변이체를 사용하는 것에 기반하며, 이러한 돌연변이 변이체는 중친화성 수용체 (베타 및 감마 사슬)에 의해서가 아니라, 주로 고친화성 수용체 (알파, 베타 및 감마 사슬)에 의해서 신호전달함으로써 이러한 분자의 용량을 증가시키도록 고안된 것이다. 기본적인 아이디어는 NK 세포들에서의 신호전달 대신에 T 세포들에서의 신호전달을 촉진하는 것인데, 관찰된 독성 효과들은 NK 세포들에서 기인하는 것으로 믿어진다. 하기 발명들은 이러한 연구의 연장선상에 있는 것들이다: 미국특허 제7,186,804호, 미국특허 제7,105,653호, 미국특허 제6,955,807호, 미국특허 제5,229,109호, 미국특허출원 제20050142106호. 그러나, 이러한 발명들 중 어느 것도, 천연 조절 T 세포들을 자극하는 능력의 감소에 기초하여, 인 비보 천연 IL-2보다 더 큰 치료적 효율성을 갖는 IL-2의 돌연변이 단백질 (muteins)에 관련된 것은 아니라는 점을 주목할 필요가 있다.
또한, 예를 들어 그 폴딩을 개선하거나 또는 혈 중 수명을 증가시킴으로써, 그 약학적 활성을 증가시키기 위한 목적으로 IL-2의 다른 돌연변이 변이체들이 제조된 바 있다. 그 중에서도, 하기 발명들이 이러한 연구의 연장선상에 있는 것들이다: 미국특허 제4,959,314호, 미국특허 제5,116,943호, 미국특허 제4,853,332호. 마찬가지로, 이러한 돌연변이 단백질들 중 어느 것도 조절 T 세포들을 활성화시키는 능력이 감소된 것이거나 또는 더 큰 치료적 효율성을 나타내는 것은 아니다.
마지막으로, 종래문헌에 다양한 치료제들이 제안되어 있다는 점을 언급할 필요성이 있는데 (Kreitman, R.J. (2009) Curr Pharm Des. 15, 2652-64; Litzinger, M.T., Fernando, R., Curiel, T.J., Grosenbach, D.W., Schlom, J. and Palena, C. (2007) Blood. 110, 3192-201; Morse, M.A., Hobeika, A.C., Osada, T., Serra, D., Niedzwiecki, D., Lyerly, H.K. and Clay, T.M. (2008) Blood. 112, 610-8; Onizuka, S., Tawara, I., Shimizu, J., Sakaguchi, S., Fujita, T. and Nakayama, E. (1999) Cancer Res. 59, 3128-33; Quezada, S.A., Peggs, K.S., Curran, M.A. and Allison, J.P. (2006) J Clin Invest. 116, 1935-45), 이들은 인 비보에서 조절 T 세포들의 활성을 조절하거나 또는 감소시키는 것을 제안하고 있다. 이러한 치료제들은 동물 모델들에서 테스트된 것들이거나, 심지어는 암의 직접 치료법으로서 또는 백신의 효과를 증가시키기 위해서 환자들에서 테스트된 것들이다. 또한, IL-2의 활성을, 특히 단클론 항체들에서 조절하는 것에 대해서 제안하는 논문들도 존재하며 (Boyman, O., Kovar, M., Rubinstein, M.P., Surh, C.D. and Sprent, J. (2006) Science. 311, 1924-1927; Boyman, O., et al .(2006) Expert OpinBiolTher. 6, 1323-31; Kamimura, D., et al . (2006) J Immunol. 177, 306-14; Murakami, M., Sakamoto, A., Bender, J., Kappler, J. and Marrack, P. (2002) ProcNatlAcadSci USA. 99, 8832-7; Tomala, J., Chmelova, H., Mrkvan, T., Rihova, B. and Kovar, M. (2009) J Immunol. 183, 4904-4912), 이는 더 나은 또는 더 효과적인 면역 반응들을 촉진하기 위한 것들이다. 그러나, 본 발명자들이 인지하고 있는 한도 내에서는, IL-2의 돌연변이 변이체에 기반한 것으로서, 천연 조절 T 세포들을 자극하는 능력이 감소됨으로써 더욱 큰 치료 효능을 얻을 수 있는 가능성을 보여주는 종래문헌이 존재하지는 않는다.
따라서, 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하여 천연 IL-2보다 더욱 큰 치료 효능을 나타내는 IL-2의 돌연변이 펩티드 서열, 이를 포함하는 융합 단백질, 이를 포함하는 약학적 조성물, 및 그 용도를 제공하고자 한다.
본 발명은 이식가능한 쥐과 종양 모델들에서 천연 IL-2보다 더욱 큰 치료 효능을 나타내는 IL-2의 돌연변이 변이체의 생산에 관한 것이다. 이러한 돌연변이 단백질들은 IL-2 활성에 대한 부분적 효능제이며, 인 비트로 및/또는 인 비보에서 조절 T 세포들 (T CD4+CD25+FoxP3+)을 자극하는 능력이 특히 낮다는 특성을 갖는다. 이러한 돌연변이 단백질들의 인 비보 치료적 효능은 악성 종양들에서 IL-2 치료법을 개선하는데 있어 실제적인 해법을 제공한다. 특히, 이러한 돌연변이 단백질들은 천연 IL-2 치료법에서 관찰되는 한계점, 즉 인 비보에서 천연 조절 T 세포들을 확장시키는 입증된 능력으로부터 유래된 한계점을 극복할 수 있는 방법을 제공할 것이다. 본 발명은, 돌연변이된 몇몇 아미노산들을 제외하고는, 인간 IL-2와 그 주서열 (primary sequence)을 공유하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 도입된 돌연변이는 이러한 폴리펩티드가 인 비트로 및 인 비보에서 조절 T 세포들 (T CD4+CD25+FoxP3+)을 자극하는 능력을 실질적으로 감소시키며, 쥐과 동물의 이식가능 종양들을 치료함에 있어서 IL-2a에 더욱 큰 효능을 부여한다. 본 발명은 또한 이러한 돌이변이 변이체들을, 단독으로 또는 암 또는 조절 T 세포들 (Tregs)의 활성이 관련되는 질병들을 치료하기 위한 백신과 조합하여, 치료적으로 사용하는 것을 포함한다.
본 발명은, 암을 직접적으로 치료하는 것 뿐만 아니라, 다른 백신들과 조합되어, IL-2에 기반한 현재의 면역조절 전략을 실질적으로 향상시키는 것을 가능케 한다. 특히, 천연 IL-2를 본 발명에 서술된 돌연변이 변이체로 대체함으로써, 원하는 치료 효과를 현저하게 저해하는 조절 T 세포들의 팽창을 억제할 수 있다.
도 1. 돌연변이 단백질의 획득. a) SDS-폴리아크릴아미드 겔 (SDS-PAGE) 중 전기영동에 의해서 평가된, E. coli의 BL21DE3 균주에서 돌연변이 단백질의 발현, 레인 1: BL21DE3 균주의 총 단백질, 발현의 음대조군; 레인 2 및 레인 3: 상기 균주에서 얻어진 발현 수준들에 대한 2가지 예시, 화살표는 돌연변이 단백질에 해당되는 밴드를 나타냄. b) 단백질의 주된 최종 정제 단계를 나타낸 역상 크로마토그램, 화살표는 관심대상이 되는 단백질에 해당되는 피크를 나타냄. c) SDS-PAGE에 의해서 분석된 돌연변이 단백질의 정제 1: 함입체 (inclusion body) 분리 과정에 대한 결과, 2: 역상에 의해서 정제된 이후 얻어진 돌연변이 단백질.
도 2. IL-2 돌연변이 단백질의 효능제 특성 분석. a) CTLL2 세포주 표면에 대한 돌연변이 단백질의 결합 능력의 유세포 분석기를 사용한 측정. 항 6His 태그 MAb를 사용하여 IL-2 및 돌연변이 단백질 검출. b) 그래프는 천연 IL-2와 비교할 때, 돌연변이 단백질이 IL-2 의존성 T-세포주 CTLL2의 번식을 유도하는 능력을 도시. 번식은 MTT 통합에 의해서 측정.
도 3. 돌연변이 단백질은 조절 T 세포들의 인 비트로 번식을 유도하지 않음. a) C57BL/6 마우스 림프절로부터 정제된 CD3+CD4+CD25+ 개체군의 순도를 나타내는 유세포 분석 그래프. b) Treg 세포들이 항-CD3 mAb를 사용하여 인 비트로에서 자극되고, 천연 IL-2가 이들 세포들에 0.5 ng/mL의 농도로, 또는 돌연변이 단백질이 32 ng/mL의 농도로 72시간 동안 투여됨. 그래프는 각 처리 이후에 회수된 생존 세포들의 개수를, 시토카인이 첨가되지 않은 대조군과 비교하여 나타냄. 선택된 농도들은 각 분자가 CTLL 세포주의 동일한 번식을 유도하는 농도에 해당됨.
도 4. 세포 개체군의 번식에 대해서 돌연변이 단백질을 사용한 처리가 미치는 영향을 평가. a) 돌연변이 단백질로 5일 동안 처리된 마우스 비장의 상대적 중량에 대한 정량화. 처리된 마우스의 비장 중량은 통계적으로 대조군의 ㅂ비장 중량에 비해서 더 높은 값을 나타냄. 크루스칼-월리스 비모수 테스트 (Kruskal-Wallis nonparametric test) 및 던 다중 비교 (Dunn multiple comparison). b) T CD8 + 세포들의 개체군 측정. 그래프는 이러한 개체군의 백분율을 나타냄.
도 5. 흑색종 MB16F0 세포주의 실험적 전이 모델에 있어서, 돌연변이 단백질이 천연 IL-2보다 더욱 효과적으로 전이 감소를 야기. a) 각 처리에 대한 대표 폐 사진들. b) 각 군에 있어서 폐 전이의 정량화.
도 6. 돌연변이 단백질 및 OVA/VSSP 백신의 조합을 처리한 경우 백신의 항종양 효과가 증강됨. 종양 보유 마우스는 OVA/VSSP 백신 단독으로 처리되거나, 또는 돌연변이 단백질과 조합되어 처리됨. 그래프는 종양 성장 곡선을 나타냄. 조합으로 처리된 군이 더욱 큰 종양 성장 억제 효과를 나타내며, 통계적으로 대조군과는 다른 양상을 보임.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
IL -2 유사폴리펩티드의 제조
본 발명은 100 내지 500개의 아미노산들, 바람직하게는 140개의 잔기들로 구성되는 폴리펩티드에 관한 것으로서, 그 겉보기 분자량 (apparent molecular weight)은 최소한 15 kD이다. 이러한 폴리펩티드들은 천연 IL-2와 높은 서열 상동성, 즉 90% 이상의 서열 상동성을 유지한다. 그 서열 중 일 영역에서, 상기 폴리펩티드들은 천연 IL-2에 비해서 3 내지 6개의 돌연변이들을 포함한다. 이러한 위치들에서, 상기 폴리펩티드들은 천연 IL-2에서의 동일한 위치에 존재하는 아미노산 잔기들과는 다른 아미노산 잔기들을 도입함으로써 돌연변이된다. 원래의 잔기들을 대체하는 아미노산들은 원래의 아미노산의 물리화학적 특성들과는 상당히 다른 물리화학적 특성들을 갖도록 선택되는데, 예를 들어 극성을 비극성으로, 비대전성을 대전성으로, 대형을 소형으로, 산을 염기로 대체할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드들은, 예를 들어 면역조절 폴리펩티드, IL-2 유사체 도는 IL-2 돌연변이 단백질로 명명될 수 있다. 이러한 폴리펩티드들은 IL-2 수용체 복합체의 3D 구조 (PDB 공개 데이테베이스로부터 입수 가능)에 기초하여 고안된 것으로서, 주로 용매에 현저하게 노출되고 다른 종들에 비해서 IL-2에서 고도로 보존되는 아미노산들에 해당되는 IL-2의 위치들 (Swissprot 데이터베이스로부터 지득한 서열들)에 주로 돌연변이들을 도입하게 된다. 상기 용매에 노출되는 아미노산들은, RASMOL, SwissPDBviewer 등과 같은, 단백질 구조를 가시화하기 위한 바이오인포매틱스 소프트웨어를 사용하여 확인된다. IL-2 서열에서 보존되는 위치들은, Fasta, ClusterW 등과 같은, 다중 서열 배열을 위한 바이오인포매틱스 소프트웨어를 사용하여 확인된다.
본 발명의 폴리펩티드는 단백질 합성을 포함하는 다양한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 또한, 유전공학기법, 예를 들어 그러한 폴리펩티드를 E. coli 또는 다른 박테리아와 같은 박테리아, 또한 NOS 세포들 또는 다른 포유류 세포들과 같은 포유류 세포들 내에서 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 특정 위치들에서의 점 돌연변이들 또한 중합효소 연쇄반응분석법 (PCR)을 사용하여 위치선택적 돌연변이 (site-directed mutagenesis)를 수행함으로써 달성될 수 있다.
예기치 않게, 본 발명자들은 천연 IL-2의 통상적 사용에 비해서 이러한 돌연변이 단백질들이 상당한 장점을 제공한다는 사실을 발견하게 되었다. 이러한 장점은 종양 치료법에 있어서 그 증가된 효율성에 있으며, 조절 T 세포들의 팽창을 억제하는 그 능력으로부터 유래된다.
생물학적 활성의 관점에서 IL -2의 폴리펩티드 유사체 선택;
본 발명의 폴리펩티드는 하기 특성들에 의해서 선택된다:
1) 천연 IL-2의 효능제 활성. 본 특성은 CTLL2 또는 Kitt225와 같은 IL-2 의존성 세포주들을 사용한 인 비트로 번식 분석, 또는 쥐과 동물 및/또는 인간 T 림프구들의 혼합물을 사용한 분석에 의해서 직접적으로 평가될 수 있다. 돌연변이 단백질들은 이러한 실험들에서 천연 IL-2에 비해서 5 내지 50배 낮은 특이적 자극 활성을 나타내어야 한다.
2) 천연 IL-2와 비교할 때, 조절 T 세포들의 인 비트로 및/또는 인 비보 개체군을 자극하는 능력의 상실. 본 특성은, 예를 들어 정상 마우스 (naive mice)로부터 정제되고 인 비트로 항-CD3 항체로 자극된 T CD4+CD25+ 세포들의 팽창을 직접적으로 유도하는 능력을, 본 발명의 돌연변이 단백질과 천연 IL-2를 비교 연구함으로써 분석될 수 있다. 이는 또한 이러한 돌연변이 단백질들 또는 천연 IL-2를 마우스 내에 5일 동안 복강주사 또는 피하주사에 의해서 투여하고, 조절 T 세포들 (T CD4+CD25+FoxP3+)의 개체군 팽창 또는 번식 속도 증가에 미치는 영향을 평가함으로써 분석될 수도 있다. 이러한 실험들에서 Treg 세포들에 대한 돌연변이 IL-2의 활성은 천연 IL-2의 그것에 비해서 적어도 1000배 낮아야 한다.
3) 동물 모델들에서 천연 IL-2에 비해서 증가된 치료 효과. 본 특성은, 예를 들어, 이식가능한 종양 모델들 (예를 들어, B16 흑색종)에서 단일 치료법으로서의 돌연변이 단백질들과 천연 IL-2의 항암 또는 항-전이 효과를 비교함으로써 분석될 수 있다. 또한, 관심대상이 되는 백신에 대한 세포 및/또는 체액 반응의 강화 효과 (potentiating effect)를 통해서도 평가할 수 있다. 돌연변이 단백질들은 동일한 총 단백질 중량을 갖는 IL-2 및 돌연변이 단백질을 함유하는 투여량에 있어서 천연 IL-2보다 더욱 높은 치료 효율을 나타내어야 한다.
특히, 본 발명은 하기 표 1에 구체화된 돌연변이 단백질들에 관한 것이다. 이러한 돌연변이 단백질들은 전술한 특성들을 갖도록 하는 다중 아미노산 치환들을 갖는다.
본 발명에서 서술된 3가지 기본적 특성들을 갖는 고안된 돌연변이 단백질들. 돌연변이는 인간 IL-2의 번호에 따라서 명명됨.
돌연변이들
R38K, F42I, Y45N, E62L, E68V
R38K, F42Q, Y45E, E68V
R38A, F42I, Y45N, E62L, E68V
R38K, F42K, Y45R, E62L, E68V
R38K, F42I, Y45E, E68V
R38A, F42A, Y45A, E62A
본 발명은 또한 전술한 IL-2 돌연변이 단백질들, 특히 상기 표 1에 서술된 것들에 부가적인 변형을 포함한다. 이러한 변형은, 조절 T 세포들을 자극하지 않는 효능제 특성에 영향을 주지 않거나 또는 심지어 증가시키면서, IL-2 수용체의 특정 성분들에 대한 친화도를 증가시키는 것, 또는 그 인 비보 약력학 (pharmacodynamics) 특성을 향상시키기 위한 것으로서: 반감기를 증가시키거나 또는 T 세포들에 의한 내부반입 (internalization)을 감소시키기 위한 것이다. 이러한 부가적 돌연변이들은 바이오인포매틱스 도구들을 사용한 합리적 고안에 의해서 얻어지거나, 또는 다른 성질들을 갖는 조합 분자 라이브러리들 (파지 라이브러리들, 효모 또는 박테리아에서의 유전자 발현 라이브러리들)을 사용함으로써 얻어질 수 있다.
본 발명의 다른 태양은 전술한 면역조절 폴리펩티드들 중 어느 하나를 포함하며, 캐리어 단백질에 연결된 융합 단백질에 관한 것이다. 상기 캐리어 단백질은 알부민 또는 인간 면역글로불린의 Fc 영역일 수 있다.
IL -2 유사체 폴리펩티드의 치료적 적용;
본 발명은 또한 유효 성분으로서 본 발명에 따른 IL-2의 돌연변이 단백질 및 그 유사체를 포함하는 약학적 조성물, 및 조절 T 세포들이 특히 관련되는 암 또는 만성 감염과 같은 질병들에서 천연 또는 백신-유도된 면역 반응을 강화하기 위한 그 잠재적 치료적 적용을 포함한다.
치료적 사용을 위해서, 본 발명의 폴리펩티드는 질병 보유자에 독립적으로, 또는 그 치료 작용을 용이하게 하거나 향상시키는 다른 폴리펩티드 또는 다른 물질들과 조합되어 투여될 수 있다. 투여 경로는 약물의 비경구적 투여에 대한 종래기술에 서술된 임의의 투여 경로일 수 있다. 바람직하게는, 정맥내, 근육내, 피하 또는 종양내로 투여될 수 있다.
본 발명에 서술된 폴리펩티드는 천연 IL-2의 대체재로서 종양 및 만성 감염 질환들의 치료에 사용되거나 또는 백신에 대한 세포성 및/또는 체액성 반응을 향상시키기 위해서 사용되는 약학적 조성물의 일부로서 투여될 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 암 치료용 백신과 조합되거나 또는 조절 T 세포들이 관련 있는 감염성 질병들에 대한 예방 백신과 조합되어 사용될 수 있다.
원하는 치료적 효과를 얻기 위해서, 본 발명의 폴리펩티드는 말초 림프절 또는 대상이 되는 질병과 관련 있는 말초 부위에서 충분한 농도를 확보할 수 있을 정도로 높은 투여량으로, 돌연변이 단백질이 면역-자극 효과를 나타내는 농도 범위 내로 투여되어야 한다. 따라서, 투여량은 대상이 되는 질병의 종류 및 투여 경로에 따라서 조절되어야 한다. 예를 들어, 종양 치료법에 있어서, 투여량은 종양 내부 및/또는 국소 림프절에서 돌연변이 단백질의 농도를 달성함으로써 항종양 면역 반응의 자극을 보장할 수 있도록 조절되어야 한다. 전개될 투여량의 범위는 일회 투여 당 수백 마이크로그램으로부터 수백 밀리그램의 범위일 수 있다. 돌연변이 단백질이 천연 IL-2를 사용하는 통상적인 치료법을 대체하는 적용예에 있어서, 사용되는 돌연변이 단백질의 투여량은 천연 IL-2에 대해서 통상적으로 사용되는 것에 비해서 적거나 또는 활성면에서 동등한 것 (CTLL2 세포주를 사용한 분석으로 결정)이어야 한다.
투여 회수 역시 문제가 되는 돌연변이 단백질의 생분포에 따라서 조절되어야 한다. 일반적으로, 상기 유효 수준이 2 내지 30일 동안 지속적으로 유지되어야 한다. 예를 들어, 만약 돌연변이 단백질이 캐리어 단백질과 결합된 경우에는, 그 투여 빈도도 따라서 조절되어야 한다는 점을 염두에 둘 필요가 있다. 천연 IL-2가 돌연변이 단백질 투여법으로 대체되는 적용예에 있어서, 돌연변이 단백질의 투여는 통상적인 요법에서 사용된 것과 유사할 수 있다. 치료 작용은 질병 징후의 전체적 또는 부분적 차도에 의해서 이해할 수 있다. 암의 경우, 종양 부피의 감소 또는 재발 이전까지 시간의 증가와 같은 사항들이 질병의 차도에 대한 기준이 될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 흑색종 및 신종양 (renal tumors)과 같은 종양들의 치료에 특히 유용하다.
실시예
실시예 1. IL -2 돌연변이 단백질 의 디자인
돌연변이 단백질들은 바이오인포매틱스 기법으로부터 컴퓨터로 디자인하였으며, 그 기초로 데이테베이스 PDB (Protein Data Bank)의 인간 IL-2의 보고된 구조 및 Swissprot 데이터베이스에서 입수 가능한 다양한 종들에서의 IL-2 아미노산 서열을 사용하였다. 몇몇 돌연변이 단백질들은 용매에 노출되고 고도로 보존된 잔기들에서 3 내지 6개의 돌연변이들을 포함하도록 (비보존성 아미노산 치환의 도입) 디자인하였다. 이러한 돌연변이 단백질들은 아미노 말단에서 6개의 히스티딘으로 이루어진 타겟 서열을 포함하는 pET28a 벡터 중의 플라스미드를 구축하는 것으로부터 E. coli 내에서 발현되었다. 돌연변이 단백질들은 역상 (도 1)에 의해서 정제되었으며, 고순도 (> 95%)가 얻어졌다. 얻어진 돌연변이 단백질들은 인 비트로 및 인 비보에서의 실험적 분석으로 얻어진 그들의 특성들로부터 선택되었는 바, 전술한 3가지 기본적 특성들을 나타내도록 선택되었다. 구축된 모든 돌연변이 단백질들 중에서, 표 1은 조절 T 세포들을 주목할 정도로 자극하지 않으면서도 IL-2 활성의 효능제로서 원하는 특성을 갖고, 이식가능한 쥐과 동물 종양들의 치료에 있어서 천연 IL-2 보다 더욱 큰 치료적 효율을 나타내는 특정 돌연변이들의 세트를 나타낸 것이다. 하기 표 2는 원하는 특성들을 나타내지 않는 구축된 돌연변이 단백질들을 나타낸 것이다.
본 발명에서 서술된 기본적 특성들을 갖지 않는 구축된 돌연변이 단백질들. 돌연변이들은 인간 IL-2의 번호에 따라서 명명됨.
돌연변이들
Q22V, Q126A, I129D, S130G
L18N, Q126Y, S130R
Q13Y, Q126Y, I129D, S130R
L18N, Q22V, T123A, I129D, S130R
R38A, F42A, Q126Y, I129D
Q126Y, I129D, E62L, E68V
실시예 2. 디자인된 IL -2 돌연변이 단백질들의 효능제 특성 서술
도 2는 표 1에 서술된 돌연변이 단백질들이 어떻게 CTLL2 세포주의 표면 상에 존재하는 IL-2 수용체의 성분들에 결합하는지를 도시한 것이다 (도 2a). 구축된 돌연변이 단백질들은 CTLL2 세포들에 결합하는데, CTLL2 세포들은 그 표면에 IL-2에 대한 고친화성 수용체들 및 중친화성 수용체들을 모두 갖는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 분석에 검출된 결합은 천연 IL-2로 얻어진 결합과 유사한 것으로 보인다. 도 2b는 표 1에 나타낸 돌연변이 단백질들이 CTLL2 세포주의 성장을 촉진하는 능력을 도시한 것이다 (도 2b). 이러한 돌연변이 단백질들은 본 분석에서 IL-2 활성의 부분적 효능제로서 기능한다. 그들의 특이적 활성은 천연 IL-2의 활성에 비해서 5 내지 50배 더 낮았다.
실시예 3. 조절 T 세포들에 대한 IL -2 돌연변이 단백질들의 효과
표 1에 나타낸 돌연변이 단백질들은 인 비트로에서 조절 T 세포들을 매우 낮은 정도로 자극하는 것으로 나타났다 (도 3). 도면에 도시된 바와 같이, 천연 IL-2는 플레이트-결합된 항-CD3 항체로 자극된 조절 T 세포들 (T CD4+CD25+FoxP3+)의 강한 번식을 유도하였다. 표 1에 나타낸 돌연변이 단백질들은 천연 IL-2보다 현저하게 높은 고농도에서 조절 T 세포들을 자극하지 않았다. 특히, 전술한 결과들은, 사용된 돌연변이 단백질의 양이 CTLL2 세포주를 사용한 번식 분석에 있어서 활성면에서 천연 IL-2와 동등하게 될 정도의 양으로증가되는 경우에도 유효하였다는 점을 부언 설명할 필요가 있다. 표 1에 나타낸 돌연변이 단백질들은 대체적으로 조절 T 세포들을 자극하는 능력에 있어서 천연 IL-2보다 최소한 1000배 낮은 것으로 나타났다.
실시예 4. 디자인된 돌연변이 단백질들의 인 비보 면역자극 활성 특성화
표 1에 나타낸 돌연변이 단백질들은 증가된 인 비보 면역자극 능력을 나타내었다. 도 4a 및 b는, 돌연변이 단백질 20 ㎍을 1일 2회 5일에 걸쳐서 처리한 이후, 돌연변이 단백질이 정상 마우스 천연 IL-2의 비종 (splenomegaly)보다 더 큰 비종을 유도하는 것을 도시한 것이다. 이러한 자극은 T CD8+ 림프구와 같은 효과기 개체군 (effector populations)의 명백한 증가와 부합되는 것이다. 이러한 관찰로부터, 본 발명에 따른 돌연변이 단백질들로 처리하는 경우, 천연 IL2에서 관찰되는 것과는 대조적으로 (도 4c 및 d), 조절 T 세포들 (T CD4+CD25+FoxP3+)의 팽창을 자극하지 않는다는 사실을 알 수 있다.
실시예 5. 쥐과 동물의 이식가능한 종양 모델 중에서 돌연변이 단백질들의 치료 효율 측정
본 실시예에 따라서, 쥐과 동물의 이식가능한 종양 모델에서 디자인된 돌연변이 단백질들의 치료 효율 증가를 입증하였다. 상기 표 1에 나타낸 돌연변이 단백질들은 MB16 쥐과 흑색종 모델 중의 폐 전이의 치료에 대해서 증가된 효율을 나타내었다. 도 5는 표 1에 나타낸 돌연변이 단백질 20 ㎍을 1일 2회 5일에 걸쳐서 처리한 이후, 돌연변이 단백질이 강한 항전이 효과를 나타내는 것을 도시한 것이며, 이러한 효과는 천연 IL-2를 동일한 투여량으로 처리한 그룹에서는 관찰되지 않았다.
실시예 6. 돌연변이 단백질의 항종양 백신 효과 증강 능력 측정
디자인된 돌연변이 단백질의 항종양 백신 효과 증강 능력을 입증하였다. OVA 항원을 발현시키기 위해서 유전적으로 변형된 종양 세포주인 EG7 세포주를 이용한 일차 종양 모델을 사용하였다. 종양 보유 마우스는 VSSP 단독으로, 또는 돌연변이 단백질과 조합하여 애주번트화된 (adjuvanted) OVA 항원을 사용하여 면역화하였다. 도 6은 종양 성장의 감소에 있어서, 돌연변이 단백질과 조합되어 처리된 경우가, 백신 단독으로 처리된 경우에 비해서 더욱 높은 정도를 나타낸다는 사실을 보여준다.
<110> Centro de inmunologia molecular <120> Polypeptides derived from IL-2 having agonist activity for the therapy of cancer and chronic infections <130> HIP0068-CU <150> CU P/2010/216 <151> 2010-11-12 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Lys Met Leu Thr Ile Lys Phe Asn Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Leu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Val Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Lys Met Leu Thr Gln Lys Phe Glu Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Val Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 3 <211> 133 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ile Lys Phe Asn Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Leu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Val Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Lys Met Leu Thr Lys Lys Phe Arg Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Leu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Val Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 5 <211> 133 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 5 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Lys Met Leu Thr Ile Lys Phe Glu Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Val Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 6 <211> 133 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Ala Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130

Claims (28)

  1. 인터루킨 2의 효능제 폴리펩티드로서, 천연 인터루킨 2의 서열과 95% 서열 상동성을 갖고, 조절 T 세포들을 인 비트로 및/또는 인 비보에서 자극함에 있어서 천연 인터루킨 2보다 적어도 1000배 적은 활성을 가지며, 천연 인터루킨 2보다 더 큰 인 비보 치료적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드로서,
    상기 폴리펩티드는 인간 인터루킨 2의 아미노산 서열에서, R38, F42 및 Y45 위치의 돌연변이와, E62번 및 E68번 위치에서 선택되는 하나 이상의 위치에서 돌열변이를 갖는 폴리펩티드이고,
    R38K, F42I, Y45N, E62L 및 E68V 돌연변이를 갖는 서열번호 1의 폴리펩티드;
    R38K, F42Q, Y45E 및 E68V 돌연변이를 갖는 서열번호 2의 폴리펩티드;
    R38K, F42I, Y45N, E62L 및 E68V 돌연변이를 갖는 서열번호 3의 폴리펩티드;
    R38K, F42K, Y45R, E62L 및 E68V 돌연변이를 갖는 서열번호 4의 폴리펩티드;
    R38K, F42I, Y45E 및 E68V 돌연변이를 갖는 서열번호 5의 폴리펩티드; 및
    R38A, F42A, Y45A 및 E62A 돌연변이를 갖는 서열번호 6의 폴리펩티드;로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드.
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  8. 캐리어 단백질에 결합된 제1항에 따른 면역조절 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 캐리어 단백질은 알부민인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  10. 제8항에 있어서, 상기 캐리어 단백질은 인간 면역글로불린의 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  11. 암 및 만성 감염성 질환들의 치료에 유용한 약학적 조성물로서, 유효 성분으로서 제1항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 유효 성분으로서 제1항에 따른 폴리펩티드를 하나 또는 복수로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 암 및 만성 감염성 질환들의 치료에 유용한 약학적 조성물로서, 유효 성분으로서 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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  19. 암 치료법에 유용한 의약을 제조하기 위한, 제1항에 따른 폴리펩티드.
  20. 만성 감염성 질환들의 치료에 유용한 의약을 제조하기 위한, 제1항에 따른 폴리펩티드.
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  27. 면역 체계를 조절하는 약물을 제조하기 위한, 제1항에 따른 폴리펩티드.
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